JP2004107352A - T細胞増殖を阻害する化合物及び同化合物の使用方法 - Google Patents

T細胞増殖を阻害する化合物及び同化合物の使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】
 CD4の異なる5側面領域の1つが示す表面に類似した表面を有する化合物を開示する。好ましくない免疫応答を特徴とする状態に罹患した又はかかりやすいと疑われる個人の治療方法であって、CD4糖タンパク質の側面の一部を模倣する少なくとも1種の化合物を該個人に投与することを含む治療方法を開示する。
【解決手段】
 本発明の化合物は、20アミノ酸以下を含み、Ser−Gln−Lys、Ala−Ser−Gln、Asp−Gln−Lys、Gln−Lys−Glu、Lys−Glu−Glu、SEQ ID NO:30、Asn−Gln−Lys、Pro−Arg−Gly、Lys−Gln−Ser、Gln−Ser−Ala、Lys−Gln−Asp、Glu−Lys−Gln、Glu−Glu−Lys、SEQ ID NO:66、Lys−Gln−Asn、及びGly−Arg−Proから成る群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含み、T細胞増殖を阻害することができる。
【選択図】 なし

Description

 関連特許出願に対するクロスリファレンス
 本出願は、係属中の1992年11月3日出願の米国特許出願第07/977,692号の一部継続出願であり、前記米国特許出願は本明細書に援用される。
 発明の分野
 本発明は免疫学の分野に関し、特に、例えばヘルパーT細胞の好ましくない活性化のような、好ましくない免疫応答の阻害に関する。
 発明の背景
 正常なT細胞は哺乳動物の免疫応答の不可欠な部分であるが、場合によっては、例えばT細胞の好ましくない増殖のような、好ましくない免疫応答を阻害することが望ましい。例えば、自己免疫疾患は“自己”抗原に対する免疫反応として特徴づけられる。自己免疫疾患には、全身性狼瘡エリテマトーデス(SLE)、慢性関節リウマチ(RA)及び多発性硬化症(MS)がある。SLEとRAは今までは例えば免疫抑制薬と組み合わせた、ステロイド又は抗炎症剤のような、抗炎症剤/免疫抑制薬によって治療されてきた。MSに対しては今までに効果的な治療法が発見されていないが、ACTH及び他の免疫抑制薬は、再発中に投与する場合には、ある程度の応答を誘発していた。例えばRA、SLE及びMSに関連するような、好ましくない免疫応答の抑制はこれらの症状に対処する(combat)ために非常に望ましい。T細胞は免疫応答の不可欠な部分である。したがって、T細胞増殖の抑制を目的とする治療法はこのような好ましくない免疫応答を治療するために非常に望ましい。
 T細胞は移植片拒絶及び対宿主性移植片病(GVHD)にも関与してきた。例えばシクロスポリンのような免疫抑制薬の投与は、移植片拒絶に対処する試みに現在用いられている1方法である。GVHDは今まではドナー骨髄からT細胞を枯渇させることによって治療されてきた。自己免疫疾患の場合におけるように、移植された器官の拒絶を減じて、宿主生体のT細胞が移植された細胞を“異物”と認識することを阻止するために、好ましくない免疫応答はT細胞レベルにおいて目標とされてきた。
 さらに、T細胞性白血病に関連した異常なT細胞増殖はT細胞増殖を抑制することによって治療することができる。白血病に罹患した患者は低い生存率を有し、一般に化学療法によって治療される。T細胞の好ましくない増殖を抑制する方法はこのような白血病の治療に有用である。
 全身性狼瘡エリテマトーデス(SLE)、慢性関節リウマチ(RA)及び多発性硬化症(MS);移植片拒絶及び対宿主性移植片病(GVHD);並びにT細胞性白血病を含む自己免疫疾患を治療するための新規な化合物及び方法が必要とされている。例えばT細胞の好ましくない増殖のような好ましくない免疫応答の抑制を目的とした新規な化合物及び方法が必要とされている。
 発明の概要
 本発明は糖タンパク質CD4の側面(lateral surface)を配座的に(conformationally)模倣する化合物を提供する。本発明の化合物は好ましくは20アミノ酸以下、より好ましくは10〜15アミノ酸以下であり、CD4の特定の領域に由来するアミノ酸配列を含み、哺乳動物における免疫応答を調節するために有用である。この特定のアミノ酸配列はSer−Gln−Lys、Ala−Ser−Gln、Asp−Gln−Lys、Gln−Lys−Glu、Lys−Glu−Glu、SEQ ID NO:30、Asn−Gln−Lys、Pro−Arg−Gly、Lys−Gln−Ser、Gln−Ser−Ala、Lys−Gln−Asp、Glu−Lys−Gln、Glu−Glu−Lys、SEQ ID NO:66、Lys−Gln−Asn、又はGly−Arg−Proを含む。
 本発明は糖タンパク質CD4の側面を配座的に模倣する化合物を含む薬剤組成物に関する。本発明の薬剤組成物中に含まれる化合物は好ましくは20アミノ酸以下、より好ましくは10〜15アミノ酸以下であり、CD4の特定の領域に由来するアミノ酸配列を含み、哺乳動物における免疫応答を調節するために有用である。この特定のアミノ酸配列はSer−Gln−Lys、Ala−Ser−Gln、Asp−Gln−Lys、Gln−Lys−Glu、Lys−Glu−Glu、SEQ ID NO:30、Asn−Gln−Lys、Pro−Arg−Gly、Lys−Gln−Ser、Gln−Ser−Ala、Lys−Gln−Asp、Glu−Lys−Gln、Glu−Glu−Lys、SEQ ID NO:66、Lys−Gln−Asn、又はGly−Arg−Proを含む。
 本発明の化合物は哺乳動物において免疫応答を調節するT細胞の増殖を抑制するために有用である。本発明は、例えば全身性狼瘡エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、移植片拒絶、対宿主性移植片病及びT細胞性白血病のような、好ましくない免疫応答を特徴とする症状に罹患した、又はこのような症状に罹患しやすいと疑われる個人の治療方法であって、該個人に糖タンパク質CD4の側面を配座的に模倣する化合物を含む薬剤組成物を投与する段階を含む前記治療方法に関する。本発明の薬剤組成物に含まれる化合物は好ましくは20アミノ酸以下、より好ましくは10〜15アミノ酸以下であり、CD4の特定の領域に由来するアミノ酸配列を含み、哺乳動物における免疫応答を調節するために有用である。この特定のアミノ酸配列はSer−Gln−Lys、Ala−Ser−Gln、Asp−Gln−Lys、Gln−Lys−Glu、Lys−Glu−Glu、SEQ ID NO:30、Asn−Gln−Lys、Pro−Arg−Gly、Lys−Gln−Ser、Gln−Ser−Ala、Lys−Gln−Asp、Glu−Lys−Gln、Glu−Glu−Lys、SEQ ID NO:66、Lys−Gln−Asn、又はGly−Arg−Proを含む。
 発明の詳細な説明
 CD4は、T細胞受容体と相乗作用的に機能して、T細胞活性化に関与するシグナルを発生する細胞表面糖タンパク質である。これの発現は、抗原提示(antigen presenting)細胞上の自己クラスII主要組織適合型複合体(MHC)タンパク質に関連した外来抗原(foreignantigen)の認識と相関関係にある(ビッディソン(Biddison)等、J.Exp.Med.1982,156,1065〜1071)。これの発現は、T細胞レパートリーを決定する正及び負の胸腺選択プロセスを調節するために重要である。CD4は、免疫グロブリンスーパーファミリーの要素に対して相同性(homology)を示す4外部領域を有する;特に、アミノ末端領域(D1)は免疫グロブリンVκ鎖に対する高い相同を示す(パーネス(Parnes),Adv.Immunology,1989,44,265〜311)。CD4の2アミノ末端領域(D1,D2)はクラスII制限T細胞の機能応答(functionalresponse)の増強に関係づけられている(フロイリー(Fleury)等,Cell,1991,66,1037〜1049)。非常に多くの証拠が、CD4がT細胞受容体(TCR)との補受容体(coreceptor)として作用し、クラスIIMHCタンパク質の非多形部分(nonpolymorphicportion)と結合するが、TCRは抗原及びMHCの多形部分と特異的に結合することを示唆している(ガイ(Gay)等,Nature,1987,328,626〜629)。CD4がこの相互作用の総結合活性を強化して、生理学的濃度における外来抗原の認識を可能にすると広く考えられている。
 補受容体としてのCD4の存在はT細胞応答を300倍程度に強化することができる(ジャネウェイ(Janeway),Sem.Immunology,1991,3,153〜160)。CD4の主要な寄与がアフィニティーエンハンサーとしてではなくシグナル伝達分子としてであることを、幾つかの研究が実証している。実際に、幾つかの直接結合研究では、CD4の存在はT細胞に対するMHCアフィニティに影響を及ぼさなかった(マツイ(Matsui)等,Science,1991,254,1788〜1791)。CD4はTCR仲介シグナル伝達経路に密接に関係して、Tヘルパー細胞の活性化を生ずる。CD4に特異的なモノクローナル抗体がレクチン又はCD3−TCRに対する抗体によって誘導されるT細胞活性化を、これらの系におけるクラスIIリガンドの不存在にも拘わらず、阻害することができることを多くの研究が実証している(バンク(Bank)とチェス(Chess)のJ.Exp.Med.1985,162,1294〜1303;タイト(Tite)等のJ.Mol.Cell.Immunol.1986,2,179〜189)。これらのデータはCD4が負のシグナルを供給することができるという仮説をある程度導いている。他のデータは、CD4が正のシグナルを供給することができること、および活性化域値を2〜3桁(twoto three orders of magnitude)低下させるシグナル伝達複合体(signalling complex)にCD4が包含されていることを明白に示している(レドベッター(Ledbetter)等,Eur.J.Immunology,1988,18,525〜532)。
 CD4の細胞質領域はp56lck、src関連チロシンキナーゼに非共有結合的に関係する(バーバー(Barber)等,PNAS USA 1989,86,3277〜3281)。細胞質テール(cytoplasmic tail)の部位特異的突然変異は、p56lckと結合するために必要である二重システインモチーフ(double cysteinemotif)を画定する(シャウ(Shaw)等,Molec.Cell.Biol.1990,10,1853〜1862;ターナー(Turner)等,Cell,1990,60,755〜765)。p56lckに関して不完全なトランスジェニックマウスはT細胞を発生することができず(Tak Mak,個人的情報)、細胞質領域を有さないCD4突然変異体はT細胞活性化において不充分であり(Glaichenhausら,Cell1991, 64. 511−520)、p56lckの誘導(triggering)がT細胞活性化に関与することを強く示唆する。保存された(conserved)カルボキシ末端チロシンキナーゼ領域を有する他のsrcファミリー要素によると同様に、別個の(distinct)細胞受容体との結合が特有のアミノ末端を介して生じ;このようにして、細胞外リガンドがチロシンキナーゼを制御することができる。CD4の抗体架橋が、CD3−TCR複合体のζ鎖(及び恐らくは△鎖とε鎖)のチロシン残基上のリン酸化を生ずることが実証されている(バーバー等,1989,上記文献)。CD3リン酸化の正味結果は、CD3−TCR複合体内の分子間結合を変えて、T細胞活性化に関係した段階的なイベントを生じることである。
 CD4は、異なる細胞上の分子とのその相互作用との他に、他のT細胞表面分子との相互作用にも、恐らくシグナル伝達分子としてのその能力(capacity)において関係する。CD4とCD3/TCR複合体との間の物理的結合は幾つかのグループによって実証されている。ジャネウェイ等のCSH Symp.Quant.Biol.1989,LIV,657〜666は、モノクローナル抗CD4がTCRのある種のエピトープに対するモノクローナル抗体に応じたT細胞クローンの活性化を阻害することができるが、他のT細胞クローン活性化を阻害できないことを実証した。さらに、高効力抗TCRはCD4によるTCRのコキャッピング(cocapping)及びコモジュレーション(comodulation)を惹起したが、低効力(20〜500倍)抗TCRは惹起することができなかった。他の研究は、CD4とCD3/TCR複合体との間の物理的結合が活性化T細胞上でのみ効果的に生ずるが、休止T細胞では生じないことを実証している(ミットレル(Mittler)等,PNAS USA,1989,86,8531〜8535;リバス(Rivas)等,J.Immunology,1988,140,2912〜2918)。CD4とCD45との間で物理的結合が生ずることが判明している。CD45は造血系(hemopoietic)起源の全ての細胞上に発現される膜結合タンパク質チロシンホスファターゼ(PTPアーゼ)である。CD45ネガティブ(negative)T細胞変異体はTCR仲介イベントを通してT細胞を活性化することができないが、IL−2仲介路を介して刺激されることができる(マッチュース(Matthews)等,CSH Symp.Quant.Biol.1989,LIV,675〜682)。CD45が試験管内分析(invitro assay)においてp56lckを直接に脱リン酸化して、p56lckキナーゼ活性を明白に増強することが報告されている(ムステリン(Mustelin)等,PNAS USA,1989,86,6302〜6306)。蛍光共鳴エネルギー転移分析を用いて、活性化T細胞の表面上の2分子の密接な物理的近接を実証したが、休止T細胞では実証しなかった(ミットレル等,J.Immunology,1991,147,3434〜3440)。機能的に、CD4によるCD45のコクラスターリング(coclustering)はp56lckリン酸化状態の変化を生じ、同時にキナーゼ活性を増加させる(オスタガード(Ostergaard)とトローブリッジ(Trowbridge),J.Exp.Med.1990,172,347〜350)。さらに、ジアンザニ(Dianzani)等,Eur.J.Immunology,1990,20,2249〜2257は、CD4と種々なCD45イソフォーム(isoform)との間の物理的結合と、免疫学的メモリー状態との相関関係を実証している。CD4タンパク質、特にその側面は、最終的にはT細胞増殖の刺激を生ずる、複雑なシグナル伝達路(complexsignalling pathway)の調節に関与すると考えられる。
