JP2003532867A - より少ない副作用を有するヌクレオチド合成阻害剤の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヌクレオチド合成阻害剤をヒトの状態に適合する哺乳動物に有効量で投与し、該哺乳動物の血液中のヌクレオチド合成阻害剤濃度を測定し、該ヌクレオチド合成阻害剤の半減期がＮ−(４−トリフルオロメチルフェニル)−２−シアノ−３−ヒドロキシ−クロトン酸アミドの半減期よりも短いかどうかを確認することによる、改善された治療ウインドウを有するヌクレオチド合成阻害剤の検出方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、より少ない副作用を示すヌクレオチド合成阻害剤の検出方法に関す
る。 新しい医薬の根本的な問題は、許容性と効力との関係にある。有効量と副作用
を示す量との間隔（＝治療ウインドウ）が大きいほど、この種の物質の使用には
危険がなく、この物質は患者に対する許容性がより良好である。

【０００２】 プリンおよびピリミジン合成阻害剤を含む細胞増殖抑止剤は、これまでの経験
によれば、それらの主要な効果（細胞増殖の抑制）によって副作用も誘発するの
で、比較的に狭い治療ウインドウを有する。この性質が腫瘍学的適応症における
使用の妨げとなることは、免疫学的に限定された疾患の治療におけるよりも少な
い。従って、この種の活性物質の使用は、免疫学的疾患においては著しく制限さ
れる。

【０００３】 プリンまたはピリミジン合成を阻害する化合物は、ヌクレオチド合成阻害剤と
呼ばれており（Burkhardt および Kalden；Rheumat. Int. (1997); 17:85-90）
、これらは例えばＮ−(４−トリフルオロメチルフェニル)−５−メチルイソキサ
ゾール−４−カルボキサミド、Ｎ−(トリフルオロメチルフェニル)−２−シアノ
−３−ヒドロキシクロトン酸アミド、２−シアノ−３−シクロプロピル−３−ヒ
ドロキシ−アクリル酸(４−シアノフェニル)−アミドまたはＮ−(トリフルオロ
メチルフェニル)−２−シアノ−３−ヒドロキシ−ヘプタ−２−エン−６−イン
−カルボン酸アミドのような化合物、ブレキナル(Brequinar)（６−フルオロ−
２−(２′−フルオロ[1,1′ビフェニル]−４−イル)−３−メチル−４−キノリ
ンカルボン酸）、ミコフェノラートモフェチル(Mycophenolatmofetil)（(E)−６
−(1,3−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソイ
ソベンゾフラン−５−イル)−４−メチル−４−ヘキサノエート）、メトキシト
レキセート(Methotrexat)（CAS-No. 59-05-02）またはミゾリビン(Mizoribine)
（CAS-No. 50924-49-7）である。

【０００４】 ヌクレオチド合成阻害剤は、慢性関節リウマチまたは尋常性天疱瘡のような免
疫学的に限定された疾患の処置に適している。 公知のヌクレオチド合成阻害剤の欠点は、胃腸管、骨髄、毛髪その他に対する
副作用である。これらの関係で、新規な医薬の臨床的開発においては極めて遅く
なってから初めて、少ない副作用が見出され、このことは多くの場合に開発の中
断をもたらす。

【０００５】 本発明の目的は、ヌクレオチド合成阻害剤が、生体内でその細胞内に存在する
標的にほんの短期間で到達し、そこでヌクレオチド合成をもはや阻害しない濃度
まで短時間以内に再び低下することによって、免疫学的疾患の処置におけるヌク
レオチド合成阻害剤の副作用を強く減少できるという観察を利用することである
。この手段により、免疫系に対する望ましい効果を余儀なく損失することなしに
、ヌクレオチド合成阻害剤の副作用を強く減少させることが可能である。

【０００６】 この知見を用いると、免疫学的に限定された疾患の処置において、極めて低い
副作用率で極めて良好な効力を示すヌクレオチド合成阻害剤を短時間以内に開発
することが可能である。

【０００７】 本発明の課題は、医薬の研究において物質の早期開発段階で既に、免疫学的適
応症におけるこれらの物質の予期すべき治療ウインドウを、技術的に容易に測定
可能な特性に基づいて正しく確認できることである。 この課題は、ヒトにおける薬物動態学的状態または臨床開発のフェーズＩのヒ
トにおける薬物動態学的状態に適合する哺乳動物の血液中のヌクレオチド合成阻
害剤の半減期を測定し、この半減期を公知のヌクレオチド合成阻害剤の半減期と
比較することによって解決される。

