JP2004105089A - カルボニル不斉還元酵素をコードするｄｎａ - Google Patents
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Abstract
【課題】２−ハロ−１−（置換−３−ニトロフェニル）エタノンを不斉還元する酵素をコードする遺伝子ＤＮＡおよび本酵素を用いる工業的な光学活性２−ハロ−１−（置換−３−ニトロフェニル）エタノールの製造法を提供する。
【解決手段】ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｌｕｌａ）属のｃＤＮＡより２−ハロ−１−（置換−３−ニトロフェニル）エタノン不斉還元酵素に関する遺伝子を単離し、そのＤＮＡ配列を明らかにし、該ＤＮＡ配列情報に基づいてタンパク質を発現させ、該タンパク質により２−ハロ−１−（置換−３−ニトロフェニル）エタノンを不斉還元し、光学活性２−ハロ−１−（置換−３−ニトロフェニル）エタノールを得る。
【選択図】 なし
【解決手段】ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｌｕｌａ）属のｃＤＮＡより２−ハロ−１−（置換−３−ニトロフェニル）エタノン不斉還元酵素に関する遺伝子を単離し、そのＤＮＡ配列を明らかにし、該ＤＮＡ配列情報に基づいてタンパク質を発現させ、該タンパク質により２−ハロ−１−（置換−３−ニトロフェニル）エタノンを不斉還元し、光学活性２−ハロ−１−（置換−３−ニトロフェニル）エタノールを得る。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性アルコールの製造に有用なカルボニル還元酵素、およびそれをコードする遺伝子、さらに該酵素を利用した光学活性アルコール体の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性アルコール体は、各種の化合物の原料として利用され得る。例えば、後述の通り、一般式（Ｐ）
【０００３】
【化９】
［式中、Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、または水酸基を示し、Ｒは、ＮＨＳＯ２Ｒ３、ニトロ基、またはアミノ基を示し、Ｒ３は、低級アルキル基またはベンジル基を示す。＊１は不斉炭素原子を示す。Ａは、下記置換基
【０００４】
【化１０】
（式中、ＸはＮＨ，ＯまたはＳのいずれかを示し、Ｒ５は、水素原子、水酸基、アミノ基またはアセチルアミノ基を示す。＊２はＲ５が水素原子でないときに不斉炭素原子を示す。）
のいずれかを示す。］
で表される三環性アミノアルコール誘導体またはその塩の中間体となることが知られている。上述の一般式（Ｐ）の化合物は、特開平９−２４９６２３号公報等に、詳細な製造法が開示され（例えば特許文献１及び２参照）、また、その化合物が、糖尿病、肥満、高脂血症等の治療および予防に極めて有用である旨が記載されている。
【０００５】
しかしながら、これらの先行技術において開示されている光学活性アルコールの製造方法は、キラル補助剤の存在下ボランを還元剤とするカルボニル基の還元反応が必要とされ、このキラル補助剤が、非常に高価で、調製が煩雑であり、しかも発火性がある等の問題点があり、工業的に実施することが困難なものであった。
【特許文献１】
国際公開第９７／２５３１１号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第９９／０１４３１号パンフレット
【特許文献３】
特開平１０−９４３９９号公報
【特許文献４】
特開平１１−２１５９９５号公報
【特許文献５】
特許第３０６７８１７号公報
【非特許文献１】
「ジャーナル オブ ケミカル ソサイエティー ケミカル コミュニケーションズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」
（英国） １９７５年 ｐ．４００
【非特許文献２】
「ジャーナル オブ オーガニック ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」 （米国） １９８０年 ｐ．３３５２−ｐ．３３５５
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
中間体として有用な光学活性アルコール体の製造法において、安全性があり、かつ生成物の光学純度や収率の高い工業的に実施可能な好ましい製造法が求められていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、不斉還元反応を酵素により行うべく鋭意研究を行った結果、一般式（２）の化合物を一般式（１）の化合物に効率よく不斉還元する新規な酵素を微生物より見出した。さらに、該酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え手法により取得し、その遺伝子の塩基配列を決定し、該酵素をコードする遺伝子が、発現制御が容易で、該酵素の高生産形質転換体の育種に使用できることを見出した。さらに研究を進めた結果、該酵素を用いた一般式（１）の化合物の好ましい合成方法を確立することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明としては、以下の発明が例示される。
【０００８】
［１］下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（ａ）下記の反応を触媒する（以下、「（２）→（１）反応式」と略することがある）。
【０００９】
【化１１】
［式中、Ｒ１０は、水素原子、ハロゲン原子、保護化された水酸基を示し、Ｂは、塩素原子または臭素原子を示す。＊１は不斉炭素原子を示す。］
【００１０】
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
（ｄ）至適ｐＨ：最高活性に対する相対活性が、ｐＨ４．０〜７．０では約９５％以上、ｐＨ３．０およびｐＨ８．０が約８０％程度である。
【００１１】
［２］下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するカルボニル不斉還元酵素。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素。
（ａ）「（２）→（１）反応式」の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
【００１２】
［３］下記の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかのカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列からなるＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（ａ）「（２）→（１）反応式」の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
【００１３】
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡがベクターに連結されていることを特徴とする組換えベクター。
［５］［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡが宿主細胞に導入され、形質転換せしめられたことを特徴とする形質転換体。
［６］下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素。
（ａ）「（２）→（１）反応式」の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
（ｄ）至適ｐＨ：最高活性に対する相対活性が、ｐＨ４．０〜７．０では約９５％以上、ｐＨ３．０およびｐＨ８．０が約８０％程度である。
【００１４】
［７］下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのカルボニル不斉還元酵素。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するカルボニル不斉還元酵素。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素。
（ａ）「（２）→（１）反応式」の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
【００１５】
［８］下記の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかのＤＮＡがコードするカルボニル不斉還元酵素。
（Ｃ）配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列からなるＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（ａ）「（２）→（１）反応式」の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
【００１６】
［９］［６］〜［８］のいずれかに記載のカルボニル不斉還元酵素を生産する能力を有するロドトルラ属に属する微生物、または［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡを導入して形質転換された形質転換体のいずれかを、培地で培養し、その培養物から該カルボニル還元酵素を採取することを特徴とする該酵素の製造法。
［１０］一般式（２）
【００１７】
【化１２】
［式中、Ｒ１０およびＢは、前記とそれぞれ同じ意味を有する。］
で表された化合物を、［６］〜［８］のいずれかに記載のカルボニル不斉還元酵素、またはその酵素含有物、または該酵素を含有する微生物菌体、または［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡを導入して形質転換された形質転換体のいずれかと、内因性または添加されたＮＡＤＰＨの存在下で接触させて不斉還元反応せしめ、一般式（１）
【００１８】
【化１３】
［式中、Ｒ１０、Ｂおよび＊１は、前記とそれぞれ同じ意味を有する。］
で表された化合物を製造することを特徴とする一般式（１）の化合物の製造法。
【００１９】
［１１］該不斉還元反応を、［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡを導入して形質転換された形質転換体を用いることを特徴とする［１０］に記載の製造法。
［１２］該不斉還元反応に際して、一般式（２）の化合物の反応液中濃度が、１％（Ｗ／Ｖ）（１０ｇ／Ｌ）以上であることを特徴とする［１０］または［１１］に記載の製造法。
［１３］該不斉還元反応が、６時間以内の反応時間、収率が９０％以上であり、生成物の光学純度が９５％以上であることを特徴とする［１０］〜［１２］のいずれかに記載の製造法。
［１４］ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する酵素とその基質およびＮＡＤＰ＋を少なくとも含むＮＡＤＰＨ再生系を共存させることを特徴とする［１０］〜［１３］のいずれかに記載の製造法。
［１５］ＮＡＤＰ再生系がグルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含むものである、［１４］に記載の製造法。
【００２０】
［１６］該不斉還元反応が、水性媒体と、一般式（２）の化合物を溶解可能な有機溶媒とを合わせて用いることを特徴とする［１０］〜［１５］のいずれかに記載の製造法。
［１７］有機溶媒が、酢酸ブチルまたはメチルイソブチルケトンであることを特徴とする［１６］に記載の製造法。
［１８］該不斉還元反応時に、ｐＨをｐＨ３〜８．５に制御することを特徴とする［１０］〜［１７］のいずれかに記載の製造法。
［１９］該不斉還元反応時に、一般式（１）の化合物を吸着可能な合成吸着樹脂を、基質の重量に対して１〜５０倍の重量で添加することを特徴とする［１０］〜［１８］のいずれかに記載の製造法。
【００２１】
【発明の実施の形態】
従来、カルボニル不斉還元酵素として、２−ハロ−１−（置換フェニル）エタノンを不斉還元する酵素として、コリネバクテリウム シュードジフテリカム亜種ＳＴ−１０株由来の酵素（例えば特許文献３参照）、キャンディダ属由来のＳ１酵素およびＳ４酵素（例えば特許文献４参照）などが知られている。しかしながら、前者の酵素は添加する基質濃度が０．１％（Ｗ／Ｖ）以下と低い点および至適ｐＨの範囲が狭い点、後者の酵素は反応率が８０％に満たない点および至適ｐＨの範囲が狭い点において工業的に用いるには満足できるものではない。いずれにしても、これらの酵素が、一般式（２）の化合物を一般式（１）の化合物に不斉還元するとの報告はない。
【００２２】
また、光学活性アルコールの製造法として、キャンデイダ属やロドトルラ属等の微生物を用いて２−ハロ−１−（置換フェニル）エタノールから対応する光学活性ハロヒドリンを得る方法（例えば特許文献５参照）、また２−クロロアセトフェノンから（Ｒ）−２−クロロ−１−フェニルアルコールを得る方法としてパン酵母を用いる方法（例えば非特許文献１参照）やクリプトコッカス マセランス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）を用いる方法（例えば非特許文献２参照）などが知られている。しかしながらこれらの方法は、一般式（２）の化合物を一般式（１）の化合物に不斉還元する反応ではなく、また微生物の還元活性が弱く反応に２４時間以上を要する点や、微生物が還元反応の逆反応を触媒するアルコール脱水素活性を有する点や、反応生成物の光学純度９０％ｅ．ｅ．以下であるか、反応率が９０％に満たない点で満足できるものではない。また、微生物菌体、その処理物、もしくは粗酵素または精製酵素を用い上述の一般式（２）の化合物を不斉還元し、一般式（１）の化合物を得る製造方法は報告例がない。
【００２３】
本発明は、先に示した［６］−［８］に記載されたカルボニル不斉還元酵素を提供する。
先ず発明［６］に基づいて本発明のカルボニル不斉還元酵素を説明すると、本発明のカルボニル不斉還元酵素は、前述の「（２）→（１）反応式」の反応を触媒する。
【００２４】
Ｒ１０は、水素原子、ハロゲン原子、または保護化された水酸基が示され、特に水素原子が好ましい例として挙げられる。また、水酸基を保護する保護基としては、ベンジル基、またはメチル基が好ましい。なお、「（２）→（１）反応式」の反応を触媒するとの確認においては、保護基が、ベンジル基、またはメチル基である場合を想定することが好ましく、さらにベンジル基が特に好ましい例として挙げられる。また発明［１０］等の製造においては、場合によっては、Ｒ１０として水酸基であることもあり得る。Ｂは、塩素原子または臭素原子を示すが、塩素原子が好ましい例として挙げられる。＊１は不斉炭素原子を示す。光学活性体として（Ｒ）体が好ましい例として挙げられる。
【００２５】
本発明のカルボニル還元酵素の還元活性を測定するに際しては、例えば、補酵素ＮＡＤＰＨ（１０ｍＭ）および本発明のカルボニル還元酵素の溶液（０．０５ｍｌ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の反応液（０．４９ｍｌ）を３０℃で５分間予備加熱後、該反応液に、基質２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン（２５０ｍＭ）をジメチルスルホキサイド中に溶解させた溶解液０．０１ｍｌを添加し、３０℃で１０分間還元反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少量、すなわち、ＮＡＤＰＨの減少量を測定することにより、本発明のカルボニル還元酵素の還元活性を測定することができる。不斉還元活性の１Ｕは、上記の条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量と定義することができる。また、本発明のカルボニル還元酵素による還元が不斉還元であること、およびその光学純度を確認する場合には、反応生成物を光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより測定し、公知の光学活性のアルコール体の標品と比較して決定することができる。
【００２６】
本発明のカルボニル還元酵素の基質特異性としては、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しないことが挙げられる。
【００２７】
本発明のカルボニル不斉還元酵素の基質特異性は、上述の測定条件において、基質を各種変更してそれぞれの基質に対し不斉還元活性を有するか否かを測定することにより判断することができる。本発明のカルボニル不斉還元酵素の基質特異性としては、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンに対して不斉還元活性を示し、アセトフェノンに対しても不斉還元活性を示すが、例えば、次に示す化合物に対しても高い不斉還元活性を示すことが好ましい。ここで「高い不斉還元活性」としては、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンに対する相対活性が５０％以上であることが好ましい例として挙げられる。本発明のカルボニル不斉還元酵素は、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−フルオロフェニル）エタノンに対して高い不斉還元活性を示すことがさらに好ましく（例えば、相対活性９０％以上であることが好ましい）、２−ブロモ−１−（４−ニトロフェニル）エタノンや２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンに対して高い不斉還元活性を示すことがさらに好ましい。２−ブロモ−１−（４−ニトロフェニル）エタノンにおいては、例えば相対活性８０％以上であることが好ましく、２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンにおいては、例えば相対活性７０％以上であることが好ましい例として挙げられる。またさらに、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−クロロフェニル）エタノンに対して高い不斉還元活性を示すことが好ましく、例えば相対活性５５％以上であることが好ましい例として挙げられる。また、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メトキシフェニル）エタノンに対して不斉還元活性を示すことが好ましく、例えば相対活性４５％以上であることが好ましい例として挙げられる。さらに、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−ベンジルオキシフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メチルフェニル）エタノン、２−ブロモ−１−（２−ニトロフェニル）エタノンに対しても不斉還元活性を示すことがさらに好ましく、例えば相対活性４０％以上であることが好ましい例として挙げられる。
【００２８】
また、本発明のカルボニル不斉還元酵素は、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を示さない。アルコール脱水素活性は、前述（ａ）の「（２）→（１）反応」の逆反応である。例えば、ＮＡＤＰ＋存在下において本発明の酵素に、上記のアルコール体を接触させ、３４０ｎｍの吸光度の単位時間当たりの変化量（増加量）を指標として、ＮＡＤＰＨの変化量（増加量）を測定してアルコール脱水素活性を測定し、実質的に活性を有しないことを確認すればよい。尚、本明細書において、「実質的にアルコール脱水素活性を有しない（示さない）」とは、アルコール脱水素活性を有しないか、わずかな活性しか認められず、「（２）→（１）の反応式」の活性に対して無視できる程度であることと理解することができる。例えば、「実質的にアルコール脱水素活性を有しない」と判断するに際しては、反応終点において、アルコール体の添加量の５％以下の変換しか行わないことが好ましく、さらに好ましくは２％以下、特に好ましくは１％以下の変換である例が挙げられる。
【００２９】
本発明のカルボニル不斉還元酵素の補酵素の利用性は、補酵素としてＮＡＤＰＨを利用できるが、ＮＡＤＨは実質的に利用できない。例えば、補酵素ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ（１０ｍＭ）の存在下にて、本発明の酵素（０．１Ｕ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）からなる反応液（０．４９ｍｌ）を、３０℃で５分間予備加熱後、ジメチルスルホキサイドに溶解した基質２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン２５０ｍＭを０．０１ｍｌ添加し、３０℃で１０分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少量によりＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの減少を測定することにより、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨそれぞれの補酵素に対する、本発明のカルボニル不斉還元酵素の利用性が確認できる。また、本発明の酵素においては、ＮＡＤＨを実質的に利用できないが、「実質的に利用できない」とは、例えば、ＮＡＤＰＨ存在下における酵素活性（例えば上記の減少量等）の測定値を１００とした場合のＮＡＤＨ存在下の測定値の相対活性（相対比率）が、５％以下、好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．５％以下である場合が挙げられる。
【００３０】
本発明のカルボニル不斉還元酵素の至適ｐＨは、最高活性に対する相対活性が、ｐＨ４．０〜７．０では、約９０％以上、好ましくは約９５％以上が例示され、ｐＨ３．０およびｐＨ８．０では、約７０％以上、好ましくは約８０％程度である。
【００３１】
例えば、補酵素ＮＡＤＰＨ（１０ｍＭ）および本発明の酵素（０．１Ｕ）を含むｐＨ３．０〜９．０の各ｐＨの５０ｍＭリン酸緩衝液からなる反応液（０．４９ｍｌ）を、３０℃で５分間予備加熱後、基質２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン２５０ｍＭを含むジメチルスルホキサイド溶解液０．０１ｍｌを添加し、３０℃で１０分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少量によりＮＡＤＰＨの減少量を測定することにより、本発明の酵素の至適ｐＨが確認できる。最高活性とは、上述の測定により各ｐＨにおける測定値の最大の値を最高活性とする。本願実施例の酵素の最高活性を示すｐＨとしては、通常ｐＨ５−６付近が該当すると思われる。
【００３２】
また、本発明として発明［７］が例示される。すなわち、本発明のカルボニル不斉還元酵素のアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２の１−２５１位のアミノ酸配列が好ましい例として挙げられる。また、本発明のカルボニル不斉還元酵素のアミノ酸配列としては、前述の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の理化学的性質を有する限り、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有していてもよい。配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、１〜３０個のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されているアミノ酸配列も好ましい例として挙げられ、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個である。なお、このような置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有するカルボニル不斉還元酵素は、公知の部位特異的変異導入法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法により、配列番号１の塩基配列の対応する部位に置換、欠失、または挿入を導入せしめたＤＮＡを用い、後述の通り、宿主に導入し発現させることにより得ることができる。
また、本発明として発明［８］が例示されるが、これは本発明のＤＮＡの説明において詳細に説明する。
【００３３】
上記のような理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素は、例えば、ロドトルラ属に属する微生物の培養物から精製することができる。特に財団法人発酵研究所において入手可能であるロドトルラ ムシラギノウザ ＩＦＯ ０９０７（Ｒｈｏｄｏｔｏｌｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ ＩＦＯ ０９０７）が本発明のカルボニル不斉還元酵素の生産菌として優れている。ＩＦＯ ０９０７はまた、国際寄託機関であるＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＣＢＳ）のカタログにもＣＢＳ ２３８２として収載されており、入手が可能である。また、新たに独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に２００２年９月１３日付けで寄託されたロドトルラ ムシラギノウザ ＩＦＯ０９０７（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８１）を利用することも好ましい。あるいはまた、上記菌株の人工または突然変異体を調製することもできる。後述に示すとおり、これらの微生物を培養し、適宜精製手段を組み合わせることにより、精製された本発明のカルボニル不斉還元酵素が取得できる。
【００３４】
本発明の酵素に関する配列情報を取得するためには、本件発明の酵素を精製後、ペプチダーゼ処理、例えばトリプシンを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で３５℃、２０時間処理することにより断片化し、逆相クロマトグラフィーによりペプチド断片を単離し、タンパク質シークエンサーによりアミノ酸配列の一部を決定することができる。
【００３５】
