JP2004004012A

JP2004004012A - 構造異性体の分離方法

Info

Publication number: JP2004004012A
Application number: JP2003085732A
Authority: JP
Inventors: Kazuhisa Takii; 瀧井　和久; Noriyuki Miyoshi; 三好　徳享; Yoshihiro Saito; 齊戸　美弘; Yoshiaki Shimizu; 清水　慶昭; Kiyokatsu Jinno; 神野　清勝
Original assignee: Okamura Oil Mill Ltd
Current assignee: Okamura Oil Mill Ltd
Priority date: 2002-04-16
Filing date: 2003-03-26
Publication date: 2004-01-08

Abstract

【課題】分子の分離力に優れた、新たな液体クロマトグラフィー固定相を提供すること。
【解決手段】キトサンを長鎖二塩基酸グリシジルエステルで化学修飾して得られる架橋キトサンは、化合物の分離に用いられている従来のキトサンの誘導体あるいはＯＤＳなどと比較して、分子サイズによる分離能、あるいは構造異性（立体異性）などの分子形状の識別・分離能が優れており、液体クロマトグラフィー用固定相として有用である。長鎖二塩基酸ジグリシジルエステルとしては、７−エチルオクタデカン二酸ビス（２，３−エポキシプロピル）または８，９−ジフェニルヘキサデカン二酸（２，３−エポキシプロピル）が好ましく用いられる。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な液体クロマトグラフィー用の固定相およびこの固定相を用いて、分子サイズにより、あるいは分子形状の相違により、化合物を分離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キトサンは、甲殻類、昆虫の外殻、微生物の細胞壁などの主成分として自然界に分布するキチンを脱アセチル化したものである。甲殻類から得られたキトサンは、食品、医薬品などの原料として使用されるだけではなく、イオン交換体、銅、クロム、錫などの重金属吸着剤、酵素の固定化担体などとして、広く用いられている。分離科学の分野においても、アミノ基を化学修飾したキトサンを固定相として、金属イオン、生体物質などの分離が行われている（非特許文献１〜３）。しかし、分離科学の分野において、単に、吸着剤として使用するだけでは、その用途は限られている。
【０００３】
現在、分離科学の分野では、液体クロマトグラフィーで、構造異性体を分離する試みがなされており、固定相としては、オクタデシル基結合シリカ（ＯＤＳ）が挙げられる。しかしながら、ＯＤＳは分離性能がそれほど高くなく、高価であり、廃棄などの問題もある。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｉ．　Ｍａｌｉｎｏｖｓｋａ　ａｎｄ　Ｊ．Ｋ．Ｒｏｚｙｌｏ，　Ｂｉｏｍｅｄ．　Ｃｈｒｉｍａｔｏｇｒ．，　１１，　２７２−２７５（１９９７）
【非特許文献２】
Ｊｙｏｔｉ　Ｄｈａｒ，　Ｊａｃｋ　Ｎ．　Ｌｏｓｓｏ，　Ｊｈｏｎ　Ｖａｎｄｅｒｓｔｏｅｐ　ａｎｄ　Ｓｈｕｒｙｏ　Ｎａｋａｉ，　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　１１，　１５５−１６８　（１９９９）
【非特許文献３】
Ｙ．Ｋｕｒａｕｃｈｉ，　Ｈ．　Ｏｎｏ，　Ｂ．　Ｗａｎｇ，　Ｎ．　Ｅｇａｓｈｉｒａ　ａｎｄ　Ｋ．　Ｏｈｇａ，　Ａｎａｌ．　Ｓｃｉ．，　１３，　４７−５２　（１９９７）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