 CD4タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、CD4タンパク質のアミノ酸配列とは周知である。ここで用いるかぎり、CD4の特定のアミノ酸残基を表すために用いられるナンバーリング(numbering)系は周知の標準ナンバーリング系であり、当業者によって通例用いられるものである。例えば、マッドン(Maddon,P)等の(1985)CELL,42:93〜104;マッドン等の(1986)CELL,47:333〜348;及びフッセイ(Hussey,R.E.)の(1988)Nature,331:78〜81を参照のこと、これらの各々は本明細書に援用される。
 本発明は哺乳動物における免疫応答を調節するために有用なペプチドと、方法を提供する。ここでは(1)CDR1;(2)CDR3;(3)127;(4)147;及び(5)161と名付けられ、好ましくは15アミノ酸以下である、CD4の異なる5領域のうちの1つの少なくとも1部分に対応するアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。本発明のペプチドは制限された配座(conformation)と、タンパク質間の分子間相互作用に介入することによって免疫応答を調節する能力とを有する。
 該領域は糖タンパク質CD4の結晶構造に基づいて決定された。特に、CD4タンパク質のD1−D2領域によって示され、タンパク質−タンパク質相互作用に関与すると考えられるCD4側面をモデル化し、配座的に制限されたペプチドを設計するための鋳型として用いた。図1はCD4のD1−D2領域を示す。
 上記で特定したCD4の異なる5領域の各々は、必須アミノ酸に加えてフランキング配列を含む特定のアミノ酸配列から形成される。これらはCD4に存在するので、これらの領域はそれぞれ他の分子と相互作用することができる表面を形成する。本発明の化合物は、CD4のこれらの異なる領域の1つ以上をモデルとして用いて設計される。本発明の化合物はCD4の5特定領域の少なくとも1つの表面に類似した表面を有する。したがって、本発明の化合物はCD4の該5領域の少なくとも1つの分子間相互作用を模倣することができる。本発明の化合物はT細胞増殖を阻害することができ、それによって、好ましくないT細胞増殖を特徴とする障害及び状態の治療及び予防に有用である。
 ここで用いるかぎり、“化合物”なる用語は、ペプチドと非ペプチドとを含む分子を意味し、非限定的に少なくとも幾つかの非ペプチジル結合によって結合されたアミノ酸残基を含む分子を包含する。ここで用いる“ペプチド”なる用語は、ネイティブな(native)ペプチド結合によって結合された自然発生のアミノ酸サブユニットから形成されるポリペプチドを意味する。したがって、この用語は実際上、自然発生サブユニット又はそれらの密接な相同体(homolog)を意味する。アミノ酸なる用語は自然発生ペプチドに類似した部(portion)を有するが、非自然発生部を有する部分(moiety)をも意味する。したがって、ペプチドは変化したアミノ酸又は結合を有することができる。ペプチドはまた、本発明の要旨に矛盾しない他の変更をも含むことができる。このようなペプチドは天然ペプチドと機能的に相互交換可能であるが構造的に異なるとして最も良く表現される。ここで用いるかぎり、“化合物”及び“ペプチド”なる用語は相互交換可能に用いられる。本発明の化合物はCD4の5特定領域の少なくとも1つを含むCD4フラグメントを含み、CD4の5特定領域の少なくとも1つの表面を模倣する物理的表面を有し、T細胞増殖を阻害することができる。本発明のペプチドは約3アミノ酸〜約100アミノ酸の範囲の長さであることができる。本発明の幾つかの実施態様では、本発明のペプチドは約3アミノ酸〜約50アミノ酸の長さである。本発明の好ましい実施態様では、本発明のペプチドは約3アミノ酸〜約20アミノ酸の長さであり、より好ましくは約3〜15アミノ酸の長さである。ペプチドができるかぎり小さいことが好ましい。幾つかの実施態様では、ペプチドは約3〜10アミノ酸である。本発明のペプチドのアミノ酸配列は少なくとも2〜7アミノ酸であるCD4領域の一部を含む。
 ペプチドの三次構造は必ずしもその親タンパク質の三次構造を模倣しないので、ペプチド類似体を共有結合的に閉じて、所望の折り畳みパターン(folding pattern)を強制することが必要であった。固定した(rigid)等電子性類似体ではなく、ペプチドはネイティブタンパク質の形状及び移行(movement)にオーバーラップするように予定の配座的レパートリーに制限された。本発明の幾つかの実施態様では、アミノー及びカルボキシー末端システィンと分子内ジスルフィドとを用いて、ペプチドを閉じて、ポテンシャル溶液配座異性体(potentialsolution conformer)を限定した。ペプチドを環状化する他の手段も公知である。
 ペプチドを機能的配座(functional conformational)に環状化するために用いる方法は、アミノ酸配列に末端においてプロリンを組み込むことを含む。幾つかの実施態様では、アミノ酸配列プロリンーグリシンープロリン(PGP)を用いて、実施例1に述べるペプチド類似体に強制されたターン(constrainedturn)を与えることができる。PGPターンモチーフに重要であることは、アミノ酸プロリンがペプチド鎖のバックボーンに課することができる堅い束縛(rigidconstraint)である。プロリンの側鎖、五員環(プロリジル環)はペプチド基の窒素原子に共有結合するので、隣接ペプチドと共に、バックボーンのCα(phi)結合を中心とした回転をシス配置を採り易いように明白に限定する。これに反して、グリシン残基の特有の可撓性は、他のアミノ酸が経験するような立体的側鎖束縛なしに、堅い隣接プロリンによって強く誘導される、固定されたターンの発生を可能にする。その配座折り畳みレパートリーがネイティブタンパク質のものにオーバーラップするような類似体を予測するために、大量の水溶液中でモデル化したペプチドにおいて、エネルギー依存性運動のコンピュータシミュレーションと分子メカニック計算とを実施した。
 本発明の好ましい実施態様では、ペプチドは15個以下のアミノ酸残基から成り、CD4分子の表面を模倣する表面を形成するために、環状化されるか又はさもなくば配座的に制限される。本発明のペプチドはCD4の特定領域の少なくとも1つからの少なくとも必須アミノ酸配列を含む。これらはさらに、CD4分子における必須配列に隣接するCD4配列、又は非CD4配列、又はCD4と非CD4配列との組合せを含む。さらに、ペプチドは環状化を促進する残基を含む、適当な三次元コンホメーションを得るために必要な非CD4残基を含むことができる。
 以下では、T細胞増殖に関連したシグナル伝達プロセスに関与すると見なされているCD4の異なる5領域の各々を説明する。各領域を構成するアミノ酸配列と各領域の必須アミノ酸配列との確認を含める。本発明の化合物は必須配列と、好ましくはフランキング配列の一部又は全てとを含む。上述したように、該化合物はCD4配列のみ又はCD4と非CD4配列との組合せを含むことができる。本発明の化合物はそれらが配座的に類似するCD4領域を模倣する。したがって、これらは、T細胞増殖の刺激のシグナル伝達(signaling)に関係するタンパク質を含む、本発明の化合物が存在しなければCD4自体と相互作用するであろう、他のタンパク質と相互作用することができる。CD4の異なる5領域の1つからのアミノ酸配列を含む化合物を用いて、免疫応答を調節して、T細胞増殖を阻害することができる。
 CD4のCDR1領域はアミノ酸17〜22(SEQ ID NO:15)を含み、CDR1の必須アミノ酸はアミノ酸19〜21(Ser Gln Lys)と、18〜20(Ala Ser Gln)である。CDR1ペプチドはCD4のアミノ酸19〜21(Ser Gln Lys)を含み、CD4からの付加的フランキング配列を含むことができる。本発明の幾つかの実施態様では、ペプチドはアミノ酸17〜22(SEQ ID NO:15)、17〜21(SEQ ID NO:16)、18〜21(SEQ ID NO:17)、18〜22(SEQ ID NO:18)又は19〜22(SEQ ID NO:19)を含む。本発明の幾つかの実施態様は付加的なCD4又は非CD4フランキング配列を含む。
 CD4のCDR3領域はアミノ酸87〜93(SEQ ID NO:20)を含み、CDR3の必須アミノ酸はアミノ酸88〜90(Asp Gln Lys)、89〜91(Gln Lys Glu)又は90〜92(Lys Glu Glu)である。CDR3ペプチドはCD4のアミノ酸88〜90(Asp Gln Lys)、89〜91(Gln Lys Glu)又は90〜92(LysGlu Glu)を含む。本発明の幾つかの実施態様では、ペプチドはアミノ酸87〜93(SEQ ID NO:20)、87〜90(SEQ ID NO:21)、87〜91(SEQ ID NO:22)、87〜92(SEQ IDNO:23)、88〜91(SEQ ID NO:24)、88〜92(SEQID NO:25)、88〜93(SEQ ID NO:26)、89〜92(SEQ ID NO:27)、89〜93(SEQ ID NO:28)又は90〜93(SEQ ID NO:29)を含む。本発明の幾つかの実施態様は付加的なCD4又は非CD4フランキング配列を含む。
 CD4の127領域はアミノ酸117〜128(SEQ ID NO:58)を含み、必須アミノ酸はアミノ酸120〜124(SEQ ID NO:30)である。127ペプチドはCD4のアミノ酸120〜124(SEQ ID NO:30)を含む。本発明の幾つかの実施態様では、ペプチドはアミノ酸117〜128(SEQ ID NO:58)、117〜124(SEQ ID NO:31)、117〜125(SEQ ID NO:32)、118〜124(SEQ ID NO:33)、118〜125(SEQ ID NO:34)、118〜126(SEQ ID NO:35)、119〜124(SEQ ID NO:36)、119〜125(SEQ ID NO:37)、119〜126(SEQ ID NO:38)、120〜125(SEQ ID NO:39)、120〜126(SEQ ID NO:40)、117〜127(SEQ ID NO:59)、118〜127(SEQ ID NO:60)、118〜128(SEQ ID NO:61)、119〜127(SEQ ID NO:62)、119〜128(SEQ ID NO:63)、120〜127(SEQ ID NO:64)又は120〜128(SEQ ID NO:65)を含む。
 本発明の幾つかの実施態様は付加的なCD4又は非CD4フランキング配列を含む。
 CD4の147領域はアミノ酸158〜171を含み、必須アミノ酸はアミノ酸164〜166(Asn Gln Lys)である。147ペプチドはCD4の少なくともアミノ酸164〜166(Asn Gln Lys)を含む。本発明の幾つかの実施態様では、ペプチドはアミノ酸163〜166(SEQ IDNO:41)を含む。本発明の幾つかの実施態様は付加的なCD4又は非CD4フランキング配列を含む。
 CD4の161領域はアミノ酸130〜138(SEQ ID NO:42)を含み、必須アミノ酸はアミノ酸133〜135(Pro Arg Gly)である。161ペプチドはCD4の少なくともアミノ酸133〜135(Pro Arg Gly)を含む。本発明の幾つかの実施態様では、ペプチドはアミノ酸130〜138(SEQ ID NO:42)、130〜135(SEQ ID NO:43)、130〜136(SEQ ID NO:44)、130〜137(SEQ ID NO:45)、131〜135(SEQ ID NO:46)、131〜136(SEQ ID NO:47)、131〜137(SEQ ID NO:48)、131〜138(SEQ ID NO:49)、132〜135(SEQ ID NO:50)、132〜136(SEQ ID NO:51)、132〜137(SEQ ID NO:52)、132〜138(SEQID NO:53)、133〜136(SEQ ID NO:54)、133〜137(SEQ ID NO:55)又は133〜138(SEQID NO:56)を含む。本発明の幾つかの実施態様は付加的なCD4又は非CD4フランキング配列を含む。
