JP2003534791A - 組織エンジニアリングのためのエイコサノイドの使用方法 - Google Patents

組織エンジニアリングのためのエイコサノイドの使用方法

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マルセル ヤコブ，
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Abstract

(57)【要約】 組織エンジニアリングは、組織機能を修復し、維持し、または改善するための生物学的代替物の開発である。新しい組織を再生するために考案された１つの方法は、細胞を用意する工程；細胞が分化機能に欠けるところの第一培養基中で、単離された細胞を膨張させる工程；および第二細胞培養基中で、膨張した細胞を再分化する工程を含む。本発明は、組織エンジニアリングのための改善された方法を提供する。特に、本発明方法は、構造的および機能的に天然の組織と似た組織等価物を再生するという目的で再生プロセス中の細胞培養基を補充するための特定の生化学因子を提供する。これらの特定の化学因子は、予め膨張させた細胞の再分化を誘発しおよび／または加速しおよび／または促進する。特に、本発明は、エイコサノイド、エイコサノイドの前駆体、および／またはエイコサノイドと協力して作用する創傷治癒の媒介物質の存在下で哺乳類またはヒトの軟骨細胞を再分化する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
組織エンジニアリングは、組織機能を修復し、維持し、または改善するための
生物学的代替物の開発である。特に、組織エンジニアリングは、新しい生体組織
を実験室で作って病的なまたは外傷を受けた組織と置き換えるところの方法であ
る。
【０００２】
【従来の技術】
新しい組織を再生するために考案された１つの方法は、組織から特定の細胞を
単離し、単離された細胞をインビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）膨張させ、そして
、移植された細胞がインビボで（ｉｎ ｖｉｖｏ）で増殖して最後には組織欠陥
と置き換わりまたは組織欠陥を修復するように、膨張した細胞を病的なまたは外
傷を受けた組織に移植することである。この方法は、種々の細胞型および組織欠
陥に適用された。単離された細胞は、特定の組織からの分化した細胞、または分
化していない前駆細胞（幹細胞）であり得る。どちらの場合も、構造的または機
能的組織等価物を再生するための潜在能力を維持しまたは改善するために、細胞
膨張のための適切な培養条件の確立が極めて重要である。
【０００３】 組織再生技術の開発のための中心となる特定の領域は、軟骨組織における欠陥
の修正である。他の組織と違って、軟骨は、外傷後に、病気後に、または加齢の
結果として、それ自身再生する能力をほとんど有しない。これは、正常な関節軟
骨の無血管性故である。表面軟骨板への損傷は一般に回復しないが、軟骨下骨は
血管形成され、したがって、この場所への損傷は限られた程度に回復する。損傷
を受けた関節軟骨に代わって成長する新しい軟骨は、繊維軟骨と言う。繊維軟骨
は、元のヒアリン軟骨の耐久性およびより望ましい機械的特性に欠ける。関節損
傷に苦しむ人々は、その後、関節炎変性にかかりやすい。
【０００４】 軟骨組織を修復するためにいつくかの異なる方法、例えば軟骨削り、軟骨下ド
リリング、および組織の自己／同種移植が採用されている。関節軟骨修復のため
の他の実験的方法は、軟骨生検から軟骨細胞を採取し、そして三次元移植マトリ
ックス物質上に軟骨細胞を直接接種した後、移植片を損傷領域に移植することに
ある。この方法は、再生がいったん完了すると、高品質の軟骨を生じるが、患者
から多量の出発物質を採取する必要があり、その結果、患者の外傷が増大するこ
とになる。
【０００５】 他の方法では、軟骨細胞が生検から単離され、十分な数の細胞が得られるまで
単層培養で膨張させ、そして組織の損傷領域に移植される。また、これらの場合
、細胞がゲルに埋め込まれまたは生物分解可能なポリマー足場に結合されること
が最初に必要である。それらのマトリックスの三次元性は、インプラントに構造
的な一体性を付与し、そして軟骨細胞が軟骨組織中に成長するための硬質支持体
を提供する。この系は、出発物質としての細胞がより少なくてよいという利点を
有するが、この方法によって得られる軟骨は、細胞が骨格的に成熟したドナー（
成人）から採取されまたは得られる場合、しばしば品質が劣る。
【０００６】 軟骨組織からの軟骨細胞が軟骨マトリックスから放出され、そして十分な数の細
胞が得られるまで膨張のために単層培養に置かれるとき、上記軟骨細胞は、それ
らが分化されていると規定する特徴的なマーカーの産生を停止する。分化した軟
骨細胞のための２つのそのようなマーカーは、軟骨プロテオグリカン（アグリカ
