JP2003529329A - ヒトのセリーンプロテアーゼｅｏｓをエンコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 発明者らがプロテアーゼＥＯＳと命名した新規なセリーンプロテアーゼをエンコードするｃＤＮＡの分子的特定が説明される。類推されたアミノ酸配列および他の十分に特徴づけられたセリーンプロテアーゼとの整列により、プロテアーゼＥＯＳはＳ１セリーンプロテアーゼファミリーの一員であることが示される。プロテアーゼＥＯＳｍＲＮＡは、血小板および白血球、詳しく言えば好酸球および恐らくはマクロファージに発現されることを見出した。このプロテアーゼは、該プロテアーゼが重要な機能を司る卵巣、網膜および胃において豊富に発現されるが、このプロテアーゼが血小板および免疫システムのある種の細胞において発現されることは、該プロテアーゼが血栓症と免疫プロセスに関与していることを示唆している。酵素的活性を有するプロテアーゼＥＯＳを、生理学的基質および特定の調節剤の確認のためのさらなる生化学的分析で調べることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） トリプシン／キモトリプシン様（Ｓ１）セリーンプロテアーゼファミリーのメ
ンバーは、消化プロセスや調節増幅カスケードを含む数多くの様々な生理学的プ
ロセスにおいて、不活性な酵素原先駆体のタンパク質加水分解的な活性化を通じ
て重要な役割を果たす。多くの例において、これらのカスケード内のプロテアー
ゼ基質は、それ自身「下流」セリーンプロテアーゼの不活性形態または酵素原で
ある。セリーンプロテアーゼ介在調節のよく知られた例には、血液凝固（Ｄａｖ
ｉｅら（１９９１）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０３６３−７０）、
キニン形成（ＰｒｏｕｄおよびＫａｐｌａｎ（１９９８）、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ ６：４９−８３）ならびに補体システム（ＲｅｉｄおよびＰｏｒ
ｔｅｒ（１９８１）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０：４３３
−４６４）が含まれる。これらのタンパク質加水分解径路は既知であるが、新規
なセリーンプロテアーゼ遺伝子およびその生成物の発見により、こうした既に存
在しているカスケード内での調節に関する我々の理解が促進され、新規なプロテ
アーゼネットワーク全体の解明につながるであろう。

【０００２】 分化した血球は、様々な病理学的状態において特定の役割を果たすであろう各
種プロテアーゼを発現する。細胞毒性Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細
胞に由来のグランザイム（Ｓｍｙｔｈら（１９９６） Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ
Ｂｉｏｌ．６０：５５５−５６２）、好中菌に由来のエラスターゼおよびコラ
ゲナーゼ（Ｓｉｍｏｎ（１９９３） Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ Ｓｕｐｐ
ｌ．４２：２７−３７）、ならびにマスト細胞に由来のキマーゼおよびトリプタ
ーゼ（Ｃａｕｇｈｅｙ（１９９５） Ｃｌｉｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．６：３０５−２９；ＫａｔｕｎｕｍａおよびＫｉｄｏ（１９８８） Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８：２９１−３０１）が現在研究されているが、病
理生理学的プロセスにおけるこれらの役割は、現在解明されつつあるところであ
る。一方、好酸球やマクロファージなどの白血球に由来のプロテアーゼの特徴は
まだ解明されておらず、現在ようやく分子的特定がなされているところである。
これらのプロテアーゼが果たす生理学的な役割を理解することは、健康な状態お
よび病気にかかっている状態における好酸球やマクロファージの機能に対するよ
り深い理解につながるであろう（Ａｂｕ−Ｇｈａｚａｌｅｈら（１９９２） Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｓｅｒ．５７：１３７−６７；Ｇｌｅｉｃｈ（１９９６） Ａｌ
ｌｅｒｇｏｌ．Ｉｎｔ．４５：３５−４４；Ｄｅ ＶｉｌｌｉｅｒｓおよびＳｍ
ａｒｔ（１９９９） Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６６：７４０−７４
６；Ｇｌｅｉｃｈら（１９９３） Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４４：８５−１
０１；ＳｈｅｒｍａｎおよびＴｒｕｏｇ（２０００） Ｌｕｎｇ Ｂｉｏｌ．Ｈ
ｅａｌｔｈ Ｄｉｓ．１３７：８１３−８３９；ＹｏｏｎおよびＪｕｎ（１９９
９） Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃａｌ Ｒｅｓ．２２：４３７−４４７）。

【０００３】 プロテアーゼは、非自然的環境において、洗濯用洗剤、食品加工、繊維加工お
よびスキンケア産物を含む様々な商業目的のために用いられる。洗濯用洗剤にお
いて、プロテアーゼは、溶解度の低い有機化合物を洗剤や水により容易に溶解可
能な、より溶解しやすい形態に分解するために用いられる。この能力において、
プロテアーゼは「しみ抜き剤」として機能する。食品加工の例には、肉を柔らか
くしたりチーズを製造することが含まれる。プロテアーゼは、繊維加工において
、たとえば繊維縮みを防止すべくウールを処理するために用いられる。プロテア
ーゼは、スキンケア産物において、落屑の不均衡のために肌の表面に集積したス
ケールを除去するために用い得る。これらの応用例のいくつかにおいて用いられ
る一般的なプロテアーゼは、酵素の産業的生産のために培養しやすい原核細胞も
しくは真核細胞に由来し、用いられる一般的な種は、たとえば米国特許第５，２
１７，８７８号に記載のバチルスである。あるいは、米国特許第５，２７８，０
６２号は、洗濯用洗剤組成物において用いるべく、真菌類のＴｒｉｔｉｒａｃｈ
ｉｕｍ ａｌｂｕｍから分離されたセリーンプロテアーゼについて記載している
。残念なことに、プロテアーゼの中には、敏感な人にアレルギー反応を引き起こ
す可能性により、あるいは非自然環境で用いられると効果が減少することにより
、その使用が制限されるものがある。ヒト以外の生物に由来するプロテアーゼタ
ンパク質を用いる場合、敏感な人において免疫反応を引き起こす可能性がさらに
高くなることが予測される。こうした制限のため、敏感な人々に対する抗原性が
低く且つ／または非自然環境において効果的なタンパク質加水分解活性をもたら
す代替的なプロテアーゼが必要とされている。組換え技術の到来により、産業的
生産に適した宿主内において、いかなる種のタンパク質でも発現可能である。

【０００４】 （発明の開示） ここで、発明者がプロテアーゼＥＯＳと名付けた新規なセリーンプロテアーゼ
をエンコードするｃＤＮＡの分子的特定について記載する。プロテアーゼＥＯＳ
ｃＤＮＡ配列は、２８４個のアミノ酸のプレプロＥＯＳポリペプチドを予測する
ものであり、充分特性化された他のセリーンプロテアーゼと上記配列との整列は
、上記の新規なセリーンプロテアーゼがＳ１セリーンプロテアーゼファミリーの
一員であることを明確に示す。

【０００５】 酵素的に活性なプロテアーゼＥＯＳは、生理学的基質および特定の調節剤を特
定するための生化学的分析に扱いやすい。本明細書に記載された色原体的検定に
おいて特定された調節剤は、マクロファージ機能に関連した、もしくは気管支喘
息および過好酸球増加に起因する合併症などでの（ただしこれらの疾病に限定さ
れない）好酸球の高いカウントに関連した疾病の治療において、治療剤として役
に立つ可能性がある。また、卵巣、網膜および胃におけるプロテアーゼＥＯＳの
発現は、プロテアーゼＥＯＳ機能の調節剤をこれらの組織の異常を治療するため
に使えることを示唆している。精製されたプロテアーゼＥＯＳを、洗濯用洗剤、
しみ抜き溶液およびスキンケア産物を含む商業産物において用いられる成分とし
て製造することができる。

【０００６】 ＥＯＳをコードする組換えＤＮＡ分子およびその部分は、このＤＮＡ分子の相
同体を分離したり、ＤＮＡ分子のゲノム同等物を特定しまたは分離したり、ＤＮ
Ａ分子の突然変異形態を特定し、検出しもしくは分離したりするのに役立つ。