 CD4の異なる5領域の1つより多い領域からの必須アミノ酸を含む本発明の化合物を構成することができる。例えば、CD4領域のCDR1とCDR3の三次元構造は相互にきわめて近接して生ずる。CD4のCDR1領域はアミノ酸17〜22(SEQ ID NO:15)を含み、CDR1の必須アミノ酸はアミノ酸19〜21(Ser Gln Lys)である。CD4のCDR3領域はアミノ酸87〜93(SEQ ID NO:20)を含み、CDR3の必須アミノ酸はアミノ酸88〜90(Asp Gln Lys)、89〜91(Gln Lys Glu)又は90〜92(Lys Glu Glu)である。1実施態様では、化合物がCD4上の2つの領域によって形成される表面を模倣する用に、両領域からの配列を含む化合物を構成することができる。このような化合物は両領域からのアミノ酸配列を含み、所望により2領域誘導配列の間にアミノ酸残基を含むことができる。単一の領域に従ってモデルを作成して化合物を設計する場合と同様に、化合物に含めるべきCD4残基と非CD4残基との画定においては配座的考慮が最も重要である。幾つかの実施態様では、化合物はCD4アミノ酸18〜20(Ala Ser Gln)と88〜90(Asp Gln Lys)とを含む。さらに、化合物はシステインを含むことができる。さらに、幾つかの実施態様では、化合物は2領域誘導配列の間にプロリンとアラニンとを含む。1実施態様は、システイン間のジスルフィド結合によって環状化された、配列Cys Gln Ser Ala Pro Ala Asp Gln Lys Cys(SEQ ID NO:57)を含む。
 ここに述べるアミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシ末端まで又はカルボキシ末端からアミノ末端までの配列で進行するように構成される。配列がアミノ末端からカルボキシ末端まで進行する場合には、配列は通常Lアミノ酸から構成される。化合物の構成にDアミノ酸を用いる場合には、配列はCD4において生ずる順序とは逆になり、それ故、カルボキシ末端からアミノ末端まで進行する。SEQ ID NO:1〜65を含めて、ここに述べるアミノ酸配列の各々はアミノ末端からカルボキシ末端まで進行するアミノ酸配列とカルボキシ末端からアミノ末端まで進行するアミノ酸配列とを表すように意図される。
 CD4タンパク質の側面を模倣する化合物を用いて、ヒトにおける好ましくない免疫応答を処理することができる。例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症及びSLEのような自己免疫疾患を、このような疾患に罹患した患者にこの好ましくない免疫応答を抑制するために本発明の化合物を投与することによって治療することができる。T細胞増殖の阻害は、この好ましくない免疫応答を抑制することができる1つの手段である。本発明の化合物は、移植片拒絶又は対宿主性移植片病に罹患した患者の治療にも有用である。移植組織、器官、骨髄等を受容した患者に本発明の化合物を投与することによって、拒絶を惹起する、好ましくない免疫応答を抑制して、外来物質の拒絶が回避される。例えば、本発明の化合物を対宿主性移植片病に罹患した患者に投与して、“自己”認識免疫応答を抑制することができる。本発明の幾つかの実施態様では、化合物の投与がT細胞増殖を阻害することができる。さらに、移植処置の準備として、移植片の拒絶を生ずる好ましくない免疫応答の可能性を減ずるために、本発明の化合物を患者に投与することができる。本発明の化合物は例えばT細胞性白血病に関連したT細胞増殖のような、異常なT細胞増殖を処理するために投与することもできる。本発明の方法に従って、そのような異常なT細胞増殖に苦しむ患者に本発明の化合物を投与し、T細胞の異常な増殖を抑制する。本発明の幾つかの好ましい実施態様では、表1に記載するペプチドが提供される。
 本発明のペプチドは下記の周知の方法のいずれかによって製造することができる。ペプチドは便利には、メリフィールド(Merrifield)がJ.Am.Chem.Soc.,15:2149〜2154(1963)に最初に述べた固相合成方法を用いて製造することができる。他のペプチド合成方法は、例えば、ボダンツキー(M.Bodanszky)等の(1976)Peptide Synthesis,John Wiley & Sons,第2版;ケント(Kent)とクラークルイス(Clark-Lewis)のSynthetic Peptides in Biology and Medicine,295〜358頁,アリタロ(Alitalo,K.)等編集,Science Publisher,(アムステルダム,1985);並びに、当業者に周知の他の参考文献に見い出すことができる。ペプチド合成方法の概要はスチャート(J.Stuart)とヤング(J.D.Young)のSolid Phase Peptide Synthelia,Pierce Chemical Company(イリノイ州,ロックフォード)(1984)に見い出される。The Protein,第II巻,第3d版,105〜237頁,ノイラス(Neurath,H.)等編集,Academic Press(ニューヨーク州,ニューヨーク)(1976)に述べられている、溶液方法によるペプチド合成も用いることができる。このような合成に用いるための適当な保護基は上記文献並びにマコミー(J.F.W.McOmie)のProtective Groups in Organic Chemistry,Plenum Press(ニューヨーク州,ニューヨーク)(1973)に見い出される。
 一般に、これらの合成方法は成長するペプチド鎖に1個以上のアミノ酸残基又は適当な保護されたアミノ酸残基を逐次添加することを含む。通常は、第1アミノ酸残基のアミノ又はカルボキシル基は選択的に除去される、適当な保護基によって保護される。例えばリシンのような、反応性側基(side group)を含むアミノ酸に対しては、選択的に除去される、異なる保護基が用いられる。
 例として固相合成を用いて、保護されたアミノ酸又は誘導体化アミノ酸を不活性な固体担体にその保護されないカルボキシル基又はアミノ基を介して付着させる。アミノ又はカルボキシル基の保護基を次に選択的に除去して、適当に保護された相補的(アミノ又はカルボキシル)基を有する配列の次のアミノ酸を混合して、固体担体に既に付着した残基と反応させる。次に、この新たに加えたアミノ酸残基からアミノ又はカルボキシル基の保護基を除去して、次のアミノ酸(適当に保護された)を加え、以後同様に繰り返す。全ての必要なアミノ酸が適当な配列で結合された後に、残留する末端保護基及び側基保護基(並びに固体担体)を順次又は同時に除去して、最終ペプチドを得る。本発明のペプチドはベンジル化又はメチルベンジル化アミノ酸を有さないことが好ましい。このような保護基部分を合成の過程で用いることができるが、ペプチドの使用前にこれらの保護基部分を除去する。配座を制限するために分子内結合を形成するには、他の箇所で述べたように、付加的反応が必要である。
 本発明のペプチドは組み換えDNA方法によっても製造されるが、このような方法は、精製と、その後に、配座的にペプチドを制限するための化学的修飾を必要とするので好ましくない。
 L−アミノ酸を含むペプチドの他に、本発明による薬剤組成物はD−アミノ酸から構成されるペプチドを含むことができる。分解(degradation)に関与する大抵の酵素は四面体型α−炭素を認識するので、酵素認識とその後の開裂(cleavage)を避けるためにD−アミノ酸を用いた。D−アミノ酸を用いて、アミノ酸配列を逆転しても同じ折り畳み表示(foldedpresentation)が得られることをコンピュータ研究が実証する。したがって、D−アミノ酸から成るペプチドは分解を受けにくい。本発明の幾つかの実施態様では、この開示を通して表示するアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を逆の順序(すなわち、カルボキシ末端からアミノ末端まで)で有する、D−アミノ酸を含む化合物を提供する。したがって、本発明の開示は本明細書に記載する配列の各々を、D−アミノ酸を含むカルボキシ末端からアミノ末端までのペプチドを付加的に表すものとして、特に包含するように意図される。
 アミノ酸配列の保存的置換(conservative substitution)を行うことも可能である。当業者はアミノ酸を保存的置換したCD4類似体を容易に設計することができる。例えば、アミノ酸置換のダイホッフ(Dayhof)ルールと呼ばれるルールに従うと(ダイホッフ(Dayhof,M.D.)の(1978)Nat.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.第5巻,付録3)、ペプチド配列のアミノ酸残基は同等な(comparable)アミノ酸残基と置換することができる。このような置換は周知であり、各アミノ酸の電荷及び構造特徴に基づいて行われる。
 CD4領域の一部を含む合成ペプチドを、これらの部分がCD4中に存在するときのゲオメトリー(geometry)を模倣するために、環状化することができる。環状化はシステイン残基間のジスルフィド結合によって容易にされる。システイン残基は、CD4領域に由来するペプチド部分に隣接する、ペプチド上の位置に含まれることができる。CD4領域に由来するペプチド部分中のシステイン残基を削除及び/又は保存的置換して、このような残基を含むジスルフィド結合の形成を除去することができる。或いは、例えばアミノ及びカルボキシ末端における又はこれらの末端近くのアミノ酸残基のような、ペプチドのアミノ酸残基の間に例えばアミド結合のような共有結合を用いて、ペプチドを環状化することができる。
 本発明はCD4のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むペプチドを含有する化合物を提供する。このCD4部分は2〜100アミノ酸から成る。好ましい実施態様では、CD4部分は2〜20アミノ酸から、より好ましくは2〜15アミノ酸から成る。幾つかの実施態様では、非CD4アミノ酸配列が形成される。他の実施態様では、ペプチドはCD4アミノ酸配列のみを含む。本発明のペプチドのアミノ酸配列の少なくとも10%がCD4の一部に由来することが好ましい。幾つかの実施態様では、本発明のペプチドのアミノ酸配列の約20〜25%より多くがCD4の一部に由来することが好ましく、30〜40%がCD4の一部に由来することがより好ましく、50%より多くがCD4の一部に由来することがさらに好ましい。幾つかの実施態様では、本発明のペプチドのアミノ酸配列中のCD4の一部に由来する割合は約60%に又は約75%以上に近づく。
 本明細書で定義した構造特性を有するペプチドが本発明の薬剤組成物及び方法に有用であるか否かを判定するために、このようなペプチドを用いて、ルーチンの分析を実施して、ペプチドが必要な活性を有するかどうか、すなわちペプチドがT細胞増殖を阻害することができるかどうかを知ることができる。T細胞増殖を阻害するペプチドの能力は、T細胞増殖分析におけるその活性を観察することによって判定することができる。T細胞増殖分析は当業者に周知であり、容易に入手可能な出発物質から構成することができる。下記実施例5〜16は化合物が必要な活性を有するか否かを判定するために使用可能な分析の説明を提供する。 上記構造特性を有するペプチドはルーチンに合成することができる。このようなペプチドを標準分析法によって試験して、それらが本発明の薬剤組成物及び方法に有用であるかどうかを判定することができる。
 本発明は、本発明の化合物と、薬剤学的に受容されるキャリヤー又は希釈剤とを含む薬剤組成物を提供する。本発明の薬剤組成物は選択した投与形に依存して組成を選択して、当業者によって配合されることができる。適当な薬剤学的キャリヤーは、この分野における標準の参考文献であるRemington’s Pharmaceutical Science,オソール(A.Osol)に記載されている。本発明の方法を実施する場合に、本発明のペプチドを単独で、又は他の診断薬、治療薬若しくは添加剤と組合せて用いることができる。このような添加剤には、例えばフレーバー(flavoring)、着色剤、安定剤、増粘剤(thickeningmaterial)、浸透剤(osmotic agent)及び抗菌剤のような賦形剤がある。このような添加剤はインビトロ(in vitro)でのペプチドの使用、貯蔵中の組成物の安定性、又は最適の効果を得るために重要な他の性質を強化する。
 非経口的投与に関しては、本発明のペプチドを、例えば、薬剤学的に受容される非経口用ビヒクル(parenteral vehicle)と組合せて、溶液、懸濁液、エマルジョン又は凍結乾燥粉末として配合することができる。このようなビヒクルの例は水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及び5%ヒト血清アルブミンである。リポソームと、例えば不揮発性油のような非水性ビヒクルをも使用可能である。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加剤(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール)及び化学的安定性を維持する添加剤(例えば、緩衝液及び防腐剤)を含むことができる。この組成物を一般に用いられる方法によって滅菌する。例えば、注射による投与に適した非経口組成物は0.9%塩化ナトリウム溶液注に活性成分1.5重量%を溶解することによって製造される。
 本発明による薬剤組成物は単回量として又は複数回量として投与することができる。本発明の薬剤組成物は個別の治療剤として又は他の治療剤と組合せて投与することができる。本発明による治療は、逐次的に又は同時に投与される通常の治療剤と組合せることができる。
 本発明の薬剤組成物は、活性剤を標的細胞に到達させることができる任意の手段によって投与される。ペプチドは経口投与した場合には消化されやすいので、吸収を最適にするために非経口投与、すなわち静脈内、皮下又は筋肉内投与が通常用いられる。静脈内投与は注入ポンプ(infusion pump)を用いて達成される。本発明の薬剤組成物はエマルジョンとして配合することができる。或いは、本発明の薬剤組成物は鼻腔内投与又は吸入投与用のエーロゾル薬剤として配合することができる。場合によっては、局所投与が望ましいこともある。
