JP2003530884A - 癌診断用プライマー - Google Patents
癌診断用プライマーInfo
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＭＡＧＥまたはＧＡＧＥを癌診断マーカーとして選択し、ＲＴ−ＰＣＲによってこれらの癌診断マーカーの多様なsubtypeを同時に検出できる、癌診断率及び癌診断の特異性が高い共同プライマーを提供する。
【解決手段】 このプライマーは、配列番号３乃至配列番号１０から選択され、好ましくは、配列番号３乃至配列番号１０から選択された２つの配列からなる。また、配列番号３乃至配列番号１０から選択されたプライマーを用い、好ましくは、配列番号３乃至配列番号１０から選択された２つの配列からなる共同プライマーを用いて、癌を診断する。また、癌診断用キットは、配列番号３乃至配列番号１０から選択されたプライマー及びＰＣＲ試薬を含み、好ましくは、配列番号３乃至配列番号１０から選択された２つの配列からなる共同プライマー及びＰＣＲ試薬を含む。
Description
【０００１】
本発明は、癌診断用プライマー（Primer for Diagnosis of One or More kind
s of Cancer）及びこれを含有する癌診断剤に関するものである。特に、本発明
はＭＡＧＥ−１からＭＡＧＥ−６までの６つのＭＡＧＥ subtypeまたはＧＡＧＥ
−１からＧＡＧＥ−８までの８つのsubtypeを同時に検出できる共同プライマー
及びこれを含む癌診断剤に関するものである。
s of Cancer）及びこれを含有する癌診断剤に関するものである。特に、本発明
はＭＡＧＥ−１からＭＡＧＥ−６までの６つのＭＡＧＥ subtypeまたはＧＡＧＥ
−１からＧＡＧＥ−８までの８つのsubtypeを同時に検出できる共同プライマー
及びこれを含む癌診断剤に関するものである。
【０００２】
癌の診断は身体検診、Ｘ−ray及びＣＴ、組織学的検査などを通じて行われて
きた。しかし、このような方法は初期癌、微細癌または陽性腫瘍と鑑別が難しい
場合には適合しない。
きた。しかし、このような方法は初期癌、微細癌または陽性腫瘍と鑑別が難しい
場合には適合しない。
【０００３】
最近開発された分子生物学的診断方法は、癌診断の特異性及び敏感度が高く、
癌診断分野で多くの発展を成している。
癌診断分野で多くの発展を成している。
【０００４】
分子生物学的診断技術として最も広く使用される方法は、重合酵素連鎖反応（
polymerase chain reaction, ＰＣＲ）または逆転写−重合酵素連鎖反応（rever
se transcriptase−ＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲ）であって、このような各方法は検体
の異常遺伝子または癌抗原遺伝子などを増幅させて検出する方法である。
polymerase chain reaction, ＰＣＲ）または逆転写−重合酵素連鎖反応（rever
se transcriptase−ＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲ）であって、このような各方法は検体
の異常遺伝子または癌抗原遺伝子などを増幅させて検出する方法である。
【０００５】
ＲＴ−ＰＣＲは、特定遺伝子で発現されたｍＲＮＡを検出する方法であって、
癌抗原遺伝子の発現性を検査して癌を診断するのに使用することができる。 ＲＴ−ＰＣＲ法で癌を診断するにおいて最も重要な事項は、検出する癌診断用
目的遺伝子（以下“癌診断マーカー”とする）を選定することであり、１つの癌
診断マーカーを検出するのが一般的である。
癌抗原遺伝子の発現性を検査して癌を診断するのに使用することができる。 ＲＴ−ＰＣＲ法で癌を診断するにおいて最も重要な事項は、検出する癌診断用
目的遺伝子（以下“癌診断マーカー”とする）を選定することであり、１つの癌
診断マーカーを検出するのが一般的である。
【０００６】
癌診断マーカーとしての要件は、癌で特異に発現され、できるだけ多くの癌で
多量に発現されるものほど良い。
多量に発現されるものほど良い。
【０００７】
ＭＡＧＥ（Melanoma antigen gene）とＧＡＧＥは、癌関連睾丸抗原（cancer-
associated testis antigen）の一種として様々な種類の癌組織で発現され、睾
丸を除外したその他の正常組織では発現されない。
associated testis antigen）の一種として様々な種類の癌組織で発現され、睾
丸を除外したその他の正常組織では発現されない。
【０００８】
ＭＡＧＥは黒色腫で初めて発見された後、様々な研究で胃癌（非特許文献１、
非特許文献２）、食道癌（非特許文献３）、大腸癌（非特許文献４）、肺癌（非
特許文献５）、乳癌（非特許文献６、非特許文献７）、肝臓癌（非特許文献８）
、白血病（非特許文献９）、神経芽細胞腫（非特許文献１０）、卵巣癌（非特許
文献１１）等多くの癌で発現されていることが明らかにされてきており、ＧＡＧ
Ｅは黒色腫、肉腫、小細胞癌腫、頭頸部癌、膀胱癌、卵巣癌等で発現されると報
告されている（非特許文献１１、非特許文献１２）。
非特許文献２）、食道癌（非特許文献３）、大腸癌（非特許文献４）、肺癌（非
特許文献５）、乳癌（非特許文献６、非特許文献７）、肝臓癌（非特許文献８）
、白血病（非特許文献９）、神経芽細胞腫（非特許文献１０）、卵巣癌（非特許
文献１１）等多くの癌で発現されていることが明らかにされてきており、ＧＡＧ
Ｅは黒色腫、肉腫、小細胞癌腫、頭頸部癌、膀胱癌、卵巣癌等で発現されると報
告されている（非特許文献１１、非特許文献１２）。
【０００９】
従って、ＭＡＧＥとＧＡＧＥは、単一種の癌ではなく様々な種類の癌を検出す
ることができるし、癌胚芽性抗原（carcinoembryonic antigen）等相違する癌関
連抗原より癌組織発現の特異性が高いため、癌診断マーカーとして活用性が非常
に高い。
ることができるし、癌胚芽性抗原（carcinoembryonic antigen）等相違する癌関
連抗原より癌組織発現の特異性が高いため、癌診断マーカーとして活用性が非常
に高い。
【００１０】
また、ＭＡＧＥとＧＡＧＥはsubtype間に遺伝子の同質性が高くてＭＡＧＥの
約１８種のsubtypeは約５６％から９９％に至る同質性を持ち（非特許文献１３
）、ＧＡＧＥの８種のsubtypeは８２％から９９％に至る同質性を持つ（非特許
文献１３）。従って、このような同一塩基配列部位をプライマーとして使用すれ
ば、ＲＴ−ＰＣＲ時に多数のＭＡＧＥまたはＧＡＧＥ subtypeを同時に検出する
ようになり、癌診断率を更に高めることができるようになる。
約１８種のsubtypeは約５６％から９９％に至る同質性を持ち（非特許文献１３
）、ＧＡＧＥの８種のsubtypeは８２％から９９％に至る同質性を持つ（非特許
文献１３）。従って、このような同一塩基配列部位をプライマーとして使用すれ
ば、ＲＴ−ＰＣＲ時に多数のＭＡＧＥまたはＧＡＧＥ subtypeを同時に検出する
ようになり、癌診断率を更に高めることができるようになる。
【００１１】
上記のような問題点を解決するための本発明の目的は、ＭＡＧＥまたはＧＡＧ
Ｅを癌診断マーカーとして選択し、ＲＴ−ＰＣＲによってこれらの癌診断マーカ
ーの多様なsubtypeを同時に検出できる、癌診断率及び癌診断の特異性が高い共
同プライマーを提供することである。
Ｅを癌診断マーカーとして選択し、ＲＴ−ＰＣＲによってこれらの癌診断マーカ