他方、キトサンは、安価であり、生分解性という性質を有するため、使用後の処理も容易である。さらに、酸性条件下および塩基性条件下でも安定であり、スラリー化することも可能である。そこで、キトサンを、単に吸着剤として利用するだけではなく、液体クロマトグラフィー用の固定相として利用する、安価で、優れた分離技術が待望されている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、キトサンを、液体クロマトグラフィーに利用するために種々の検討を行った結果、ある種の架橋剤で処理したキトサンを用いて、試料中に含まれる化合物を、分子サイズにより、あるいは分子形状の相違により分離できることを見出して、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、分子の両端にエポキシ基を有する化合物を用いて処理されたキトサンからなる、液体クロマトグラフィー用固定相に関する。
【０００８】
好ましい実施態様においては、前記化合物は、長鎖二塩基酸ジグリシジルエステルである。
【０００９】
さらに好ましい実施態様においては、前記長鎖二塩基酸ジグリシジルエステルが、７−エチルオクタデカン二酸ビス（２，３−エポキシプロピル）または８，９−ジフェニルヘキサデカン二酸（２，３−エポキシプロピル）である。
【００１０】
本発明は、また、長鎖脂肪酸グリシジルエステルを用いて化学修飾されたキトサンからなる液体クロマトグラフィー用固定相に関する。
【００１１】
本発明は、さらに、前記いずれかの液体クロマトグラフィー用固定相を用いて、試料中の化合物を分子形状の相違により分離する方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、前記いずれかの液体クロマトグラフィー用固定相を用いて、試料中の化合物を分子サイズにより分離する方法に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるキトサンとしては特に制限がなく、通常、市販のキトサンが用いられる。キトサンは、一般に、キチンを脱アセチル化することにより得られるが、完全に脱アセチル化されないため、キチンを含む場合がある。従って、本発明に用いられるキトサンは、本発明の効果を損なわない範囲で、キチンを含んでもよい。キチンは、キトサン中に約１０重量％まで含まれていてもよい。
【００１４】
本発明の液体クロマトグラフィー用固定相は、分子の両端にエポキシ基を有する化合物で処理されたキトサンからなる。
【００１５】
分子の両端にエポキシ基を有する化合物としては、特に制限はないが、キトサン間に架橋を形成することができ、そして、キトサン鎖間にある程度の間隙を生じるような化合物であることが好ましい。このような化合物としては、長鎖二塩基酸ジグリシジルエステルが好ましく用いられる。
【００１６】
長鎖二塩基酸ジグリシジルエステルは、主鎖が炭素数１０〜２２の長鎖脂肪族二塩基酸のジグリシジルエステルであることが好ましく、炭素数１４〜２０の長鎖脂肪族二塩基酸のジグリシジルエステルであることがさらに好ましい。脂肪族二塩基酸は、飽和脂肪族二塩基酸であってもよく、不飽和脂肪族二塩基酸であってもよい。また、直鎖の脂肪族二塩基酸であってもよく、分岐を有する脂肪族二塩基酸であってもよい。分岐を有する場合、分岐は炭素数１〜６の低級アルキル基（メチル基、エチル基など）、置換あるいは未置換のアリール基が好ましい。
【００１７】
好ましい長鎖二塩基酸ジグリシジルエステルとしては、以下の長鎖二塩基酸ジグリシジルエステルが挙げられる。
【００１８】
【化１】