 投与量は例えば薬力学的特性;その投与形式と投与経路;レシピエントの年齢、健康及び体重;症状の性質と重症度;並行治療の種類;治療の回数(frequency)のような要素に依存して変化する。ペプチドの用量は通常、体重50kgにつき約1〜3000mg;好ましくは体重50kgにつき10〜1000mg;より好ましくは体重50kgにつき25〜800mgでありうる。通常、個人に対して1〜6回の分割量で又は持続放出形で一日に投与される8〜800mgが、望ましい結果を得るために効果的である。
 治療すべき疾患又は障害に依存して、本発明の薬剤組成物を配合して、最も効果的に投与することができる。本発明の開示を考慮するならば、投与形式は当業者に明らかであろう。
 下記実施例は例示的であり、本発明の限定を意図するものではない。
 実施例
 実施例1  分子モデル化
 マウスCD4タンパク質(L3T4)の分子モデルを、ヒトCD4の高解像度結晶構造(ブルックハーベン(Brookhaven)コード:lCD4)から開発した。コンピュータアルゴリズムを用いてエネルギー依存性運動(energydependent motion)(分子動力学)をシミュレートして、分子メカニック計算を実施した。この研究はMolecular Simulations/Polygen Inc.(カリフォルニア州,パサデナ)によって供給されるコンピュータ用化学パッケージと、Silicon Graphics(カリフォルニア州,マウンテインビュー)のPower Series 4D/480パラレルプロセスコンピュータ(parallelprocess computer)とを用いて実施した。モデル化パッケージの説明はジェイムソン(Jameson,B.A.)のNature,1989,341,465によって既述されている。
  L3T4タンパク質
 一般に、Igスーパーファミリーのアミノ酸組成と機能的性質とは非常に多様である;しかし、バックボーン折り畳みパターンは主として、構造を維持する比較的少数の重要な残基の不変性(conservation)のために、顕著に保存される。これらの重要な(key)構造モチーフを未知タンパク質を既知構造に比較して、調節することによって最大化した。重要な位置により重く重みをかけ、化学的に相同な変化又は同様な構造特性を有する残基のいずれかを含む変化をあまり不利としないような、構造的に類似したマトリックスを用いる。構造的相同性を最大化した後に、L3T4タンパク質のアミノ酸組成をヒトCD4の結晶構造のバックボーンにスーパーインポーズし、新たに組み入れた側鎖を連続シリーズのエネルギー最小化計算で平衡させた。Ig折り畳み構造(fold)は一連のペアード非並列β鎖(pairedantiparallel beta strands)の充分に画定された系列から成るので、これらのペアード(paired)構造を最初に基本的単位として処理した。動力学的計算の第1シリーズでは、非並列鎖を再配列させ、続いてペアード鎖を隣接鎖と相互作用させ、最後に、全構造を配座的に平衡させた。計算の全てを大量の水性溶媒の存在下で実施した。得られた構造は長時間の動力学的ラン(100ピコ秒)において安定であり、例えば加熱及び冷却のような、エネルギー変動(perturbation)に対して安定であった。次に、この構造を機能的ペプチド類似体の設計のための鋳型として用いた。
  ペプチド
 相補性決定領域(CDR)と呼ばれる3基礎構造(substructure)の存在によって形成されるタンパク質表面を用いて、免疫グロブリン可変領域を抗原に接触させる。L3T4もまた、IgスーパーファミリーのメンバーとしてCDR類似領域を用いて、タンパク質−タンパク質相互作用を仲介するという仮説が立てられた。望ましい折り畳みパターンを強制するために、ペプチドを共有結合的に閉ざし、配座異性体の可能な発生源を制限するように、例えばアミノ末端とカルボキシ末端のような合理的に設計された化学的束縛と、分子内ジスルフィド富化操作とをいくつかのペプチド類似体に導入した。
  ペプチド1
 L3T4領域1のCDR3類似領域を、これは逆ターンによって接続された2個の非並列β鎖から成り、その折り畳みが残りの構造からある程度独立しているので、ペプチド模倣体(mimic)を設計するための1候補として選択した。
 予想されるタンパク質構造の分析から、CDR3類似領域の一部(残基86〜97)のみが溶媒に暴露され、結合のために、すなわちカルボキシ末端β鎖と逆ターンの一部とを結合させるために利用可能であると予測された。したがって、ネイティブ配列を完全に保持しながらこれらの構造を維持するようにペプチドを設計した。CDR3類似配座中の86〜93領域の存在を安定化する非並列β鎖ステムループ構造の形成を強制するようなターンモチーフ(turn motif)を用いた。ペプチド類似体中に制約されたターンを与えるためにアミノ酸配列プロリンーグリシンープロリン(PGP)を用いた。PGPターンモチーフにとって重要であることは、アミノ酸プロリンがペプチド鎖のバックボーンに与えることができる堅い束縛(rigidconstraint)である。プロリンの側鎖、五員環(プロリジル環)はペプチド基の窒素原子に共有結合されるので、隣接ペプチド結合と共に、バックボーンのN−Cα(phi)結合を中心とした回転をシス配置を採り易いように明白に限定する。これに反して、グリシン残基の特有の可撓性は、他のアミノ酸が経験するような立体的側鎖束縛なしに、堅い隣接プロリンによって強く誘導される、堅いターン(tightturn)の発生を可能にする。その配座折り畳みレパートリーがネイティブタンパク質のものにオーバーラップするような類似体を予測するために、大量の水溶液中でモデル化したペプチドにおいて、エネルギー依存性運動のコンピュータシミュレーションと分子メカニック計算とを実施した。ペプチド1のアミノ酸配列はSEQ ID NO:1として示す。
  ペプチド2
 SEQ ID NO:1と同様に、ペプチド2(SEQ ID NO:13,mCDR3スクランブル)をCDR3類似領域から誘導した。しかし、この配列はスクランブルであった(scrambled)。
  ペプチド3
 ペプチド3(SEQ ID NO:3,hPGPtide)をヒトCD4のCDR3類似領域から誘導した。SEQ ID NO:3はSEQ ID NO:1に存在する同じPGPターンモチーフを有する。
  ペプチド4
 ペプチド4(SEQ ID NO:4,h158〜171 C−C)は側面(ヒトCD4タンパク質のD2領域に由来)の中央コーナーの1つを表す。CD4タンパク質の残基165の周囲に集中する中央縁において側面からの明白なトポロジカル突出が生ずる。このペプチドは表面露出アミノ酸Leu(162)、Gln(163)、Asn(164)、Gln(165)、Lys(166)、Lys(167)及びGlu(169)の表現を模倣するように設計された。分子動力学のコンピュータシミュレーションとメカニックとを用いて、可能なペプチド配列を選別して、残基158〜171を含む配列に到達した、この場合に、ペプチドを環状化して、ネイティブタンパク質に見られる表面の一部を再現するために、Phe170をシステインと置換した。
  ペプチド5
 ペプチド5(SEQ ID NO:5,h117〜126,線状)は残基122に集中した、CD4のD1−D2領域の側面の中央に、ペプチド4(SEQ ID NO:4)とは反対側に側面(side)を有する。この配列ではプロリンが自然に広範囲に見い出されるために、配座的制約は不必要であった。
  ペプチド6
 ペプチド6(SEQ ID NO:6,h130〜138,C−C)は残基134に集中した、CD4のD1−D2領域の側面の最低部を表す。表面露出残基Arg(131)、Arg(134)、Lys(136)及びAsn(137)を正確に位置付けることを試みた。ねじれ歪を避けるために、最初に人為的に導入したシステインはD−アミノ酸であった。
  ペプチド7
 ペプチド7(SEQ ID NO:7,m86〜104,C−C)は、折り畳みを達成するために、末端にシステインを組み込んだL3T4CDR3領域の一部を表す。
  ペプチド8
 ペプチド8(SEQ ID NO:8,m86〜104,線状)は、配列とサイズにおいて、ペプチド7(SEQ ID NO:7)に同じであるが、束縛(restraining)カルボキシル末端システインを有さない。ペプチド7(SEQ ID NO:7)とは異なり、線状ペプチドは、フェニルアラニン104がシステインに置換されていないので、環化することができない。
  ペプチド9
 ペプチド9(SEQ ID NO:9,m86〜104,スクランブル)は、両端においてシステインを含み、ペプチド7(SEQ ID NO:7)と同じアミノ酸組成を有したが、その配列順序はランダムであった。この形(version)において、ペプチド7(SEQ ID NO:7)中に存在する負のパッチ(patch)が細胞反応に影響を与える可能性を除外するために、負に荷電したアミノ酸のパッチを保有した。
  ペプチド10
 ペプチド10(SEQ ID NO:10,m86〜103,C−C)は、真正の(authentic)CDR3類似体に比べるとアミノ酸1個分だけ切頭されていた。このペプチドは不適当な配座レパートリーを有するように故意に設計された。
 実施例2  ペプチド合成
 アプライド バイオシステム(Applied Biosystem)(カルフォルニア州,フォスターシティ)430A,完全自動化ペプチド合成器で、ジェイムソン(Jameson)等の方法(Science,1988,240,1335)に従って、ペプチドを合成した。内部システイン残基を含むペプチドを再生し(refolded)、それらを0.1M NH4HCO3中に100μg/mlで溶解し、23℃において空気に暴露させながら一晩撹拌することによって酸化した。このペプチドは、この操作の終了時に、Ellmans試薬、HPLC分析及びゲル濾過によって監視すると95%より大きい分子内ジスルフィド結合を示す。ペプチドを凍結乾燥し、完全培地(complete medium)中に再懸濁させ、生物学的分析に用いる前に0.22μフィルターに通して濾過した。合成されたペプチドの配列を以下の表Iに示す。
Figure 2004107352
  実施例3  NMR測定とペプチド モデル化
 ペプチド5mgを10mMリン酸カリウム450μl中に溶解した。この溶液のpHを6.0に調節し、重水素化トリフルオロエタノール50μlを加えた。得られた溶液を5mm NMR管に移した。
 全てのH NMRスペクトルをBruker(マサチュセッツ州,ビレリカ)AMX600分光光度計に278Kにおいて記録した。全てのスペクトルは5℃において得られた。下記2D NMR実験、二重量子濾過相関スペクトロスコピー(double quantum filtered correlated spectroscopy)(DQF−COSY)と、完全相関スペクトロスコピー(totallycorrelated spectroscopy)(TOCSY)とを用いて、スピン特定割り当て(spin specific assignment)を行った。バックス(Bax)とデイビス(Davis),J.Mag.Reson.1985,65,355。NOESY実験を用いて、逐次割り当てを行い、二次構造を検出した。クマール(Kumar)等,Biochem.Biophys.Res.Commun.1980,95,1。 両次元において600Hzのスペクトル幅を用い、16及び64スキャン(scan)をそれぞれTOCSYとNOESYに関してt1増分につき記録した。混合時間はTOCSYでは70ms、NOESYスペクトルでは400msであった。
 NOE誘導距離制約(NOE derived distance constraint)をモデル化プログラムディスカバー(modelling programDiscover)(Biosym Technologies,カルフォルニア州,サンジエゴ)に用いられる標準圧力場(standard force field)に導入した。模擬アニーリングプロセス(simulatedannealing process) を用いて、ペプチドモデルを得た。大量の水の中でのペプチドの拡大配座を高温(900K)分子動力学(moleculardynamics)(MD)に暴露させ、300KにおいてMDを実施することによってアニーリングし、最後に、0.01kcal/mol−Åの平均誘導体(averagederivative)に最小化した。
 ペプチド1の溶液構造を二次元NMRと、距離制約分子動力学とによって特徴づけた。幾つかの長い距離i,i+3NOEが観察されたが、i,i+4NOEは観察されなかった。距離制約分子動力学の結果は図9Aに示す。プロチド(protide)のこの配座異性体は、得られた収束構造(convergent structure)のファミリーの典型的なものであり、約0.5Åのバックボーン位置における平均平方根(RMS,root mean square)偏差を有する。
 プロチドの提案された構造とL3T4の残基86〜96の構造との詳細な比較は、推定結合面を含むArg(6)〜Glu(9)のペプチド領域がネイティブタンパク質に表される配座に類似した提案配座で暴露面を形成することを実証した。しかし、ペプチド1(SEQ ID 1)の他の領域はL3T4タンパク質に殆ど又は全く類似性を示さなかった。
 環状化とPGP“ベンド(bend)”配列とによる立体的制約は、適当な接触面が暴露されるように、配座異性体ファミリーの二次構造を充分に固定するように思われる。表面暴露領域におけるアミノ酸のバックボーンと、特に側鎖は可撓性であり、プロチドの提案されたバックボーン構造がL3T4領域とは異なるとしても、エネルギー的に接近可能な、適当な静電面を有する。
  実施例4  円二色性測定
 CD測定の全てはJobin Yvon(ニュージャーシー州,エジソン)CD6分光光度計において0.05cmの光路長さを有する円形石英セルを用いて実施した。ペプチドの濃度は10mMリン酸カリウム中0.2mg/mlであった。各測定値は、2秒間の総合時間での、0.2nmのステップにおける4回反復スキャンの平均値であった。CD曲線をCCA/LicombとProvencher最小二乗プログラムとを用いて分析した。
