JP2003532390A - 生体異物代謝に関与したタンパク質誘導のための組成物と方法 - Google Patents

生体異物代謝に関与したタンパク質誘導のための組成物と方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明が提供するのは、生体異物、内因性物質、化学物質や薬物のような、タンパク質発現を変化させる化合物を同定するための改良された細胞と方法である。本発明の一つの様態は、ある細胞が、薬物代謝に関与したタンパク質（酵素またはトランスポーターなど）をコードする核酸分子に機能可能なプロモーターまたはエンハンサーとレポーター遺伝子を含む第一の核酸分子；および細胞内受容体または転写因子をコードする第二の核酸を有し、細胞内受容体または転写因子が化合物と結合したときに、細胞内受容体または転写因子が、前記レポーター遺伝子の発現に至るプロモーターまたはエンハンサーと機能可能に結合できるようにする。本発明の別の側面は、薬物代謝に関与したタンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導する特性について化合物を評価する方法において、試験化合物を提供し；試験化合物を本発明の細胞と接触させ；前記レポーター遺伝子の発現を検出することを含む方法である。この方法はハイスループット法とすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、２０００年４月１２日提出の「薬物代謝用のインビトロスクリーニ
ングのための方法」と題する米国仮特許出願整理番号６０／１９６，６８１、お
よび２０００年１０月１７日提出の「ｐ４５０誘導のための大量スクリーニング
」と題する米国仮特許出願整理番号６０／２４１，３９１への優先権の特典を請
求するものであり、これらはその全文をここで言及することで組み込まれている
。
【０００２】 本発明は、国立衛生研究所、認可番号ＧＭ−５８２８７によって授与された政
府支援によってなされたものであり、米国政府は発明に対する特定の権利を有す
るともいえる。
【０００３】 技術の分野 本発明は、タンパク質発現を変化させる化合物を識別する分野に関するもので
ある。
【０００４】 背景 治療薬に対する拒絶反応は病気と死亡の一般的原因であるが、それはとくにこ
のような治療薬の使用が比較的普及している先進工業国においてである。薬物か
らの副作用は、合衆国の病院における主たる死亡原因の第四位から第六位である
と推定された（Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｋｌｉｅｗｅｒ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ
１５３：１−１０（２０００））。これら拒絶反応の多くは、薬物間相互作用に
よるもので、このプロセスによって一つの薬物の投与が、第二の同時投与される
薬物の特性を変化させる。もっとも一般的な薬物間相互作用が発生するのは、一
つの薬物が他のものの効力を増加、または減少させるときである（Ｍｏｏｒｅ
ａｎｄ Ｋｌｉｅｗｅｒ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １５３：１−１０（２０００
））。薬物の薬理学的反応におけるこの変化は、一般的に薬物の代謝における変
化が原因である。したがって、薬物間相互作用に関連する大きな要因は、変化し
た代謝である。
【０００５】 薬物代謝にもっとも関連する組織は肝臓と腸である。これらの組織内で、薬物
およびその他の生体異物の酸化代謝が、ヘム含有モノオキシゲナーゼのスーパー
ファミリーの作用によって発生するが、それは集合的に、シトクロムＰ４５０酵
素（ＣＹＰ’ｓ）として知られている（Ｎｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｇｏｎｚａｌｅ
ｚ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：９４５−９９３（１９８７））。
一般的に、ＣＹＰｓの酵素作用は極性の高い産生物の形成に至り、薬物自体に関
する産生物のより早い除去を引き起こす。このプロセスは、薬物の薬力学的特徴
を大きく変えることがある。かかる反応が特に重要なのは、該反応が狭い治療範
囲で薬物に影響するときである。
【０００６】 ヒトの肝臓および腸内にもっとも大量に存在するＣＹＰ酵素は、ＣＹＰ３Ａ４
であり、全腸細胞ＣＹＰｓの約７０％（Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｋｌｉｅｗｅｒ，
Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １５３：１−１０（２０００））および肝臓Ｐ４５０ｓ
の約２９％から約６０％を占める（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ
Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．３２：３３９−３６１（２０００））。ＣＹＰ３Ａ４の
基質、つまりミクロソーム酵素は、一般的に親油性が高い。既知のＣＹＰ３Ａ４
基質の構造分化は幅広く、内因性ステロイド、避妊ステロイド、免疫抑制剤、イ
ミダゾール抗真菌剤およびマクロライド抗生物質が含まれる（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．３２：３３９‐３６１（２０
００））。肝臓と腸内に豊富なＣＹＰ３Ａ４と、その幅広い基質特異性のために
、ＣＹＰ３Ａ４は薬物の生体内変化に優位な役割を果たすと思われている。この
Ｐ４５０酵素は、今日使用されているすべての薬物の５０％を超える代謝に関与
すると推定される（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．
Ｒｅｖ．３２：３３９‐３６１（２０００））。
【０００７】 薬物への長時間の曝露は、治療薬物の代謝とクリアランスを増すことができる
特定のｐ４５０ｓの発現の増加に至ることがある。ＣＹＰ３Ａ４活性は、一連の
様々な薬物によって高められ、そして誘導された発現は、多くの薬物間相互作用
の原因になる。ＣＹＰ３Ａ４発現のもっとも効果的な誘導物質のいくつかは広く
用いられている薬物で、糖質コルチコイドのデキサメタゾン、抗てんかん剤のフ
ェノバルビタール、抗生物質のリファンピシンおよび抗真菌剤のクロトリマゾー
ルなどである（Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．
１０２：１０１６−１０２３（１９９８））。上昇したＣＹＰ３Ａ４レベルの結
果として、このＰ４５０によって代謝される治療法は、低い効果を示す。したが
って重要なことは、ＣＹＰ３Ａ４およびその他のｐ４５０酵素を含むがそれらに
限定されない薬物代謝酵素を誘導する能力を有する作用物質を同定することであ
る。
【０００８】 Ｐ４５０調節の生化学的特性は複雑なことがある。ｐ４５０活性のいくつかの
誘導物質が同定された。ＣＹＰ３Ａ４レベルは、数多くの構造的に異なる作用物
質に曝露することによって誘導された。この多様性のために、その酵素の発現に
影響するかもしれない新しい薬物を予測することが困難になる。糖質コルチコイ
ドおよびその他の非ステロイド系のＣＹＰ３Ａ４誘導物質は、オーファン核受容
体、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）および潜在的な他の受容体が関与するメカニ
ズムによって、このＰ４５０の発現を転写的に調節する。ＰＸＲは、核ホルモン
受容体スーパーファミリーの新しいメンバーとして同定された。ＰＸＲは、ＣＹ
Ｐ３Ａ４プロモーターの高用量の糖質コルチコイドおよびプレグナンステロイド
の誘導を媒介するが、それは核ホルモン受容体パートナーＲＸＲとヘテロダイマ
ーを形成し、およびＣＹＰ３Ａ４プロモーターに多く保存された要素、ＰＸＲ要
素（ＰＸＲＥ）と結合することによってである。ＰＸＲ結合のためのヌクレオチ
ドの制限は、明らかにＡＧＴＴＣＡと定義され、これは、直接反復（ＤＲ）、ま
たは３、４、５または６のヌクレオチド間隔での逆方向反復（ＥＲ）として配置
されている（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ
．３２：３３９−３６１（２０００））。
【０００９】 ＣＹＰ３Ａ４およびその他のＣＹＰｓは、種の差異を表し得るので、製薬会社
はヒトのシステムにおけるインビトロでその薬物候補を試験するが、それはヒト
における薬物間相互作用の可能性の評価を得るためである。大半のインビトロで
の試験には、ヒト肝細胞の初代培養の使用を伴う。肝細胞の有用性は、臨床上関
連するインビトロでの薬物間相互作用のデータを得る能力を薬物産業に付与した
。肝細胞におけるヒトＰ４５０の潜在的誘導物質として同定された化合物は、さ
らなる開発からは外され、薬物間相互作用、したがって安全性と市販の障害の可
能性を軽減することができる（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４
：１５０４−１５１０（１９９７））。
【００１０】 しかしながら、これらの試験に初代培養を使用することの短所もある。肝細胞
調製に伴うある論理上の問題は、酵素活性が約四、五日以上は安定しないことで
ある。また、これらシステムは費用と時間がかかり、変動的な応答が発生する。
くわえて、有用性が散発的であり得るのは、初代培養はヒトの臓器の入手可能性
に依存するからである。かかる細胞を使用して得られた結果も、培養培地および
培養条件に依存する。最後に、所与の時間に試験できる化合物の数は限られてい
る。これはとくに問題であるのは、組み合わせ化学および組み合わせ生物学の方
法によって、多数の候補薬物が製造されているからである。
【００１１】 臨床前の薬物開発用のヒト肝細胞の使用に関わる固有の問題、および研究目的
の肝臓標本の入手の困難さのために、他のインビトロシステムが研究されている
。転写活性化は、化学物質によるＰ４５０酵素の遺伝子発現における変化を調査
するために、多年にわたってインビトロで実施されてきた（Ｐｌａｎｔ ｅｔ
ａｌ．，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７８：１７０−１７４（２０００）
）。もっとも一般的なタイプは、適切な細胞系へのレポーター遺伝子構造物の一
過性トランスフェクションの使用である。これに続くのが、試験化合物の投与、
レポーター遺伝子産物の測定、およびコントロール細胞との比較である。この手
順の各過程において、生物学的および実験的変動が生じることがあり、それが十
分に再現できない結果や、誤った可能性のある解釈をもたらしうる。かかる変動
の例には、初期トランスフェクション効率、ホスト細胞系への内因性因子による
活性化、および細胞毒性または増殖効果などの化学的な特定の影響を含む。これ
らの問題はこれらのタイプのシステムを使用する熱意を失わせる。
【００１２】 図面の簡単な説明 図１は、本発明の一態様のための一連の図を描いており、そこでは第一の核酸
分子と第二の核酸分子が、プラスミドのような染色体外因子として提供されてい
る。図１Ａに示したように、調節因子Ｐ２は細胞内受容体または転写因子をコー
ドする遺伝子の転写を調節する。翻訳産物はつぎに、細胞内受容体または転写因
子と結合する試験化合物と相互作用することができる。図１Ｂに示したように、
細胞内受容体または転写因子と生体異物または試験化合物の複合体はつぎに、薬
物代謝に関与したタンパク質をコードする核酸分子に作用することができるプロ
モーターまたはエンハンサーと結合することができる。複合体はまた核に入るこ
と、そして薬物代謝に関与したタンパク質をコードする核酸分子に作用すること
ができる内因性プロモーターまたはエンハンサーと随意に結合することができる
が、それは該複合体がこのような細胞内に存在するか活性である場合である。こ
の複合体を薬物代謝に関与したタンパク質をコードする核酸分子に作用すること
ができるプロモーターまたはエンハンサーと結合させた後、レポーター遺伝子が
レポーターに転写、翻訳され、そして薬物代謝に関与した内因性酵素が随意に発
現するが、それは該レポーター遺伝子がこのような細胞内に存在するか活性であ
る場合である（図１Ｃ）。レポーターは、蛍光または発光などの物理特性によっ
て検出可能であり、あるいは基質の、検出可能な生成物のような生成物への、そ
の酵素変換に基づいて検出できるタンパク質でありうる（図１Ｄ）。このような
レポーターは、細胞内または細胞外でありうる。本発明の別の態様によれば、第
一の核酸分子と第二の核酸分子の両方が、同一の染色体外因子、例えば単一のプ
ラスミドまたはＹＡＣに提供される。
【００１３】 図２は、第一の核酸分子が染色体外因子（２０）であるのに対し、第二の核酸
分子が細胞の染色体（２２）に内在している場合を示している。
【００１４】 図３は、第一の核酸分子が染色体外因子（３０）であり、そして第二の核酸分
子が細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸分子（３２）である場合を示してい
る。
【００１５】 図４は、第一の核酸分子が細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸分子（４０
）であり、そして第二の核酸分子が細胞の染色体に内在している（４２）場合を
示している。
【００１６】 図５は、第一の核酸分子が細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸分子（５０
）であり、そして第二の核酸分子が細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸分子
（５２）である場合を示している。
【００１７】 図６は、安定して組み込まれたＣＹＰ３Ａ４ ＰＸＲＥ／ルシフェラーゼレポ
ーター構造物を含む、ＨｅｐＧ２細胞系の構造を示している。ＥＲ６ ＤＮＡ配
列を含むＣＹＰ３Ａ４ ＰＸＲＥは、プラスミドｐＧＬ３プロモーター（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）に備わっている。トランスフェクションされた細胞は、ジェネティシ
ンの存在の下で培養し、組み込まれたプラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ（Ｃｌｏｎｅ
ｔｅｃｈ）を選択する。ジェネティシン耐性コロニーは、リファンピシンに増強
された発光でスクリーニングされる。
【００１８】 図７は、図６に示したＨｅｐＧ２細胞系の応答を示している。新規化学物質（
ＮＣＥ）などのリガンドに結合した後で、内因性ＨｅｐＧ２ ＰＸＲは、活性化
され、そして内因性ＨｅｐＧ２ ＲＸＲとヘテロダイマーを形成する。ＰＸＲ／
ＲＸＲ複合体は、ｐＧＬ３−プロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングさ
れ、およびＨｅｐＧ２ゲノム内に安定して組み込まれた、ＰＸＲＥ配列と結合す
る。ＰＸＲ／ＲＸＲ複合体の結合は、組み込まれたｐＧＬ３プロモータープラス
ミドのＳＶ４０プロモーターからの転写を活性化する。ルシフェラーゼ遺伝子は
、転写および翻訳されて、ＮＣＥ用量依存発光を引き起こす。
【００１９】 図８は、ＲＮＡのノーザンブロット解析を示しているが、該ＲＮＡは、ｈＰＸ
Ｒだけを含むｐＩＲＥＳで安定して形質転換され（コロニーＤ６，Ｄ４，Ｂ６，
Ｂ５，Ａ５，Ａ２，Ｗ６，Ｗ５，Ｗ４，Ｗ２およびＷ１）、あるいは例（コロニ
ー６Ｇ）に記載されたＣＹＰ３Ａ４エンハンサー因子を含むｐＧＬ３プロモータ
ーの組み合わせで安定して形質転換された、個別のコロニーから単離されている
。各ウェルは、１０マイクログラムの全ＲＮＡを含有し、そしてｈＰＸＲに特異
的なｃＤＮＡプローブで展開した。
【００２０】 図９は、ｐＧＬ３−プロモーター／３Ａ４エンハンサーで安定して形質転換し
た細胞への、リファンピシンおよびＤＭＳＯ処理の影響を示している。９６ウェ
ルプレートを使用して、高レベルのルシフェラーゼ誘導を引き起こすための曝露
の長さを決定した。細胞は、ゼロから７８時間の間で処理されてから、ルシフェ
ラーゼ活性を測定した。結果は、ＤＭＳＯコントロール細胞に対する増加倍率で
表示され、四回の実験の結果である。
【００２１】 図１０は、ｐＧＬ３／３Ａ４エンハンサーに加えてｐｈＰＸＲを含む細胞に対
する、リファンピシン処理の影響を示している。細胞は、９６ウェルプレートフ
ォーマットで培養され、１０マイクロモルのリファンピシンまたはＤＭＳＯに７
２時間曝露した。結果は、相対発光量で表示され、四回の実験の結果である。
【００２２】 図１１は、ｈＰＸＲにｐＧＬ３／３Ａ４エンハンサーを加えたものまたはｐＧ
Ｌ３／３Ａ４エンハンサーのみを含む細胞の様々な量を、９６ウェルプレートに
添加し、そして１０マイクロモルのリファンピシンまたはＤＭＳＯで４８時間処
置した結果を示している。結果は、コントロールＤＭＳＯ処理細胞に対する増加
倍率で表示され、四回の実験の結果である。
【００２３】 図１２は、ｐＧＬ３ベクターおよびｈＰＸＲを伴うｐＩＲＥＳベクターで安定
して形質転換されたＨｅｐＧ２細胞における、ルシフェラーゼ活性に対する血清
、ＤＭＳＯおよびリファンピシンの影響を示している。細胞は、ゼロから７８時
間の範囲で様々な時間の間処理されたが、それはリファンピシン、ＤＭＳＯ、も
しくは培地内に０．１％血清が存在するか、存在しない状態である。リファンピ
シンまたはＤＭＳＯのいずれかがない追加的な制御も含めた。結果は、相対発光
量で表示され、四回の実験の結果である。
【００２４】 図１３は、ヒトの肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４発現に対する各種のＣＹＰ３Ａ
４誘導物質の影響を示している。ヒトの肝細胞は、１０マイクロモルのデキサメ
タゾン、デキサメタゾンなし、または肝細胞培養培地に通常存在するデキサメタ
ゾンの量（約１０-7Ｍ）に、曝露された。その他の誘導物質に含まれるのは、１
ミリモルのフェノバルビタール、１０マイクロモルのリファンピシン、クロトリ
マゾール、またはＲＵ４８６である。全ＲＮＡ（１０マイクログラム）は、ノー
ザンブロット解析の対象となり、そして実施例に記載したように、ＣＹＰ３Ａ４
に特異的なｃＤＮＡプローブで展開された。
【００２５】 図１４は、ｐＩＲＥＳベクターにおけるｈＰＸＲおよびルシフェラーゼベクタ
ー（コロニー１Ｆ）における３Ａ４エンハンサーによって安定して形質転換され
たＨｅｐＧ２細胞に対する、各種のＣＹＰ３Ａ４誘導物質および非誘導物質の影
響を示している。細胞は、９６ウェルプレートフォーマットで７２時間それぞれ