【００１９】
【化２】

【００２０】
これらの長鎖二塩基酸ジグリシジルエステルは単独で用いてもよく、２種以上併用してもよい。
【００２１】
キトサンを、分子の両端にエポキシ基を有する化合物で処理する方法としては、例えば、キトサンをアルコールなどの溶媒に懸濁し、これに分子の両端にエポキシ基を有する化合物を所定量添加して、適切な温度（例えば、常圧で溶媒の沸点以下）で、適切な時間攪拌し、濾過、洗浄する方法が挙げられる。あるいは、酸性溶液中にキトサンを溶解させて、分子の両端にエポキシ基を有する化合物を所定量添加して反応させ、ついで適切な溶媒（例えば、アセトン）でキトサンを固形分として回収する方法が挙げられる。
【００２２】
この処理により、分子中あるいは分子間のアミノ基がエポキシ化合物で架橋されたキトサンと、エポキシ化合物がアミノ基にペンダント的に結合したキトサンが単独で、あるいは共に得られると考えられる。
【００２３】
本発明の液体クロマトグラフィー用固定相は、また、長鎖脂肪酸グリシジルエステルで化学修飾されたキトサンからなる。長鎖脂肪酸グリシジルエステルは、主鎖が炭素数１０〜２２の長鎖脂肪酸を有することが好ましく、炭素数１４〜２０の長鎖脂肪酸を有することがさらに好ましい。長鎖脂肪酸は、飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。また、直鎖の脂肪酸であってもよく、分岐を有する脂肪酸であってもよい。
【００２４】
キトサンを長鎖脂肪酸グリシジルエステルで修飾する方法には、特に制限はなく、上記のようなキトサンと分子の両端にエポキシ基を有する化合物とを反応させる方法と同じ方法が適用される。
【００２５】
分子の両端にエポキシ基を有する化合物で処理されたキトサン、あるいは長鎖脂肪酸グリシジルエステルで修飾されたキトサン（以下、架橋・修飾キトサンと総称する）は、そのままの形態で、あるいは乾燥され、さらには微粒子化されて、液体クロマトグラフィー用固定相として使用し得る。化合物の分離をシャープにするには、粒子径を予め均一な大きさとすることが好ましい。架橋・修飾キトサンは、力学的にも安定化していると考えられる。従って、架橋・修飾キトサンを粉砕し、スラリー化することも可能である。好ましくは、平均粒子径が、１〜５０μｍ、より好ましくは、１〜１０μｍとなるように粉砕される。粉砕された架橋・修飾キトサンは、乾燥状態で保存するよりも、液体の状態で溶媒中でスラリーとして保存しておくことが好ましい。
【００２６】
架橋・修飾キトサンの粉砕は、当業者が通常用いる方法で行われ、例えば、メノウ乳鉢、その他の粉砕装置を用いて、行われる。
【００２７】
本発明の架橋・修飾キトサンを、例えば、スラリー化して、液体クロマトグラフィーのマイクロカラムに充填し、液体カラムクロマトグラフィーの分離カラムとして用いると、分離したい物質を含有する試料をロードすることにより、分子サイズにより、あるいは立体構造の相違などの分子形状の相違を認識して、目的の物質が分離される。立体構造が相違する化合物としては、例えば、構造異性体、あるいは平面構造体と非平面構造体が挙げられる。
【００２８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例のみに限定されるものではない。
【００２９】
（実施例１：液体カラムクロマトグラフィー用固定相の作成−１）
（１）原料のキトサンとして、粉末状のキトサンＦＭ−８０（甲陽ケミカル（株）製、Ｎ−アセチル化度２１．９％、繰り返し単位量１７０．３６ｇ／ｍｏｌ）を用いた。長鎖二塩基酸ジグリシジルエステルとして、７−エチルオクタデカン二酸ビス（２，３−エポキシプロピル）（岡村製油（株）製、エポキシ当量２９４（過塩素酸法）：以下、２０ｂＧと略称する）を用いた。
【００３０】
キトサン２．５ｇを５％酢酸水溶液１００ｍＬに溶解し、メタノール１００ｍＬで希釈した。表１に記載の量の２０ｂＧを含有するメタノール溶液１００ｍＬを準備し、それぞれ、上記キトサン溶液中に６０〜７０℃で３０分かけて滴下し、この温度で２０時間攪拌した。反応後、内容物をアセトン中に注ぎ、固形分をろ取した。アセトン、５％水酸化カリウム水溶液、およびエーテルで順次洗浄した後、乾燥し、固形の反応生成物を得た。反応生成物である架橋キトサン−Ｉ、架橋キトサン−ＩＩ、および架橋キトサン−ＩＩＩの合成における２０ｂＧとキトサンとの仕込比（エポキシ基／アミノ基比）、および得られた各反応生成物の元素分析値を表１に示す。元素分析は（株）柳本製作所製ヤナコＣＨＮ　ｃｏｒｄｅｒ　ＭＴ−５型を使用して行った。
【００３１】
【表１】

【００３２】
（２）反応生成物である架橋キトサン−Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩと原料キトサンＦＭ−８０との赤外吸収差スペクトル（４００〜４０００ｃｍ^−１）をそれぞれ、測定した。図１に架橋キトサン−Ｉの差スペクトルを示す。赤外吸収差スペクトルは、日立分光（株）製ＦＴ−ＩＲ４３０を使用して測定した。図１において、１７４１ｃｍ^−１のピークは、エステルのＣ＝Ｏの伸縮振動に基づく吸収であり、２９２６ｃｍ^−１および２８５４ｃｍ^−１のピークは脂肪族鎖のＣＨ伸縮振動に基づく吸収である。この結果は、反応生成物中に、２０ｂＧ構造に由来するエステル結合およびメチレン結合が検出されたことを示している。さらに、１５９９ｃｍ^−１のピークはアミンが減少したことを示している。これらのことから、キトサンに２０ｂＧが導入されたことが確認された。架橋キトサン−ＩＩおよびＩＩＩについても同様のスペクトルが得られた。
【００３３】
（３）反応生成物架橋キトサン−Ｉと原料キトサンとの示差走査熱量の測定（ＤＳＣ分析：Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製ＤＳＣ７を使用）を行った。結果を図２に示す。原料キトサンについてのＤＳＣ曲線（ａ）の３１６．１７℃に見られた発熱ピークは、架橋キトサン−ＩのＤＳＣ曲線（ｂ）には認められなかった。
【００３４】
（４）以上の（１）〜（３）の結果は、以下の反応が起こっていることを示唆する。
【００３５】
【化３】

