JP2002535241A - オーファン核内受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、チトクロームP-450モノオキシゲナーゼ（CYP）プロモータに結合し、またCYP遺伝子発現を誘導する化合物によって活性化される新規なヒト・オーファン核内受容体に関する。本発明は更に、このような受容体をコードする核酸配列、該受容体を製造する方法、並びに前記受容体およびこれをコードする核酸配列を使用する方法に関する。また、本発明は、ヒト受容体を発現するように形質転換された非ヒト動物、並びに薬物相互作用および毒性について化合物をスクリーニングするためにこのような動物を使用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は米国仮特許出願第60/079,593号(1998年3月27日出願)の優先権を主張
する。その米国仮特許出願の全内容は参考として本明細書中に組み込まれる。

【０００２】

【技術分野】

本発明は、チトクロームＰ−４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ）プロモータ
に結合し、そしてＣＹＰ遺伝子発現を誘導する化合物で活性化される新規なヒト
のオーファン核内受容体に関する。本発明はさらに、そのような受容体をコード
する核酸配列、そのような受容体を作製する方法、ならびにそのような受容体お
よびこの受容体をコードする核酸配列を使用する方法に関する。本発明また、そ
のようなヒト受容体を発現するように形質転換された非ヒト動物、ならびに薬物
の相互作用および毒性について化合物をスクリーニングするためにそのような動
物を使用する方法に関する。

【０００３】

【発明の背景】

ヘムタンパク質のチトクロームＰ−４５０（ＣＹＰ）ファミリーのメンバーは
、種々の発ガン性物質および毒素を含む広範囲の内因性物質および生体異物の酸
化的代謝において重要である（Nebert et al., Ann. Rev. Biochem. 56:945〜99
3(1987)）。ヒトにおいて、ＣＹＰ３Ａ４モノオキシゲナーゼは、肝臓および腸
におけるその大きな存在量ならびにその広い基質特異性のために薬物の生体変換
において主要な役割を果たしている。ＣＹＰ３Ａ４は、ステロイド類、免疫抑制
剤、イミダゾール系抗真菌剤およびマクロライド抗生物質を含む６０％を越える
使用中の薬物の代謝を触媒している（Maurel, P.「チトクロームＰ４５０：代謝
的側面および毒物学的側面」（Ioannides, C. 編）、２４１〜２７０（CRC Pres
s, Inc., Boca Raton, FL, 1996）。

【０００４】 ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現は、様々な化合物による処置に応答してインビボお
よび初代肝細胞の両方において顕著に誘導される。ＣＹＰ３Ａ４発現の最も有効
な誘導剤の多くは、グルココルチコイドのデキサメタゾン、抗生物質のリファン
ピシン、抗真菌剤のクロトリマゾール、および低コレステロール血症剤のロバス
タチンなどの広く使用されている薬物である（Maurel, P.「チトクロームＰ４５
０：代謝的側面および毒物学的側面」（Ioannides,C.編）, 241〜270 (CRC Pres
s, Inc., Boca Raton, FL, 1996)、Guzelian,P.S.「ミクロソームおよび薬物酸
化」(Miners, J.O., Birkett, D.J., Drew, R.&McManus, M.編)、148〜155 (Tay
lor and Francis, London, 1988)）。ＣＹＰ３Ａ４タンパク質の広い基質特異性
と結びつけられたＣＹＰ３Ａ４発現レベルの誘導性は、混合薬物治療を受けてい
る患者における多くの薬物相互作用に関する基礎を表している。ＣＹＰ３Ａ４発
現レベルに対する化合物の作用を特徴づけるインビボアッセイおよびインビトロ
アッセイを開発する試みが行われているが、このような努力は、動物およびその
組織を試験目的に使用することの有用性を制限している種特異的な作用によって
妨げられている。従って、新規化合物のＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現に対する効果の
分析は、主として、ヒトの肝臓組織を含む面倒なアッセイに限られている。

【０００５】 最近では、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現の誘導に関する分子的基礎を理解すること
に努力が向けられている。ＣＹＰ３Ａ４プロモータがクローニングされ、転写開
始部位の約１５０ｂｐ上流に位置する２０ｂｐの領域が、デキサメタゾンおよび
リファンピシンに対する応答性を付与していることが明らかにされている（Hash
imoto et al., Eur. J. Biochem. 218:585〜595(1993)、Barwick et al., Molec
. Pharmacol. 50:10〜16(1996)）。この領域は、多数の核内受容体スーパーファ
ミリーによって認識されるＡＧ（Ｇ／Ｔ）ＴＣＡモチーフを２コピー含有する。
このことは、核内受容体が、ＣＹＰ３Ａ４発現の化学的誘導剤の少なくとも幾つ
かの作用を媒介することに関与し得ることを示唆している。しかし、本発明がな
される前には、この応答エレメントに結合するタンパク質は特徴づけられていな
かった。

【０００６】 本発明は、ＣＹＰ３Ａ４プロモータ内の応答エレメントに結合し、そしてＣＹ
Ｐ３Ａ４発現を誘導することが知られている様々な化合物で活性化される新規な
オーファン核内受容体の同定に基づいている。この受容体の同定により、薬物が
インビボで相互作用するかどうかを明らかにするために使用することができるア
ッセイが可能になる。

【０００７】

【発明の概要】

本発明は、ＣＹＰプロモータ、例えば、チトクロームＰ−４５０モノオキシゲ
ナーゼ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）プロモータ内のリファンピシン／デキサメタゾン
応答エレメントに結合する、ヒトプレグナンＸ受容体（ｈＰＸＲ）と名付けられ
た新規なヒトのオーファン核内受容体に関する。この受容体は、ＣＹＰ（例えば
、ＣＹＰ３Ａ４）遺伝子の転写を調節するために活性化される。本発明はさらに
、ｈＰＸＲをコードする核酸に関する。このような核酸には、ホスト細胞におい
て受容体を発現させるために使用することができる発現ベクターが含まれる。本
発明はまた、そのような発現ベクターで形質転換されたホスト細胞、ならびに化
合物（例えば、薬物）をそのＣＹＰ（例えば、ＣＹＰ３Ａ４）遺伝子発現調節能
についてスクリーニングするために設計されたアッセイにおいて受容体および受
容体コード配列を使用する方法に関する。本発明はまた、ヒト受容体を発現する
ように形質転換された非ヒト動物、および薬物スクリーニングにおいてそのよう
な動物を使用する方法に関する。

【０００８】

【発明の詳細な記述】

本発明は新規ヒト核内受容体であるｈＰＸＲに関する。更に、本発明はｈＰＸ
Ｒをコードする核酸配列、このような配列を含む構築物、構築物を含むホスト細
胞、及びこのようなホスト細胞を使用するｈＰＸＲ作製方法に関する。更に本発
明は、ＣＹＰ発現を誘導する化合物を同定するのに使用できるイン・ビボ及びイ
ン・ビトロアッセイに関する。以下ＣＹＰ３Ａ４を具体的に参照しながら開示す
るが、供せられる詳細（例えば方法）はその他のＣＹＰ遺伝子に関しても同様に
応用できると認識すべきである。

【０００９】 ｈＰＣＲは約４３４アミノ酸を含む、分子量約４９．７キロダルトンのタンパ
ク質として特徴付けされる。ｈＰＸＲは、ＣＹＰ３Ａ４プロモータ内のＤＮＡ応
答エレメントに、９−シスレチノール酸受容体、即ち、ＲＸＰとのヘテロダイマ
ーとして結合する。ｈＰＸＲは、ＣＹＰ３Ａ４発現を調節することが知られてい
る化合物によって活性化される。該受容体は肝臓に最も豊富に発現されるが、結
腸や小腸にも存在している。

【００１０】 本発明の受容体の実施形態の１つは、図１に記載のアミノ酸配列、又はその類
似体（ここに言う類似体とは、図１の配列の天然に生起するヒト変異体を示す）
、又はｈＰＸＲの少なくとも１の機能的特性（例えばリガンド結合又はＤＮＡ結
合）を有する断片を含むその断片を有する。好ましい断片は、図１の配列の一部
を少なくとも長さ連続３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも長さ５０連続ア
ミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも長さ７５連続アミノ酸含む。具体的断
片は、リガンド結合ドメイン（即ち、図１の配列のアミノ酸１４１ないし４３４
）及びＤＮＡ結合ドメイン（即ち、図１の配列のアミノ酸４１ないし１０７）及
び以下の実施例に記載されたリガンド結合アッセイ（即ち、図１の配列のアミノ
酸１３０ないし４３４）に使用されるドメインを含む。更に、発明は図１の配列
のリガンド結合ドメインと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を共有する、
より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を、そして最も好ましく
は図１の配列のリガンド結合ドメインと少なくとも９０％又は９５％、９６％、
９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性（％配列同一性は、例えばＮＣ
ＢＩウエブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/より入手可能なＢａｓｉｃ Ｂ
ｌａｓｔ（第２版）により決定される）を共有するドメインを含み、そして図１
の配列の機能を保持することが好都合であるタンパク質を包含する。

【００１１】 本発明の受容体、又はその断片は検出可能な標識体（例えば放射線活性又は蛍
光標識）を含有できる。受容体、又はその断片は固体支持体、例えばガラス又は
プラスチック製粒子、プレート又はフィルターに結合することもできる。

【００１２】 本発明の核酸配列は、ｈＰＸＲ、例えば図１に示すアミノ酸配列を有するｈＰ
ＸＲをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ配列、及び上記規定のような図１のアミノ酸
配列の類似体及び断片をコードする核酸配列、そして上記のような図１の配列の
リガンド結合ドメインと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性（より好ましく
は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少な
くとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、または少なくと
も９９％）を共有するドメインを含むタンパク質をコードする核酸配列を包含す
る。本発明の具体的な核酸配列は図１に示されている。

【００１３】 ｈＰＸＲをコードする配列は構築物、例えばプロモータ（例えばＣＭＶ、ＳＶ
４０、Ｔａｑ、Ｔ７又はＬａｖ０プロモータ）と作動可能に連結された発現構築
物中に存在できる。この様な発現構築物は培養細胞（例えば酵母、細菌、昆虫又
は哺乳動物）内にて操作可能であり、コードされたｈＰＸＲ又はその断片を発現
する。好ましい発現ベクターにはｐＧＥＸ、ｐＥＴ、ｐＦＡＳＴｂａｃＨＴ及び
ｐＳＧ５が含まれる。