の誘導物質に曝露された後、ルシフェラーゼ活性を測定する。細胞は、１マイク
ロモルのデキサメタゾン、１００マイクロモルのオメプラゾール、１０マイクロ
モルのクロトリマゾール、１０マイクロモルのＲＵ４８６、１０マイクロモルの
リファンピシン、１００マイクロモルのメバスタチン、５０マイクロモルのＰＣ
Ｎ、１００マイクロモルのフェノバルビタール、１マイクロモルのＴＣＤＤで処
理された。データは、コントロールのＤＭＳＯ処理細胞に対するルシフェラーゼ
活性の増加倍率で表示され、四通りの測定の結果である。
【００２６】 図１５は、ルシフェラーゼベクター（コロニー１３）における３Ａ４エンハン
サーによって安定して形質転換されたＨｅｐＧ２細胞に対する、各種のＣＹＰ３
Ａ４誘導物質および非誘導物質の影響を示している。細胞は、９６ウェルプレー
トフォーマットで７２時間それぞれの誘導物質に曝露された後に、ルシフェラー
ゼ活性を測定する。細胞は、１マイクロモルのデキサメタゾン、１００マイクロ
モルのオメプラゾール、１０マイクロモルのクロトリマゾール、１０マイクロモ
ルのＲＵ４８６、１０マイクロモルのリファンピシン、１００マイクロモルのメ
バスタチン、５０マイクロモルのＰＣＮ、１００マイクロモルのフェノバルビタ
ール、１マイクロモルのＴＣＤＤで処理した。データは、コントロールのＤＭＳ
Ｏ処理細胞に対するルシフェラーゼ活性の増加倍率で表示され、四通りの測定の
結果である。
【００２７】 図１６は、ルシフェラーゼベクター（コロニー１３）におけるＣＹＰ３Ａ４エ
ンハンサーによって安定して形質転換されたＨｅｐＧ２細胞に対する、各種のＣ
ＹＰ誘導物質の様々な用量の影響を示している。細胞は、９６ウェルプレートフ
ォーマットで７２時間それぞれの誘導物質に曝露された後に、ルシフェラーゼ活
性を測定する。細胞は、それぞれの薬物の三倍の用量で処理された。用量は、作
用物質に応じて、０．１マイクロモルから５ミリモルの範囲とした。デキサメタ
ゾンの用量は、０．１マイクロモル、１．０マイクロモルおよび１０マイクロモ
ル；オメプラゾールは、５０マイクロモル、１００マイクロモルおよび２５０マ
イクロモル；クロトリマゾールは、５マイクロモル、１０マイクロモルおよび５
０マイクロモル；フェノバルビタールは、１ミリモル、２ミリモルおよび５ミリ
モル；ＴＣＤＤは、０．５ナノモル、１ナノモルおよび２ナノモル；ＲＵ４８６
は、５マイクロモル、１０マイクロモルおよび５０マイクロモル；リファンピシ
ンは、５マイクロモル、１０マイクロモルおよび２５マイクロモル；またメバス
タチンは、１０マイクロモル、５０マイクロモルおよび１００マイクロモルであ
る。結果は、ＤＭＳＯ処理細胞に対するルシフェラーゼ活性の増加倍率と、六測
定の平均＋／−標準偏差で表示されている。それぞれの薬物の最少用量は、左か
ら右に増加するように示した。
【００２８】 図１７は、２４および９６ウェルプレートにおいて安定した細胞系を培養する
ことの影響を示している。１０１Ｌ細胞を、２４または９６ウェルプレートにお
いて培養し、様々な用量のＡｈ受容体リガンドのベンズアントラセンに曝露した
。１８時間曝露した後に、ルシフェラーゼ活性を評価した。結果は、三つの異な
る実験の平均＋／−ＳＤで表示した。
【００２９】 図１８は、各種のＣＹＰ１Ａ１誘導物質の応答時間曲線を表している。誘導物
質曝露の最長時間は、１０１Ｌ細胞における誘導物質に媒介されるルシフェラー
ゼ活性の経過時間を確立することと、９６ウェルプレートで決定した。増強され
た活性は、ベンズアントラセン（１００マイクロモル）、オメプラゾール（１０
０マイクロモル）および３−メチルコラントレン（１０マイクロモル）の投与か
ら６時間以内に観察された。細胞は、ネガティブコントロールとして、リファン
ピシン（１００マイクロモル）によっても処理した。それぞれの点は、三つの試
験の結果の平均＋／−ＳＤを表している。
【００３０】 図１９は、各種の既知のＣＹＰ１Ａ１誘導物質の応答用量曲線を示している。
各種のＣＹＰ１Ａ１誘導物質の影響は、９６ウェルプレートフォーマットと１０
１Ｌ細胞を用いて測定した。用量応答曲線は、ＴＣＤＤ（０．５から２．２ナノ
モル（パネルＡ）、ベンズアントラセンおよびオメプラゾール（１から２００マ
イクロモル）（パネルＢ）について作成された。それぞれの点は、三つの試験の
結果の平均＋／−ＳＤを表している。
【００３１】 図２０は、各種のフラボノイドについての用量応答曲線を示している。９６ウ
ェルプレートフォーマットと１０１Ｌ細胞を用いて、用量応答曲線は、ＧＴＥ（
挿入）について作成された。用量は、０．０１ミリグラム／ｍｌから０．２ミリ
グラム／ｍｌの範囲で、１８時間の曝露を行なった。用量応答曲線は、ＥＧＣＧ
、ケルセチン、クルクミン、ケンフェロール、ナリンゲニン、アピゲニン、およ
びレスベラトロールについても決定し、範囲は１から２０マイクロモルであった
。それぞれの作用物質に対する曝露は、１８時間であった。それぞれの点は、三
つの試験の結果の平均＋／−ＳＤを表している。
【００３２】 図２１は、ＴＣＤＤとそれぞれのフラボノイドとの、共処理の影響を示してい
る。ＣＹＰ１Ａ１含有細胞系は、それぞれのフラボノイド１０マイクロモル、あ
るいはＧＴＥ０．１ミリグラム／ｍｌ、およびＴＣＤＤ２ナノモルで処理した。
細胞は、両方の作用物質に１８時間曝露された。結果は、三つの試験の平均＋／
−ＳＤを表している。
【００３３】 概要 本書に記載のインビトロシステムは、ＣＹＰ３Ａ４のようなＰ４５０ｓを含む
、薬物代謝酵素の誘導を検出できる。開示された方法は、適切なエンハンサーと
レポーター遺伝子の生体異物による転写活性化を検出できるが、該エンハンサー
とレポーター遺伝子は、ヒトの肝癌細胞のような宿主細胞内に随意に独立して安
定的にトランスフェクションされたものである。システムはマイクロタイタープ
レートフォーマットにおいて使用可能であり、結果は、薬物候補を細胞に適用し
てから、二ないし三日以内に適切なマイクロタイタープレートリーダーで随意に
得ることができる。このインビトロ転写システムの利点は、単離したヒト肝細胞
または肝臓薄片と比較した場合は多く、アッセイの一貫性および再現性の向上を
含んでいる。またアッセイの結果に影響を及ぼし得る個体間あるいは標本間の変
動および培養条件は、本発明のシステムを用いて対処される。本システムは、ハ
イスループットアッセイのために形式化されることが可能であり、比較的短時間
で、特定の薬物代謝タンパク質をコードする遺伝子の二倍もしくはそれ以上の誘
導を予測できる。
【００３４】 本発明の一つの推奨態様によれば、インビトロシステムは、本質的にハイスル
ープットであり、そしてＣＹＰ３Ａ４誘導を評価できる。本発明のこの推奨態様
は、ＰＸＲＥと命名されたＣＹＰ３Ａ４遺伝子の調節領域と転写因子ＰＸＲを含
んでいる。ＰＸＲＥはプラスミド上などの、ルシフェラーゼのようなレポーター
遺伝子に機能可能に連結されている。ＰＸＲＥおよびレポーター遺伝子を含有す
るプラスミドは、つぎに、ＨｅｐＧ２のような肝癌細胞系に安定的に形質転換さ
れる。いったん形質転換されると、ＰＸＲはＰＸＲＥに結合し、そして転写を活
性化できる。これは、ＰＸＲが薬物などの適切なリガンドによって刺激されたと
きに起こすことができる。ＣＹＰ３Ａ４以外、またはＰ４５０’ｓ以外の薬物代
謝タンパク質をコードする核酸分子は、核酸分子を置換することで使用すること
ができる。ＰＸＲＥ以外の適切な調節領域も使用することができるが、それによ
り調節領域が薬物代謝酵素またはトランスポーターをコードする核酸分子にとっ
て適切になるようにする。くわえて、検出可能なタンパク質、グリーン蛍光タン
パク質（ＧＦＰ）またはその変型のようなルシフェラーゼ以外のレポーター遺伝
子、またはその他の酵素、例えばベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ラクタマ
ーゼあるいはアルカリホスファターゼを、このシステムにおいて使用することが
できる。代替細胞を使用することができるが、薬物代謝に関与する組織に由来す
る細胞が推奨される。
【００３５】 本発明が認めていることは、化合物相互作用を評価するための細胞ベースのシ
ステムを、適切な核酸分子を用いて作ることができるが、該核酸分子は、レポー
ター遺伝子をコードする核酸分子に機能可能に連結された薬物代謝に関与したタ
ンパク質をコードする核酸分子、および細胞内受容体または転写因子をコードす
る核酸分子のための一つまたはそれ以上のエンハンサーまたはプロモーターを含
む。これらの核酸分子は、染色体外であり得るし、あるいは安定して細胞のゲノ
ムに組み込むことができる。くわえて、特定の場合では、核酸分子は細胞の染色
体に内在できるが、それはとくに核酸分子が細胞内受容体、トランスポーターま
たは転写因子をコードする場合である。
【００３６】 本発明の一つの態様は、ある細胞を提供するが、該細胞は第一の核酸分子を含
み：該第一の核酸分子は、薬物代謝に関与したタンパク質をコードする核酸分子
のために機能可能なプロモーターまたはエンハンサーおよびレポーター遺伝子を
含有する。好ましくは、プロモーターまたはエンハンサーは、前記レポーター遺
伝子に機能可能に連結される。細胞もまた、細胞内受容体または転写因子をコー
ドする第二の核酸を含むが、それにより細胞内受容体または転写因子が化合物と
結合または活性化されたとき、前記細胞内受容体または転写因子が前記レポータ
ー遺伝子の発現に至るよう、前記プロモーターまたはエンハンサーと機能可能に
結合できるようにする。細胞が薬物代謝に関与したタンパク質の発現を誘導する
化合物と接触したとき、レポーター遺伝子が発現する。
【００３７】 本発明の第二の態様は、薬物代謝に関与したタンパク質をコードする遺伝子の
発現を誘導する特性のために化合物を評価する方法を提供するのであって、該方
法は；試験化合物を提供すること；試験化合物を本発明の細胞と接触させること
；および前記レポーター遺伝子の発現を検出することから成る。レポーター遺伝
子の発現は、前記化合物が薬物代謝に関与したタンパク質をコードする遺伝子の
発現を変化させたことを示す。
【００３８】 発明の詳細な説明
【００３９】 定義 特記事項なき限り、本書に用いられるすべての技術的および科学的用語は、本
発明が属する分野のある当業者が通常理解するのと同じ意味を持つ。一般的に本
書に使用する学名、および後述の細胞培養、化学、微生物学、分子生物学、細胞
科学および細胞培養における実験手順はこの分野で周知であり、広く用いられて
いる。従来の方法がこれらの手順で用いられ、例えば、これらは現状技術と各種
の一般的参照文献に提供されているものである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａ
ｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ
（１９９８）；Ｈａｒｌｏｗｅ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８））。用語が単数形で用いられている場合、発明者は
、その用語の複数形も企図する。本書に用いられる学名および後述の実験手順は
、この分野で周知であり広く用いられている。本明細書を通じて用いられる限り
において、以下の用語は、特記事項なき限り、以下の意味を持つと解されるべき
である。
【００４０】 「核酸分子」は、ポリヌクレオチドである。核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ま
たは両者の組み合わせとすることができる。核酸分子は、バックボーンに組み込
まれたリボースおよびデオキシリボース以外の糖も含み、したがって、ＤＮＡま
たはＲＮＡ以外とすることができる。核酸は核酸塩基を含み得るが、該核酸塩基
は、自然に発生するか、あるいは例えば２−アミノアデニンなどのような核酸塩
基の誘導体であるキサンチンのように自然に発生しない。本発明の核酸分子は、
ホスホジエステル結合以外の結合を有することができる。核酸分子は、ペプチド
核酸分子とすることができる。核酸分子の長さは任意であり、一本鎖または二本
鎖、あるいは部分的に一本鎖または部分的に二本鎖とすることができる。
【００４１】 「プローブ」または「プローブ核酸分子」は、少なくとも部分的に一本鎖であ
り、および対象とする配列に対して少なくとも部分的に相補性があり、または少
なくとも部分的に大体の相補性がある核酸分子である。プローブは、ＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両者の組み合わせとすることができる。本発明の
範囲内でもあるのは、バックボーンの糖がリボースまたはデオキシリボース以外
の核酸を含むプローブ核酸分子を有することである。プローブ核酸は、ペプチド
核酸であってもよい。プローブは、ヌクレアーゼ活性に抵抗性のある、または検
出可能な標識を含むことができ、もしくは例えばペプチドなどの他の部分に機能
可能に結合することができる。
【００４２】 一本鎖核酸分子が、他の一本鎖核酸分子に対して「相補的」であるのは、該核
酸分子が他の核酸分子の全体または一部と塩基対形成（ハイブリダイズ）できる
ときであり、それによりシトシン（Ｃ）と塩基対となるグアニン（Ｇ）、および
チミン（Ｔ）またはウリジン（Ｕ）と塩基対となるアデニン（Ａ）の能力に基づ
いて、二重螺旋（二本鎖核酸分子）を形成する。例えば、ヌクレオチド配列５’
−ＴＡＴＡＣ−３’は、ヌクレオチド配列５’−ＧＴＡＴＡ−３’に相補的であ
る。
【００４３】 「大体相補的である」とは、厳しい条件下で互いに選択的にハイブリダイズす
る核酸を指す。
【００４４】 「選択的にハイブリダイズする」とは、検出可能な特定の結合を指す。ポリヌ
クレオチド、オリゴヌクレオチドおよびその断片は、標的核酸鎖と特異的にハイ
ブリダイズするが、それは非特異的な核酸への検出可能な結合のかなりの量を最
少にするハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のもとでである。きわめて制限
的な条件を使用して、この分野で周知の選択的なハイブリダイゼーションの条件
を達成してもよい。一般的に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそ
の断片と対象の核酸配列の間の核酸配列相補性は、少なくとも３０％、もっと典
型的かつ好適には少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％
であり、１００％とすることもできる。塩濃度、温度、洗浄剤およびホルムアミ
ドなどの変性剤などのハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション
の厳しさを増すために変化させる、すなわち核酸鎖にそった、Ｇと塩基対となる
Ｃ，およびＴまたはＵと塩基対となるＡの正確な一致を要求することが可能であ
る。
【００４５】 「に対応する」は、基準となるポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と同
一性を共有する（例えば同一の）ポリヌクレオチド配列を指す。対照的に、ここ
で使用されている「に相補的である」という用語が意味するのは、相補的配列が
基準となるポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と塩基対となることである
。例としては、ヌクレオチド配列５’−ＴＡＴＡＣ−３’は、基準配列５’−Ｔ
ＡＴＡＣ−３’に対応し、そして基準配列５’−ＧＴＡＴＡ−３’に相補的であ
る。
【００４６】 「配列同一性」または「同一」が意味するのは、二つのポリヌクレオチド配列
が比較範囲にわたって同一（例えば、ヌクレオチドごとを基に）であることであ
る。「部分的配列同一性」または「部分的な同一」が意味するのは、核酸分子の
配列の一部が、別の核酸分子の配列の少なくとも一部と同一であることである。
【００４７】 本書に使用された「大体の同一性」または「大体同一」は、ポリヌクレオチド
配列の特徴を指し、ここでポリヌクレオチドは、少なくとも３０パーセントの配
列同一性、好適には少なくとも５０から６０パーセントの配列同一性、もっと一
般的には少なくとも６０パーセントの配列同一性を有する配列から成るが、これ
は少なくとも２０ヌクレオチド位置の比較範囲にわたって、しばしば少なくとも
２５から５０ヌクレオチドの範囲にわたって基準配列と比較したときであり、こ
こで配列同一性の百分率は、比較範囲にわたって基準配列の合計２０パーセント
またはそれを下回る欠失または付加を含むことがあるポリヌクレオチド配列と基
準配列を比較することによって計算される。「大体の部分的配列同一性」または
「大体部分的に同一」が使用されるのは、核酸分子の一部が別の核酸分子の少な
くとも一部とほぼ同一であるときである。本書で用いられる「同一性」または「
同一」は、核酸の塩基組成を指し、他の成分、例えば一つ以上の糖、および一つ
以上のリン酸塩から成ること、あるいは他の置換された部分を有することがある
バックボーンなどではない。
【００４８】 「突然変異」は、標準野生型配列に関してのゲノムでの変化である。突然変異
は、ゲノムのある位置での核酸配列の欠失、挿入または転位であり得、また「点
突然変異」と称される、ゲノムのある位置での単一塩基の変化でもあり得る。突
然変異は、遺伝し得るし、また個体の寿命の間に１つ以上の細胞に発生すること
がある。
【００４９】 「ハイブリダイゼーション」は、一本鎖核酸または核酸の一本鎖部分の、塩基
対形成のプロセスであり、二本鎖核酸または核酸分子の二本鎖部分を作り出す。
【００５０】 「単一ヌクレオチド多形性」または「ＳＮＰ」は、同じ種の別個の個体から単
離した核酸の塩基組成において異なる核酸配列の位置である。
【００５１】 「機能可能に連結した」は並置させることを指すが、ここではそのように記載
された構成要素が、その意図された仕方で機能することを可能にする関係にある
。例えば、コード配列に機能可能に連結したプロモーターまたはエンハンサーま
たはその他の調節配列のような制御配列は、コード配列の発現が制御配列と比較
しうる条件下で達成されるように、位置づけられる。
【００５２】 薬物代謝に関与したタンパク質などの、ポリペプチドまたはタンパク質をコー
ドする核酸分子について機能可能な制御配列という意味における「機能可能な」
とは、機能可能に連結されているような適切な立体構造で、または制御配列への
適切な立体構造における適切なモジュレーターの結合のような適切な条件での、
かかるポリペプチドまたはタンパク質の発現を調節する制御配列の能力を指す。
【００５３】 「プロモーター」は核酸分子を指すが、それは転写を開始するためのＲＮＡポ
リメラーゼが結合する、ＤＮＡにあるようなものである。プロモーターは遺伝子
制御領域の成分と見なすことができるが、該遺伝子制御領域には転写因子とポリ