【０００７】 （図面の簡単な説明） 図１、新規なプロテアーゼＥＯＳｃＤＮＡのヌクレオチド（配列番号１）およ
びアミノ酸配列（配列番号７）を示す。

【０００８】 図２、他のＳ１セリーンプロテアーゼと比較してプロテアーゼＥＯＳアミノ酸
配列の系統樹を示す。

【０００９】 図３、ＰＣＲに基づく組織分布は、プロテアーゼＥＯＳｍＲＮＡが制限されて
いることを示す。ゲルのオートラジオグラムが、ＥＯＳ特異的ＰＣＲ生成物（Ｅ
ＯＳ）の位置と共に示されており、これは標識付け内部プローブのハイブリッド
形成によって検出された。フリープローブ（Ｆ．Ｐ．）は電気泳動後に分離され
た。分析された組織および細胞系統のｃＤＮＡライブラリーは、示されていると
おりである。

【００１０】 図４、酵素原活性構築物中のプロテアーゼＥＯＳ触媒領域のヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列が示されている。

【００１１】 図５、組換えプロテアーゼＰＦＥＫ−プロテアーゼＥＯＳ−ＨＡ６ＸＨＩＳの
ポリアクリルアミドゲルおよびウエスタンブロット分析。クーマシーブリリアン
トブルー（左端１，２．）で染色された新規なセリーンプロテアーゼＰＦＥＫ−
プロテアーゼＥＯＳ−ＨＡ６ＸＨＩＳのサンプルを含むポリアクリルアミドゲル
が示されている。相対分子量は、タンパク質基準（Ｍ）の位置によって示されて
いる。示された各レーンにおいて、精製された酵素原は、全く処理されていない
か（−）あるいはＥＫで消化されたか（＋）のいずれかであった。ＥＫは、酵素
原を活性を有する形態に切断して活性化するために用いられた。抗ＦＬＡＧＭｏ
ＡｂＭ２でプローブされたゲルのウェスタンブロットも示されている（右端１）
。これは、発現され且つ精製された酵素原が定量的に切断され、加工され且つ活
性化されたプロテアーゼが生成されたことを明らかにしている。

【００１２】 図６、活性構築物から発現され、精製され且つ活性化された組換えプロテアー
ゼＥＯＳ−ＨＡ６ＸＨＩＳの機能的アミド分解活性が、色原体基質を用いて測定
された。

【００１３】 図７、抗ＥＯＳ抗血清は、ＥＯＳタンパク質と特異的に反応する。バキュロウ
イルス発現システムから発現された半精製プロテアーゼＥＯＳおよび関連するタ
ンパク質プロテアーゼＨが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解離され、新規プロテアー
ゼＥＯＳに対する抗体を用いた免疫ブロットで分析された。タンパク質−抗体の
結合は、ＥＣＬによって視覚化された。これらの組換えプロテアーゼはＦＬＡＧ
エピトープのタグに融合しているので、同等の負荷を確認すべく、抗ＦＬＡＧＭ
２ＭｏＡｂを用いた検出も行われた。

【００１４】 図８、新規なプロテアーゼＥＯＳが、マクロファージ様細胞のサブセットにお
いて発現されている。プロテアーゼＥＯＳタンパク質（上のパネル）の局在部位
分析は免疫組織化学によって、ｍＲＮＡ（下のパネル）の局在部位分析はヒトの
脾臓、肺および結腸における原位置ハイブリダイゼーションによって行われた。
用いられた条件下で、陽性の抗ＥＯＳ免疫反応細胞は茶色のしみを示し、陽性の
ＥＯＳｍＲＮＡ検出は紫色である（矢印の頭）。倍率は２０倍である。

【００１５】 図９、ＥＯＳおよびマクロファージマーカーＣＤ６８のに二重焼付け可能染色
である。抗ＥＯＳ抗体およびマクロファージに特異性を有するマーカーである抗
ＣＤ６８抗体を用いて、二重免疫蛍光法が実施された。二重免疫蛍光法によって
二重焼付け可能染色パターンが生成され、ここでＥＯＳは緑（左のパネル）、Ｃ
Ｄ６８は赤（右のパネル）で示される。これは、プロテアーゼＥＯＳがマクロフ
ァージ（矢印の頭）において発現されることを明らかにしている。倍率は６０倍
である。

【００１６】 図１０、Ｕ９３７細胞におけるフォルボールエステルによるプロテアーゼＥＯ
Ｓタンパク質の上向き調節（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）が、免疫細胞化学に
より検出されている。モノブラストＵ９３７細胞は、処理されないか（上のパネ
ル）、５日間フォルボールエステルＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理されたか（
下のパネル）のいずれかであった。細胞はチャンバースライドに設置され、１０
％ホルマリン生理食塩水溶液で固定されてから免疫細胞化学によって分析された
。免疫染色は、図に示されるように、ビメンチン、プロテアーゼＥＯＳおよびＣ
Ｄ６８に対する抗体を用いて行われた。陽性の免疫反応は、用いられた条件下で
濃い茶色で示されている（矢印の頭）。

【００１７】 図１１、Ｕ９３７細胞におけるフォルボールエステルによるプロテアーゼＥＯ
ＳｍＲＮＡの上向き調節。モノブラストＵ９３７細胞は、処理されないか、もし
くは示された日数フォルボールエステルＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理された
かのいずれかであった。ＲＮＡの全量（３０μｇ）は、ＥＯＳ、ＣＤ６８もしく
はβ−アクチンでノーザン・ブロットプローブにより分析された。

【００１８】 （発明の詳細な説明） 定義 本明細書で用いられる「タンパク質領域」という用語は、あるタンパク質のあ
る領域であって、そのタンパク質の残りの部分から独立して安定した三次元構造
に折り畳み得る領域を指す。この構造は、酵素活性、別の分子ための認識モチー
フの作成を含む、タンパク質内部の領域の機能に関連した特定の機能を維持して
いよう。あるいは、タンパク質が特定の環境において存在するために必要な構造
的構成要素を提供していよう。タンパク質領域は通常、タンパク質スーパーファ
ミリー内および同様に機能する他のタンパク質スーパーファミリー内のいずれに
おいても、タンパク質の進化において保存されている領域である。

【００１９】 本明細書において用いられる「タンパク質スーパーファミリー」という用語は
、進化における関係が、既に認められた系統発生的基準によって完全に確立され
ないかあるいは疎遠であるが、類似した三次元構造もしくは重要なアミノ酸の独
自の共働を示すタンパク質を指す。本明細書で用いられる「タンパク質ファミリ
ー」という用語は、進化における関係が、認められた系統発生的な基準によって
既に確立されているタンパク質を指す。

【００２０】 本明細書で用いられる「融合タンパク質」という用語は、領域もしくはリンカ
ー領域の組み合わされた機能としての機能を得る目的のために、多くのタンパク
質領域もしくはリンカー域を組み合わせた結果であるタンパク質構築物を指す。
この構成は、ヌクレオチド配列の分子的クローニングを行い、所望のタンパク質
をコードする新しいポリヌクレオチド配列を創造することによって達成されるこ
とが最も多い。あるいは、二つのタンパク質を化学的に融合することによって、
融合タンパク質の創造を達成してもよい。

【００２１】 本明細書で用いられる「リンカー域」もしくは「リンカー領域」もしくはそれ
らに類似の記述用語は、クローニングベクターあるいは融合タンパク質の構築に
おいて使用されるポリヌクレアチドもしくはポリペプチド配列の広がりを指す。
リンカー域の機能には、ヌクレオチド配列へのクローニング部位の導入、二つの
タンパク質領域間への可撓性を有する構成要素もしくは間隔形成域の導入、ある
いは特定の分子間相互作用に対する親和性タグの作成を含む。リンカー域は、特
定の目的に基づかずに融合タンパク質に導入されてよく、クローン中になされた
選択の結果によるものであってよい。

【００２２】 本明細書で用いられる「プレ配列」は、分泌シグナルアミノ酸配列をエンコー
ドするヌクレオチド配列を指す。様々な種類のそうした分泌シグナル配列が当業
者には既知であり、また本発明において用いられる上で適切である。適切なプレ
配列の例には、プロラクチンＦＬＡＧ、トリプシノーゲンおよびキモＦＬＡＧが
含まれるが、これらに限定されない。

【００２３】 本明細書で用いられる「プロ配列」は、制限プロテアーゼのための切断部位を
エンコードするヌクレオチド配列を指す。様々な種類の制限プロテアーゼ用切断
部位が当業者に既知であり、本発明において用いられる上で適当である。適当な
前配列の例には、ＥＫ、ＦＸａ、およびトロンビンが含まれるが、これらに限定
されない。