さらに本発明は、発明［１］−［３］に示されるとおり、上述のカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡである。具体的には、配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列からなるＤＮＡが例示される。本発明のＤＮＡは配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列に限定されるものではなく、この塩基配列を含むＤＮＡであればよい。また前記配列番号１の塩基配列の８０−８３２位と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡであっても、前述の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の理化学的性質を有する限り、本発明に包含される。すなわち、これらのＤＮＡを用いて本発明のカルボニル不斉還元酵素を発現することができる。ストリンジェントな条件下としては、例えばＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、マニュアル記載の条件（ｗａｓｈ：４２℃、０．５ｘＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）が例示される。ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、例えば、前述のストリンジェントな条件下、配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列における相補的な塩基配列の任意の、通常は少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個、特に好ましくは少なくとも１００個の連続した塩基配列を検出試料として、これにハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
【００３６】
本発明のカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡは、以下の方法によって得ることができる。本明細書において、特に記載がない限り当該分野で公知である遺伝子組換え技術、酵母および大腸菌での組み換えタンパク質の生産技術、分析法が採用される。
【００３７】
本発明のカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡは、本願明細書において開示される塩基配列、またはアミノ酸配列、場合によれば、前記した精製酵素から決定したアミノ酸配列等の配列情報にしたがって、本発明のカルボニル不斉還元酵素を含有する微生物、例えばロドトルラ ムシラギノウザ ＩＦＯ ０９０７（Ｒｈｏｄｏｔｏｌｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ ＩＦＯ ０９０７）、ＣＢＳ ２３８２またはＦＥＲＭ ＢＰ−８１８１から取得することができる。通常は、その菌体からｍＲＮＡを調製し、それを鋳型とし、合成されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、３’ｃＤＮＡ末端迅速増幅法および５’ｃＤＮＡ末端迅速増幅法（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｂｓ，ＲＡＣＥ法）（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８９９８−９００２，１９８８）により得ることができる。また、アミノ酸配列にしたがって合成されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、カルボニル不斉還元酵素生産菌の染色体ＤＮＡを制限酵素により消化したＤＮＡ断片、またはｃＤＮＡをファージやプラスミドに導入し、宿主を形質転換して得られるライブラリーから、プラークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーションなどにより本発明のカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡを得ることもできる。得られたＤＮＡは、プラスミドベクター、たとえばｐＵＣ１１８に挿入しクローニングし、ジデオキシ・ターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７４： ５４６３−５４６７， １９７７）のような周知の方法により塩基配列の決定を行うことができる。
【００３８】
このようにして調製された遺伝子は、その遺伝子を用いて形質転換した大腸菌宿主中の発現産物を、前記記載のカルボニル不斉還元活性測定法を用いて、カルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡであることを確認することができる。
【００３９】
さらに本発明は、上記のＤＮＡがベクターに連結されていることを特徴とする組換えベクターを提供する。
組換えベクターは、宿主微生物に適したプロモーターの下流に、上記方法で得られたＤＮＡの５’末端側が機能し得るように連結して、適当な発現用ベクターに組み込み調製することができる。
【００４０】
適切な発現ベクターとしては、宿主微生物内で複製増殖可能であれば特に制限されない。例えば、宿主として大腸菌を用いるのであれば、強力なプロモーター、たとえば、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｔ７やピルビン酸オキシダーゼ遺伝子のプロモーター（特許公報第２５７９５０６号）などを含むｐＵＣ系、ｐＧＥＸ系、ｐＥＴ系、ｐＴ７系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＫＫ系、ｐＢＳ系、ｐＢＣ系、ｐＣＡＬ系など通常大腸菌で使用される任意のベクターから選択できる。
【００４１】
さらに本発明は、上記のＤＮＡが宿主細胞に導入され、形質転換せしめられたことを特徴とする形質転換体を提供する。
形質転換体は、上記方法にて作成した発現ベクターを用い、適当な宿主微生物を形質転換することにより、発現させることができる。
【００４２】
宿主細胞としては、微生物、哺乳類細胞、および植物細胞などが含まれる。微生物を利用することが好ましく、例えば、大腸菌、バチルス属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ストレプトコッカス属、サッカロマイセス属、ピキア属などが例示されるが、本件の「（２）→（１）反応式」を邪魔し、または逆反応を触媒し、収率および光学選択性を低下させる天然由来の酵素等を包含しない性質を有することが好ましく、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２またはその誘導体が特に好ましい例として挙げられる。
【００４３】
宿主微生物への遺伝子の導入法としては、たとえば、形質転換、形質導入、接合伝達、またはエレクトロポレーションなどの当技術分野で周知の任意の常法によって、好ましい宿主に導入することができる。
【００４４】
さらに本発明である該カルボニル不斉還元酵素の製造法としては、前述の通り、該カルボニル不斉還元酵素を生産し得る微生物、例えば、ロドトルラ属の微生物、特に好ましくは、ロドトルラ ムシラギノウザ ＩＦＯ ０９０７（Ｒｈｏｄｏｔｏｌｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ ＩＦＯ ０９０７）、ＣＢＳ ２３８２またはＦＥＲＭ ＢＰ−８１８１の培養物から、公知の精製方法を適宜組み合わせて該酵素を取得することができるが、さらに、上述の通り、該カルボニル不斉還元酵素の遺伝子を用い形質転換された形質転換体から取得することもできる。
【００４５】
該酵素を取得するに当り、まず上記微生物や形質転換体を、通常これらの微生物が資化可能な栄養源を含む培地で培養することが好ましく、例えば、酵素や抗生物質などを生産する通常の方法で培養することができる。培養は、通常、液体培養でも固体培養でもよい。たとえば、グルコース、シュクロース等の炭水化物；ソルビトール、グリセロール等のアルコール；クエン酸、酢酸等の有機酸；大豆油等の炭素源またはこれらの混合物；酵母エキス、肉エキス、硫安、アンモニア等の含窒素無機有機窒素源；リン酸塩、マグネシウム、鉄、マンガン、カリ等の無機栄養源；およびビオチン、チアミン等のビタミン類を適宜混合した培地が用いられる。培養条件は、通常、好気条件下で行うことが好ましい。培養温度は、宿主微生物が生育し得る温度であれば特に制限はないが、通常、０℃〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃、さらに好ましくは約３７℃で行うことが例示される。また、培養途中のｐＨは宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はないが、通常、ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ５〜８、さらに好ましくはｐＨ６〜７で行うことが例示される。
【００４６】
次いで、このようにして得られた培養物からカルボニル不斉還元酵素を抽出し、粗製のカルボニル不斉還元酵素含有液を得ることができる。例示すれば、まず培養物を固液分離し、得られる湿菌体を、必要に応じてリン酸緩衝液やトリス塩酸緩衝液などの緩衝液に懸濁せしめ、次いで超音波処理、フレンチプレス処理やガラスビーズを用いる粉砕処理などの菌体破砕処理を適宜組み合わせて、菌体内からカルボニル不斉還元酵素を抽出し、粗製のカルボニル不斉還元酵素含有液を得ることができる。この粗製のカルボニル不斉還元酵素含有液を、必要により、公知のタンパク質、酵素などの単離、精製手段を用いることにより、さらに精製することができる。例えば、粗製のカルボニル不斉還元酵素含有液に、アセトン、エタノールなどの有機溶媒を加えて分別沈殿せしめるか、硫安などを加えて塩析せしめるかして、水溶液からカルボニル不斉還元酵素を含有する区分を沈殿せしめ回収する方法が例示される。またさらに、陰イオン交換、陽イオン交換、ゲル濾過、抗体やキレートを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて精製することができる。例えば、ジエチルアミノエチル−セファロースを用いた陰イオン、レッド−セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを用いて電気泳動的にほぼ単一のバンドにまで精製することができる。
【００４７】
また、発明［１０］に記載されているとおり、本発明の酵素を用いて、光学活性アルコールを製造することが出来る。この発明において、前述の本発明のカルボニル不斉還元酵素を用いるに際しては、本発明の酵素の作用を阻害しないかぎり、特別に精製程度等は限定されず、精製された本発明の酵素の他、その酵素含有物が用いられ、さらには、その酵素を生産する微生物やその酵素の遺伝子を導入して形質転換された形質転換体等を使用してもよい。微生物や形質転換体等を使用する場合には、菌体を利用してもよく、菌体としては、生菌体、もしくはアセトン処理または凍結乾燥等の処理を施した菌体を使用することができる。場合によっては、菌体破砕物や菌体抽出物等の酵素含有物となっていてもよい。勿論、酵素や菌体、酵素含有物等は、カラムにおいて充填されていてもよく、公知の方法により、担体に固定化されていてもよい。
【００４８】
本発明の反応にはＮＡＤＰＨが必要とされるが、微生物、または形質転換体を使用する場合等において、内因性ＮＡＤＰＨが十分量であれば特に問題ないが、予め十分量のＮＡＤＰＨを存在せしめておくか、または、ＮＡＤＰＨを再生することができる反応系（ＮＡＤＰＨ再生系）を利用することが好ましい。
【００４９】
ＮＡＤＰＨ再生系を構築するには、通常、ＮＡＤＰ＋を利用してＮＡＤＰＨを生成する酵素、その基質、およびＮＡＤＰ＋を存在せしめればよい。ＮＡＤＰＨ再生系は、本発明のカルボニル不斉還元酵素の活性に見合う量を供給できる程度に適宜組み合わせることが好ましい。ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する酵素としては、たとえば、ＮＡＤＰ＋を要求するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１１９）やアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１）を用いることができる。具体的には、ＮＡＤＰ＋を要求するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１１９）としては、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のグルコースデヒドロゲナーゼが例示され、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ由来のグルコースデヒドロゲナーゼはシグマ社より販売されており利用し易い。また、ＮＡＤＰ＋を要求するアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２）としては、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ由来のアルコールデヒドロゲナーゼが例示される。これらの酵素は、精製酵素、粗酵素であってもよく、さらに、これらの酵素を含有する微生物やまたはその処理物等であってもよい。また、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する上述の酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換体を使用することもでき、例えば、配列番号３に示すＮＡＤＰ＋を要求するグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、微生物、好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２またはその誘導体に導入した形質転換体は、本発明において特に有用である。さらに、ＮＡＤＰＨ再生系を構成する酵素をコードするＤＮＡと、本発明のカルボニル不斉還元酵素のＤＮＡとを導入し共発現せしめた形質転換体を使用することも好ましい。また、ＮＡＤＰＨ再生用の酵素の基質として、グルコースデヒドロゲナーゼの場合はグルコースを、アルコールデヒドロゲナーゼの場合はエタノールなどを用いればよく、一般式（２）の化合物に対し、モル比で等量以上適宜添加することが例示される。なお、ＮＡＤＰＨ再生系を利用するに際しても、その再生系に供するＮＡＤＰ＋は内因性のものを利用する場合もあるが、不足するのであれば、さらに添加することが好ましい。添加、または存在せしめるＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤＰＨの量は、通常０．０２ｍＭ以下、好ましくは０．０１ｍＭ以下、より好ましくは０．００１ｍＭ以下が例示される。
【００５０】
ＮＡＤＰＨ再生系を利用しない場合には、添加、または存在せしめるＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤＰＨの量は、通常、基質と等モル以上添加することが好ましく、例えば、２倍モル以上、好ましくは５倍モル以上、さらに好ましくは１０倍モル以上を添加する例が挙げられる。添加量の上限としては特に限定されないが、例えば、１００倍モル以下、好ましくは、２０倍モル以下が挙げられる。また、製造においては、コスト等の要因を重視することも多く、製造現場においては、通常１−１０倍モル、好ましくは１．５−５倍モル、特に好ましくは約２倍モル程度が例示される。
【００５１】
本発明の反応を行うに際して、一般式（２）の化合物を添加する場合、その化合物を固体のまま添加することもできるが、反応に影響を与えないような適当量の溶媒、たとえばジメチルスルホキサイド、ジメチルホルムアミド、メチルイソブチルケトンまたは酢酸ブチルに溶解して添加することができる。また、場合によっては、さらに水溶性溶媒が混入されていてもよい。添加方法としては、反応の始めに一括添加することができるが、分割添加または連続添加してもよい。
【００５２】
また、一般式（２）の化合物から一般式（１）の化合物を製造するに際しては、通常の酵素反応の通り、緩衝液や蒸留水等の水溶液中にて反応させることが好ましいが、該反応を阻害しない限り、その他の溶媒を利用することも可能である。特に、一般式（２）の化合物を溶解し得る有機溶媒を含有せしめた水溶性溶媒を用いることができるが、特に、水に溶解しにくい有機溶媒を水とともに共存せしめ、２相系となすことが好ましい。例えば、緩衝液や蒸留水等の水溶液に対して、メチルイソブチルケトン、または酢酸ブチルをそれぞれ用いる２相系が特に好ましい例として挙げられる。有機溶媒は、適宜の時期に添加することができるが、上述の一般式（２）の化合物とともに添加してもよく、前記したとおり、一般式（２）の化合物を添加する際に、溶解せしめるために用いられる有機溶媒として添加されることも好ましい。また任意の段階で追加することも可能である。有機溶媒と水性媒体の比率は、特に限定されないが、一般式（２）の物性により変化せしめることも好ましく、例えば、通常は１：１０〜１０：１が例示され、好ましくは１：４〜４：１、または１：２〜２：１、場合により約１：１付近が例示される。
【００５３】
また本発明の反応には、より高い光学純度の一般式（１）の化合物を得るために、反応液中に合成吸着樹脂を添加することもできる。合成吸着樹脂の材質は、一般式（１）の化合物を吸着し、反応を阻害しないものであれば特に限定されないが、中間極性のアクリル系のものが好ましく、例えば、アンバーライトＸＡＤ−７ＨＰ（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａｓｓ社）、ダイアイオンＨＰ−２ＭＧ（三菱化学工業株式会社）等を用いることができる。合成吸着樹脂は、基質の重量に対して、通常、１倍の重量以上、好ましくは２倍の重量以上、より好ましくは５倍の重量以上の添加が例示される。また、上限として特に限定されないが、基質の重量に対して、通常、５０倍の重量以下、好ましくは２０倍の重量以下、より好ましくは１０倍の重量以下を添加することができる。
【００５４】
本発明の一般式（１）の製造方法においては、一般式（２）の化合物を１０ｇ／Ｌ（１％ｗ／ｖ）以上、好ましくは２０ｇ／Ｌ（２％ｗ／ｖ）以上、より好ましくは５０ｇ／Ｌ（５％ｗ／ｖ）以上添加することができる。反応中のｐＨは、通常ｐＨ３〜８．５、好ましくはｐＨ５〜８、より好ましくはｐＨ６〜７．５に制御されることが好ましく、温度は１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは約３０℃が選択される。また反応は、攪拌条件下で行うことができる。反応時間は酵素の使用量で調節することができるが、６時間以内、好ましくは４時間以内、最も好ましくは２時間以内で行うことができる。また、反応収率は９０％以上、好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上が例示される。また本発明の酵素の性質に関連するものとして、本発明の酵素により調製される一般式（１）の化合物の光学純度としては、通常９５％以上が期待でき、好ましくは９８％以上が期待でき、最も好ましくは９９％以上の光学純度の高い一般式（１）の化合物が製造され得る。
【００５５】
かくして得られた反応液から一般式（１）の化合物を取得するためには、反応液が１相の場合は酢酸エチルや酢酸ブチル等の溶剤で抽出して水洗後濃縮乾固することにより、また、２相系で反応を行う場合は有機溶媒層を分離し、水洗後濃縮乾固することにより、一般式（１）の化合物を取得できる。合成吸着樹脂を添加して反応させた場合は、反応終了後、ろ過により樹脂を回収し、該樹脂から、アセトン等の適当な溶剤で溶出後、濃縮乾固することにより一般式（１）の化合物を取得できる。本発明においては、光学純度や収率が高いので、さらなる目的物の原料として、そのまま使用されることができ、最終的な目的物の段階、あるいはその以前の適宜の段階において、精製することができる。また、一般式（１）の化合物を精製するのであれば、各種のクロマトグラフィーや光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等の公知の精製方法により、一般式（１）の化合物を精製することもできる。
さらに本発明は、前記の方法にて、一般式（２）の化合物を還元して生成せしめた一般式（１）の化合物を、アルカリ条件下で、一般式（６）
【００５６】
【化１４】
［式中、Ｒ１０および＊１は、前記とそれぞれ同じ意味を有する。］
で表されるエポキシ体となし、次いで該エポキシ体と一般式（７）
【００５７】
【化１５】
［式中、Ｒ２は、アミノ基の保護基を示し、Ａ’は、下記置換基
【００５８】
【化１６】
（式中、Ｘは、ＮＨ、ＯまたはＳを示し、Ｒ５１は、水素原子、保護基で保護された水酸基、保護基で保護されたアミノ基またはアセチルアミノ基を示す。＊２はＲ５１が水素原子でないときに不斉炭素原子を示す。）
のいずれかを示す。］
で表される化合物とを反応させることにより一般式（５）
【００５９】
【化１７】
［式中、Ｒ１０、Ｒ２、Ａ’および＊１は、前記とそれぞれ同じ意味を有する。］で表されるアミノアルコールを生成せしめて、必要に応じてさらにニトロ基を還元して、一般式（４）
【００６０】
【化１８】
［式中、Ｒ１０、Ｒ２、Ａ’および＊１は、前記とそれぞれ同じ意味を有する。］で表されるアニリン誘導体を生成せしめて、該アニリン誘導体とスルホン化剤とを反応させて、一般式（３）
【００６１】
【化１９】
［式中、 Ｒ３は、低級アルキル基またはベンジル基を示し、Ｒ１０、Ｒ２、Ａ’および＊１は、前記とそれぞれ同じ意味を有する。］
で表されるアミノアルコールを生成せしめて、調製せしめた一般式（５）、一般式（４）、および一般式（３）からなる一般式（Ｐ’）
【００６２】
【化２０】
［式中、Ｒ１０、Ｒ２、Ａ’および＊１は、前記とそれぞれ同じ意味を示し、Ｒは、ＮＨＳＯ２Ｒ３、ニトロ基、またはアミノ基を示し、Ｒ３は、低級アルキル基またはベンジル基を示す。但し、Ａ’におけるＸ、Ｒ５１、＊２は、前記とそれぞれ同じ意味を示す。］
で表される物質を、さらに一括または段階的に保護基を脱保護することにより、一般式（Ｐ）
【００６３】
【化２１】
［式中、Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、または水酸基を示し、Ｒは、ＮＨＳＯ２Ｒ３、ニトロ基、またはアミノ基を示す。Ｒ３および＊１は、前記とそれぞれ同じ意味を有する。Ａは下記置換基
【００６４】
【化２２】
（式中、ＸはＮＨ，ＯまたはＳのいずれかを示し、Ｒ５は、水素原子、水酸基、アミノ基またはアセチルアミノ基を示す。＊２はＲ５が水素原子でないときに不斉炭素原子を示す。）
のいずれかを示す。］
で表される化合物を生成せしめることを特徴とする、一般式（Ｐ）で表される化合物の製造方法に利用することができる。
【００６５】
一般式（２）の化合物を具体的に例示すると、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、２−ブロモ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−ブロモ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−ブロモ−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−ヨード−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、２−ヨード−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−ヨード−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−ヨード−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノン等が挙げられる。
【００６６】
一般式（１）の化合物を具体的に例示すると、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−クロロ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−クロロ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−クロロ−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ブロモ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ブロモ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ブロモ−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ヨード−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ヨード−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ヨード−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ヨード−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノール等が挙げられる。
【００６７】
具体的に一般式（５）の化合物を脱保護化した化合物を例示すると、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノール、およびその塩等が挙げられる。
【００６８】
さらに、具体的に一般式（４）を脱保護化した化合物を例示すると、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（３−アミノフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（３−アミノ−４−ヒドロキシフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（３−アミノ−４−クロロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（３−アミノ−４−ブロモフェニル）エタノール、およびその塩等が挙げられる。
【００６９】