ン）およびII型コラーゲンである。膨張環境では、アグリカンおよびII型コラー
ゲンの合成の低下ならびにコラーゲンＩ型の産生の増加によって示されるように
、軟骨細胞が増殖し、そして分化した表現型を次第に失う。脱分化は、細胞の平
板化（flattening）を抑制する条件、例えば高い細胞密度で、液体懸濁物中で、
コラーゲン中で、アガロース中でおよびアルギネートゲル中で、接着性の低い基
体上で、またはアクチン崩壊剤の存在下で軟骨細胞を培養することにより防止さ
れ、または逆にされ得る。しかし、連続継代により長期間にわたって脱分化した
哺乳類の軟骨細胞は一般に、所与の時間枠内で再分化するための低められた潜在
能力を示し、これは、表現型復帰速度のかなりの低下または分化プログラムに完
全に再び入る能力の低下を示す。
【０００７】 この知見に基づいて、新しい軟骨組織を再生するための別の方法が考案された。
対応する方法は、 膨張環境で再分化するための潜在能力を維持するために増殖因子の存在下で単層
培養基中で、単離された細胞を膨張させる工程、および 異なる細胞培養基を使用して、三次元環境中で、膨張した細胞を再分化させる工
程 を含む。
【０００８】 「線維芽細胞増殖因子２・・・の存在下で膨張させた哺乳類軟骨細胞」、Expe
rimental Cell Research, 253, 681-688, 1999には、線維芽細胞増殖因子２（Ｆ
ＧＦ−２）の存在下で膨張させた軟骨細胞は脱分化するが、環境変化に応答して
再分化のための潜在能力を維持することが報告されている。ＦＧＦ−２の存在下
で膨張した軟骨細胞は、三次元ポリマー足場上に接種した後、新しく単離された
軟骨細胞（一次軟骨細胞）を使用して得られるものに組織学的および生化学的に
匹敵する軟骨組織を形成する。これは、同じ程度に膨張したがＦＧＦ−２の不存
在下で膨張した軟骨細胞とは対照的である。ＦＧＦ−２の存在は、そうでなけれ
ば単層膨張中に形成されるところの密なＦ−アクチン構造の形成を抑制する。こ
の研究は、ＦＧＦ−２が、恐らくＦ−アクチン要素の構造の変化故に、単層での
軟骨細胞膨張中に軟骨細胞能力を維持すること、および軟骨組織エンジニアリン
グのための採取された組織のより有効な利用を可能にすることの証拠を提供する
。
【０００９】 組織エンジニアリングにおける他の方法が公知である。それらは、動物細胞の
増殖および分化のための培養基を作るため、または細胞の分化および増殖におけ
る生化学因子（調節因子とも言う）の役割を調べるために考案された。
【００１０】 例えば、国際特許出願公開第９０／１２０８３号は、ビタミンＡおよびＤなら
びに脂肪酸またはそのエステルを包含する動物細胞培養基を開示している。その
培地は、上皮細胞の一次または二次培養のために特に適合され、細胞系、特に骨
髄腫およびハイブリドーマの確立および維持のためにも使用され得る。文献「軟
骨細胞および他の細胞、軟骨細胞の増殖および分化・・・」 Quarto R.ら、Bon
e, GB, Pergamon Press., Vol.17, no.6, 1995, 第588頁は、軟骨前駆細胞の発
達のための、インシュリン、スリイドチロニン（thriidothyronin）およびデキ
サメタゾンを含む培養基を開示している。文献「増殖板軟骨細胞の分化における
プロスタグランジンの役割」、Kemick M.L.S.ら、Advances in Prostaglandin T
hromboxane and Leukotriene Research, 1989, 第423-426頁、および「脇軟骨細
胞分化・・・に対するプロスタグランジンＥ２の影響」、Schwartz Z. ら、Endo
crinology, vol.139, no.4, 1998, 第1825-1834頁は、プロスタグランジンが肥
大性軟骨細胞におけるアルカリホスファターゼ活性に対して効果を有すること、
およびプロスタグランジンＥ２の軟骨細胞分化に対する効果が、ｃＡＭＰおよび
蛋白質キナーゼＣによって媒介されることを示している。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
増殖因子および他の調節因子は主に、単層での膨張中に細胞の軟骨形成能を維
持することによって細胞の増殖および分化を調節することができるが、組織エン
ジニアリングで使用され得る細胞のための改善された再分化技術が望まれる。特
に、細胞−組織におけるコラーゲンＩ型（脱分化した軟骨細胞のマーカー）の発
現が、生化学的に活性な因子、例えばプロスタグランジンまたはヒスタミンの添
加によって有意に低下され得ることはまだ示されていない。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
驚いたことに、活性剤、例えばエイコサノイド、例えばプロスタグランジン、