【００２４】 本明細書において用いられる「クローニング部位」あるいは「ポリクローニン
グ部位」は、一つ以上の利用可能な制限エンドヌクレアーゼ共通配列を有する、
クローニングベクター内部に含まれる、もしくは融合プロテイン内部に作られた
ヌクレオチド配列の領域を指す。当面選択された制限エンドヌクレアーゼを使用
することにより、転写および翻訳の後に所望のタンパク質産物を生成する開始コ
ドンに対するインフレーム配列をコードする所望のヌクレオチド配列を分離する
ことが可能になる。その後、これらのヌクレオチド配列を、他のクローニングベ
クターに導入することができ、新規な融合タンパク質の生成に用いることができ
、あるいは特定の部位に向けられた変異を導入するために用いることができる。
クローニング部位を、サイレント変異、保存変異、あるいは所望の制限酵素共通
配列を含むリンカー域の導入によって、所望の箇所に作り出せることは、当業者
には既知である。また、クローン化タンパク質あるいはそのフラグメントの所望
の機能が維持されている限りクローニング部位の正確な位置は柔軟であり得るこ
とも、当業者には既知である。

【００２５】 本明細書で用いられている「タグ」という用語は、そのタグを含む融合タンパ
ク質の分離、精製もしくは検出を促すアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチ
ド配列を指す。様々な種類のそうしたタグが当業者には既知であり、また本発明
において使用する上で適当である。適当なタグにはＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、ビオ
チン、アビジンおよび抗体結合部位が含まれるが、これらの例に限定されない。

【００２６】 本明細書での使用例から分かるように、本明細書において「発現ベクター」は
、遺伝子のクローンされた複製の転写、および適切な宿主におけるそれらのｍＲ
ＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として定義されている。そのようなベクターを、
大腸菌を含む細菌、藍藻植物、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を含む真菌類細胞
、および動物細胞などの様々な宿主において真核性の遺伝子を発現するために用
いることができる。

【００２７】 本発明において用いられる「触媒領域カセット」という用語は、対象となって
いるセリーンプロテアーゼの少なくとも触媒領域をエンコードするアミノ酸配列
をエンコードするヌクレオチド配列を指す。ヌクレオチド配列が分離されたら、
様々な種類のプロテアーゼ触媒領域（当業者にとって現在既知であるものおよび
該領域をエンコードするヌクレオチド配列がまだ分離されていないものを含む）
を、本発明の発現ベクターに挿入してよい。

【００２８】 本明細書での使用例から分かるように、ヌクレオチド配列、ベクターあるいは
ポリペプチドの「機能的誘導体」は、本明細書に記載の特性と実質的に同じ（機
能的あるいは構造的な）生物学的活性を有する。「機能的誘導体」という用語は
、ヌクレオチド配列、ベクター、あるいはポリペプチドの「フラグメント」、「
変異型」、「縮重変異型」、「類似体」および「相同体」を含むものとする。「
フラグメント」という用語は、発現された酵素原先駆体の活性化のために用いら
れるプレ配列およびプロ配列として記載される任意のヌクレオチド配列、ベクタ
ー、あるいはモジュールのポリペプチドサブセットを指すものとする。「変異体
」という用語は、構造および機能において、核酸配列全体もしくはエンコードさ
れたタンパク質と実質的に同一な、あるいはそれらのフラグメントと実質的に同
一なヌクレオチドもしくはアミノ酸配列を指すものとする。核酸もしくはアミノ
酸配列は、もしその核酸もしくはアミノ酸の分子と別の核酸もしくはアミノ酸の
分子が類似した構造的特徴を有するか、あるいは双方の分子が類似した生物学的
性質を有する場合に「実質的に同じである」とする。従って、二つの分子が実質
的に同じ活性を有する場合は、たとえ一方の分子の構造が他方に見出されなくて
も、あるいはその二つのアミノ酸配列が同一でなくても、変異体であるとみなす
。「類似体」という用語は、別の関連したタンパク質と機能面で実質的に同じで
あるタンパク質分子を指す。

【００２９】 ここで、ＥＯＳと称される好酸球ｃＤＮＡライブラリーから分離されたセリー
ンプロテアーゼについて説明する。アミノ酸配列から推定されるプロテアーゼＥ
ＯＳに最も類似しているのは、クローン化されたセリーンプロテアーゼプロスタ
ジン（ｐｒｏｓｔａｓｉｎ）（Ｙｕら（１９９６）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３２：
３３４−４０）およびトリプターゼ（Ｍｉｌｌｅｒら（１９９０）、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６：８６４−７００）である。マスト細胞で豊富に生成さ
れるトリプターゼは、喘息性の炎症や閉塞に関係している（Ｊｏｈｎｓｏｎら（
１９９７）、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．１０：３８−４３）。プロテアーゼＥ
ＯＳヌクレオチドでＧｅｎｂａｎｋのデータベースをさらに相同検索した結果、
ヒトのコスミドクローンの非隣接域（４０７Ｄ８、Ｇｅｎｂａｎｋ受理＃ＡＣ０
０５５７０）と相同であることが判明した。この非隣接域は染色体１６ｐ１３．
３に位置している。Ｇｅｎｂａｎｋ受理＃ＡＣ００５５７０の付注に記載、提案
されたイントロン／エクソン結合から得られる連続した核酸配列の組合せにより
、本発明のプロテアーゼＥＯＳより短く且つ非隣接的であり、よって実質的に本
発明のプロテアーゼＥＯＳとは異なる核酸配列を生成される。つまり、Ｇｅｎｂ
ａｎｋ受理＃ＡＣ００５５７０の付注に記載のエクソンは、実験に基づかない手
段によって導かれたものなので、不正確である可能性が高い。従って、本発明の
プロテアーゼＥＯＳは、先行記載のないプロテアーゼを表す。本発明の、先行記
載のない配列の使用例は、染色体１６ｐ１３．３がプロテアーゼＥＯＳ遺伝子の
正確な位置であることを示す。興味深いことに、プロスタジンをエンコードする
遺伝子は、染色体１６ｐ１１．２上に配置されている（Ｙｕら（１９９６）、Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ ３２：３３４−４０）。一方、トリプターゼ遺伝子のいくつか
は、同じ染色体１６ｐ１３．３のゲノム内にクラスター化しており（Ｐａｌｌａ
ｏｒｏら（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３３５５−３３６２
）、それ故に結果的にプロテアーゼＥＯＳの遺伝子と一緒に局在している。最近
の遺伝学的データは、ある集団において、喘息になりやすい体質の決定因子を染
色体１６に結び付けている（Ｄａｎｉｅｌｓら（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌ
ｏｎｄｏｎ） ３８３：２４７−２５３）。

【００３０】 本発明は、好酸球のライブラリーから特定され、アレルギー性喘息患者から得
られ、プールされた疾病好酸球から分離されたポリＡ ＲＮＡを用いて構築され
たセリーンプロテアーゼＥＯＳをエンコードするＤＮＡに関する。本明細書で用
いられるプロテアーゼＥＯＳは、プロテアーゼとして具体的に機能し得るエンコ
ードされたタンパク質産物を指す。

【００３１】 プロテアーゼＥＯＳの完全なアミノ酸配列は過去に知られておらず、プロテア
ーゼＥＯＳをエンコードする完全なヌクレオチド配列もまた知られていなかった
。本明細書は、プロテアーゼＥＯＳをエンコードするＤＮＡ分子全長のクローニ
ングに関する最初の報告である。ｍＲＮＡ分布に基づき、制限された数の組織お
よび細胞種が上述のプロテアーゼを含むことが予測される。プロテアーゼＥＯＳ
を生成する能力を有する脊椎動物の細胞には、血液から分離された白血球が含ま
れるが、これに限定されない。他のタイプの組織の例として、ヒトの脾臓、網膜
、脊髄および卵巣であり得る。

【００３２】 プロテアーゼＥＯＳｃＤＮＡを分離する上で、他の細胞や細胞系も適切に使用
できる。適切な細胞の選別は、馴致細胞培地においてプロテアーゼＥＯＳタンパ
ク質分解活性をスクリーニングすることによってなされる。この検定においてＥ
ＯＳタンパク質分解活性を有する細胞種は、プロテアーゼＥＯＳＤＮＡもしくは
ｍＲＮＡの分離のために適切であろう。