 水溶液中では、ペプチド1(SEQ ID NO:1)のCDスペクトルは、200nm以下において強い陰性帯を示した。この種のスペクトルは周期的な二次構造の欠損をしばしば意味する。30%トリフルオロエタノールの添加又はジスルフィド結合のジチオスレイトールによる還元は知覚されうるほどにCDスペクトルを変化させなかった。
  実施例5  細胞ライン
 22D11はCD4+,PCC特異的T細胞ハイブリドーマであり、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM L−グルタミン、50mM MEM非必須アミノ酸、50mM MEM必須アミノ酸、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)及び10%熱不活化FCSを補充したDMEM中に維持する(イボンヌ パターソン(Yvonne Patterson)、ペンシルバニア大学、ペンシルバニア州,フィラデルフィアから入手)。D10.G4.1はCD4+,コンアルブミン特異的T細胞クローンであり、ATCC,メリーランド州,ロックビルから入手した(ATCC#TIB224)。クローンを10〜14日間毎に、1mMグルタミン、5x10M 2−ME及びペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI 1640中の100μg/ml Agと支持細胞(C3H照射脾臓細胞)とによって刺激した。CT20はIL−2依存性T細胞クローンであり、RPMI 1640,10%FCS中に維持し、Lymphocult(Biotest,ニュージャーシー州,デンビル)、IL−2供給源を補充した。ハイブリドーマGK1.5(αL3T4)、145−2C11(αCD3ε)、H57−597(αTCR−βC)及びMKD6(αI−A)は例えばワイルド(Wilde)等のJ.Immunol.1983,131,2178;レオ(Leo)等のProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1987,84,1374;クボ(Kubo)等のJ.Immunol.1989,142,2736;及びカプラー(Kappler)等のJ.Exp.Med.1981,53,1198によって記載されているように維持した。
  実施例6  混合リンパ球反応
 混合リンパ球反応は主要組織適合型複合体(MHC)不適合ドナーのTリンパ球に対する個人のTリンパ球の応答である。CD4+,T細胞は外来MHCタンパク質を認識し、これに応じて、CD4分子に非常に依存的に増殖する。
 マウスを殺し、脾臓を無菌的に摘出した。脾臓をナイロンメッシュに穏やかに圧し通し、この細胞をRPMI 1640と赤血球の低張性溶解物(hypotonic lysis)とによって洗浄することによって、細胞懸濁液を製造した。RPMI 1640で3回洗浄した後に、細胞を完全培地(RPMI 1640,10%熱不活化FCS、2mM L−グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、及び5x10の2−ME)中に再懸濁させた。丸底96孔プレートにおいて、1x10応答(responder)細胞(BALB/c脾臓細胞)を1x10の刺激(stimulator)細胞(C3H脾臓細胞,2000ラド照射)と共に3通りに(intriplicate)インキュベートし(最終容量 200μl)、指定濃度のペプチド(0.01、0.1、1、10、100及び1000μMペプチド)を加えて、37℃、5%COにおいて5日間インキュベートした。チミジン組込みを測定する12時間前に、1μCi/孔の[H]TdRを加えた。細胞から標識DNAをガラス繊維フィルター上にPHD細胞回収器(マサチュセッツ州,ケンブリッジ)を用いて回収し、CPMを1209Rackbeta(LKB,ニュージャーシー州,ピスカタウェイ)を用いて液体シンチレーション計測によって測定した。
  実施例7
 実施例6に述べたようにMLRを実施した。細胞を下記ペプチド:SEQ ID NO:1(mPGPtide)、及び対照ペプチド,SEQ ID NO:3(hPGtides)及びSEQ ID NO:13(mCDR3スクランブル)の各々の0.01、0.1、1、10、100及び1000μMと共にインキュベートした。SEQ ID NO:1はペプチドの低濃度において阻害活性を示したが、対照ペプチドのSEQ ID NO:3とSEQ ID NO:13とは活性を殆ど又は全く示さなかった。図2は、BALB/c(H−2D)抗C3H(H−2K)アロレスポンス(alloresponse)での、CD4依存性混合リンパ球反応(MLR)に対するSEQ ID NO:1(mPGPtide)の免疫抑制反応を実証する。活性は0.01μM SEQ ID NO:1の添加後に約85000CPMであり、200μM SEQ ID NO:1の添加後に約30000CPMであった。SEQ ID NO:3は、PGPモチーフの所有がそれだけでは生物学的活性のために充分でないことを実証する。活性は0.01μM SEQ ID NO:3において約75000CPMであり、200μM SEQ ID NO:3の添加後に約60000CPMであった。同様に、活性は0.01μM SEQ ID NO:13の添加後に約80000CPMであり、200μM SEQ ID NO:13の添加後に約90000CPMであった。
 L3T4CDR3類似体による以前の研究(マクドンネル(McDonnell)等,J.Immunol.1992,149,1626)におけるように、抗原発現細胞ではなく、応答T細胞の予備処理としてT細胞に直接位置づけられるSEQ ID NO:1の活性は刺激を阻害した。さらに、IL−2又はLPS仲介B細胞刺激に対するT細胞応答の阻害は見られなかったので、SEQ ID NO:1の免疫抑制効果はT細胞受容体複合体を通して発生されるシグナルに対して特異的であった。これらのデータは、SEQ ID NO:1の作用機構がシス型CD4相互作用を破壊し、正常T細胞活性化カスケードからそれを分離することであることを示唆する。
  実施例8
 ペプチドsCD4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13及びSEQ ID NO:14の0.01、0.1、1、10、100、500及び1000μMを用いて、MLRを実施例6に述べたように実施した。SEQ ID NO:2(h84−101,C−C)は、ペプチドの高濃度においても殆ど又は全く活性を示さなかったsCD4、SEQ ID NO:14(h18−40線状)、SEQ ID NO:13(h84−101スクランブル)及びSEQ ID NO:12(h84−101線状)に比べて、低濃度において阻害活性を示した。図3は、ヒトCD4 CDR3類似体SEQ ID NO:2(h84−101 C−C)がMLRの増殖応答を阻害することができ;低μmol濃度においても半最大阻害が見られる(500μMペプチドでは陽性対照の約30%CPM)ことを実証するデータを示す。sCD4とSEQID NO:14(CD4,18−40)とは若干の阻害を示した(1000μMペプチドにおいて陽性対照の約45〜55%CPM)が、SEQ ID NO:12(h84−101線状)及びSEQ ID NO:13(h84−101スクランブル)は殆ど又は全く活性を示さなかった。SEQ ID NO:12(h84−101線状)は100μMペプチドでは陽性対照の約95%CPMを示し、SEQ ID NO:13(h84−101スクランブル)は500μMペプチドでは陽性対照の約100%CPMを示した。
  実施例9
 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及びSEQ ID NO:10の0.01、0.1、1、5、20、50及び100μMを用いて、MLRを実施例6に述べたように実施した。ネズミのペプチドSEQ ID NO:7(m86−104,C−C)、SEQ ID NO:8(m86−104,線状)、SEQ ID NO:9(m86−104,スクランブル)及びSEQ ID NO:10(m86−103,C−C)は、BALB/c(H−2D)抗C3H(H−2K)アロレスポンスでの、MLRに対するそれらの効果に関して試験した。SEQ ID NO:7は、ペプチドの低濃度においても活性を示した。SEQ ID NO:8はペプチドの高濃度において限定された活性を示し、SEQ ID NO:9は不活性であった。図4は、CDR3類似体がL3T4依存性応答を阻害できることを示す。SEQ ID NO:7は低μmol範囲において抑制活性を示した。20μMにおいて、SEQ ID NO:7は陽性対照の約45%CPMを示し、100μMでは陽性対照の約0%CPMを示した。完全な配列を有するが配座の変化を示す両ペプチド(SEQ ID NO:8とSEQ ID NO:10)は非常に限定された活性を、試験した最高濃度においてのみ示した。20μMにおいて、SEQ ID NO:8とSEQ ID NO:10は対照の約95%〜約100%CPMを示した。100μMでは、SEQ ID NO:8は対照の約80%CPMを示し、SEQ ID NO:10は対照の約55%CPMを示した。SEQ ID NO:9は殆ど又は全く活性を示さず、添加ペプチドの濃度に関係なく、対照の約100%のCPMを示した。スクランブルペプチドの不活化は、負の電荷が免疫応答を抑制するために充分でないことを実証する。したがって、両配列並びに配座に関してこの電荷の存在が生物学的活性のために必要である。B及びDアロタイプに対するMLRも実施したところ、同じ阻害が認められ、この阻害がH−2K制限応答に限定されないことが実証された。
  実施例10
 MLRを実施例6に述べたように実施した。h84−101 C−C、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、(SEQ ID NO:4+SEQ ID NO:5)及びCD4に対するモノクローナル抗体(OKT4A)を、BALB/c(H−2D)抗C3H(H−2K)アロレスポンスにおけるMLRに対するこれらの効果に関して試験した。MLRをペプチド又は抗体(MLR)を添加せずにも実施した。各ペプチドは中等レベル(30〜50%)で阻害活性を有するが、両類似体を一緒に加えた場合には(SEQ ID NO:4とSEQ ID NO:5)、効果は相乗的であり、CD4に対するモノクローナル抗体(OKT4Aに比べて、阻害は100%に近かった。結果は表IIに要約する。
Figure 2004107352
  実施例11  IL−2産生の阻害
 丸底96孔プレートにおいて、1x10T細胞ハイブリドーマー22D11細胞を、5x10支持細胞(照射C3H脾臓細胞)及び100μg/ml PCC、又はH57−597−(αTCR)被覆孔中の1x105の22D11、及び指定濃度のペプチド(0.01、0.1、1、10、50及び100μM)と共に3通りに培養することによって、IL−2産生を分析した。24時間目に、細胞はペレット化し、上澄みを他の96孔プレートに1x10のCT20細胞/孔と共に移した。細胞を1μCi/孔の[H]TdRと共に、24時間インキュベーションの最後の4時間インキュベートした。細胞から標識DNAをガラス繊維フィルター上にPHD細胞回収器(マサチュセッツ州,ケンブリッジ)を用いて回収し、CPMを1209Rackbeta(LKB,ニュージャーシー州,ピスカタウェイ)を用いて液体シンチレーション計測によって測定した。応答はIE制限され、PCC特異性であった。
  実施例12
 IL−2産生に対するSEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及びSEQ ID NO:11の効果を測定するために、実施例11に従って分析を実施した。SEQ IDNO:7は、ペプチドの低濃度においても阻害活性を示した。SEQ ID NO:8とSEQ ID NO:10とはペプチドの高濃度において限定された活性を示し、SEQ ID NO:9とSEQ ID NO:11とは不活性であった。図5は、SEQ ID NO:7(m86−104,C−C)が低μM範囲においてIL−2産生の抑制活性を示すことを説明する。 50μMSEQ ID NO:7の投与はIL−2産生を対照のIL−2産生の約30%まで阻害し、100μMSEQ ID NO:7の投与はIL−2産生を対照のIL−2産生の約25%まで阻害した。完全な配列を有するが配座の変化を示す両ペプチド(SEQ ID NO:8(m86−104,線状)とSEQ ID NO:10(m86−103,C−C))は限定された活性を、試験した最高濃度においてのみ示した。50μM及び100μMのSEQ ID NO:8の投与は、それぞれ、対照のIL−2産生の約90%及び60%を生じた。同様に、50μM及び100μMのSEQ ID NO:10の投与は、それぞれ、対照のIL−2産生の約85%及び70%を生じた。SEQ ID NO:9(m86−104,スクランブル)は殆ど又は全く活性を示さず、対照のIL−2産生の約100%を生じた。
  実施例13  T細胞増殖分析