エイコサノイドの前駆体、例えばアラキドン酸、およびエイコサノイドと協力し
て作用する創傷治癒の媒介物質、例えばヒスタミンおよびデキサメタゾンが、細
胞培養のための、特に細胞分化のための、例えば軟骨細胞に特異的な表現型の獲
得のための生化学的因子として非常に有効であることを今、見出した。
【００１３】 したがって、上記目的は、組織エンジニアリングにおいて請求項１に記載の生
化学的因子を使用することにより達成される。
【００１４】 本発明の他の目的は、細胞の良好な増殖および細胞の分化能の維持が得られる
ように、細胞集団の膨張期の間にプロスタグランジンを使用することである。
【００１５】 本発明のさらに別の目的は、組織を培養するための方法、すなわち、組織エン
ジニアリングでの使用のための請求項４記載の方法を提供することである。
【００１６】 本発明の有利な実施態様は、従属請求項から明らかになる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、 細胞集団を用意する工程； 細胞が分化機能に欠けるところの単層培養基中で、単離された細胞を膨張させる
工程；および 細胞の再分化を誘発しおよび／または加速しおよび／または促進するところの少
なくとも１の生化学因子の存在下、第二細胞培養基中で、膨張した細胞を再分化
する工程 を含む。
【００１８】 細胞の分化を高める種々の生化学因子のいずれも、請求項４に従う細胞再分化
の方法において使用され得る。本発明の方法で使用され得る生化学因子の非制限
的例は、アラキドン酸、プロスタグランジンＡ、プロスタグランジンＢ、プロス
タグランジンＥ、プロスタグランジンＦおよびヒスタミンであり、追加のホルモ
ン／コルチコイド、例えばデキサメタゾン、および増殖因子、例えばＴＧＦβを
伴っても伴わなくてもよい。
【００１９】 上記生化学因子は、好ましくは、先に成熟組織から単離されそして膨張条件下
で脱分化された細胞の再分化を誘発・促進することができる。本発明によれば、
再分化中に組織培養基に添加されるとき、その細胞集団のコラーゲンＩ型産生を
減少させる生化学因子が好ましい。
【００２０】 本発明は、上記した生化学因子が、成熟軟骨組織から単離されそして単層培養
基中で膨張した軟骨細胞の再分化プロセスを、その細胞を分化環境に移した後に
促進することを示す。特に、膨張した細胞を再分化環境で２週間培養した後、分
化指数は、プロスタグランジンＤ２および／またはＥ２の不存在下で再分化した
軟骨細胞と比較して、培地にプロスタグランジンＤ２および／またはＥ２が補充
された全ての培養条件においてより高かった。本発明によれば、コラーゲンII型
のｍＲＮＡレベルのＩ型に対する比が分化指数として定義される。なぜならば、
コラーゲンII型は、脱分化した軟骨細胞によって発現されるコラーゲンＩ型と反
対に、分化した軟骨細胞の典型的マーカーであるからである。
【００２１】 本発明では、種々の細胞型が使用され得る。本発明によれば、新しい組織を生
じさせるために前駆（幹）細胞を使用することができ、単離され膨張され得るあ
らゆる細胞型が新しい組織の再生に使用され得る。
【００２２】 請求項４に従う本発明の好ましい実施態様では、軟骨細胞、好ましくは哺乳類
、より好ましくはヒトの軟骨細胞が、成熟軟骨組織から単離され、単層培養基中
でインビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）膨張させられ、そしてプロスタグランジン
Ｄ２および／またはＥ２および／またはアラキドン酸および／またはデキサメタ
ゾンを含む第二培養基に再分化のために移される。
【００２３】 請求項４に従う本発明の別の好ましい実施態様では、再分化が、好ましくは血清
を含まない培地中で行われる。より好ましくは、再分化が、プロスタグランジン
Ｄ２および／またはＥ２およびデキサメタゾンを含み、血清を含まない培地中で
行われる。最も好ましくは、再分化が、プロスタグランジンＥ２、アラキドン酸
、ヒスタミンおよびデキサメタゾンを含み、血清を含まない培地中で行われる。
【００２４】 膨張した細胞の条件は、良質組織の再生の成功に重要な影響を及ぼす。したがっ
て、膨張した細胞は分化の段階に関して均一であること、および従って、脱分化
した細胞の均一な集団を達成するために、および高品質の軟骨組織の良好な再生
が移植のために確実にされ得るように細胞の適切な分化特性を保持しながら軟骨
細胞の増殖速度を高めるために、増殖因子および／またはホルモンの添加によっ
て増殖環境を操作することが好ましい。使用され得る増殖因子の例は、血小板由
来増殖因子、表皮増殖因子、ヘパリン結合因子、形質転換増殖因子αおよびβ、
α線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、インシュリン様
増殖因子、骨形態形成蛋白質、および血管内皮増殖因子である。使用され得るホ