【００１４】 本発明は上記構築物にて形質転換された培養細胞（例えば酵母、細菌、あるい
は哺乳動物（例えばＣＶ−１、ＨｕＨ７、ＨｅｐＧ２又はＣａＣｏ２細胞））に
も関する。形質転換は各種標準的技法の何れかを使用し実施できる。これら細胞
は、ポリペプチド産物の発現に好適な条件下にこれら細胞を培養することでｈＰ
ＸＲ（又はその断片）を作製する方法に使用できる。

【００１５】 更に本発明は、少なくともｈＰＸＲの１つのＤＮＡ結合ドメイン又はリガンド
結合ドメイン、及び非ｈＰＸＲ由来配列を含むキメラ受容体（又は受容体成分を
有する融合タンパク質）（及びコードする配列）に関する。非ｈＰＸＲ由来配列
は、キメラ受容体により提供される目的に好適になるよう選択することができる
。このような配列の例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及び酵母転
写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン及びその他のＤＮＡ結合ドメイン、例えば
エストロゲン及びグルココルチコイド受容体のＤＮＡ結合ドメインが含まれる。
キメラ受容体は検出可能な標識体（例えば放射線活性又は蛍光標識）を持つこと
ができる。キメラ受容体は固体支持体、例えばガラス又はプラスチック製粒子、
プレート又はフィルターに結合することもできる。

【００１６】 本発明の別の態様は、ＣＹＰ３Ａ４レベルに対する化合物（例えば潜在的新規
薬物）の作用のプロファイルに使用できるイン・ビトロ（無細胞）及びイン・ビ
ボ（細胞ベース）アッセイに関する。ＣＹＰ３Ａ４酵素の広範囲の基質特異性と
連結したＣＹＰ３Ａ４レベルの誘導性は、多剤治療を受けている患者に於ける多
くの薬物間相互作用のベースを表す。理想的には、新規薬物はＣＹＰ３Ａ４発現
レベルに殆ど、又は全く影響しないだろう。

【００１７】 本発明のアッセイは各種形状の何れかを取ることができる。ｈＰＸＲを活性化
する化合物はＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現誘導体として機能することから、ｈＰＸＲ
結合及び活性化アッセイはＣＹＰ３Ａ４の活性化が期待できる化合物を特定する
効率的方法を提供する。

【００１８】 本発明の結合アッセイは、ｈＰＸＲ又はそのリガンド結合ドメイン（単独又は
融合タンパク質として存在する）が、検出可能な標識体（例えば放射線活性又は
蛍光標識体）を持つと好都合である試験化合物とインキュベートされる無細胞ア
ッセイを含む。次に、試験化合物に対し遊離または結合しているｈＰＸＲ、又は
そのリガンド結合ドメインは、各種技術（例えばゲル濾過クロマトグラフィー（
例えばセファデックスＧ５０スピンカラム）又はハイドロキシアパタイト樹脂上
への捕捉による）の何れかを用い遊離型試験化合物から分離される。次にｈＰＸ
Ｒまたはそのリガンド結合ドメインに結合した試験化合物の量が決定される（例
えば、放射線標識試験化合物の場合では液体シンチレーション測定による）。

【００１９】 ｈＰＸＲまたはそのリガンド結合ドメインに結合する放射線標識試験化合物を
検出する別の方法は、シンチレーションプロキシミティーアッセイ（ＳＰＡ）で
ある。このアッセイでは、ビーズ（又はその他の粒子）をシンチラントに含浸さ
せ、ｈＰＸＲまたはそのリガンド結合ドメインを捕捉可能な分子でコートする（
例えばストレプトアビジンコーティングビーズはビオチン化ｈＰＸＲリガンド結
合ドメインの捕捉に使用できる）。放射線標識された試験化合物とｈＰＸＲ又は
そのリガンド結合ドメインの複合体がＳＰＡビーズの表面上に捕捉され、放射線
標識体がシンチラントにシグナルを発するのに十分な程度近接して持ち込まれた
時のみ放射線活性数値が検出される。この方法には、結合試験化合物からの遊離
型試験化合物の分離を必要としない利点がある（Nichols et al., Anal. Bioche
m. 257:112-119(1998)）。

【００２０】 試験化合物がｈＰＸＲリガンド結合ドメインと結合するか否かを決定するアッ
セイは、競合結合アッセイによっても実施できる。このアッセイでは、ｈＰＸＲ
又はそのリガンド結合ドメインは、検出可能な標識体（例えば、放射線活性又は
蛍光標識体（実施例５−実施例５記載の合成法での使用に好適なクラブトリー触
媒には、Chen et al., J. Labelled Compd. Radiopharm. 39:291(1997) 及びCra
btree et al., Inorg. Synth. 28:56(1990)に報告の触媒が含まれる）を持つこ
とが好都合であるｈＰＸＲと相互作用することが既知である化合物とインキュベ
ートされる。試験化合物を反応体に加え、ｈＰＸＲ、又はそのリガンド結合ドメ
インへの結合に関する標識化合物との競合能力についてアッセイする。遊離型の
既知（標識された）化合物を結合したものと分離するステップを実施する標準的
アッセイフォーマットまたはＳＰＡフォーマットは、試験化合物の競合する能力
の評価に使用できる。

【００２１】 本発明による結合アッセイの別の実施例は、ｈＰＸＲリガンドがｈＰＸＲリガ
ンド結合ドメインと共活性因子（例えば、ＳＲＣ１、ＴＩＦ−１、ＴＩＦ−２又
はＡＣＴＲ、あるいはその断片）との相互作用を誘導するという発見に基づく。
試験化合物がｈＰＸＲを活性化する、即ちＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導するかを決
定するためには、ｈＰＸＲのリガンド結合ドメインは融合タンパク質（例えばグ
ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジンタグまたはマルト
ース結合タンパク質）として調整（例えば発現）される。融合タンパク質及び共
活性化因子（いずれか、あるいは共に検出可能な標識体、例えば放射線活性また
は蛍光タグで好都合に標識される）を試験化合物存在下、又は非存在下にインキ
ュベートし、融合タンパク質に対する共活性化因子の結合の強さを決定する。試
験化合物の存在下での相互作用の誘導はｈＰＸＲ活性化因子の指標である。

【００２２】 本発明によるｈＰＸＲ活性化アッセイは全長ｈＰＸＲ及びｈＰＸＲ結合ドメイ
ンにより認識されるＤＮＡ結合部位を１コピーまたはそれ以上のコピー含むレポ
ーターシステムを使用し実施される（実施例３）。しかし、活性化アッセイは活
性化されたキメラ受容体システムを使用し好都合に実施される。例えば、ｈＰＸ
Ｒのリガンド結合ドメインは例えば酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン
、またはエストロゲンあるいはグルココルチコイド受容体のＤＮＡ結合ドメイン
に融合できる。キメラ（例えば、ＧＡＬ４−ｈＰＸＲキメラ）の発現ベクターは
ホスト細胞（例えばＣＶ−１、ＨｕＨ７、ＨｅｐＧ２、又はＣａＣｏ２細胞）内
にレポーター構築物と共にトランスフェクトできる。レポーター構築物は、レポ
ーター遺伝子（例えばＣＡＴ、ＳＰＡＰ又はルシフェラーゼ）の発現を推進する
、キメラ（例えば、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合部位）中に存在する結合ドメインによ
り認識されるＤＮＡ結合部位を、１またはそれ以上のコピー（例えば５）含むこ
とができる。次に構築物を含む細胞をビヒクル単独、又は試験化合物を含むビヒ
クルで処理し、レポーター遺伝子の発現レベルが決定される。本アッセイによれ
ば、試験化合物存在下でのレポーター遺伝子の発現促進は、試験化合物がｈＰＸ
Ｒを活性化し、従ってＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現の誘導因子として機能できること
を示す。（実施例４参照） 本発明に関連した使用に好適な別のフォーマットは、酵母２ハイブリッドアッ
セイである。本法は酵母内で実施されるタンパク質−タンパク質相互作用を検出
する確立した方法である。エサを表すタンパク質＃１は酵母内にてＤＮＡ結合ド
メインとのキメラとして発現される（即ちＧＡＬ４）。捕食者を表すタンパク質
＃２は同一酵母細胞内にて強い転写活性ドメインと共にキメラとして発現される
。エサと捕食者の相互作用の結果、レポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ又
はβ−ガラクトシダーゼ）の活性化、あるいは選択可能マーカーの制御（例えば
ＬＥＵ２遺伝子）が起こる。本法は例えばｈＰＸＲ１と共活性化タンパク質（例
えばＳＲＣ１、ＴＩＦ１、ＴＩＦ２、ＡＣＴＲ）またはその断片の様な別のタン
パク質とのリガンド依存性相互作用を検出するスクリーニングとして使用できる
（Fields et al., Nature 340:245-246(1989)）。

【００２３】 更に別のフォーマットはリガンド−誘導複合体形成（ＬＩＣ）アッセイである
。本法は、核内受容体ＤＮＡ相互作用へのリガンド−介在作用を検出する方法で
ある。ｈＰＸＲ（又は、少なくともそのＤＮＡ及びリガンド結合ドメイン）は、
確立されたｈＰＸＲ／ＲＸＲ結合部位を表すＤＮＡ存在下にヘテロダイマーの相
方であるＲＸＲとインキュベートできる。試験化合物は、ＤＮＡへのｈＰＸＲ／
ＲＸＲヘテロダイマーの結合を促進、または干渉するそれらの能力についてアッ
セイすることができる（Forman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4312-
4317(1997)）。

【００２４】 好適なｐＫｉ、例えばｐＫｉ＞５にてＰＸＲを結合する化合物は、標準的な結
合アッセイを用いることで、他の核内受容体（例えばＲＸＲ）に対するＰＸＲの
選択性についてスクリーニングすることができる。ＰＸＲに対し選択的に結合し
（即ち、ＰＸＲに対する親和性が、例えばグルココルチコイド受容体に比べて少
なくとも１０倍以上、好ましくはＰＸＲに対する親和性が１００倍以上大きい）
、そしてそれにより細胞（例えば培養中の細胞、組織中に存在する細胞、または
全動物体内に存在する細胞）中のＰＸＲの機能活性に影響を及ぼす化合物は、病
気にかかった哺乳動物とＰＸＲ活性との関連付けに使用できる。例えば、ＰＸＲ
を活性化する化合物はＣＹＰ３Ａを誘導する。即ち、ＣＹＰ３Ａ活性が重要であ
る疾患はＰＸＲと関連し、ＰＸＲを活性化又は失活化する化合物はこれら疾患の
予防又は治療に有効であろう。本発明の関連方法を使用することで、新規ＰＸＲ
−関連疾患を発見することができる。これら新規の関連性が発見されれば、ＰＸ
Ｒを活性化、または失活化する化合物をスクリーニングすることで、これら疾患
に関する新規薬物を発見できる。