ーの多様なsubtypeを同時に検出できる、癌診断率及び癌診断の特異性が高い共
同プライマーを提供することである。
【００１２】
上記の目的を達成するために、本発明の好適実施例によれば、配列番号３乃至
配列番号１０から選択されたことを特徴とするプライマーが提供される。 本発明の他の好適実施例によれば、配列番号３乃至配列番号１０から選択され
た２つの配列からなることを特徴とする共同プライマーが提供される。 本発明の他の好適実施例によれば、配列番号３乃至配列番号１０から選択され
たプライマーを用いて癌を診断することを特徴とする方法が提供される。 本発明の他の好適実施例によれば、配列番号３乃至配列番号１０から選択され
た２つの配列からなる共同プライマーを用いて癌を診断することを特徴とする方
法が提供される。 本発明の他の好適実施例によれば、配列番号３乃至配列番号１０から選択され
たプライマー及びＰＣＲ試薬を含むことを特徴とする癌診断用キットが提供され
る。 本発明の他の好適実施例によれば、配列番号３乃至配列番号１０から選択され
た２つの配列からなる共同プライマー及びＰＣＲ試薬を含むことを特徴とする癌
診断用キットが提供される。
配列番号１０から選択されたことを特徴とするプライマーが提供される。 本発明の他の好適実施例によれば、配列番号３乃至配列番号１０から選択され
た２つの配列からなることを特徴とする共同プライマーが提供される。 本発明の他の好適実施例によれば、配列番号３乃至配列番号１０から選択され
たプライマーを用いて癌を診断することを特徴とする方法が提供される。 本発明の他の好適実施例によれば、配列番号３乃至配列番号１０から選択され
た２つの配列からなる共同プライマーを用いて癌を診断することを特徴とする方
法が提供される。 本発明の他の好適実施例によれば、配列番号３乃至配列番号１０から選択され
たプライマー及びＰＣＲ試薬を含むことを特徴とする癌診断用キットが提供され
る。 本発明の他の好適実施例によれば、配列番号３乃至配列番号１０から選択され
た２つの配列からなる共同プライマー及びＰＣＲ試薬を含むことを特徴とする癌
診断用キットが提供される。
【００１３】
本発明は、ＲＴ−ＰＣＲにおいてＭＡＧＥｓまたはＧＡＧＥｓの多様なsubtyp
eを同時に増幅させてこれらの遺伝子を検出することによって、癌を診断できる
プライマーとこれを含有する癌診断剤を提供する。
eを同時に増幅させてこれらの遺伝子を検出することによって、癌を診断できる
プライマーとこれを含有する癌診断剤を提供する。
【００１４】
多数のＭＡＧＥ及びＧＡＧＥ subtypeを同時に検出するために、これら多様な
subtypeの遺伝子配列を比較して共同プライマーを製作した。 プライマーの製作は、GenBankに登録された１２種のＭＡＧＥ遺伝子と８種の
ＧＡＧＥ遺伝子情報をさがした後、各遺伝子の塩基配列を互いに比較してＤＮＡ
の同質性を分析し、同質性の高い部位を選択して製造した。製造した共同プライ
マーは次の通りである（表１）。
subtypeの遺伝子配列を比較して共同プライマーを製作した。 プライマーの製作は、GenBankに登録された１２種のＭＡＧＥ遺伝子と８種の
ＧＡＧＥ遺伝子情報をさがした後、各遺伝子の塩基配列を互いに比較してＤＮＡ
の同質性を分析し、同質性の高い部位を選択して製造した。製造した共同プライ
マーは次の通りである（表１）。
【００１５】
【表１】
【００１６】
配列番号１／２は、ＭＡＧＥに対するプライマーであるが、ＰＣＲを実施して
偽陽性反応が現れた。偽陽性反応が現れた理由は、これらのプライマーの位置が
一つのエクソン内にあるため、汚染されているgenomic ＤＮＡから遺伝子が増幅
された可能性が高いものと考えられる。
偽陽性反応が現れた。偽陽性反応が現れた理由は、これらのプライマーの位置が
一つのエクソン内にあるため、汚染されているgenomic ＤＮＡから遺伝子が増幅
された可能性が高いものと考えられる。
【００１７】
配列番号３／４及び配列番号５／６は、ＭＡＧＥに対するプライマーである。
配列番号３と配列番号５は、２つのエクソンの境界部に位置するプライマーで、
配列番号３／４及び配列番号５／６を使用したＰＣＲ及びnested ＰＣＲ上では
偽陽性反応が現れなかった。これは配列番号３と配列番号５がgenomic ＤＮＡに
は結合しないためである。
配列番号３と配列番号５は、２つのエクソンの境界部に位置するプライマーで、
配列番号３／４及び配列番号５／６を使用したＰＣＲ及びnested ＰＣＲ上では
偽陽性反応が現れなかった。これは配列番号３と配列番号５がgenomic ＤＮＡに
は結合しないためである。
【００１８】
配列番号７／８及び配列番号９／１０は、ＧＡＧＥに対するプライマーである
。配列番号７と配列番号８または配列番号９と配列番号１０がそれぞれ相違する
エクソンに位置しており、配列番号７／８及び配列番号９／１０を使用した実験
で偽陽性反応がなかった。これはこのエクソン間に長いイントロンが挟まれてい
るためである。
。配列番号７と配列番号８または配列番号９と配列番号１０がそれぞれ相違する
エクソンに位置しており、配列番号７／８及び配列番号９／１０を使用した実験
で偽陽性反応がなかった。これはこのエクソン間に長いイントロンが挟まれてい
るためである。
【００１９】
癌診断のために使用した細胞株は、人の胃癌細胞株（ＳＮＵ４８４、ＳＮＵ６
３８、ＳＮＵ６６８）、頭頸部癌細胞株（ＡＭＣ−ＨＮ−３、ＡＭＣ−ＨＮ−４
、ＡＭＣ−ＨＮ−７）、子宮頸癌細胞株（HeLa、Caski）、肺癌細胞株（ＮＣＩ
Ｈ１７０３、ＮＣＩＨ５２２）、大腸癌細胞株（ＨＴ２９）、転移性前立腺癌細
胞株（ＬＮ．ＣＡＰ）、前骨髓球性白血病（promyelocytic leukemia）（ＨＬ６
０）及び骨肉腫細胞部（ＳａＯＳ２）を使用した。人体の癌組織及び細胞は、乳
癌１２例、頭頸部上皮細胞癌２７例、胃癌５例、甲状腺癌３例、リンパ腫３例、
アデノイド嚢腫１例、肉腫１例、皮膚繊維肉腫１例、悪性混合腫瘍１例、膀胱癌
患者の小便細胞９例、胃癌患者の腹腔細胞１５例を使用した。対照用である陽性
癌組織及び細胞は、頭頸部陽性癌１８例、正常血液白血球１０例、正常及び泌尿
器炎症患者の小便細胞１０例を使用した。 各種癌組織は、使用前まで−７０℃に保管してから、組織にＲＮＡzol Ｂ（Te
l-Test Inc., U. S. A.）を加えた後、組織粉砕機で組織を粉砕した。
３８、ＳＮＵ６６８）、頭頸部癌細胞株（ＡＭＣ−ＨＮ−３、ＡＭＣ−ＨＮ−４
、ＡＭＣ−ＨＮ−７）、子宮頸癌細胞株（HeLa、Caski）、肺癌細胞株（ＮＣＩ
Ｈ１７０３、ＮＣＩＨ５２２）、大腸癌細胞株（ＨＴ２９）、転移性前立腺癌細
胞株（ＬＮ．ＣＡＰ）、前骨髓球性白血病（promyelocytic leukemia）（ＨＬ６
０）及び骨肉腫細胞部（ＳａＯＳ２）を使用した。人体の癌組織及び細胞は、乳
癌１２例、頭頸部上皮細胞癌２７例、胃癌５例、甲状腺癌３例、リンパ腫３例、
アデノイド嚢腫１例、肉腫１例、皮膚繊維肉腫１例、悪性混合腫瘍１例、膀胱癌
患者の小便細胞９例、胃癌患者の腹腔細胞１５例を使用した。対照用である陽性
癌組織及び細胞は、頭頸部陽性癌１８例、正常血液白血球１０例、正常及び泌尿
器炎症患者の小便細胞１０例を使用した。 各種癌組織は、使用前まで−７０℃に保管してから、組織にＲＮＡzol Ｂ（Te
l-Test Inc., U. S. A.）を加えた後、組織粉砕機で組織を粉砕した。
【００２０】
培養した癌細胞株は、培養培地を完全に除去して生理食塩水で洗浄した後、Ｒ