メラーゼが転写を制御するために集まっている。
【００５４】 「エンハンサー」は調節核酸分子を指すが、遺伝子調節タンパク質が結合する
ことで、構造遺伝子の転写率に影響し得るＤＮＡ配列などである。エンハンサー
の例に含まれるのは、ベータ−ガラクトシダーゼの発現に影響するＬａｃＺ遺伝
子の調節領域に付着するＧＡＬ４タンパク質である。別の例はプレグナンＸ受容
体（ＰＸＲ）であるが、該受容体は酵素ＣＹＰ３Ａ４の転写率を調節するＰＸＲ
ＥまたはＸＲＥＭと呼ばれるＤＮＡ配列に結合する。さらに別の例はＡｈ受容体
（ＡｈＲ）で、ＤＲＥ、ダイオキシン応答配列、と呼ばれるある特定のＤＮＡ配
列に結合するが、該配列は転写率を調節するためのＣＹＰｓ１Ａ１および１Ａ２
の調節領域内にある。
【００５５】 「薬物代謝に関与したタンパク質」は、タンパク質またはポリペプチドを指す
が、例えば、代謝あるいは、薬物などの生体異物の代謝を調節できるタンパク質
である。かかる調節に含まれるのは、触媒反応および共有または非共有結合を介
した生体異物の化学的構造の変化、細胞に出入りする生体異物の透過性の改変、
または細胞に出入りする生体異物の輸送である。
【００５６】 「薬物代謝酵素」は酵素タンパク質を指し、これは宿主にとって異物である薬
物などの生体異物の共有原子価の変更を触媒する。かかる共有原子価の変更は任
意であるが、好適には酸化または共役反応である。酸化反応では一般的に、水溶
性の代謝産物または水溶性が増した代謝産物となる。例えばＣＹＰ３Ａ４は、薬
物エリスロマイシンを脱メチル化した代謝産物に代謝して、その極性を増す。グ
ルクロノシルトランスフェラーゼ１（ＵＧＴ１）は、グルクロニドをアセトアミ
ノフェンに添加して、その極性を増すようにする。ＣＹＰ２Ｃ１９は、ヒドロキ
シル基を抗てんかん剤に導入して、Ｓ−メフェニトインを代謝する。一般的に、
生体異物の極性を増すことによって、修飾された生体異物は、尿などを介して、
被験体からもっと除去されやすくなる。
【００５７】 「レポーター遺伝子」は、アッセイによってすぐに検出されるタンパク質をコ
ードするＤＮＡのような、核酸分子の領域を指す。この領域は、通常の遺伝子コ
ード領域に置き換えることができる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子は、照度計
によって検出できる発光生成物を生成することができる、ルシフェラーゼタンパ
ク質をコードする。ＬａｃＺ遺伝子はベータ−ガラクトシダーゼタンパク質をコ
ードするが、該ベータ−ガラクトシダーゼは、適切な酵素基質の存在下で色測定
または蛍光測定で検出できる着色した形態に、特定の基質を変換できるものであ
る。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）はクロラムフ
ェニコールを代謝する酵素であり、この反応の結果は放射測定のＴＬＣ分析によ
って視覚化できる。
【００５８】 「細胞内受容体」は細胞内に存在するポリペプチドまたはタンパク質を指すが
、これらはリガンドなどの細胞外シグナル分子などの分子と結合し、細胞内での
応答を開始する。細胞内受容体の例には、Ａｈ受容体またはＰＸＲが含まれる。
【００５９】 「ホルモン受容体」は、形質膜を介して細胞内に拡散するホルモンに結合する
、ステロイドホルモン受容体を指す。甲状腺ホルモンまたはビタミンＤの受容体
のようなステロイド受容体は、そのリガンドと結合し、ついでリガンドが調節す
る遺伝子内で特定のＤＮＡ配列に結合する。例に含まれるのは、エストロゲン受
容体、プロゲステロン受容体またはコルチゾール受容体である。
【００６０】 「トランスポーター」は形質膜内のタンパク質を指し、細胞膜を通って、分子
を運ぶか別の方向に振り向ける。トランスポーターとなり得るのは、特定のリガ
ンドに対して特異的なトランスポーター、リガンド群に対する一般的なトランス
ポーター、ＡＴＰまたは起電力のようなエネルギーを用いる能動的なトランスポ
ーター、または細胞のエネルギーを使用しない受動的なトランスポーターである
。分子は、トランスポーターとそれが置かれた条件に依存して、細胞の内外に輸
送されることができる。例に含まれるのは、ナトリウム−カリウムＡＴＰアーゼ
および細胞内から細胞外に薬物代謝産物を輸送するＰ−糖タンパク質（ＭＤＲ１
）である。
【００６１】 「転写因子」は、任意のポリペプチドまたはタンパク質を指し、これらは真核
細胞などであるがそれに限定されない細胞内で、転写を開始もしくは調節できる
ものである。これらに含まれるのは、エンハンサーに結合する遺伝子調節タンパ
ク質、およびこのような特異的な仕方で作用しない一般的な転写因子である。転
写因子の例に含まれるのは、ＴＦＩＩＤ、一般的な転写因子、またはＰＸＲなど
の特定の受容体である。ＨＮＦ１は、組織特異的な方法で遺伝子の発現を調節す
る、別の転写因子である。
【００６２】 化合物と結合される細胞内受容体、トランスポーターまたは転写因子のような
ポリペプチドの意味で「結合」されるとは、ポリペプチドと化合物が結合すると
複合体の活性が個々の要素の活性と異なるように接触している、これらの要素を
指す。
【００６３】 「機能可能に結合する」とはある要素が別の要素に結合されることであり、こ
こで結果として複合体がある機能を果たすことができる。例えば、ポリペプチド
は化合物に結合することができ、また結果として生じる複合体は制御配列と機能
可能に結合して、このような制御配列に機能可能に連結した遺伝子の発現を調節
できるようにする。
【００６４】 「化合物」は、任意の化学物質、試験化学物質、薬物、新規化学物質（ＮＣＥ
）または他の部分を指す。例えば、化合物は、ヒトを含む哺乳類などの被験体に
通常存在しない異物の化学物質（生体異物）とすることができる。化合物は、ヒ
トを含む哺乳類などの生物システムに通常存在し、および合成される、内因性化
学物質とすることもできる。一つの態様においては、酵素による化合物の酸化で
は、一般的にもっと水溶性の、容易に排泄できるものが生成する。例に含まれる
のは、食品添加物、ステロイドホルモンおよび薬物である。
【００６５】 「誘導する」とは、化合物がないときのそのようなポリペプチドの発現量に対
しての、化合物があるときの、薬物代謝に関与した酵素のような、酵素などのポ
リペプチドの発現の増加を指す。例として、化合物、例えば試験化合物、例えば
薬物は、Ｐ４５０酵素の発現を誘導して、化合物が存在するときに生成したＰ４
５０酵素の量が、化合物がないときに生成したＰ４５０酵素の量より多くなるよ
うにする。
【００６６】 「Ｐ４５０」は、薬物、およびステロイドホルモンなどの内因性物質のような
、生体異物の触媒酸化に関与したヘム含有モノオキシゲナーゼスーパーファミリ
ーのメンバーを指す。例に含まれるのは、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４およびＣ
ＹＰ１Ａ２であるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】 「グルクロニルトランスフェラーゼ」または「ＵＧＴｓ」は、グルクロン酸抱
合に関与したポリペプチドとタンパク質を指し、該グルクロン酸抱合は主要な経
路で、多くの親油性生体異物と内因性物質を、より水溶性の化合物へ排出するの
を促進する。ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼファミリーは、受容体
化合物への糖ヌクレオチドのグリコシル基のグルクロン酸抱合を触媒するが、そ
れはベータ−Ｄ−グルクロニド産物の形成を伴う、酸素、窒素、硫黄、および炭
素の求核官能基においてである。３５を超える様々なＵＧＴ遺伝子産物が周知で
あるが、これらは、配列同一性に基づいて、ＵＧＴ１とＵＧＴ２の二つのサブフ
ァミリーに分割された。例に含まれるのは、ＵＧＴ１Ａ２、ＵＧＴ２Ｂ７および
ＵＧＴ１Ａ８である。
【００６８】 「グルタチオントランスフェラーゼ」は、肝細胞のサイトゾルに広く見いださ
れる可溶性タンパク質の、酵素を指す。これら酵素は、多種多様な化合物の内因
性トリペプチド、グルタチオンとの抱合を触媒する。サイトゾルのグルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼは、アルファ、ミュー、パイおよびシータと名付けられ
た四つのファミリーに分割され、それぞれ異なるがときには重複する基質特異性
を有する。また、例えば小胞体（ＥＲ）に存在する、ミクロソームグルタチオン
トランスフェラーゼもある。例に含まれるのは、ＧＳＴ（ミュー）およびＧＳＴ
（アルファ）であるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】 「スルホトランスフェラーゼ」は、薬物と内因性化合物を含む構造的に多様な
生体異物の硫酸化を触媒する酵素のような、ポリペプチドまたはタンパク質を指
す。これらの反応に関わるのは、３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸塩（
ＰＡＰＳ）から、硫酸エステルおよびスルファミン酸を形成する受容体分子のヒ
ドロキシル／アミノ基への、スルフリル基の転移である。硫酸抱合は一般的に、
水溶性代謝産物を産生し解毒する。硫酸化も、内因性ホルモンのステロイド生合
成、不活性化、および排泄の調節に重要な要素である。これらの酵素のいくつか
のアイソフォームは、ヒトに存在する。例に含まれるのは、ｈＨＳＴ、ｈＰ−Ｐ
ＳＴおよびｈＭ−ＰＳＴであるが、それらに限定されるものではない。
【００７０】 「Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ」は、アリールアミン類をアセチル基に抱
合させる酵素のような、タンパク質またはポリペプチドを指す。この酵素ファミ
リーには別個の遺伝子がある。例えば、ＮＡＴ１とＮＡＴ２は、ヒトにおいてＮ
−アセチルトランスフェラーゼ活性をコードする。ＮＡＴ１活性がヒトの組織内
に同一の形式で分配されているのに対し、ＮＡＴ２は多形性を示し、アセチル化
が表現的に遅い、および速い人の検出を可能にする。アリールアミン類のＮ−ア
セチル化は、肝臓で発生する代謝活性化過程である、Ｎ−酸化のための競合する
経路を示す。複素環式アミンは、ＮＡＴ２トランスフェラーゼによるアセチル化
によって活性化される。
【００７１】 「Ｐ−糖タンパク質」または「Ｐｇｐ」は、ＭＤＲ１遺伝子産物を指す。その
機能は、細胞膜を通して薬物とステロイドを輸送することである。Ｐｇｐは、Ｃ
ＹＰ３Ａ誘導の大きさの決定因子であり得る。Ｐｇｐは、ＰＸＲリガンド相互作
用、およびステロイドと生体異物に対するＣＹＰ３Ａ誘導応答に影響する場合が
ある。
【００７２】 「酵素」は、触媒活性を有するポリペプチドを指す。検出可能な酵素は、適切
な基質に作用したときに、検出可能な生成物を産生するであろう酵素である。検
出可能な生成物が好適に検出されるのは、光学的に、例えば、蛍光、発光または
化学発光のようなその放出を介して、あるいは色、例えば色素体の形成によって
である。推奨される検出可能な酵素に含まれるのは、ベータ−ラクタマーゼ、ル
シフェラーゼおよびベータ−ガラクトシダーゼであるが、それらに限定されるも
のではない。
【００７３】 「検出可能なタンパク質」は、検出可能な物理特性を有するポリペプチドであ
る。推奨される検出可能なタンパク質は、本来蛍光性のタンパク質の、グリーン
蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＳＰＡＰレニラ蛍光タンパク質およびそれらの誘導
体である。
【００７４】 「染色体外因子」は、細胞に存在するとき、そのような細胞のゲノムに組み込
まれない、核酸分子を指す。染色体外因子の例に含まれるのは、プラスミドおよ
び酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）である。
【００７５】 核酸分子の関連における細胞の「染色体内」とは、核酸分子が、染色体外因子
であることではなく、細胞の染色体またはゲノム内にあることを指す。細胞の染
色体内の核酸分子は、相同的組換えまたはその他の方法によって、ゲノムに「挿
入」できるか、あるいは「染色体に内在」することができる。染色体に内在して
いる場合、核酸分子は、その元の遺伝子座において染色体内に存在する。
【００７６】 「直接的に」現象を実現する、ないし構造体を形成するとは、中間過程または
中間構造体を持たないことである。例えば、ＡＢを形成するＡおよびＢは直接相
互作用するが、それはＡとＢの間に構造体がないからである。また、Ｅを形成す
るために反応するＣおよびＤは、直接相互に作用してＥを形成するが、それはＥ
を形成するＣとＤの反応の間に、中間過程がないからである。
【００７７】 「間接的に」現象を実現する、ないし構造体を形成するとは、中間過程または
中間構造体を有することである。例えば、ＡＢＣを形成するＡおよびＢは、間接
的に相互作用するＡとＢを有するが、それはＡとＢの間に構造体があるからであ
る。また、Ｉを形成するためにＨと反応するＧを形成するＥおよびＦは、ＥとＦ
からのＩの間接形成であるが、それはＩを形成するプロセスに中間過程を伴うか
らである。
【００７８】 「細胞」は、任意の細胞、例えば原核細胞または真核細胞である。ある細胞は
、好適には真核細胞であり、好適には多細胞生物からのものであるが、酵母また
は自由生活真核生物のような単細胞生物でもよい。ある細胞は、動物またはヒト
などの生物から得ることができ、および初代培養内、あるいは細胞系の場合のよ
うに連続培養内で提供することができる。ある細胞は集団の一部とすることがで
きるが、該集団は例えば、同じ組織または器官からの細胞のような、類似した細
胞の集団、あるいは細胞のクローン集団にあるような実質上同一の細胞などであ
る。細胞は、適切な生物から得ることができるが、それは例えば通常のサンプリ
ング、例えば通常の方法を用いる組織回収のための生検、あるいは血液などの体
液の回収を通じてである。細胞は、好適には哺乳類の細胞であり、好適にはヒト
の細胞であるが、その限りである必要はない。細胞はまた好適には、酵素の比較
的高レベルの発現を本来的に示す組織に由来するものであるが、該酵素は、肝臓
、腸、肺、腎臓などの、またそれらに限定されない薬物代謝に関与する。細胞は
また形質転換細胞であってもよく、該細胞は、例えば染色体外因子の導入または
細胞の染色体への核酸分子の組み込みのような、遺伝子工学プロセスによって遺
伝子的に改変された細胞である。
【００７９】 「ハイスループットスクリーニング」は、薬物のような試験化合物などの、化
合物の活性によるスクリーニング方法を指し、一日あたり約５検定またはサンプ
ルと一日あたり約１０，０００検定またはサンプルの間、好適には一日あたり約
１０検定またはサンプルと一日あたり約１，０００検定またはサンプルの間、さ
らに好適には一日あたり約１５と約５００の間の検定またはサンプル、という進
度で行われる。
【００８０】 序論 本発明は、化学物質や薬物のようなタンパク質発現を変化させる化合物を識別
するための、改良された細胞と方法を提供する。本発明は他の利点も提供する。
【００８１】 本発明の範囲の非制限的な導入として、本発明は以下を含むいくつかの一般的
かつ有益な態様を含んでいる： １）薬物代謝に関与したタンパク質をコードする核酸分子に機能可能なプロモー
ターまたはエンハンサーとレポーター遺伝子を含む第一の核酸分子；および細胞
内受容体または転写因子をコードする第二の核酸を有する細胞であって、細胞内
受容体または転写因子がある化合物と接触し、あるいは化合物によって直接また
は間接に活性化され、あるいは化合物によって直接または間接に調節されたとき
に、細胞内受容体または転写因子が、プロモーターまたはエンハンサーと機能可
能に結合し、前記レポーター遺伝子が発現できるようにする細胞；および ２）薬物代謝に関与したタンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導する特性に
ついて化合物を評価する方法において、試験化合物を提供し；試験化合物を本発
明の細胞と接触させ；そして前記レポーター遺伝子の発現を検出することから成
る方法。
【００８２】 本発明のこれらの態様、ならびに本書に記載の他の態様は、本発明の方法、製
品および化合物を用いて達成できる。本発明の範囲の完全な真価を理解するため
に、さらに本発明の様々な態様を、本発明の所望の実施態様を作るように、組み
合わせられることが容認されるだろう。
【００８３】 Ｉ．試験化合物によって高められたタンパク質発現を評価するための細胞 本発明が含む細胞には、薬物代謝に関与したタンパク質をコードする核酸分子
に機能可能なプロモーターまたはエンハンサーとレポーター遺伝子を含む第一の
核酸分子；および細胞内受容体または転写因子をコードする第二の核酸が含まれ
、細胞内受容体または転写因子が化合物と結合したとき、細胞内受容体または転
写因子が、プロモーターまたはエンハンサーと機能可能に結合し、レポーター遺
伝子が発現できるようにする。
【００８４】 第一の核酸分子 細胞が含む第一の核酸分子は、酵素とトランスポーターを含む薬物代謝に関与
したタンパク質をコードする、核酸分子に機能可能なプロモーターまたはエンハ
ンサーとレポーター遺伝子を含む。プロモーターまたはエンハンサーは、レポー
ター遺伝子に機能可能に連結されている。このようにして、プロモーターまたは
エンハンサーが（受容体／化合物複合体の結合などによって）活性化されたとき
、レポーター遺伝子が発現する。レポーター遺伝子が検出レベル以上で発現した
場合には、プロモーターまたはエンハンサーが活性化したとされる。
【００８５】 第一の核酸分子は、好適には二本鎖ＤＮＡであるが、その限りである必要はな
い。第一の核酸分子は、染色体外、または細胞の染色体内とすることができる。
染色体外因子に含まれるのは、ベクター、ウィルス、プラスミド、ＹＡＣｓおよ
び線状核酸分子であるが、それらに限定されない。レポーター遺伝子に機能可能
に連結したプロモーターまたはエンハンサーのような第一の核酸分子の特性を有
する、このようなプラスミド、ＹＡＣｓおよび線状核酸分子を調製する方法は、
この技術において周知である。例えば、薬物代謝に関与したタンパク質をコード
する核酸分子に機能可能なプロモーターまたはエンハンサーをコードする核酸分
子は、この技術において周知であり、たいていの場合商業的に入手可能であり、
ＰＣＲ，制限酵素、消化および化学合成を含む通常の方法によって、調製または
クローニングすることができる。これらのプロモーターまたはエンハンサーをレ
ポーター遺伝子に機能可能に連結させられるのは、プロモーターまたはエンハン
サーが活性化されたときに、レポーター遺伝子が発現するようにする通常の方法
を用いてである。この構造は、ついでプラスミド、ウィルスベクター、ＹＡＣｓ