ルモンの例は、プロスタグランジン、例えばプロスタグランジンＤ２およびＥ２
である。
【００２５】 請求項４に従う本発明の別の好ましい実施態様では、哺乳類の軟骨細胞、好まし
くはヒトの軟骨細胞を、ＦＧＦ−２、血小板由来増殖因子および軽質転換増殖因
子β（ＴＧＦβ）を含む培地中で膨張させる。
【００２６】 ＦＧＦ−２を含む細胞培養基で膨張したヒト軟骨細胞は、血清を実質的に含まず
、かつインシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸（selenous acid）、リノ
ール酸、ウシ血清アルブミン、および上記した生化学因子の少なくとも１を含む
細胞培養基中で優先的に再分化される。
【００２７】 本発明の別の実施態様では、ホルモン（例えば、インシュリングルカゴンまたは
エストロゲン）および／または血管形成性因子が、インビトロ増殖、すなわち膨
張のために使用され得る。軟骨組織から新しく単離された軟骨細胞は、軟骨細胞
の高められた増殖をもたらすインシュリンに正常に応答する。最初にＦＧＦ−２
の存在下で膨張させられた軟骨細胞は、軟骨組織から直接採取され、そして介在
する膨張工程を伴うことなく移植マトリックス上に直接接種された軟骨細胞と同
様に、インシュリンに応答する。ＦＧＦ−２膨張した軟骨細胞は、新しく採取さ
れた軟骨細胞と同様に、インシュリンに非常に応答するので、それらは、組織再
生をさらに刺激するために追加のホルモンおよび増殖因子の使用を含む治療にお
ける軟骨再生のための適切な細胞集団を表し得る。
【００２８】 当業者であれば、細胞の膨張および再分化の本発明方法が適用され得る種々の細
胞型を理解するであろう。組織エンジニアリング法は、無数の種々の細胞型を使
用することによって欠陥を修正するために使用されている。組織エンジニアリン
グは、硬質組織欠陥、例えば病気または外傷から生じる軟骨または骨の欠陥など
の修正に適用され得る。組織エンジニアリングはまた、軟質組織構造の修正にも
適用されている。例えば、本発明で使用される細胞は、代謝器官（肝臓または膵
臓）や表皮組織（例えば、火傷を負った者の組織）の再生、または胸組織の再構
築または増大（例えば、乳癌、先天的欠陥、または外傷から生じた損傷に苦しむ
女性の胸を再構築するために筋肉細胞が使用される。米国特許第５，５１２，６
００号および国際特許出願公開第９６／１８４２４号を参照。これらはともに、
引用することにより本明細書に組み入れられる。）に使用され得る。さらに、先
天的欠陥、例えば膀胱尿管逆流現象、または失禁は、尿の通過にわたって必要な
制御を付与しまたは欠陥を修正する筋肉領域を生じるのに有効な量の筋肉細胞が
接種されたゲルまたは足場マトリックスを移植することにより修正され得る（米
国特許第５，６６７，７７８号、引用することにより本明細書に組み入れられる
）。
【００２９】 本発明によれば、特定の物理的位置を再構築しまたは増大するために使用される
細胞は、体内でその組織を通常構築する細胞と異なり得る。例えば、軟骨細胞は
、充填剤として作用することにより軟質組織欠陥の修正に使用され得る。
【００３０】 三次元環境における哺乳類細胞（例えば、軟骨細胞および骨）が、単層培養にお
ける細胞とは非常に異なって刺激（例えば、生化学因子および流体力学因子また
は信号）に応答することは公知である。軟骨細胞を再分化のために単層培養から
三次元環境へ移す、例えば生物分解可能なポリマー足場（例えば、ポリグリコー
ル酸から作られたメッシュ）上に接種する、または円錐形チューブ中で球状ペレ
ットを形成することにより、軟骨細胞の分化した表現型が安定化され得ることが
示されている。
【００３１】 好ましくは、細胞が自家移植細胞である。あるいは、細胞が、密接に関係するも
のまたは同じ種の個体から単離される。当業者であれば理解されるように、増殖
または分化細胞刺激に応答する細胞集団が組織エンジニアリングでの使用に有利
である。そのような刺激に一層良好に応答し得る細胞集団は、より素早く、より
信頼性を持って再生し、そしてその結果、移植のためのより良質の組織を生じる
。
【００３２】 本発明のさらに別の実施態様では、細胞の膨張が、核酸の細胞へのトランスフェ
クションの効率をも改善する。典型的には、単層膨張の間に遺伝子の転移が行わ
れる。従って、組織エンジニアリング法が遺伝子治療と組み合わせられるところ
の適用が、本発明の開示に従って利用され得る。例えば、種々の生物学的および
化学的化合物（例えば抗体、サイトカインおよび炎症剤）に対する耐性を付与す
るベクターが細胞にトランスフェクションされ得る。
【００３３】 本発明に従って再分化された細胞は、適する生物分解可能なポリマーマトリクッ
スと共に移植されて新しい組織を形成し得る。使用され得る種々の形状のマトリ
ックスがある。非限定的例は、その中に細胞を懸濁させる、アルギネートなどの