ＮＡzol Ｂを入れて細胞を溶解させた。胃癌の腹腔細胞は、開腹後に腹腔細胞を
回収した後、ＲＮＡzol Ｂを加えて混合した。正常血液の白血球細胞は、血液か
ら有核細胞だけを回収した後、ＲＮＡzol Ｂを加えて細胞を完全に溶かした。小
便細胞は、小便から細胞を回収した後、ＲＮＡzol Ｂを加えて混合した。
ＮＡzol Ｂを入れて細胞を溶解させた。胃癌の腹腔細胞は、開腹後に腹腔細胞を
回収した後、ＲＮＡzol Ｂを加えて混合した。正常血液の白血球細胞は、血液か
ら有核細胞だけを回収した後、ＲＮＡzol Ｂを加えて細胞を完全に溶かした。小
便細胞は、小便から細胞を回収した後、ＲＮＡzol Ｂを加えて混合した。
【００２１】
各種組織及び細胞が溶解されたＲＮＡzol Ｂ溶液からＲＮＡ分離は、イム・ハ
ク等（非特許文献１４）の方法に従った。
ク等（非特許文献１４）の方法に従った。
【００２２】
喀痰は、同量のstabilizer（Roche Diagnostics, Mahnheim, Germany）を添加
して振とう混合して完全に液化させた後、ｍＲＮＡ分離試薬（Roche Diagnostic
s, Mahnheim, Germany）を利用してｍＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲに用い
た。
して振とう混合して完全に液化させた後、ｍＲＮＡ分離試薬（Roche Diagnostic
s, Mahnheim, Germany）を利用してｍＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲに用い
た。
【００２３】
本発明の共同プライマーを利用して癌を診断するにはＰＣＲを利用できる。患
者の各種癌組織、喀痰、血液、小便、腹腔細胞などから総ＲＮＡまたはｍRＮＡ
を抽出した後、逆転写反応を実施してｃＤＮＡを生産する。ｃＤＮＡに本発明の
共同プライマー（配列番号１、２または配列番号３、４または配列番号７、８）
を用いたＰＣＲを実施してＭＡＧＥ１−６またはＧＡＧＥ１−８を増幅させる、
１次ＰＣＲ産物に本発明の共同プライマー（配列番号５、６または配列番号９、
１０）を用いた２次ＰＣＲ（nested ＰＣＲ）を実施した後、ＰＣＲ産物を電気
永動してＭＡＧＥ１−６またはＧＡＧＥ１−８ ＤＮＡ bandを検出することによ
って多種類の癌を同時に診断することができる。 本発明では、ＭＡＧＥ１−６またはＧＡＧＥ１−８を増幅または発現させる方
法としてＰＣＲを用いたが、ＰＣＲは実験者が試薬または周期などを変形して多
様な応用が可能であるところ、本明細書に記載されたところに限定されるもので
はなく、本発明の共同プライマーを利用してＭＡＧＥ１−６またはＧＡＧＥ１−
８を増幅または発現させる多様な方法が含まれる。
者の各種癌組織、喀痰、血液、小便、腹腔細胞などから総ＲＮＡまたはｍRＮＡ
を抽出した後、逆転写反応を実施してｃＤＮＡを生産する。ｃＤＮＡに本発明の
共同プライマー（配列番号１、２または配列番号３、４または配列番号７、８）
を用いたＰＣＲを実施してＭＡＧＥ１−６またはＧＡＧＥ１−８を増幅させる、
１次ＰＣＲ産物に本発明の共同プライマー（配列番号５、６または配列番号９、
１０）を用いた２次ＰＣＲ（nested ＰＣＲ）を実施した後、ＰＣＲ産物を電気
永動してＭＡＧＥ１−６またはＧＡＧＥ１−８ ＤＮＡ bandを検出することによ
って多種類の癌を同時に診断することができる。 本発明では、ＭＡＧＥ１−６またはＧＡＧＥ１−８を増幅または発現させる方
法としてＰＣＲを用いたが、ＰＣＲは実験者が試薬または周期などを変形して多
様な応用が可能であるところ、本明細書に記載されたところに限定されるもので
はなく、本発明の共同プライマーを利用してＭＡＧＥ１−６またはＧＡＧＥ１−
８を増幅または発現させる多様な方法が含まれる。
【００２４】
以上で説明したように、本発明では、本発明の共同プライマーとＰＣＲ試薬を
共に含む癌診断用キットを提供することもできる。
共に含む癌診断用キットを提供することもできる。
【００２５】
以下、実施例を通じて、本発明をより一層詳細に説明するが、実施例によって
本発明の内容が限定されるものではない。
本発明の内容が限定されるものではない。
【００２６】
〔実施例１〕
<ＭＡＧＥｓ及びＧＡＧＥｓ遺伝子分析とプライマーの製作>
GenBankに登録された１２種のＭＡＧＥ遺伝子と６種のＧＡＧＥ遺伝子情報を
さがした後、まずＤＮＡsis programを利用して遺伝子塩基配列を比較分析した
。ＭＡＧＥ種の遺伝子（ｃＤＮＡ）の同質性は５６％−９９％、ＧＡＧＥ種の遺
伝子（ｃＤＮＡ）の同質性は８２％−９９％の間に示された。各subtypeの塩基
配列が同じ部位をプライマーとしてデザインした。
さがした後、まずＤＮＡsis programを利用して遺伝子塩基配列を比較分析した
。ＭＡＧＥ種の遺伝子（ｃＤＮＡ）の同質性は５６％−９９％、ＧＡＧＥ種の遺
伝子（ｃＤＮＡ）の同質性は８２％−９９％の間に示された。各subtypeの塩基
配列が同じ部位をプライマーとしてデザインした。
【００２７】
プライマー合成材料であるｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰと合成用
カラムを自動ＤＮＡ合成器（PerSeptive Biosystem社のExpedidite ＴＭ Nuclei
c Acid Synthesis System）に装着して合成する配列を入力させた後、合成を完
了した。合成したプライマーをアンモニア処理過程と精製過程を経てから、紫外
線分光光度計（ＵＶ spectrophotometer）で濃度を測定して使用した。
カラムを自動ＤＮＡ合成器（PerSeptive Biosystem社のExpedidite ＴＭ Nuclei
c Acid Synthesis System）に装着して合成する配列を入力させた後、合成を完
了した。合成したプライマーをアンモニア処理過程と精製過程を経てから、紫外
線分光光度計（ＵＶ spectrophotometer）で濃度を測定して使用した。
【００２８】
製作したプライマーは表１の通りである。
配列番号１と配列番号２（配列番号１／２）、配列番号３と配列番号４（配列
番号３／４）は、ＭＡＧＥプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲまたは１次ＰＣＲに使
用し、配列番号５と配列番号６（配列番号５／６）は２次ＰＣＲ（nested ＰＣ
Ｒ）に使用した。
番号３／４）は、ＭＡＧＥプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲまたは１次ＰＣＲに使
用し、配列番号５と配列番号６（配列番号５／６）は２次ＰＣＲ（nested ＰＣ
Ｒ）に使用した。
【００２９】
配列番号７と配列番号８（配列番号７／８）及び配列番号９と配列番号１０（
配列番号９／１０）は、ＧＡＧＥ検出のためのプライマーとして、配列番号７／
８はＲＴ−ＰＣＲまたは１次ＰＣＲに使用し、配列番号９／１０はnested ＰＣ
Ｒに使用した。
配列番号９／１０）は、ＧＡＧＥ検出のためのプライマーとして、配列番号７／
８はＲＴ−ＰＣＲまたは１次ＰＣＲに使用し、配列番号９／１０はnested ＰＣ
Ｒに使用した。
【００３０】
〔実施例２〕
<総ＲＮＡ分離>
各種癌組織は使用前まで−７０℃に保管した。組織にＲＮＡzol Ｂ（Tel-Test
Inc., U. S. A）を１−２ml加えた後、組織粉砕機で組織を粉砕した。培養した