【００３３】 当業者にとって既知の各種手順のいずれをプロテアーゼＥＯＳＤＮＡの分子ク
ローン化に用いてもよい。これらの方法には、これらに限定されないが、適切な
発言ベクターシステム中にプロテアーゼＥＯＳ含有ｃＤＮＡライブラリーの構築
後の、プロテアーゼ遺伝子の直接機能的発現を含む。別の方法は、バクテリオフ
ァージもしくはプラスミドシャトルベクターにおいて構築されたプロテアーゼＥ
ＯＳ含有ｃＤＮＡライブラリーを、プロテアーゼＥＯＳＤＮＡのアミノ酸配列か
ら設計された標識付けオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングすることを
含む。さらに別の方法は、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベク
ターにおいて構築されたプロテアーゼＥＯＳ含有ｃＤＮＡライブラリーを、プロ
テアーゼＥＯＳタンパク質をエンコードする部分的ｃＤＮＡでスクリーニングす
ることを含む。この部分的ｃＤＮＡは、精製されたプロテアーゼＥＯＳタンパク
質のアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計するこを経て、
プロテアーゼＥＯＳＤＮＡフラグメントの特定のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）増幅によって得られる。核酸データベースの相同検索を通して特定された、発
現配列タグ（ＥＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２１５：４０３−１０；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４−８）も
、この目的のために利用可能である。この特定のプロテアーゼは、保存性の高い
残基およびモチーフを含む多重遺伝子ファミリーの一員である。よって、関連し
ているが同一ではない相同なｃＤＮＡを特定するために、低いストリンジェンシ
ーでのｃＤＮＡライブラリースクリーニングが可能である。より最近、与えられ
た細胞種のＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの縮重オリゴヌクレオチドを用いた
直接的なＰＣＲが、目的の新規関連ｃＤＮＡを分離するための効果的アプローチ
となっている。別の方法として、完全長ｃＤＮＡ配列がひとたび発表されれば、
それは、完全コード配列の側面において合致するオリゴヌクレオチドプライマー
の設計を経て後、特定のＰＣＲ増幅により得ることができる。

【００３４】 別の方法は、ＲＮＡをプロテアーゼＥＯＳ生成細胞から分離し、そのＲＮＡを
生体外もしくは生体内の翻訳システムを介してタンパク質に翻訳することである
。ＲＮＡをタンパク質に翻訳することにより、たとえば抗プロテアーゼＥＯＳ抗
体を用いた免疫学的反応性によって同定可能であるプロテアーゼＥＯＳタンパク
質の少なくとも一部分を生成することができる。もし触媒領域全体が翻訳されな
ければならないのであれば、ＥＯＳタンパク質の機能的なタンパク質分解活性を
、プロテアーゼＥＯＳｍＲＮＡを含むＲＮＡのフラクションを特定するために用
いることができるであろう。この方法において、プロテアーゼＥＯＳ生成細胞か
ら分離されたＲＮＡのプールを、ＥＯＳタンパク質の少なくとも一部をエンコー
ドするＲＮＡの存在に関して分析することができる。プロテアーゼＥＯＳＲＮＡ
を非プロテアーゼＥＯＳＲＮＡから精製するために、ＲＮＡプールをさらに分別
することができる。この方法で生成されたペプチドもしくはタンパク質を分析し
てアミノ酸配列を提供し、今度はこのアミノ酸配列を、プロテアーゼＥＯＳｃＤ
ＮＡ生成用のプライマーを提供するために用いてよい。同様に、翻訳のために用
いられたＲＮＡを分析してヌクレオチド配列を提供し、これをプロテアーゼＥＯ
ＳｃＤＮＡ生成用のプローブを製造するのに用いてもよい。この方法は当業者に
おいて既知であり、たとえば（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８９） １−１６２６
）に記載がある。

【００３５】 他の種類のライブラリー、他の細胞もしくは細胞種から構築されたライブラリ
ーが、プロテアーゼＥＯＳをエンコードするＤＮＡを分離する上で有用であり得
ることは、当業者には自明のことである。他の種類のライブラリーには、他の細
胞、ヒト以外の生物体に由来するｃＤＮＡライブラリー、酵母の人工染色体（ｙ
ｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）を含むゲノ
ムＤＮＡライブラリー、およびコスミドライブラリーが含まれるが、これに限定
されない。

【００３６】 適当なｃＤＮＡライブラリーを、ＥＯＳタンパク質分解活性を有する細胞もし
くは細胞系統から調製できることは、当業者にとって明白である。プロテアーゼ
ＥＯＳｃＤＮＡを分離するためのｃＤＮＡライブラリーの調製において用いられ
る細胞もしくは細胞系の選別は、第一に、プロテアーゼＥＯＳに関連した生物学
的活性あるいはＥＯＳ特異的な免疫学的反応性の測定を用いて、ＥＯＳタンパク
質分解活性に関連した細胞を測定することによって行うことができる。

【００３７】 ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当業者において既知の標準的な技術によって
行うことができる。既知のｃＤＮＡライブラリー構築技術は、たとえば（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら（１９８９） １−１６２６）に記載がある。

【００３８】 プロテアーゼＥＯＳをエンコードするＤＮＡを適当なゲノムＤＮＡライブラリ
ーから分離し得ることは、当業者に明白である。ゲノムＤＮＡライブラリーの構
築は、当業者において既知の標準的な技術によって行うことができる。既知のゲ
ノムＤＮＡライブラリー構築技術は、たとえば（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８９
） １−１６２６）に記載がある。

【００３９】 上述の方法によってプロテアーゼＥＯＳ遺伝子をクローニングするためには、
プロテアーゼＥＯＳのアミノ酸配列が必要であろう。これを達成するために、プ
ロテアーゼＥＯＳタンパク質を精製し、自動シークエンサーによって部分的なア
ミノ酸配列を決定してよい。アミノ酸配列の全体を決定する必要はなく、部分的
なプロテアーゼＥＯＳＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅用のプライマーを製造す
るために、タンパク質から、アミノ酸６〜８個の二つの領域の直線的な配列が決
定される。または、決定されたアミノ酸配列のより大きな連続した広がりを用い
て、より長い縮重オリゴヌクレオチドプローブを合成することができる。このオ
リゴヌクレオチドプローブに標識を付け、プロテアーゼＥＯＳに対応するＤＮＡ
を分離するために、適当なｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーを適切な緊縮下
でスクリーニングに用いることができる。

【００４０】 適切なアミノ酸配列が特定されたら、それらをエンコードすることができるＤ
ＮＡ配列が合成される。遺伝コードは同義性を有するので、特定のアミノ酸をエ
ンコードするために一つ以上のコドン用いてよく、従って、類似のＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドの任意のセットによってアミノ酸配列をエンコードすることができ
る。上記のセットのうちただ一つのメンバーだけがプロテアーゼＥＯＳ配列と同
一であるが、たとえＤＮＡオリゴヌクレオチドが合致していなくても、プロテア
ーゼＥＯＳＤＮＡへハイブリッド形成することができる。合致していないＤＮＡ
オリゴヌクレオチドでも、プロテアーゼＥＯＳをエンコードするＤＮＡの特定と
分離を可能にする上で十分な程度にプロテアーゼＥＯＳＤＮＡへのハイブリッド
形成を行う。これらの方法によって分離されたＤＮＡは、様々な細胞種、無脊椎
動物および脊椎動物に由来するＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために
、また相同な遺伝子を分離するために用いられる。

【００４１】 精製された、生物学的活性を有するプロテアーゼＥＯＳは、いくつかの異なる
物理的形態を有してよい。プロテアーゼＥＯＳは、全長にわたりナセントまたは
加工されていないポリペプチドとして存在しても、部分的に加工されたポリペプ
チドとして存在しても、加工されたポリペプチドの組み合わせとして存在しても
よい。全長にわたりナセントなプロテアーゼＥＯＳポリペプチドは、翻訳後に特
定のタンパク質分解切断事象により修飾されてよく、この結果、全長にわたりナ
セントなポリペプチドのフラグメントが形成される。フラグメントあるいはフラ
グメントの物理的会合は、プロテアーゼＥＯＳに伴う完全な生物学的活性を有す
る可能性があるが、プロテアーゼＥＯＳ活性の程度は、個々のプロテアーゼＥＯ
Ｓフラグメントと物理的に会合したプロテアーゼＥＯＳポリペプチドフラグメン
トとの間で変動する可能性がある。

【００４２】 本明細書に記載の方法を通して得られた、クローン化されたプロテアーゼＥＯ
ＳＤＮＡは、適切なプロモーターおよび他の適切な転写調節要素を含む発現ベク
ター中に分子クローニングし、原核もしくは真核宿主細胞に移されて、組換え発
現され、組換えプロテアーゼＥＯＳタンパク質が生産されよう。そうした操作の
技術は（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８９） １−１６２６）に十分に記載されて
おり、当分野で既知である。