【００２５】 上記方法による病気関連付けへの使用に好適な化合物の例は、式Ｉの化合物で
ある：

【化３】 式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立にＣ_１−Ｃ_６アルキル（直鎖又
は分枝型）、好ましくはＣ_２またはＣ_３アルキル（例えばエチル、ｎ−プロピル
又はイソプロピル）であり、より好ましくはＣ_２アルキルである。化合物は検出
可能な標識体、即ち放射線標識体、例えばトリチウムで標識できる。

【００２６】 本発明の別の態様は、ｈＰＸＲを発現するトランスジェニック動物である。例
えば、ｈＰＸＲ遺伝子及び内因性のマウスＰＸＲ遺伝子を発現するトランスジェ
ニックマウスを作ることができる。さらに内因性ＰＸＲ遺伝子がノックアウトさ
れ、次にｈＰＸＲ遺伝子で置換されたマウスも作ることができる。ｈＰＸＲのイ
ソフォーム及び遺伝子の突然変異対立遺伝子を発現するトランスジェニック動物
を作ることができる。これら方法により開発されたトランスジェニック動物は、
薬物相互作用及び毒性に関する化合物のスクリーングに、及びイン・ビボでのＣ
ＹＰ３Ａの制御の研究に使用できる。

【００２７】 本発明の別の側面は、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現を誘導する受容体の能力が変化
するｈＰＸＲ内突然変異のスクリーニングに使用できる診断用アッセイに関する
。これらのアッセイは、ｈＰＸＲ遺伝子の配列決定、配列変化又は多形を検出す
るために設計されたハイブリダイゼーション法、又は変異／多形ｈＰＸＲから野
生型を区別する抗体の使用に基づくことができる。ｈＰＸＲに特徴的なＤＮＡ結
合またはリガンド結合に変化させる変化は、ｈＰＸＲ活性に大きな影響を持つと
期待できる。ｈＰＸＲの突然変異又は多形は、薬物代謝の速度が異常になる結果
、薬物に対する副作用リスクが高い患者の指標になるだろう。

【００２８】 本発明はｈＰＸＲ、及びその抗原結合断片（例えばＦａｂ断片）に対し特異的
なポリクローナル又はモノクローナル抗体にも関連する。抗体は、無傷のｈＰＸ
Ｒまたは上記のその断片を使用する標準的な技術に従って作製することができる
。抗体は、例えば受容体の存在を検出するアッセイに使用できる。更に、抗体は
、ｈＰＸＲ精製プロトコールに使用することができる。

【００２９】 本発明は、例えば上記の１またはそれ以上の方法での使用に好適なキットにも
関する。キットはｈＰＸＲ（又はその断片）又は同一体をコードする核酸、また
は上記抗体を含むことができる。キットは、ＧＷ−４８５８０１のようなｈＰＸ
Ｒに結合する化合物を含むこともできる。キット、核酸及び／又は抗体は容器内
の配置されたキット内に存在することができる。キットは、特定の方法の実施を
促進するために、補助的試薬及び緩衝剤等を含むことができる。

【００３０】 本発明の具体的な態様は、以下の非限定的実施例に詳細に記述される。

【００３１】

【実施例】

以下の実験的な詳細は引き続く具体的実施例に関連する。

【００３２】 ＜化学物質＞ デキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテートおよびＲＵ４８６をResearch Plus, I
nc.（Bayonne, NJ）およびBiomol（Plymouth Meeting, PA）よりそれぞれ入手し
た。他のすべての化合物はSigma Chemical Co.（St. Louis, MO）あるいはStera
loids, Inc.（Wilton, NH）のいずれかから入手した。

【００３３】 ＜ｈＰＸＲ ｃＤＮＡの分子クローニング＞ ＥＳＴを、ｈＰＸＲ配列のヌクレオチド４４４−２１１１を含むＩｎｃｙｔｅ
データベース（クローン識別番号２２１１１５２６）で同定した。このＥＳＴ配
列から由来するオリゴヌクレオチド（５’ＣＴＧＣＴＧＣＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡ
ＣＡＴ３’）（配列番号１）を、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｐｐｅｒ溶液ハイブリダイゼ
ーションクローニング法（Gibco/BRL）を用いたｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴヒト肝臓
ｃＤＮＡライブラリー（Gibco/BRL）のスクリーニングに使用した。２つのクロ
ーンがｈＰＸＲをコードし、１方はヌクレオチド１−２１２５を、もう１方はヌ
クレオチド１０２−２１１８を含んで入手した。長い方の配列を図１Ａに示す。
配列を並べ、ウィスコンシン大学遺伝子コンピュータグループ(University of W
isconsin Genetics Computer Group)プログラムで分析した。

【００３４】 ＜プラスミド＞ 発現ベクターｐＳＧ５−ｈＰＸＲをＰＣＲ増幅およびｐＳＧ５発現ベクター（
Strategene）内にｈＰＸＲクローンのヌクレオチド１−１６０８をサブクローニ
ングすることで生成した。ｐＳＧ５−ｈＰＸＲ ＡＴＧを、オリゴヌクレオチド

【化４】

【化５】 を用いたｈＰＸＲのアミノ酸１−４３４をコードしているｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
およびＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐＳＧ５内への挿入で生成した。細菌性発現
ベクターｐＧＥＸ−ｈＰＸＲを、アミノ酸１０８−４３４をコードしているｃＤ
ＮＡのＰＣＲ増幅とｐＧＥＸ−２Ｔ（Pharmacia）への挿入で生成した。レポー
タープラスミド（ＤＲ３）_４−ｔｋ−ＣＡＴを、ＣＹＰ３Ａ１ ＤＲ３ ＰＸＲ
Ｅ

【化６】 を含む２本鎖オリゴヌクレオチドの４つのコピーを、ｐＢＬＣＡＴ２（Luckow e
t al., Nucl. Acids Res. 15:5490(1987)）のＢａｍＨＩ部位に挿入することで
生成した。レポータープラスミド（ＩＲ６）_３−ｔｋ−ＣＡＴを、ＣＹＰ３Ａ４
ＩＲ６ ＰＸＲＥ

【化７】 の３つのコピーをｐＢＬ２ＣＡＴのＢａｍＨＩ部位に挿入することで生成した。
ｐＲＳＥＴ−ＳＲＣ１．１４発現プラスミドはすでに記載している（Kliewer, S
. A., et al., Cell 92:73-82(1998)）。すべての構築物を配列分析で確認した
。

【００３５】 ＜共トランスフェクションアッセイ＞ ＣＶ−１細胞を１０％木炭除去ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地内で、１ウエル
あたり１．２×１０^５細胞の濃度で２４穴プレートにまいた。一般的に、トラン
スフェクション混合液は３３ｎｇの受容体発現ベクター、１００ｎｇのレポータ
ープラスミド、２００ｎｇのβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター（pCH110, Phar
macia）および１６６ｎｇの担体プラスミドが含まれた。細胞を、取扱説明書に
したがってLipofectamine（Life Technologies, Inc.）を用いてリポフェクショ
ンにて一晩トランスフェクトした。培地を１０％脱脂ウシ血清（Sigma）を含む
ＤＭＥ培地に換え、細胞をさらに２４時間インキュベートした。細胞抽出物を準
備し、すでに記載されたように（Lehmann et al., J. Biol. Chem. 270:12953-1
2956(1995)）、ＣＡＴおよびβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。

【００３６】 ＜ノーザン分析＞ およそ１．０ｋｂのｈＰＸＲのＬＢＤをコードしている断片を、ランダムプラ
イミングによって［^３２Ｐ］−標識化し、マウスの複数の組織ノーザンブロット
（Clontech）をプローブするのに使用した。ブロットをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶
液（Clontech）中で４２℃一晩ハイブリダイゼーションした。最終洗浄を０．１
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５８℃にておこなった。

【００３７】 ＜バンドシフトアッセイ＞ ｈＰＸＲ、ｍＰＸＲ１、およびｈＲＸＲを、取扱説明書にしたがって、ＴＮＴ
ウサギ網状赤血球溶解物結合イン・ビトロ転写／翻訳システム（Ｐｒｏｍｅｇａ
）を用いてイン・ビトロで合成した。ゲル易動度シフトアッセイ（２０μｌ）に
は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ ＮＰ−
４０、６％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２μｇ ポリ（ｄＩ−ｄＣ）お
よび各２．５μｌのイン・ビトロ合成ＰＸＲおよびＲＸＲタンパク質を含んだ。
競合剤オリゴヌクレオチドは１０倍から５０倍過剰に含めた。氷上１０分間のイ
ンキュベーションの後、１０ｎｇの［^３２Ｐ］−標識化オリゴヌクレオチドを加
え、さらに１０分間インキュベーションを続けた。ＤＮＡ−タンパク質複合体を
０．５ＸＴＢＥ（１×ＴＢＥ＝９０ｍＭ Ｔｒｉｓ、９０ｍＭ ホウ酸、２ｍＭ
ＥＤＴＡ）中４％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを乾燥させ、−
７０℃でオートラジオグラフィーにかけた。以下のオリゴヌクレオチドを放射標
識したプローブあるいは競合剤のいずれかで使用した（センスストランドを示す
）。

【００３８】

【化８】 ＜ＣＡＲＬＡ＞ ＧＳＴ−ｈＰＸＲ融合タンパク質をＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ細胞に発現
させ、細菌抽出物を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、１
０ｍＭ ＤＴＴおよび１％ ＮＰ−４０を含むタンパク質溶解緩衝液(Protein L
ysis Buffer)中で細胞を１回凍結−解凍し、つづいて３０分間４０，０００×ｇ
で遠心して調製した。グリセロールを最終濃度１０％となるように得られた上清
に加えた。溶解物を−８０度で保存した。［^３５Ｓ］ＳＲＣ１．１４をPro-Mix
（Amersham）の存在下、ＴＮＴウサギ網状赤血球システム（Promega）を用いて
作製した。共沈殿反応物には、２５μｌのＧＳＴ−ｈＰＸＲ融合タンパク質を含
む溶解物、２５μｌインキュベーション緩衝液(Incubation Buffer)（５０ｍＭ
ＫＣｌ、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５ｍＭ β−メルカプトエタノ
ール、１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１％脂肪不含粉乳）、５μｌ［^３５Ｓ］ＳＲＣ
１．１４およびビヒクル（１％ ＤＭＳＯ）あるいは指示したような化合物が含
まれた。混合液をゆっくりかき混ぜながら４℃で２５分間インキュベートし、大
量にタンパク質溶解緩衝液で洗浄した１５μｌのグルタチオン−セファロース４
Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を加えた。反応液をさらに２５分間４℃でゆっ
くり混ぜながらインキュベートした。ビーズを微量遠心管で３０００ｒｐｍでペ
レットにし、ビヒクルのみ、デキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテート、リファン
ピシン、あるいはクロトリマゾールいずれかを含むタンパク質溶解緩衝液で３回
洗浄した。最後の洗浄の後、ビーズを５０ｍＭ ＤＴＴを含む２５μｌの２×Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ標本緩衝液に再懸濁した。標本を１００℃で５分間熱し、１０％
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＰＡＧＥゲルにのせた。ゲルを乾燥させ、オートラジオグ
ラフィーにかけた。