【００３６】
（５）得られた架橋キトサン−Ｉ〜ＩＩＩを、メノウ乳鉢を用いて粉砕し、４００〜５００メッシュ通過区分を集め、液体クロマトグラフィー用の固定相を作成した。このキトサンポリマーは、約２０〜３０万の重量平均分子量であり、グルコサミンが約１２００〜１８００個連なっていると考えられる。
【００３７】
（実施例２：架橋キトサン−Ｉ〜ＩＩＩの固定相としての機能）
実施例１で得られた、架橋キトサン−Ｉ〜ＩＩＩの液体クロマトグラフィー用固定相の機能を、市販のキトサン誘導体およびオクタデシル基結合シリカゲル（ＯＤＳ）と比較した。
【００３８】
比較対照のキトサン誘導体としては、以下に示す構造を有するＣｈｉｔｏｐｅａｒｌ　ＢＴ−０１およびＣｈｉｔｏｐｅａｒｌ　ＰＨ−０１（いずれも、Ｆｕｊｉ　ｓｐｉｎｎｉｎｇ（株）製）を用いた。
【００３９】
【化４】

【００４０】
また、比較対照のＯＤＳとしては、Ｄｅｖｅｌｏｓｏｌ　ＯＤＳ−ＵＧ−５（野村化学（株））およびＶｙｄａｃ　２０１　ＴＰＢ−５（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ，　Ｉｎｃ．，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を用いた。Ｄｅｖｅｌｏｓｏｌ　ＯＤＳ−ＵＧ−５は、モノメリック相のＯＤＳであり、Ｖｙｄａｃ　２０１　ＴＰＢ−５は、エンドキャッピングが施されていないポリメリックＯＤＳである。これらのＯＤＳのうち、ポリメリックＯＤＳは、アルキル鎖の自由度が小さいため、分子形状認識能を有している。なお、Ｃｈｉｔｏｐｅａｒｌ、ＤｅｖｅｌｏｓｏｌおよびＶｙｄａｃは、それぞれ、登録商標である。
【００４１】
（分析装置）
マイクロカラムＬＣシステム
ポンプ：マイクロフィーダーＭＦ−２（東電気（株））
検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＩＩ（Ｊａｓｃｏ社製）
インジェクター：Ｒｈｅｏｄｙｎｅ　７５２０（Ｃｏｔａｔｉ社製、ＣＡ、ＵＳＡ）
カラム：φ０．５３ｍｍ×１５０ｍｍ　溶融シリカキャピラリー
（Ｓｈｉｎｗａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）
データ取得ソフトウエア：ＢＯＲＷＩＮ　Ｖｅｒ．　１．５０（Ｊａｓｃｏ社製）
【００４２】
（分析条件）
移動相：メタノール／水
流速：２μｌ／分
注入量：０．２μｌ
カラム温度：室温
検出波長：２５４、２７３、３００（ｎｍ）
【００４３】
（試料）
以下に示す、種々の形状を有する多環芳香族炭化水素（以下、ＰＡＨという）を、分離用試料として使用した。各ＰＡＨはメタノールにそれぞれ１００ｐｐｍとなるように溶解した。ＰＡＨが完全に溶解しない場合は、少量のジクロロメタンをメタノールに加えて、溶解した。
【００４４】
【化５】

【００４５】
（結果）
（１）種々の組成の移動相を用いた場合の、各固定相におけるＰＡＨ類の保持値（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）を表２〜５に示す。なお、各表におけるＦ値は、Ｈｕｒｔｕｂｉｓｅらにより提案された分子サイズを表す因子であり、以下の式で定義される。
【００４６】
Ｆ＝（二重結合の数）＋（第１、２級炭素の数）−０．５×（非芳香環の数）
【００４７】
【表２】