【００４３】 本明細書において、発現ベクターは、適切な宿主における遺伝子のクローン化
コピーの転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として定義され
る。そうしたベクターを、大腸菌を含む細菌、藍藻植物、植物細胞、昆虫細胞、
酵母細胞を含む真菌細胞、および動物細胞などの様々な宿主において真核性遺伝
子を発現するために用いることができる。

【００４４】 特別に設計されたベクターは、宿主間、たとえば細菌−酵母間、細菌−動物細
胞間、細菌−真菌細胞間あるいは細菌−無脊椎動物細胞間でのＤＮＡの往復を可
能にする。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自律複製のため
の複製起点、選択可能なマーカー、制限された数の有用な制限酵素部位、多くの
複製を作る潜在能力、および活性を有するプロモーターを含んでいる必要がある
。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼにＤＮＡが結合してＲＮＡ合成を開始す
るよう指令を下すＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモータとは、ｍＲＮ
Ａを高頻度で開始させるものである。発現ベクターにはクローニングベクター、
修飾されたクローニングベクター、特別に設計されたプラスミドもしくはウイル
スが含まれるが、これらに限定されない。

【００４５】 様々な哺乳類の発現ベクターを、哺乳類の細胞において組換えプロテアーゼＥ
ＯＳを発現するために用いることができる。商業的に利用可能な哺乳類の発現ベ
クターであって、組換えのタンパク質発現に適当なものの例には、ｐＣＩ Ｎｅ
ｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、ｐＭＡ
Ｍｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉ
ｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）ｐＢＰＶ−１（
８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）
（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎ
ｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐ
ＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）およびＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が
含まれるが、これらに限定されない。

【００４６】 様々な細菌発現ベクターを、細菌の細胞内に組換えプロテアーゼＥＯＳを発現
するために用いてよい。商業的に利用可能な細菌発現ベクターであって組換えタ
ンパク質発現のために適当なものの例には、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，
Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）およびｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａ
ｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎ
ｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が含まれるが、これらに限定されない。

【００４７】 様々な真菌類細胞発現ベクターを、酵母などの真菌類の細胞内に組換えプロテ
アーゼＥＯＳを発現するために用いてよい。商業的に利用可能な真菌類細胞発現
ベクターであって組換えプロテアーゼＥＯＳ発現のために適当なものの例には、
ｐＹＥＳ２（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＰｉｃ
ｈｉａ発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が含
まれるが、これらに限定されない。

【００４８】 様々な昆虫細胞発現システムを、昆虫の細胞内に組換えプロテアーゼＥＯＳを
発現するために用いてよい。商業的に利用可能なバキュロウイルス転移ベクター
であって、Ｓｆ９細胞内に組換えタンパク質発現用の組換えバキュロウイルスを
生成する上で適当なものの例には、ｐＦａｓｔＢａｃｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）、ｐＡｃＳＧ２（Ｐｈａｒ
ｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（ＩｎＶｉ
ｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が含まれるが、これらに限定されな
い。さらに、ドロソフィラ・シュナイダー系統（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈ
ｎｅｉｄｅｒ ｌｉｎｅ）２（Ｓ２）細胞内での組換えタンパク質の発現を可能
にする昆虫細胞ベクター類も利用できる（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ，ＣＡ）。

【００４９】 プロテアーゼＥＯＳをエンコードするＤＮＡを、組換え宿主細胞内での発現用
の発現ベクターにサブクローン化してよい。組換え宿主細胞は、大腸菌などの細
菌を含む（ただしこれに限定されない）原核細胞あるいは真核細胞、酵母などの
真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞系を含む（ただし
これに限定されない）哺乳類細胞、ドロソフィラＳ２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９
６３）およびカイコＳｆ９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７１１）由来の細胞系を含む
（ただしこれに限定されない）昆虫細胞であってよい。哺乳類の種に由来する細
胞系であって適当かつ商業的に利用可能のものの例には、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ
３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）
、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６
）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
１７１）、Ｌ細胞、およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）が
含まれるが、これらに限定されない。

【００５０】 発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リ
ポフェクションおよびエレクトロポレーションを含む（ただしこれらに限定され
ない）数多くの技術のいずれか一つを介して宿主細胞内に導入されてよい。発現
ベクターを含んでいる細胞はクローン的に増殖され、個々に分析されて、それら
の細胞がプロテアーゼＥＯＳタンパク質を生産するかどうか評価される。プロテ
アーゼＥＯＳを発現している宿主細胞クローンの同定は、抗プロテアーゼＥＯＳ
抗体を用いた免疫学的反応性、宿主細胞に伴われたＥＯＳタンパク質分解活性の
存在を含む（ただしこれらに限定されない）いくつかの手段によって行ってよい
。

【００５１】 プロテアーゼＥＯＳＤＮＡの発現は、生体外で生産された合成ｍＲＮＡを用い
て行ってもよい。プロテアーゼＥＯＳを生産する細胞から分離された合成ｍＲＮ
ＡもしくはｍＲＮＡは、コムギ麦芽の抽出物および網赤血球の抽出物を含む（た
だしこれらに限定されない）各種の無細胞システムにおいて効率的に翻訳され、
また、カエルの卵母細胞内へのミクロ注入を含む（ただしこれらに限定されない
）細胞に基づくシステムにおいて効率的に翻訳されるが、一般的にはカエル卵母
細胞内へのミクロ注入が好ましい。

【００５２】 最適レベルのＥＯＳタンパク質分解活性および／またはＥＯＳタンパク質をも
たらすプロテアーゼＥＯＳＤＮＡ配列（単数あるいは複数）を決定するために、
以下を含むプロテアーゼＥＯＳＤＮＡを構築することができる。すなわち約６９
塩基から約９２０塩基（これらの数は、最初のメチオニンの最初のヌクレオチド
および最初の停止コドンの前の最後のヌクレオチドに対応する。図１参照）から
の３０−ｋＤａタンパク質をエンコードするプロテアーゼＥＯＳｃＤＮＡの全長
オープンリーディングフレームと、ＥＯＳプロテアーゼをエンコードするｃＤＮ
Ａのいくつかの部分を含む複数の構築物（ただしこれらの構成要素に限定されな
い）。全ての構築物について、各構築物は、プロテアーゼＥＯＳｃＤＮＡの５’
もしくは３’の非翻訳領域を全く含まないように、あるいは全て含むように、あ
るいは未翻訳領域のいくつかの部分を含むように設計されてよい。プロテアーゼ
ＥＯＳ活性およびタンパク質発現のレベルは、これらの構築物（構築物は一つの
種類でも複数の種類の組み合わせでもよい）を適当な宿主細胞内に導入した後で
評価することができる。過渡的な検定において最適の発現を示すプロテアーゼＥ
ＯＳＤＮＡカセットを決定した後、このプロテアーゼＥＯＳＤＮＡ構築物は、哺
乳類の細胞、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む（ただしこれらに限定されない）宿主細胞内で発現さ
せるべく、各種の発現ベクターに移される。

【００５３】 宿主細胞トランスフェクタントおよびミクロ注入された卵母細胞を、プロテア
ーゼＥＯＳタンパク質分解活性のレベルおよびＥＯＳタンパク質のレベルを検定
するために、以下の方法によって用いることができる。組換え宿主細胞の場合、
この方法は、少なくともフラグメントもしくはサブユニットをエンコードするプ
ロテアーゼＥＯＳＤＮＡを含む、一つの（できれば二つ以上の）プラスミドの共
トランスフェクションを含む。卵母細胞の場合、この方法は、プロテアーゼＥＯ
Ｓをエンコードする合成ＲＮＡの共注入を伴う。発現を充分に行わせる上で適切
な時間が経過した後、細胞タンパク質をたとえば^３５Ｓ−メチオニンで２４時間
、代謝的に標識を付け、その後、細胞の溶解物および細胞培養液の上澄みを集め
、プロテアーゼＥＯＳタンパク質に向けられたポリクローン抗体を用いて免疫沈
澱させる。