癌細胞株は、培養培地を完全に除去して生理食塩水で１回洗浄してから、ＲＮＡ
zol Ｂを入れて細胞を分離した。胃癌の腹腔細胞は、開腹後、腹腔下部に生理食
塩水を１００ml入れて腹腔細胞を回収した後、１２００rpmで５分間遠心して腹
腔細胞を回収した。細胞をリン酸塩緩衝液（phosphate buffered saline, ＰＢ
Ｓ）で１回洗浄した後、細胞沈殿物をＲＮＡzol Ｂに加えて混合した。正常血液
の白血球分離は、まず抗凝固剤の入った血液５ｍｌに滅菌蒸溜水（ＤＥＰＣ−Ｄ
Ｗ）を２０ml加えて１７秒間置いた後、２倍の濃度のリン酸塩緩衝溶液を２０ml
加えて混合した後、１２００rpmで５分間遠心して有核細胞だけを回収した。回
収した細胞にＲＮＡzol Ｂを１ml加えて細胞を完全に溶かした。小便細胞は、小
便１５０mlを回収した後、遠心して細胞を回収した。ここにリン酸塩緩衝溶液を
入れて細胞を１回洗浄した後、細胞にＲＮＡzol Ｂ １mlを加えて混合した。
Inc., U. S. A）を１−２ml加えた後、組織粉砕機で組織を粉砕した。培養した
癌細胞株は、培養培地を完全に除去して生理食塩水で１回洗浄してから、ＲＮＡ
zol Ｂを入れて細胞を分離した。胃癌の腹腔細胞は、開腹後、腹腔下部に生理食
塩水を１００ml入れて腹腔細胞を回収した後、１２００rpmで５分間遠心して腹
腔細胞を回収した。細胞をリン酸塩緩衝液（phosphate buffered saline, ＰＢ
Ｓ）で１回洗浄した後、細胞沈殿物をＲＮＡzol Ｂに加えて混合した。正常血液
の白血球分離は、まず抗凝固剤の入った血液５ｍｌに滅菌蒸溜水（ＤＥＰＣ−Ｄ
Ｗ）を２０ml加えて１７秒間置いた後、２倍の濃度のリン酸塩緩衝溶液を２０ml
加えて混合した後、１２００rpmで５分間遠心して有核細胞だけを回収した。回
収した細胞にＲＮＡzol Ｂを１ml加えて細胞を完全に溶かした。小便細胞は、小
便１５０mlを回収した後、遠心して細胞を回収した。ここにリン酸塩緩衝溶液を
入れて細胞を１回洗浄した後、細胞にＲＮＡzol Ｂ １mlを加えて混合した。
【００３１】
各種組織及び細胞が溶解されたＲＮＡzol Ｂ溶液に１／１０量のクロロホルム
を添加して振とう混合した後、１２，０００rpmで１５分間遠心して蛋白質層と
ＲＮＡを分離し、分離された上層のＲＮＡ溶液を注意しながら回収して１．５ml
試験管に移した。ＲＮＡ溶液に同量の１００％イソプロパノールを添加して混合
した後、−２０℃に１６時間以上保管してＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡ−イソプ
ロパノール混合液を１２，０００rpmで遠心してＲＮＡ沈殿を作った後、上層を
除去し、ここに７０％冷エタノール１mlを添加してＲＮＡ沈殿を洗浄した後、遠
心して上層のエタノール溶液を完全に除去してＲＮＡ沈殿を滅菌蒸溜水（ＤＥＰ
Ｃ−ＤＷ）に溶かしてから、測光器（spectrophotometer）を利用してＲＮＡの
濃度と純度を測定した。一部試料は、ＤＮase溶液（２０mM ＭｇＣｌ2、２０mM
Tris-ＨＣｌ、０．４Ｕ ＤＮaseＩ、０．８Ｕ ＲＮasin）にＲＮＡ１００μgを
入れて３７℃で１時間処理した後、前記したようにＲＮＡを再抽出してＲＴ−Ｐ
ＣＲまたはＲＮＡ ＰＣＲに使用した。
を添加して振とう混合した後、１２，０００rpmで１５分間遠心して蛋白質層と
ＲＮＡを分離し、分離された上層のＲＮＡ溶液を注意しながら回収して１．５ml
試験管に移した。ＲＮＡ溶液に同量の１００％イソプロパノールを添加して混合
した後、−２０℃に１６時間以上保管してＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡ−イソプ
ロパノール混合液を１２，０００rpmで遠心してＲＮＡ沈殿を作った後、上層を
除去し、ここに７０％冷エタノール１mlを添加してＲＮＡ沈殿を洗浄した後、遠
心して上層のエタノール溶液を完全に除去してＲＮＡ沈殿を滅菌蒸溜水（ＤＥＰ
Ｃ−ＤＷ）に溶かしてから、測光器（spectrophotometer）を利用してＲＮＡの
濃度と純度を測定した。一部試料は、ＤＮase溶液（２０mM ＭｇＣｌ2、２０mM
Tris-ＨＣｌ、０．４Ｕ ＤＮaseＩ、０．８Ｕ ＲＮasin）にＲＮＡ１００μgを
入れて３７℃で１時間処理した後、前記したようにＲＮＡを再抽出してＲＴ−Ｐ
ＣＲまたはＲＮＡ ＰＣＲに使用した。
【００３２】
喀痰は、同量のstabilizer（Roche Diagnostics, Mahnheim, Germany）を添加
して振とう混合して完全に液化させた後、ｍＲＮＡ分離試薬（Roche Diagnostic
s, Mahnheim, Germany）を利用してｍＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲに用い
た。
して振とう混合して完全に液化させた後、ｍＲＮＡ分離試薬（Roche Diagnostic
s, Mahnheim, Germany）を利用してｍＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲに用い
た。
【００３３】
〔実施例３〕
<ＲＮＡＰＣＲ>
総ＲＮＡにgenomic ＭＡＧＥ ＤＮＡが汚染されているかを調べるために、総
ＲＮＡを取って次のようにＰＣＲを実施した。まず１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液３μl、
２５mM ＭｇＣｌ2１．８μl、１０mM ｄＡＴＰ０．３μl、１０mM ｄＧＴＰ０．
３μl、１０mM ｄＴＴＰ０．３μl、１０mM ｄＣＴＰ０．３μl、５０μMセンス
及びアンチセンスプライマー０．２５μl、Ｔaq重合酵素（５Ｕ／μl、Promega
Co., U. S. A.）０．２５μlを混合して最終溶液量が２５μlになるようにして
ＰＣＲ反応液を作った。ＰＣＲ反応液をＰＣＲチューブに入れてここに総ＲＮＡ
溶液（０．１μg／μl）を５μl添加して混合した後、ミネラルオイル（mineral
oil）を１滴落とした後、ＰＣＲ器（Cetus 480、Perkin Elmer Co., U. S. A.
）に入れて次の条件でＰＣＲを実施した。まず９４℃で５分間加熱した後、９４
℃で３０秒、５７℃で４５秒、７２℃で４５秒を１周期とし、３０−３５周期反
応させてＤＮＡを増幅させ、最終的に７２℃で５分間処置することでＰＣＲを完
了した。１％のアガロースゲルにＰＣＲ生成物を加えて電気泳動した後ＵＶトラ
ンスイルミネータ（ＵＶ transilluminater）を利用して増幅されたＤＮＡバン
ドを観察した。
ＲＮＡを取って次のようにＰＣＲを実施した。まず１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液３μl、
２５mM ＭｇＣｌ2１．８μl、１０mM ｄＡＴＰ０．３μl、１０mM ｄＧＴＰ０．
３μl、１０mM ｄＴＴＰ０．３μl、１０mM ｄＣＴＰ０．３μl、５０μMセンス
及びアンチセンスプライマー０．２５μl、Ｔaq重合酵素（５Ｕ／μl、Promega
Co., U. S. A.）０．２５μlを混合して最終溶液量が２５μlになるようにして
ＰＣＲ反応液を作った。ＰＣＲ反応液をＰＣＲチューブに入れてここに総ＲＮＡ
溶液（０．１μg／μl）を５μl添加して混合した後、ミネラルオイル（mineral
oil）を１滴落とした後、ＰＣＲ器（Cetus 480、Perkin Elmer Co., U. S. A.