 T細胞増殖分析に関しては、D10.G4.1細胞を刺激後10〜14日目に用いた。Ficoll(Pharmacia Fine Chemicals,ニュージャーシー州,ピスカタウェイ)での遠心分離によって生存細胞を選択し、3回洗浄した。1x10D10細胞を、丸底96孔プレートにおいて、5x10支持細胞、100μg/mlコンアルブミン、及び指定ペプチド濃度(0.01、0.1、0.5、1、5、25、50及び100μM)と共に3通りに72時間培養した。最後の16時間は、細胞を1μCi/孔の[H]TdRと共に、インキュベートした。上記のように、細胞を回収し、導入放射能を計測した。応答はI−A制限され、コンアルブミン特異性であった。SEQ ID NO:7は、ペプチドの低濃度において阻害活性を示した。SEQ ID NO:8とSEQ ID NO:10とはペプチドの高濃度において限定された活性を示し、SEQ ID NO:9とSEQ ID NO:11とは不活性であった。 図6は、SEQ ID NO:7(m86−104,C−C)が低μM範囲においてT細胞増殖の抑制活性を示すことを説明する。5μMペプチド濃度では、T細胞増殖は対照の約65%に減ぜられた(SEQ ID NO:11)。25〜100μMペプチド濃度では、T細胞増殖は対照の約30%に減ぜられた。完全な配列を有するが配座の変化を示す両ペプチド(SEQ ID NO:8(m86−104,線状)とSEQ ID NO:10(m86−103,C−C))は非常に限定された活性を、試験した最高濃度においてのみ示す。SEQ IDNO:8は、100μMペプチド濃度において対照の約80%のT細胞増殖を示し、SEQ ID NO:10は、100μMペプチド濃度において対照の約75%のT細胞増殖を示した。SEQ ID NO:9(m86−104,スクランブル)は100μMペプチド濃度において対照の100%のT細胞増殖を示し、完全に不活性であった。
  実施例14  植物凝集素T細胞増殖分析
 マイトジェン植物凝集素(PHA)はCD3/TCR複合体を架橋することによってT細胞を活性化する。ヒト血液を被験者(volunteer)ドナーから採取する。Ficollグラジエント(gradient)上での分離によってリンパ球を精製する。T細胞をヒツジ赤血球へのロゼット形成によって分離する。富化(enriched)T細胞集団を5μg/ml植物凝集素(PHA)によって刺激する。図7はD2ペプチド類似体がPHA刺激に応じてT細胞増殖を阻害できることを示す。0.000025、0.00025、0.0025、0.025、0.25、2.5、25及び250μMペプチド濃度を試験した。MLR分析と同様に、各D2誘導ペプチドは単独では、中等度の用量依存性阻害活性を示した。結果は図7に示す。0.25μMのSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及びSEQ ID NO:11の添加は、それぞれ、47000CPM、53500CPM、48000CPM、及び5000CPMを生じた。SEQ ID NO:4とSEQ ID NO:5とを一緒に加えた場合には、観察される阻害率は有意に上昇した。一緒に加えたSEQ ID NO:4とSEQ ID NO:5の0.25μg(合計)は41500CPMを生じた。阻害のためのペプチド必要量は2桁減少し、両ペプチドの間に相乗効果があることを実証した。例えば、組合せたSEQ ID NO:4とSEQ ID NO:5の僅か2.5μg(合計)が34500CPMを生じた。250μgのSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及びSEQ ID NO:6は、それぞれ、38000CPM、39500CPM及び39500CPMを生じた。
  実施例15  細胞死分析
 細胞死分析のために、平底96孔培養プレートにmAb(100μg/ml)100μlを37℃にわたって4時間で塗布し;次に、このプレートを指定濃度のペプチド又は抗体を入れてインキュベートした。ペプチドを100μMで用いた。モノクローナル抗体GK1.5(α−L3T4)、145−2C11(α−CD3)及び陰性対照MKD6(α−1A)を飽和濃度で用いた。24時間目に、培養上澄み100μlを取り出し、上述したように、IL−2産生に関して分析した。その後、細胞を回収し、細胞生存率を[H]TdR摂取の阻害によって、かつトリパンブルー排除試験によって監視した。結果は3通り培養の平均値として表す。
 SEQ ID NO:7(m86−104,C−C)は抗TCR刺激22D11細胞による受容体仲介細胞死を阻害した。完全な配列を有するが配座の変化を示す両ペプチド(SEQ ID NO:8(m86−104,線状)とSEQ ID NO:10(m86−103,C−C))は非常に限定された活性を、試験した最高濃度においてのみ示した。SEQ ID NO:9(m86−104,スクランブル)は完全に不活性であった。結果は表IIIに要約する。
Figure 2004107352
  実施例16  抗CD3、LPS及びrIL−2に対するBALB/c脾臓細胞増殖応答へのペプチドの効果
 抗CD3(145−2C11)、LPS及びrIL−2の増殖効果に対するSEQ ID NO:7(m86−104,C−C)の効果を試験した。BALB/c脾臓細胞を丸底96孔プレートに1x10脾臓細胞/孔で接種し、抗CD3(145−2C11,1%組織培養上澄み)又はリポ多糖(LPS,10μg/ml)又はマウスrIL−1(100U/ml)によって刺激した。SEQ ID NO:7はαCD3に対するT細胞増殖応答を阻害したが、LPS又はrIL−2に対するT細胞増殖応答には殆ど又は全く効果を示さなかった。図8から分かるように、このペプチドはLPS仲介B細胞増殖の阻害を示さず、阻害活性の特異性を実証した。αCD3に対する細胞の増殖応答は用量依存的に抑制されたが、rIL−2に対する細胞増殖応答には効果が見られず、T細胞活性化の阻害能力がTCRを介して発生されるシグナルに限定されるように見えることを実証した。
  実施例17
 ネズミ86ー103ペプチド(共有結合的に閉じた環状類似体を形成するために位置103に導入した非CD4システインを含む)のインビトロ活性はこのペプチドのごく小部分、残基Arg−91、Lys−92、Glu−93及びGlu−94に属する。さらに、これらのアミノ酸の活性はそれらの空間的並置(spacial juxtaposition)に決定的に依存する。したがって、CDR3類似体の可能な活性にはバックボーン折り畳みと配列とが重要であるという予想に反して、類似体の完全な活性を与えるものは、“表面”を形成するための、空間におけるアミノ酸側鎖原子の正確な位置である。
 新規に開発されたCD4誘導類似体の活性は、例えば多発性硬化症のような自己免疫疾患の治療に有用であると示すことができる。多発性硬化症は病因がまだ分からない自己免疫疾患である。これは中枢神経系(CNS)のミエリン破壊を生ずる慢性再発性炎症性応答を含む。この疾患のエフェクター期(effector phase)におけるニューロンのミエリン鞘の破壊機構は不明であり、非特異的な細胞活性又はシトキン(cytokine)活性によると考えられるが、早期病巣に見られる小リンパ球の大半はCD4+ ヘルパー/インデューサーT細胞サブセットによる(ライネ(Raine)とシャインベルグ(scheinberg)の(1988)J.Neuroimmunol.120:189〜201)。如何なる抗原(例えば、ミエリン塩基性タンパク質又はプロテオリピド)がこの応答を刺激するのかに関する論争にも拘わらず、CNS中へのCD4+T細胞の浸潤レベルが多発性硬化症発作に相関すると考えられる。多発性硬化症の臨床経過と臨床発現の両方が、CNS病巣部位並びにこの疾患の動態と進行に依存して、可変である。
 多発性硬化症の研究には実験的アレルギー性腦脊髄炎(EAE)が最良の実験動物モデルと考えられる。この理由は、このモデルがヒト障害と同じ臨床的及び組織病態学的特徴の多くを共有するからである。EAEはマウスを含めた幾つかの動物種に、粗CNS組織抽出物、精製MBP、プロトリピド、又はこれらの抗原分子の活性部分から成る合成ポリペプチドを接種することによって、発症させることができる。抗原は完全フロインドアジュバンド(CFA)と共に皮下投与されるが、この標準方法の我々の改良方法では、誘導のために0日目と、7日目の2回投与する(コーンゴールド(Korngold)等、(1986)Immunogenetics,24:309〜315,本明細書に援用される)。疾患の症状は最初の免疫化後15〜19日目に通常生じ、25日間まで継続する。マウスは通常、急性EAE発作から回復するが、後に再発するか、又は再免疫化時に重度な(enhanced)疾患発症を受けやすい。マウスの臨床神経学的症状を四肢衰弱度と麻痺度とに基づいてスコアをつけ、組織病態学的分析がCNSへの細胞浸潤度とミエリン破壊度とを明らかにする。ネズミEAEモデルからCD4+T細胞が疾患の誘導に重要であることが明らかであり、EAEと多発性硬化症の分野における免疫学的研究の主要目的は、CNS抗原と反応するようなCD4+T細胞を、免疫系全体を危険にさらすことなく、特異的に阻害することができるアプローチを見いだすことであった。
 CD4タンパク質のCDR3類似領域のD−アミノ酸類似体は、特に例えば多発性硬化症のようなミエリン破壊疾患に関して、自己免疫疾患の治療に強力でかつ有用な治療活性を有することが実証されている。
 SEQ ID NO:1の逆配列である下記ペプチドを、標準方法によってD−アミノ酸を用いて合成し、当面の問題に関連した分析で試験した。
  D−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1:
     CPGPEEKRNELEC
 全L−アミノ酸類似体SEQ ID NO:1を、ヒト多発性硬化症の実験的アレルギー性腦脊髄炎ネズミモデルで試験した。この類似体は疾患の進行の経過に対して統計的に有意な効果を有さないことが判明した。
 上記の全D−アミノ酸配列はこの自己免疫障害の進行を顕著に妨げることが判明した。全D−アミノ酸逆配列類似体のインビボ(in vivo)効力はこの化合物の治療価値を実証する。
  実施例18  EAEの臨床発生率に対するCD4−CDR3類似体(CD4−CDR3−like Analog)の効果
 急性EAEの誘導を非常に受けやすいSJLマウスを、コーンゴールド等、(1986)Immunogenetics,24:309〜315の記載に従って免疫化した。したがって、粗SJLマウス脊髄ホモジネート(MSCH)1mgをリン酸塩緩衝化溶液0.15ml中で希釈し、等量のCFA中でエマルジョン化した。この接種物0.15mlをメタファン麻酔したマウスの側腹部後方に皮下注射した。第2回接種を、第1回と同様に、7日目に投与した。マウスを毎日、疾患の症状に関して評価して、0〜5の採点した(0=疾患の臨床発現なし;1=尾弛緩、軽度の後肢衰弱を付随又は付随せず;2=尾弛緩、中等度の後肢衰弱を付随;3=重度の後肢衰弱及び軽度の前肢衰弱;4=完全な後肢麻痺、中等度の前肢衰弱を付随;5=四肢麻痺又は瀕死の状態)。
 マウスを4群に分けた:第1群,治療せず;第2群,2日目と8日目にD−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1 0.5mgを静脈内投与(i.v.);第3群,12日目にD−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1をi.v.投与;第4群2日目と8日目に、D−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1と同じ長さの対照D−ポリペプチドをi.v.投与。図10に示すように、非治療群(任意の投球の症状を有するマウス)におけるEAE発生率レベルは実験の19日目までに83%に達し、対照ペプチドで治療した群でも同様なレベルに達した(71%)。他方では、2日目と8日目に、又は12日目のみにD−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1によって治療した両群は、それぞれ、36%と31%の最大EAE発生率に達した。疾患の症状を発現したマウスの最初の発症の平均時間はD−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1によって治療したマウスでは遅かった(2日目と8日目に又は12日目に治療したマウスでは、それぞれ、17.1日と17.0日であり、これに比べて、非治療群と対照ペプチド群では、それぞれ、15.6日と15.2日)。
  実施例19  EAEの臨床重症度に対するDアミノ酸CDR3類似ペプチド#1の効果
 上記と同じ実験を用いて、種々な治療群からのマウスを疾患の臨床的発現に関して評価した。図11に示すように、非治療群と対照ペプチド群とのマウスの平均EAE重症度は、実験の17日〜18日にそれぞれ2.17と2.29の最大値に達したが、2日目と8日目に又は12日目にD−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1を投与した群が達した最大重症度は、それぞれ、0.77と0.75であり、19〜21日目にピーク活性を示した。ターキー(Tukey)の多重変動分析(multiple analysis of variance)によると、非治療群と、D−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1による2日目と8日目治療群の間では、16〜19日目と24日目に(0.01≦p≦0.04);非治療群と、D−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1による12日目治療群の間では、16〜24日目に(0.01≦p≦0.05);及び対照ペプチド2日目と8日目治療群と、D−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1による2日目と8日目治療群の間では、17日目に(p=0.02)であり、この差は統計的に有意である。
  実施例20  エフェクター期のEAEの臨床重症度に対するDアミノ酸CDR3類似ペプチド#1の効果