【００５４】 プロテアーゼＥＯＳ発現を検出する他の方法は、プロテアーゼＥＯＳｃＤＮＡ
でトランスフェクトした全細胞もしくはプロテアーゼＥＯＳｍＲＮＡを注入した
卵母細胞において、ＥＯＳタンパク質分解活性を直接測定することを含む。タン
パク質分解活性は、馴致培地あるいは細胞の溶解物を色原体もしくは蛍光体基質
の加水分解によって分析することにより測定できる。プロテアーゼＥＯＳを発現
している組換え宿主細胞の場合、モックトランスフェクトした細胞すなわちプロ
テアーゼＥＯＳＤＮＡが挿入されていない発現ベクターでトランスフェクトされ
た細胞よりも相対的に高いレベルの基質の加水分解が観察されることになる。卵
母細胞の場合、プロテアーゼＥＯＳをエンコードするＲＮＡに感染した卵母細胞
に由来する溶解物もしくは馴致培地は、無関係なＲＮＡでプログラムされた卵母
細胞よりも高いレベルの基質の加水分解を示すことになる。

【００５５】 タンパク質分解活性を検出する他の方法には、放射標識付けタンパク質のタン
パク質分解過程で生じる生成物を測定すること（Ｃｏｏｌｉｃａｎら（１９８６
） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４１７０−６）、分解されたタンパク質
基質の蛍光光度的分析（Ｌｏｎｅｒｇａｎら（１９９５） Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃ
ｉ．６０：７２−３，７８；Ｔｗｉｎｉｎｇ（１９８４） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．１４３：３０−４）あるいは比色分析（Ｂｕｒｏｋｅｒ−Ｋｉｌｇｏｒ
ｅおよびＷａｎｇ（１９９３） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：３８７−
９２）が含まれるが、これらに限定されない。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行った後のザイモグラフィー（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）（Ｗａｄｓｔｒ
ｏｅｍおよびＳｍｙｔｈ（１９７３） Ｓｃｉ．Ｔｏｏｌｓ ２０：１７−２１
）、および蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅｓｏｎａｎ
ｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）に基づく方法（Ｎｇおよび
Ａｕｌｄ（１９８９） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：５０−６）も、タ
ンパク質分解活性を検出するために用いられる方法である。

【００５６】 宿主細胞内のプロテアーゼＥＯＳタンパク質のレベルは、免疫親和性によって
定量できる。プロテアーゼＥＯＳに特異な親和性を有するビーズあるいはプロテ
アーゼＥＯＳに特異性を有する抗体が、たとえば^３５Ｓ−メチオニンで標識を付
けた（あるいは標識を付けていない）プロテアーゼＥＯＳタンパク質を分離する
ために用いられる。標識を付けたプロテアーゼＥＯＳタンパク質は、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって分析される。標識を付けられていないＥＯＳタンパク質は、プロ
テアーゼＥＯＳに特異性を有する抗体を用い、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ
もしくはＲＩＡ検定によって検出される。

【００５７】 遺伝コードは同義性を有するので、一つの特定のアミノ酸をエンコードするの
に二つ以上のコドンを用いてよく、従って、類似ＤＮＡオリゴヌクレオチドのい
ずれの組によってもそのアミノ酸配列はエンコードされ得る。その組のうちただ
一つのみがプロテアーゼＥＯＳ配列と同一であるが、適当な条件下であれば、合
致していないＤＮＡオリゴヌクレオチドであっても、プロテアーゼＥＯＳにハイ
ブリッド形成可能である。別の条件下では、合致していないＤＮＡオリゴヌクレ
オチドであっても、プロテアーゼＥＯＳをエンコードするＤＮＡの同定および分
離が可能な程度に、プロテアーゼＥＯＳにハイブリッド形成しよう。

【００５８】 ある特定の生物体由来のプロテアーゼＥＯＳをエンコードするＤＮＡを、他の
生物体に由来するプロテアーゼＥＯＳＤＮＡの相同体を分離し精製するのに用い
てよい。これを達成するには、プロテアーゼＥＯＳの相同体をエンコードするＤ
ＮＡを含むサンプルを、適当なハイブリッド形成条件下で第一のプロテアーゼＥ
ＯＳＤＮＡと混合する。ハイブリッド形成されたＤＮＡ複合体が分離され、相同
なＤＮＡをエンコードするＤＮＡがそれから精製される。

【００５９】 特定のアミノ酸を指定する各種のコドンには、相当量の重複性が存在すること
が知られている。従って、本発明は、結果的に同一のアミノ酸の翻訳を指定する
代わりのコドンを含むＤＮＡ配列にも向けられている。この明細書の目的のため
に、コドンが一つ以上置き換えられている配列は、縮重変異として定義される。
本発明の範囲内には、ＤＮＡ配列もしくは翻訳されたタンパク質における、発現
されたタンパク質の最終的な物性を実質的に変えない変異が含まれる。たとえば
、バリンをロイシンに、アルギニンをリシンに、アスパラギンをグルタミンに代
えても、ポリペプチドの機能性に変化は生じない。

【００６０】 ペプチドを指定するＤＮＡ配列を、天然に存在するペプチドの性質とは異なる
性質を有するペプチドをコードするように変えてよいことは、既知である。ＤＮ
Ａ配列を変える方法には、部位指向変異誘発が含まれるが、これに限定されない
。変えられた性質の例には、基質の酵素への親和性もしくはリガンドのレセプタ
ーの親和性の変化が含まれるが、これに限定されない。

【００６１】 組換えセリーンプロテアーゼ精製工程のいくつかは、利用可能であり且つ適切
に使用できる（Ｈａｎｓｓｏｎら（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
９：１９４２０−６；Ｌｉｔｔｌｅら（１９９７） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７２：２５１３５−２５１４２；Ｔａｋａｙａｍａら（１９９７） Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１５８２−２１５８８；Ｙａｍａｏｋａら（１９９
８） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１８９５−１１９０１）。プロテア
ーゼＥＯＳの自然界の原料からの精製に関して上述したように、塩分別、イオン
交換クロマトグラフィー、サイズ除去クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタ
イト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを個別に
適用することにより、あるいはこれらの方法を様々に組み合わせることにより、
組換えプロテアーゼＥＯＳを、細胞溶解物および抽出物から、あるいは馴致培地
から精製してよい。組換え宿主細胞におけるプロテアーゼＥＯＳの発現後、Ｓ１
セリーンプロテアーゼファミリーの多くのものと同様に、プロテアーゼＥＯＳタ
ンパク質を、制限されたタンパク質分解をタンパク質分解活性を有するために必
要とするであろう不活性の酵素原先駆体の形態として回収してよい。

【００６２】 生化学的および酵素学的分析のための、全長にわたるセリーンプロテアーゼｃ
ＤＮＡの発現における大きな欠点は、大量の不活性な酵素原が生産される可能性
が圧倒的に高いことである。これらの酵素原先駆体は、顕著なタンパク質分解活
性をほとんどあるいは全く持たないことがよくあり、よって、現在利用可能な二
つの方法のいずれか一つの方法で活性化されなければならない。一つの方法は自
己活性化に依るものであり（Ｌｉｔｔｌｅら（１９９７） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７２：２５１３５−２５１４２）、環境が正確に整えられていれば、均
質に精製されたプロテアーゼ調製物において起こり得る。分析者は、そうした条
件を厳しく評価する必要があり、そのため高濃度のタンパク質を必要とすること
がよくある。第二の方法は、トリプシンなどの代理の活性化プロテアーゼを用い
て分析中のセリーンプロテアーゼを切断し、汚染プロテアーゼを不活性化するか
（Ｔａｋａｙａｍａら（１９９７） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１５
８２−２２５８８）または物理的に除去して（Ｈａｎｓｓｏｎら（１９９４）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９４２０−６）活性化に至るものである。
しかし、両方の方法において、そうした活性化技術を用いることにより、分解や
サンプルの損失につながる不適切な活性化もしくは過剰消化が結果的に生じる可
能性が常に存在するので、抽出条件を実験的に確立すると共に、活性化反応を注
意深く監視する必要がある。Ｓ１セリーンプロテアーゼファミリーの特定のもの
を研究している研究者は、制限プロテイナーゼを、細菌において発現された酵素
原の活性化に利用し（Ｗａｎｇら（１９９５） Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐ
ｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７６：６８１−４）、また哺乳類の細胞において発現され
た酵素原の活性化に利用している（Ｙａｍａｓｈｉｒｏら（１９９７） Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３５０：１１−１４）。報告の一つに
おいて、その著者は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現システムにおいて内
在性酵母ＫＥＸ２シグナルペプチダーゼを利用することにより、タンパク質分解
的に加工され且つ活性化されたマウスのグランザイムＢの分泌に成功している（
Ｐｈａｍら（１９９８） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６２９−１６３
３）。本発明のもう一つの態様は、プロテアーゼの活性化を促すプロテアーゼＥ
ＯＳをエンコードするプロテアーゼＥＯＳを含む融合遺伝子を提供する。