【００４８】
【表３】

【００４９】
【表４】

【００５０】
【表５】

【００５１】
これらの結果は、どの移動相組成においても、架橋キトサン−Ｉ〜ＩＩＩの順に、すなわち、架橋度が大きくなるほど、保持値（ｋ）が増大したことを示している。また、架橋キトサン−Ｉ〜ＩＩＩは、既存の化学修飾キトサン（Ｃｈｉｔｏｐｅａｒｌ）よりも、保持値が優れていることがわかった。このとから、キトサンよりはその架橋構造が基質の保持に寄与していると考えられる。また、架橋キトサン−ＩＩＩは、市販のＯＤＳと同等の性質を有することが明らかになった。
【００５２】
（２）次に、上記表２〜５におけるナフタレン（Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、フェナントレン（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）、アントラセン（Ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）、およびピレン（Ｐｙｒｅｎｅ）　の各化合物について、移動相の組成と架橋キトサン−Ｉ〜ＩＩＩの保持値ｋの対数（ｌｏｇｋ）との関係をそれぞれ図３〜５に示す。架橋キトサン−Ｉ〜ＩＩＩのいずれも、移動相のメタノールの割合が減少するにつれて、保持値ｋが対数的に増加した。このことは、ＯＤＳに代表される逆相の固定相に一般的に見られる傾向である。従って、架橋キトサン固定相におけるＰＡＨ類の保持には、架橋部分のアルキル鎖とＰＨＡとの間の疎水的相互作用が支配的に作用しているものと考えられる。
【００５３】
（３）表２〜５における、上記定義されたＦ値は、水系の逆相ＨＰＬＣの場合、ｌｏｇｋとの間で直線関係にあると言われている。Ｆ値と、架橋キトサン−Ｉ〜ＩＩＩのｌｏｇｋとの関係を図６〜８にそれぞれ示す。
【００５４】
図６〜８に示すように、平面構造を有するＰＡＨ類に対しては、Ｆ値と保持値の対数ｌｏｇｋとの間に高い相関関係が認められた。また、Ｆ＝９であり、平面構造である４種のＰＡＨ類（トリフェニレン（Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）、ベンズ［ａ］アントラセン（Ｂｅｎｚ［ａ］ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）、クリセン（Ｃｈｒｙｓｅｎｅ）、およびナフタセン（Ｎａｐｈｔｈａｃｅｎｅ））は、それぞれの架橋キトサンＩ〜ＩＩＩにおいて、ほぼ同じ保持値を有することから、これらは、分子の大きさのみに従って分離されていることが明らかとなった。
【００５５】
（４）図８は、架橋キトサン−ＩＩＩを用いた場合の、Ｆ値と保持値の対数ｌｏｇｋとの関係を示す。非平面構造であるｏ−テルフェニル（Ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ）のプロットが、上記平面構造の４種のＰＡＨ類とはかなり離れた位置に存在している。このことは、ｏ−テルフェニルの保持値が、Ｆ値から推定される保持値よりも、はるかに小さいことを示しており、キトサンを架橋して得られる固定相が、平面性の異なるＰＡＨ類に対して、優れた選択性があることを示している。
【００５６】
（実施例３：架橋キトサン−ＩＩＩを用いる平面構造を有するＰＡＨ類の分離−１）
ナフタレン、アントラセンおよびピレンをそれぞれ１００ｐｐｍとなるようにメタノールに溶解し、実施例２と同じ装置および条件で、架橋キトサン−ＩＩＩを充填したカラムで分離した。比較として、モノメリックＯＤＳ（Ｄｅｖｅｌｏｓｏｌ　ＯＤＳ−ＵＧ−５）を用いた。結果を図９に示す。移動相をメタノールとした場合でも、対称性のあるピークが得られた。架橋キトサン−ＩＩＩが平面構造を有するＰＡＨ類を分離する能力は、市販のＯＤＳとほぼ同等であることが示された。
【００５７】
（実施例４：架橋キトサン−ＩＩＩを用いる平面構造を有するＰＡＨ類の分離−２）
ナフタレン、アントラセン、ピレンおよびトリフェニレンをそれぞれ１００ｐｐｍとなるようにメタノールに溶解した以外は、実施例３と同様にして、分離した。結果を図１０に示す。これらの４種のＰＡＨ類は架橋キトサン−ＩＩＩで分離され、市販のＯＤＳとほぼ同等の能力を有することが示された。
【００５８】
（実施例５：構造異性体の分離）
架橋キトサン−ＩＩＩを用いて、分子サイズがほぼ同じで、平面性が異なる３組のＰＡＨ類の分離を検討した。比較として、モノメリックＯＤＳ（Ｄｅｖｅｌｏｓｏｌ　ＯＤＳ−ＵＧ−５）およびポリメリックＯＤＳ（Ｖｙｄａｃ　２０１　ＴＰＢ−５）を用いた。結果を表６に示す。表６における選択性（α）（ｋ平面／ｋ非平面）は、（平面ＰＡＨ類の保持値）／（非平面ＰＡＨ類の保持値）で算出され、この値が大きいほど平面認識能が高いことを意味する。一般に、モノメリックＯＤＳは平面認識能が低く、ポリメリックＯＤＳは平面認識能が高いことが知られている。
【００５９】
【表６】