 D−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1が、症状がひと度発現した場合に、それ故、疾患のエフェクター期に対応して、EAEの発症に効果を及ぼすことができるか否かを研究するために、30SJLマウスに0日と7日目にMSCHとCFAを上述のように接種した。16日目までに等級1レベルの臨床EAE発現した12マウスを選択し、ランダムに非治療群と、D−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1 0.5mgi.v.治療群とに分けた。図12に示すように、非治療マウス群では18日までに平均2.4までに疾患が進行したが、D−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1治療群では19日目に1.17の重症度に達するにすぎず、その後重症度は迅速に低下した。18日目に、非治療群と治療群との差は統計的に有意であった(p=0.003)。
  実施例21  EAE試験し、D−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1で治療したマウスからのT細胞の表現型と機能性
 0日目と7日目にEAE誘導のための接種を受け、治療されないか、又はD−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1 0.5mgi.v.で12日目に治療されたSJLマウスを27日目に、脾臓とリンパ節とにおけるCD4+と、CD8+T細胞サブセットに関してサンプリングした(頚部リンパ節、軸性(axial)リンパ節、上腕リンパ節、鼠蹊リンパ節、腸間膜リンパ節からプール)。細胞の表現型はFITC標識抗ネズミCD4とCD8モノクローナル抗体とによるフローサイトメトリック分析によって評価した。図13に示すように、2群におけるリンパ系器官の細胞組成は同等であった。D−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1で治療されたマウスのCD4+細胞が有意に減少しないという結果が特に興味深い(0.76≦p≦0.99)。さらに、D−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1治療群のマウスからのリンパ節細胞を照射(1500cGy)MHC同種刺激脾臓細胞(CBA株)に対する混合リンパ球反応での免疫応答性を分析した。図14に示すように、D−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1治療群は、MHC同種抗原に対して、良好ではないとしても、同等の増殖反応を示した(Hチミジン摂取によって測定した同種反応を照射SJL刺激細胞を用いる同系反応によって除して、刺激インデックスを算出した)。
  実施例22  CD4+T細胞によって仲介されるGVHDの発症に対するD−アミノ酸CDR3類似ペプチド#1の効果
 下記データは、移植処置を受ける又は移植処置から回復した個人への治療剤としてのCD4類似体の使用を支持する。臨床骨髄移植は危険性の高い白血病、再生不良性貧血、重度な免疫不全合併症を含めた幾つかの疾患の重要な治療方法である。さらに、このアプローチによって治療される可能性がある広範囲な代謝性及び遺伝性障害が存在する。しかし、現在、骨髄移植の有用性は、幾つかの危険要素によって限定されており、重要な要素は対宿主性移植片病(GVHD)であり、これはしばしば、移植組織の高い割合で生ずる致死的併発症である。GVHDの危険性は、骨髄ドナーとレシピエントとのHLA適合によって減ぜられ、適合した兄弟が第一選択である。しかし、北アメリカではHLA適合兄弟を有する患者は30%未満に過ぎない、それ故、血縁関係ではないが、適当なHLA適合ドナーをナショナル マロードナープログラム(National Marrow Donor Program)から求めなければならない。血縁関係のないHLA適合ドナーを発見する確率は現在、30〜40%のオーダーであり、登録ドナーの全体数に依存する。血縁の又は血縁関係の無いHLA適合移植組織の両方において、GVHDの危険性は、非HLA多重マイナー組織適合型(H)抗原の格差(disparity)のためにまだ非常に高い。血縁関係が無い場合、GVHDは、これがこれらの部位の相違の可能性を高めるので、幾らか多い。
 骨髄接種物を汚染する成熟ドナーT細胞がGVHDの原因となることは明らかであり、幾つかの研究がこのようなT細胞の存在しないことが疾患の発生率を有意に低下させることを示している。しかし、ドナーT細胞の除去も白血病再発の大きな発生率を生じている。これらの完全な免疫寛容患者に少なくともあるレベルの免疫適格性を与えて、残留白血病細胞に対処するのみでなく、偶発的な感染症に対抗することが重要に思われる。これに関して、CD4−CDR3類似体が宿主のマイナーH抗原に反応し、GVHDの原因となるドナーCD4+T細胞のサブポピュレーションを特異的に減ずることができるならば、残りの免疫が完全な状態で残されて、白血病再発及び感染症を抑制することが可能になる。
 B10.D2 CD4+T細胞をT細胞欠失骨髄と共に移植することも照射(850cGy)DBA/2マウスに致命的なGVHD応答を誘発することが今までに判明している(コーンゴールドとスプレント(Sprent)、J Exp.Med.165:1552〜1564)。図15に示すように、B10.D2 CD4+T細胞の移植は15日間のメジアン生存時間によってDBA/2レシピエントに致命的なGVHDの83%発生率を生じた。ドナーT細胞欠失骨髄のみの移植は65日目の実験終了まで完全な生存を生じた。一方、Dアミノ酸CDR3類似ペプチド#1 0.5mgi.v.で治療された、B10.D2 CD4+T細胞のDBA/2レシピエントは、有意に高い生存率(57%)と、非治療群に比べて、65日間より長い有意に延長されたメジアン生存時間とを示した(p=0.04)。このデータは、Dアミノ酸CDR3類似ペプチド#1がGVHDの発症と移植されたドナーCD4+T細胞の同種反応性(alloreactivity)とに減少効果を有しうることを実証する。
図1は、水接近可能な面を指示したL3T4タンパク質モデルのリボン表示を示す。 図2は、BALB/c抗C3H混合リンパ球反応に対するSEQ ID NO:1((黒三角)によって表されるネズミCDR3類似体(analog))、対照ペプチドSEQ ID NO:9((白丸)によって表されるmCDR3スクランブル(scramble))及びSEQ ID NO:3((白四角)によって表されるヒトCDR3類似体)の効果を説明するグラフである。 図3は、ヒト混合リンパ球反応に対するSEQ ID NO:2(h84−101 C−C)、sCD4(CD4タンパク質の2アミノ末端領域の溶解性組換え体)、SEQ ID NO:14(h18−40線状(linear))、及び対照ペプチドSEQ ID NO:13(h84−101スクランブル)とSEQ ID NO:12(h84−101線状)の効果を説明するグラフである。 図4は、BALB/c抗C3H混合リンパ球反応に対するSEQ ID NO:7(m86−104 C−C,(白三角))、SEQ ID NO:8(m86−104線状,(白四角))、SEQ ID NO:9(m86−104スクランブル,(白丸))、及びSEQ ID NO:10(m86−103 C−C,(黒三角))の効果を説明するグラフである。SEQ ID NO:7はペプチドの低濃度において阻害活性を示した。SEQ ID NO:8とSEQ ID NO:10とは、ペプチドの高濃度において限定された活性を示し、SEQ ID NO:9は不活性であった。 図5は、IL−2産生に対するSEQ ID NO:7(m86−104 C−C,(白三角))、SEQ ID NO:8(m86−104線状,(白四角))、SEQ ID NO:9(m86−104スクランブル,(白丸))、SEQ ID NO:10(m86−103 C−C,(黒三角))及びSEQ ID NO:11(無関係対照,(黒四角))の効果を説明するグラフである。 図6は、T細胞増殖に対するSEQ ID NO:7(m86−104 C−C,(白三角))、SEQ ID NO:8(m86−104線状,(白四角))、SEQ ID NO:9(m86−104スクランブル,(白丸))、SEQ ID NO:10(m86−103 C−C,(黒三角))及びSEQ ID NO:11(無関係対照,(黒四角))の効果を説明するグラフである。 図7は、T細胞のPHA仲介刺激の阻害効果に対するSEQ ID NO:4+対照ペプチド(白三角)、SEQ ID NO:5+対照ペプチド(白四角)、SEQID NO:6+対照ペプチド(白丸)、SEQ ID NO:4+SEQ IDNO:5(黒三角)及び対照ペプチド(黒丸)の効果を説明するグラフである。 図8は、αCD3(145−2C11,(白三角))、LPS(白四角)及びrIL−2(白丸)の増殖結果(proliferative effect)に対するSEQ ID NO:7(m86−104 C−C)の効果を説明するグラフである。 図9は、タンパク質モデルに基づくL3T4のCDR3類似領域(CDR3 like region)の水接近可能な面(図9B)と、NMR分析に基づくSEQ ID NO:1の推定結合領域(putativebinding region)の水接近可能な面(図9A)との比較である。 図10は、無処理マウスと、対照ペプチド又はDアミノ酸CDR3類似ペプチド#1を投与したマウスとにおけるEAE発生率のレベルを示すグラフである。 図11は、無処理マウスと、対照ペプチド又はDアミノ酸CDR3類似ペプチド#1を投与したマウスとにおける重症度を示すグラフである。 図12は、症状の発現後の、無処理マウスと、対照ペプチド又はDアミノ酸CDR3類似ペプチド#1を投与したマウスとにおける重症度を示すグラフである。 図13は、無処理マウスと、Dアミノ酸CDR3類似ペプチド#1を投与したマウスとにおける類リンパ器官の細胞組成(cellular composition)の比較を示す棒グラフである。 図14は、無処理マウスと、Dアミノ酸CDR3類似ペプチド#1を投与したマウスとからの細胞による同種(allogeneic)MHC抗原に対する増殖応答の比較を示す棒グラフである(刺激インデックスはH−チミジン摂取によって測定される同種応答を照射SJL刺激細胞(irradiatedSJL stimulator cell)を用いた同系(syngeneic)応答によって除して算出した)。 図15は、無処理の場合と、Dアミノ酸CDR3類似ペプチド#1を投与した場合との2x106のB10.D2 CD4+ T細胞移植後のマウスの比較生存率を示すグラフである。

Claims (5)

  1.  SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、若しくはSEQ ID NO.56、又は、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、若しくはSEQ ID NO.56の逆のアミノ酸配列によって表されるペプチドを含む化合物であって、T細胞増殖を阻害する化合物。
  2.  アミノ酸がDアミノ酸である、請求項1の化合物。
  3.  10より少ないアミノ酸を含む、請求項1又は2の化合物。
  4.  薬剤学的に受容可能なキャリヤー若しくは希釈剤、及び1若しくはそれより多くの請求項1ないし3のいずれかに記載の化合物を含む薬剤組成物であって、T細胞の好ましくない増殖によって特徴付けられる状態を有する、又は有する疑いのある個体を治療するための薬剤組成物。
  5.  T細胞の好ましくない増殖によって特徴付けられる状態を有する、又は有する疑いのある個体を治療するための医薬を、請求項1ないし3のいずれかに記載の化合物を用いて製造する方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7989160B2 (en) 2006-02-13 2011-08-02 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in the process of bone remodeling
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
US9493562B2 (en) 2012-07-19 2016-11-15 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-Siglec-15 antibodies
JPWO2021090894A1 (ja) * 2019-11-05 2021-05-14

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5589458A (en) * 1992-11-13 1996-12-31 Thomas Jefferson University Compounds that inhibit T cell proliferation and methods for using the same
FR2726003B1 (fr) 1994-10-21 2002-10-18 Agronomique Inst Nat Rech Milieu de culture de cellules embryonnaires totipotentes aviaires, procede de culture de ces cellules, et cellules embryonnaires totipotentes aviaires
WO1996020722A1 (en) * 1995-01-03 1996-07-11 Thomas Jefferson University Compounds that inhibit t cell proliferation and methods using the same
DE69631529T2 (de) * 1995-06-29 2004-12-23 Thomas Jefferson University Cd4-derivierte peptide die einen immunrespons inhibieren