）に入れて次の条件でＰＣＲを実施した。まず９４℃で５分間加熱した後、９４
℃で３０秒、５７℃で４５秒、７２℃で４５秒を１周期とし、３０−３５周期反
応させてＤＮＡを増幅させ、最終的に７２℃で５分間処置することでＰＣＲを完
了した。１％のアガロースゲルにＰＣＲ生成物を加えて電気泳動した後ＵＶトラ
ンスイルミネータ（ＵＶ transilluminater）を利用して増幅されたＤＮＡバン
ドを観察した。
【００３４】
〔実施例４〕
<逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）>
総ＲＮＡ溶液を７０℃の水槽に１０分間置いてＲＮＡを変性させた後、氷に保
存した。まず５Ｘ ＲＴ緩衝液２μl、１０mM ｄＡＴＰ０．２５μl、１０mM ｄ
ＧＴＰ０．２５μl、１０mM ｄＴＴＰ０．２５μl、１０mM ｄＣＴＰ０．２５μ
l、ＭＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ／μl）０．２５μl、ＲＮase抑制剤（２８Ｕ
／μl）０．２５μl、５０μM oligo ｄＴプライマー０．５μl、滅菌蒸溜水（
ＤＥＰＣ−ＤＷ）４μlをＰＣＲチューブに入れてＲＴ−反応液を作った。ＲＴ
−反応液に氷に保存した総ＲＮＡ溶液（１μg／μl）を２μl添加した後、miner
al oilを１滴落として室温に１０分間置いた。この試験管をＰＣＲ器に入れて４
２℃で６０分間熱処理して逆転写反応を完了し、逆転写反応物を蒸溜水で１：１
希釈した後、ＰＣＲに用いた。ＰＣＲは、前記ＰＣＲ−反応物２５μlに逆転写
反応物を５μl入れて混合した後、mineral oilを１滴落としてＰＣＲ器に入れて
次の条件でＰＣＲを実施した。まず９４℃で５分間加熱した後９４℃で３０秒、
５７℃で４５秒、７２℃で４５秒を１周期として１８−３５周期反応させてＤＮ
Ａを増幅させ、最終的に７２℃で５分間処置することでＰＣＲを完了した。
存した。まず５Ｘ ＲＴ緩衝液２μl、１０mM ｄＡＴＰ０．２５μl、１０mM ｄ
ＧＴＰ０．２５μl、１０mM ｄＴＴＰ０．２５μl、１０mM ｄＣＴＰ０．２５μ
l、ＭＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ／μl）０．２５μl、ＲＮase抑制剤（２８Ｕ
／μl）０．２５μl、５０μM oligo ｄＴプライマー０．５μl、滅菌蒸溜水（
ＤＥＰＣ−ＤＷ）４μlをＰＣＲチューブに入れてＲＴ−反応液を作った。ＲＴ
−反応液に氷に保存した総ＲＮＡ溶液（１μg／μl）を２μl添加した後、miner
al oilを１滴落として室温に１０分間置いた。この試験管をＰＣＲ器に入れて４
２℃で６０分間熱処理して逆転写反応を完了し、逆転写反応物を蒸溜水で１：１
希釈した後、ＰＣＲに用いた。ＰＣＲは、前記ＰＣＲ−反応物２５μlに逆転写
反応物を５μl入れて混合した後、mineral oilを１滴落としてＰＣＲ器に入れて
次の条件でＰＣＲを実施した。まず９４℃で５分間加熱した後９４℃で３０秒、
５７℃で４５秒、７２℃で４５秒を１周期として１８−３５周期反応させてＤＮ
Ａを増幅させ、最終的に７２℃で５分間処置することでＰＣＲを完了した。
【００３５】
〔実施例５〕
<Nested ＰＣＲ>
ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ生成物を蒸溜水で１０倍希釈した後、２μlを取った
。ここに前記したようにＰＣＲ試薬を添加した後、second ＰＣＲを実施した。
。ここに前記したようにＰＣＲ試薬を添加した後、second ＰＣＲを実施した。
【００３６】
〔実施例６〕
<ＭＡＧＥプライマー及びＤＮase処理がＭＡＧＥ検出に及ぼす影響>
培養した胃癌細胞株（ＳＮＵ４８４、ＳＮＵ６３８、ＳＮＵ６６８）、頭頸部
癌細胞株（ＡＭＣ−ＨＮ−３、ＡＭＣ−ＨＮ−４、ＡＭＣ−ＨＮ−７）、子宮頸
部癌細胞株（HeLa、Caski）、肺癌細胞株（ＮＣＩ Ｈ１７０３、ＮＣＩ Ｈ５２
２）、大腸癌細胞株（ＨＴ２９）、転移性前立腺癌細胞株（ＬＮ．ＣＡＰ）、
前骨髓球性白血病（promyelocytic leukemia）（ＨＬ６０）及び骨肉腫（ＳａＯ
Ｓ２）細胞株から総ＲＮＡを抽出した後、ＭＡＧＥを検出するためのＰＣＲ及び
ＲＴ−ＰＣＲを実施した（図１）。
癌細胞株（ＡＭＣ−ＨＮ−３、ＡＭＣ−ＨＮ−４、ＡＭＣ−ＨＮ−７）、子宮頸
部癌細胞株（HeLa、Caski）、肺癌細胞株（ＮＣＩ Ｈ１７０３、ＮＣＩ Ｈ５２
２）、大腸癌細胞株（ＨＴ２９）、転移性前立腺癌細胞株（ＬＮ．ＣＡＰ）、
前骨髓球性白血病（promyelocytic leukemia）（ＨＬ６０）及び骨肉腫（ＳａＯ
Ｓ２）細胞株から総ＲＮＡを抽出した後、ＭＡＧＥを検出するためのＰＣＲ及び
ＲＴ−ＰＣＲを実施した（図１）。
【００３７】
図１のＡは総ＲＮＡを対象として配列番号１／２を利用してＰＣＲした結果で
あり、Ｂは総ＲＮＡにＤＮaseを処理した後、配列番号１／２を利用してＰＣＲ
した結果である。Ｃは総ＲＮＡを対象として配列番号３／４を利用してＰＣＲし
た結果であり、Ｄは総ＲＮＡを対象として配列番号３／４を利用してＰＣＲした
後、配列番号５／６を利用してnested ＰＣＲした結果である。結論的に配列番
号１／２を使用するためにはＤＮase処理が必要であるが、配列番号３／４また
は配列番号５／６は、ＤＮase処理無しにＭＡＧＥを検出することができ、genom
ic ＤＮＡ増幅による偽陽性反応を示さない。配列番号３／４及び配列番号５／
６は、ＭＡＧＥ−１からＭＡＧＥ−６まで少なくとも６種のＭＡＧＥ subtype（
ＭＡＧＥ１−６）を検出することができる。
あり、Ｂは総ＲＮＡにＤＮaseを処理した後、配列番号１／２を利用してＰＣＲ
した結果である。Ｃは総ＲＮＡを対象として配列番号３／４を利用してＰＣＲし
た結果であり、Ｄは総ＲＮＡを対象として配列番号３／４を利用してＰＣＲした
後、配列番号５／６を利用してnested ＰＣＲした結果である。結論的に配列番
号１／２を使用するためにはＤＮase処理が必要であるが、配列番号３／４また
は配列番号５／６は、ＤＮase処理無しにＭＡＧＥを検出することができ、genom
ic ＤＮＡ増幅による偽陽性反応を示さない。配列番号３／４及び配列番号５／
６は、ＭＡＧＥ−１からＭＡＧＥ−６まで少なくとも６種のＭＡＧＥ subtype（
ＭＡＧＥ１−６）を検出することができる。
【００３８】
〔実施例７〕
<配列番号３／４、配列番号５／６を用いたＲＴ−ＰＣＲ法の癌診断特異性評価>
配列番号３／４と配列番号５／６を用いたＲＴ−ＰＣＲ法の特異性を試すため
に、ＳＮＵ４８４細胞株と正常な血液の白血球を抽出してＲＴ−ＰＣＲ及びnest
ed ＰＣＲを実施した結果、ＳＮＵ４８４ではＲＴ−ＰＣＲとnested ＰＣＲでの
みＭＡＧＥ１−６が検出され、ＰＣＲ及びnested ＰＣＲを実施した場合はＤＮ
Ａ増幅がなかった（図２Ａ）。正常な白血球ではＭＡＧＥ１−６が検出されなか
った（図２Ｂ）。
に、ＳＮＵ４８４細胞株と正常な血液の白血球を抽出してＲＴ−ＰＣＲ及びnest
ed ＰＣＲを実施した結果、ＳＮＵ４８４ではＲＴ−ＰＣＲとnested ＰＣＲでの
みＭＡＧＥ１−６が検出され、ＰＣＲ及びnested ＰＣＲを実施した場合はＤＮ
Ａ増幅がなかった（図２Ａ）。正常な白血球ではＭＡＧＥ１−６が検出されなか
った（図２Ｂ）。
【００３９】
〔実施例８〕
<癌細胞株におけるＭＡＧＥ測定>
１４種の癌細胞株を対象としてＭＡＧＥ各subtypeとＭＡＧＥ１−６を測定し
た。ＭＡＧＥ各subtypeに対しては、ＭＡＧＥ特異性を有する配列番号３をプラ
イマーとしてＲＴ−ＰＣＲで測定し、ＭＡＧＥ１−６は配列番号３／４及び配列
番号５／６を用いてＲＴ−ＰＣＲ及びnested ＰＣＲを実施した。各subtypeを測
定した結果に比べて、ＭＡＧＥ１−６を測定した実験でより高い陽性率（７８．
６％）を示した（図３）。
た。ＭＡＧＥ各subtypeに対しては、ＭＡＧＥ特異性を有する配列番号３をプラ
イマーとしてＲＴ−ＰＣＲで測定し、ＭＡＧＥ１−６は配列番号３／４及び配列