【００６０】
表６の結果から、架橋キトサン−ＩＩＩは、どの移動相組成に対しても、ポリメリックＯＤＳを超える高い平面認識能を有していることが理解される。また、移動相のメタノールの濃度が高いほどポリメリックＯＤＳよりも選択性が高くなり、水の濃度が高くなるほど選択性が低下することがわかる。これは、架橋キトサン−ＩＩＩの架橋部分にあるヒドロキシル基あるいはエステル基などの水和により、架橋部分のアルキル鎖とＰＡＨ分子との間の疎水性相互作用が抑制され、平面認識能が低下するためと考えられる。さらに、ＰＡＨの分子サイズが大きくなるに伴い、ＯＤＳとの選択性（α）の値の差が拡大すると予想される。
【００６１】
図１１は、トランス−スチルベン（ｔｒａｎｓ−Ｓｔｉｌｂｅｎｅ）とシス−スチルベン（ｃｉｓ−　Ｓｔｉｌｂｅｎｅ）との分離クロマトグラムを示す。移動相がメタノールである場合、比較対照のポリメリックＯＤＳはこれらの化合物を分離できなかったのに対して、架橋キトサン−ＩＩＩはこれらの化合物を分離できた。また、いずれの移動相においても、架橋キトサン−ＩＩＩのα値に変化は見られなかった。
【００６２】
図１２は、トリフェニレン（Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）とｏ−テルフェニル（ｏ−Ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ）との分離クロマトグラムを示す。α値はいずれの移動相においても、架橋キトサン−ＩＩＩの方がポリメリックＯＤＳよりも高く、トリフェニレンとｏ−テルフェニルとを分離することができた。
【００６３】
（実施例６：液体カラムクロマトグラフィー用固定相の作成−２）
（１）長鎖二塩基酸ジグリシジルエステルとして、８，９−ジフェニルヘキサデカン二酸（２，３−エポキシプロピル）（岡村製油（株）製、エポキシ当量３２５．８（過塩素酸法）：以下、２ＰＧと略称する）を用いた以外は、実施例１と同様にして、架橋キトサンを合成した。なお、精製は、反応終了後、５％水酸化カリウム水溶液で中和し、内容物をアセトン中に注ぎ、固形分をろ取した。アセトン、およびエーテルで順次洗浄した後、乾燥することによって行った。反応生成物である架橋キトサン−ＩＶ、架橋キトサン−Ｖおよび架橋キトサン−ＶＩの合成における２ＰＧとキトサンとの仕込比（エポキシ基／アミノ基比）、および得られた各反応生成物の元素分析値を表７に示す。
【００６４】
【表７】

【００６５】
（２）反応生成物である架橋キトサン−ＩＶ、ＶおよびＶＩと原料キトサンＦＭ−８０との赤外吸収差スペクトル（４００〜４０００ｃｍ^−１）をそれぞれ、測定した。図１３にキトサン−ＶＩの差スペクトルを示す。図１３において、１７３６ｃｍ^−１（エステルの吸収）および７０２ｃｍ^−１（ベンゼン環）付近に山のピークがみられ、１６４４ｃｍ^−１（アミンの吸収）付近に谷のピークが見られた。このことから、キトサンに２ＰＧが導入されたことが確認された。他の架橋キトサン−ＩＶおよびＶについても同様のスペクトルが得られた。
【００６６】
（実施例７：架橋キトサン−ＶＩの固定相としての機能）
実施例６で得られた架橋キトサン−ＶＩを、メノウ乳鉢を用いて粉砕し、４００〜５００メッシュ通過区分を集め、液体クロマトグラフィー用の固定相を作成した。この液体クロマトグラフィー用固定相の機能を、実施例２と同様に、検討した。
【００６７】
（試料）
以下に示す、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）を、分離用試料として使用した。各ＰＡＨはメタノールにそれぞれ１００ｐｐｍとなるように溶解した。ＰＡＨが完全に溶解しない場合は、少量のジクロロメタンをメタノールに加えて、溶解した。
【００６８】
【化６】

【００６９】
（結果）
（１）水／メタノール＝０／１００〜４０／６０の組成の移動相を用いて測定したＰＡＨ類の保持値（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）を表８に示す。
【００７０】
【表８】