さらに、具体的に一般式（３）を脱保護化した化合物を例示すると、２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−［（３−メチルスルホニルアミノ）フェニル］エタノール、２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−［（４−ヒドロキシ−３−メチルスルホニルアミノ）フェニル］エタノール、２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−［（４−クロロ−３−メチルスルホニルアミノ）フェニル］エタノール、２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−［（４−ブロモ−３−メチルスルホニルアミノ）フェニル］エタノール、およびその塩等が例示され、特に好ましい例として該化合物のＲ体が例示される。
【００７０】
上記の合成経路においては、特開平９−２４９６２３号公報（ＷＯ９７／２５３１１公報）およびＷＯ９９／０１４３１公報、さらにＷＯ２００１／１７９６２公報を参考にすることができる。すなわち、一般式（６）の化合物と一般式（７）の化合物とのカップリング反応は、一般式（６）の化合物のＲ１０が水素原子またはハロゲン原子である場合により好ましい。
【００７１】
一般式（Ｐ）の製造において、Ｒ１０およびＲ１としては、水素原子、ハロゲン原子、水酸基（Ｒ１０においては、保護化された水酸基である）が挙げられ、特に水素原子またはハロゲン原子が好ましい例として挙げられる。このハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、特に塩素原子、臭素原子が好ましい例として挙げられる。また、Ｒとしては、特にＮＨＳＯ２Ｒ３が好ましい例として挙げられる。Ｒ３としては、後述の低級アルキル基が好ましく、特にメチル基が好ましい。また、ベンジル基も好ましい例として例示される。
【００７２】
低級アルキル基の「低級」とは、炭素数１〜６の炭素を含む直鎖状もしくは分枝状の飽和炭化水素を意味し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等の直鎖状または分岐状のアルキル基および、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等の環状アルキルが好ましい例として挙げられ、特に好ましくはメチルが例示される。
【００７３】
Ｒ２は、アミノ基の保護基であるが、このアミノ基の保護基としては、例えば、アシル基、あるいは容易に脱保護可能なアラルキル基等が例示される。容易に脱保護可能なアラルキル基としては、例えば、炭素数７から１６の炭素を含むアラルキル基が用いられ、具体的には、ベンジル基、フェネチル基、３−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基等、および（１−ナフチル）メチル基、２−（１−ナフチル）エチル基、２−（２−ナフチル）エチル基等が挙げられ、フェニル基およびナフチル基上に、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子等の適当な置換基を適当な位置に有していても良い。特に好ましくはベンジル基が例示される。
Ｂとしては、特に塩素原子であることが好ましい。
【００７４】
Ｒ５としては水素原子が好ましい例として挙げられる。また、水酸基であることも好ましい。 Ｒ５１としては水素原子が好ましい例として挙げられる。またＲ５１としては、保護基で保護された水酸基であることが好ましい。
【００７５】
上記の一般式（３）、（４）、（５）、（６）、（Ｐ）、（Ｐ’）および（１）の各化合物において、＊１は不斉炭素原子を示し、２つの光学異性体が存在する。薬理活性の発現という点からは、例えば不斉炭素の好ましい配置は絶対配置Ｒが例示される。
【００７６】
＊２は不斉炭素原子を示し、２つの光学異性体が存在する。従って、これらの化合物は、光学的に純粋な異性体のみならず、任意の２つの異性体混合物も本製造方法の範囲内に包含される。
【００７７】
Ｒ１０における水酸基の保護基としては、通常使用されるものであれば特に限定されないが、例えば通常容易にかつ選択的に脱保護できる保護基として、アラルキル基、トリアルキルシリル基、アルコキシアルキル基、アシル基等が好ましく、さらに好ましい例としてメチル基およびベンジル基が例示される。これらの水酸基の保護基の導入、脱保護に際しては、成書（例えば、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）、ウッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）ら、プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ））に記載されている公知の方法が用いられるが、例えばベンジル基の導入においては、酸捕足剤の存在下、フェノールに塩化ベンジル、臭化ベンジル、ヨウ化ベンジル、またはスルホン酸ベンジル等のベンジル化剤を作用させる例が例示される。
【００７８】
水酸基の保護基の除去は、例えば、ベンジル基の場合にはラネーニッケル、パラジウム−炭素または水酸化パラジウム−炭素等の触媒を用い、水素化分解することにより行うことができる。また、アセチル基の除去は、例えば、酢酸エステルに炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を作用させ、加水分解することにより行うことができる。さらに、アミノ基の保護基の脱保護に際しては、成書（例えば、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）、ウッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）ら、プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ））に記載されている公知の方法が用いられるが、例えば、ベンジル基の場合にはラネーニッケル、パラジウム−炭素または水酸化パラジウム−炭素等の触媒を用い、水素化分解することにより除去することができる。その他に、文献（コリーダ（Ｍ．Ｋｏｒｅｅｄａ）ら、ジャーナル オブ オーガニック ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）４９巻、２０８１頁、１９８４年およびグーベルト（Ｓ．Ｇｕｂｅｒｔ）ら、シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）４巻、３１８頁、１９９１年）に記載されている方法に従い脱保護することもできる。
【００７９】
水酸基およびアミノ基の保護基の除去は、段階的に行なっても、一括して行なってもよいが、例えば、Ｒ１０がベンジルオキシ基であり、Ｒ２がベンジル基である組み合わせにおいては、同一条件により脱保護が可能であって、一括して脱保護することが好ましい。また、Ｒ１０がベンジルオキシ基であり、Ｒ２がアセチル基である組み合わせにおいては、例えば、Ｒ２のアセチル基を脱保護した後、Ｒ１０のベンジル基を脱保護する段階的な脱保護の例が挙げられる。但し、その順序はこれらに限定されるものでなく、化合物の物性等により適宜選択して行なうことが好ましい。各々の保護基を脱保護する際の条件は前述の通りである。またこれらは、特開平９−２４９６２３号公報に記載の方法を参考にすることができる。
【００８０】
一般式（３）、（４）、（５）、（Ｐ’）および（Ｐ）の化合物の塩には、公知の塩が挙げられ、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸二水素塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、メタンスルホン酸塩や、あるいは樟脳スルホン酸、マンデル酸、置換マンデル酸のような光学的に活性な酸との付加塩が含まれるが、医薬的に許容される塩が特に好ましい。一般式（３）、（４）、（５）、（Ｐ’）および（Ｐ）の化合物からその塩となす場合には、メタノール、エタノールなどのアルコール類に溶解し、当量もしくは数倍量の酸成分を加えることにより、それらの酸付加塩を得ることができる。用いれられる酸成分としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硫酸水素、リン酸二水素、クエン酸、マレイン酸、酒石酸、フマル酸、グルコン酸、メタンスルホン酸などの医薬的に許容される鉱酸または有機酸を挙げることができる。
【００８１】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンおよび反応生成物の定量は、高速液体クロマトグラフィーにより行った。分析例は、分析カラム ＣＯＳＭＯＳＩＬ ＯＤＳ−５（ジーエルサイエンス社製、４．６ｍｍＩＤＸ１５０ｍｍ）、溶離液 ５０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液：アセトニトリル＝６：４、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２５４ｎｍ、温度４０℃とした。この分析条件において、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンおよび２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールの保持時間はそれぞれ８．７分、５．４分であった。
【００８２】
２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノ−ルの光学純度は、光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析できる。たとえば、分析カラムに、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＳ（ダイセル社製、４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）を用い、ｎ−ヘキサン：エタノール＝８５：１５の溶離液、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２５４ｎｍ、温度１５℃の分析条件下で、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノ−ルは、Ｒ体が１７．５分、Ｓ体が１８．５分の保持時間で分離する。
【００８３】
反応生成物の同定は核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）で行った。ＡＣ−２００Ｐ（ＦＴ−ＮＭＲ、ＢＲＵＫＥＲ社）を用い、化学シフトはテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準としδ（ｐｐｍ）で、また結合定数はＪ（Ｈｚ）で示した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｐｒｅｃｏａｔｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（ＭＥＲＣＫ社製）を使用した。各実施例中に記載した溶媒で展開後、ＵＶ（２５４ｎｍ）照射、ニンヒドリンによる呈色により確認した。ＴＬＣのＲｆ値の測定に際しては、遊離アミンを用いた。有機溶媒の乾燥には、無水硫酸マグネシウム或いは無水硫酸ナトリウムを使用した。
【００８４】
実施例１ カルボニル不斉還元酵素の精製
ＹＭ培地（グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、ｐＨ６）２Ｌに、ロドトルラ ムシラギノウザ ＩＦＯ ０９０７（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８１）を植菌し、３０℃で２４時間培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、１００ｍｌの同緩衝液に懸濁した。菌体を冷却下でフレンチプレス（大岳製作所）により破砕し、さらに５０００ｇの遠心分離により無細胞抽出液を得た。
【００８５】
該無細胞抽出液を、硫安分画し、硫安濃度４０％以上６０％以下で塩析されたタンパク質の画分を取得し、これを、ＳＴＤ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１ｍＭ ＤＴＴ）に溶解し、透析膜（三光純薬株式会社製）にて脱塩後、ＳＴＤ緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ；アマシャムファルマシアバイオテク社）に吸着せしめ、塩化カリウム濃度を０．０Ｍから０．３Ｍへ直線的に増加させた前記緩衝液により溶出し、溶出液をフラクショネーションした。カルボニル不斉還元活性を有する画分を脱塩、限外ろ過により濃縮後、ＳＴＤ緩衝液で平衡化したアフィニティークロマトグラフィー（Ｒｅｄ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ；アマシャムファルマシアバイオテク社）に吸着せしめ、ＮＡＤＰ濃度を０．０ｍＭから２．０ｍＭへ直線的に増加させた緩衝液により溶出し、溶出液をフラクショネーションした。カルボニル不斉還元活性を有する画分を回収することにより精製された本発明のカルボニル不斉還元酵素を得た（４００Ｕ）。
精製されたカルボニル不斉還元酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後クマシーブレリエントブルーによりタンパク質染色を行い、単一バンドであることを確認した。
【００８６】
実施例２ 精製されたカルボニル不斉還元酵素の酵素化学的性質
実施例１で精製した不斉還元酵素は以下のような理化学的性質を有していた。尚、不斉還元活性の測定は、基本的には、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に補酵素ＮＡＤＰＨ１０ｍＭおよび酵素液０．０５ｍｌを含む０．４９ｍｌの反応液に、３０℃で５分間予備加熱後、ジメチルスルホキサイドに溶解した適宜の基質（例えば、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン等）２５０ｍＭを、０．０１ｍｌ添加し、３０℃で１０分間反応させ、ＮＡＤＰＨの減少を波長３４０ｎｍの吸光度の減少として測定した。
▲１▼作用：ＮＡＤＰＨを補酵素とし、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンを不斉還元し、光学純度９９．９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールを生成した。
▲２▼基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンと同様に各種カルボニル化合物を基質として反応を行った結果、表１に示す基質特異性を示した。
【００８７】
【表１】
【００８８】
▲３▼至適ｐＨ：ｐＨ３．０〜８．５の範囲で、上記方法によりアセトフェノンを基質とした場合の酵素活性を測定した。その結果、図１に示すように最高活性に対する相対活性が、ｐＨ４．０〜７．０では約９５％以上、ｐＨ３．０およびｐＨ８．０が約８０％程度であった。
▲４▼分子量：酵素の分子量測定はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより行った。その結果、本酵素の分子量は約２９０００であった。
▲５▼比活性：約２００Ｕ／ｍｇｐ
不斉還元活性の１Ｕは、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンを基質としたときの、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量と定義することができる。また、タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いて行った。
▲６▼補酵素の利用性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に補酵素ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを１０ｍＭおよび０．１Ｕの酵素を含む０．４９ｍｌの反応液に、３０℃で５分間予備加熱後、ジメチルスルホキサイドに溶解した２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン２５０ｍＭを、０．０１ｍｌ添加し、３０℃で１０分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少量によりＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの減少を測定した。結果を表２に示すように、本発明の不斉還元酵素は、ＮＡＤＰＨを利用するが、ＮＡＤＨを利用しないことがわかった。
【００８９】
【表２】
【００９０】
実施例３ カルボニル不斉還元酵素の遺伝子のクローニング
（１）カルボニル不斉還元酵素の部分アミノ酸配列の決定
実施例１で得られた精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、染色後に目的のバンドを切り出しトリプシンを含むトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて３５℃、２０時間の処理を行った。その後、溶液の全量を、逆相クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ ＱＡ（２．０Ｘ２５０ｍｍ，ＴＯＳＯＨ）、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％のグラジエント（溶離液Ａ：０．１％ ＴＦＡ、溶離液Ｂ：０．０９％ ＴＦＡ ｉｎ ９０％ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）、室温）に供して、断片ペプチドを分離した。
【００９１】
２種類の断片ペプチド、Ｐ１およびＰ２をプロテインシークエンサ（ＨＰ Ｇ１００５Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ヒューレットパッカード社製）を用いてアミノ酸配列決定を行った。その結果、Ｐ１およびＰ２のアミノ酸配列は以下の様になった。
Ｐ１：Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ（配列番号５）
Ｐ２：Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（配列番号６）
【００９２】
（２）部分アミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオチドプライマーの合成
Ｐ１のアミノ酸配列に対応する以下のオリゴヌクレオチドＳ１（２０ｍｅｒ）、５’−ＡＡＣ−ＧＣ［Ｃ，Ｇ，Ａ，Ｔ］−ＣＡ［Ｇ，Ａ］−［Ｃ，Ｔ］Ｔ［Ｃ，Ｇ，Ａ，Ｔ］−［Ｃ，Ｔ］Ｔ［Ｃ，Ｇ，Ａ，Ｔ］−ＧＡＣ−ＧＣ−３’（配列番号７）を合成し、センスプライマーとして使用した。
Ｐ２のアミノ酸配列に対応する以下のオリゴヌクレオチドＳ２（１９ｍｅｒ）、５’−ＧＧ［Ｃ，Ｇ，Ａ，Ｔ］−ＡＴＣ−ＧＡ［Ｃ，Ｔ］−ＡＣ［Ｃ，Ｇ，Ａ，Ｔ］−ＧＴ［Ｃ，Ｇ，Ａ，Ｔ］−ＡＴ［Ｃ，Ａ，Ｔ］−Ｇ−３’（配列番号８）を合成し、センスプライマーとして使用した。
【００９３】
（３）３’ＲＡＣＥ法による３’末端側ＤＮＡのクローニング
ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ロドトルラ ムシラギノウザＩＦＯ０９０７よりＴｏｔａｌ ＲＮＡを分離し、ｍＲＮＡ精製用キット（ＴａＫａＲａ社製；ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用いてｍＲＮＡを精製した。精製したｍＲＮＡを鋳型とし、合成したＳ１およびＳ２をＰＣＲプライマーとして、Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて３’ＲＡＣＥ法を行い、３’末端側ＤＮＡを増幅した。
【００９４】
増幅したＤＮＡ断片をＢｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて平滑末端化後、Ｔ４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）によりリン酸化し、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入しｐＡＺ０１プラスミドベクター作成した。クローニングした３’末端側ＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサ（Ｇｎｅｎ Ｒａｐｉｄ，アマシャムファルマシアバイオテク社製）により決定した。
【００９５】
（４）５’ＲＡＣＥ法による５’末端側ＤＮＡのクローニング
前記（３）で決定した３’末端側ＤＮＡ塩基配列よりＡ１（１６ｍｅｒ）５’−ＡＡＡ−ＧＴＴ−ＧＴＴ−ＣＡＴ−ＧＴＣ−Ｇ−３’（配列番号９）、Ａ２（２０ｍｅｒ）５’−ＡＣＧ−ＴＴＧ−ＧＴＧ−ＣＧＧ−ＡＡＧ−ＴＴＧ−ＧＣ−３’（配列番号１０）、Ａ３（２０ｍｅｒ）５’−ＧＡＣ−ＣＴＣ−ＣＧＡ−ＣＡＡ−ＡＧＡ−ＣＴＣ−ＣＧ−３’（配列番号１１）の３種のアンチセンスプライマーを作成した。
前記（３）と同様に精製したｍＲＮＡを鋳型として、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を用いて、５’末端側ＤＮＡ断片を増幅した。
【００９６】
増幅したＤＮＡ断片をＢｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて平滑末端化後、Ｔ４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）によりリン酸化し、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入しｐＡＺ０２プラスミドベクター作成した。クローニングした５’末端側ＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサ（Ｇｎｅｎ Ｒａｐｉｄ，アマシャムファルマシアバイオテク社製）により決定した。
【００９７】
（５）完全長のカルボニル不斉還元酵素遺伝子の取得
決定した２種類のｃＤＮＡクローンの塩基配列に共通する領域を解析するとともに、２種類の該ｃＤＮＡクローンの共通領域に存在するＨｉｎｃＩＩサイトで、５’末端側ＤＮＡ断片と３’末端側ＤＮＡ断片とを連結し、完全長のカルボニル不斉還元酵素遺伝子取得した。この完全長のカルボニル不斉還元酵素遺伝子は、配列番号１の塩基配列を有するものである。尚、推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００９８】
実施例４ 発現ベクターおよび形質転換体の作成
（１）ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターおよび形質転換体の作成
ｐＵＣ１１８のｌａｃプロモーターの下流のＫｐｎＩ／ＰｓｔＩサイト間に、カルボニル不斉還元酵素遺伝子である配列番号１の塩基配列の１位が連結するように挿入せしめた発現ベクターｐＡＺ０５を作成し、ｐＡＺ０５を用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
【００９９】
（２）高発現ベクターおよび形質転換体の作成
Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ由来のピルビン酸オキシダーゼ遺伝子のプロモーターｐｏｐの下流に、カルボニル不斉還元酵素遺伝子である配列番号１の塩基配列の１位が連結したＤＮＡ断片をｐＵＣ１３に挿入し、発現ベクターｐＡＺ０７を作成し、このｐＡＺ０７を用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
【０１００】
実施例５ ｐＡＺ０５で形質転換した大腸菌を用いたカルボニル不斉還元酵素の製造
ｐＡＺ０５で形質転換した大腸菌ＤＨ５αを１００ｍｌのＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ）に植菌し、３７℃で１６時間培養した後、１００ｍＭ ＩＰＴＧを１ｍｌ加え、更に８時間培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、２５ｍｌの可溶化液（４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％リゾチーム、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に懸濁し、３７℃で３０分間の処理を行い菌体を破砕し、さらに５０００ｇの遠心分離により無細胞抽出液を得た。さらに、無細胞抽出液を実施例１の方法で酵素を精製し、２５Ｕの発現産物を得た。
得られた発現産物は、実施例２で示したカルボニル不斉還元酵素と同等の諸性質を有していた。
【０１０１】
実施例６ 形質転換した大腸菌を用いた（Ｒ ） −２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールの製造１
ｐＡＺ０５で形質転換した大腸菌ＤＨ５αを２ｍｌのＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ）に植菌し、３７℃で１６時間培養した後、１００ｍＭ ＩＰＴＧを０．０２ｍｌ加え、更に８時間培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、０．５ｍｌの可溶化液（４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％リゾチーム、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に懸濁し、３７℃で３０分間の処理を行い菌体を破砕し、さらに５０００ｇの遠心分離により無細胞抽出液を得た。
【０１０２】
得られた無細胞抽出液０．１ｍｌに、５０ｍＭ ＮＡＤＰＨを０．１ｍｌ、５０ｍＭ リン酸緩衝液を０．８ｍｌを加え、さらに５０ｇ／ｌの２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンを含むジメチルスルホキサイド溶液を０．００４ｍｌ加え、３０℃で１０分間反応させた。反応終了後、１ｍｌの酢酸エチルを添加して反応生成物を抽出した。得られた酢酸エチル層を減圧下で溶媒を留去し、０．１９ｍｇの淡黄色油状の反応生成物を得た。
【０１０３】