【００６３】 プロテアーゼＥＯＳＤＮＡを含むＤＮＡクローンは、組換え宿主内に発現され
たとき、プロテアーゼＥＯＳのアミノ酸配列を有するタンパク質（タンパク質分
解活性を持っている場合と持っていない場合がある）を製造するタンパク質をエ
ンコードするものとされる。プロテアーゼＥＯＳＤＮＡの発現により、プロテア
ーゼＥＯＳをエンコードするポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを注入された卵母細胞において
観察される性質が再構築される。

【００６４】 組換えプロテアーゼＥＯＳは、プロテアーゼＥＯＳの全長にわたるナセントプ
ロテアーゼＥＯＳポリペプチドフラグメントに対して特異性を有するモノクロー
ナルもしくはポリクローナル抗体で作られた免疫親和性コラムを用いることによ
って、他の細胞性タンパク質から分離される。プロテアーゼＥＯＳに対する単一
特異性抗体は、プロテアーゼＥＯＳに対して反応する抗体を含む哺乳類抗血清か
ら精製されるか、あるいは、（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６
） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：５１１−９）の技術を用いて、プロテア
ーゼＥＯＳに反応するモノクローナル抗体として調製される。本明細書で用いら
れる単一特異性抗体とは、プロテアーゼＥＯＳに対する均一な結合特徴を備えた
一種類の抗体もしくは複数種の抗体として定義される。本明細書で用いられる均
一な結合とは、たとえば上述のようなプロテアーゼＥＯＳに関連したそれのよう
な、特定の抗原すなわちエピトープに結合する抗体種の能力を指す。プロテアー
ゼＥＯＳ特異性抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなど
の動物（ウサギが好ましい）を、適切な濃度のプロテアーゼＥＯＳで（免疫アジ
ュバントは入れても入れなくてもよい）免疫化することによって得られる。

【００６５】 免疫前の血清を、最初の免疫の前に採取する。各動物は、約０．１ｍｇから約
１０００ｍｇのプロテアーゼＥＯＳタンパク質もしくはペプチドを注射される。
このプロテアーゼＥＯＳタンパク質もしくはペプチドは、類推されたプロテアー
ゼＥＯＳＤＮＡ配列に由来するか、あるいは使用してよい免疫アジュバントと連
関した、プロテアーゼＥＯＳタンパク質自身の化学的劣化（分解）もしくは酵素
的消化によって得られる。そのような使用してよいアジュバントの例には、フロ
イント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈殿、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｐａｖｕｍおよびｔＲＮＡを含むオイル−水エマルジョン、あるいはＴｉ
ｔｅｍａｘ（ＣｙｔＲｘ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）が含まれるが、これらに限
定されない。最初の免疫化は、多くの接種箇所で、皮下（ＳＣ）注射か腹腔内（
ＩＰ）注射か、あるいはその両方で接種された、好ましくはフロイント完全アジ
ュバントに溶解したプロテアーゼＥＯＳ抗原を含む。各動物は、抗体力価を評価
すべく、規則的な間隔で、好ましくは毎週採血される。最初の免疫化に続けて、
ブースター注射を動物に行っても行わなくてもよい。ブースター注射をされてい
る動物には、一般に、フロイント完全アジュバントに溶解した同量の抗原を同じ
ルートで接種する。ブースター注射は、約三週間の間隔で、最大の力価が得られ
るまで行われる。各ブースター免疫化の約７日後もしくは一回だけの免疫化の約
１週間後に、動物から採血し、血清を採取し、アリクウォットを約−２０℃で保
存する。

【００６６】 プロテアーゼＥＯＳに反応するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）は、同系繁殖
によるマウス（好ましくはＢａｌｂ／ｃ）を、類推されたプロテアーゼＥＯＳＤ
ＮＡ配列に由来するか、あるいはプロテアーゼＥＯＳタンパク質自身の化学的分
解もしくは酵素的消化によって得られるプロテアーゼＥＯＳタンパク質もしくは
ペプチドで免疫化することによって調製される。マウスは、上述のように、約０
．５ｍｌの緩衝液もしくは生理食塩水に溶解した約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ（好
ましくは約１ｍｇ）のプロテアーゼＥＯＳ抗原を同体積の使用してよいアジュバ
ントと混合したもので、腹腔内注射あるいは皮下注射によって免疫化される。フ
ロイント不完全アジュバントが好ましい。マウスには０日目に最初の免疫化を行
い、約３週間〜約３０週間休ませる。免疫化されたマウスは、リン酸塩で緩衝さ
れた生理食塩水などの緩衝液に溶解した約０．１〜約１０ｍｇのプロテアーゼＥ
ＯＳ抗原で、静脈注射（ＩＶ）ルートによって少なくとも一回ブースター免疫化
される。抗体陽性マウスから、白血球（好ましくは脾臓の白血球）を、免疫化さ
れたマウスから当業者にとって既知の標準的な工程によって脾臓を取り出すこと
によって得る。脾臓の白血球を適当な融合パートナー（好ましくは骨髄腫細胞）
と、安定したハイブリドーマの形成が可能な条件下で混合することにより、ハイ
ブリドーマ細胞が生成される。融合パートナーの例にはマウス骨髄腫細胞Ｐ３／
ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０が含まれるが
、これに限定されない。Ｓｐ２／０が好ましい。抗体生成細胞および骨髄腫細胞
は、約３０％〜約５０％の濃度で、約１０００重量モルのポリエチレングリコー
ル内で融合される。融合されたハイブリドーマ細胞は、ヒポキサンチン、チミジ
ンおよびアミノプテリンを補ったＤｕｌｂｅｃｃｏの改質されたイーグルズ培養
基（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ，
ＤＭＥＭ）における成長によって、当業者にとっては既知の工程によって選別さ
れた。１４、１８および２１日後に成長が陽性のウェルから上澄み液を採取し、
抗原としてプロテアーゼＥＯＳもしくは抗原性ペプチドを用いた固相免疫放射線
検定（ＳＰＩＲＡ）などの免疫検定によって、抗体生産のためのスクリーニング
を行う。培養液も、ＭｏＡｂのアイソタイプを評価すべく、オクタロニー沈殿検
定で試験される。抗体陽性細胞に由来するハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅ
ｒｓｏｎの軟寒天技術（Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｉｎ Ｔ
ｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，１９７３）によってクローンする。

【００６７】 モノクローナル抗体は、プリスタンを投与されたＢａｌｂ／ｃマウスに、投与
後約４日目に一匹当たり約０．５ｍｌの約２×１０^６〜約６×１０^６個のハイブ
リドーマ細胞を注射することにより、生体内で生成される。細胞転移の約８〜１
２日後に腹水液を採取し、当業者にとっては既知の技術でモノクローナル抗体が
精製される。

【００６８】 抗プロテアーゼＥＯＳＭｏＡｂの生体内での生成は、約２％のウシ胎児血清を
含むＤＭＥＭにおいてハイブリドーマを培養し、十分な量の特異性ＭｏＡｂを得
ることによって行われる。モノクローナル抗体は、当業者にとって既知の技術に
よって精製される。

【００６９】 腹水あるいはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、各種の血清学的あるいは免
疫学的検定によって評価され、そうした検定には、沈殿、受動的凝集、酵素結合
イムノスルベント（ＥＬＩＳＡ）技術および放射線免疫検定（ＲＩＡ）技術が含
まれるが、これに限定されない。体液もしくは組織、細胞抽出物におけるプロテ
アーゼＥＯＳの存在を検出するために、これらに類似の検定が用いられる。

【００７０】 単一特異性抗体を生成する上記の方法を、プロテアーゼＥＯＳポリペプチドフ
ラグメントあるいは全長にわたるナセントプロテアーゼＥＯＳポリペプチドに対
して特異性を有する抗体を生成するのに利用できることは、当業者であれば自明
である。特に、ただ一つの、あるいは二つ以上のプロテアーゼＥＯＳエピトープ
に対して特異性を有する単一特異性抗体を生成できることは、当業者にとって自
明である。