および線状核酸分子などの、しかしこれらに限定されない適切なベクターに、ク
ローニングさせることができる。これらのベクターはついで、細胞または細胞集
団の形質転換に使用することができる。かかる形質転換はこの技術分野で周知で
あり、エレクトロポレーション、ウィルス伝染性、微小投射物衝撃、または細胞
による核酸分子の受動的取り込みなどがある。
【００８６】 第一の核酸分子が、ＣＭＶプロモーター、ＭＭＴＶプロモーターまたはＳＶ４
０プロモーターのような構成プロモーターなどの、プロモーターに機能可能に連
結された選択マーカーをコードする遺伝子を含むとき、核酸分子および機能可能
な核酸分子を取り込む細胞は選択されうる。好ましい選択マーカーは抗生物質耐
性を有し、そのため、かかる第一の核酸分子を持たない細胞がこのような抗生物
質に感受性があるのに対し、機能可能な第一の核酸分子を有する細胞は特定の抗
生物質に耐性がある。このようにして、選択マーカーを発現する第一の核酸分子
を有する細胞は、選択され、および濃縮されることができる。選択的な選択マー
カーが含むのは、例えばグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその誘導体な
どの蛍光タンパク質、または、ベータ−ラクタマーゼのような蛍光基質または生
成物の形成または変換を触媒する酵素である。これらの条件下で、蛍光活性化細
胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いて、所望の蛍光特性を有する細胞を単離すること
ができる。
【００８７】 第一の核酸分子は、染色体外にあり得るか、あるいは細胞のゲノムに組み込む
ことができる。第一の核酸が細胞のゲノムに組み込まれたとき、第一の核酸は安
定して組み込まれ、その結果、細胞は一過性トランスフェクションした細胞より
も大きな信頼性と再現性を有する。特定のベクター、例えばウィルスベクター、
特にレトロウィルスベクターは、ゲノムに組み込むことができる。また、相同組
換えを用いて細胞のゲノムへの核酸分子の挿入を促進することができるが、それ
には、２００１年２月１３日発行のＴｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，に対する米国特
許第６，１８７，３０５号，および２０００年５月１６日発行のＴｒｅｃｏ ｅ
ｔ ａｌ．，に対する米国特許第６，０６３，６３０号に記載されているような
方法を用いる。別の方法では、形質転換された核酸分子は、自発的に宿主ゲノム
に組み込むことができる。細胞のゲノムへの第一の核酸分子の組み込みは、選択
マーカーまたはレポーター遺伝子の損失について細胞をスクリーニングすること
によって監視できるが、それは一過性トランスフェクションした細胞系は、細胞
のゲノムに組み込まれなかった核酸分子を排除する傾向があるためである。した
がって、選択マーカーまたはレポーター遺伝子は、細胞系の継代の反復を通して
、経時的に喪失される傾向がおそらくあるだろう。
【００８８】 本発明の一つの態様において、レポーター遺伝子は細胞の染色体に内在してい
る。この場合、レポーター遺伝子は好適にはある酵素をコードするが、該酵素は
検出可能な酵素基質またはその生成物などによってすぐに決定できる。この場合
、所望のレポーター遺伝子に機能可能なプロモーターまたはエンハンサーを含む
核酸分子は、ベクター内に遺伝子操作され、そのベクターの組み込みが、レポー
ター遺伝子またはその近傍のゲノムの遺伝子座に向けられるようにされる。プロ
モーターまたはエンハンサーなどの核酸構造の組み込みは、この分野で既知の相
同組換え法を用いて方向付けることができるが、例えば２００１年２月１３日発
行のＴｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，に対する米国特許第６，１８７，３０５号およ
び２０００年５月１６日発行のＴｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，に対する米国特許第
６，０６３，６３０号に記載されていているものである。また、この分野で知ら
れている自然発生的なまたは方向付けのない組換え法も使用できる。このような
相同組換え現象のすべてが、プロモーターまたはエンハンサーとレポーター遺伝
子との間の機能可能な連結に結びつくわけではなく、したがって、細胞または細
胞集団は、このような機能可能な連結についてスクリーニングされるべきである
。例えば、現象の結果が機能可能な連結になる場合、エンハンサーまたはプロモ
ーターの活性化はレポーター遺伝子の発現に結びつくだろう。このような発現は
、適切な検出可能な酵素基質および／または生成物を用いて、監視、およびスク
リーニングすることができる。
【００８９】 本発明の別の態様において、エンハンサーまたはプロモーターは細胞の染色体
に内在している。この場合、エンハンサーまたはプロモーターに機能可能なレポ
ーター遺伝子を含む核酸分子は、ベクター内に遺伝子操作されて、そのベクター
の組み込みが、レポーター遺伝子またはその近傍の、ゲノムの遺伝子座に向けら
れるようにする。レポーター遺伝子を含む核酸構造の組み込みは、この分野で周
知の相同組換え法を用いて方向付けることができるが、それは２００１年２月１
３日発行のＴｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，に対する米国特許第６，１８７，３０５
号および２０００年５月１６日発行のＴｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，に対する米国
特許第６，０６３，６３０号に記載されているようなものである。このような相
同組換え現象のすべてが、プロモーターまたはエンハンサーとレポーター遺伝子
との間の機能可能な連結に結びつくわけではなく、したがって、細胞または細胞
集団は、このように機能可能な連結についてスクリーニングされるべきである。
例えば、現象の結果が機能可能な連結になる場合、エンハンサーまたはプロモー
ターの活性化は、レポーター遺伝子の発現に結びつくだろう。このような発現は
、適切な検出可能な酵素基質および／または生成物を用いて、監視、およびスク
リーニングすることができる。
【００９０】 第二の核酸分子 細胞は、細胞内受容体または転写因子をコードする第二の核酸も含んでいる。
細胞内受容体または転写因子が化合物と結合したとき、細胞内受容体または転写
因子はプロモーターまたはエンハンサーと機能可能に結合することができ、結果
としてレポーター遺伝子が発現する。
【００９１】 第二の核酸分子は、好適には二本鎖ＤＮＡであるが、その限りである必要はな
い。第二の核酸分子は、染色体外または細胞の染色体内とすることができる。染
色体外因子に含まれるのは、ベクター、ウィルス、プラスミド、ＹＡＣｓおよび
線状核酸分子であるが、それらに限定されない。細胞内受容体または転写因子を
コードする核酸分子を含むような、第二の核酸分子の特性を有するこのようなプ
ラスミド、ＹＡＣｓおよび線状核酸分子を調製する方法は、この技術において周
知である。例えば、細胞内受容体または転写因子をコードする核酸分子はこの技
術において周知であり、たいていの場合商業的に入手可能であり、そして通常の
方法によってクローニングすることができる。この構造体は、ついでプラスミド
、ウィルスベクター、ＹＡＣｓおよび線状核酸分子などの、しかしこれらに限定
されない、適切なベクターにクローニングすることができる。これらのベクター
は次に、細胞または細胞集団の形質転換に使用することができる。かかる形質転
換はこの技術分野で周知であり、エレクトロポレーション、ウィルス伝染性、微
小投射物衝撃、または細胞による核酸分子の受動的取り込みなどがある。
【００９２】 好適には、第二の核酸分子は調節因子を含み、例えば細胞内受容体または転写
因子をコードする前記核酸分子と機能可能に連結した、プロモーターまたはエン
ハンサーなどである。調節因子は、好適にはプロモーターまたは構成的プロモー
ターであり、例えばＳＶ４０プロモーター、ＭＭＴＶプロモーターまたはＣＭＶ
プロモーターである。第一の核酸分子について論じたように、このタイプの配置
を有するベクターなどの構造を作るのに認められた技術方法がある。
【００９３】 第二の核酸分子が、ＣＭＶプロモーター、ＭＭＴＶプロモーターまたはＳＶ４
０プロモーターのような構成的プロモーターなどの、プロモーターに機能可能に
連結された選択マーカーをコードする遺伝子を含むとき、核酸分子を取り込んだ
細胞は選択できる。好ましい選択マーカーは抗生物質耐性を含み、かかる第二の
核酸分子を持たない細胞はかかる抗生物質に感受性があるのに対し、機能可能な
第二の核酸分子を有する細胞は特定の抗生物質への耐性がある。このようにして
、選択マーカーを発現する第二の核酸分子を有する細胞は、選択、および濃縮す
ることができる。選択的な選択マーカーが含むのは、例えばグリーン蛍光タンパ
ク質（ＧＦＰ）またはその誘導体などの蛍光タンパク質、または、ベータ−ラク
タマーゼのような蛍光基質または生成物の形成または変換を触媒する酵素である
。これらの条件下で、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いて、所望の蛍
光特性を有する細胞を単離することができる。
【００９４】 第一の核酸分子と第二の核酸分子の双方が選択マーカーを含む本発明の態様に
おいて、好ましいことは、これらの選択マーカーが異なることであるが、その限
りである必要はない。異なる選択マーカーは、細胞における第一の核酸分子と第
二の核酸分子の両方の監視を独立してできる。
【００９５】 第二の核酸分子は、染色体外にあり得るか、あるいは細胞のゲノムに組み込む
ことができる。第二の核酸が細胞のゲノムに組み込まれたとき、第二の核酸は安
定して組み込まれ、その結果、細胞は一過性トランスフェクションした細胞より
も大きな信頼性と再現性を有する。特定のベクター、例えばウィルスベクター、
とくにレトロウィルスベクターは、ゲノムに組み込むことができる。また、相同
組換えを用いて、細胞のゲノム内への核酸分子の挿入を促進することができるが
、それには２００１年２月１３日発行のＴｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，に対する米
国特許第６，１８７，３０５号および２０００年５月１６日発行のＴｒｅｃｏ
ｅｔ ａｌ．，に対する米国特許第６，０６３，６３０号に記載されているよう
な方法を用いる。別の方法では、形質転換された核酸分子は、自発的に宿主ゲノ
ムに組み込むことができる。細胞のゲノムへの第二の核酸分子の組み込みは、選
択マーカーまたはレポーター遺伝子の損失について細胞をスクリーニングするこ
とによって監視できるが、それは一過性トランスフェクションした細胞系は、細
胞のゲノムに組み込まれなかった核酸分子を排除する傾向があるからである。こ
のように、選択マーカーまたはレポーター遺伝子は経時的に損失する傾向がおそ
らくある。染色体に核酸分子を組み込む機器と方法は、この分野で周知である（
例えば、Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，を発明者とする１９９８年４月２日公
開のＷＯ９８／１３３５３；エディンバラ大学に１９９４年１０月２７日公開さ
れたＷＯ９４／２４３０１；２００１年２月１３日発行のＴｒｅｃｏ ｅｔ ａ
ｌ．，に対する米国特許第６，１８７，３０５号および２０００年５月１６日発
行のＴｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，に対する米国特許第６，０６３，６３０号を参
照）。
【００９６】 本発明の一つの推奨される態様において、細胞内受容体または転写因子をコー
ドする遺伝子は、細胞の染色体に内在する。とくに、細胞内受容体または転写因
子をコードする遺伝子は、細胞のゲノム内のその本来の環境にあり、すなわちそ
の位置、およびプロモーターまたはエンハンサーのようなシス作用調節因子を含
む周囲のゲノムは、人の介入によって意図的に改変されていない。
【００９７】 本発明の別の態様において、細胞内受容体または転写因子をコードする遺伝子
は、細胞の染色体に内在するが、プロモーターまたはエンハンサーのような細胞
内受容体または転写因子をコードする遺伝子に機能可能な外因性の調節配列が、
細胞のゲノムに組み込まれており、好ましくは細胞内受容体または転写因子をコ
ードする内因性遺伝子と操作自体に連結されるようになっている。細胞内受容体
または転写因子をコードする遺伝子を含む核酸構造の組み込みは、この技術分野
で周知の相同組換え法または自然発生的な方向付けのない組換え法を用いて方向
付けることができるが、それは２００１年２月１３日発行のＴｒｅｃｏ ｅｔ
ａｌ．，に対する米国特許第６，１８７，３０５号および２０００年５月１６日
発行のＴｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，に対する米国特許第６，０６３，６３０号に
記載されているようなものである
【００９８】 このような相同組換え現象のすべてが、調節因子と細胞内受容体または転写因
子をコードする遺伝子との間の機能可能な連結に結びつくわけではなく、したが
って、細胞または細胞集団は、かかる機能可能な連結でスクリーニングされるべ
きである。このような発現を監視、およびスクリーニングすることができるのは
、かかる細胞内受容体または転写因子の活性を検出するのに適した方法を用いて
である。別の方法では、細胞のゲノムに組み込まれる構造体が含むことのできる
レポーター遺伝子は、細胞内受容体または転写因子の発現を調節するのに使用さ
れた調節配列と機能可能に連結する。別の方法では、レポーター遺伝子は第二の
調節配列と機能可能に連結することができるが、該調節配列は細胞内受容体また
は転写因子の発現を調節するのに使用された調節配列と同一または異なっていて
もよい。この場合、レポーター遺伝子の持続した発現が示すのは、核酸構造が細
胞のゲノムに機能可能に連結されたことである。
【００９９】 第一の核酸分子と第二の核酸分子の相互作用 図１から図５は、概略図で本発明の様々な態様を示している。これらの図が提
供するのは、ある状況における本発明の一般的作用であり、ここで第一の核酸分
子と第二の核酸分子は外因性、内因性、組み込みあるいは染色体外である。図１
が示すのは、第一の核酸分子と第二の核酸分子の一般的相互作用である。一般的
に細胞が、薬物代謝に関与する酵素またはトランスポーターの発現を誘導する化
合物と接触したとき、レポーター遺伝子が発現する。しかしながら、細胞が薬物
代謝に関与する酵素をコードする遺伝子を持たないとき、あるいはこのような遺
伝子が発現を許す配置にないとき、薬物代謝に関与したタンパク質は発現しない
ことがある。
【０１００】 図１Ａに示したように、細胞（１６）内の第二の核酸分子（１０）は調節因子
（１２）を含み、細胞内受容体または転写因子をコードする遺伝子（１４）の発
現を調節する。このとき発現した細胞内受容体または転写因子（１８）は、結合
、組み合わせ、調節などの適切な相互作用によって試験化合物（１１）と相互作
用することができる。試験化合物は、能動輸送または受動輸送機構によって細胞
に入ることができる。試験化合物はこの輸送プロセスによって随意に修飾するこ
とができ、修飾された試験化合物（１３）を形成する。図１Ｂに示したように、
転写因子または受容体は、適切な試験化合物または代謝物と特異的に結合するこ
とができるが、それは受容体−リガンドの組であり、複合体（１７）を形成する
ときである。この複合体（１７）は、第一の核酸分子（１９）と、また随意に細
胞のゲノム（２０）と結合することができる。第一の核酸分子（１９）、または
細胞のゲノム（２０）と結合するとき、複合体（１７）が結合できるのは、薬物
代謝に関与したタンパク質をコードする核酸分子に機能可能な調節因子（２２）
、またはこのような複合体（１７）と結合できる内因性調節因子（２４）である
。後者の場合、内因性調節因子は、薬物代謝に関与したタンパク質をコードする
遺伝子（２６）の発現を調節することができる。しかしながら、内因性調節因子
との結合は、とくに本発明のこの態様において、本発明の要件ではない。図１Ｃ
に示したように、第一の核酸分子の調節因子に複合体を結合することによって、
レポーター遺伝子（３０）によってコードされたレポーター（２８）の発現に至
る。内因性調節配列への複合体の結合の結果は、薬物代謝に関与した内因性タン
パク質（２１）の発現に至ることがある。薬物代謝に関与した内因性タンパク質
は、ヒドロキシル化（２５）などの様々な機構を介して化合物（２３）を修飾す
ることができる。レポーターが検出できるのは、レポーターの蛍光性（２７）ま
たは検出可能な物質（３１）への基質（２９）の変換などによる（図１Ｄ）。
【０１０１】 このように、化合物（１１）または修飾された化合物（１３）が、細胞内受容
体または転写因子（１８）と結合できるとき、および薬物代謝に関与したタンパ
ク質をコードする核酸分子の調節配列（２２）と結合できるとき、レポーター遺
伝子（３０）は検出できるレポーター（２８）として発現する。
【０１０２】 薬物代謝に関与したタンパク質 薬物代謝に関与したタンパク質は、任意の適切な酵素またはトランスポーター
とすることができる。薬物代謝に関与する好ましい酵素に含まれるのは、Ｐ４５
０ｓ、トランスポーター、グルクロノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルト
ランスフェラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、ｐ−糖タンパク質および
スルホトランスフェラーゼであるが、それらに限定されない。好ましいトランス
ポーターに含まれるのは、ｐ−糖タンパク質（ＭＤＲ１）であるが、それに限定
されない。このタンパク質は、薬物代謝物を細胞から運び出し、そして細胞によ
る薬物代謝の速度に影響することができる。Ｐ−糖タンパク質発現は一定の薬物
によって変化させることができる（例えば、Ｓｃｈｕｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍ
ｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９：３１１−３１８（１９９９）；Ｌａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８：８６３−８６９（２０００）お
よびＷｒｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．３２：
３３９−３６１（２０００）参照）。これらのタイプのタンパク質をコードする
核酸分子は報告されており、および分子生物学の標準的方法を用いて単離できる