物質で形成されたポリマーゲル、約１００〜３００μｍの間隙空間を有する繊維
マトリックス、および３Ｄフォームを包含する。マトリックスは、天然に存在す
るポリマー（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲンなど）、または合成ポリマー（
例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸など）、またはその両方に基づき得る。ヒ
ドロゲルポリマー溶液およびポリマーマトリックスの詳細な説明、ならびに移植
の他の方法に関しては、米国特許第５，７１６，４０４号を参照。代謝器官およ
び他の組織を再生するための、生物分解可能なポリマーを使用する他の方法に関
しては、Cimaら、Biotechn. Bioeng., 38, 145-158, 1991; Langerら、Biomater
ials, 11, 738-745, 1990; Vacantiら、J. Pediatr. Surg., 23, 3-9, 1988; お
よびVacantiら、Arch. Surg., 123, 545-549, 1988を参照。
【００３４】 いくつかの実施態様では、細胞−マトリックス構造が、組織エクスパンダーデバ
イスと組み合わせて移植される。細胞−マトリックスが移植されるとき、または
細胞が増殖しそして新しい組織を形成するとき、エクスパンダーのサイズは、そ
れを除去することができかつ所望の再構築または増大が得られるまで縮小される
。
【００３５】
【実施例】
次に、本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、以下の実施例は
本発明の範囲を限定するものではない。これらの実施例は、図面を参照して説明
される。
【００３６】 培養段階Ｉ：細胞の単離および単層での膨張 大腿骨頚部破砕後に関節置換を受けた、関節疾患の病歴のない３人の患者（６
７、７３および８４歳）の股関節から、ヒト関節軟骨サンプルを採集した。 軟骨サンプルを無菌的に採取し、０．１５％のII型コラゲナーゼで２２時間消
化して、一次軟骨細胞を単離した。細胞を洗浄し、１０％のウシ胎仔血清、４，
５００ｍｇ／リットルのＤ−グルコース、非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸
ナトリウム、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１
００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および０．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタ
ミンが補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に再懸濁した（対
照培地、ＣＴＲ）。軟骨細胞を、約１０4細胞／ｃｍ2で組織培養フラスコ中に接
種し、加湿された３７℃／５％ＣＯ2のインキュベーター中で培養した。 約１０日後、細胞が融合したとき、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ
を使用して第一継代細胞（Ｐ１）を分離し、５ｘ１０3細胞／ｃｍ2で再培養した
。さらに１週間後、細胞が再び融合したとき、第二継代細胞（Ｐ２）をトリプシ
ン処理し、ペレット状で培養した。膨張期の間、５ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖
因子−２（ＦＧＦ−２）の添加を伴ってまたは伴わないで、対照培地中で細胞を
培養した。
【００３７】 段階II：ペレット状のヒト軟骨細胞の培養 ＩＴＳ＋１（１０μｇ／ｍｌのインシュリン、５．５μｇ／ｍｌのトランスフ
ェリン、５ｎｇ／ｍｌのセレニウム、０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、
４．７μｇ／ｍｌのリノール酸を含む）、０．１ｍＭのアスコルビン酸２−ホス
フェート、および１．２５μｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンが補充されたＤＭＥ
Ｍから成る、血清を含まない培地（ＳＦ）に５ｘ１０5細胞／０．５ｍｌで細胞
を懸濁した。この懸濁物をポリプロピレンの円錐チューブで１５秒間、８０００
ｒｐｍ未満で遠心分離して、球形ペレットを形成し、次いでそれを、加湿された
３７℃／５％ＣＯ2のインキュベーター中で２４時間、静的にインキュベートし
た。次いで、ペレットを軌道撹拌器（orbital shaker）（３０ｒｐｍ）上に置き