番号５／６を用いてＲＴ−ＰＣＲ及びnested ＰＣＲを実施した。各subtypeを測
定した結果に比べて、ＭＡＧＥ１−６を測定した実験でより高い陽性率（７８．
６％）を示した（図３）。
【００４０】
〔実施例９〕
<乳癌におけるＭＡＧＥ測定>
乳癌患者の癌組織を対象としてＭＡＧＥ各subtypeとＭＡＧＥ１−６を測定し
た。ＭＡＧＥ各subtypeに対しては配列番号３／４をプライマーにしたＲＴ−Ｐ
ＣＲとＭＡＧＥ特異性を有する配列番号５プライマーを用いたnested ＰＣＲで
測定したが、ＭＡＧＥ１−６は配列番号３／４及び配列番号５／６を利用してＲ
Ｔ−ＰＣＲ及びnested ＰＣＲを実施した。各subtype測定に比べてＭＡＧＥ１−
６測定でより高い陽性率（９１．２％）を示した（図４）。
た。ＭＡＧＥ各subtypeに対しては配列番号３／４をプライマーにしたＲＴ−Ｐ
ＣＲとＭＡＧＥ特異性を有する配列番号５プライマーを用いたnested ＰＣＲで
測定したが、ＭＡＧＥ１−６は配列番号３／４及び配列番号５／６を利用してＲ
Ｔ−ＰＣＲ及びnested ＰＣＲを実施した。各subtype測定に比べてＭＡＧＥ１−
６測定でより高い陽性率（９１．２％）を示した（図４）。
【００４１】
〔実施例１０〕
<頭頸部癌及び頭頸部陽性腫瘍におけるＭＡＧＥ測定>
頭頸部癌と頭頸部陽性腫瘍におけるＭＡＧＥ１−６を測定した。ＭＡＧＥ１−
６は配列番号３／４及び配列番号５／６を利用してＲＴ−ＰＣＲ及びnested Ｐ
ＣＲで測定した。２７例の癌中１９例が陽性（７０．３％）であり、陽性腫瘍で
は一つも検出されなかった（図５、図５でのＭはサイズマーカーであり、−はｃ
ＤＮＡを入れずＰＣＲしたものである）。
６は配列番号３／４及び配列番号５／６を利用してＲＴ−ＰＣＲ及びnested Ｐ
ＣＲで測定した。２７例の癌中１９例が陽性（７０．３％）であり、陽性腫瘍で
は一つも検出されなかった（図５、図５でのＭはサイズマーカーであり、−はｃ
ＤＮＡを入れずＰＣＲしたものである）。
【００４２】
〔実施例１１〕
<頭頸部ＭＡＧＥ１−６陽性腫瘍におけるＭＡＧＥ subtype測定>
頭頸部癌検体のうち、ＭＡＧＥ１−６が検出された検体におけるＭＡＧＥ各su
btypeとＭＡＧＥ１−６を測定した。ＭＡＧＥ各subtypeに対しては配列番号３／
４をプライマーにしたＲＴ−ＰＣＲとＭＡＧＥ特異性を有する配列番号５プライ
マーを用いたnested ＰＣＲで測定し、ＭＡＧＥ１−６は配列番号３／４及び配
列番号５／６を用いてＲＴ−ＰＣＲ及びnested ＰＣＲで測定した。各subtypeを
測定する方法はＭＡＧＥ１−６を検出する方法より効率性が低かった（図６）。
btypeとＭＡＧＥ１−６を測定した。ＭＡＧＥ各subtypeに対しては配列番号３／
４をプライマーにしたＲＴ−ＰＣＲとＭＡＧＥ特異性を有する配列番号５プライ
マーを用いたnested ＰＣＲで測定し、ＭＡＧＥ１−６は配列番号３／４及び配
列番号５／６を用いてＲＴ−ＰＣＲ及びnested ＰＣＲで測定した。各subtypeを
測定する方法はＭＡＧＥ１−６を検出する方法より効率性が低かった（図６）。
【００４３】
〔実施例１２〕
<その他の癌組織と腹腔及び小便細胞におけるＭＡＧＥ１−６測定>
その他の癌組織と腹腔及び小便細胞におけるＭＡＧＥ１−６を測定した。ＭＡ
ＧＥ１−６は配列番号３／４及び配列番号５／６を利用してＲＴ−ＰＣＲ及びne
sted ＰＣＲで測定した。測定した対象は甲状腺癌（Ａ）、リンパ腫（Ｂ）、ア
デノイド嚢腫（Ｃ）、肉腫（Ｄ）、皮膚繊維肉腫（Ｅ）、悪性混合腫瘍（Ｆ）、
胃癌患者の腹腔細胞（Ｇ）、膀胱癌患者の小便（Ｈ）、その他の患者の小便（Ｉ
）である（図７、図７でのＭはサイズマーカーであり、−はｃＤＮＡを入れずＰ
ＣＲしたものである）。
ＧＥ１−６は配列番号３／４及び配列番号５／６を利用してＲＴ−ＰＣＲ及びne
sted ＰＣＲで測定した。測定した対象は甲状腺癌（Ａ）、リンパ腫（Ｂ）、ア
デノイド嚢腫（Ｃ）、肉腫（Ｄ）、皮膚繊維肉腫（Ｅ）、悪性混合腫瘍（Ｆ）、
胃癌患者の腹腔細胞（Ｇ）、膀胱癌患者の小便（Ｈ）、その他の患者の小便（Ｉ
）である（図７、図７でのＭはサイズマーカーであり、−はｃＤＮＡを入れずＰ
ＣＲしたものである）。
【００４４】
甲状腺癌ではＭＡＧＥ１−６が検出されなかったが、他の癌と胃癌患者の腹腔
細胞及び膀胱癌患者の小便細胞では多様にＭＡＧＥが検出された。
細胞及び膀胱癌患者の小便細胞では多様にＭＡＧＥが検出された。
【００４５】
〔実施例１３〕
<癌細胞株、癌組織及び小便細胞におけるＧＡＧＥ測定>
１４種の各種癌細胞株を対象としてＧＡＧＥ１−８を測定した。ＧＡＧＥ１−
８は配列番号７／８を用いたＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲと配列番号９／１０を用
いたnested ＰＣＲで測定した。
８は配列番号７／８を用いたＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲと配列番号９／１０を用
いたnested ＰＣＲで測定した。
【００４６】
逆転写反応をさせないでＰＣＲ及びnested ＰＣＲした場合、ＧＡＧＥが全く
検出されず、逆転写後ＰＣＲ及びnested ＰＣＲしたの場合には１４個のうち１
３個において陽性（９２．９％）として現れた（図８）。胃癌では８０％、乳癌
では８５．７％、膀胱癌の小便細胞では５５．６％現れ、癌でない患者の小便で
は陽性が一つもなかった（図９）。
検出されず、逆転写後ＰＣＲ及びnested ＰＣＲしたの場合には１４個のうち１
３個において陽性（９２．９％）として現れた（図８）。胃癌では８０％、乳癌
では８５．７％、膀胱癌の小便細胞では５５．６％現れ、癌でない患者の小便で
は陽性が一つもなかった（図９）。
【００４７】
〔実施例１４〕
<肺癌組織と喀痰におけるＭＡＧＥ測定>
肺癌組織８例、肺癌患者喀痰１４例、肺癌でない入院患者の喀痰１６例を対象
としてＭＡＧＥ１−６を測定した。配列番号３／４及び配列番号５／６を用いて
ＲＴ−ＰＣＲ及びnested ＰＣＲを実施して測定した。肺癌組織８例中７例、肺
癌患者の喀痰１４例中４例ではＭＡＧＥ１−６が検出され、肺癌でない入院患者
の喀痰１６例からは全く検出されなかった（図１０）。
としてＭＡＧＥ１−６を測定した。配列番号３／４及び配列番号５／６を用いて
ＲＴ−ＰＣＲ及びnested ＰＣＲを実施して測定した。肺癌組織８例中７例、肺
癌患者の喀痰１４例中４例ではＭＡＧＥ１−６が検出され、肺癌でない入院患者
の喀痰１６例からは全く検出されなかった（図１０）。
【００４８】
〔実施例１５〕
<血液におけるＭＡＧＥ測定>
癌患者血液２０例と正常な血液１５例を対象としてＭＡＧＥを測定した。配列
番号３／４及び配列番号５／６を利用してＲＴ−ＰＣＲ及びnested ＰＣＲを実
施して測定した。癌患者血液２０例中３例においてＭＡＧＥ１−６が検出され、
正常人の血液では全く検出されなかった（図１１、図１１での＋は正常人の血液
５mlにＳＮＵ４８４（ＭＡＧＥ１−６陽性細胞）を５ cells添加したサンプルで
ある）。
番号３／４及び配列番号５／６を利用してＲＴ−ＰＣＲ及びnested ＰＣＲを実
施して測定した。癌患者血液２０例中３例においてＭＡＧＥ１−６が検出され、
正常人の血液では全く検出されなかった（図１１、図１１での＋は正常人の血液
５mlにＳＮＵ４８４（ＭＡＧＥ１−６陽性細胞）を５ cells添加したサンプルで
ある）。
【００４９】
上記において、本発明の好適な実施の形態について説明したが、本発明の請求範
囲を逸脱することなく、当業者は種々の改変をなし得る。
囲を逸脱することなく、当業者は種々の改変をなし得る。
【００５０】
ＭＡＧＥ−１からＭＡＧＥ−６までを同時に検出するプライマー配列番号３／
４と配列番号５／６、ＧＡＧＥ−１からＧＡＧＥ−８までを同時に検出する配列
番号７／８、配列番号９／１０は、これらの様々なsubtypeをそれぞれ測定する
方法に比べて、特異性及び癌診断率が高い癌診断剤として使用できる。 また、各種正常細胞及び陽性腫瘍では陽性として現れることが一つもないため