（例えば、Ｇａｒａｔｔｉｎｉ，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．２９：８５３
−８８６（１９９７）；Ｓｃｈｕｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌ．４９：３１１−３１８（１９９６））およびＮｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｄ
ｉｅｔｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６１：１２４−１３５（２０００）参
照）。
【０１０３】 プロモーターまたはエンハンサー 薬物代謝に関与したタンパク質をコードする核酸分子に機能可能である、プロ
モーターまたはエンハンサーのような調節配列は、好適にはＰ４５０ｓ、グルク
ロニルトランスフェラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼおよびスルホトラ
ンスフェラーゼまたはｐ−糖タンパク質の、プロモーターまたはエンハンサーで
ある。このような調節配列の配列は、この分野で周知であり、分子生物学の標準
的方法を用いて単離できる（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：１−５１（１９９３）；Ｗｉｎｄｍｉｌｌ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．３７６：１５３−１６０（１９９７）；Ｓｃｈｕｅ
ｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６５：２６１−２７２
（１９９５）；Ｓｃｈｕｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
４９：３１１−３１８（１９９６）；Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌ．８０：１０２７−１０３１（
１９９５）；Ｂｒｏｃｋｍｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．１０３：１７３−１８３（１９９８）；Ｖａｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：５５２０−５５２３（１９９５）；Ｒｏｄｒｉｇｏ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３４：３０３−３
０７（１９９９）およびＭｕｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．
Ｄｉｓｐｏｓ．２７：５６９−５７３（１９９９）参照）。
【０１０４】 レポーター遺伝子 レポーター遺伝子は、この分野で周知の適切な任意のレポーター遺伝子とする
ことができる。レポーター遺伝子は、検出可能なタンパク質または検出可能な酵
素のようなレポーターをコードする。検出可能なタンパク質は、それらの物理特
性、例えばグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその誘導体のような蛍光タ
ンパク質の場合は、蛍光性に基づいて検出され得る。酵素が検出されるのは適切
な基質を用いてであり、該基質は、タンパク質が基質に作用したときに特性を変
化して生成物を形成する。特定の基質−酵素の組み合わせは、基質の蛍光特性に
おける変化の要因となるが、それは例えばＣＣＦ２／ＡＭに作用するベータ−ラ
クタマーゼの場合、ＣＣＦ２／ＡＭ分子におけるＦＲＥＴの特性を変化させる。
蛍光は、ＭＵＧに対する一連のグルクロニダーゼ活性において生成させることが
できる。化学発光は、一連のルミノールジオキサンの活性によって生成できる。
発光は、ルシフェリンに対するルシフェラーゼ活性によって生成できる（例えば
、Ａｌａｍ ａｎｄ Ｃｏｏｋ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８：４５−２
５４（１９９９）参照）。着色生成物は、Ｘ−Ｇａｌ基質に対するベータ−ガラ
クトシダーゼ活性によって生成できる。レポーター遺伝子転写の研究に対するレ
ポーター遺伝子の適用の可能性が論じられている（Ａｌａｍ ａｎｄ Ｃｏｏｋ
，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８：４５−２５４（１９９０））。
【０１０５】 細胞内受容体または転写因子 本発明の一つの態様において、細胞内受容体または転写因子は、薬物、化学物
質またはそれらの代謝産物のような生体異物と複合体を形成し、そして薬物代謝
に関与したタンパク質をコードする遺伝子を直接または間接的に転写活性化する
。この活性は図に示されている。本発明の一つの態様によれば、細胞内受容体ま
たは転写因子は、ホルモン受容体ではないが、それは本発明の要件ではない。本
発明の別の態様によれば、細胞内受容体または転写因子は、オーファン受容体で
ある、すなわち周知のあるいは認定された機能がない受容体である。このような
オーファン受容体の例に含まれるのは、ＰＸＲとＣＡＲであるが、それらに限定
されない（例えば、Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．１０２：１０１６−１０２３（１９９８）；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍ
ｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：２７−３９（２０００）；Ｈｏｎｋａｋｏ
ｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４７：３２１−３３７（２００
０）およびＳａｖａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：８
５１−８５７（１９９９）参照）。細胞内受容体または転写因子は、糖質コルチ
コイド受容体などのホルモン受容体とすることができるが、それに限定されない
。
【０１０６】 細胞 本発明の細胞は、原核細胞または真核細胞を含む、任意の細胞とすることがで
きる。細胞は好適には真核細胞であり、ヒトを含む哺乳類被験体由来のものであ
る。細胞の起源は任意であることができ、例えば中胚葉、内胚葉または外胚葉に
由来するものなどである。細胞は被験体からの任意の組織、器官または体液に由
来するものとすることができるが、好適には肝臓、腎臓または肺に由来するもの
である。細胞は被験体から提供され得るが、例えば生検または解剖からのサンプ
ルからなどであり、また周知の初代培養細胞とすることができ、あるいはこの分
野で周知の方法によって製造できる。例えば、アメリカン・タイプ・ティシュー
・コレクションからは多種多様な細胞系を入手できる（ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏ
ｇｕｅｓ（２００１）参照）。細胞は各種の細胞などの混合培養物とすることも
できるし、または細胞タイプが提供される。例えば、初代培養細胞が含み得るの
は、繊維芽細胞と混合した肝細胞などの、各種の細胞タイプである。異なる連続
培養細胞系の混合培養物あるいは初代培養細胞および連続培養細胞系の混合培養
物も使用することもできる。本発明の一つの態様において、細胞は形質変換する
ことができ、外因性のタンパク質またはポリペプチドを発現できるようにする。
【０１０７】 本発明の一つの態様において、細胞は特定の被験体から提供され得る。被験体
の身元が判明している必要はないが、ただ特定の被験体が細胞の供給源である。
別の方法では、共通の種族的出身、または共通の疾患状態、疾患条件、生理学的
な遺伝子型または表現型あるいは代謝表現型あるいは遺伝子型を有するものなど
、被験体の集団からの細胞を用いることができる。これらの細胞は本発明の細胞
になるように形質転換することができ、また本発明の方法に使用することができ
る。この場合、生体異物に対するこれらの細胞の応答が示し得るのは、その被験
体または被験体集団がどのようにその生体異物に対して代謝的に、また生理的に
応答するかである。被験体集団からの細胞の場合、異なる被験体からの細胞を別
個に試験することができるが、その限りである必要はない。これらのタイプの研
究の結果を収集し、分析されることができるのは、薬理ゲノム学の研究および方
法の役に立つ生物情報学の技術を用いてである。各種のコンピュータプログラム
がこのような分析を提供するのに利用可能であるが、線形または非線形統計手法
を提供することができる統計ソフトウェアのようなものに限定されない。統計分
析の選択は、当業者によって選ばれる。
【０１０８】 これらの方法を用いて生成されたデータ、分析および／または結果も、本発明
の一部である。データ、分析および／または結果は、適切な情報保存媒体に保存
できるが、磁気媒体、テープ、紙などに限定されない。情報保存媒体は、好まし
くは機械で読取り可能なフォーマットであるが、その限りである必要はない。情
報保存媒体は、中央処理装置を有する機械などの、機械の一部とすることもでき
る。このような機械は、本発明の一部として機能することも、機能しないことも
ある。
【０１０９】 ＩＩ．薬物代謝に関与したタンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導するた
めの試験化合物を評価する方法
【０１１０】 本発明が含む方法は、薬物代謝に関与したタンパク質をコードする遺伝子の発
現を誘導する特性について化合物を評価するために、試験化合物を提供し、試験
化合物を本発明の細胞と接触させ、前記レポーター遺伝子の発現を検出すること
である。レポーター遺伝子の発現が示すのは、試験化合物が薬物代謝に関与した
タンパク質をコードする遺伝子の発現が変化したことである。この方法はハイス
ループット法において可能だが、それは本発明の要件ではない。
【０１１１】 本発明の様々な態様が図に示されている。例えば、図１は本発明の一つの態様
の一連の図を示し、そこでは第一の核酸分子と第二の核酸分子がプラスミドのよ
うな染色体外因子として提供されている。図１Ａに示したように、調節因子Ｐ２
は、細胞内受容体または転写因子をコードする遺伝子の転写を調節する。翻訳産
物はつぎに、細胞内受容体または転写因子と結合する試験化合物と相互作用する
ことができる。図１Ｂに示したように、細胞内受容体または転写因子と生体異物
または試験化合物の複合体はついで、薬物代謝に関与したタンパク質をコードす
る核酸分子に機能可能なプロモーターまたはエンハンサーと結合することができ
る。複合体はまた核に入ること、そして薬物代謝に関与したタンパク質をコード
する核酸分子に機能可能な内因性プロモーターまたはエンハンサーと随意に結合
することができるが、それはこのような細胞に存在するか活性であるときである
。この複合体を薬物代謝に関与したタンパク質をコードする核酸分子に機能可能
なプロモーターまたはエンハンサーと結合させたとき、レポーター遺伝子が転写
され、そしてレポーターに翻訳され、また随意に薬物代謝に関与する内因性酵素
が発現するが、それはこのような細胞に存在するか活性であるときである（図１
Ｃ）。そのレポーターは、蛍光のような物理特性によって検出可能であり、ある
いは基質の、検出可能な生成物のような生成物への酵素変換に基づいて検出でき
るタンパク質とすることができる（図１Ｄ）。本発明の別の態様によれば、第一
の核酸分子と第二の核酸分子の両方が、同一の染色体外因子、例えば単一のプラ
スミドまたはＹＡＣまたは別個のプラスミドに提供される。
【０１１２】 図１に記載の本発明の態様に対する代替案も提供される。例えば、図２が示し
ているのは、第一の核酸分子が染色体外因子であるのに対し、第二の核酸分子が
細胞の染色体に内在する場合である。図３が示しているのは、第一の核酸分子が
染色体外因子であり、第二の核酸分子が細胞のゲノムに組み込まれた外因性の核
酸分子である場合である。図４が示しているのは、第一の核酸分子が細胞のゲノ
ムに組み込まれた外因性の核酸分子であり、第二の核酸分子が細胞の染色体に内
在する場合である。図５が示しているのは、第一の核酸分子が細胞のゲノムに組
み込まれた外因性の核酸分子であり、第二の核酸分子が細胞のゲノムに組み込ま
れた外因性の核酸分子である場合である。
【０１１３】 本発明の方法が実施できるのは、適切な機器、例えばフラスコまたはウェルあ
たりの適切な表面積を有する組織培養フラスコまたはプレートを用いてである。
好適には、該方法が使用するのは、標準サイズのマイクロタイタープレートのフ
ットプリントに、６，１２，２４，４８または９６のウェルを有する適切なプレ
ートである。該方法が使用することもできるのは、標準フットプリントのプレー
トあたり１９２，２８８，３８４，４８０，５７６，６７２，７６８，８６４，
９６０，１０５６あるいはそれ以上のウェルがある、密度が高いプレートである
。これらのプレートは、Ｃｏｓｔｅｒをはじめとして商業市場内のその他の業者
を通じて、商業的に入手可能である。
【０１１４】 該方法を実施できるのは、技術的人材、あるいは部分的にまたは全体的にロボ
ットを用いてである。後者の場合、ロボットを用いて高い処理能力を提供して、
費用を削減し、方法の性能の信頼性を高めることができる。ロボットシステムは
これらの方法を実施するように作られることができる。例えば、この技術分野で
周知のサンプル保存ユニットを使用して、索引を付けた様式で試験化合物を保管
することができる。この技術分野で周知の検索ロボットを利用して、サンプル保
存ユニットからサンプルを取り出し、この技術分野で周知の分配ロボットを用い
て、ウェルやマイクロタイタープレートのウェルのような試験容器に後で分配す
ることができる。ロボットを利用してできるのは、この技術分野で周知の分配ロ
ボットを用いて、試験容器に本発明の細胞および適切な培養試料を分配し、つい
で適切な条件で培養して、このような細胞培養物を生育または維持することであ
る。この技術分野で周知の培養器が、適切な条件を提供するのに用いることがで
きる。
【０１１５】 試験容器における細胞培養物は、この技術分野で周知の分配ロボットを用いる
ような、ロボットを利用して試験化合物と組み合わせることができる。試験化合
物を伴う細胞は空気および温度のような適切な条件を提供され、それはこの技術
分野で周知の培養器のような、本発明の方法のためである。レポーター遺伝子産
物は直接検出できるが、検出可能なタンパク質、あるいは酵素のための酵素基質
を添加することによる。酵素基質は、分配ユニットなどの、ロボットを用いて試
験容器に添加できる。細胞は、もし必要なら、この技術分野で周知のロボット分
配装置と方法を用いて分配できる、望まれた、あるいは適切な試薬を用いて溶解
することができる。この技術分野で周知の検出装置、例えば色原体、蛍光、発光
その他のマイクロタイタープレートリーダーが、レポーター遺伝子産物を検出す
るのに使用できる。
【０１１６】 これらの方法を用いて生成された出力情報またはデータは、中央処理装置を含
む装置のような情報保存装置に導くことができる。情報保存装置は、適切なソフ
トウェアのような情報処理能力を含むこともできる。このソフトウェアは、この
技術分野で周知の統計比較を実施し、あるいは統計分析を実施する能力を有する
ことができ、線形および非線形手法を含んでいる。
【０１１７】 かかるロボットシステムとそれらの構成要素は、一般的にこの技術分野で周知
であり、一般的に記載されているか、またはその全部または一部がさまざまな業
者から入手できる（一般的には、発明者Ｓｔｙｌｌｉ ｅｔ ａｌ．による１９
９８年１１月１９日に発行されたＷＯ９８／５２０４７参照）。本発明の方法を
実施するために使用される各種の工程とプロセスは、ロボットまたは人手によっ
て独立して実施することができる。
【０１１８】 実施例 実施例１
【０１１９】 Ａ．機器と方法
【０１２０】 トランスフェクションのためのプラスミド構造 ヒトＰＸＲの全長コード領域は、ＲＴ−ＰＣＲによってヒト肝臓のサンプルか
ら得られたＲＮＡから誘導された。フォワードプライマーとリバースプライマー
のオリゴヌクレオチド配列はそれぞれ、５’−ＡＴＧＧＡＧＧＴＧＡＧＡＣＣＣ
ＡＡＡＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および５’−ＣＴＣＡＧＣＴＡ
ＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）であった。ＰＣ
Ｒ条件は、９４℃で４分間、ついで９４℃で４５秒、５５℃で１分および７２℃
で２分の３０サイクルで変性し、最後に７２℃で７分間延長することから成る。
１３００の塩基対増幅産物をｐＣＲ２．１にクローニングし（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、配列分析にかけた。得られた配列は、全コー
ド領域にわたって、先に記載されたものと一致した（Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：１０１６−１０２３（１９９８）
）。つぎにｃＤＮＡは、ＢａｍＨ１とＮｏｔ１で消化してｐＣＲ２．１から抽出
し、ネオマイシン選択カセットを含むｐＩＲＥＳ（ｎｅｏ）ベクターの類似の部
位にクローニングした（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。
【０１２１】 フォワードプライマーとリバースプライマーは、ＰＸＲＥを含むことが既知で
あるＣＹＰ３Ａ４の５’−フランキング領域に作られた（Ｑｕａｔｔｒｏｃｈｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８９１７−２８９２３（
１９９５））。フォワードプライマーとリバースプライマーのオリゴヌクレオチ
ド配列はそれぞれ、５’−ＡＧＡＣＴＣＡＣＣＴＣＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＡＡ−
３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）および５’−ＣＡＣＣＴＴＧＧＡＡＧＴＴＧＧ
Ｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）であった。この４８０塩基対領域は、ヒト
の肝臓のサンプルから単離したゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した。アンプライ
マーは、ｐＣＲ２．１にクローニングし、配列決定した。つぎにエンハンサー領
域を、ｐＣＲ２．１からＥｃｏＲ１で遊離させ、平滑末端にし、そして哺乳類の