【００３９】 例 １： ｈＰＸＲの分子クローニングおよび組織発現パターン ｍＰＸＲ１（Kliewer et al., Cell 92:73-82(1998)）領域に高い相同性を有
するIncyte LifeSeq（登録商標）の適切なデータベースにおいて、ヒトＥＳＴを
同定した。プローブとしてのＥＳＴ内において、オリゴヌクレオチドを使用した
ヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリのスクリーンにおいて、２つの大きなクローン
を単離した。これらクローンのうち最大のものは長さ２１４６ｂｐ（図１Ａ）で
あり、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）中
のｍＰＸＲ１に対してそれぞれ９７％と７６％の相同性を有する核内受容体スー
パーファミリの新規メンバーを有していた（図１Ｂ）。核内受容体スーパーファ
ミリにおけるその他のメンバーとしては、ｈＰＸＲがXenopus laevisのオーファ
ン受容体ＯＮＲ１（Smith et al., Nucl. Acids Res. 22:66-71(1994)）および
ビタミンＤ受容体に対してもっとも関連性が高かった（図１Ｂ）。注目すべきこ
とに、ｈＰＸＲ配列はインフレーム停止コドン（ｈＰＸＲ配列中のヌクレオチド
２０５−２０７）の間においてＡＵＧ開始コドンとＤＢＤをコードする領域の開
始位置を欠いている。しかし、ＣＶ−１細胞、ｈＰＸＲクローン、および最小チ
ミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモータならびにクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子（Kliewer et al., Cell 92:73-82(1998)）の
上流に挿入されたラットＣＹＰ３Ａ１遺伝子プロモータからの確立されたｍＰＸ
Ｒ結合部位のコピーを４つ含むレポータープラスミドを使って実施したトランス
フェクション試験からは、ｈＰＸＲクローンが周知のｍＰＸＲ１リガンドである
デキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテートにより効率よく活性化される機能的核内
受容体をコードすることが明らかとなった（Kliewer et al., Cell 92:73-82(19
98)）（図１Ｃ）を示した。

【００４０】 ｈＰＸＲ配列の試験からは、インフレームＣＵＧコドン（ヌクレオチド３０４
−３０６）が、所望されるkozak配列（Kozak, J. Biol. Chem. 266:19867-19870
(1991)）に囲まれていることが明らかとなった。核内受容体ＲＡＲβ４（Kozak,
J. Biol. Chem. 266, 19867-19870(1991)、Nagpal et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89:2718-2722(1982)）を含む真核細胞タンパク質の翻訳を開始するに
は、ＣＵＧコドンを使用することが慣例となっている。このＣＵＧコドンでの翻
訳を開始することにより、ｍＰＸＲ１より３個長い４３４個のアミノ酸からなる
タンパク質を得ることが予想され、分子量は４９．７ｋＤであると推定される。
ＣＵＧコドンでのｈＰＸＲ ｃＤＮＡの翻訳が始まっているかどうかを決定する
ため、野性型５’領域を含むｈＰＸＲ ＲＮＡを、［^３５Ｓ］メチオニンの存在
下にウサギ網状赤血球溶解物を使用して翻訳した。対照としてのｈＰＸＲ ＲＮ
Ａ中ではこのＣＵＧコドンがすでに至適ＡＵＧ（ｈＰＸ ＡＵＧ）に突然変異し
ており、これをイン・ビトロにおいて翻訳した。野性型ｈＰＸＲ ＲＮＡの翻訳
の結果、ｈＰＸＲ ＡＵＧ ＲＮＡの翻訳産物（図１Ｄ中、星印付きの白抜き矢
印）と共に遊走している約５０ｋＤのタンパク質が生成した。翻訳反応中でｈＰ
ＸＲアンチセンスＲＮＡを使用した場合には、この５０ｋＤの産物が産生しなか
った。ｈＰＸＲ ＲＮＡを使用して実施した翻訳反応中では、約５３ｋＤの翻訳
産物もごく微量産生しており（図１折れた矢印）、このことはＣＵＧコドンより
も上流の、別の非ＡＵＧコドンで少量の翻訳が始まっていることを示していた。
しかし、機能性ＤＢＤを含むｈＰＸＲにとってはＣＵＧコドンが主要な翻訳開始
部位であることが、試験結果からわかっている。

【００４１】 次に、多数の成人組織から調製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ含有ブロットを使
用し、ノーザン分析を介してｈＰＸＲの組織発現パターンを調べた。ｈＰＸＲ
ｍＲＮＡは肝臓においてもっとも大量に発現しており、結腸および小腸でも発現
していた（図２）。最大発現を示す２．６ｋｂ産物の他に、４．３ｋｂおよび５
ｋｂの２つのより少量のメッセージとからなる、サイズの異なる３つの転写物を
、これら組織の各々から検出した。最近、ｍＰＸＲ遺伝子もまた肝臓および小腸
で大量に発現していることが分かった（Kliewer et al., Cell 92:73-82(1998)
）。ｍＰＸＲメッセージもまた胃および腎臓において低レベルで発現していたが
、これらの組織中ではｈＰＸＲに対するｍＲＮＡは検出されなかった（図２）。
しかるに、ｈＰＸＲとｍＰＸＲは共に肝臓および消化管組織において多量に発現
している。しかし、マウスとヒトではＰＸＲの発現パターンに差異が生じている
。

【００４２】 例 ２： ｈＰＸＲはＣＹＰ３Ａ４遺伝子プロモータにおける反応エレメントを介し
て転写を活性化する ｍＰＸＲがＣＹＰ３Ａ１遺伝子の発現を制御していることを示す証拠が幾つか
示されている。ｍＰＸＲ１はＣＹＰ３Ａ１遺伝子発現を活性化させることで周知
のグルココルチコイドおよびアンチグルココルチコイドを含む化合物により活性
化され、ｍＰＸＲ１およびＣＹＰ３Ａ１遺伝子は肝臓および小腸に局在しており
、ｍＰＸＲ１は過去にグルココルチコイドおよびアンチグルココルチコイドとコ
ンファーすることが明らかになっていたＣＹＰ３Ａ１遺伝子プロモータ中の反応
エレメントに結合している（Kliewerら Cell 92:73-82(1998)、Quattrochi et a
l., J. Biol. Chem. 270:28917-28923(1995)、Huss et al., J. Biol. Chem. 93
:4666-4670(1996)）。ＣＹＰ３Ａ４遺伝子が肝臓および小腸でも発現することを
示す所見と、この発現がグルココルチコイドおよびアンチグルココルチコイドに
反応して誘導されることを示す所見（Molawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 83:5311-5315(1986)、Kocarek et al., Drug Met. Dispos. 23:415-421(199
5)）は、結果的にｈＰＸＲがＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現を制御しているかどうか
の探索へつながった。

【００４３】 デキサメタゾンおよびリファンピシンに反応したＣＹＰ３Ａ４の発現誘導は、
反転反復（ＩＲ）として構成された核内受容体ハーフサイト配列Ｇ（Ｇ／Ｔ）Ｔ
ＣＡを２コピー含むプロモータの約２０ｂｐの領域にほぼ局在し、６つの塩基対
すなわちＩＲ６モチーフ（Barwick et al., Molec. Pharmacol. 50:10-16(1996)
）（図３Ｂ）によって分けられていた。このＩＲ６モチーフは幾つかの種におい
てＣＹＰ３Ａ遺伝子ファミリーのメンバーにおけるプロモータ中でかなり保存さ
れていた（Barwick et al., Molec. Pharmacol. 50:10-16(1996)）。興味深いこ
とに、このハーフサイト構造は、ＤＲ３モチーフなる３ヌクレオチドスペーサー
を有する直接反復配列（ＤＲ）として構成される２つのハーフサイトを含むＣＹ
Ｐ３Ａ１ ＰＸＲ反応エレメント（ＰＸＲＥ）に見出されたハーフサイト構造と
は大きく異なっている（Kliewer et al., Cell 92:73-82(1998)）。ｈＰＸＲが
ＩＲ６モチーフを介して転写を制御できるかどうかを決定するために、ｔｋプロ
モータおよびＣＡＴ遺伝子の上流にあるＣＹ３ＰＡ４ ＩＲ６反応エレメントの
コピー３つを含むレポータープラスミドが生成された。（ＩＲ６）_３−ｔｋ−Ｃ
ＡＴレポーターおよびｐＳＧ５−ｈＰＸＲ ＡＴＧ発現プラスミドをＣＶ−１細
胞中において、ビヒクルのみ、または１０μＭデキサメタゾン−ｔ−ブチルアセ
テートのいずれかで処理して、共トランスフェクションアッセイを実施した。ｈ
ＰＸＲはデキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテートの存在下にてレポーターのレベ
ルを誘導しており（図３Ａ）、このことは、ｈＰＸＲがＣＹＰ３Ａ４ ＩＲ６モ
チーフを介して転写を活性化できることを示す。