【００７１】
この結果から、移動相中の水の割合が増加するにつれて保持値も増加することが確認された。水／メタノール＝１０／９０〜４０／６０の範囲のデータから、水の増加に対する各ＰＡＨのｌｏｇｋをプロットしたとき、どのＰＡＨも直線関係が得られた。これらの相関関数ｒを表８に示す。表８からわかるように、最小でもｒ＝０．９９５を示したことから、保持値の対数と移動相との間に高い相関性があることが判った。
【００７２】
表８の水／メタノール＝２０／８０のデータから、水の増加に対する各ＰＡＨのｌｏｇｋをプロットした結果を図１４に示す。この結果は、平面構造を有するＰＡＨについては、Ｆ値とｌｏｇｋとの間に相関性があることを示している。
【００７３】
この表８のＰＡＨのうち、Ｆ＝９のＰＡＨ（ナフタセン、ベンズ［ａ］アントラセン、クリセン、トルフェニレン、およびｏ−テルフェニル）のｌｏｇｋを、水の増加に対してプロットした図を図１５に示す。
【００７４】
図１５の結果は、非平面性の構造を有するＰＡＨ（ｏ−テルフェニル）は、他の平面構造の異性体より保持値が顕著に小さいことを示している。このことは、固定相が平面構造である分子を選択的に認識し、保持することを示唆している。
【００７５】
そこで、分子サイズが同じかほぼ同じで、平面性の異なる３組のＰＡＨ（トランス−スチルベン／シス−スチルベン、フェナントレン／シス−スチルベン、およびトリフェニレン／ｏ−テルフェニル）について、それぞれの選択性（α）を求めた。
【００７６】
結果を図１６に示す。この結果は、平面構造のＰＡＨは、非平面構造のＰＡＨと比較すると、約２倍以上の保持値を有することを示す。
【００７７】
この例として典型的なトリフェニレン／ｏ−テルフェニルのクロマトグラムを図１７に示す。
【００７８】
以上のデータを総合すると、ポリメリックＯＤＳはアルキル鎖の自由度が小さいため平面認識能が高いとされるが、本発明の架橋キトサン−ＶＩにおいても、アルキル鎖を有する架橋剤の両端がキトサンによって固定されているため、ポリメリックＯＤＳ以上にアルキル鎖の自由度が小さいと考えられ、架橋キトサンＶＩを用いる逆相液体クロマトグラフィーにおけるＰＡＨの保持は、疎水性相互作用が支配的であると考えられる。
【００７９】
（実施例８：架橋キトサン−ＶＩを用いる平面構造を有するＰＡＨ類の分離−１）架橋キトサン−ＶＩを充填したカラムを用いて、実施例３と同様にナフタレン、フェナントレン、ピレンを分離した。結果を図１８に示す。この図１８においては、芳香環が２、３、および４である化合物のうち、分子の長さと幅の最大比であるＬ／Ｂがあまり変化しないように組合わせた例であるが、極めて良好に分離された。
【００８０】
（実施例９：架橋キトサン−ＶＩを用いる平面構造を有するＰＡＨ類の分離−２）架橋キトサン−ＶＩを充填したカラムを用いて、ナフタレン、アントラセン、およびナフタセンをそれぞれ１００ｐｐｍとなるようにメタノールに溶解した以外は、実施例３と同様にして、分離した。結果を図１９に示す。この図１９においては、分子の幅が変化しないように組合わせた例であるが、極めて良好に分離された。
【００８１】
以上の結果から、本発明の架橋キトサンを固定相として用いることにより、平面ＰＡＨ類は、分子のサイズで分離できることが示された。
【００８２】
（実施例１０：架橋キトサン−ＶＩを用いる平面構造を有するＰＡＨ類の分離−３）
架橋キトサン−ＶＩを充填したカラムを用いて、ジメチルビフェニルの３つの異性体（２，２’−、３，３’−、および４，４’−）をそれぞれ１００ｐｐｍとなるようにメタノールに溶解した以外は、実施例３と同様にして、分離した。結果を図２０に示す。図２０では、２，２’−異性体が、他の３，３’−　異性体、および４，４’−　異性体から分離された。
【００８３】
このジメチルビフェニルの３つの異性体は、芳香環を結合する単結合の自由回転によって２つの芳香環が捩れたような構造を有しているため、非平面構造を有すると考えられる。ところで、上記の通り、Ｆ値が同じＰＡＨ類であれば非平面性構造の分子は平面構造に比べて保持値が小さいことが示唆されている。実際に測定すると、表８で示されるように、２，２’−異性体の保持値は他の異性体（３，３’−、および４，４’−）の半分程度であるため、２，２’−異性体の方が他の異性体と比べ、分子構造の非平面性が大きいと考えられ、図２０のように分離されたと考えられる。このことは、テルフェニルの異性体にも適用されると考えられる。