選択マーカーなしに、またルシフェラーゼレポーター遺伝子を含めて、ｐＧＬ３
−プロモーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＳｍａ１
部位にクローニングした。配列分析で確認されたことは、エンハンサーが先に公
開されたもの（Ｑｕａｔｔｒｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７０：２８９１７−２８９２３（１９９５））と同一であることと、オリゴ
ヌクレオチドが挿入されていることであった。
【０１２２】 Ｇ４１８−耐性コロニーの安定したトランスフェクションと選択 ＨｅｐＧ２細胞は、約５０％の飽和細胞密度で採取され、１０％ウシ胎児血清
（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭにウェルあたり５×１０5で６ウェルプレートに播種
した。２４時間の再生の後、細胞は次の割合でトランスフェクションした、すな
わち５：１の割合のＣＹＰ３Ａ４エンハンサー／ｐＧＬ３プロモーターおよびｈ
ＰＸＲ／ｐＩＲＥＳ（ｎｅｏ）（合計６マイクログラムＤＮＡ／ウェル）、ＣＹ
Ｐ３Ａ４エンハンサー／ｐＧＬ３プロモーターおよびｐＩＲＥＳ（ｎｅｏ）（５
：１の割合、ウェルあたり６マイクログラムＤＮＡ）、ｐＧＬ３プロモーターお
よびｐＩＲＥＳ（ｎｅｏ）（５：１の割合、６マイクログラムＤＮＡ／ウェル）
、およびｐＧＬ３プロモーターおよびｈＰＸＲ／ｐＩＲＥＳ（５：１の割合、ウ
ェルあたり６マイクログラムのＤＮＡ）であり、リン酸カルシウム共沈法の修飾
を用いている（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ／Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０））。コントロール細胞は、ｐＧＬ３プロモーターお
よびｐＩＲＥＳ（ｎｅｏ）またはｐＧＬ３プロモーターおよびｐＩＲＥＳ（ｎｅ
ｏ）にあるｈＰＸＲを含むプラスミドＤＮＡを受け取ったものであった。沈殿し
たＤＮＡに１６時間曝露した後、培地は除去され、細胞をＤＭＥＭで二回洗浄し
、１０％ＦＢＳを含有する新しい培地を添加した。さらに２４時間後、培地はミ
リリットルあたり４００マイクログラムのＧ４１８を含有しているものに替えた
。培地は、三週間の間二日おきに小さなコロニーが見えるようになるまで、交換
した。一つのコロニーを選択して、Ｃｏｓｔａｒの２４ウェルプレートに移送し
た（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）。２４のウェルのそれぞれは、同
じ培地を含有し、細胞は三日おきに交換した培地で飽和細胞密度まで生長させた
。飽和細胞密度に達したウェルはトリプシン処理され、細胞を６ウェルプレート
に移送し、そこで飽和細胞密度に達すると、細胞はさらにＴ７５フラスコに移送
した。無作為に選択したコロニーの飽和細胞密度に達したフラスコはトリプシン
処理され、９６ウェルプレートへの播種に用いて、組換え体の存在を試験するた
め、個別のコロニーのリファンピシン誘導されたルシフェラーゼ応答を測定した
。
【０１２３】 ルシフェラーゼアッセイ ルシフェラーゼアッセイを、製造者によって明記されたように実施した（Ｌｕ
ｃＬｉｔｅ ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍｅｒｉ
ｄｅｎ，ＣＴ）。活性はＰａｃｋａｒｄ社のＬｕｍｎｉＣｏｕｎｔルミノメータ
ーを用いて測定し、結果は相対発光量、またはコントロール（ＤＭＳＯ処理細胞
）に対する増加倍率で表した。
【０１２４】 安定した形質転換細胞の処理 組換えＤＮＡを含むＨｅｐＧ２誘導細胞系を、培地において単層として生長さ
せるが、該培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲ
Ｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、ミリリット
ル毎に１００マイクログラムのストレプトマイシン、０．１ミリモル非必須アミ
ノ酸（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、ミリリットル毎に０．４ミリグラムのＧ４１８（
Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ．Ｌｏｇａ
ｎ，ＵＴ）を含み、そして３７℃で５％ＣＯ2と９５％空気の環境で維持した。
細胞は、Ｔ７５フラスコに播種し、飽和細胞密度に達するまで生長させた。三か
ら五日後、細胞をトリプシン処理によってフラスコから除去し、０．１％ＦＢＳ
とＧ４１８を含むが指示薬（フェノールレッド）を含んでいないＤＭＥＭ培地に
おいて、ウェルあたり約１．０×１０4細胞の密度で９６ウェルプレートで再培
養した。７２時間の再生の後に、細胞を含む、肝臓癌、コントロールおよびＣＹ
Ｐ３Ａ４エンハンサー、およびｈＰＸＲ＋３Ａ４エンハンサーを伴うそれらは、
０．１％ＤＭＳＯ（コントロール）またはＤＭＳＯに溶解した誘導物質で処理さ
れるが、それは０．１％ＦＢＳとＧ４１８を含むが指示薬なしの新鮮な培地にお
いて様々な時間と濃度においてである。そのＣＹＰ３Ａ４エンハンサーを含む細
胞が確認されるのは、ｈＰＸＲ／ｐＩＲＥＳ（ｎｅｏ）およびｐＧＬ３プロモー
ターまたはｐＩＲＥＳ（ｎｅｏ）およびｐＧＬ３プロモーターでトランスフェク
ションしたコントロール細胞との結果の比較による。ｐＧＬ３／３Ａ４エンハン
サーを含む細胞のスクリーニングを行うのは、１０マイクロモルのリファンピシ
ンおよび０．１％ＤＭＳＯでの処理による。コントロール（ＤＭＳＯ処理）細胞
に対してルシフェラーゼ活性が三倍増以上を示す細胞は、正確なプラスミドで形
質転換されたと見なされた。最後に、ＨｅｐＧ２細胞のゲノムに組み込まれた３
Ａ４エンハンサーのコピー数は、サザンブロット解析で確認された。
【０１２５】 ｐＩＲＥＳ（ｎｅｏ）とｐＧＬ３／３Ａ４またはｈＰＸＲ＋ｐＧＬ３／３Ａ４
で陽性と認められた細胞系を試験するために、経時研究を実施した。細胞が処理
されるのは、１０マイクロモルのリファンピシンで６から７８時間の間、六時間
間隔で測定した応答の分析による。くわえて、用量反応曲線を各種ＣＹＰ３Ａ４
誘導物質および非誘導物質について作成し、応答因子の特異性を確認するように
した。用量反応曲線は、五回の異なる投与につき１から１，０００マイクロモル
の範囲の濃度から成る。試験した作用物質は、ＲＵ４８６（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｐｌ
ｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）、メバスタチン（Ｂｉｏｍｏｌ）、リフ
ァンピシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、オメ
プラゾール（Ａｓｔｒａ‐Ｚｅｎｅｃａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、クロトリマゾール（
Ｓｉｇｍａ）、フェノバルビタール（Ｍｅｒｃｋ，Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ，ＰＡ
）、またはデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、および負の誘導物質としては、プレ
グネノロン１６（アルファ）−カルボニトリル（ＰＣＮ，Ｓｉｇｍａ）およびＴ
ＣＤＤ（Ｃｈｅｍｓｙｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｎ
ｅｘａ，ＫＹ）であった。細胞は，それぞれの化合物に７２時間曝露した。すべ
ての誘導物質は、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
，ＭＯ）に溶解し、この溶液を０．１％でコントロール細胞に添加した。
【０１２６】 Ｂ．結果 誘導性のルシフェラーゼ活性を発現するＧ４１８−耐性コロニーの同定 安定した細胞系が生長したのは、プラスミド、ｐ３Ａ４−エンハンサー、ｐｈ
ＰＸＲおよびコントロールベクターのＨｅｐＧ２細胞へのトランスフェクション
、およびＧ４１８耐性からの選択による。耐性コロニーは、ｐ３Ａ４−エンハン
サー、ｐ３Ａ４−エンハンサー−ｐｈＰＸＲおよびコントロールベクターについ
て同定された（表１）。いくつかの形質転換からの全細胞ＤＮＡのサザンブロッ
ト解析によって、安定して組み込まれたＣＹＰ３Ａ４エンハンサー配列の存在が
確認された。ｈＰＸＲがこのプラスミドを受け取った細胞に安定して組み込まれ
ることの検証は、いくつかのコロニーのノーザンブロット解析によって行った（
図８）。ｐｈＰＸＲで形質転換されていないＨｅｐＧ２細胞、またはヒトの肝細
胞の初代培養からのＲＮＡと比較した場合、ＰＸＲｍＲＮＡは有意に過剰発現を
示した。随意に選択したコロニーは、誘導性のルシフェラーゼ活性を試験したが
、ＤＭＳＯまたは１０マイクロモルのリファンピシンでの処理による。表１は、
ルシフェラーゼ活性についてスクリーニングしたＧ４１８−耐性コロニーの数、
および基礎または誘導されたルシフェラーゼ活性を有するＧ４１８−耐性コロニ
ーの数をまとめたものである。
【０１２７】
【表１】
【０１２８】 ＨｅｐＧ２細胞へのｐ３Ａ４−エンハンサープラスミドのトランスフェクショ
ンにつづいて、Ｇ４１８を選択した結果、複数個のＧ４１８−耐性コロニーが単
離され、そのうち１３をルシフェラーゼ活性について試験した。１１のＧ４１８
−耐性コロニーは、基礎レベルのルシフェラーゼ発現を示すことができ、また６
のコロニーは、４８時間または７２時間１０マイクロモルのリファンピシンで処
理したとき、誘導物質に媒介されたルシフェラーゼ活性を示した。
【０１２９】 安定して組み込まれたｐ３Ａ４−エンハンサーおよびｐｈＰＸＲプラスミドを
含む３６のＧ４１８−耐性コロニーは、リファンピシン処理で高レベルのルシフ
ェラーゼ発現を示した（表１）。ｐＩＲＥＳ（ｎｅｏ）＋ｐルシフェラーゼプラ
スミドを含む三つのコントロールＧ４１８−耐性コロニー（クローン）は、基礎
レベルのルシフェラーゼ活性を示した。最も高い誘導性のルシフェラーゼ活性を
含むｐ３Ａ４−エンハンサー＋ｐｈＰＸＲおよびｐ３Ａ４−エンハンサー形質転
換体を、さらなる研究のために選択し、それぞれＰＸＲ／３Ａ４（コロニー１Ｆ
）および３Ａ４（コロニー１３）と名付けた。
【０１３０】 安定して組み込まれたＣＹＰ３Ａ４配列からの誘導性のルシフェラーゼ活性 ９６ウェルプレートで実施した最初の実験は、ｐ３Ａ４−エンハンサー＋ｐｈ
ＰＸＲ、ｐ３Ａ４−エンハンサー、およびベクターコントロール細胞についての
反応時間曲線から成る。１０マイクロモルのリファンピシンへの曝露は、ゼロか
ら７２時間の範囲であった（図９）。コロニー３Ａ４／１３では、リファンピシ
ンに媒介されたルシフェラーゼ活性誘導は、曝露から７２から７８時間で認めら
れ、ＤＭＳＯで処理した細胞の３５倍から４３倍の範囲であった。ＣＹＰ３Ａ４
エンハンサーとｈＰＸＲを含む二つの別個のコロニー、すなわちコロニー１Ｆお
よび６Ｈは、ルシフェラーゼ活性を示したが、それは１０マイクロモルのリファ
ンピシンに７２時間曝露したＤＭＳＯで処理した細胞の２．８から３．８倍であ
った（図１０）。くわえて、様々な量の細胞を、好ましいまたは最適の量を決定
するためにそれぞれのウェルに添加するが、それは例えば、最低バックグラウン
ドで最大の応答を示した（図１１）。この数（５０マイクロリットル）が反映す
るのは、すぐに検出できるルシフェラーゼ信号、つまり低バックグラウンドレベ
ルを生成するのに必要な細胞の量であり、かつ７２時間の薬物曝露期間にわたっ
て培地のｐＨを変えないような量である。
【０１３１】 最後に、血清がバックグラウンドのルシフェラーゼ活性への影響を有するか否
かを、ｐｈＰＸＲ＋ｐＧＬ３プロモーターを含むコントロール形質転換体を用い
て試験した（図１２）。結果は、血清がルシフェラーゼ活性を変えなかったこと
も示している。
【０１３２】 ヒトの肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の誘導 ヒトの肝細胞を４８時間の間各種のＣＹＰ３Ａ４誘導物質で処理し、採集し、
そしてＲＮＡと細胞ホモジェネートを単離した。図１３が示すのは、各種の誘導
物質で処理した初代培養からのＲＮＡにおけるノーザンブロット解析の結果であ
り、該誘導物質に含まれるのはデキサメタゾン（１０マイクロモル）、フェノバ
ルビタール（１ミリモル）、リファンピシン（１０マイクロモル）、クロトリマ
ゾール（１０マイクロモル）、ＲＵ４８６（１０マイクロモル）である。結果が
示すのは、デキサメタゾンのない培地に曝露した細胞は、ＣＹＰ３Ａ４を発現し
なかったことである。０．１および１０マイクロモルのデキサメタゾンにおいて
、ＣＹＰ３Ａ４レベルは明らかである。実際、１０マイクロモルのデキサメタゾ
ンは、ＣＹＰ３Ａ４ｍＲＮＡを有意に八倍増させた。さらにリファンピシンは、
３Ａ４メッセージを、０．１％ＤＭＳＯにおける１０-7Ｍデキサメタゾンに曝露
した細胞で観察されるものに対して７．８倍増で生成した。ところが、フェノバ
ルビタール、クロトリマゾールおよびＲＵ４８６は、０．１％ＤＭＳＯおよび１
０-7Ｍデキサメタゾン処理細胞より、それぞれ３．８倍、４．９倍と１．７倍と
ＣＹＰ３Ａ４メッセージをわずかに増加させた。
【０１３３】 安定細胞系を含むハイスループットシステム ９６ウェルプレートハイスループットフォーマットを用いて、ＣＹＰ３Ａ４の
各種の誘導物質と非誘導物質を検査した。それぞれの化学物質は、四通りの異な
る濃度で細胞に適用した。ＰＸＲ＋３Ａ４エンハンサーを含む細胞と３Ａ４エン
ハンサーだけの細胞（外因性のｈＰＸＲなし、コロニー１３）の両方を検査した
。図１４と図１５が示すのは、安定して形質転換した細胞（コロニー１Ｆ）にお
けるルシフェラーゼ活性の変化であり、該細胞は各種周知のＣＹＰ３Ａ４誘導物
質および二つの非誘導物質、すなわちＴＣＤＤおよびＰＣＮを単一濃度で処理し
たｐ３Ａ４およびｐｈＰＸＲの両方を含んでいる。単一濃度で、オメプラゾール
が、他の誘導物質と比較した場合、最大応答を生成するように見えた一方で、Ｐ
ＣＮとＴＣＤＤは二倍未満の、最小ルシフェラーゼ活性を生成した。３Ａ４エン
ハンサーとルシフェラーゼを含むコロニー１３は、コロニー１Ｆと比較した場合
、すべての誘導物質についてルシフェラーゼ活性の大きな増加倍率を示した。オ
メプラゾール、クロトリマゾールおよびＲＵ４８６は、最大誘導を生成する一方
で、ＰＣＮとＴＣＤＤは一倍増未満で生成した。各誘導物質の三つの異なる濃度
をコロニー１３で試験したとき、１００マイクロモルのオメプラゾールは最大誘
導を生成した。リファンピシン（２５マイクロモル）に１０マイクロモルのクロ
トリマゾールを加えたものも、４０倍と４５倍増の間で生成した（図１６）。こ
れらの結果が示すことは、ＣＹＰ３Ａ４エンハンサーを含む細胞系は誘導物質の
スクリーニングに効果的であること、および安定した形質転換体の構築の際にｈ
ＰＸＲを添加しても、ＣＹＰ３Ａ４の誘導を増加しないことである。
【０１３４】 実施例ＩＩ この例において検査したのは、ヒトＣＹＰ誘導の評価のためのハイスループッ
トスクリーニングシステムを用いるＣＹＰ１Ａ１発現に対する、食物フラボノイ
ドのようないくつかの作用物質の影響である。ヒトＣＹＰ１Ａ１の調節領域と安
定して組み込まれたＨｅｐＧ２細胞を処理したのは、レスベラトロール、アピゲ
ニン、クルクミン、ケンフェロール、緑茶抽出物（ＧＴＥ）、（−）エピガロカ
テキンガレート（ＥＧＣＧ）、ケルセチンおよびナリンゲニンによる。これらの
フラボノイドの中で、レスベラトロールがＣＹＰ１Ａ１に媒介されるルシフェラ
ーゼ活性に最大の増加（１０倍）を生成する一方で、ＧＴＥ、アピゲニン、クル
クミン、ケンフェロールは二倍から三倍増の活性を生成した。ルシフェラーゼ活
性が１２から３５倍の範囲で増加したＴＣＤＤ、オメプラゾールまたはベンズア
ントラセンと比較して、これらフラボノイドは弱いアゴニスト活性を示した。残
りの化合物、ＥＧＣＧ、ケルセチンおよびナリンゲニンが示したのはごくわずか
な影響である。ＴＣＤＤとＧＴＥ、ナリンゲニンおよびアピゲニンでの細胞の共
処理はＴＣＤＤに媒介されるＣＹＰ１Ａ１誘導において、それぞれ、５８、７７
、７４％の低下の結果を示し、この結果は、これらのフラボノイドがＡｈ受容体
に対する潜在的なアンタゴニスト活性を示すことを指す。さらに結果が示すこと
は、ＧＴＥおよびアピゲニンがＡｈ受容体アンタゴニストおよび弱いアゴニスト
活性を有することである。さらに明らかにしたことは、２４時間未満でのＰ４５
０誘導のハイスループットスクリーニングのための９６ウェルプレートアッセイ
は、ヒトＣＹＰ１Ａ発現に対するフラボノイドの影響の測定に有効であったこと
である。ＳＮ比は低く、ウェル間のおよび複製の変動性は１０パーセント以下な
ので、このシステムで誘導は容易に検出された。これらの特徴が示すことは、Ｃ
ＹＰ誘導物質の同定に対するこの大量スクリーニングシステムの信頼性と実現可
能性である。さらに安定細胞系で得られた結果は、ＨｅｐＧ２細胞とヒト肝細胞
の初代培養で裏付けられ、Ｐ４５０遺伝子のエンハンサー因子を含んでいる安定
して組み込まれた細胞系はハイスループットスクリーニングシステムにおいて使
用できること示している。
【０１３５】 Ａ．機器と方法
【０１３６】 細胞培養と処理 ヒトの肝臓癌細胞系ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ，Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ）から誘導した細胞系１０１Ｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉａ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結し
たヒトＣＹＰ１Ａ１プロモーター、そして５’フランキング配列で安定してトラ
ンスフェクションされた（Ｐｏｓｔｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．
Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１８：２５５−２６２（１９９３）参照）。
つまり、１０１Ｌ細胞系が確立するのは、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝
子に連結したヒトＣＹＰ１Ａ１プロモーター（−３２７５から＋８９）を含むプ
ラスミドを、ヒト肝臓癌細胞系ＨｅｐＧ２に安定してトランスフェクションする