癌診断特異性が非常に高いだけでなく、これら共同プライマーを使用して小便細
胞でもＭＡＧＥを検出することができ、組織でない非侵襲性検体を対象とした癌
診断剤としても使用されることができる。また、本発明はＭＡＧＥｓまたはＧＡ
ＧＥｓの様々なsubtypeを同時に測定することで時間及び経費の消耗を減らすこ
とができる。
４と配列番号５／６、ＧＡＧＥ−１からＧＡＧＥ−８までを同時に検出する配列
番号７／８、配列番号９／１０は、これらの様々なsubtypeをそれぞれ測定する
方法に比べて、特異性及び癌診断率が高い癌診断剤として使用できる。 また、各種正常細胞及び陽性腫瘍では陽性として現れることが一つもないため
癌診断特異性が非常に高いだけでなく、これら共同プライマーを使用して小便細
胞でもＭＡＧＥを検出することができ、組織でない非侵襲性検体を対象とした癌
診断剤としても使用されることができる。また、本発明はＭＡＧＥｓまたはＧＡ
ＧＥｓの様々なsubtypeを同時に測定することで時間及び経費の消耗を減らすこ
とができる。
【００５１】
<参考文献>
【非特許文献１】 Li J, Yang Y, Fujie T, Tanaka F, Mimori K, Har
aguchi M, Ueo H, Mori M, Akiyoshi T. Expression of the MAGE gene family
in human gastric carcinoma. Anticancer Res. 17: 3559-3563, 1997.
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【非特許文献２】 Inoue H, Li J, Honda M. MAGE−１ｍＲＮＡ expre
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【非特許文献３】 Inoue H, Mori M, Honda M. Human esophageal car
cinomas frequently express the tumor-rejection antigens of MAGE genes. I
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genes in human colorectal carcinoma. Ann Surg 224: 183-188, 1996.
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【非特許文献６】 Russo M, Traversari C, Verrecchia A. Expressio
n of MAGE gene family in primary and metastatic human breast cancer: imp
lications for tumor-specific immunotherapy. Int J Cancer 64: 216-221, 19
95.
n of MAGE gene family in primary and metastatic human breast cancer: imp
lications for tumor-specific immunotherapy. Int J Cancer 64: 216-221, 19
95.
【非特許文献７】 Fujie T, Mori M, Ueo H, Sugimachi K, Akiyoshi
T. Expression of MAGE and BAGE genes in Japanese breast cancers. Ann Onc
ol 8: 369-372, 1997.
T. Expression of MAGE and BAGE genes in Japanese breast cancers. Ann Onc
ol 8: 369-372, 1997.
【非特許文献８】 Yamashita N, Ishibashi H, Hayashida K, Kudo J,
Takenaka K, Itoh K, Niho Y. High frequency of the MAGE-1 gene expressio
n in hepatocellular carcinoma. Hepatology 24: 1437-1440, 1996.
Takenaka K, Itoh K, Niho Y. High frequency of the MAGE-1 gene expressio
n in hepatocellular carcinoma. Hepatology 24: 1437-1440, 1996.
【非特許文献９】 Shichijo S, Tsunosue R, Masuoka K, Natori H, T
amai M, Miyajima J, Sagawa K, Itoh K. Expression of the MAGE gene family
in human lymphocytic leukemia. Cancer Immunol Immunother 41: 90-103, 19
95.
amai M, Miyajima J, Sagawa K, Itoh K. Expression of the MAGE gene family
in human lymphocytic leukemia. Cancer Immunol Immunother 41: 90-103, 19
95.
【非特許文献１０】 Corrias MV, Scaruffi P, Occhino M, De Bernar
di B, Tonini GP, Pistoia V. Expression of MAGE-1, MAGE-3 and MART-1 gene
s in neuroblastoma. Int J Cancer 69: 403-407, 1995.
di B, Tonini GP, Pistoia V. Expression of MAGE-1, MAGE-3 and MART-1 gene
s in neuroblastoma. Int J Cancer 69: 403-407, 1995.
【非特許文献１１】 Russo V, Dalerba P, Ricci A, Bonazzi C, Leon
e BE, Mangioni C, Allavena P, Bordignon C, Traversari C. MAGE, BAGE and
GAGE genes expression in fresh epithelial ovarian carcinomas. Int J Canc
er 67: 457-460, 1996.
e BE, Mangioni C, Allavena P, Bordignon C, Traversari C. MAGE, BAGE and
GAGE genes expression in fresh epithelial ovarian carcinomas. Int J Canc
er 67: 457-460, 1996.
【非特許文献１２】 Van den Eynde B, Peeters O, DeBacker B, Gaug
ler S, Lucas, Boon T. An ewfamily of genes coding for an antigen recogni
zed by autologous cytolytic Tlymphocytes on a human melanoma. J Exp Med
182: 689, 1995.
ler S, Lucas, Boon T. An ewfamily of genes coding for an antigen recogni
zed by autologous cytolytic Tlymphocytes on a human melanoma. J Exp Med
182: 689, 1995.
【非特許文献１３】 パク ジョン ウク，キム イン ホ，キム ユ サ：
MAGE isotypes またはGAGE isotypesのDNA及び蛋白質同質性．啓明大論文集 18:
475-483, 1999.