反応生成物のＮＭＲ分析の結果、Ｈ１−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：３．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，４．５）、３．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，３．３）、５．０４（１Ｈ，ｍ）、６．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３）、７．６７（１Ｈ，ｍ）、７．９２（１Ｈ，ｍ）８．１７（１Ｈ，ｍ）、８．３２（１Ｈ，ｂｒｓ）であり、反応生成物は（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールと同定された。また、高速液体クロマトグラフィー分析の結果、反応率は約９６％、光学純度はＲ体が９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。
また、ベクターｐＵＣ１１８で形質転換した大腸菌ＤＨ５αを同様に処理したが（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールは検出されなかった。
【０１０４】
実施例７ 形質転換した大腸菌を用いた（Ｒ ） −２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールの製造２
実施例６に記載の方法により調製した洗浄菌体を、０．２ｍＭ ＮＡＤＰ＋、２５０ｍＭグルコース、１０Ｕ／ｍｌグルコースデヒドロゲナーゼ（シグマ社製：Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ由来）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌに懸濁し、２０ｇ／Ｌの２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンを含む酢酸ブチルを０．５ｍｌ添加し、３０℃、９０分間反応させた。反応後、遠心分離により酢酸ブチル層を分離し、得られた酢酸ブチル層を減圧下で溶媒を留去し、エタノールに溶解し、生成物量および生成物の光学純度を測定した。その結果、反応収率は約９６％、生成物の光学純度はＲ体が９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１０５】
実施例８ 枯草菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
（１）枯草菌の染色体ＤＮＡの精製
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６６３３）をＬＢ培地で培養し、菌体を調製した。Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｉｐ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、菌体からの染色体ＤＮＡの精製を行った。
【０１０６】
（２）枯草菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
文献（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６，２３８−２４３（１９８６））記載の塩基配列を元に、プライマーＳＧＤ１１６（２５ｍｅｒ）５’−ＡＡＴ−ＴＣＡ−ＴＡＡ−ＣＡＡ−ＡＴＧ−ＧＡＧ−ＧＡＧ−ＧＡＴ−Ｇ−３’（配列番号１２）およびプライマーＡＧＤ１１６（２２ｍｅｒ）５’−ＧＣＣ−ＴＡＡ−ＴＡＡ−ＡＧＡ−ＡＡＧ−ＣＧＡ−ＴＣＣ−Ａ−３’（配列番号１３）を合成した。前記（１）により調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行い特異的な増幅ＤＮＡを得た。増幅したＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサ（Ｇｎｅｎ Ｒａｐｉｄ，アマシャムファルマシアバイオテク社製）により決定した。その結果、配列番号３に示す塩基配列を得た。なお、その推定アミノ酸配列を配列番号４に示す。
【０１０７】
決定した塩基配列を元に、プライマーＳＧＤ１１７（３９ｍｅｒ）５’−ＴＣＴ−ＡＧＡ−ＡＴＧ−ＣＡＴ−ＡＴＣ−ＣＡＧ−ＡＴＴ−ＴＡＡ−ＡＡＧ−ＧＡＡ−ＡＡＧ−ＴＴＧ−ＴＣＧ−３’（配列番号１４）およびＡＧＤ１１７（３６ｍｅｒ）５’−ＧＡＡ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＡＣＣ−ＴＧＧ−ＧＴＣ−ＧＣＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＧＴＴ−ＴＴＡ−ＴＣＣ−３’（配列番号１５）を合成し、前記（１）により調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行い特異的な増幅ＤＮＡを得た。
【０１０８】
（３）グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターおよび形質転換体の作成前記（２）で得られたＤＮＡ断片の上流に、ｐｏｐプロモーターを連結し、ｐＵＣ１３に挿入して発現ベクターｐＡＺ０８を作成した。このｐＡＺ０８を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
【０１０９】
実施例９ 形質転換した大腸菌を用いた（Ｒ） − ２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールの製造３
実施例４（カルボニル不斉還元酵素生産形質転換体）および実施例８（グルコースデヒドロゲナーゼ生産形質転換体）で作成した形質転換体をそれぞれ１００ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、それぞれの菌体を調製した。
【０１１０】
上記で得られたカルボニル不斉還元酵素生産形質転換体（湿菌体１５ｇ）、およびグルコースデヒドロゲナーゼ生産形質転換体（湿菌体１５ｇ）とを、０．０２５ｍＭ ＮＡＤＰ＋、５０ｇ／Ｌ グルコース、を含む１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２．５Ｌに懸濁し、４０ｇ／Ｌの２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンを含む酢酸ブチルを２．５Ｌ添加し、３０℃で反応させた。ｐＨ７コントロール条件化で１２０分間反応後、遠心分離により酢酸ブチル層を分離した。得られた酢酸ブチル層を減圧下で溶媒を留去し、エタノールに溶解し、生成物量および生成物の光学純度を測定した。その結果、反応収率は１００％、生成物の光学純度はＲ体が９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１１１】
実施例１０ （Ｒ）−２−クロロ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノールの製造
実施例９に記載の方法に準じ、２−クロロ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノンより（Ｒ）−２−クロロ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノールを得た。
Ｒｆ＝０．３５（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：２）。
保持時間：２０．３分、
分析条件：カラム：キラルセルＡＳ（４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）（ダイセル社製）；移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝９／１；流速：０．５ｍｌ／分；検出波長：２５４ｎｍ；温度：４０℃。
【０１１２】
実施例１１ （Ｒ）−２−ブロモ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノールの製造
実施例９に記載の方法に準じ、２−ブロモ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノンより（Ｒ）−２−ブロモ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノールを得た。
Ｒｆ＝０．４１（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１）。
保持時間：３５．７分、
分析条件：カラム：キラルセルＯＢ（４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）（ダイセル社製）；移動相：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝７／３；流速：０．５ｍｌ／分；検出波長：２５４ｎｍ；温度：３５℃。
【０１１３】
実施例１２ （Ｒ）−２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールの製造
実施例９に記載の方法に準じ、２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンより（Ｒ）−２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールを得た。
Ｒｆ＝０．７２（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１）。
保持時間：９．０２分、
分析条件：カラム：キラルセルＡＤ（４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）（ダイセル社製）；移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝１／１；流速：０．５ｍｌ／分；検出波長：２５４ｎｍ；温度：３５℃。
【０１１４】
実施例１３ ２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−フルオロフェニル）エタノールの製造
実施例９に記載の方法に準じ、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−フルオロフェニル）エタノンより２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−フルオロフェニル）エタノールを得た。
保持時間：３０．６分、
分析条件：カラム：キラルセルＡＤ（４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）（ダイセル社製）；移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝１／１；流速：０．５ｍｌ／分；検出波長：２５４ｎｍ；温度：２５℃。光学純度：９９．５％ｅ．ｅ．。
【０１１５】
実施例１４ ２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メトキシフェニル）エタノールの製造
実施例９に記載の方法に準じ、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メトキシフェニル）エタノンより２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メトキシフェニル）エタノールを得た。
保持時間：２２．６分、
分析条件：カラム：キラルセルＯＪ（４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）（ダイセル社製）；移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝７／３；流速：０．５ｍｌ／分；検出波長：２５４ｎｍ；温度：２５℃。光学純度：１００％ｅ．ｅ．。
【０１１６】
実施例１５ ２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メチルフェニル）エタノールの製造
実施例９に記載の方法に準じ、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メチルフェニル）エタノンより２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メチルフェニル）エタノールを得た。
保持時間：３５．９分、
分析条件：カラム：キラルセルＯＪ−Ｈ（４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）（ダイセル社製）；移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝９／１；流速：０．５ｍｌ／分；検出波長：２５４ｎｍ；温度：２５℃。光学純度：１００％ｅ．ｅ．。
【０１１７】
参考例１ 三環性アミノアルコール誘導体の製造（ ＷＯ ０１／１７９６２ の実施例６−１０の方法）
【０１１８】
【化２３】
【０１１９】
上記化合物（８）（７６．８ｇ）を２−プロパノール（２０００ｍｌ）に溶解し、２規定水酸化ナトリウム水溶液（３００ｍｌ）を２０分かけて添加した。室温で３０分間撹拌した後、反応液を氷冷し攪拌しながら、氷冷した水（７５００ｍｌ）を１時間かけて添加した。氷冷下、３０分間撹拌し、析出した結晶を濾取し、室温下減圧乾燥することにより、淡黄色結晶として化合物（９）（５２．５ｇ）を得た。
融点：ｐ３８−３９℃、
Ｒｆ＝０．６０（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：２）、
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．３，２．５）、３．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，４．１）、４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．１，２．６）、７．６４−７．７９（２Ｈ，ｍ）、８．１１−８．２１（２Ｈ，ｍ）
ＨＰＬＣ：保持時間（６．９分）（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ＯＤＳ−５（ジーエルサイエンス社製；４．６ｍｍ ＩＤ×１５０ｍｍ）、溶媒：５０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液／アセトニトリル＝６／４、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２５４ｎｍ、２５℃）
ＨＰＬＣ：保持時間（Ｒ体：１６．１分）（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（ダイセル社製；４．６ｍｍ ＩＤ ×２５０ｍｍ）、溶媒：ｎ−ヘキサン／エタノール＝８５／１５、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２５４ｎｍ、３５℃）
尚、Ｓ体の保持時間は１３．８分であった。
【０１２０】
【化２４】
次いで、化合物（９）（３．２ｇ）と化合物（１０）（１２．３ｇ）、及び２−ブタノール（９６ｍｌ）の混合物を内温９５℃で８時間加熱撹拌した。冷却後、減圧下溶媒を留去して得られる残留物に酢酸エチル（３２０ｍｌ）、０．５規定塩化水素／２−プロパノール溶液（７７．５ｍｌ）を加え、０℃で１時間撹拌した。不溶物を濾取した後、濾液に飽和食塩水（３２０ｍｌ）を加え、分液して有機層を得た。さらに、この有機層を飽和重曹水（３２０ｍｌ）で洗浄後、乾燥し減圧下で溶媒を留去することにより、化合物（１１）（８．３５ｇ）を淡黄色アモルファスとして得た。
Ｒｆ＝０．６９（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１）、
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．７９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４）、２．９５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６）、３．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．９）、３．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．８）、４．０１−４．０８（２Ｈ，ｍ）、４．８６（２Ｈ，ｂｒｓ）、５．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０）、６．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．２）、６．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１）、７．０６−７．５９（５Ｈ，ｍ）、７．７７−８．１７（４Ｈ，ｍ）、１１．０６（１Ｈ，ｓ）
ＨＰＬＣ：保持時間（７．８分）（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライテスク社製；６．０ｍｍ ＩＤ×１５０ｍｍ）、溶媒：５ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液／メタノール＝２／８、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２５４ｎｍ、２５℃）
ＨＰＬＣ：保持時間（Ｒ体：７１．３分）（カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＪ−Ｒ（ダイセル社製；４．６ｍｍ ＩＤ ×１５０ｍｍ）、溶媒：０．５Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（過塩素酸によりｐＨ２に調整）／アセトニトリル＝６／４、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２３３ｎｍ、３５℃）
尚、Ｓ体の保持時間は６５．０分であった。
【０１２１】
【化２５】
【０１２２】
次に化合物（１１）（８．３５ｇ）のメタノール（１２５ｍｌ）溶液に酸化白金（３９ｍｇ、アルドリッチ社製）を加え、常圧の水素雰囲気下、室温で４時間撹拌した。触媒を濾過し、濾液を減圧下、溶媒留去し化合物（１２）（７．７４ｇ）を淡黄色アモルファスとして取得した。
Ｒｆ＝０．３６（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１）、
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１）、２．９７（２Ｈ，ｂｒｓ）、３．８３（２Ｈ，ｂｒｓ）、４．０５−４．０８（２Ｈ，ｍ）、４．５７（２Ｈ，ｂｒｓ）、４．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１）、４．９４（２Ｈ，ｂｒｓ）、６．４０−６．４７（１Ｈ，ｍ）、６．５７（１Ｈ，ｂｒｓ）、６．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．１）、６．８９−６．９６（２Ｈ，ｍ）、７．０６−７．４３（４Ｈ，ｍ）、７．９２−７．９９（２Ｈ，ｍ）、１１．０６（１Ｈ，ｓ）
ＨＰＬＣ：保持時間（３．４分）（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライテスク社製；６．０ｍｍ ＩＤ×１５０ｍｍ）、溶媒：５ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液／メタノール＝２／８、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２５４ｎｍ、２５℃）
ＨＰＬＣ：保持時間（Ｒ体：１０．４分）（カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＪ−Ｒ（ダイセル社製；４．６ｍｍ ＩＤ ×１５０ｍｍ）、溶媒：０．５Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（過塩素酸によりｐＨ２に調整）／アセトニトリル＝６／４、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２３３ｎｍ、３５℃）
尚、Ｓ体の保持時間は１２．５分であった。
【０１２３】
【化２６】
【０１２４】
得られた化合物（１２）（７．７４ｇ）のテトラヒドロフラン（７８ｍｌ）溶液にピリジン（１１ｍｌ、和光純薬社製）を加え、０℃に冷却した。次いでメタンスルホニルクロライド（１．５９ｍｌ、東京化成社製）を１５分かけて添加し、０℃で４時間撹拌した。反応液に酢酸エチル（２００ｍｌ）と１規定塩酸（２００ｍｌ）を加え、分液し、有機層を得た。有機層を水（２００ｍｌ）で２回、飽和重曹水（２００ｍｌ）、飽和食塩水（２００ｍｌ）で順次洗浄し、乾燥後、減圧下溶媒を留去し、化合物（１３）（９．０ｇ）を微橙色アモルファスとして得た。
Ｒｆ＝０．４０（メチルエチルケトン：トルエン＝１：２）、
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１）、２．９１（３Ｈ，ｓ）、２．９５−３．０１（２Ｈ，ｍ）、３．８０（２Ｈ，ｂｒｓ）、４．０２−４．０９（２Ｈ，ｍ）、４．６６−４．６９（２Ｈ，ｍ）、５．４７（１Ｈ，ｂｒｓ）、６．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．９）、６．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０）、７．０２−７．４５（７Ｈ，ｍ）、７．９３−８．００（２Ｈ，ｍ）、１１．０６（１Ｈ，ｓ）
ＨＰＬＣ：保持時間（３．１分）（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライテスク社製；６．０ｍｍ ＩＤ×１５０ｍｍ）、溶媒：５ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液／メタノール＝２／８、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２５４ｎｍ、２５℃）
ＨＰＬＣ：保持時間（Ｒ体：２１．７分）（カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＪ−Ｒ（ダイセル社製；４．６ｍｍ ＩＤ ×１５０ｍｍ）、溶媒：０．５Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（過塩素酸によりｐＨ２に調整）／アセトニトリル＝６／４、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２３３ｎｍ、３５℃）
尚、Ｓ体の保持時間は２７．７分であった。
【０１２５】
【化２７】
【０１２６】
次いで、得られた化合物（１３）（２．０ｇ）のエタノール（１００ｍｌ）溶液に１０％パラジウム−炭素（１００ｍｇ、メルク社製）を加え、常圧の水素雰囲気下、内温約７０℃で４時間撹拌した。冷却後、テトラヒドロフラン（４０ｍｌ）を加え、室温で３０分間撹拌後濾過し、残渣をテトラヒドロフラン（８ｍｌ）で洗浄した後、濾液と洗液を合わせて減圧下溶媒留去し、淡黄色固形物として化合物（１４）（１．２ｇ）を取得した。
ＨＰＬＣ：保持時間（６．６分）（カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８（ワイエムシー社製；４．６ｍｍ ＩＤ×１５０ｍｍ）、溶媒：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．９）／アセトニトリル＝７０／３０、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２５４ｎｍ、２５℃）
ＨＰＬＣ：保持時間（Ｒ体：２４．６分）（カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＪ−Ｒ（ダイセル社製；４．６ｍｍ ＩＤ ×１５０ｍｍ）、溶媒：０．５Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（過塩素酸によりｐＨ２に調整）／アセトニトリル＝６／４、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２３３ｎｍ、３５℃）
尚、Ｓ体の保持時間は２２．１分であった。
【０１２７】
実施例１６−２５ 三環性アミノアルコール誘導体の製造
参考例１の方法と同様の方法に準じて、本発明の方法を用いて製造された表３に記載の化合物１と化合物２とを反応せしめ、各工程を経て、表３に記載の生成物を製造した。なお、表３には、生成物として、式（Ｐ）におけるＲがＮＨＳＯ２ＣＨ３である化合物のみを記載したが、式（Ｐ）のＲがニトロ基、およびアミノ基もそれぞれ作成した。これらの物質は、それぞれ物性を確認し、正しく製造されていることが確認された。
【０１２８】
【表３】
【０１２９】
【発明の効果】
本発明によれば実施例に示すとおり、光学活性２−ハロ−１−（置換−３−ニトロフェニル）エタノールを、通常９９．９％ｅ．ｅ．以上の光学純度で効率よく製造することができる。
【０１３０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のカルボニル不斉還元酵素の至適ｐＨを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性アルコールの製造に有用なカルボニル還元酵素、およびそれをコードする遺伝子、さらに該酵素を利用した光学活性アルコール体の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性アルコール体は、各種の化合物の原料として利用され得る。例えば、後述の通り、一般式（Ｐ）
【０００３】
【化９】
【０００４】
【化１０】
のいずれかを示す。］
で表される三環性アミノアルコール誘導体またはその塩の中間体となることが知られている。上述の一般式（Ｐ）の化合物は、特開平９−２４９６２３号公報等に、詳細な製造法が開示され（例えば特許文献１及び２参照）、また、その化合物が、糖尿病、肥満、高脂血症等の治療および予防に極めて有用である旨が記載されている。
【０００５】
しかしながら、これらの先行技術において開示されている光学活性アルコールの製造方法は、キラル補助剤の存在下ボランを還元剤とするカルボニル基の還元反応が必要とされ、このキラル補助剤が、非常に高価で、調製が煩雑であり、しかも発火性がある等の問題点があり、工業的に実施することが困難なものであった。
【特許文献１】
国際公開第９７／２５３１１号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第９９／０１４３１号パンフレット
【特許文献３】
特開平１０−９４３９９号公報