ことによる。ＣＹＰ１Ａ１プロモーター領域は三つのＤＲＥｓを含み、細胞系は
組み込まれたプラスミドの二つの複製を含んでいると推定される。
【０１３７】 １０１Ｌ細胞系を、培地で単層として生長させるが、該培地はダルベッコ変法
イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、１
００マイクログラム／ｍｌのストレプトマイシン、０．１ミリモル必須アミノ酸
（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、０．４ミリグラム／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ／Ｂ
ＲＬ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ ＵＴ）を
含み、そして３７℃で５％ＣＯ2と９５％空気の環境で維持した。細胞は当初、
Ｇ４１８のない培地を含むフラスコに播種した。一晩培養した後、培養物を抗生
物質選択のためにＧ４１８含有培地に替えた。三から五日後、細胞はトリプシン
処理によってフラスコから除去され、ウェルあたり３．５×１０5ノ細胞密度で２
４ウェルプレートで、またはウェルあたり７．５×１０4の細胞密度で９６−ウ
ェルプレートで再び培養したが、これは０．１％ＦＢＳを含むがＧ４１８または
指示薬（フェノールレッド）を含んでいないものに替えたＤＭＥＭ培地において
である。翌日、０．１％ＦＢＳとＧ４１８を含む培地を培養物に添加した。２４
時間後、安定して組み込まえたレポーター構造を含む細胞を処理したのは、０．
１％ＤＭＳＯ（コントロール）、２，３，７，８−四塩化ジベンゾ−ｐ−ジオキ
シン（ＴＣＤＤ，Ｃｈｅｍｓｙｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＹ）、３−メチルコラントレン（３−ＭＣ，Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、ベンズアントラセン（Ｂ
Ａ，Ｓｉｇｍａ）、オメプラゾール（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ，Ｓｗｅｄｅｎ
）、リファンピシン（Ｒｉｆ，Ｓｉｇｍａ）、ケルセチン（Ｓｉｇｍａ）、緑茶
抽出物（ＧＴＥ，Ｓｉｇｍａ）、レスベラトロール（Ｓｉｇｍａ）、アピゲニン
（Ｓｉｇｍａ）、クルクミン（Ｓｉｇｍａ）、ケンフェロール（Ｓｉｇｍａ）、
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ，Ｓｉｇｍａ）またはナリンゲニ
ン（Ｓｉｇｍａ）により、０．１％ＦＢＳとＧ４１８を含むが指示薬なしの新鮮
培地においてである。アンタゴニスト試験として、細胞をフラボノイドと二ナノ
モルのＴＣＤＤで共処理した。すべての誘導物質は、ＤＭＳＯに溶解し、この試
薬を０．１％でコントロール細胞に添加した。細胞は様々な用量と時間（６から
１８時間）で処理した。処理後、化合物を含有する培地は吸引で除去して、ルシ
フェラーゼ活性の直接分析のためにウェルあたり１００マイクロリットルのＤＭ
ＥＭに置換えた。実験を、最初の誘導で凍結保存した１０１Ｌ細胞で実施し、継
代数を３０に限定した。後の方の継代細胞は、最初の継代細胞と類似の応答を示
した。
【０１３８】 ルシフェラーゼアッセイ ルシフェラーゼアッセイを、製造者が明記したように実施した（ＬｕｃＬｉｔ
ｅ ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，
ＣＴ）。活性をＰａｃｋａｒｄ社のＬｕｍｉＣｏｕｎｔルミノメーターを用いて
測定し、結果は相対発光量、またはコントロール（ＤＭＳＯ処理細胞に対する増
加倍率で表した。
【０１３９】 ＨｅｐＧ２培養と処理 ＨｅｐＧ２細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ）から入手した。細胞はＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で生長させた。細胞
は培養して、飽和細胞密度まで生長させてから２４時間後、バイオフラボノイド
、ＴＣＤＤ、またはベータ−ナフトフラボン（Ｓｉｇｍａ）のいずれか一つで処
理した。すべての誘導物質は、ＤＭＳＯに溶解し、この溶液を０．１％でコント
ロール細胞に添加した。
【０１４０】 ヒト肝細胞の初代培養と処理 ヒト肝細胞を含む６ウェルプレートを調達したのは、リバー・ティシュー・プ
ロキュアメント・アンド・ディストリビューション・システム（ＬＴＰＡＤＳ，
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，
ＭＮ）からである。到着時、培地を、ヒト肝細胞維持培地（ＨＨＭＭ，Ｃｌｏｎ
ｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（Ｒｕｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７３：３３３−３４１（
２０００））を含むものに替え、そして３７℃で９５％空気と５％ＣＯ2の環境
に維持した。翌日、細胞を２４時間、０．１％ＤＭＳＯ（コントロール）、５０
マイクロモルのベンズアントラセン、２ナノモルのＴＣＤＤ、２０マイクロモル
のケンフェロール、２０マイクロモルのレスベラトロール、または２０マイクロ
モルのナリンゲニン、１０マイクロモルのアピゲニン、０．１ミリグラム／ｍｌ
のＧＴＥで処理したか、あるいはＴＣＤＤとフラボノイドで共処理した。すべて
の誘導物質は、ＤＭＳＯに溶解し、この試薬の０．１％最終濃度で培地に添加し
た。処理後、培地を除去し、ＲＮＡ単離のために細胞を採取した。
【０１４１】 ＲＮＡ単離とノーザンブロット解析 肝細胞またはＨｅｐＧ２からの全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を
用いて単離し、そして２６０ｎｍで吸光度を測定して定量化した；純度は２６０
／２８０ｎｍ比を測定して評価した。ノーザンブロット解析を実施したのは、１
％アガロース−２．２Ｍホルムアルデヒドゲルでの全ＲＮＡ（１０マイクログラ
ム）の電気泳動と、それに続くナイロン膜（ＭＳＩ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏ，ＭＡ）
へのブロッティングによる（Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔ
ｏｘｉｃｏｌ．１８：９５−１０５（１９９９））。ＲＮＡを、ＵＶ Ｃｒｏｓ
ｓｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて膜
に架橋し、膜はヒトＣＹＰ１Ａ１をコードする、ランダムプライマー法によるｃ
ＤＮＡプローブとハイブリダイズした。ヒトＣＹＰ１Ａ１用のｃＤＮＡプローブ
は、先に記載されている（Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｏ
ｘｉｃｏｌ．１８：９５−１０５（１９９９））。ヒト１８Ｓ ＲＮＡプローブ
用のｃＤＮＡプローブ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を使用して、各レ
ーンにロードしたＲＮＡ量を平均化した。ブロットのハイブリダイゼーションは
、先に記載されたように実施した（Ｑｕａｔｔｒｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＤＮ
Ａ ４：３９５−４００（１９８５））。ノーザンブロットは、分子分析／Ｍａ
ｃバージョン１．１．１．画像解析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を備えたモデルＧＳ−６７０イメージ
ングデンシトメーターを用いるデンシトメトリーによって、あるいはＳｃａｎＭ
ａｋｅｒＩＩ（Ｍｉｃｒｏｔｅｋ）によりオートラジオグラムをスキャンするこ
とによりオートラジオグラフを定量化し、そしてＵｎ−Ｓｃａｎ−Ｉｔソフトウ
ェア（Ｓｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｒｅｍ Ｕｔａｈ）でデジタル化し
た。使用した照射時間は、フィルム、Ｋｏｄａｋ ＸＡＲ−５の線形範囲内であ
った。
【０１４２】 データ分析 Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いてデータを統計分析した。統計的有意性はｐ＜
０．０５のレベルで定義した。データは平均＋／−標準偏差（ＳＤ）で表した。
【０１４３】 Ｂ．結果
【０１４４】 １０１Ｌ細胞を培養するのは、ウェルあたり３．５×１０5または７．５×１
０4細胞の密度で、それぞれ２４または９６ウェルプレートにおいてである。Ａ
ｈ受容体リガンドのベンズアントラセンに曝露した後、ルシフェラーゼ活性を測
定した。９６ウェルプレートアッセイから得られた結果を２４プレートからのも
のと比較したとき、ルシフェラーゼ活性のごくわずかな差を検出した（図１７）
。これらの発見により、ウェルあたりの細胞が少ないと不適切な信号が発生する
のではないかという懸念が軽減された。複製したウェル間の変動が大きいのでは
ないかという懸念もあった。しかしながら、９６ウェルフォーマットが示したの
は、最低バックグラウンドで最大１０％のウェル間の変動である（図１７）。９
６ウェルフォーマットを用いて次の実験を実施した。
【０１４５】 誘導物質曝露の最大時間の決定は、誘導物質に媒介されるルシフェラーゼ活性
の時間的経過を設定することによる。高められた活性が認められたのは、ベンズ
アントラセン（１００マイクロモル）、オメプラゾール（１００マイクロモル）
または３−ＭＣ（１０マイクロモル）の投与の６時間以内である（図１８）。ベ
ンズアントラセン（３５倍）および３−ＭＣ（１４倍）による最大誘導は、１２
時間で発生した一方で、オメプラゾールに媒介される誘導は１８時間で最大にな
り（１２倍）、その後ルシフェラーゼ活性は低下した。誘導応答の低下は、Ｈｅ
ｐＧ２ ＣＹＰ１Ａ１による誘導物質の代謝による可能性が高い。予期した通り
、リファンピシン（１００マイクロモル）による誘導は、ごくわずかなものであ
ったが、それはこの抗生物質がＣＹＰ１Ａ誘導物質（Ｋｏｓｔｒｕｂｓｋｙ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２７：８８７−８９４（１
９９９））であることが知られていないからである。これらの結果が示すことは
、この大量スクリーニング手段が、例えば２４時間未満の比較的短時間内に容易
に検出できる誘導を監視するのに効果的であることである。くわえて、各種の周
知のＣＹＰ１Ａ１誘導物質の濃度に依存した影響は、このシステムで測定された
。０．５から２．５ナノモルの範囲の用量応答曲線が、ＴＣＤＤに（図１９Ａ）
、そしてベンズアントラセンとオメプラゾールについては１から２００マイクロ
モルについて（図１９Ｂ）作成された。ベンズアントラセンとオメプラゾールに
ついて、最大誘導（それぞれ３５倍と１２倍）は、１００マイクロモルで発生し
た。ＴＣＤＤによる倍増誘導は２ナノモルの用量でピークに至らず、またこの用
量は２２倍増のルシフェラーゼ活性を示した。
【０１４６】 機構研究のためのハイスループット法の使用も研究した。化学発ガンのフラボ
ノイドによる抑制に絡みうるメカニズムを明らかにするために、試験したのは、
ＣＹＰ１Ａ１誘導に対するいくつかの食物フラボノイドの影響である。これらの
研究の結果示し得ることは、フラボノイドがＡｈ受容体アゴニストおよび／また
はアンタゴニスト活性を示すかどうかである。初期研究が調べたことは、各種の
自然発生フラボノイドが１０１Ｌ細胞系においてＣＹＰ１Ａ１−プロモーターに
媒介されるレポーター遺伝子活性を誘導する能力である。ＧＴＥ、ＥＧＣＧ、ケ
ルセチン、クルクミン、ケンフェロール、ナリンゲニン、アピゲニンおよびレス
ベラトロールについての用量応答曲線を測定した。これらのフラボノイドの中で
、レスベラトロール（１０マイクロモル）は、ＣＹＰ１Ａ１の最大誘導（１０倍
）を生成した。二番目に影響力が大きいフラボノイド誘導物質は、アピゲニン、
ケルセチンおよびクルクミン（三倍）であった。ルシフェラーゼ活性の三倍上昇
は、５マイクロモルのアピゲニン処理で観察される一方で、より高い用量のケル
セチンおよびクルクミン（２０マイクロモル）では、同様なレベルの誘導が供給
された。５マイクロモルを超える用量のアピゲニンは、ＣＹＰ１Ａ１誘導におけ
る低下を生み、それは細胞毒性の結果による可能性が高い。ＧＴＥ（０．１ミリ
グラム／ｍｌ）（図２０、挿入）およびケンフェロールも、１から２０マイクロ
モルの範囲の濃度で、ルシフェラーゼ活性のＣＹＰ１Ａ１−プロモーターに媒介
された誘導に対してわずかな誘導（２から２．５倍誘導）を生成した（図２０）
。
【０１４７】 内因性ＣＹＰ１Ａ１遺伝子の類似の誘導応答を検証するために、ＨｅｐＧ２細
胞も同じフラボノイドで処理した。増強したＣＹＰ１Ａ１ ｍＲＮＡ発現は、Ｇ
ＴＥ（ＴＣＤＤ誘導の１０％）で処理した細胞においても観察された（表２）。
ＣＹＰＡ１ ｍＲＮＡ発現の増加はこれらのフラボノイドでも発生したが、誘導
はベータ−ナフトフラボンのそれよりはるかに低かった（ＴＣＤＤ応答の５０％
）。集合的に、ＧＴＥ、レスベラトロールおよびアピゲニンは、Ａｈ受容体に対
する弱いアゴニストであるようである。
【０１４８】
【表２】
【０１４９】 Ａｈ受容体アンタゴニスト活性を示すフラボノイドの能力も、ハイスループッ
トスクリーニングシステムを用いて調べた。９６ウェルプレートアッセイにおけ
るＴＣＤＤおよびフラボノイドによる１０１Ｌ細胞の共処理の結果、フラボノイ
ドのいくつかによってレポーター遺伝子活性のＴＣＤＤに媒介される誘導が低下
し、これらの食物作用物質のいくつかがアンタゴニスト活性を示したことを示す
（図２１）。１０１Ｌ細胞をＧＴＥとＴＣＤＤで共処理したとき、ＴＣＤＤ単独
で処理した細胞と比較してルシフェラーゼ活性の５８％の低下が観察された。さ
らに、フラボノイドのナリンゲニンおよびアピゲニンは、ＴＣＤＤに媒介される
誘導において、それぞれ７７％と７４％の低下を生んだ。これらの研究結果が示
すことは、これらの食物フラボノイドがＣＹＰ１Ａ１プロモーター活性のＴＣＤ
Ｄに媒介される誘導に拮抗する能力があり、ナリンゲニンがより大きな影響力を
有することである（図２１）。アピゲニンまたはＧＴＥ単独で、ＣＹＰ１Ａ１に
媒介されるレポーター遺伝子活性での２．５から３倍の誘導を示した（図２０）
結果に基づくと、これらのフラボノイドは、Ａｈ受容体に対してアゴニストおよ
びアンタゴニスト活性を示すことは明らかである。他のフラボノイドは、ルシフ
ェラーゼ活性のＴＣＤＤに媒介される誘導にはっきりとした変化を起こさなかっ
たか、あるいはその効果を刺激したかである。実際、ＴＣＤＤとクルクミンによ
る共処理は、ＴＣＤＤ単独の効果よりも１．５倍の刺激を生成し、このメカニズ
ムが、ＡｈＲに関与するものに加えて、クルクミンによるＰ４５０の誘導におい
てある役割を果たすかもしれないことを示している。ＨｅｐＧ２細胞をＴＣＤＤ
と個別のフラボノイドで共処理したとき、レポーター遺伝子アッセイで得られた
とものと類似の結果が認められた。レスベラトロールが生んだのは、ＣＹＰ１Ａ
１ ｍＲＮＡのＴＣＤＤ誘導応答におけるわずかな低下である（１４％低下）一
方で、アピゲニンとナリンゲニンが生んだのは、ＴＣＤＤによって媒介されるＣ
ＹＰ１Ａ１ ｍＲＮＡ蓄積に有意な低下である（５７％から７０％の減少）（表
２）。これらの結果は、１０１Ｌ細胞系で得られたものを裏付け、アピゲニンお
よびナリンゲニンはＡｈＲアンタゴニスト活性を有することを示唆している。
【０１５０】 ヒト肝細胞の初代培養でも同様の効果が発生するかを実証するために、細胞か
ら単離したｍＲＮＡに対してノーザン解析を実施したが、該細胞はＴＣＤＤ、フ
ラボノイド、またはＴＣＤＤと別個のフラボノイドの組み合わせによって処理さ
れている。結果は、ハイスループットまたは大量スクリーニングシステムによっ
て得られたものと類似の所見を示した。レスベラトロールは、二つの個別の肝臓
サンプル（被験者Ａと被験者Ｃ）からの肝細胞において、ＴＣＤＤ誘導の５％か
ら１２％のレベルにＣＹＰ１Ａ１ ｍＲＮＡを増強した一方で、ＧＴＥは、一つ
の培養物（被験者Ａ）においてＴＣＤＤ誘導の３４％のレベルにＣＹＰ１Ａ１
ｍＲＮＡを増強した（表３）。比較すると、１００マイクロモルのベンズアント
ラセンは、すべての被験者においてＴＣＤＤで認められたものの５０％までＣＹ
Ｐ１Ａ１ ｍＲＮＡの誘導を引き起こした。一人の被験者からの肝細胞において
、ベンズアントラセンだけでなくレスベラトロール、アピゲニンおよびケンフェ
ロールは、ＣＹＰ１Ａ１ ｍＲＮＡの蓄積を生じさせた（被験者Ｃ、表３）。レ
スベラトロールは、ベンズアントラセンで認められたものの１２％に、アピゲニ
ンは３％に、ケンフェロールは１０％に発現を増加させた。他の二人の被験者（
被験者Ｂと被験者Ｄ、表３）からの肝細胞は、どのフラボノイドでもＣＹＰ１Ａ
１誘導を示さなかったが、ＴＣＤＤとベンズアントラセンによって生じたＣＹＰ
１Ａ１ ｍＲＮＡ蓄積を示した（ＴＣＤＤレベルの５０％）。ヒト肝細胞はまた
、ＴＣＤＤおよび個別のフラボノイドでも共処理した。レスベラトロールが生じ
させたのは、ＴＣＤＤによって生成されたＣＹＰ１Ａ１ ｍＲＮＡの増強された
レベルにおける４９％の低下である。アピゲニンとナリンゲニンが生じさせたの
は、ＣＹＰ１Ａ１ ｍＲＮＡのＴＣＤＤ−媒介増加において、それぞれ７８％と
８０％の低下である（表３）。これらの結果は、ＴＣＤＤとアピゲニンまたはナ
リンゲニンによる１０１Ｌ細胞系の共処理から得られたものと類似していた（図
２１）。
【０１５１】
【表３】
【０１５２】 Ｃ．議論 この実施例が利用するのは、レポーター遺伝子アッセイおよび安定細胞系、す
なわち１０１Ｌ細胞（Ｐｏｓｔｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐ
ｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１８：２５５−２６２（１９９３））であり、潜在
的なＣＹＰ１Ａ誘導物質をスクリーニングする。Ｐ４５０エンハンサーおよびレ
ポーター遺伝子を含む安定細胞系が、スクリーニングの適用に有利であるのは、
連続したトランスフェクションの必要が軽減され、一過性トランスフェクション
に伴う変動が除去されるからである。安定して組み込まれた細胞も、感受性を顕
著に増加させ、容易に評価される誘導を可能にする。一貫した結果が得られ、安
定した細胞は時間浪費および強度の労力となる他のシステムに替わるものになり
うる。したがって、Ｐ４５０エンハンサーを持つ安定細胞系を用いることによっ