、以下の種々の組み合わせが補充されたＳＦ中で２〜４週間培養した。 １０-7Ｍのデキサメタゾン（Ｄ）、 １μｇ／ｍｌのアラキドン酸（Ａ）、 １μｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ２（Ｐ）、および １０-4Ｍのヒスタミン（Ｈ）。 ヒト軟骨細胞ペレットの３Ｄ培養中、Ｐを単独で、またはＡおよび／またはＤ
および／またはＨおよび／またはＴと組み合わせて、ＳＦ培地に補充した。２週
間後、分化指数（ＣII／ＣＩおよびＡｇｇ／Ｖｅｒ）を評価した。
【００３８】 以下の６個の実験群を形成した。 ＳＦ ＳＦ＋Ａ＋Ｐ ＳＦ＋Ｄ＋Ｐ ＳＦ＋Ｄ＋Ａ＋Ｐ ＳＦ＋Ｄ＋Ａ＋Ｐ＋Ｈ ＳＦ＋Ｄ＋Ａ＋Ｐ＋Ｈ＋Ｔ（ＴＧＦβ） さらに、各一次培養のために、実験群ごとに２つのペレットを形成し、下記に
説明するように、組織学的におよび定量的ＰＣＲに関して評価した。
【００３９】 組織学： ペレットを４％の緩衝剤処理されたホルマリンに４℃で２４時間固定した。次
いで、それらをパラフィンに包埋し、そして５μｍの断片に切断した。サンプル
の薄片を、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のためにサフラニンＯで染色
した。
【００４０】 リアルタイム定量的ＰＣＲ： 理論的基礎：リアルタイム定量的ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅の各サイクル後に、配
列特異的な、二重標識された蛍光プローブの低下をモニターする。伸長期の間、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性がプローブを切断し
て、３’−消去剤（quencher）蛍光染料から５’−リポーター蛍光染料を分離し
、リポーター蛍光染料の発光スペクトルの増加を生じる。最初の１５増幅サイク
ルの間に計算された、バックグラウンドの蛍光を差し引いた後、測定された蛍光
を増幅プロットとしてグラフに示した。各反応は、リポーター蛍光発光が増幅プ
ロットの指数関数的領域において所定の閾値レベルに達するサイクルの分数とし
て定義される値Ｃｔによって特徴付けられる。Ｃｔ値は、インプット標的ｍＲＮ
Ａ量に相関する。ｍＲＮＡ標的の出発量が多いほど、リポーター蛍光発光が閾値
に達するのに要するＰＣＲサイクル数は少なくなり、従って、より低いＣｔ値が
得られる。すなわち、上記方法は、慣用のＰＣＲのように、所定数のサイクル後
の増幅された生成物の総量の測定に基づくのではなく、そして生成物の後ＰＣＲ
処理を必要としない（Gibson UEら、1996）。
【００４１】 プライマーおよびプローブ：最小内部構造（すなわち、プライマー−二量体構
成）および類似の溶融温度を表示するために、ヒトＧＡＰＤＨ、コラーゲンＩ型
、II型、アグリカン（Aggrecan）、およびバーシカン（Versican）のためのプラ
イマーおよびプローブを、Primer Expressコンピュータープログラム（Perkin-E
lmer Applied Biosystems, Foster City, CA）の助けによって設計した。上記プ
ライマーおよびプローブのために選択されたヌクレオチド配列の全体の遺伝子特
異性を、ＢＬＡＳＴＮサーチ（GenBankデータベース配列）によって確認した。
混在しているゲノムＤＮＡがプローブによって認識されることにより誘導される
非特異的蛍光発光を回避するために、プローブの真ん中の３分の１を、２つのエ
キソンの間の連結部に置いた。プライマーは、Microsynth（Balgach、スイス国
）から購入され、プローブは、Perkin-Elmer Applied BiosystemsまたはEurogen
tech（Seraing、ベルギー国）から購入された。設計されたプライマーおよびプ
ローブのための最適な濃度を、最も高い蛍光レベルおよび最も低いＣｔ値を与え
る、最も低い濃度として決定した。各標的遺伝子のための増幅の効率は、Jakob
らに記載されているように評価されるとき、常に９０％より上であった。
【００４２】 全ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成：ＲＮＡを、標準の単一工程による酸−フェ
ノールグアニジニウム法（Chomczynski Pら、1987）を使用してペレットから抽
出した。ｃＤＮＡを、ｄＮＴＰおよびＤＴＴの存在下、マウスＭＬＶ逆転写酵素
（ＢＲＬ、Gaithersville、MD）を使用して、製造者の指示に従って、２μｇの
ＲＮＡから作製した。
【００４３】 ＰＣＲ増幅および分析：ＰＣＲ反応を、ＡＢＩ Prism 7700配列検出システム
（Perkin-Elmer Applied Biosystems）を使用して行い、モニターした。ＰＣＲ
マスター混合物は、AmpliTaq Gold ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer Applied