US5846933A (en) 1996-06-28 1998-12-08 Korngold; Robert CD-4 derived peptides that inhibit immune responses
US7345020B2 (en) 1995-06-29 2008-03-18 Thomas Jefferson University Mimetics of CD4 that inhibit immune response
WO1997036606A1 (en) * 1996-03-29 1997-10-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Constrained cd4 peptides and methods of using the same
US6436903B1 (en) * 1996-05-22 2002-08-20 Stanford University (Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University) Immunomodulating compounds comprising d-isomers of amino acids
US6127387A (en) * 1996-12-10 2000-10-03 Thomas Jefferson University Use of CD4-binding small molecules to inhibit immune responses
US7067117B1 (en) 1997-09-11 2006-06-27 Cambridge University Technical Services, Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
US6989435B2 (en) 1997-09-11 2006-01-24 Cambridge University Technical Services Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
US20030220234A1 (en) 1998-11-02 2003-11-27 Selvaraj Naicker Deuterated cyclosporine analogs and their use as immunodulating agents
US7238711B1 (en) * 1999-03-17 2007-07-03 Cambridge University Technical Services Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
US7053043B1 (en) * 1999-07-23 2006-05-30 Yeda Research And Development Co.Ltd. Pharmaceutical compositions comprising synthetic peptide copolymers and methods for preventing and treating GVHD and HVGD
US6544750B1 (en) 1999-08-17 2003-04-08 Thromgen, Inc. Peptide analogs as selective inhibitors of thrombin activation of protease activated receptor 1
US6797461B2 (en) * 2000-10-27 2004-09-28 Promega Corporation Tryptase substrates and assay for tryptase activity using same
PL210795B1 (pl) 2001-10-19 2012-03-30 Isotechnika Inc Sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (E), sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (Z), sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (E) ISATX247, sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (Z) ISATX247 i sposób wytwarzania mieszaniny izomerów ISATX247
FR2836924B1 (fr) * 2002-03-08 2005-01-14 Vivalis Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet
ES2223287B1 (es) * 2003-08-04 2006-04-16 Universidad Del Pais Vasco-Euskal Herriko Unibertsitatea Compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes y autoinmunes.
EP2054507A1 (en) * 2006-08-09 2009-05-06 Vivalis Method of production of transgenic avian using embryonic stem cells
EP1985305A1 (en) 2007-04-24 2008-10-29 Vivalis Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines
WO2011118804A1 (ja) * 2010-03-26 2011-09-29 国立大学法人徳島大学 新規抗cd98抗体とその用途

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL69558A (en) * 1983-08-23 1988-06-30 Yeda Res & Dev Synthetic cholera vaccine
WO1989003420A1 (en) * 1987-10-13 1989-04-20 Genelabs Incorporated Anti-retroviral agent
WO1989009782A1 (en) * 1987-10-14 1989-10-19 United States Of America, Represented By The Secre New anti-receptor peptides and therapeutic agents
PT90657B (pt) * 1988-05-27 1995-03-01 Ortho Pharma Corp Processo para a preparacao de peptidos que bloqueiam a ligacao de hiv-1 a proteina cd4 receptora
WO1990000178A1 (en) * 1988-06-30 1990-01-11 Cor Therapeutics, Inc. Platelet blocking peptides
CA2041271A1 (en) * 1990-04-30 1991-10-31 Bradford A. Jameson Peptide analogs to proteins of the immunoglobin superfamily
AU8305491A (en) * 1990-08-01 1992-03-02 Cytel Corporation Novel immunosuppressant peptides
WO1992009628A1 (en) * 1990-11-23 1992-06-11 Immunodynamics, Inc. Synthetic immunoactive peptides having immunomodulating and therapeutic activities
AU9118891A (en) * 1990-11-29 1992-06-25 Smithkline Beecham Corporation Conformationally constrained peptides i
DE4134982A1 (de) * 1991-10-23 1993-04-29 Kernforschungsz Karlsruhe Verwendung von antikoerper enthaltenden praeparationen zur immunsuppression
DE69228945T2 (de) * 1992-01-02 1999-09-16 Cytran Ltd Pharmazeutische pentapeptid-zusammensetzung und ihre verwendung
JPH08502244A (ja) * 1992-08-11 1996-03-12 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 免疫調節ペプチド
US5589458A (en) * 1992-11-13 1996-12-31 Thomas Jefferson University Compounds that inhibit T cell proliferation and methods for using the same

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9040246B2 (en) 2006-02-13 2015-05-26 Alethia Biotherapeutics Inc. Methods of making antibodies that bind polypeptides involved in the process of bone remodeling
US9067984B2 (en) 2006-02-13 2015-06-30 Alethia Biotherapeutics Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind Siglec-15
US8431126B2 (en) 2006-02-13 2013-04-30 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies that bind polypeptides involved in the process of bone remodeling
US8540988B2 (en) 2006-02-13 2013-09-24 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies that bind polypeptides involved in the process of bone remodeling
US9695419B2 (en) 2006-02-13 2017-07-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Polynucleotides and polypeptide sequences involved in the process of bone remodeling
US7989160B2 (en) 2006-02-13 2011-08-02 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in the process of bone remodeling
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
US9388242B2 (en) 2009-10-06 2016-07-12 Alethia Biotherapeutics Inc. Nucleic acids encoding anti-Siglec-15 antibodies
US8900579B2 (en) 2009-10-06 2014-12-02 Alethia Biotherapuetics Inc. Siglec-15 antibodies in treating bone loss-related disease
US9617337B2 (en) 2009-10-06 2017-04-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Siglec-15 antibodies in treating bone loss-related disease
US8741289B2 (en) 2009-10-06 2014-06-03 Alethia Biotherapeutics Inc. Siglec 15 antibodies in treating bone loss-related disease
USRE47672E1 (en) 2009-10-06 2019-10-29 Daiichi Sankyo Company, Limited Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
US9493562B2 (en) 2012-07-19 2016-11-15 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-Siglec-15 antibodies
JPWO2021090894A1 (ja) * 2019-11-05 2021-05-14
JP7398716B2 (ja) 2019-11-05 2023-12-15 国立大学法人京都大学 ペプチド、組成物、及び、気分障害を治療、予防、又は改善する方法

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