【０００８】 従って、本発明は、 ａ）ヌクレオチド合成阻害剤をヒトの状態に適合する哺乳動物に有効量で投与
し、 ｂ）該哺乳動物の血液中のヌクレオチド合成阻害剤濃度を測定し、 ｃ）該ヌクレオチド合成阻害剤がＮ−(４−トリフルオロメチルフェニル)−２
−シアノ−３−ヒドロキシクロトン酸アミドの半減期よりも短い半減期を示すか
どうかを確認することを特徴とする、より少ない副作用を示すヌクレオチド合成
阻害剤の検出方法に関する。

【０００９】 ヌクレオチド合成阻害剤は、インビトロでプリンまたはピリミジン合成を阻害
する化合物である。「半減期」という用語は、血漿中のヌクレオチド合成阻害剤
濃度が半分になる時間を意味する。

【００１０】 薬物動態学的比較研究に適する哺乳動物は、例えばマウス、ラット、ウサギ、
イヌ、サルまたはブタである。ヒトにおける半減期を測定することが好ましい。
半減期は、使用する動物およびヌクレオチド合成阻害剤に応じて著しく異なる。
Ｎ−(４−トリフルオロメチルフェニル)−２−シアノ−３−ヒドロキシクロトン
酸アミドの半減期は、例えばラットでは約４〜８時間であり、ヒトでは３５０時
間以下である。１５０時間未満、好ましくは４０時間未満のヒト血漿中の半減期
を示すヌクレオチド合成阻害剤が好ましい。

【００１１】 本発明方法の利点は、ヌクレオチド合成阻害剤の予期すべき治療ウインドウを
、血漿中の半減期の測定によって、医薬開発の極めて早い段階までに速やかに確
認できることである。一方でそうしないと、医薬の用量範囲は、数週間から数年
の治療期間に広範囲の臨床検査によって初めて判明する。従って、医薬物質の開
発を著しく促進することができる。

【００１２】 下記の実施例では、免疫系に対するヌクレオチド合成阻害剤の望ましい効果に
関して、より長い半減期を有する物質が、より短い半眼期を有するよりも優れて
いることが証明される。

【００１３】実施例１ Ｎ−(４−トリフルオロメチルフェニル)−２−シアノ−３−ヒドロキシクロトン
酸アミド（以下、化合物１）の用量−効果の関係 化合物１の用量−効果関の係を、アジュバント誘導関節炎のモデル（Pearson
C.M. および Wood F.D. の方法; Arth. Rheum. 2:44 (1995) および Taurog J.D
., Argentieri D.C. ら, Meth. Enzymol. 162:339 (1988)）において作成した。
足の腫脹、一般化した関節炎症状の形成（スコア指数）、体重増加および動物の
生存を測定した。

【００１４】 １％カルボキシメチルセルロース溶液（ＣＭＣ）中の化合物１を、実験の開始
から第２１日に終了するまで経口投与した。コントロールグループには、活性物
質を含まない１％ＣＭＣの相当量を与えた。約２１０ｇの体重を有する６匹の雄
ルイスラットを各実験グループに用いた。 表１に２１日後の結果を示す。負の数値は、それぞれの測定パラメーターの悪
化を示す。

【００１５】

【表１】

【００１６】 ラットにおけるアジュバント誘導関節炎モデルでは、ヒトにおけるリウマチ性
形態の範囲から生じる自己免疫疾患に相当する自己免疫反応が観察される。 この実験では、化合物１は、ラットにおいて毎日１回２.５mg／kgの用量から
、極めて良好な効果を示すことが証明される。２.５mg／kg未満の用量では、効
果が強く低下する。１mg／kg／日の化合物１では、効果を全く確認することがで
きない。

【００１７】実施例２ ラットにおける化合物１の血漿レベル 化合物１を検出するために、選択的ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を用いた。血漿か
らの化合物１の定量測定を下記のように行った： 採取した血漿に内部標準物の溶液を加え、次いで０.１ｍのＮａＯＨ溶液およ
び１mlのジエチルエーテルを加えた。この混合物を激しく振盪し、有機相を捨て
た。水相に０.５ＮのＨＣｌ溶液を加え、アナライトおよび内部標準物を１mlの
ジエチルエーテルで抽出した。有機相を蒸発濃縮し、アセトニトリルおよび水の
１：１混合物に吸収させた。この溶液１０μlをＨＰＬＣ装置に注入した。