【００４４】 ｈＸＰＲがＣＹＰ３Ａ４ ＩＲ６反応エレメントと直接反応するかどうかを決
定するために、バンドシフトアッセイを実施した。ｍＰＸＲ１はＲＸＲとのヘテ
ロダイマーとしてＤＮＡと結合するので（Kliewer et al., Cell 92:73-82(1998
)）、ｈＰＸＲにはＤＮＡとの高い親和性相同作用を有するＲＸＲが必要になる
であろうと推察された。ｈＰＸＲとＲＸＲは、いずれもＣＹＰ３Ａ４ ＩＲ６モ
チーフを含む放射性標識オリゴヌクレオチドと自ら結合することはない（図３Ｃ
）。しかし、ｈＰＸＲとＲＸＲはヘテロダイマーとして効率よくＩＲ６ ＰＸＲ
Ｅと結合する。ｈＰＸＲ／ＲＸＲ複合体は、ＣＹＰ３Ａ４プロモータ由来のＩＲ
６のＰＸＲＥか、または過去においてｍＰＸＲ１／ＲＸＲ結合部位として定義さ
れていたＣＹＰ３Ａ１プロモータ由来のＤＲ３ ＰＸＲＥのいずれかをコードす
る未標識オリゴヌクレオチドと効率良く競合していた（Kliewer et al., Cell 9
2:73-82(1998)）（図３Ｃ）。このため、ｈＰＸＲ／ＲＸＲヘテロダイマーは、
明らかに構造の異なるアーキテクチャを持つ２つの反応エレメントと効率よく相
互作用していた。ＩＲ６ ＰＸＲＥ（図３Ｃ）の５’ハーフサイトのいずれか、
あるいはハーフサイト配列の両側に突然変異を含むものを使用した競合剤オリゴ
ヌクレオチドを使用した場合では、競合は殆どまたはまったく生じなかった。ｍ
ＰＸＲ１をｈＰＸＲで置換した場合には、同一の結合プロファイルが認められた
（図３Ｃ）。これらの実験からは、ｈＰＸＲがＲＸＲに対するヘテロダイマーと
してＣＹＰ３Ａ４ ＩＲ６ ＰＸＲＥと効率よく結合することと、ｈＰＸＲとｍ
ＰＸＲ１がきわめてよく似たＤＮＡ結合プロファイルを有することが結論付けら
れた。

【００４５】 例 ３： ヒトとｍＰＸＲの活性化の違い ＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現は合成ステロイド（Kocarek et al., Drug. Met. Dis
pos. 23:415-421(1995)，Schetz et al., J. Biol. Chem. 259:2007-2012(1984)
，Heuman et al., Mol. Pharmaclo. 21:753-760(1982)、Schulte-Hermann et al
., Cancer Res. 48:2462-2468(1988)），マクロライド系抗生物質（Weighton et
al., Biochem. 24:2171-2178(1985)）、抗真菌剤（Hostetler et al., Mol. Ph
armacol. 35:279-285(1989)）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤(statins)（
Kocarek et al., Toxicol.Appl. Pharmacol. 120:298-307(1993)，Schetz et al
., Hepatology 18:1254-1262(1993)）、およびフェノバルビタール様化合物（Hu
man et al., Mol. Pharmacol. 21:753-760(1982)）を含む、ゼノバイオチックス
の著明なアレーに反応して誘導される。次に、ＣＹＰ３Ａ４の発現に対してこれ
ら化合物の幾つか、またはすべてが及ぼす影響をｈＰＸＲが仲介するかどうかを
調べた。ＣＶ−１細胞をｐＳＧ５−ｈＰＸＲ ＡＴＧ発現プラスミド、および（
ＩＲ６）_３−ｔｋ−ＣＡＴレポータープラスミドと共にトランスフェクションし
、この細胞を、ヒトおよび／またはげっ歯類にＣＹＰ３Ａ遺伝子発現を誘導する
ことで周知の多数の化合物のマイクロモル濃度で処理した。図４Ａに見られるよ
うに、ｈＰＸＲは合成ステロイド類であるデキサメタゾン、デキサメタゾン−ｔ
−ブチルアセテート、ＰＣＮ、ＲＵ４８６、スピロノラクトン、およびシプロテ
ロン−アセテートにより活性化された。デキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテート
およびＲＵ４８６は試験した合成ステロイド類のなかでもｈＰＸＲに対してのも
っとも効率良い活性化物質である。注目すべきことに、抗生物質リファンピシン
および抗真菌剤クロトリマゾールは共にｈＰＸＲの効率良い活性化物質である（
図４Ａ）。抗高コレステロール血症薬であるロバスタチンもまた、フェノバルビ
タールおよびオルガノコリン殺虫剤トランスノナクロールがそうであったように
、ｈＰＸＲを活性化した（図４Ａ）。しかるに、ｈＰＸＲはＣＹＰ３Ａ４遺伝子
発現を誘導することで周知のきわめて多様性に富む化合物群により活性化される
（図４Ｂ）。

【００４６】 幾つかの天然に生起するＣ２１ステロイドについても、ｍＰＸＲ１を活性化す
ることが過去に示されてきたｈＰＸＲを対象として試験した（Kliewer et al.,
Cell 92:73-82(1998)）。プレグネノロン、プロゲステロン、および５β−プレ
グナン−３、２０−ジオンはすべてｈＰＸＲをほぼ４倍活性化した。プレグネノ
ロンおよびプロゲステロンの１７−ヒドロキシ誘導体はｈＰＸＲにとっての弱い
活性化物質であった（図４Ａ）。これらの天然型ステロイドはすべて＞１０ｕＭ
のＥＣ_５０値により一過性のトランスフェクションアッセイにおいてｈＰＸＲを
活性化しており、このことが、これらステロイドが天然型のｈＰＸＲリガンドと
は考えられないことを示唆している。しかし、プレグナンおよびプレグナン代謝
物関連物質は天然型リガンドとして機能すると考えられる。

【００４７】 げっ歯類またはヒトのいずれから採取した初代肝細胞を対象に、ＣＹＰ３Ａ遺
伝子発現に対する化学的誘導物質の影響を分析した結果、有意な種差のあること
が明らかとなった（Barwick et al., Molec. Pharmacol. 50:10-16(1996)，Koca
rek et al., Drug. Met. Diospos. 23:415-421(1995)）。たとえば、リファンピ
シンはヒト肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現にとって効率良い誘導剤であ
るが、ラット肝細胞のＣＹＰ３Ａ１レベルに対しては殆どあるいはまったく影響
を及ぼさない。これとは対照的に、ＰＣＮはラット肝細胞においてＣＹＰ３Ａレ
ベルに対して著明な影響を有するけれども、ヒト肝細胞に対しては軽微な影響を
及ぼすに過ぎない。このような種差のばらつきがＰＸＲ活性化プロファイルの差
に関わっているかどうかを調べるために、ｍＰＸＲ１に対するこれら化合物の同
一パネルを調べた。図４Ａに示すように、ＰＸＲにおけるマウスとヒトの相同部
分に対する反応プロファイルには顕著な差異が認められた。リファンピシンはｈ
ＰＸＲにとっての効率よい活性化物質であるけれども、ｍＰＸＲ１にとっては弱
い活性化物質であるに過ぎなかった（図４Ａ）。クロトリマゾール、ロバスタチ
ンおよびフェノバルビタールもまた、ｍＰＸＲ１よりもｈＰＸＲに対しての効率
良い活性化物質であった。これとは対照的に、ＰＣＮはｈＰＸＲのみを３倍強く
活性化したが、ｍＰＸＲ１に対してはほぼ９倍強く活性化した（図４Ａ）。これ
をあわせて考えると、これらのデータは、ＣＹＰ３Ａの制御に関する種差の大半
が、ＰＸＲの活性化プロファイルの差異に起因していることを指摘している。

【００４８】 ＣＹＰ３Ａ発現を誘導する化学物質のパネルを、ヒトグルココルチコイド受容
体（ＧＲ）上でもプロファイルした。図４Ａに示すように、ＧＲにとっての効率
よい活性化物質はデキサメタゾンとデキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテートのみ
であった。その他の化合物のなかでＧＲを＞１．５倍活性化させた物質は認めら
れなかった（図４Ａ）。最近の報告（Calleja et al., Nature Med. 4:92-96(19
98)）とは対照的に、リファンピシンによるＧＲの活性化は認められなかった。
この試験は過去においてＨｅｐＧ２細胞を対象に実施されたので、リファンピシ
ンは細胞株によって異なる代謝を受けると考えられる。予想どおり、プレグネノ
ロン、プロゲステロン、あるいはそれらの１７−ヒドロキシ誘導体はいずれもＧ
Ｒ活性に対して何の影響も及ぼさなかった（図４Ａ）。しかるに、ＣＹＰ３Ａ遺
伝子発現誘導物質を伴うＰＸＲにおいて、ヒトとマウスでの相同部に認められた
広範囲の活性化プロファイルは、その他のステロイドホルモン受容体にとっての
一般的特徴にはなっていない。

【００４９】 高い親和性を有する放射活性リガンドの非存在下において、コアクチベータ基
本アッセイを生化学的手段として使用し、オーファン核内受容体がタンパク質と
直接反応するかどうかを測定した（Kliewer et al., Cell 92:73-82(1998)、Kre
y et al., Mol. Endocrinol. 11:779-791(1997)）。これらのアッセイは、核内
受容体とコアクチベータという名のアクセサリタンパク質との相互作用をリガン
ド類が誘導するとの所見において予見されている（Krey et al., Mol. Endocrin
ol. 11:779-791(1997)）。また、最近、デキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテート
およびＰＣ等、幾つかのｍＰＸＲ１のステロイド状の活性化物質が、ｍＰＸＲ１
ＬＢＤとステロイド状受容体コアクチベータ１（ＳＲＣ１．１４）における１
４ｋＤ断片との相互作用を促進することがわかった（Kliewer et al., Cell 92:
73-82(1998)）。ｈＰＸＲを活性化し構造的には多様である化合物類が、リガン
ドとして作用するのと同様に作用するかどうかを調べるために、互いに化学的ク
ラスの異なる強力な活性化物質３つすなわちデキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテ
ート、リファンピシンおよびクロトリマゾールを選択し、コアクチベータ受容体
リガンドアッセイ（ＣＡＲＬＡ）の試験に使用した。Ｅ．Ｃｏｌｉ内においてｈ
ＰＸＲおよびｍＰＸＲのＬＢＤｓはグルタチオン−ｔ−ブチルアセテート（ＧＳ
Ｔ）との融合タンパク質として発現しており、［^３５Ｓ］メチオニンと［^３５Ｓ
］システインとの存在下においてイン・ビトロでＳＲＣ１．１４が合成された。
図４Ｃに示すように、デキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテート、リファンピシン
およびクロトリマゾールは各々が［^３５Ｓ］ＳＲＣ１．１４とＧＳＴ−ｈＰＸＲ
との相互作用を促進した。トランスフェクション試験に関する試験結果と矛盾す
ることなく、デキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテートはＧＳＴ−ｍＰＸＲ１と［ ^３５ Ｓ］ＳＲＣ１．１４との相互作用を効率よく誘導したが、リファンピシンと
クロトリマゾールは誘導しなかった（図４Ｃ）。これとあわせて考えると、これ
らのデータは、構造的に多様性を有する化合物がｈＰＸＲリガンド類として作用
することと、ヒトとマウスでのＰＸＲにおける相同部分が、リガンドへの結合特
性の面からみて有意に異なっていることを示唆している。