【特許文献４】
特開平１１−２１５９９５号公報
【特許文献５】
特許第３０６７８１７号公報
【非特許文献１】
「ジャーナル オブ ケミカル ソサイエティー ケミカル コミュニケーションズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」
（英国） １９７５年 ｐ．４００
【非特許文献２】
「ジャーナル オブ オーガニック ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」 （米国） １９８０年 ｐ．３３５２−ｐ．３３５５
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
中間体として有用な光学活性アルコール体の製造法において、安全性があり、かつ生成物の光学純度や収率の高い工業的に実施可能な好ましい製造法が求められていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、不斉還元反応を酵素により行うべく鋭意研究を行った結果、一般式（２）の化合物を一般式（１）の化合物に効率よく不斉還元する新規な酵素を微生物より見出した。さらに、該酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え手法により取得し、その遺伝子の塩基配列を決定し、該酵素をコードする遺伝子が、発現制御が容易で、該酵素の高生産形質転換体の育種に使用できることを見出した。さらに研究を進めた結果、該酵素を用いた一般式（１）の化合物の好ましい合成方法を確立することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明としては、以下の発明が例示される。
【０００８】
［１］下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（ａ）下記の反応を触媒する（以下、「（２）→（１）反応式」と略することがある）。
【０００９】
【化１１】
【００１０】
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
（ｄ）至適ｐＨ：最高活性に対する相対活性が、ｐＨ４．０〜７．０では約９５％以上、ｐＨ３．０およびｐＨ８．０が約８０％程度である。
【００１１】
［２］下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するカルボニル不斉還元酵素。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素。
（ａ）「（２）→（１）反応式」の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
【００１２】
［３］下記の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかのカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列からなるＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（ａ）「（２）→（１）反応式」の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
【００１３】
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡがベクターに連結されていることを特徴とする組換えベクター。
［５］［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡが宿主細胞に導入され、形質転換せしめられたことを特徴とする形質転換体。
［６］下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素。
（ａ）「（２）→（１）反応式」の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
（ｄ）至適ｐＨ：最高活性に対する相対活性が、ｐＨ４．０〜７．０では約９５％以上、ｐＨ３．０およびｐＨ８．０が約８０％程度である。
【００１４】
［７］下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのカルボニル不斉還元酵素。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するカルボニル不斉還元酵素。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素。
（ａ）「（２）→（１）反応式」の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
【００１５】
［８］下記の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかのＤＮＡがコードするカルボニル不斉還元酵素。
（Ｃ）配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列からなるＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（ａ）「（２）→（１）反応式」の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
【００１６】
［９］［６］〜［８］のいずれかに記載のカルボニル不斉還元酵素を生産する能力を有するロドトルラ属に属する微生物、または［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡを導入して形質転換された形質転換体のいずれかを、培地で培養し、その培養物から該カルボニル還元酵素を採取することを特徴とする該酵素の製造法。
［１０］一般式（２）
【００１７】
【化１２】
で表された化合物を、［６］〜［８］のいずれかに記載のカルボニル不斉還元酵素、またはその酵素含有物、または該酵素を含有する微生物菌体、または［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡを導入して形質転換された形質転換体のいずれかと、内因性または添加されたＮＡＤＰＨの存在下で接触させて不斉還元反応せしめ、一般式（１）
【００１８】
【化１３】
で表された化合物を製造することを特徴とする一般式（１）の化合物の製造法。
【００１９】
［１１］該不斉還元反応を、［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡを導入して形質転換された形質転換体を用いることを特徴とする［１０］に記載の製造法。
［１２］該不斉還元反応に際して、一般式（２）の化合物の反応液中濃度が、１％（Ｗ／Ｖ）（１０ｇ／Ｌ）以上であることを特徴とする［１０］または［１１］に記載の製造法。
［１３］該不斉還元反応が、６時間以内の反応時間、収率が９０％以上であり、生成物の光学純度が９５％以上であることを特徴とする［１０］〜［１２］のいずれかに記載の製造法。
［１４］ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する酵素とその基質およびＮＡＤＰ＋を少なくとも含むＮＡＤＰＨ再生系を共存させることを特徴とする［１０］〜［１３］のいずれかに記載の製造法。
［１５］ＮＡＤＰ再生系がグルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含むものである、［１４］に記載の製造法。
【００２０】
［１６］該不斉還元反応が、水性媒体と、一般式（２）の化合物を溶解可能な有機溶媒とを合わせて用いることを特徴とする［１０］〜［１５］のいずれかに記載の製造法。
［１７］有機溶媒が、酢酸ブチルまたはメチルイソブチルケトンであることを特徴とする［１６］に記載の製造法。
［１８］該不斉還元反応時に、ｐＨをｐＨ３〜８．５に制御することを特徴とする［１０］〜［１７］のいずれかに記載の製造法。
［１９］該不斉還元反応時に、一般式（１）の化合物を吸着可能な合成吸着樹脂を、基質の重量に対して１〜５０倍の重量で添加することを特徴とする［１０］〜［１８］のいずれかに記載の製造法。
【００２１】
【発明の実施の形態】
従来、カルボニル不斉還元酵素として、２−ハロ−１−（置換フェニル）エタノンを不斉還元する酵素として、コリネバクテリウム シュードジフテリカム亜種ＳＴ−１０株由来の酵素（例えば特許文献３参照）、キャンディダ属由来のＳ１酵素およびＳ４酵素（例えば特許文献４参照）などが知られている。しかしながら、前者の酵素は添加する基質濃度が０．１％（Ｗ／Ｖ）以下と低い点および至適ｐＨの範囲が狭い点、後者の酵素は反応率が８０％に満たない点および至適ｐＨの範囲が狭い点において工業的に用いるには満足できるものではない。いずれにしても、これらの酵素が、一般式（２）の化合物を一般式（１）の化合物に不斉還元するとの報告はない。
【００２２】
また、光学活性アルコールの製造法として、キャンデイダ属やロドトルラ属等の微生物を用いて２−ハロ−１−（置換フェニル）エタノールから対応する光学活性ハロヒドリンを得る方法（例えば特許文献５参照）、また２−クロロアセトフェノンから（Ｒ）−２−クロロ−１−フェニルアルコールを得る方法としてパン酵母を用いる方法（例えば非特許文献１参照）やクリプトコッカス マセランス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）を用いる方法（例えば非特許文献２参照）などが知られている。しかしながらこれらの方法は、一般式（２）の化合物を一般式（１）の化合物に不斉還元する反応ではなく、また微生物の還元活性が弱く反応に２４時間以上を要する点や、微生物が還元反応の逆反応を触媒するアルコール脱水素活性を有する点や、反応生成物の光学純度９０％ｅ．ｅ．以下であるか、反応率が９０％に満たない点で満足できるものではない。また、微生物菌体、その処理物、もしくは粗酵素または精製酵素を用い上述の一般式（２）の化合物を不斉還元し、一般式（１）の化合物を得る製造方法は報告例がない。
【００２３】
本発明は、先に示した［６］−［８］に記載されたカルボニル不斉還元酵素を提供する。
先ず発明［６］に基づいて本発明のカルボニル不斉還元酵素を説明すると、本発明のカルボニル不斉還元酵素は、前述の「（２）→（１）反応式」の反応を触媒する。
【００２４】
Ｒ１０は、水素原子、ハロゲン原子、または保護化された水酸基が示され、特に水素原子が好ましい例として挙げられる。また、水酸基を保護する保護基としては、ベンジル基、またはメチル基が好ましい。なお、「（２）→（１）反応式」の反応を触媒するとの確認においては、保護基が、ベンジル基、またはメチル基である場合を想定することが好ましく、さらにベンジル基が特に好ましい例として挙げられる。また発明［１０］等の製造においては、場合によっては、Ｒ１０として水酸基であることもあり得る。Ｂは、塩素原子または臭素原子を示すが、塩素原子が好ましい例として挙げられる。＊１は不斉炭素原子を示す。光学活性体として（Ｒ）体が好ましい例として挙げられる。
【００２５】
本発明のカルボニル還元酵素の還元活性を測定するに際しては、例えば、補酵素ＮＡＤＰＨ（１０ｍＭ）および本発明のカルボニル還元酵素の溶液（０．０５ｍｌ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の反応液（０．４９ｍｌ）を３０℃で５分間予備加熱後、該反応液に、基質２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン（２５０ｍＭ）をジメチルスルホキサイド中に溶解させた溶解液０．０１ｍｌを添加し、３０℃で１０分間還元反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少量、すなわち、ＮＡＤＰＨの減少量を測定することにより、本発明のカルボニル還元酵素の還元活性を測定することができる。不斉還元活性の１Ｕは、上記の条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量と定義することができる。また、本発明のカルボニル還元酵素による還元が不斉還元であること、およびその光学純度を確認する場合には、反応生成物を光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより測定し、公知の光学活性のアルコール体の標品と比較して決定することができる。
【００２６】
本発明のカルボニル還元酵素の基質特異性としては、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しないことが挙げられる。
【００２７】
本発明のカルボニル不斉還元酵素の基質特異性は、上述の測定条件において、基質を各種変更してそれぞれの基質に対し不斉還元活性を有するか否かを測定することにより判断することができる。本発明のカルボニル不斉還元酵素の基質特異性としては、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンに対して不斉還元活性を示し、アセトフェノンに対しても不斉還元活性を示すが、例えば、次に示す化合物に対しても高い不斉還元活性を示すことが好ましい。ここで「高い不斉還元活性」としては、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンに対する相対活性が５０％以上であることが好ましい例として挙げられる。本発明のカルボニル不斉還元酵素は、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−フルオロフェニル）エタノンに対して高い不斉還元活性を示すことがさらに好ましく（例えば、相対活性９０％以上であることが好ましい）、２−ブロモ−１−（４−ニトロフェニル）エタノンや２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンに対して高い不斉還元活性を示すことがさらに好ましい。２−ブロモ−１−（４−ニトロフェニル）エタノンにおいては、例えば相対活性８０％以上であることが好ましく、２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンにおいては、例えば相対活性７０％以上であることが好ましい例として挙げられる。またさらに、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−クロロフェニル）エタノンに対して高い不斉還元活性を示すことが好ましく、例えば相対活性５５％以上であることが好ましい例として挙げられる。また、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メトキシフェニル）エタノンに対して不斉還元活性を示すことが好ましく、例えば相対活性４５％以上であることが好ましい例として挙げられる。さらに、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−ベンジルオキシフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メチルフェニル）エタノン、２−ブロモ−１−（２−ニトロフェニル）エタノンに対しても不斉還元活性を示すことがさらに好ましく、例えば相対活性４０％以上であることが好ましい例として挙げられる。
【００２８】
また、本発明のカルボニル不斉還元酵素は、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を示さない。アルコール脱水素活性は、前述（ａ）の「（２）→（１）反応」の逆反応である。例えば、ＮＡＤＰ＋存在下において本発明の酵素に、上記のアルコール体を接触させ、３４０ｎｍの吸光度の単位時間当たりの変化量（増加量）を指標として、ＮＡＤＰＨの変化量（増加量）を測定してアルコール脱水素活性を測定し、実質的に活性を有しないことを確認すればよい。尚、本明細書において、「実質的にアルコール脱水素活性を有しない（示さない）」とは、アルコール脱水素活性を有しないか、わずかな活性しか認められず、「（２）→（１）の反応式」の活性に対して無視できる程度であることと理解することができる。例えば、「実質的にアルコール脱水素活性を有しない」と判断するに際しては、反応終点において、アルコール体の添加量の５％以下の変換しか行わないことが好ましく、さらに好ましくは２％以下、特に好ましくは１％以下の変換である例が挙げられる。
【００２９】
本発明のカルボニル不斉還元酵素の補酵素の利用性は、補酵素としてＮＡＤＰＨを利用できるが、ＮＡＤＨは実質的に利用できない。例えば、補酵素ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ（１０ｍＭ）の存在下にて、本発明の酵素（０．１Ｕ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）からなる反応液（０．４９ｍｌ）を、３０℃で５分間予備加熱後、ジメチルスルホキサイドに溶解した基質２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン２５０ｍＭを０．０１ｍｌ添加し、３０℃で１０分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少量によりＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの減少を測定することにより、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨそれぞれの補酵素に対する、本発明のカルボニル不斉還元酵素の利用性が確認できる。また、本発明の酵素においては、ＮＡＤＨを実質的に利用できないが、「実質的に利用できない」とは、例えば、ＮＡＤＰＨ存在下における酵素活性（例えば上記の減少量等）の測定値を１００とした場合のＮＡＤＨ存在下の測定値の相対活性（相対比率）が、５％以下、好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．５％以下である場合が挙げられる。
【００３０】
本発明のカルボニル不斉還元酵素の至適ｐＨは、最高活性に対する相対活性が、ｐＨ４．０〜７．０では、約９０％以上、好ましくは約９５％以上が例示され、ｐＨ３．０およびｐＨ８．０では、約７０％以上、好ましくは約８０％程度である。
【００３１】
例えば、補酵素ＮＡＤＰＨ（１０ｍＭ）および本発明の酵素（０．１Ｕ）を含むｐＨ３．０〜９．０の各ｐＨの５０ｍＭリン酸緩衝液からなる反応液（０．４９ｍｌ）を、３０℃で５分間予備加熱後、基質２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン２５０ｍＭを含むジメチルスルホキサイド溶解液０．０１ｍｌを添加し、３０℃で１０分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少量によりＮＡＤＰＨの減少量を測定することにより、本発明の酵素の至適ｐＨが確認できる。最高活性とは、上述の測定により各ｐＨにおける測定値の最大の値を最高活性とする。本願実施例の酵素の最高活性を示すｐＨとしては、通常ｐＨ５−６付近が該当すると思われる。
【００３２】
また、本発明として発明［７］が例示される。すなわち、本発明のカルボニル不斉還元酵素のアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号２の１−２５１位のアミノ酸配列が好ましい例として挙げられる。また、本発明のカルボニル不斉還元酵素のアミノ酸配列としては、前述の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の理化学的性質を有する限り、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有していてもよい。配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、１〜３０個のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されているアミノ酸配列も好ましい例として挙げられ、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個である。なお、このような置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有するカルボニル不斉還元酵素は、公知の部位特異的変異導入法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法により、配列番号１の塩基配列の対応する部位に置換、欠失、または挿入を導入せしめたＤＮＡを用い、後述の通り、宿主に導入し発現させることにより得ることができる。
また、本発明として発明［８］が例示されるが、これは本発明のＤＮＡの説明において詳細に説明する。
【００３３】
上記のような理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素は、例えば、ロドトルラ属に属する微生物の培養物から精製することができる。特に財団法人発酵研究所において入手可能であるロドトルラ ムシラギノウザ ＩＦＯ ０９０７（Ｒｈｏｄｏｔｏｌｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ ＩＦＯ ０９０７）が本発明のカルボニル不斉還元酵素の生産菌として優れている。ＩＦＯ ０９０７はまた、国際寄託機関であるＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＣＢＳ）のカタログにもＣＢＳ ２３８２として収載されており、入手が可能である。また、新たに独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に２００２年９月１３日付けで寄託されたロドトルラ ムシラギノウザ ＩＦＯ０９０７（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８１）を利用することも好ましい。あるいはまた、上記菌株の人工または突然変異体を調製することもできる。後述に示すとおり、これらの微生物を培養し、適宜精製手段を組み合わせることにより、精製された本発明のカルボニル不斉還元酵素が取得できる。
【００３４】
本発明の酵素に関する配列情報を取得するためには、本件発明の酵素を精製後、ペプチダーゼ処理、例えばトリプシンを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で３５℃、２０時間処理することにより断片化し、逆相クロマトグラフィーによりペプチド断片を単離し、タンパク質シークエンサーによりアミノ酸配列の一部を決定することができる。
【００３５】
さらに本発明は、発明［１］−［３］に示されるとおり、上述のカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡである。具体的には、配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列からなるＤＮＡが例示される。本発明のＤＮＡは配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列に限定されるものではなく、この塩基配列を含むＤＮＡであればよい。また前記配列番号１の塩基配列の８０−８３２位と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡであっても、前述の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の理化学的性質を有する限り、本発明に包含される。すなわち、これらのＤＮＡを用いて本発明のカルボニル不斉還元酵素を発現することができる。ストリンジェントな条件下としては、例えばＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、マニュアル記載の条件（ｗａｓｈ：４２℃、０．５ｘＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）が例示される。ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、例えば、前述のストリンジェントな条件下、配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列における相補的な塩基配列の任意の、通常は少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個、特に好ましくは少なくとも１００個の連続した塩基配列を検出試料として、これにハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
【００３６】
本発明のカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡは、以下の方法によって得ることができる。本明細書において、特に記載がない限り当該分野で公知である遺伝子組換え技術、酵母および大腸菌での組み換えタンパク質の生産技術、分析法が採用される。
【００３７】
本発明のカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡは、本願明細書において開示される塩基配列、またはアミノ酸配列、場合によれば、前記した精製酵素から決定したアミノ酸配列等の配列情報にしたがって、本発明のカルボニル不斉還元酵素を含有する微生物、例えばロドトルラ ムシラギノウザ ＩＦＯ ０９０７（Ｒｈｏｄｏｔｏｌｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ ＩＦＯ ０９０７）、ＣＢＳ ２３８２またはＦＥＲＭ ＢＰ−８１８１から取得することができる。通常は、その菌体からｍＲＮＡを調製し、それを鋳型とし、合成されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、３’ｃＤＮＡ末端迅速増幅法および５’ｃＤＮＡ末端迅速増幅法（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｂｓ，ＲＡＣＥ法）（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８９９８−９００２，１９８８）により得ることができる。また、アミノ酸配列にしたがって合成されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、カルボニル不斉還元酵素生産菌の染色体ＤＮＡを制限酵素により消化したＤＮＡ断片、またはｃＤＮＡをファージやプラスミドに導入し、宿主を形質転換して得られるライブラリーから、プラークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーションなどにより本発明のカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡを得ることもできる。得られたＤＮＡは、プラスミドベクター、たとえばｐＵＣ１１８に挿入しクローニングし、ジデオキシ・ターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７４： ５４６３−５４６７， １９７７）のような周知の方法により塩基配列の決定を行うことができる。