Biosystems）に基づいた。ｃＤＮＡサンプル（１ウェルにつき合計２５μｌ中
に２．５μｌ）を１回または２回分析した。プライマーおよびプローブを、５０
〜９００ｎＭの濃度で使用した。９５℃で１０分間、初期変性を行った後、９５
℃で１５秒間の変性工程および６０℃で１分間の伸長工程から成る５０ＰＣＲサ
イクルを用いてｃＤＮＡ生成物を増幅した。データ分析は、Sequence Detector
Vプログラム（Perkin-Elmer Applied Biosystems）を使用して行われた。各サン
プルに関して、Ｃｔ値を、蛍光強度が０．０５に達するサイクル数として決定し
た。０．０５の値は、全ての曲線がこの範囲で対数増幅期にあることを確認した
後に選択された。各ｃＤＮＡサンプルに関して、各標的配列のＣｔ値を、参照遺
伝子（ＧＡＰＤＨ）のＣｔ値に関して差し引いて、ΔＣｔを誘導した。次いで、
各標的遺伝子の発現レベルを２ΔCtとして計算した。この式は、関与する遺伝子
およびハウスキーピング遺伝子の増幅効率が同等であり（＜１０％の差）、かつ
１００％に近い（ＰＥ−ＡＢＩ；Sequence Detector User Bulletin 2）という
仮定に基づく。ＧＡＰＤＨは、軟骨細胞遺伝子発現に関する先の研究の多くに基
づいて、参照ハウスキーピング遺伝子として選択された。
【００４４】 コラーゲンII型およびアグリカンは、脱分化された軟骨細胞によって線維軟骨
中で発現されるところのコラーゲンＩ型およびバーシカンとは反対に、ヒアリン
軟骨中の分化した軟骨細胞の典型的なマーカーであるので、コラーゲンII型とＩ
型とのｍＲＮＡレベルの比（ＣII／ＣＩ）およびアグリカンとバーシカンとのｍ
ＲＮＡレベルの比（Agg／Ver）は、各々、コラーゲンおよびプロテオグリカンの
発現に関する「分化指数」を定義する。
【００４５】 結果： ＦＧＦ−２を用いないで先に膨張させたペレット培養物における膨張した軟骨
細胞の再分化は、ペレットが生化学因子として少なくともプロスタグランジンを
含む規定された培地中で培養されるならば、ＣII／ＣＩおよびAgg／Ver比は、対
照培地ＳＦと比較して、はるかに高いことを示した。最も高いＣII／ＣＩｍＲＮ
Ａ比は、ＳＦ＋Ｄ＋Ａ＋Ｐ＋Ｈに基づくペレットにおいて検出され、最も高いAg
g／Ver ｍＲＮＡ比は、ＳＦ＋Ｄ＋Ａ＋Ｐ＋Ｈ＋Ｔに基づくペレットにおいて検
出された。
【００４６】 上記アッセイから、ＳＦ培地にＰが補充された全ての培養条件では、分化指数
（ＣII／ＣＩおよびAgg／Ver）が、対照培養物と比較して少なくとも２のオーダ
ーの大きさで高かったと結論付けることができる。
【００４７】 これらの全ての効果は、ＦＧＦ−２を用いて膨張させた軟骨細胞に関して同等で
ある。このことは、Ｐが補充された培地が、増殖因子を伴って膨張させた軟骨細
胞に対しても有益な効果を有することを示唆する。
【００４８】 ＰＤＧＦｂｂ、ＧＦＧ−２およびＴＧＦｂを用いて膨張させた軟骨細胞が接種さ
れかつＳＦ ＤＡＰＨＴ培地で培養されたＰＧＡメッシュは、組織学的に軟骨組
織に似ており、細胞は典型的な軟骨細胞形態学を示し、そして、ヘマトキシリン
／サフラニンＯ染色によって評価されかつ図４に示されるように、周囲の細胞外
マトリックスが硫酸化グリコサミノグリカンを含む。
【００４９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、種々の培養基中で再分化され、そしてＦＧＦ−２を用いてまたは用い
ないで予め膨張させたヒト軟骨細胞に基づく６個のペレットの分化指数ＣII／Ｃ
Ｉを表すグラフを示す
【図２】 図２は、上記の６個のペレットのＩ型コラーゲンｍＲＮＡのレベルを表すグラ
フを示す。
【図３】 図３は、上記６個のペレットの分化指数Ａｇｇ／Ｖｅｒ比を表すグラフを示す
。
【図４】 図４は、デキサメタゾン、アラキドン酸、プロスタグランジンＥ２、ヒスタミ
ンおよびＴＧＦｂの存在下で６週間培養されたヒト軟骨細胞−ＰＧＡメッシュ構
築物のサフラニンＯ染色された組織学的部分である。ヒト軟骨細胞は、ＰＤＧＦ
ｂｂ、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβを用いて予め膨張させた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B065 AA93X BB08 BB10 BB19 BB20 BB32 BB34 CA24 CA44

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 組織エンジニアリングにおいて（ｉ）前駆細胞、（ii）成熟細
    胞、および／または（iii）脱分化した細胞の分化のために少なくとも１の生化
    学因子を使用する方法において、該少なくとも１の生化学因子が、プロスタグラ