て、潜在的な誘導物質のスクリーニングを容易にすることができる。実際、１０
１Ｌレポーター遺伝子システムは現在のところ一つの用途であり、ＣＹＰ１Ａ１
に誘導される化合物の存在について環境サンプルをスクリーニングするために業
界によって６ウェルプレートフォーマットで現在用いられている（Ｊｏｎｅｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８：１
１９−１２６（２０００））。
【０１５３】 安定細胞系でハイスループットシステムを開発するために、あらかじめ特徴付
けた１０１Ｌ細胞は、標準フットプリントを有する２４ウェルまたは９６ウェル
プレートのいずれかにおいて最初に培養し、そしてベンズアントラセンで処理し
た（図１７）。これらの実験から生成された結果が示すことは、９６ウェルプレ
ートフォーマットが２４ウェルプレートフォーマットと同じくらい有効であるこ
とである。くわえて、ハイスループット（９６ウェル）フォーマットでは、バッ
クグラウンドは最低、およびウェル間の変動は１０％未満であった。各種ＣＹＰ
１Ａ誘導物質が存在するとき、最大誘導（１２から３５倍）は、曝露時間２４時
間内で発生し、６ウェルプレートで得られたものに類似していた（Ｐｏｓｔｌｉ
ｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１８
：２５５−２６２（１９９３）；Ｑｕａｔｔｒｏｃｈｉ ａｎｄ Ｔｕｋｅｙ，
Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４３：５０４−５０８（１９９３））。Ｚｉｃｃ
ａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．５４：１８３−１９３（２
０００））は、Ａｈ受容体リガンドについて血清サンプルをスクリーニングする
９６ウェルフォーマットを報告している。
【０１５４】 本発明のハイスループットフォーマットを試験するために、追加のＣＹＰ１Ａ
誘導物質を検査した。ベンズアントラセンについての用量曲線を作成した。６ウ
ェルプレートにおいて先に報告された１０１Ｌ細胞の最大誘導は、５０マイクロ
モルのベンズアントラセンの用量で発生した（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎ
ｖｉｒｏｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８：１１９−１２６（２０
００））。本書で述べた研究において、９６ウェルプレートフォーマットで同じ
用量が生成したのは、ＣＹＰ１Ａ１に媒介されたルシフェラーゼの最大の活性（
３３倍）であった（図１９Ｂ）。３−メチルコラントレン、ＴＣＤＤおよびオメ
プラゾールを含む他の周知のＣＹＰ１Ａ誘導物質も、９６ウェルフォーマットで
ルシフェラーゼの誘導を発生させる一方で、リファンピシン、つまりＣＹＰ３Ａ
４誘導物質は効果がなく（図１７）、ＣＹＰ１Ａ誘導物質にだけ応答するこのシ
ステムの特異性が確認された。ＴＣＤＤおよび／またはベンズアントラセンも、
ＨｅｐＧ２細胞（表２）、および試験したすべてのヒト肝細胞サンプルにおいて
ＣＹＰ１Ａ１ ｍＲＮＡを誘導した。ここでは試験しなかったが、オメプラゾー
ルが以前の調査において示したことは、ヒト肝細胞においてＣＹＰ１Ａ’ｓを誘
導することである（Ｄｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇ
ｙ ９９：７３７−７４７（１９９０）およびＳｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ
．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：９５−１０５（１９９９））。集合的に
、一つの誘導物質がハイスループットシステム（ＨＴＳ）においてルシフェラー
ゼ活性を１２倍増を超えて生成したとき、おそらく同じ作用物質によるＣＹＰ１
Ａ１の誘導がヒト肝細胞において起こるだろう。
【０１５５】 このＨＴＳが作用物質を誘導する新規ＣＹＰ１Ａ１の同定に使えるか否かを判
断するために、ＣＹＰ１Ａ１を誘導する各種の食物フラボノイドの能力を調べた
。調べたフラボノイドの中で、レスベラトロールだけがＣＹＰ１Ａ１に媒介され
たルシフェラーゼ活性でかなりの増加（１０倍）を生んだ。しかしながら、２０
マイクロモル未満の濃度のレスベラトロールで処理した細胞は、ルシフェラーゼ
活性に対してごくわずかな効果しかなく、この作用物質が乳ガン細胞系またはＨ
ｅｐＧ２細胞においてＣＹＰ１Ａ１ ｍＲＮＡを誘導しないという以前の報告（
Ｃｉｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：５７０７−５７
１２（１９９８）およびＣａｓｐｅｒ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：７
８４−７９０（１９９９））と一致した。レポーター遺伝子アッセイで観察され
た誘導を、初代肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞におけるＣＹＰ１Ａ１ ｍＲＮＡ蓄
積と比較したときは、また一方、レスベラトロールはＨｅｐＧ２細胞からのＣＹ
Ｐ１Ａ１ ｍＲＮＡ、および二つの個体からの肝細胞において増加を生んだ（表
２、表３、とくに被験者Ａと被験者Ｃ）。これらの結果が示すことは、ＨＴＳに
おいて認められたルシフェラーゼ活性の１０倍増を生成する作用物質は、肝細胞
内でもＣＹＰ１Ａ１誘導を生成させることである。ＨＴＳシステム、すなわちＧ
ＴＥとアピゲニンにおいて２．５倍以上の誘導を生成させるフラボノイドは、本
書で試験した三つの個体の一つから単離した初代肝細胞におけるＣＹＰ１Ａ１
ｍＲＮＡの蓄積にもわずかな増加を生んだ。同様に、ルシフェラーゼ活性の二倍
増を生成するケンフェロールは、単一の個体からの肝細胞においてＣＹＰ１Ａ１
ｍＲＮＡの蓄積を引き起こした。対照的に、ケルセチンおよびクルクミンは、
単離した肝細胞においてＣＹＰ１Ａ１ ｍＲＮＡの誘導を誘発しなかった（デー
タは示されていない）が、ルシフェラーゼ活性で軽微な増加（２．５から３倍）
を生んだ。このように、各種の作用物質の間でのＨＴＳとヒト肝細胞の間の結果
におけるこのような不均等が示唆することは、レポーターアッセイが特定の作用
物質による比較的低レベルの誘導を示すとき（例えば、２から３倍）、初代肝細
胞ＣＹＰ１Ａ１の増加は、起きることも起きないこともあることである。
【０１５６】 ＨＴＳでここで得られた結果に基づき、ルシフェラーゼ活性の２倍未満の誘導
が示すことは、ＣＹＰ１Ａ１の増加した発現が初代肝細胞内では起こりそうにな
いことである。ＨＴＳのものを裏付ける肝細胞での所見の重要性は、ヒト肝細胞
データをインビボの状態に外挿する能力にある（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３８：４６１−４９９（１
９９８）およびＫｅｄｄｅｒｉｓ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１
０７：１０９−１２１（１９９７））。例えば、オメプラゾールはＣＹＰ１Ａ’
ｓを、単離したヒト肝細胞（Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔ
ｏｘｉｃｏｌ．１８：９５−１０５（１９９９）およびＤｉａｚ ｅｔ ａｌ．
，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９９：７３７−７４７（１９９０））と
インビボ（Ｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ
．５２：１７０−１８０（１９９２））の双方において誘導した。一般的に、生
体異物の薬物動態学は、単離した肝細胞による研究から適切に予測されていた（
Ｋｅｄｄｅｒｉｓ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１０７：１０９−
１２１（１９９７））。この例において、安定してトランスフェクションされた
細胞とヒト肝細胞（初代肝細胞およびＨｅｐＧ２細胞）において生成した結果の
間に完全な一致が発生し、ＣＹＰエンハンサーで安定してトランスフェクション
された細胞系は、インビボでの結果を予測できるかもしれないことを示唆してい
る。
【０１５７】 ＣＹＰ１Ａ１誘導を評価するＨＴＳフォーマットは、Ａｈ受容体によってＣＹ
Ｐ１Ａ１の発現を高めることができる作用物質の同定に有益である。さらにこの
システムは、ＣＹＰ誘導に関与したメカニズムを決定するのにも使用できる。こ
の例が示すことは、特定のフラボノイドがＡｈ受容体に対して弱いアゴニストお
よび／またはアンタゴニスト活性を示すものとして同定されたことである。ＣＹ
Ｐ誘導物質同定のためのこのＨＴＳの信頼性に関しては、ＳＮ比は低く、ウェル
間および複製の変異性は１０％以下で、このシステムにおいてすぐに検出される
誘導を可能にする。またこのＨＴＳで生成された結果が反映するのは、単離した
ヒト肝細胞またはＨｅｐＧ２細胞において得られた誘導物質応答である。
【０１５８】 引用文献を含む、本出願で参照した特許文書と科学論文を含むすべての刊行物
は、それぞれの個別の刊行物が参照として個別に含まれたのと同様に、すべての
目的のためにその全体が参照として含まれている。
【０１５９】 すべての見出しは、読者の便宜のためであり、特定することなく見出しに続く
文章の意味を限定すべきではない。
【０１６０】
【図面の簡単な説明】
【図１】第一の核酸分子と第二の核酸分子が、プラスミドのような染色体外
因子として提供されていることを示した図である。
【図２】第一の核酸分子が染色体外因子であるのに対し、第二の核酸分子が
細胞の染色体に内在していることを示した図である。
【図３】第一の核酸分子が染色体外因子であり、第二の核酸分子が細胞のゲ
ノムに組み込まれた外因性核酸分子であることを示した図である。
【図４】第一の核酸分子が細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸分子であ
り、第二の核酸分子が細胞の染色体に内在していることを示した図である。
【図５】第一の核酸分子が細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸分子であ
り、第二の核酸分子が細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸分子であることを
示した図である。
【図６】安定して組み込まれたＣＹＰ３Ａ４ ＰＸＲＥ／ルシフェラーゼレ
ポーター構造物を含む、ＨｅｐＧ２細胞系の構造を示した図である。
【図７】図６に示したＨｅｐＧ２細胞系の応答を示した図である。
【図８】ＲＮＡのノーザンブロット解析を示した図である。
【図９】ｐＧＬ３−プロモーター／３Ａ４エンハンサーで安定して形質転換
した細胞への、リファンピシンおよびＤＭＳＯ処理の影響を示したグラフである
。
【図１０】ｐＧＬ３／３Ａ４エンハンサーに加えてｐｈＰＸＲを含む細胞に
対する、リファンピシン処理の影響を示したグラフである。
【図１１】ｐｈＰＸＲにｐＧＬ３／３Ａ４エンハンサーを加えたものまたは
ｐＧＬ３／３Ａ４エンハンサーのみを含む細胞の様々な量を、９６ウェルプレー
トに添加し、そして１０マイクロモルのリファンピシンまたはＤＭＳＯで４８時
間処置した結果を示した図である。
【図１２】ｐＧＬ３ベクターおよびｈＰＸＲを伴うｐＩＲＥＳベクターで安
定して形質転換されたＨｅｐＧ２細胞における、ルシフェラーゼ活性に対する血
清、ＤＭＳＯおよびリファンピシンの影響を示したグラフである。
【図１３】ヒトの肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４発現に対する各種のＣＹＰ３
Ａ４誘導物質の影響を示した図である。
【図１４】ｐＩＲＥＳベクターにおけるｈＰＸＲおよびルシフェラーゼベク
ター（コロニー１Ｆ）における３Ａ４エンハンサーによって安定して形質転換さ
れたＨｅｐＧ２細胞に対する、各種のＣＹＰ３Ａ４誘導物質および非誘導物質の
影響を示したグラフである。
【図１５】ルシフェラーゼベクター（コロニー１３）における３Ａ４エンハ
ンサーによって安定して形質転換されたＨｅｐＧ２細胞に対する、各種のＣＹＰ
３Ａ４誘導物質および非誘導物質の影響を示したグラフである。
【図１６】ルシフェラーゼベクター（コロニー１３）におけるＣＹＰ３Ａ４
エンハンサーによって安定して形質転換されたＨｅｐＧ２細胞に対する、各種の
ＣＹＰ誘導物質の様々な用量の影響を示したグラフである。
【図１７】２４および９６ウェルプレートにおいて安定した細胞系を培養す
ることの影響を示したグラフである。
【図１８】各種のＣＹＰ１Ａ１誘導物質の応答時間曲線を示したグラフであ
る。
【図１９】各種の既知のＣＹＰ１Ａ１誘導物質の応答用量曲線を示したグラ
フである。
【図２０】各種のフラボノイドについての用量応答曲線を示したグラフであ
る。
【図２１】ＴＣＤＤとそれぞれのフラボノイドとの、共処理の影響を示した
グラフである。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 4B024 AA11 BA07 CA02 CA11 DA02 EA04 GA11 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ08 QQ22 QQ53 QR77 QS05 QS34 QS36 QS38 QX02 4B065 AA93X AA93Y AB01 BA02 CA27 CA46

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細胞において、 薬物代謝に関与したタンパク質をコードする核酸分子に機能可能なプロモーター
    またはエンハンサーとレポーター遺伝子とを含む第一の核酸分子、ただし前記プ
    ロモーターまたはエンハンサーが前記レポーター遺伝子に機能可能に連結されて
    いるもの；および 細胞内受容体または転写因子をコードする第二の核酸、ただし前記細胞内受容体
    または転写因子がある化合物と結合、組み合わせ、あるいはそれによって活性化
    されたとき、前記細胞内受容体または転写因子が、前記レポーター遺伝子の発現
    に至る前記プロモーターまたはエンハンサーと機能可能に結合、組み合わせ、あ
    るいは活性化されるもの、 とを有する細胞について、 前記細胞が薬物代謝に関与した前記タンパク質の発現を誘導するある化合物と接
    触したときに、前記レポーター遺伝子が発現されることを特徴とする細胞。
  2. 【請求項２】薬物代謝に関与した前記酵素が、Ｐ４５０ｓ、グルクロノシル
    トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ｐ−糖タンパク質、グ
    ルタチオントランスフェエラーゼおよびスルホトランスフェラーゼからなる群か
    ら選択されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
  3. 【請求項３】前記レポーター遺伝子が、酵素または検出可能なタンパク質を
    コードすることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
  4. 【請求項４】前記第一の核酸分子が、染色体外因子に存在することを特徴と
    する、請求項１に記載の細胞。
  5. 【請求項５】前記第一の核酸分子が、前記細胞の染色体内にあることを特徴
    とする、請求項１に記載の細胞。
  6. 【請求項６】前記レポーター遺伝子が、前記細胞の染色体に挿入されること
    を特徴とする、請求項１に記載の細胞。
  7. 【請求項７】前記エンハンサーまたはプロモーターが、前記細胞の染色体に
    内在することを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
  8. 【請求項８】前記レポーター遺伝子が、前記細胞の染色体に内在することを
    特徴とする、請求項１に記載の細胞。
  9. 【請求項９】前記細胞内受容体または転写因子が、薬物、化学物質またはそ
    の代謝物と複合体を形成し、および薬物代謝に関与したタンパク質をコードする
    ある遺伝子の転写活性を、直接または間接に引き起こすことを特徴とする、請求
    項１に記載の細胞。
  10. 【請求項１０】前記細胞内受容体または転写因子が、オーファン受容体また
    はホルモン受容体であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
  11. 【請求項１１】前記第二の核酸分子が、染色体外因子に存在することを特徴
    とする、請求項１に記載の細胞。
  12. 【請求項１２】前記第二の核酸分子が、前記細胞の染色体内にあることを特
    徴とする、請求項１に記載の細胞。
  13. 【請求項１３】前記第二の核酸分子が、前記細胞の染色体に内在することを
    特徴とする、請求項１に記載の細胞。
  14. 【請求項１４】前記細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする、請求項１
    に記載の細胞。
  15. 【請求項１５】前記細胞が、形質転換細胞であることを特徴とする、請求項
    １に記載の細胞。
  16. 【請求項１６】前記細胞が、ヒト細胞であることを特徴とする、請求項１に
    記載の細胞。
  17. 【請求項１７】前記細胞が、細胞系であることを特徴とする、請求項１に記
    載の細胞。
  18. 【請求項１８】前記細胞が、肝臓、肺または腎臓からなる群から選択された
    組織由来であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
  19. 【請求項１９】薬物代謝に関与したタンパク質をコードする遺伝子の発現を
    誘導する特性について化合物を評価する方法において、以下； 試験化合物を提供し、 前記試験化合物を、請求項１に記載の細胞と接触させ、および 前記レポーター遺伝子の発現を検出すること を含み、 そこにおいて、前記レポーター遺伝子の発現が、前記化合物が、薬物代謝に関与
    したタンパク質をコードする遺伝子の発現を変化させたことを示すことを特徴と
    する方法。
  20. 【請求項２０】前記方法が、ハイスループット法であることを特徴とする、
    請求項１９に記載の方法。
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