【００３８】
このようにして調製された遺伝子は、その遺伝子を用いて形質転換した大腸菌宿主中の発現産物を、前記記載のカルボニル不斉還元活性測定法を用いて、カルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡであることを確認することができる。
【００３９】
さらに本発明は、上記のＤＮＡがベクターに連結されていることを特徴とする組換えベクターを提供する。
組換えベクターは、宿主微生物に適したプロモーターの下流に、上記方法で得られたＤＮＡの５’末端側が機能し得るように連結して、適当な発現用ベクターに組み込み調製することができる。
【００４０】
適切な発現ベクターとしては、宿主微生物内で複製増殖可能であれば特に制限されない。例えば、宿主として大腸菌を用いるのであれば、強力なプロモーター、たとえば、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｔ７やピルビン酸オキシダーゼ遺伝子のプロモーター（特許公報第２５７９５０６号）などを含むｐＵＣ系、ｐＧＥＸ系、ｐＥＴ系、ｐＴ７系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＫＫ系、ｐＢＳ系、ｐＢＣ系、ｐＣＡＬ系など通常大腸菌で使用される任意のベクターから選択できる。
【００４１】
さらに本発明は、上記のＤＮＡが宿主細胞に導入され、形質転換せしめられたことを特徴とする形質転換体を提供する。
形質転換体は、上記方法にて作成した発現ベクターを用い、適当な宿主微生物を形質転換することにより、発現させることができる。
【００４２】
宿主細胞としては、微生物、哺乳類細胞、および植物細胞などが含まれる。微生物を利用することが好ましく、例えば、大腸菌、バチルス属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ストレプトコッカス属、サッカロマイセス属、ピキア属などが例示されるが、本件の「（２）→（１）反応式」を邪魔し、または逆反応を触媒し、収率および光学選択性を低下させる天然由来の酵素等を包含しない性質を有することが好ましく、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２またはその誘導体が特に好ましい例として挙げられる。
【００４３】
宿主微生物への遺伝子の導入法としては、たとえば、形質転換、形質導入、接合伝達、またはエレクトロポレーションなどの当技術分野で周知の任意の常法によって、好ましい宿主に導入することができる。
【００４４】
さらに本発明である該カルボニル不斉還元酵素の製造法としては、前述の通り、該カルボニル不斉還元酵素を生産し得る微生物、例えば、ロドトルラ属の微生物、特に好ましくは、ロドトルラ ムシラギノウザ ＩＦＯ ０９０７（Ｒｈｏｄｏｔｏｌｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ ＩＦＯ ０９０７）、ＣＢＳ ２３８２またはＦＥＲＭ ＢＰ−８１８１の培養物から、公知の精製方法を適宜組み合わせて該酵素を取得することができるが、さらに、上述の通り、該カルボニル不斉還元酵素の遺伝子を用い形質転換された形質転換体から取得することもできる。
【００４５】
該酵素を取得するに当り、まず上記微生物や形質転換体を、通常これらの微生物が資化可能な栄養源を含む培地で培養することが好ましく、例えば、酵素や抗生物質などを生産する通常の方法で培養することができる。培養は、通常、液体培養でも固体培養でもよい。たとえば、グルコース、シュクロース等の炭水化物；ソルビトール、グリセロール等のアルコール；クエン酸、酢酸等の有機酸；大豆油等の炭素源またはこれらの混合物；酵母エキス、肉エキス、硫安、アンモニア等の含窒素無機有機窒素源；リン酸塩、マグネシウム、鉄、マンガン、カリ等の無機栄養源；およびビオチン、チアミン等のビタミン類を適宜混合した培地が用いられる。培養条件は、通常、好気条件下で行うことが好ましい。培養温度は、宿主微生物が生育し得る温度であれば特に制限はないが、通常、０℃〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃、さらに好ましくは約３７℃で行うことが例示される。また、培養途中のｐＨは宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はないが、通常、ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ５〜８、さらに好ましくはｐＨ６〜７で行うことが例示される。
【００４６】
次いで、このようにして得られた培養物からカルボニル不斉還元酵素を抽出し、粗製のカルボニル不斉還元酵素含有液を得ることができる。例示すれば、まず培養物を固液分離し、得られる湿菌体を、必要に応じてリン酸緩衝液やトリス塩酸緩衝液などの緩衝液に懸濁せしめ、次いで超音波処理、フレンチプレス処理やガラスビーズを用いる粉砕処理などの菌体破砕処理を適宜組み合わせて、菌体内からカルボニル不斉還元酵素を抽出し、粗製のカルボニル不斉還元酵素含有液を得ることができる。この粗製のカルボニル不斉還元酵素含有液を、必要により、公知のタンパク質、酵素などの単離、精製手段を用いることにより、さらに精製することができる。例えば、粗製のカルボニル不斉還元酵素含有液に、アセトン、エタノールなどの有機溶媒を加えて分別沈殿せしめるか、硫安などを加えて塩析せしめるかして、水溶液からカルボニル不斉還元酵素を含有する区分を沈殿せしめ回収する方法が例示される。またさらに、陰イオン交換、陽イオン交換、ゲル濾過、抗体やキレートを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて精製することができる。例えば、ジエチルアミノエチル−セファロースを用いた陰イオン、レッド−セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを用いて電気泳動的にほぼ単一のバンドにまで精製することができる。
【００４７】
また、発明［１０］に記載されているとおり、本発明の酵素を用いて、光学活性アルコールを製造することが出来る。この発明において、前述の本発明のカルボニル不斉還元酵素を用いるに際しては、本発明の酵素の作用を阻害しないかぎり、特別に精製程度等は限定されず、精製された本発明の酵素の他、その酵素含有物が用いられ、さらには、その酵素を生産する微生物やその酵素の遺伝子を導入して形質転換された形質転換体等を使用してもよい。微生物や形質転換体等を使用する場合には、菌体を利用してもよく、菌体としては、生菌体、もしくはアセトン処理または凍結乾燥等の処理を施した菌体を使用することができる。場合によっては、菌体破砕物や菌体抽出物等の酵素含有物となっていてもよい。勿論、酵素や菌体、酵素含有物等は、カラムにおいて充填されていてもよく、公知の方法により、担体に固定化されていてもよい。
【００４８】
本発明の反応にはＮＡＤＰＨが必要とされるが、微生物、または形質転換体を使用する場合等において、内因性ＮＡＤＰＨが十分量であれば特に問題ないが、予め十分量のＮＡＤＰＨを存在せしめておくか、または、ＮＡＤＰＨを再生することができる反応系（ＮＡＤＰＨ再生系）を利用することが好ましい。
【００４９】
ＮＡＤＰＨ再生系を構築するには、通常、ＮＡＤＰ＋を利用してＮＡＤＰＨを生成する酵素、その基質、およびＮＡＤＰ＋を存在せしめればよい。ＮＡＤＰＨ再生系は、本発明のカルボニル不斉還元酵素の活性に見合う量を供給できる程度に適宜組み合わせることが好ましい。ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する酵素としては、たとえば、ＮＡＤＰ＋を要求するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１１９）やアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１）を用いることができる。具体的には、ＮＡＤＰ＋を要求するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１１９）としては、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のグルコースデヒドロゲナーゼが例示され、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ由来のグルコースデヒドロゲナーゼはシグマ社より販売されており利用し易い。また、ＮＡＤＰ＋を要求するアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２）としては、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ由来のアルコールデヒドロゲナーゼが例示される。これらの酵素は、精製酵素、粗酵素であってもよく、さらに、これらの酵素を含有する微生物やまたはその処理物等であってもよい。また、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する上述の酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換体を使用することもでき、例えば、配列番号３に示すＮＡＤＰ＋を要求するグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、微生物、好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２またはその誘導体に導入した形質転換体は、本発明において特に有用である。さらに、ＮＡＤＰＨ再生系を構成する酵素をコードするＤＮＡと、本発明のカルボニル不斉還元酵素のＤＮＡとを導入し共発現せしめた形質転換体を使用することも好ましい。また、ＮＡＤＰＨ再生用の酵素の基質として、グルコースデヒドロゲナーゼの場合はグルコースを、アルコールデヒドロゲナーゼの場合はエタノールなどを用いればよく、一般式（２）の化合物に対し、モル比で等量以上適宜添加することが例示される。なお、ＮＡＤＰＨ再生系を利用するに際しても、その再生系に供するＮＡＤＰ＋は内因性のものを利用する場合もあるが、不足するのであれば、さらに添加することが好ましい。添加、または存在せしめるＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤＰＨの量は、通常０．０２ｍＭ以下、好ましくは０．０１ｍＭ以下、より好ましくは０．００１ｍＭ以下が例示される。
【００５０】
ＮＡＤＰＨ再生系を利用しない場合には、添加、または存在せしめるＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤＰＨの量は、通常、基質と等モル以上添加することが好ましく、例えば、２倍モル以上、好ましくは５倍モル以上、さらに好ましくは１０倍モル以上を添加する例が挙げられる。添加量の上限としては特に限定されないが、例えば、１００倍モル以下、好ましくは、２０倍モル以下が挙げられる。また、製造においては、コスト等の要因を重視することも多く、製造現場においては、通常１−１０倍モル、好ましくは１．５−５倍モル、特に好ましくは約２倍モル程度が例示される。
【００５１】
本発明の反応を行うに際して、一般式（２）の化合物を添加する場合、その化合物を固体のまま添加することもできるが、反応に影響を与えないような適当量の溶媒、たとえばジメチルスルホキサイド、ジメチルホルムアミド、メチルイソブチルケトンまたは酢酸ブチルに溶解して添加することができる。また、場合によっては、さらに水溶性溶媒が混入されていてもよい。添加方法としては、反応の始めに一括添加することができるが、分割添加または連続添加してもよい。
【００５２】
また、一般式（２）の化合物から一般式（１）の化合物を製造するに際しては、通常の酵素反応の通り、緩衝液や蒸留水等の水溶液中にて反応させることが好ましいが、該反応を阻害しない限り、その他の溶媒を利用することも可能である。特に、一般式（２）の化合物を溶解し得る有機溶媒を含有せしめた水溶性溶媒を用いることができるが、特に、水に溶解しにくい有機溶媒を水とともに共存せしめ、２相系となすことが好ましい。例えば、緩衝液や蒸留水等の水溶液に対して、メチルイソブチルケトン、または酢酸ブチルをそれぞれ用いる２相系が特に好ましい例として挙げられる。有機溶媒は、適宜の時期に添加することができるが、上述の一般式（２）の化合物とともに添加してもよく、前記したとおり、一般式（２）の化合物を添加する際に、溶解せしめるために用いられる有機溶媒として添加されることも好ましい。また任意の段階で追加することも可能である。有機溶媒と水性媒体の比率は、特に限定されないが、一般式（２）の物性により変化せしめることも好ましく、例えば、通常は１：１０〜１０：１が例示され、好ましくは１：４〜４：１、または１：２〜２：１、場合により約１：１付近が例示される。
【００５３】
また本発明の反応には、より高い光学純度の一般式（１）の化合物を得るために、反応液中に合成吸着樹脂を添加することもできる。合成吸着樹脂の材質は、一般式（１）の化合物を吸着し、反応を阻害しないものであれば特に限定されないが、中間極性のアクリル系のものが好ましく、例えば、アンバーライトＸＡＤ−７ＨＰ（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａｓｓ社）、ダイアイオンＨＰ−２ＭＧ（三菱化学工業株式会社）等を用いることができる。合成吸着樹脂は、基質の重量に対して、通常、１倍の重量以上、好ましくは２倍の重量以上、より好ましくは５倍の重量以上の添加が例示される。また、上限として特に限定されないが、基質の重量に対して、通常、５０倍の重量以下、好ましくは２０倍の重量以下、より好ましくは１０倍の重量以下を添加することができる。
【００５４】
本発明の一般式（１）の製造方法においては、一般式（２）の化合物を１０ｇ／Ｌ（１％ｗ／ｖ）以上、好ましくは２０ｇ／Ｌ（２％ｗ／ｖ）以上、より好ましくは５０ｇ／Ｌ（５％ｗ／ｖ）以上添加することができる。反応中のｐＨは、通常ｐＨ３〜８．５、好ましくはｐＨ５〜８、より好ましくはｐＨ６〜７．５に制御されることが好ましく、温度は１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは約３０℃が選択される。また反応は、攪拌条件下で行うことができる。反応時間は酵素の使用量で調節することができるが、６時間以内、好ましくは４時間以内、最も好ましくは２時間以内で行うことができる。また、反応収率は９０％以上、好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上が例示される。また本発明の酵素の性質に関連するものとして、本発明の酵素により調製される一般式（１）の化合物の光学純度としては、通常９５％以上が期待でき、好ましくは９８％以上が期待でき、最も好ましくは９９％以上の光学純度の高い一般式（１）の化合物が製造され得る。
【００５５】
かくして得られた反応液から一般式（１）の化合物を取得するためには、反応液が１相の場合は酢酸エチルや酢酸ブチル等の溶剤で抽出して水洗後濃縮乾固することにより、また、２相系で反応を行う場合は有機溶媒層を分離し、水洗後濃縮乾固することにより、一般式（１）の化合物を取得できる。合成吸着樹脂を添加して反応させた場合は、反応終了後、ろ過により樹脂を回収し、該樹脂から、アセトン等の適当な溶剤で溶出後、濃縮乾固することにより一般式（１）の化合物を取得できる。本発明においては、光学純度や収率が高いので、さらなる目的物の原料として、そのまま使用されることができ、最終的な目的物の段階、あるいはその以前の適宜の段階において、精製することができる。また、一般式（１）の化合物を精製するのであれば、各種のクロマトグラフィーや光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等の公知の精製方法により、一般式（１）の化合物を精製することもできる。
さらに本発明は、前記の方法にて、一般式（２）の化合物を還元して生成せしめた一般式（１）の化合物を、アルカリ条件下で、一般式（６）
【００５６】
【化１４】
で表されるエポキシ体となし、次いで該エポキシ体と一般式（７）
【００５７】
【化１５】
【００５８】
【化１６】
のいずれかを示す。］
で表される化合物とを反応させることにより一般式（５）
【００５９】
【化１７】
【００６０】
【化１８】
【００６１】
【化１９】
で表されるアミノアルコールを生成せしめて、調製せしめた一般式（５）、一般式（４）、および一般式（３）からなる一般式（Ｐ’）
【００６２】
【化２０】
で表される物質を、さらに一括または段階的に保護基を脱保護することにより、一般式（Ｐ）
【００６３】
【化２１】
【００６４】
【化２２】
のいずれかを示す。］
で表される化合物を生成せしめることを特徴とする、一般式（Ｐ）で表される化合物の製造方法に利用することができる。
【００６５】
一般式（２）の化合物を具体的に例示すると、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、２−ブロモ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−ブロモ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−ブロモ−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−ヨード−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、２−ヨード−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−ヨード−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノン、２−ヨード−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノン等が挙げられる。
【００６６】
一般式（１）の化合物を具体的に例示すると、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−クロロ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−クロロ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−クロロ−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ブロモ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ブロモ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ブロモ−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ヨード−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ヨード−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ヨード−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−ヨード−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノール等が挙げられる。
【００６７】
具体的に一般式（５）の化合物を脱保護化した化合物を例示すると、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（４−ブロモ−３−ニトロフェニル）エタノール、およびその塩等が挙げられる。
【００６８】
さらに、具体的に一般式（４）を脱保護化した化合物を例示すると、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（３−アミノフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（３−アミノ−４−ヒドロキシフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（３−アミノ−４−クロロフェニル）エタノール、（Ｒ）−２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−（３−アミノ−４−ブロモフェニル）エタノール、およびその塩等が挙げられる。
【００６９】
さらに、具体的に一般式（３）を脱保護化した化合物を例示すると、２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−［（３−メチルスルホニルアミノ）フェニル］エタノール、２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−［（４−ヒドロキシ−３−メチルスルホニルアミノ）フェニル］エタノール、２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−［（４−クロロ−３−メチルスルホニルアミノ）フェニル］エタノール、２−［Ｎ−［２−（９Ｈ−カルバゾール−２−イルオキシ）エチル］］アミノ−１−［（４−ブロモ−３−メチルスルホニルアミノ）フェニル］エタノール、およびその塩等が例示され、特に好ましい例として該化合物のＲ体が例示される。
【００７０】
上記の合成経路においては、特開平９−２４９６２３号公報（ＷＯ９７／２５３１１公報）およびＷＯ９９／０１４３１公報、さらにＷＯ２００１／１７９６２公報を参考にすることができる。すなわち、一般式（６）の化合物と一般式（７）の化合物とのカップリング反応は、一般式（６）の化合物のＲ１０が水素原子またはハロゲン原子である場合により好ましい。
【００７１】
一般式（Ｐ）の製造において、Ｒ１０およびＲ１としては、水素原子、ハロゲン原子、水酸基（Ｒ１０においては、保護化された水酸基である）が挙げられ、特に水素原子またはハロゲン原子が好ましい例として挙げられる。このハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、特に塩素原子、臭素原子が好ましい例として挙げられる。また、Ｒとしては、特にＮＨＳＯ２Ｒ３が好ましい例として挙げられる。Ｒ３としては、後述の低級アルキル基が好ましく、特にメチル基が好ましい。また、ベンジル基も好ましい例として例示される。
【００７２】
低級アルキル基の「低級」とは、炭素数１〜６の炭素を含む直鎖状もしくは分枝状の飽和炭化水素を意味し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等の直鎖状または分岐状のアルキル基および、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等の環状アルキルが好ましい例として挙げられ、特に好ましくはメチルが例示される。
【００７３】
Ｒ２は、アミノ基の保護基であるが、このアミノ基の保護基としては、例えば、アシル基、あるいは容易に脱保護可能なアラルキル基等が例示される。容易に脱保護可能なアラルキル基としては、例えば、炭素数７から１６の炭素を含むアラルキル基が用いられ、具体的には、ベンジル基、フェネチル基、３−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基等、および（１−ナフチル）メチル基、２−（１−ナフチル）エチル基、２−（２−ナフチル）エチル基等が挙げられ、フェニル基およびナフチル基上に、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子等の適当な置換基を適当な位置に有していても良い。特に好ましくはベンジル基が例示される。
Ｂとしては、特に塩素原子であることが好ましい。
【００７４】
Ｒ５としては水素原子が好ましい例として挙げられる。また、水酸基であることも好ましい。 Ｒ５１としては水素原子が好ましい例として挙げられる。またＲ５１としては、保護基で保護された水酸基であることが好ましい。
【００７５】
上記の一般式（３）、（４）、（５）、（６）、（Ｐ）、（Ｐ’）および（１）の各化合物において、＊１は不斉炭素原子を示し、２つの光学異性体が存在する。薬理活性の発現という点からは、例えば不斉炭素の好ましい配置は絶対配置Ｒが例示される。
【００７６】
＊２は不斉炭素原子を示し、２つの光学異性体が存在する。従って、これらの化合物は、光学的に純粋な異性体のみならず、任意の２つの異性体混合物も本製造方法の範囲内に包含される。
【００７７】
Ｒ１０における水酸基の保護基としては、通常使用されるものであれば特に限定されないが、例えば通常容易にかつ選択的に脱保護できる保護基として、アラルキル基、トリアルキルシリル基、アルコキシアルキル基、アシル基等が好ましく、さらに好ましい例としてメチル基およびベンジル基が例示される。これらの水酸基の保護基の導入、脱保護に際しては、成書（例えば、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）、ウッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）ら、プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ））に記載されている公知の方法が用いられるが、例えばベンジル基の導入においては、酸捕足剤の存在下、フェノールに塩化ベンジル、臭化ベンジル、ヨウ化ベンジル、またはスルホン酸ベンジル等のベンジル化剤を作用させる例が例示される。
【００７８】