【００１８】 このＨＰＬＣ装置は Lichrospher C-18HD カラムを含んでいた。１ml／分の流
速で、アセトニトリル＋（酢酸アンモニウム溶液[１０モル]）６７＋３３の移動
剤の組み合わせを用いてアナライトおよび内部標準物を溶離し、続いて質量分析
法で選択的に検出した（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法）。血漿プローブの分析中に校
正プローブを随伴させた。 異物代謝の同一状況を予知するために、薬力学的実験のように化合物１をアジ
ュバント関節炎動物だけに投与した。関節炎は実施例１と同様に誘導した。動物
の体重は平均２１０ｇであり、各グループは６匹の雄ルイスラットからなってい
た。尾先端の切断により血液を採取した。

【００１９】 コレスチルアミンによる化合物１の血漿レベルに対する影響を研究した。化合
物１を、アジュバント関節炎に対して薬力学的効果を示す最低用量である２.５m
g／kg／日で投与した。コレスチルアミンとの組み合わせ療法においては、化合
物１の投与後４時間に１０００mgのコレスチルアミンを投与した。コントロール
動物には、活性物質を含まない１％ＣＭＣを相当する時点で与えた。コレスチル
アミンによる化合物１の薬物動態学に対する影響を、コレスチルアミンと共にま
たはこれなしで、化合物１の１回投与後ならびに慢性投与により研究した。化合
物１の最終投与後２、４、６、８、２４および４８時間に血液サンプルを採取し
た。

【００２０】 表２は、コレスチルアミンと共におよびこれなしで１回投与後の化合物１の薬
物動態学的パラメーターを示し；表３は、コレスチルアミンと共におよびこれな
しで慢性投与後の化合物１の薬物動態学的パラメーターを示す。

【００２１】

【表２】

【００２２】 「曲線下の範囲」（ＡＵＣ）という用語は、時間に対して記録した医薬物質の
濃度レベルの下の面積を意味する。ＡＵＣは、生体が物質にさらされる程度を反
映する。「慢性投与」という用語は、少なくとも一定の化合物１の血中レベルを
生じさせる時間にわたって、化合物１を投与することを意味する。この一定の血
中レベル（「定常状態」）は、一様な取り込みにより約４〜５半減時間後に得ら
れる。

【００２３】

【表３】

【００２４】 ４時間後にコレスチルアミンを投与したか否かとは無関係に、化合物１の投与
後から最初の４時間の時点までに同一のピーク血中レベルに達することが証明さ
れた。しかしながら、コレスチルアミンの投与により、化合物１の血中レベルは
より遅い時点で強く低下した。 この実験から、コレスチルアミンの投与により、予めブロックされなかった吸
収期の後で、化合物１の血中レベルを明らかに低下させうると結論することがで
きる。曲線下の範囲（ＡＵＣ）は、１回投与では３０％だけ、複数回投与では４
０％だけ減少する。

【００２５】実施例３ 実施例３では、コレスチルアミンを４時間の時間間隔で投与することにより、
化合物１の最低用量の効果が低下するかどうかを研究した。これをアジュバント
関節炎モデルで研究した。このモデルは実施例１と同様に作成した。化合物１を
、１％カルボキシメチルセルロース中で２.５mg／kg／日の用量で、研究の開始
から終了まで毎日経口投与した。コレスチルアミンは、化合物１の投与後４時間
に１％カルボキシメチルセルロース中で同様に経口投与した。相当するコントロ
ールグループには、化合物１を１％カルボキシメチルセルロース溶液中で同様に
経口投与した。 表４に結果を示す：

【００２６】

【表４】

【００２７】 実施例３では、免疫系に対する化合物１の望ましい効果が、長時間持続する比
較的に一定した血中レベルのためであるのかどうか、または短期間生じる化合物
１の血中レベル（ピーク血中レベル）がこの効果を規定するのかどうかを研究し
た。

【００２８】 このために、化合物１を２.５mg／kg／日の最低有効量で（実施例１参照）毎
日１回経口投与した。相当する比較グループには、生じた吸収期後の化合物１の
血中レベルの低下を促進させるために、化合物１の投与後４時間にコレスチルア
ミンを投与した。これによって、免疫学的に限定された病理学的過程に対する種
々の長さの時間持続する化合物１の血中レベルの効果を、ラットのアジュバント
誘導関節炎モデルで研究した。化合物１の投与後４時間にコレスチルアミンを投
与したか否かとは無関係に、アジュバント誘導関節炎に対する化合物１の効果に
は差異がないことが証明された。