【００５０】 例 ４： トランスフェクションアッセイ プラスミド：ＧＡＬ４−ｈＰＸＲキメラおよびＵＡＳ−ｔｋ−ＳＰＡＰレポー
ター ＧＡＬ４−ｈＰＸＲ発現構築物は、ｐＳＧ５発現ベクター（Statagene）中に
、酵母Ｓ．ｃｒｅｖｉｓｉａｅの転写ファクターＧＡＬ４の翻訳開始配列とアミ
ノ酸１−１４７を含有する。ｈＰＸＲのアミノ酸１０８−４３４はベントポリメ
ラーゼ（New England Biolads）を使ってポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によっ
て増幅され、ＧＡＬ４配列のＣ−末端へ挿入される。ＵＡＳ−ｔｋ−ＳＰＡＰレ
ポーターはｔｋプロモータとＣＡＴ遺伝子の上流にあるＧＡＬ４結合部位５個分
のコピーを含有する（Berger et al., Gene 66:1(1988)）。

【００５１】 トランスフェクションアッセイ：ＳＰＡＰレポーター ＣＶ−１細胞を１０％のデリピデート化ウシ胎児血清含有ＤＭＥ培地中に添加
し、２．４ｘ１０^４の濃度で９６穴プレート（Coaster）中でトランスフェクシ
ョン前に１６−２４時間培養する。一般的には、８．０ｎｇのレポータープラス
ミド、２５．０ｎｇのβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター（ｐＣＨ１１０、Phar
macia）、および２．０ｎｇのＧＡＬ４−ｈＰＸＲ発現ベクターを担体ＤＮＡ（p
Bluescript、Stratagene）と混合し、１０ｍｌのｏｐｔｉＭＥＭ Ｉ培地（Life
Technologies）において、１ウエルあたり合計８０ｎｇのＤＮＡとなるように
する。これに２次混合液として９．３ｍｌのｏｐｔｉＭＥＭ Ｉ培地と０．７ｍ
ｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ^ＴＭ（Life Technologies）を添加する。３０
分後、さらに８０ｍｌのｏｐｔｉＭＥＭ Ｉ培地を添加し、この混合液を細胞に
添加する。１６時間後、この培地をデリピデート化と加熱非働化処理したウシ胎
児血清を１０％添加したＤＭＥ培地、および１０^−５Ｍの濃度で被験物質を添加
した培地と交換する。２４時間培養後、ＳＰＡＰ活性およびβ−ガラクトシダー
ゼ活性を、２００ｍｌの基質混合液（１６ｍＭのｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド（Sigma）、１２０ｍＭのフルオレセインジフォスフェート（M
olecular Probes）、０．１６％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１６０ｍＭのジエ
タノールアミンｐＨ９、４４．８ｍＭのＮａＣｌ、および０．８ｍＭのＭｇＣｌ _２ ）を直接添加することによって測定する。あるいは、標準プロトコールを使用
することによってアルカリフォスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を
別個に測定する。簡単にいえば、２５ｍｌの０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を
上清に添加することによって細胞を溶解させる。４０ｍｌの細胞溶解物に対して
２００ｍｌのβ−ガラクトシダーゼ基質試薬（３６ｍＭのｏ−ニトロフェニルβ
−ガラクトシダーゼ、１．２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．８ｍＭのＮａＣｌ、およ
び４．４Ｍのβ−メルカプトエタノール）または２００ｍｌのアルカリフォスフ
ァターゼ基質試薬（２．５ｍＭのｐ−ニトロフェニルフォスフェート、０．５ｍ
ＭのＭｇＣｌ_２、２０ｍＭのＮａＣｌ、１ＭのジエタノールアミンｐＨ９．８５
）のいずれかを添加し、１時間培養する。アルカリフォスファターゼ活性は、ビ
ヒクル単独（トランスフェクション効率に対する内部対照標準として機能するβ
−ガラクトシダーゼ活性に対して正常化されたもの）に対する相対活性の度合い
の倍数として発現される。

【００５２】 例 ５： 〔^３Ｈ〕ＧＷ―４８５８０１の合成 （ｉ）〔^３Ｈ〕３，５−ジテルトブチルー４―ヒドロキシベンズアルデヒドの
調製 ３，５−ジテルトブチルー４−ヒドロキシベンズアルデヒド５ｍｇ（２０．６
μｍｏｌ）およびＣｒａｂｔｒｅｅ触媒７．５ｍｇ（９．３μｍｏｌ）を２ｍｌ
のジクロロメタンに溶解し、１０Ｃｉトリチウムガスの存在下５時間撹拌する。
溶液を蒸発させ、乾燥し、不安定なトリチウムを、メタノールから繰り返し蒸発
させて除去する。残渣を１０ｍｌのメタノールに再溶解し、計数し分析する。

【００５３】 収率：８００ ｍＣｉ ヘキサン：酢酸エチル（８０：２０）で溶出したシリカによるＴＬＣでは放射
化学純度はおよそ５０％である。

【００５４】 未精製の物質を蒸発させ１ｍｌとして、ヘキサン：酢酸エチル（８５：１５）
で溶出した単一５００μｍシリカプレート上の調整用のプレートクロマトグラフ
ィーにて精製する。プレートを紫外線下で調べて、必要なアルデヒドに相当する
バンドを集め、生成物を酢酸エチル中で抽出する。これを蒸発させて乾燥し、ジ
クロロメタン中に再溶解し、計数し分析する。

【００５５】 収率：３７０ ｍＣｉ 上記のＴＬＣは単一の標識および２３Ｃｉ／ｍｍｏｌで比活性を示した。

【００５６】 （ｉｉ）〔^３Ｈ〕ＧＷ−４８５８０１の調製 上記（ｉ）での生成物（２３Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１６μｍｏｌで３７０ｍＣｉ）
を蒸発させ乾燥し、ＴＨＦ１ｍｌ中に再溶解し、氷浴にて撹拌下、冷却する。ト
ルエン５５μｌ、５５μｍｏｌ中の１Ｍチタニウム（ｉｖ）塩化物を加えると、
直ちに黄色になる。テトラエチルメチレンジホスホネート７５μｌのＴＨＦ溶液
１１０ｍｇ／ｍｌ、２８．６μｍｏｌ次いでＮ―メチルモルホリン８．１μｌ、
７．５ｍｇ、７４μｍｏｌを加える。こうすることにより、深青色となる。次い
で、溶液を室温で４時間撹拌する。

【００５７】 酢酸エチル：メタノール（９０：１０）中のシリカ上のＴＬＣ分析によると、
およそ６０％の不活性なＧＷ−４８５８０１に相当する放射能を示した。

【００５８】 （ｉｉｉ）〔^３Ｈ〕ＧＷ−４８５８０１の精製 粗生成物を酢酸エチル：メタノール（９０：１０）で溶出した２×１ｍｍシリ
カプレート上の調整用のプレートクロマトグラフィーにて精製する。プレートを
紫外線下で調べて、必要な生成物に相当するバンドを集め、生成物を酢酸エチル
：メタノール（９０：１０）中に抽出する。これを蒸発させて乾燥し、ニトロゲ
ンー流出エタノール３０ｍｌに再溶解する。これは黄色の液体である。

【００５９】 収率：１８０ ｍＣｉ （ｉｖ）〔^３Ｈ〕ＧＷ−４８５８０１の分析 （ｉｉｉ）で得られた精製された生成物をＴＬＣ、ＨＰＬＣ、質量分光法およ
びＴ−ＮＭＲによって分析する。

【００６０】 ＴＬＣは、９９％の放射化学純度を示す。

【００６１】 ＨＰＬＣ９８．９％の放射化学純度を示す。

【００６２】 上記の両システムでは、放射性のピークは共に不活性なＧＷ−４８５８０１に
溶出される。

【００６３】 重量分光法では、２３Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性を示し、同位体分布は未標識が
１８．４％、１×^３Ｈが８１．６％である。放射性物質のスペクトルは、不活性
なＧＷ−４８５８０１のスペクトルに一致する。

【００６４】 Ｔ−ＮＭＲは、ＧＷ−４８５８０１のビニル位置の標識に相当する単一の標識
位置（ピークがリン原子にカップリングすることによって４つのシグナルに分割
する。）を示す。これは前駆体のアルデヒド−Ｈでの標識に相当する。

【００６５】 原料の一部は、ニトロゲンー流出エタノールで１ｍＣｉ／ｍｌに希釈され、１
×２ｍＣｉパックとして分配される。残りは、−２０℃（約１７０ｍＣｉ）で保
管される。

【００６６】 例 ６： ビオチン−Ｈｉｓ６―ＰＸＲ／ＲＸＲａ タンパク質 ヒトＰＸＲ（Genbank AF061056）のアミノ酸１３０−４３４を示すコード配列
は、ｐＲＳＥＴａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）に更にクローニング
される。Ｎ−末端ＰＣＲプライマー（ＭＫＫＧＨＨＨＨＨＨＧ）（配列番号１０
）由来の、ポリヒスチジンタグをコードする配列は、フレーム中で融合される。
得られたコードされたＨｉｓ６−ＰＸＲ配列は以下に示すとおりである。

【００６７】

【化９】 制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩがＢＢ５５０８（ｐＲＳＥＴａ）から
ＲＸＲαのアミノ酸２２５−４６２をコードするｃＤＮＡ断片を脱離するのに用
いられる。断片は、ｐＥＴ２４ａ発現プラスミド（Novagen）中にライゲートさ
れる。この構築物のＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｔ７プロモータ、ラクト
ースオペレーター、ＲＢＳおよびＲＸＲａ含有）は、ｐＡＣＹＣ１８４（ＢＢ５
１１４）のＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ部位（テトラサイクリン耐性を除去する
）にクローニングされる。このことにより、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で培養さ
れ、ＩＰＴＧで誘発されるとＴ７プロモータからＲＸＲαが発現される。得られ
たコードされたＲＸＲα配列は以下の通りである。