水酸基の保護基の除去は、例えば、ベンジル基の場合にはラネーニッケル、パラジウム−炭素または水酸化パラジウム−炭素等の触媒を用い、水素化分解することにより行うことができる。また、アセチル基の除去は、例えば、酢酸エステルに炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を作用させ、加水分解することにより行うことができる。さらに、アミノ基の保護基の脱保護に際しては、成書（例えば、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）、ウッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）ら、プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ））に記載されている公知の方法が用いられるが、例えば、ベンジル基の場合にはラネーニッケル、パラジウム−炭素または水酸化パラジウム−炭素等の触媒を用い、水素化分解することにより除去することができる。その他に、文献（コリーダ（Ｍ．Ｋｏｒｅｅｄａ）ら、ジャーナル オブ オーガニック ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）４９巻、２０８１頁、１９８４年およびグーベルト（Ｓ．Ｇｕｂｅｒｔ）ら、シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）４巻、３１８頁、１９９１年）に記載されている方法に従い脱保護することもできる。
【００７９】
水酸基およびアミノ基の保護基の除去は、段階的に行なっても、一括して行なってもよいが、例えば、Ｒ１０がベンジルオキシ基であり、Ｒ２がベンジル基である組み合わせにおいては、同一条件により脱保護が可能であって、一括して脱保護することが好ましい。また、Ｒ１０がベンジルオキシ基であり、Ｒ２がアセチル基である組み合わせにおいては、例えば、Ｒ２のアセチル基を脱保護した後、Ｒ１０のベンジル基を脱保護する段階的な脱保護の例が挙げられる。但し、その順序はこれらに限定されるものでなく、化合物の物性等により適宜選択して行なうことが好ましい。各々の保護基を脱保護する際の条件は前述の通りである。またこれらは、特開平９−２４９６２３号公報に記載の方法を参考にすることができる。
【００８０】
一般式（３）、（４）、（５）、（Ｐ’）および（Ｐ）の化合物の塩には、公知の塩が挙げられ、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸二水素塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、メタンスルホン酸塩や、あるいは樟脳スルホン酸、マンデル酸、置換マンデル酸のような光学的に活性な酸との付加塩が含まれるが、医薬的に許容される塩が特に好ましい。一般式（３）、（４）、（５）、（Ｐ’）および（Ｐ）の化合物からその塩となす場合には、メタノール、エタノールなどのアルコール類に溶解し、当量もしくは数倍量の酸成分を加えることにより、それらの酸付加塩を得ることができる。用いれられる酸成分としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硫酸水素、リン酸二水素、クエン酸、マレイン酸、酒石酸、フマル酸、グルコン酸、メタンスルホン酸などの医薬的に許容される鉱酸または有機酸を挙げることができる。
【００８１】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンおよび反応生成物の定量は、高速液体クロマトグラフィーにより行った。分析例は、分析カラム ＣＯＳＭＯＳＩＬ ＯＤＳ−５（ジーエルサイエンス社製、４．６ｍｍＩＤＸ１５０ｍｍ）、溶離液 ５０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液：アセトニトリル＝６：４、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２５４ｎｍ、温度４０℃とした。この分析条件において、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンおよび２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールの保持時間はそれぞれ８．７分、５．４分であった。
【００８２】
２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノ−ルの光学純度は、光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析できる。たとえば、分析カラムに、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＳ（ダイセル社製、４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）を用い、ｎ−ヘキサン：エタノール＝８５：１５の溶離液、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２５４ｎｍ、温度１５℃の分析条件下で、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノ−ルは、Ｒ体が１７．５分、Ｓ体が１８．５分の保持時間で分離する。
【００８３】
反応生成物の同定は核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）で行った。ＡＣ−２００Ｐ（ＦＴ−ＮＭＲ、ＢＲＵＫＥＲ社）を用い、化学シフトはテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準としδ（ｐｐｍ）で、また結合定数はＪ（Ｈｚ）で示した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｐｒｅｃｏａｔｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（ＭＥＲＣＫ社製）を使用した。各実施例中に記載した溶媒で展開後、ＵＶ（２５４ｎｍ）照射、ニンヒドリンによる呈色により確認した。ＴＬＣのＲｆ値の測定に際しては、遊離アミンを用いた。有機溶媒の乾燥には、無水硫酸マグネシウム或いは無水硫酸ナトリウムを使用した。
【００８４】
実施例１ カルボニル不斉還元酵素の精製
ＹＭ培地（グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、ｐＨ６）２Ｌに、ロドトルラ ムシラギノウザ ＩＦＯ ０９０７（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８１）を植菌し、３０℃で２４時間培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、１００ｍｌの同緩衝液に懸濁した。菌体を冷却下でフレンチプレス（大岳製作所）により破砕し、さらに５０００ｇの遠心分離により無細胞抽出液を得た。
【００８５】
該無細胞抽出液を、硫安分画し、硫安濃度４０％以上６０％以下で塩析されたタンパク質の画分を取得し、これを、ＳＴＤ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１ｍＭ ＤＴＴ）に溶解し、透析膜（三光純薬株式会社製）にて脱塩後、ＳＴＤ緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ；アマシャムファルマシアバイオテク社）に吸着せしめ、塩化カリウム濃度を０．０Ｍから０．３Ｍへ直線的に増加させた前記緩衝液により溶出し、溶出液をフラクショネーションした。カルボニル不斉還元活性を有する画分を脱塩、限外ろ過により濃縮後、ＳＴＤ緩衝液で平衡化したアフィニティークロマトグラフィー（Ｒｅｄ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ；アマシャムファルマシアバイオテク社）に吸着せしめ、ＮＡＤＰ濃度を０．０ｍＭから２．０ｍＭへ直線的に増加させた緩衝液により溶出し、溶出液をフラクショネーションした。カルボニル不斉還元活性を有する画分を回収することにより精製された本発明のカルボニル不斉還元酵素を得た（４００Ｕ）。
精製されたカルボニル不斉還元酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後クマシーブレリエントブルーによりタンパク質染色を行い、単一バンドであることを確認した。
【００８６】
実施例２ 精製されたカルボニル不斉還元酵素の酵素化学的性質
実施例１で精製した不斉還元酵素は以下のような理化学的性質を有していた。尚、不斉還元活性の測定は、基本的には、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に補酵素ＮＡＤＰＨ１０ｍＭおよび酵素液０．０５ｍｌを含む０．４９ｍｌの反応液に、３０℃で５分間予備加熱後、ジメチルスルホキサイドに溶解した適宜の基質（例えば、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン等）２５０ｍＭを、０．０１ｍｌ添加し、３０℃で１０分間反応させ、ＮＡＤＰＨの減少を波長３４０ｎｍの吸光度の減少として測定した。
▲１▼作用：ＮＡＤＰＨを補酵素とし、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンを不斉還元し、光学純度９９．９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールを生成した。
▲２▼基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンと同様に各種カルボニル化合物を基質として反応を行った結果、表１に示す基質特異性を示した。
【００８７】
【表１】
▲３▼至適ｐＨ：ｐＨ３．０〜８．５の範囲で、上記方法によりアセトフェノンを基質とした場合の酵素活性を測定した。その結果、図１に示すように最高活性に対する相対活性が、ｐＨ４．０〜７．０では約９５％以上、ｐＨ３．０およびｐＨ８．０が約８０％程度であった。
▲４▼分子量：酵素の分子量測定はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより行った。その結果、本酵素の分子量は約２９０００であった。
▲５▼比活性：約２００Ｕ／ｍｇｐ
不斉還元活性の１Ｕは、２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンを基質としたときの、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量と定義することができる。また、タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いて行った。
▲６▼補酵素の利用性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に補酵素ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを１０ｍＭおよび０．１Ｕの酵素を含む０．４９ｍｌの反応液に、３０℃で５分間予備加熱後、ジメチルスルホキサイドに溶解した２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン２５０ｍＭを、０．０１ｍｌ添加し、３０℃で１０分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少量によりＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの減少を測定した。結果を表２に示すように、本発明の不斉還元酵素は、ＮＡＤＰＨを利用するが、ＮＡＤＨを利用しないことがわかった。
【００８９】
【表２】
実施例３ カルボニル不斉還元酵素の遺伝子のクローニング
（１）カルボニル不斉還元酵素の部分アミノ酸配列の決定
実施例１で得られた精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、染色後に目的のバンドを切り出しトリプシンを含むトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて３５℃、２０時間の処理を行った。その後、溶液の全量を、逆相クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ ＱＡ（２．０Ｘ２５０ｍｍ，ＴＯＳＯＨ）、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％のグラジエント（溶離液Ａ：０．１％ ＴＦＡ、溶離液Ｂ：０．０９％ ＴＦＡ ｉｎ ９０％ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）、室温）に供して、断片ペプチドを分離した。
【００９１】
２種類の断片ペプチド、Ｐ１およびＰ２をプロテインシークエンサ（ＨＰ Ｇ１００５Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ヒューレットパッカード社製）を用いてアミノ酸配列決定を行った。その結果、Ｐ１およびＰ２のアミノ酸配列は以下の様になった。
Ｐ１：Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ（配列番号５）
Ｐ２：Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（配列番号６）
【００９２】
（２）部分アミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオチドプライマーの合成
Ｐ１のアミノ酸配列に対応する以下のオリゴヌクレオチドＳ１（２０ｍｅｒ）、５’−ＡＡＣ−ＧＣ［Ｃ，Ｇ，Ａ，Ｔ］−ＣＡ［Ｇ，Ａ］−［Ｃ，Ｔ］Ｔ［Ｃ，Ｇ，Ａ，Ｔ］−［Ｃ，Ｔ］Ｔ［Ｃ，Ｇ，Ａ，Ｔ］−ＧＡＣ−ＧＣ−３’（配列番号７）を合成し、センスプライマーとして使用した。
Ｐ２のアミノ酸配列に対応する以下のオリゴヌクレオチドＳ２（１９ｍｅｒ）、５’−ＧＧ［Ｃ，Ｇ，Ａ，Ｔ］−ＡＴＣ−ＧＡ［Ｃ，Ｔ］−ＡＣ［Ｃ，Ｇ，Ａ，Ｔ］−ＧＴ［Ｃ，Ｇ，Ａ，Ｔ］−ＡＴ［Ｃ，Ａ，Ｔ］−Ｇ−３’（配列番号８）を合成し、センスプライマーとして使用した。
【００９３】
（３）３’ＲＡＣＥ法による３’末端側ＤＮＡのクローニング
ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ロドトルラ ムシラギノウザＩＦＯ０９０７よりＴｏｔａｌ ＲＮＡを分離し、ｍＲＮＡ精製用キット（ＴａＫａＲａ社製；ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用いてｍＲＮＡを精製した。精製したｍＲＮＡを鋳型とし、合成したＳ１およびＳ２をＰＣＲプライマーとして、Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて３’ＲＡＣＥ法を行い、３’末端側ＤＮＡを増幅した。
【００９４】
増幅したＤＮＡ断片をＢｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて平滑末端化後、Ｔ４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）によりリン酸化し、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入しｐＡＺ０１プラスミドベクター作成した。クローニングした３’末端側ＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサ（Ｇｎｅｎ Ｒａｐｉｄ，アマシャムファルマシアバイオテク社製）により決定した。
【００９５】
（４）５’ＲＡＣＥ法による５’末端側ＤＮＡのクローニング
前記（３）で決定した３’末端側ＤＮＡ塩基配列よりＡ１（１６ｍｅｒ）５’−ＡＡＡ−ＧＴＴ−ＧＴＴ−ＣＡＴ−ＧＴＣ−Ｇ−３’（配列番号９）、Ａ２（２０ｍｅｒ）５’−ＡＣＧ−ＴＴＧ−ＧＴＧ−ＣＧＧ−ＡＡＧ−ＴＴＧ−ＧＣ−３’（配列番号１０）、Ａ３（２０ｍｅｒ）５’−ＧＡＣ−ＣＴＣ−ＣＧＡ−ＣＡＡ−ＡＧＡ−ＣＴＣ−ＣＧ−３’（配列番号１１）の３種のアンチセンスプライマーを作成した。
前記（３）と同様に精製したｍＲＮＡを鋳型として、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を用いて、５’末端側ＤＮＡ断片を増幅した。
【００９６】
増幅したＤＮＡ断片をＢｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて平滑末端化後、Ｔ４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）によりリン酸化し、ｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入しｐＡＺ０２プラスミドベクター作成した。クローニングした５’末端側ＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサ（Ｇｎｅｎ Ｒａｐｉｄ，アマシャムファルマシアバイオテク社製）により決定した。
【００９７】
（５）完全長のカルボニル不斉還元酵素遺伝子の取得
決定した２種類のｃＤＮＡクローンの塩基配列に共通する領域を解析するとともに、２種類の該ｃＤＮＡクローンの共通領域に存在するＨｉｎｃＩＩサイトで、５’末端側ＤＮＡ断片と３’末端側ＤＮＡ断片とを連結し、完全長のカルボニル不斉還元酵素遺伝子取得した。この完全長のカルボニル不斉還元酵素遺伝子は、配列番号１の塩基配列を有するものである。尚、推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００９８】
実施例４ 発現ベクターおよび形質転換体の作成
（１）ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターおよび形質転換体の作成
ｐＵＣ１１８のｌａｃプロモーターの下流のＫｐｎＩ／ＰｓｔＩサイト間に、カルボニル不斉還元酵素遺伝子である配列番号１の塩基配列の１位が連結するように挿入せしめた発現ベクターｐＡＺ０５を作成し、ｐＡＺ０５を用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
【００９９】
（２）高発現ベクターおよび形質転換体の作成
Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ由来のピルビン酸オキシダーゼ遺伝子のプロモーターｐｏｐの下流に、カルボニル不斉還元酵素遺伝子である配列番号１の塩基配列の１位が連結したＤＮＡ断片をｐＵＣ１３に挿入し、発現ベクターｐＡＺ０７を作成し、このｐＡＺ０７を用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
【０１００】
実施例５ ｐＡＺ０５で形質転換した大腸菌を用いたカルボニル不斉還元酵素の製造
ｐＡＺ０５で形質転換した大腸菌ＤＨ５αを１００ｍｌのＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ）に植菌し、３７℃で１６時間培養した後、１００ｍＭ ＩＰＴＧを１ｍｌ加え、更に８時間培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、２５ｍｌの可溶化液（４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％リゾチーム、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に懸濁し、３７℃で３０分間の処理を行い菌体を破砕し、さらに５０００ｇの遠心分離により無細胞抽出液を得た。さらに、無細胞抽出液を実施例１の方法で酵素を精製し、２５Ｕの発現産物を得た。
得られた発現産物は、実施例２で示したカルボニル不斉還元酵素と同等の諸性質を有していた。
【０１０１】
実施例６ 形質転換した大腸菌を用いた（Ｒ ） −２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールの製造１
ｐＡＺ０５で形質転換した大腸菌ＤＨ５αを２ｍｌのＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ）に植菌し、３７℃で１６時間培養した後、１００ｍＭ ＩＰＴＧを０．０２ｍｌ加え、更に８時間培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、０．５ｍｌの可溶化液（４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％リゾチーム、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に懸濁し、３７℃で３０分間の処理を行い菌体を破砕し、さらに５０００ｇの遠心分離により無細胞抽出液を得た。
【０１０２】
得られた無細胞抽出液０．１ｍｌに、５０ｍＭ ＮＡＤＰＨを０．１ｍｌ、５０ｍＭ リン酸緩衝液を０．８ｍｌを加え、さらに５０ｇ／ｌの２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンを含むジメチルスルホキサイド溶液を０．００４ｍｌ加え、３０℃で１０分間反応させた。反応終了後、１ｍｌの酢酸エチルを添加して反応生成物を抽出した。得られた酢酸エチル層を減圧下で溶媒を留去し、０．１９ｍｇの淡黄色油状の反応生成物を得た。
【０１０３】
反応生成物のＮＭＲ分析の結果、Ｈ１−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：３．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，４．５）、３．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，３．３）、５．０４（１Ｈ，ｍ）、６．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３）、７．６７（１Ｈ，ｍ）、７．９２（１Ｈ，ｍ）８．１７（１Ｈ，ｍ）、８．３２（１Ｈ，ｂｒｓ）であり、反応生成物は（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールと同定された。また、高速液体クロマトグラフィー分析の結果、反応率は約９６％、光学純度はＲ体が９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。
また、ベクターｐＵＣ１１８で形質転換した大腸菌ＤＨ５αを同様に処理したが（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールは検出されなかった。
【０１０４】
実施例７ 形質転換した大腸菌を用いた（Ｒ ） −２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールの製造２
実施例６に記載の方法により調製した洗浄菌体を、０．２ｍＭ ＮＡＤＰ＋、２５０ｍＭグルコース、１０Ｕ／ｍｌグルコースデヒドロゲナーゼ（シグマ社製：Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ由来）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌに懸濁し、２０ｇ／Ｌの２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンを含む酢酸ブチルを０．５ｍｌ添加し、３０℃、９０分間反応させた。反応後、遠心分離により酢酸ブチル層を分離し、得られた酢酸ブチル層を減圧下で溶媒を留去し、エタノールに溶解し、生成物量および生成物の光学純度を測定した。その結果、反応収率は約９６％、生成物の光学純度はＲ体が９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１０５】
実施例８ 枯草菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
（１）枯草菌の染色体ＤＮＡの精製
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６６３３）をＬＢ培地で培養し、菌体を調製した。Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｉｐ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、菌体からの染色体ＤＮＡの精製を行った。
【０１０６】
（２）枯草菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
文献（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６，２３８−２４３（１９８６））記載の塩基配列を元に、プライマーＳＧＤ１１６（２５ｍｅｒ）５’−ＡＡＴ−ＴＣＡ−ＴＡＡ−ＣＡＡ−ＡＴＧ−ＧＡＧ−ＧＡＧ−ＧＡＴ−Ｇ−３’（配列番号１２）およびプライマーＡＧＤ１１６（２２ｍｅｒ）５’−ＧＣＣ−ＴＡＡ−ＴＡＡ−ＡＧＡ−ＡＡＧ−ＣＧＡ−ＴＣＣ−Ａ−３’（配列番号１３）を合成した。前記（１）により調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行い特異的な増幅ＤＮＡを得た。増幅したＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサ（Ｇｎｅｎ Ｒａｐｉｄ，アマシャムファルマシアバイオテク社製）により決定した。その結果、配列番号３に示す塩基配列を得た。なお、その推定アミノ酸配列を配列番号４に示す。
【０１０７】
決定した塩基配列を元に、プライマーＳＧＤ１１７（３９ｍｅｒ）５’−ＴＣＴ−ＡＧＡ−ＡＴＧ−ＣＡＴ−ＡＴＣ−ＣＡＧ−ＡＴＴ−ＴＡＡ−ＡＡＧ−ＧＡＡ−ＡＡＧ−ＴＴＧ−ＴＣＧ−３’（配列番号１４）およびＡＧＤ１１７（３６ｍｅｒ）５’−ＧＡＡ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＡＣＣ−ＴＧＧ−ＧＴＣ−ＧＣＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＧＴＴ−ＴＴＡ−ＴＣＣ−３’（配列番号１５）を合成し、前記（１）により調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行い特異的な増幅ＤＮＡを得た。
【０１０８】
（３）グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターおよび形質転換体の作成前記（２）で得られたＤＮＡ断片の上流に、ｐｏｐプロモーターを連結し、ｐＵＣ１３に挿入して発現ベクターｐＡＺ０８を作成した。このｐＡＺ０８を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
【０１０９】
実施例９ 形質転換した大腸菌を用いた（Ｒ） − ２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールの製造３