【００２９】 化合物１の最低有効量において、投与後４時間の血中レベルの低下は化合物１
の効果の低下を引き起こさないので、この効果はもっぱらピーク血中レベルのた
めであり、化合物１の持続する血中レベルのためではないと結論づけることがで
きる。 実施例２および３により、Ｎ−(４−トリフルオロメチルフェニル)−５−メチ
ルシロキサゾール−４−カルボキサミド（Leflunomide）の効果には短期間のピ
ーク血中レベルだけが必要であり、Leflunomide の効力には持続する血中レベル
が寄与しないというヒトの臨床からの観察が確認された。

【００３０】実施例４ 免疫学的に限定された疾患である尋常性天疱瘡に罹患した患者において、Ｎ−
(４−トリフルオロメチルフェニル)−５−メチルシロキサゾール−４−カルボキ
サミド（Leflunomide）を用いた治療では、この自己免疫疾患症状は実際に完全
に消失したが、患者は永続的な下痢に悩まされた。この下痢はクオリティオブラ
イフにマイナスの影響を与える。この副作用の問題に基づいて、１日当たり２０
mgのLeflunomideの一定用量を用いた２年以上の治療の後で、この治療をやめて
みた。この場合、Leflunomideの中止後４日に、自己免疫疾患である尋常性天疱
瘡の実質的な再発が観察された。しかしながら、この期間中にLeflunomide治療
の副作用は消失しなかった。

【００３１】 この観察は、Leflunomide の活性代謝産物である化合物１がヒトにおいて約１
４日の半減期を有するので、予想外であった。さらにこの患者では、Leflunomid
e の活性代謝産物の血中レベルは、しばしば７０mg／Ｌ〜８５mg／Ｌの比較的に
高い範囲で測定された。リウマチ様関節炎を患い、Leflunomide で処置された患
者の検査は、３２mg／Ｌを越える化合物１の血中レベルを示した。この観察から
、この患者に存在した比較的にゆっくりと低下する化合物１の血中レベルが実際
に副作用の原因であるが、免疫系に対する望ましい効果の原因ではないと結論す
ることができる。

【００３２】 さらに、これらの観察は、免疫系に対する Leflunomide の望ましい効果が、
吸収後の化合物１および／または Leflunomide の短時間の比較的に低い局所的
なピーク濃度によって引き起こされ、化合物１の高い一定の血中レベルによって
引き起こされるのではないことを示す。

【００３３】 これらの観察から、良好に許容されるヌクレオチド合成阻害剤は、ほんの短時
間でその作用部位に到達すべきであり、従って著しい副作用を生じることなく、
この阻害剤がその作用部位で免疫系に対してその望ましい効果を発揮できること
が明らかである。驚くべきことに、より長く作用部位に滞留すると、免疫系に対
する効力の上昇には寄与せず、望ましくない副作用の増加をもたらす。 この効果は、Leflunomide および／または化合物１のようなヌクレオチド合成
の阻害剤であり、生体内で作用部位の短い滞留期間（半減期）を示す物質を用い
て得ることができる。

【００３４】実施例５ 実施例５は、パルス様に生じる化合物１の血中レベルと比較した、化合物１の
一定の血中レベルの許容性を示す。一定の血中レベルを得るために、試験動物に
ミニ注入ポンプを皮下インプラントした。このミニ注入ポンプに化合物１の１５
％エタノール溶液２mlを入れ、２８日間にわたり連続的に送出した。２.５、５
、１０および２５mg／kg／日の用量を用いた。比較のために、同じ日量の化合物
１を経口投与で与えた動物に、ベヒクル（水中の１５％エタノール）だけを充填
したミニ注入ポンプをインプラントした。化合物１をミニ注入ポンプで与えた動
物には、さらに１％カルボキシメチルセルロース溶液を経口投与した。ランニン
グパラメーターとしては、動物の生存を採用した。さらに第５日および第２７日
に、化合物１の血中レベルを測定するために採血した。化合物１を経口投与した
動物からは、投与後４時間に採血した。グループの大きさは６匹の動物であり、
体重が約２１０ｇの雄ルイスラットを用いた。前に行った実験と同様に、第５日
に動物にアジュバント関節炎を誘導した。 表５に結果を示す。