【００６８】

【化１０】 Ｈｉｓ６−ＰＸＲ／ｐＲＳＥＴａおよびＲＸＲα／ｐＡＣＹＣ１８４プラスミ
ドは、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株に同時形質転換される。０．０５ｍ
ｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．０５ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有す
る標準Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培養液を含む１リットル振とうフラ
スコ液体培養を、接種し、２２℃で２４時間培養する。細胞を０．０５ｍＭＩＰ
ＴＧで４〜６時間、２２℃で誘導し、次いで細胞を遠心分離（２０分、３５００
ｇ、４℃）にて取り出す。細胞ペレットを−８０℃で保管する。細胞ペレットを
２５０ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣｌｐＨ８．０、２５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、５０ｍＭイミダゾールｐＨ７．５）中に再懸濁する。細胞を３から５分
間、氷上で超音波処理し、細胞破片を遠心分離（４５分、２０，０００ｇ、４℃
）により取り除く。きれいにした上澄みを０．４５ｍＭフィルターを通して濾過
し、５０ｍｌＰｒｏＢｏｎｄ（Ｎｉ^＋＋荷電）キレート化樹脂（Invitorogen）
に充填する。緩衝液Ａで基線まで洗浄した後、カラムを１２５ｍＭイミダゾール
ｐＨ７．５を含有する緩衝液Ａで洗浄する。Ｈｉｓ６−ＰＸＲ／ＲＸＲα複合体
を、３００ｍＭイミダゾールｐＨ７．５を含有する緩衝液Ａによって、カラムか
ら溶離する。カラム留分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉ―ｐｒｅｐ３０Ｋ（Amicon）
ユニットを用いて濃縮する。タンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ―Ｃｌ、ｐＨ８
．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡｐＨ８．
０であらかじめ平衡にしたセファロースＳ−７５樹脂（Pharmacia）を充填した
カラム（２６ｍｍ×９０ｃｍ）を用いてサイズ除去する。カラム画分を前述した
ようにプ−ルし、濃縮する。精製されたＨｉｓ６−ＰＸＲ／ＲＸＲαは、ゲル濾
過によってＰＢＳに変化した緩衝液で処理し、平均総モルタンパク質質濃度４５
ｍＭとなる。５倍の総モル数の過剰なＮＨＳ―ＬＣ−ビオチン（Pierce）を最小
量のＰＢＳ中のこのタンパク質混合物に添加する。この溶液を穏やかな撹拌下、
６０分間室温で、およそ２３℃でインキュベートする。ビオチン化修飾反応は２
０００×過剰モル数のＴｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ８を添加すると停止する。ビオチ
ンーＨｉｓ６―ＰＸＲ／ＲＸＲαを、３種の緩衝液の変化に対して、即ち、それ
ぞれ少なくとも５０容量の、５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび２％スク
ロースを含有するＴＢＳｐＨ８で４℃にて透析する。ビオチンーＨｉｓ６−ＰＸ
Ｒ／ＲＸＲαを質量分析に付し、試薬による修飾の程度を明らかにする。ビオチ
ン化されたタンパク質溶液を凝結させ、−８０℃で保管する。

【００６９】 例 ７： ＰＸＲシンチレーションプロキシマティーアッセイ（ＳＰＡ） ストレプトアビジン―ＰＶＡ ＳＰＡビーズ（Amershampharmacia cat # RPNQ
0007）をアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ
ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含まない必
須脂肪酸）０．５ｍｇ／ｍｌ中に再懸濁する。ビオチン−Ｈｉｓ６−ＰＸＲ／Ｒ
ＸＲαをビーズに添加し、最終濃度を５０ｎＭとする。受容体を、３０分間、室
温でＳＰＡビーズに結合させる。未結合の受容体をＳＰＡビーズを３０００ｒｐ
ｍで５分間、Rupp&Bowman Silencer遠心分離機のスインギングバケットローター
中で遠心分離によって、除去する。次いで、ＳＰＡビーズでコートされた受容体
をアッセイ緩衝液中で再懸濁させて３．３ｍｇ／ｍｌとする。１００μｇ（３０
μＬ）のＳＰＡビーズでコートされた受容体を９６穴オプティプレート（Packar
d cat # 6005190）のそれぞれのウエルに添加する。それぞれのウエルには、最
終濃度では〔^３Ｈ〕ＧＷ−４８５８０１が含まれていて、０．５ｎＭから８００
ｎＭの間で変化する。非特異的な結合は１０μＭクロトリマゾールの添加によっ
て決定される。それぞれのウエルの総容量は１００μＬである。プレートはＴｏ
ｐＳｅａｌＡ（Packard cat # 6005185）で封じられ、完全に混合したことを確
認するまで、瞬間的に撹拌する。次いで、プレートを室温で、平衡になるまでイ
ンキュベートする。次いで、プレートをＴｏｐＣｏｕｎｔ液体シンチレーション
カウンター（Packard）上、^３Ｈ ＰＶＴ ＳＰＡで最適化されたプロトコール
を用いて計数する。クロトリマゾール非存在（Ｔサンプル）または存在下（ＮＳ
サンプル）の３つの部分からなるサンプルの平均をとり、特異的結合を式： 特異的結合＝Ｔ−ＮＳ によって、計数する。

【００７０】 特異的結合 vs.〔^３Ｈ〕ＧＷ−４８５８０１濃度のプロットを生じ（図６）、デ
ータが直角双曲線の式に適合する際には、非線形の回帰を用いてＫｄ値を決定す
る。

【００７１】 試験化合物を１０ｍＭ ＤＭＳＯに溶解し、アッセイ緩衝液中で連続的に希釈
する前にＤＭＳＯ中１：１０に希釈する。一般的には、化合物は１００μＭから
０．３ｎＭの範囲の濃度で試験される。ストレプトアビジンーＰＶＴ ＳＰＡビ
ーズ（AmershamPharmacia cat # RPNQ0007）はアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０，５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／
ｍｌウシ血清アルブミンを含まない必須脂肪酸）０．５ｍｇ／ｍｌに再懸濁され
る。ビオチンーＨｉｓ６−ＰＸＲ／ＲＸＲαをビーズに添加し、最終濃度を５０
ｎＭとする。受容体を３０分間、室温でＳＰＡビーズに結合させる。未結合の受
容体を、ＳＰＡビーズを３０００ｒｐｍで５分間、Ｒｕｐｐ＆Ｂｏｗｍａｎ Ｓ
ｉｌｅｎｃｅｒ遠心分離機のスインギングバケットローター中で遠心分離によっ
て、除去する。次いで、ＳＰＡビーズでコートされた受容体をアッセイ緩衝液中
で再懸濁させて３．３ｍｇ／ｍｌとする。１００μｇ（３０μＬ）のＳＰＡビー
ズでコートされた受容体を９６穴オプティプレート（Packard cat # 6005190）
のそれぞれのウエルに添加する。それぞれのウエルには、最終濃度では２５ｎＭ
の〔^３Ｈ〕ＧＷ−４８５８０１、および試験化合物またはアッセイ緩衝液と同量
が含まれている。非特異的結合は１０μＭクロトリマゾールの添加によって決定
される。それぞれのウエルの総容量は１００μＬである。プレートはＴｏｐＳｅ
ａｌＡ（Packard cat # 6005185）で封じられ、完全に混合したことを確認する
まで、瞬間的に撹拌する。次いで、プレートを室温で平衡になるまで、およそ１
．５時間インキュベートする。次いで、プレートをＴｏｐＣｏｕｎｔ液体シンチ
レーションカウンター（Packard）上、^３ＨＰＶＴ ＳＰＡで最適化されたプロ
トコールを用いて計数され、色が消えるまで訂正するようプログラムされる。「
％〔^３Ｈ〕ＧＷ−４８５８０１の範囲」の値は下記の式によって計算される；

【数１】 （式中、Ｃ_ＤＰＭは試験化合物を含有するウエルのＤＰＭ値、ＮＳ_ＤＰＭは１０
μＭクロトリマゾールを含有する「非特異的」ウエルの平均ＤＰＭ値、Ｔ_ＤＰＭ は、何も添加しない化合物を含有する「すべての」ウエルの平均ＤＰＭ値である
。％〔^３Ｈ〕ＧＷ−４８５８０１範囲 vs. 濃度のグラフは各試験化合物につい
て作製され、またＩＣ50値は非線形回帰を用いて決定された（表１参照）。

【００７２】

【表１】 上記の全ての記述は参照して、ここに組み込まれる。

【００７３】 ここでの開示を読めば、形式および詳細における種々の変更が、発明の主旨か
ら逸脱することなく実施されることが、当業者に明らかであろう。

【００７４】

【表２】

【表２】

【表２】

【表２】

【表２】

【表２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ−１】 ｈＰＸＲのヌクレオチド配列（配列番号１３）および予想されるアミノ酸配列
（配列番号１４）。図１Ａ〜１ＤはｈＰＸＲの分子クローニングを示している。

【図１Ａ−２】 ｈＰＸＲのヌクレオチド配列（配列番号１３）および予想されるアミノ酸配列
（配列番号１４）。

【図１Ｂ】 ｈＰＸＲ、ｍＰＸＲ１、Ｘｅｎｏｐｕｓのオーファン核内受容体１（ｘＯＮＲ
１）（Smith et al., Nucl. Acids Res. 22:66〜71(1994)）、およびヒトビタミ
ンＤ受容体（ｈＶＤＲ）間のアミノ酸配列比較。数字はＤＢＤおよびＬＢＤにお
けるアミノ酸同一性の割合を示す。

【図１Ｃ】 ｈＰＸＲクローンは機能的な核内受容体をコードする。トランスフェクション
アッセイを、ｈＰＸＲ ｃＤＮＡの野生型５’領域を含有するｐＳＧ５−ｈＰＸ
Ｒ発現ベクター、および４コピーのＣＹＰ３Ａ４ ＤＲ３ ＰＸＲＥを含有する
レポータープラスミドを用いて行った。細胞をビヒクル単独（０．１％のＤＭＳ
Ｏ）または１０μＭデキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテートで処理した。続いて
、細胞抽出物をＣＡＴ活性についてアッセイした。データ点は、二連で行ったア
ッセイの平均値を示す。

【図１Ｄ】 全長のｈＰＸＲの翻訳は非ＡＵＧコドンで開始される。インビトロでの転写お
よび翻訳を、ｈＰＸＲ ｃＤＮＡの野生型５’領域を含有するｐＳＧ５−ｈＰＸ
Ｒ発現ベクター、またはヌクレオチド位３０４〜３０６のＣＵＧコドンがＡＵＧ
に改変されているｐＳＧ５−ｈＰＸＲ ＡＵＧを用いて行った。いずれかのテン
プレートが使用されたときに合成された５０ｋＤの産物を白抜き矢印および星印
で示す。ＤＢＤ内のメチオニン−５６またはメチオニン−６９での翻訳開始を示
していると考えられる２つのより短い産物を黒矢印で示す。少ない量で存在する
より大きな翻訳産物を曲がった矢印で示す。サイズマーカー（ｋＤ単）を左側に
示す。