実施例４（カルボニル不斉還元酵素生産形質転換体）および実施例８（グルコースデヒドロゲナーゼ生産形質転換体）で作成した形質転換体をそれぞれ１００ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、それぞれの菌体を調製した。
【０１１０】
上記で得られたカルボニル不斉還元酵素生産形質転換体（湿菌体１５ｇ）、およびグルコースデヒドロゲナーゼ生産形質転換体（湿菌体１５ｇ）とを、０．０２５ｍＭ ＮＡＤＰ＋、５０ｇ／Ｌ グルコース、を含む１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２．５Ｌに懸濁し、４０ｇ／Ｌの２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンを含む酢酸ブチルを２．５Ｌ添加し、３０℃で反応させた。ｐＨ７コントロール条件化で１２０分間反応後、遠心分離により酢酸ブチル層を分離した。得られた酢酸ブチル層を減圧下で溶媒を留去し、エタノールに溶解し、生成物量および生成物の光学純度を測定した。その結果、反応収率は１００％、生成物の光学純度はＲ体が９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１１１】
実施例１０ （Ｒ）−２−クロロ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノールの製造
実施例９に記載の方法に準じ、２−クロロ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノンより（Ｒ）−２−クロロ−１−（４−クロロ−３−ニトロフェニル）エタノールを得た。
Ｒｆ＝０．３５（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：２）。
保持時間：２０．３分、
分析条件：カラム：キラルセルＡＳ（４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）（ダイセル社製）；移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝９／１；流速：０．５ｍｌ／分；検出波長：２５４ｎｍ；温度：４０℃。
【０１１２】
実施例１１ （Ｒ）−２−ブロモ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノールの製造
実施例９に記載の方法に準じ、２−ブロモ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノンより（Ｒ）−２−ブロモ−１−（４−ベンジルオキシ−３−ニトロフェニル）エタノールを得た。
Ｒｆ＝０．４１（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１）。
保持時間：３５．７分、
分析条件：カラム：キラルセルＯＢ（４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）（ダイセル社製）；移動相：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝７／３；流速：０．５ｍｌ／分；検出波長：２５４ｎｍ；温度：３５℃。
【０１１３】
実施例１２ （Ｒ）−２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールの製造
実施例９に記載の方法に準じ、２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノンより（Ｒ）−２−ブロモ−１−（３−ニトロフェニル）エタノールを得た。
Ｒｆ＝０．７２（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１）。
保持時間：９．０２分、
分析条件：カラム：キラルセルＡＤ（４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）（ダイセル社製）；移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝１／１；流速：０．５ｍｌ／分；検出波長：２５４ｎｍ；温度：３５℃。
【０１１４】
実施例１３ ２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−フルオロフェニル）エタノールの製造
実施例９に記載の方法に準じ、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−フルオロフェニル）エタノンより２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−フルオロフェニル）エタノールを得た。
保持時間：３０．６分、
分析条件：カラム：キラルセルＡＤ（４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）（ダイセル社製）；移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝１／１；流速：０．５ｍｌ／分；検出波長：２５４ｎｍ；温度：２５℃。光学純度：９９．５％ｅ．ｅ．。
【０１１５】
実施例１４ ２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メトキシフェニル）エタノールの製造
実施例９に記載の方法に準じ、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メトキシフェニル）エタノンより２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メトキシフェニル）エタノールを得た。
保持時間：２２．６分、
分析条件：カラム：キラルセルＯＪ（４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）（ダイセル社製）；移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝７／３；流速：０．５ｍｌ／分；検出波長：２５４ｎｍ；温度：２５℃。光学純度：１００％ｅ．ｅ．。
【０１１６】
実施例１５ ２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メチルフェニル）エタノールの製造
実施例９に記載の方法に準じ、２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メチルフェニル）エタノンより２−クロロ−１−（３−ニトロ−４−メチルフェニル）エタノールを得た。
保持時間：３５．９分、
分析条件：カラム：キラルセルＯＪ−Ｈ（４．６ｍｍＩＤＸ２５０ｍｍ）（ダイセル社製）；移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝９／１；流速：０．５ｍｌ／分；検出波長：２５４ｎｍ；温度：２５℃。光学純度：１００％ｅ．ｅ．。
【０１１７】
参考例１ 三環性アミノアルコール誘導体の製造（ ＷＯ ０１／１７９６２ の実施例６−１０の方法）
【０１１８】
【化２３】
上記化合物（８）（７６．８ｇ）を２−プロパノール（２０００ｍｌ）に溶解し、２規定水酸化ナトリウム水溶液（３００ｍｌ）を２０分かけて添加した。室温で３０分間撹拌した後、反応液を氷冷し攪拌しながら、氷冷した水（７５００ｍｌ）を１時間かけて添加した。氷冷下、３０分間撹拌し、析出した結晶を濾取し、室温下減圧乾燥することにより、淡黄色結晶として化合物（９）（５２．５ｇ）を得た。
融点：ｐ３８−３９℃、
Ｒｆ＝０．６０（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：２）、
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．３，２．５）、３．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，４．１）、４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．１，２．６）、７．６４−７．７９（２Ｈ，ｍ）、８．１１−８．２１（２Ｈ，ｍ）
ＨＰＬＣ：保持時間（６．９分）（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ＯＤＳ−５（ジーエルサイエンス社製；４．６ｍｍ ＩＤ×１５０ｍｍ）、溶媒：５０ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液／アセトニトリル＝６／４、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２５４ｎｍ、２５℃）
ＨＰＬＣ：保持時間（Ｒ体：１６．１分）（カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（ダイセル社製；４．６ｍｍ ＩＤ ×２５０ｍｍ）、溶媒：ｎ−ヘキサン／エタノール＝８５／１５、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２５４ｎｍ、３５℃）
尚、Ｓ体の保持時間は１３．８分であった。
【０１２０】
【化２４】
Ｒｆ＝０．６９（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１）、
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．７９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４）、２．９５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６）、３．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．９）、３．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．８）、４．０１−４．０８（２Ｈ，ｍ）、４．８６（２Ｈ，ｂｒｓ）、５．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０）、６．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．２）、６．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１）、７．０６−７．５９（５Ｈ，ｍ）、７．７７−８．１７（４Ｈ，ｍ）、１１．０６（１Ｈ，ｓ）
ＨＰＬＣ：保持時間（７．８分）（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライテスク社製；６．０ｍｍ ＩＤ×１５０ｍｍ）、溶媒：５ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液／メタノール＝２／８、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２５４ｎｍ、２５℃）
ＨＰＬＣ：保持時間（Ｒ体：７１．３分）（カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＪ−Ｒ（ダイセル社製；４．６ｍｍ ＩＤ ×１５０ｍｍ）、溶媒：０．５Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（過塩素酸によりｐＨ２に調整）／アセトニトリル＝６／４、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２３３ｎｍ、３５℃）
尚、Ｓ体の保持時間は６５．０分であった。
【０１２１】
【化２５】
次に化合物（１１）（８．３５ｇ）のメタノール（１２５ｍｌ）溶液に酸化白金（３９ｍｇ、アルドリッチ社製）を加え、常圧の水素雰囲気下、室温で４時間撹拌した。触媒を濾過し、濾液を減圧下、溶媒留去し化合物（１２）（７．７４ｇ）を淡黄色アモルファスとして取得した。
Ｒｆ＝０．３６（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１）、
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１）、２．９７（２Ｈ，ｂｒｓ）、３．８３（２Ｈ，ｂｒｓ）、４．０５−４．０８（２Ｈ，ｍ）、４．５７（２Ｈ，ｂｒｓ）、４．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１）、４．９４（２Ｈ，ｂｒｓ）、６．４０−６．４７（１Ｈ，ｍ）、６．５７（１Ｈ，ｂｒｓ）、６．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．１）、６．８９−６．９６（２Ｈ，ｍ）、７．０６−７．４３（４Ｈ，ｍ）、７．９２−７．９９（２Ｈ，ｍ）、１１．０６（１Ｈ，ｓ）
ＨＰＬＣ：保持時間（３．４分）（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライテスク社製；６．０ｍｍ ＩＤ×１５０ｍｍ）、溶媒：５ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液／メタノール＝２／８、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２５４ｎｍ、２５℃）
ＨＰＬＣ：保持時間（Ｒ体：１０．４分）（カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＪ−Ｒ（ダイセル社製；４．６ｍｍ ＩＤ ×１５０ｍｍ）、溶媒：０．５Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（過塩素酸によりｐＨ２に調整）／アセトニトリル＝６／４、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２３３ｎｍ、３５℃）
尚、Ｓ体の保持時間は１２．５分であった。
【０１２３】
【化２６】
得られた化合物（１２）（７．７４ｇ）のテトラヒドロフラン（７８ｍｌ）溶液にピリジン（１１ｍｌ、和光純薬社製）を加え、０℃に冷却した。次いでメタンスルホニルクロライド（１．５９ｍｌ、東京化成社製）を１５分かけて添加し、０℃で４時間撹拌した。反応液に酢酸エチル（２００ｍｌ）と１規定塩酸（２００ｍｌ）を加え、分液し、有機層を得た。有機層を水（２００ｍｌ）で２回、飽和重曹水（２００ｍｌ）、飽和食塩水（２００ｍｌ）で順次洗浄し、乾燥後、減圧下溶媒を留去し、化合物（１３）（９．０ｇ）を微橙色アモルファスとして得た。
Ｒｆ＝０．４０（メチルエチルケトン：トルエン＝１：２）、
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１）、２．９１（３Ｈ，ｓ）、２．９５−３．０１（２Ｈ，ｍ）、３．８０（２Ｈ，ｂｒｓ）、４．０２−４．０９（２Ｈ，ｍ）、４．６６−４．６９（２Ｈ，ｍ）、５．４７（１Ｈ，ｂｒｓ）、６．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．９）、６．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０）、７．０２−７．４５（７Ｈ，ｍ）、７．９３−８．００（２Ｈ，ｍ）、１１．０６（１Ｈ，ｓ）
ＨＰＬＣ：保持時間（３．１分）（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライテスク社製；６．０ｍｍ ＩＤ×１５０ｍｍ）、溶媒：５ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液／メタノール＝２／８、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２５４ｎｍ、２５℃）
ＨＰＬＣ：保持時間（Ｒ体：２１．７分）（カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＪ−Ｒ（ダイセル社製；４．６ｍｍ ＩＤ ×１５０ｍｍ）、溶媒：０．５Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（過塩素酸によりｐＨ２に調整）／アセトニトリル＝６／４、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２３３ｎｍ、３５℃）
尚、Ｓ体の保持時間は２７．７分であった。
【０１２５】
【化２７】
次いで、得られた化合物（１３）（２．０ｇ）のエタノール（１００ｍｌ）溶液に１０％パラジウム−炭素（１００ｍｇ、メルク社製）を加え、常圧の水素雰囲気下、内温約７０℃で４時間撹拌した。冷却後、テトラヒドロフラン（４０ｍｌ）を加え、室温で３０分間撹拌後濾過し、残渣をテトラヒドロフラン（８ｍｌ）で洗浄した後、濾液と洗液を合わせて減圧下溶媒留去し、淡黄色固形物として化合物（１４）（１．２ｇ）を取得した。
ＨＰＬＣ：保持時間（６．６分）（カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８（ワイエムシー社製；４．６ｍｍ ＩＤ×１５０ｍｍ）、溶媒：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．９）／アセトニトリル＝７０／３０、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２５４ｎｍ、２５℃）
ＨＰＬＣ：保持時間（Ｒ体：２４．６分）（カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＪ−Ｒ（ダイセル社製；４．６ｍｍ ＩＤ ×１５０ｍｍ）、溶媒：０．５Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（過塩素酸によりｐＨ２に調整）／アセトニトリル＝６／４、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長 ２３３ｎｍ、３５℃）
尚、Ｓ体の保持時間は２２．１分であった。
【０１２７】
実施例１６−２５ 三環性アミノアルコール誘導体の製造
参考例１の方法と同様の方法に準じて、本発明の方法を用いて製造された表３に記載の化合物１と化合物２とを反応せしめ、各工程を経て、表３に記載の生成物を製造した。なお、表３には、生成物として、式（Ｐ）におけるＲがＮＨＳＯ２ＣＨ３である化合物のみを記載したが、式（Ｐ）のＲがニトロ基、およびアミノ基もそれぞれ作成した。これらの物質は、それぞれ物性を確認し、正しく製造されていることが確認された。
【０１２８】
【表３】
【発明の効果】
本発明によれば実施例に示すとおり、光学活性２−ハロ−１−（置換−３−ニトロフェニル）エタノールを、通常９９．９％ｅ．ｅ．以上の光学純度で効率よく製造することができる。
【０１３０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のカルボニル不斉還元酵素の至適ｐＨを示す。
Claims (19)
- 下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（ａ）下記の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
（ｄ）至適ｐＨ：最高活性に対する相対活性が、ｐＨ４．０〜７．０では約９５％以上、ｐＨ３．０およびｐＨ８．０では約８０％程度である。 - 下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するカルボニル不斉還元酵素。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素。
（ａ）下記の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。 - 下記の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかのカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列からなるＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（ａ）下記の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。 - 請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡがベクターに連結されていることを特徴とする組換えベクター。
- 請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡが宿主細胞に導入され、形質転換せしめられたことを特徴とする形質転換体。
- 下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素。
（ａ）下記の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。
（ｄ）至適ｐＨ：最高活性に対する相対活性が、ｐＨ４．０〜７．０では約９５％以上、ｐＨ３．０およびｐＨ８．０が約８０％程度である。 - 下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのカルボニル不斉還元酵素。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するカルボニル不斉還元酵素。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素。
（ａ）下記の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。 - 下記の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかのＤＮＡがコードするカルボニル不斉還元酵素。
（Ｃ）配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列からなるＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号１の塩基配列の８０−８３２位の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、下記の理化学的性質を有するカルボニル不斉還元酵素をコードするＤＮＡ。
（ａ）下記の反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノン、およびアセトフェノンを基質とし、それぞれ（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−ニトロフェニル）エタノール、および（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する不斉還元活性を有し、且つ、（Ｓ）−１−フェニルエタノール、（Ｒ）−１−フェニルエタノールおよび２−プロパノールのいずれに対しても実質的にアルコール脱水素活性を有しない。
（ｃ）補酵素の利用性：ＮＡＤＰＨは利用できるがＮＡＤＨは実質的に利用できない。 - 請求項６〜８のいずれかに記載のカルボニル不斉還元酵素を生産する能力を有するロドトルラ属に属する微生物、または請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡを導入して形質転換された形質転換体のいずれかを、培地で培養し、その培養物から該カルボニル還元酵素を採取することを特徴とする該酵素の製造法。
- 一般式（２）
で表された化合物を、請求項６〜８のいずれかに記載のカルボニル不斉還元酵素、またはその酵素含有物、または該酵素を含有する微生物菌体、または請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡを導入して形質転換された形質転換体のいずれかと、内因性または添加されたＮＡＤＰＨの存在下で接触させて不斉還元反応せしめ、一般式（１）
で表された化合物を製造することを特徴とする、一般式（１）の化合物の製造法。 - 該不斉還元反応を、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡを導入して形質転換された形質転換体に接触せしめることにより行うことを特徴とする請求項１０に記載の製造法。
- 該不斉還元反応に際して、一般式（２）の化合物の反応液中濃度が、１％（Ｗ／Ｖ）以上であることを特徴とする請求項１０または１１に記載の製造法。
- 該不斉還元反応が、６時間以内の反応であり、収率が９０％以上、生成物の光学純度が９５％以上であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれかに記載の製造法。
- ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する酵素とその基質およびＮＡＤＰ＋を少なくとも含むＮＡＤＰＨ再生系を共存させることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれかに記載の製造法。
- ＮＡＤＰ再生系がグルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含むものである、請求項１４に記載の製造法。
- 該不斉還元反応が、水性媒体と、一般式（２）の化合物を溶解可能な有機溶媒とを合わせて用いることを特徴とする、請求項１０〜１５のいずれかに記載の製造法。
- 有機溶媒が、酢酸ブチルまたはメチルイソブチルケトンであることを特徴とする、請求項１６に記載の製造法。
- 該不斉還元反応時に、ｐＨをｐＨ３〜８．５に制御することを特徴とする、請求項１０〜１７のいずれかに記載の製造法。
- 該不斉還元反応時に、一般式（１）の化合物を吸着可能な合成吸着樹脂を基質の重量に対して１〜５０倍の重量で添加することを特徴とする、請求項１０〜１８のいずれかに記載の製造法。
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|---|---|---|---|---|
| WO2006090814A1 (ja) * | 2005-02-25 | 2006-08-31 | Kaneka Corporation | 光学活性２級アルコールの製造方法 |
| CN112725389A (zh) * | 2019-10-29 | 2021-04-30 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种米拉贝隆中间体的制备方法 |
-
2002
- 2002-09-18 JP JP2002272095A patent/JP2004105089A/ja not_active Withdrawn
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