【００３５】

【表５】

【００３６】 実施例５は、化合物１の一定の血中レベルが短期間生じる高い血中レベルより
も許容性が低いことを示す。 化合物１の一定の血中レベルを得るために、動物にミニ注入ポンプを皮下イン
プラントし、このポンプで動物に化合物１を２８日間にわたり連続的に供給した
。これによって、化合物１の一定の血中レベルが得られ、従ってヒトにおいて観
察されるような化合物１の長い半減期をシミュレートした。 比較グループとしては、同じ日量の化合物１で処置したが、この物質をミニ注
入ポンプによるのではなくて経口投与した動物を用いた。経口投与した化合物１
は、実施例２で測定されたように、約４〜８時間の短い半減期を示した。

【００３７】 この実験では、より短い半減期を有する化合物１の許容性（経口投与した化合
物１）を、より長い半減期を有する化合物１の許容性（ポンプにより一定の無限
半減期で投与した化合物１）と比較した。２.５mg／kg／日、５mg／kg／日、１
０mg／kg／日および２５mg／kg／日の用量を用いた。許容性の尺度としては、処
置で生き残った動物の数を採用した。さらに、許容性を観察された血中レベルに
関して比較した。

【００３８】 ミニ注入ポンプで２５mg／kg／日の化合物１を与えた動物では、９３％の動物
が死んだ。これに対して、２５mg／kg／日の用量を経口投与した動物は全て生き
残った。この実験は、化合物１の一定の血中レベルが、同じ日量の物質負荷にお
いて、短期間生じて再び低下する化合物１の血中レベルよりも本質的に劣った許
容性を有することを示す。

【００３９】 ミニ注入ポンプによる動物の血中レベルは、実験開始後の第５日および終了時
でほぼ等しかった。注入ポンプによる動物は、設定された用量に応じて２.３４
μg／ml、４.１８μg／mlおよび６.７２μｇ／mlの化合物１の血漿値を示した。
２５mg／kgの用量グループでは動物の状態が劣っていたため、これらの動物から
は採血しなかった。 しかしながら、より低い用量グループにおける値から、化合物１をミニ注入ポ
ンプで与えた２５mg／kg／日の用量グループでは、１５μg／ml以下の血中レベ
ルを持続できたであろうと推定することができる。

【００４０】 化合物１を経口投与した動物は、９.６６μg／ml、１８.０１μg／ml、３４.
３５μg／mlおよび８０.５０μg／mlの本質的に高い血漿値を示した。 従って、これらの血中レベルの比較は、化合物１を経口投与した動物がミニ注
入ポンプによる動物よりも本質的に高い血中レベルを有する（約４〜５倍高い）
ことを示す。 従って、実施例５は、パルス様に生じる血中レベルが一定の血中レベルよりも
４〜５倍高い場合でさえも、化合物１の一定の血中レベルがパルス様に生じる血
中レベルよりも本質的に許容性が劣ることを示す。

【００４１】 この結果は、ヒトで観察される化合物１の一定血中レベルがその副作用の原因
であるという最初の臨床観察と一致する。 実施例５は、化合物１の効力を有するが短い半減期を示す物質が、長い半減期
を有する物質よりも本質的に良好な許容性を有することを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 イュルゲン・リントナー ドイツ連邦共和国35041マルブルク．ハー ゼルヘッケ60 (72)発明者 ブルクハルト・ハーゼ ドイツ連邦共和国65719ホーフハイム．ケ ーニヒシュタイナーシュトラーセ28 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 CA25 CA26 CB17 DA12 DA13 DA14 FB06

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）ヌクレオチド合成阻害剤を哺乳動物に有効量で投与し、 ｂ）該哺乳動物の血液中のヌクレオチド合成阻害剤濃度を測定し、 ｃ）該ヌクレオチド合成阻害剤がＮ−(４−トリフルオロメチルフェニル)−２
   −シアノ−３−ヒドロキシクロトン酸アミドの半減期よりも短い半減期を示すか
   どうかを確認することを特徴とする、より少ない副作用を示すヌクレオチド合成
   阻害剤の検出方法。
2. 【請求項２】 マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタからなる群
   からの哺乳動物を用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ヌクレオチド合成阻害剤をヒトに有効量で投与することを特
   徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 ヒト血漿中のヌクレオチド合成阻害剤の半減期が１５０時間
   未満、好ましくは４０時間未満であることを特徴とする、請求項３に記載の方法
   。