    ンジンおよび他のエイコサノイド、アラキドン酸および他の、エイコサノイドの
    前駆体、ならびにヒスタミン、デキサメタゾンおよび他の、エイコサノイドと協
    力して作用する創傷治癒の媒介物質から成る群から選択される方法。
  2. 【請求項２】 細胞の分化能を維持しながら細胞の膨張を支えるための生化学
    因子としてプロスタグランジンを使用する方法。
  3. 【請求項３】 少なくとも１の生化学因子が、プロスタグランジンＤ２または
    Ｅ２である、請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 細胞を用意する工程； 細胞が分化機能に欠けるところの第一培養基中で、単離された細胞を膨張させる
    工程；および 膨張した細胞を第二細胞培養基中で再分化する工程 を含む、組織を再生する方法において、膨張した細胞の再分化が、細胞の再分化
    を誘発しおよび／または加速しおよび／または促進するところの少なくとも１の
    生化学因子の存在下で行われることを特徴とする方法。
  5. 【請求項５】 細胞を用意する工程が、哺乳類の細胞を用意することを含むこ
    とを特徴とする、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 細胞を用意する工程が、ヒトの細胞を用意することを含むこと
    を特徴とする、請求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】 細胞を用意する工程が、軟骨細胞を用意することを含むことを
    特徴とする、請求項５または６記載の方法。
  8. 【請求項８】 細胞を用意する工程が、前駆細胞を用意することを含むことを
    特徴とする、請求項５または６記載の方法。
  9. 【請求項９】 膨張した細胞の再分化が、プロスタグランジンおよび他のエイ
    コサノイド、アラキドン酸および他の、エイコサノイドの前駆体、ならびにヒス
    タミン、デキサメタゾンおよび他の、エイコサノイドと協力して作用する創傷治
    癒の媒介物質から成る群から選択される少なくとも１の生化学因子の存在下で行
    われることを特徴とする、請求項４〜８のいずれか１項記載の方法。
  10. 【請求項１０】 再分化が、プロスタグランジンＤ２および／またはＥ２の存
    在下で行われることを特徴とする、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 成熟軟骨組織から軟骨細胞を単離する工程； 該細胞を単層培養基中でインビトロで膨張させる工程；および 膨張した細胞を、再分化のために、該生化学因子の少なくとも１を含む第二培養
    基に移す工程 を特徴とする、請求項４〜１０のいずれか１項記載の方法。
  12. 【請求項１２】 再分化が、血清を含まない培地で行われることを特徴とする
    、請求項４〜１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】 血清を含まない培地が、インシュリン、トランスフェリン、
    亜セレン酸、アルブミン、リノール酸およびアスコルビン酸を含むことを特徴と
    する、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 血清を含まない細胞培養基が、少なくとも１の増殖因子を含
    むことを特徴とする、請求項１２または１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 血清を含まない細胞培養基が、形質転換増殖因子βを含むこ
    とを特徴とする、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 細胞の膨張が、少なくとも１の増殖因子の存在下で行われる
    ことを特徴とする、請求項４〜１５のいずれか１記載の方法。
  17. 【請求項１７】 細胞を膨張させる工程が、血小板由来増殖因子、表皮増殖因
    子、ヘパリン結合因子、形質転換増殖因子αおよびβ、α線維芽細胞増殖因子、
    線維芽細胞増殖因子２、インシュリン様増殖因子、骨形態形成蛋白質、血管内皮
    増殖因子、およびプロスタグランジンから成る群から選択される少なくとも１の
    因子を含むことを特徴とする、請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 細胞の膨張が、血小板由来増殖因子、形質転換増殖因子β、
    および線維芽細胞増殖因子２の存在下で行われることを特徴とする、請求項１７
    記載の方法。
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