【００８４】
【発明の効果】
分子の両端にエポキシ基を有する長鎖脂肪酸グリシジルエステルで化学修飾されたキトサンは、従来の分離用のキトサン誘導体あるいはＯＤＳなどと比較して、分子サイズによる分離能、あるいは構造異性（立体異性）などの分子形状の識別・分離能が優れており、液体クロマトグラフィー用固定相として有用である。さらに、キャピラリー電気クロマトグラフィーの固定相としても十分応用可能であり、混合物中に存在する微量分析対象物質の抽出・濃縮媒体としても幅広い応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】架橋キトサン−Ｉと原料キトサンとの赤外吸収差スペクトルである。
【図２】（ａ）原料キトサンおよび（ｂ）架橋キトサン−Ｉの示差走査熱量の測定結果を示すグラフである。
【図３】多環芳香族炭化水素について、移動相の組成と架橋キトサン−Ｉの保持値の対数（ｌｏｇｋ）との関係を示す図である。
【図４】多環芳香族炭化水素について、移動相の組成と架橋キトサン−ＩＩの保持値の対数（ｌｏｇｋ）との関係を示す図である。
【図５】多環芳香族炭化水素について、移動相の組成と架橋キトサン−ＩＩＩの保持値の対数（ｌｏｇｋ）との関係を示す図である。
【図６】多環芳香族炭化水素のＦ値と架橋キトサン−Ｉの保持値の対数（ｌｏｇｋ）との関係を示す図である。
【図７】多環芳香族炭化水素のＦ値と架橋キトサン−ＩＩの保持値の対数（ｌｏｇｋ）との関係を示す図である。
【図８】多環芳香族炭化水素のＦ値と架橋キトサン−ＩＩＩの保持値の対数（ｌｏｇｋ）との関係を示す図である。
【図９】架橋キトサン−ＩＩＩおよびモノメリックＯＤＳにおける３種の多環芳香族炭化水素のクロマトグラムである。
【図１０】架橋キトサン−ＩＩＩにおける４種の多環芳香族炭化水素のクロマトグラムである。
【図１１】架橋キトサン−ＩＩＩおよびポリメリックＯＤＳにおけるトランス−スチルベンおよびシススチルベンのクロマトグラムである。
【図１２】架橋キトサン−ＩＩＩおよびポリメリックＯＤＳにおけるトリフェニレンおよびｏ−テルフェニルのクロマトグラムである。
【図１３】架橋キトサン−ＶＩの差スペクトルである。
【図１４】多環芳香族炭化水素のＦ値と架橋キトサン−　ＶＩの保持値の対数（ｌｏｇｋ）との関係を示す図である。
【図１５】Ｆ値が９の多環芳香族炭化水素における、移動相組成と架橋キトサン−　ＶＩの保持値の対数（ｌｏｇｋ）との関係を示す図である。
【図１６】分子サイズが同等で、平面性の異なる３組の多環芳香族炭化水素の選択性（α）と移動相との関係を示す図である。
【図１７】架橋キトサン−　ＶＩを用いるトリフェニレン／ｏ−テルフェニルのクロマトグラムである。
【図１８】架橋キトサン−ＶＩを用いる、平面構造を有する多環芳香族炭化水素のクロマトグラムである。
【図１９】架橋キトサン−ＶＩを用いる、平面構造を有する多環芳香族炭化水素のクロマトグラムである。
【図２０】架橋キトサン−ＶＩを用いる、ジメチルビフェニルの３つの異性体のクロマトグラムである。

Claims

分子の両端にエポキシ基を有する化合物を用いて処理されたキトサンからなる、液体クロマトグラフィー用固定相。
前記化合物が、長鎖二塩基酸ジグリシジルエステルである、請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用固定相。
前記長鎖二塩基酸ジグリシジルエステルが、７−エチルオクタデカン二酸ビス（２，３−エポキシプロピル）または８，９−ジフェニルヘキサデカン二酸（２，３−エポキシプロピル）である、請求項２に記載の液体クロマトグラフィー用固定相。
長鎖脂肪酸グリシジルエステルを用いて化学修飾されたキトサンからなる、液体クロマトグラフィー用固定相。
請求項１から４のいずれかの項に記載の液体クロマトグラフィー用固定相を用いて、試料中の化合物を分子形状の相違により分離する方法。
請求項１から４のいずれかの項に記載の液体クロマトグラフィー用固定相を用いて、試料中の化合物を分子サイズにより分離する方法。