MAGE isotypes またはGAGE isotypesのDNA及び蛋白質同質性．啓明大論文集 18:
475-483, 1999.
【非特許文献１４】 イム ハク，ユン ス ジョン，パク ジョン ウク
：メサンジウム細胞でlipopolysaccharideによって誘導されるchemokine遺伝子
発現．大韓腎臓学会誌 18: 847-855, 1999.
：メサンジウム細胞でlipopolysaccharideによって誘導されるchemokine遺伝子
発現．大韓腎臓学会誌 18: 847-855, 1999.
【非特許文献１５】 Mori M, Mimori K, Tanaka F, Ueo H, Sugimachi
K, Akiyoshi T. Molecular Diagnosis of circulating cancer cells using MA
GE gene assay. JAMA 278: 476-477, 1997.
K, Akiyoshi T. Molecular Diagnosis of circulating cancer cells using MA
GE gene assay. JAMA 278: 476-477, 1997.
【図１】
ＭＡＧＥプライマー及びＤＮase処理がＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを用いたＭ
ＡＧＥ検出に及ぼす影響を示した図である。
ＡＧＥ検出に及ぼす影響を示した図である。
【図２】
配列番号３／４と配列番号５／６プライマーのＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＭＡＧ
Ｅ検出の特異性を示した結果である。
Ｅ検出の特異性を示した結果である。
【図３】
癌細胞株で配列番号３／４と配列番号５／６プライマーを利用してＭＡＧＥの
各subtypeとＭＡＧＥ１−６を測定した結果である。
各subtypeとＭＡＧＥ１−６を測定した結果である。
【図４】
乳癌患者の癌組織で配列番号３／４と配列番号５／６プライマーを利用してＭ
ＡＧＥの各subtypeとＭＡＧＥ１−６を測定した結果である。
ＡＧＥの各subtypeとＭＡＧＥ１−６を測定した結果である。
【図５】
頭頸部癌と頭頸部陽性腫瘍における配列番号３／４と配列番号５／６プライマ
ーを利用してＭＡＧＥ１−６を測定した結果である。
ーを利用してＭＡＧＥ１−６を測定した結果である。
【図６】
頭頸部癌患者の癌組織における配列番号３／４と配列番号５／６プライマーを
利用してＭＡＧＥの各subtypeとＭＡＧＥ１−６を測定した結果である。
利用してＭＡＧＥの各subtypeとＭＡＧＥ１−６を測定した結果である。
【図７】
その他の癌組織と小便細胞における配列番号３／４と配列番号５／６プライマ
ーを利用してＭＡＧＥ１−６を測定した結果である。
ーを利用してＭＡＧＥ１−６を測定した結果である。
【図８】
癌細胞株における配列番号７／８と配列番号９／１０プライマーを利用してＧ
ＡＧＥ１−８を測定した結果である。
ＡＧＥ１−８を測定した結果である。
【図９】
癌組織及び小便細胞における配列番号７／８と配列番号９／１０プライマーを
利用してＧＡＧＥ１−８を測定した結果である。
利用してＧＡＧＥ１−８を測定した結果である。
【図１０】
肺癌組織及び喀痰における配列番号３／４と配列番号５／６プライマーを利用
してＭＡＧＥ１−６を測定した結果である。
してＭＡＧＥ１−６を測定した結果である。
【図１１】
血液における配列番号３／４と配列番号５／６プライマーを利用してＭＡＧＥ
１−６を測定した結果である。
１−６を測定した結果である。
Ｃ１：配列番号１
Ｃ２：配列番号２
Ｃ３：配列番号３
Ｃ４：配列番号４
Ｃ５：配列番号５
Ｃ６：配列番号６
Ｃ７：配列番号７
Ｃ８：配列番号８
Ｃ９：配列番号９
Ｃ１０：配列番号１０
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(71)出願人 Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ， ｉＣ＆Ｇ （ｉｍｍｕｎｏ
Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅ），
Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，
Ｋｅｉｍｙｕｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ， ＃194 Ｄｏｎｇｓａｎ−ｄｏｎｇ，
Ｊｕｎｇ−ｋｕ， Ｄａｅｇｕ 700−
712， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒ
ｅａ
(72)発明者 パク ジョンウク
大韓民国、706−050 デグ、スーサン−
ク、ジョン−ドン ＃411−１、ジョンド
ン クワンミョオン プレジデント Ａ−
902
(72)発明者 ジョン チャンホ
大韓民国、704−796 デグ、ダッセオ−
ク、ドーウォン−ドン ＃1438、サキヨル
アパートメント 307−607
Ｆターム(参考） 2G045 AA35 CB01 FB05
4B024 AA12 BA36 CA01 CA11 CA12
CA20 HA11
4B063 QA01 QA19 QQ53 QR08 QR32
QR35 QR40 QR42 QR62 QS16
QS25 QS36 QX01
Claims (13)
- 【請求項１】 配列番号３乃至配列番号１０から選択されたことを特徴とす
るプライマー。 - 【請求項２】 配列番号３乃至配列番号１０から選択された２つの配列から
なることを特徴とする共同プライマー。 - 【請求項３】 配列番号３と配列番号４、配列番号５と配列番号６、配列番
号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０の中から選択されたことを特徴と
する請求項２に記載の共同プライマー。 - 【請求項４】 請求項１乃至請求項３に記載から選択された共同プライマー
を主成分とすることを特徴とする癌診断剤。 - 【請求項５】 配列番号３乃至配列番号１０から選択されたプライマーを用
いて癌を診断することを特徴とする方法。 - 【請求項６】 配列番号３乃至配列番号１０から選択された２つの配列から
なる共同プライマーを用いて癌を診断することを特徴とする方法。 - 【請求項７】 配列番号３と配列番号４、配列番号５と配列番号６、配列番
号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０の中から選択された共同プライマ
ーを用いて癌を診断することを特徴とする請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 一種類以上の癌を同時に診断することを特徴とする請求項５
乃至請求項７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 ＰＣＲ（polymerase chain reaction）を実施して癌を診断
することを特徴とする請求項５乃至請求項８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 ＲＴ−ＰＣＲ及びnested ＰＣＲの２次ＰＣＲを実施して
癌を診断することを特徴とする請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 配列番号３乃至配列番号１０から選択されたプライマー及
びＰＣＲ試薬を含むことを特徴とする癌診断用キット。 - 【請求項１２】 配列番号３乃至配列番号１０から選択された２つの配列か
らなる共同プライマー及びＰＣＲ試薬を含むことを特徴とする癌診断用キット。 - 【請求項１３】 配列番号３と配列番号４、配列番号５と配列番号６、配列
番号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０の中から選択された共同プライ
マー及びＰＣＲ試薬を含むことを特徴とする請求項１２に記載の癌診断用キット
。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| KR10-2000-0021837A KR100374423B1 (ko) | 2000-04-25 | 2000-04-25 | 다수의 ｍａｇｅ 아형 또는 ｇａｇｅ 아형을 인식하는암진단용 프라이머 |
| KR2000-21837 | 2000-04-25 | ||
| PCT/KR2001/000681 WO2001081575A1 (en) | 2000-04-25 | 2001-04-24 | Primer for diagnosis of one or more kinds of cancer |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003530884A true JP2003530884A (ja) | 2003-10-21 |
Family
ID=19666713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001578646A Pending JP2003530884A (ja) | 2000-04-25 | 2001-04-24 | 癌診断用プライマー |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7034146B2 (ja) |
| EP (1) | EP1276864A4 (ja) |
| JP (1) | JP2003530884A (ja) |
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Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
| DE102004023187A1 (de) * | 2004-05-11 | 2005-12-01 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie |
Family Cites Families (4)
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|---|---|---|---|---|
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| US6013481A (en) * | 1993-07-22 | 2000-01-11 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated, nucleic acid molecules which code for gage tumor rejection antigen, the tumor rejection antigen, and uses thereof |
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| CA2285688A1 (en) * | 1997-04-11 | 1998-10-22 | Peter Kufer | Novel primers and methods for the detection of disseminated tumor cells |
-
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- 2000-04-25 KR KR10-2000-0021837A patent/KR100374423B1/ko not_active IP Right Cessation
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2001
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