【図２】 成体組織におけるｈＰＸＲ発現パターンのノーザンブロット分析（左から右に
、心臓（１）、脳（２）、胎盤（３）、肺（４）、肝臓（５）、骨格筋（６）、
腎臓（７）、膵臓（８）、脾臓（９）、胸腺（１０）、前立腺（１１）、精巣（
１２）、卵巣（１３）、小腸（１４）、結腸（１５）、ＰＢＬ（１６）。ＲＮＡ
サイズマーカー（ｋｂ単位）を左側に示す。 図３Ａ〜３Ｃ：ｈＰＸＲはＣＹＰ３Ａ４プロモータ内のＩＲ６エレメントを介
して転写を活性化する。

【図３Ａ】 ＣＶ−１細胞を、ｐＳＧ５−ｈＰＸＲ ＡＴＧ発現プラスミドの存在下（＋）
または非存在下（−）のいずれかで（ＩＲ６）_３−ｔｋ−ＣＡＴレポータープラ
スミドで同時トランスフェクションして、ビヒクル単独（白棒）または１０μＭ
デキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテート（黒棒）で処理した。続いて、細胞抽出
物をＣＡＴ活性についてアッセイした。データは、三連で行ったアッセイの平均
値＋／−標準偏差を示す。

【図３Ｂ】 バンドシフトアッセイにおける使用オリゴヌクレオチド。核内受容体ハーフ−
部位モチーフの位置および変異を示す。

【図３Ｃ】 バンドシフトアッセイを、ＣＹＰ３Ａ４ ＩＲ６ ＰＸＲＥおよびｈＰＸＲと
、ｈＰＸＲ（上段）またはｍＰＸＲ１（下段）のいずれかとを含有する放射能標
識したオリゴヌクレオチドを用いて行った。未標識の競合剤オリゴヌクレオチド
を示されているように１０倍または５０倍のモル過剰量で加えた。 図４Ａ〜４Ｃ：ｈＰＸＲは、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現の構造的に異なる誘導
剤により活性化される。

【図４Ａ】 ＣＶ−１細胞を、ｐＳＧ５−ｈＰＸＲ ＡＴＧ発現プラスミドまたはｐＳＧ５
−ｍＰＸＲ１発現プラスミドおよび（ＩＲ６）_３−ｔｋ−ＣＡＴレポーターを用
いて（それぞれ、左側および中央）、あるいはＲＳ−ｈＧＲ発現プラスミド（Gi
guere et al., Cell 46:645〜652(1986)）と、ｔｋ−ＣＡＴの上流に位置するコ
ンセンサスグルココルチコイド応答エレメントを２コピー含有するレポーターと
を用いて（右側）トランスフェクションした。細胞を１μＭのメバスタチンまた
はロバスタチン、１００μＭのフェノバルビタールあるいは１０μＭの他の化合
物で処理した。続いて、細胞抽出物をＣＡＴ活性についてアッセイした。データ
は、三連で行ったアッセイの平均値＋／−標準偏差を示す。

【図４Ｂ】 ｈＰＸＲを活性化する代表的な化合物の構造を示す。

【図４Ｃ】 ＣＡＲＬＡを、細菌で発現させたＧＳＴ−ｈＰＸＲまたはＧＳＴ−ｍＰＸＲ１
、およびインビトロ合成した［^３５Ｓ］ＳＲＣ１．１４を用いて行った。［^３５ Ｓ］ＳＲＣ１．１４を、ビヒクル単独（１）（１％のＤＭＳＯ）あるいは１０μ
Ｍのデキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテート（２）、リファンピシン（３）また
はクロトリマゾール（４）の存在下、ＧＳＴ−ｈＰＸＲまたはＧＳＴ−ｍＰＸＲ
１のいずれかと混合した。ＧＳＴ−ｈＰＸＲ（上段）またはＧＳＴ−ｍＰＸＲ１
（下段）との複合体を形成した［^３５Ｓ］ＳＲＣ１．１４をグルタチオン−セフ
ァロースビーズで沈澱させた。

【図５】 ［^３Ｈ］ＧＷ−４８５８０１を製造するための反応スキーム。

【図６】 ［^３Ｈ］ＧＷ−４８５８０１濃度に対する特異的結合のプロット。Ｋｄ＝３７
０ｎＭ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/566 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 クリーワー、スティーブン・アンソニー アメリカ合衆国 ノース・カロライナ州 27709 リサーチ・トライアングル・パー ク、ピー・オー・ボックス 13398、ファ イブ・ムーア・ドライブ（番地なし）、グ ラクソ・ウェルカム・インコーポレーテッ ド内 (72)発明者 ウィルソン、ティモシー・マーク アメリカ合衆国 ノース・カロライナ州 27709−3398 リサーチ・トライアング ル・パーク、ピー・オー・ボックス 13398、ファイブ・ムーア・ドライブ（番 地なし）、グラクソ・ウェルカム・インコ ーポレーテッド内 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB07 4B024 AA11 BA63 CA04 CA11 DA02 DA06 EA04 FA02 FA10 GA11 GA13 GA18 GA19 4B063 QA01 QA18 QQ61 QR33 QR41 QR58 QR60 QR77 QR80 QS05 QS36 QX01 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 BA02 BA05 BD15 BD17 BD18 CA24 CA46 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA50 EA50 FA74 GA10 GA15 GA22 GA26

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 チトクロームP-450モノオキシゲナーゼプロモータに結合す
   る単離されたヒト核内受容体、またはそのDNA結合ドメインもしくはリガンド結
   合ドメイン。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の受容体であって、前記プロモータはチトク
   ロームP-450モノオキシゲナーゼ3A4（CYP3A4）プロモータである受容体。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の受容体であって、前記受容体はhPXRである
   受容体。
4. 【請求項４】 図１に示したアミノ酸配列を有する単離されたヒト核内受容
   体、または少なくとも30の連続的なアミノ酸配列のその断片。
5. 【請求項５】 hPXRおよび非hPXR誘導された配列のDNA結合性またはリガン
   ド結合性ドメインを含む融合タンパク質。
6. 【請求項６】 請求項１もしくは４のタンパク質または請求項５の融合タン
   パク質をコードする配列を具備する単離された核酸。
7. 【請求項７】 請求項６の核酸およびベクターを含む構築物。
8. 【請求項８】 請求項７の構築物を含むホスト細胞。
9. 【請求項９】 請求項３の受容体またはその断片を製造する方法であって： プロモータに動作可能に連結された、前記受容体またはその断片をコードする
   配列を具備する発現構築物を含むホスト細胞を、前記受容体またはその断片が産
   生される条件下で培養することと； 前記受容体またはその断片を単離することとを包含する方法。
10. 【請求項１０】 CYP3A4遺伝子発現を誘導する能力について被検化合物をス
    クリーニングする方法であって： ｉ）前記被検化合物を、hPXRのリガンド結合ドメインと接触させることと； ｉｉ）前記被検化合物が前記リガンドドメインに結合するかどうかを決定する
    こととを具備し、 前記被検化合物の前記リガンド結合ドメインへの結合が、CYP3A4遺伝子発現を
    誘導する化合物の指標である方法。
11. 【請求項１１】 hPXRを活性化または阻害する能力について被検化合物をス
    クリーニングする方法であって： ｉ）ＤＮＡ結合ドメインおよびhPXRリガンド結合ドメインをコードする配列を
    具備した発現ベクターを調製することと； ｉｉ）レポーター遺伝子に動作可能に連結され、前記ＤＮＡ結合ドメインによ
    って認識される前記ＤＮＡ結合部位を含むレポーター構築物を調製することと； ｉｉｉ）前記は発現ベクターおよび前記レポーター構築物を、適合性ホスト細
    胞に導入することと； ｉｖ）工程（ｉｉｉ）から得られる前記細胞を、前記被検化合物と共にインキ
    ュベートすることと； ｖ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを決定することとを具備し、 前記被検化合物の存在下における前記レポーター遺伝子の発現の増大は、前記
    被検化合物がhPXRを活性化できることを示し、 前記被検化合物の存在下における前記レポーター遺伝子の発現の阻害は、前記
    被検化合物がhPXRを阻害できることを示す方法。
12. 【請求項１２】 請求項１０の方法によって同定された、CYP3A4を誘導する
    化合物。
13. 【請求項１３】 請求項１１の方法によって同定された、hPXRを活性化する
    化合物。
14. 【請求項１４】 PXRによって媒介される細胞の機能を調節する方法であっ
    て、前記細胞と請求項１１の方法を用いて同定されたPXRを活性化する化合物と
    を、前記活性化が行われ且つそれにより前記機能が調節される条件下で接触させ
    ることを具備した方法。
15. 【請求項１５】 PXRによって媒介される細胞の機能を調節する方法であっ
    て、前記細胞と請求項１１の方法を用いて同定されたPXRを阻害する化合物とを
    、前記阻害が行われ且つそれにより前記機能が調節される条件下で接触させるこ
    とを具備した方法。
16. 【請求項１６】 請求項１４または１５に記載の方法であって、前記化合物
    は次式Ｉの化合物である方法。 【化１】 ここで、R1、R2、R3およびR4は、独立に、直鎖または分岐鎖のC1〜C6アルキル
    である。
17. 【請求項１７】 請求項１４または１５に記載の方法であって、前記細胞は
    培養細胞である方法。
18. 【請求項１８】 請求項１４または１５に記載の方法であって、前記細部は
    組織内に存在する方法。
19. 【請求項１９】 請求項１５または１５に記載の方法であって、前記細胞は
    動物中に存在する方法。
20. 【請求項２０】 特定の疾患または症状をPXRの調節と関連させるための方
    法であって、 PXRに特異的に結合する化合物を、該結合が行われ且つPXRにより媒介される細
    胞の機能的活性がPXRによって調節される条件下で、前記細胞中に存在するPXRに
    接触させることと、 前記機能的活性の調節を検出し、該機能的活性の調節を或る疾患または症状と
    関連させることにより、該疾患または症状をPXRの調節と関連させることとを具
    備した方法。
21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の方法であって、前記化合物は次式Ｉの
    化合物である方法。 【化２】 ここで、R1、R2、R3およびR4は、独立に、直鎖または分岐鎖のC1〜C6アルキル
    である。
22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法であって、前記化合物はGW-48580
    1である方法。
23. 【請求項２３】 請求項２０の方法によりPXRの調節と関連させられた疾患
    または症状を予防または治療する方法であって、それを必要としている患者に対
    して、前記予防または治療が行われるようにPXRの活性を調節する治療的に有効
    な量の薬剤を投与することを具備した方法。
24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の方法であって、前記薬剤はGW-485801
    である方法。