【００７１】 プロテアーゼＥＯＳ抗体アフィニティコラムは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルで活性化されたゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ）に抗体を加え、抗体とアガロースゲルビーズ支持体との間に共有結合を形
成させることによって製造される。その後、抗体は、スペーサーアームとのアミ
ド結合を介してゲルに接続される。残りの活性化されたエステルは、１Ｍのエタ
ノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で活性を失わせる。コラムを水で、続いて０．２
３ＭのグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗い、共有結合していない抗体すなわち
外来のタンパク質を除去する。その後、リン酸塩で緩衝された生理食塩水（ｐＨ
７．３）でコラムを平衡状態にし、プロテアーゼＥＯＳを含んでいる細胞培養基
の上澄み液すなわち細胞抽出液をゆっくりとコラムに通す。そして、光学濃度（
Ａ_２８０）がバックグラウンドに低下するまでコラムをリン酸塩で緩衝した生理
食塩水で洗い、タンパク質を０．２３ＭのグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出
させる。精製されたプロテアーゼＥＯＳタンパク質を、リン酸塩で緩衝した生理
食塩水から透析する。

【００７２】 プロテアーゼＥＯＳは、エンコードされたプロテアーゼＥＯＳタンパク質が通
常の生理学的状態で（また、あるいは病理学的状態で）重要な機能を果たす網膜
、卵巣および胃で発現される。よって、プロテアーゼＥＯＳ機能の調節剤を、こ
れらの組織に影響を与えている疾患を治療するのに用いることができる。本発明
の発見者は、プロテアーゼＥＯＳｍＲＮＡが、ヒトの血小板、血球の物質交代の
主要な場である脾臓、ならびに白血球（より詳しく言えば好酸球）において発現
されることを発見した。好酸球増加は、好酸球の循環の高まりによって特徴づけ
られる条件であり、気管支喘息を含む数多くのアレルギー状態に関連している（
Ｇｌｅｉｃｈ（１９９６） Ａｌｌｅｒｇｏｌ．Ｉｎｔ．４５：３５−４４）。
よって、血小板および免疫システムのある種の細胞におけるプロテアーゼＥＯＳ
の発現は、それが止血および免疫プロセスのサブセットにおいて何らかの役割を
演じていることを示している。従って、プロテアーゼＥＯＳ機能の調節剤を、止
血における疾患を治療するために、および／またはある種の免疫反応を調節する
ために使える可能性がある。ＥＯＳはマクロファージにおいて発現され、これら
の細胞は、傷の治癒、アテローム硬化症、免疫および炎症反応などの様々な生理
学的および病理学的条件において重要な役割を果たす。

【００７３】 マクロファージおよび非特異的（先天的）免疫反応：免疫システムの全体的機
能は、外来物質を非自己として認識し、この物質を排除あるいは中和することに
よって、いかなる外来物質からも宿主を保護することである。この全体的な機能
は、免疫システムの二つの独立した、しかし相互作用的な反応、すなわち非特異
的（先天的）反応と特異的（後天的）反応を通して達成される。マクロファージ
は主に非特異的免疫性に貢献し、防御の二次的なラインにおいて重要な役割を果
たす。マクロファージは、循環している単核細胞に由来する。マクロファージが
標的の組織に移住すると、単核細胞はずっと大きく成長し、組織マクロファージ
となる。組織マクロファージは、一般に、感染性を有する因子に容易に晒される
身体域に存在する。組織マクロファージは、外来物質および老化した赤血球を血
液から除く、脾臓内のマクロファージと、細菌の胃腸管を介した侵入から保護す
る、肝臓脈洞内のクップファー細胞と、局部組織で破壊されなかった外来粒子の
破壊を助ける、リンパ節内のマクロファージと、微細な塵、カーボンおよび／ま
たは細菌などの吸入された異物から保護する肺胞のマクロファージとを含む。

【００７４】 マクロファージおよび傷の治癒：皮膚が破壊されると、欠損をふさぐ凝血とい
う形で一時的な修復が達成され、その後何日にもわたって傷を再生し治癒する一
連の工程が開始される。炎症細胞（好中球および単核白血球）、次いで繊維芽細
胞および毛細管が凝血に侵入し、傷の境界部分を互いに引き寄せる収縮性の肉芽
化組織を形成する。血液中の単核白血球は、様々な走化シグナルによって傷の箇
所に誘引され、マクロファージとなる（Ｍａｒｔｉｎ Ｐ，１９９７）。マクロ
ファージは、効率的な傷の治癒のために必須である。もしマクロファージの浸潤
が妨げられると、治癒は甚だしく阻害される（Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ ＳＪおよび
Ｒｏｓｓ Ｒ，１９７５）。マクロファージの任務には、残存している病理学的
生物体、他の細胞およびマトリックスの屑があれば何でも食べてしまうことが含
まれる。また、マクロファージは傷の箇所で一連の成長ファクターおよびサイト
カインを放出し、これにより脱顆粒している血小板や好中球によって放出された
早期の傷シグナルを増幅する。ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ
１，２および４、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦを含む数多くの成長ファクターが、マクロ
ファージによって分泌される。マクロファージは多くのプロテアーゼも生成し、
これらのプロテアーゼはフィブリンの沈着やコラーゲン形成、ならびに細胞外マ
トリックスの代謝回転に関わっている。これらのファクターは全て、傷の境界部
分において比較的着性の高い細胞系列を増殖させると共に侵襲性を持たせ、傷の
隙間に新しいマトリックスを構築する。皮膚の損傷の大部分は、一週間か二週間
以内に迅速かつ効率的に治癒する。しかし、最終的な生成物は、美的にも機能的
にも完全とは言えない。損傷箇所で失われた表皮の付属肢は再生せず、傷が直っ
たとき、びっしりと存在する平行な束の中でコラーゲンマトリックスは貧弱にし
か再構築されていない結合組織の傷跡が残る。

【００７５】 マクロファージおよびアテローム硬化：早期のアテローム硬化の損傷は、元々
は主としてマクロファージである脂質付着細胞（泡沫細胞）によって特徴付けら
れる。泡沫細胞形成のプロセスは明らかでないが、化学的に改質されたＬＤＬ分
子、アセチルＬＤＬがスカベンジャーレセプタを介してマクロファージに取り込
まれ、結果として脂質の集積と泡沫細胞の発達が生じるという報告がある（Ｇｏ
ｌｄｓｔｅｉｎら、１９７９）。そのうえ、内皮細胞によって改質されたＬＤＬ
も、マクロファージによって取り込まれ、代謝され得る（Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎら
、１９８１）。マクロファージから放出されたプロテアーゼは、ＬＤＬの改質、
あるいはアテローム硬化の後期段階におけるその後のプラークの不安定化に関わ
っている可能性がある。

【００７６】 プロテアーゼＥＯＳＤＮＡもしくはＲＮＡ、プロテアーゼＥＯＳもしくはプロ
テアーゼＥＯＳタンパク質に対する抗体を含むキットを準備してよい。そうした
キットは、サンプル中の、プロテアーゼＥＯＳＤＮＡにハイブリッド形成するＤ
ＮＡを検出するために、あるいはプロテアーゼＥＯＳタンパク質もしくはペプチ
ドフラグメントの存在を検出するために用いられる。そのような特徴付けは、法
医学的分析、診断への応用、および疫学的研究を含む（ただしこれらに限定され
ない）様々な目的のために有用である。

【００７７】 本発明は、プロテアーゼＥＯＳをエンコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現
ならびに生体内でのプロテアーゼＥＯＳタンパク質の機能を調節する化合物をス
クリーニングする方法にも適用される。こうした活性を調節する化合物は、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質あるいは非タンパク質様の有機分子である可
能性がある。化合物は、プロテアーゼＥＯＳをエンコードするＤＮＡもしくはＲ
ＮＡの発現、あるいはプロテアーゼＥＯＳタンパク質の機能を増強もしくは弱め
ることによって、調節する。プロテアーゼＥＯＳをエンコードするＤＮＡもしく
はＲＮＡの発現、あるいはプロテアーゼＥＯＳタンパク質の機能を調節する化合
物を、様々な検定によって検出してよい。検定は、発現もしくは機能に変化があ
るか否かを判定する簡便な「イエス／ノー」検定でよい。試験サンプルにおける
発現もしくは機能を標準サンプルにおける発現もしくは機能のレベルと比較する
ことにより、検定を定量的に行ってよい。このプロセスにおいて確認された調節
剤は、治療的因子として潜在的有用性を有する。プロテアーゼＥＯＳタンパク質
分解活性を調節する化合物を検出する方法は、化合物、プロテアーゼＥＯＳ、お
よび適当な標識を付けた基質を組み合わせることと、時間の関数として基質の量
を変化させることによってプロテアーゼに対する化合物の効果をモニターするこ
とを含む。標識基質の例には、放射線で標識された基質（Ｃｏｏｌｉｃａｎら（
１９８６） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４１７０−６）、蛍光で標識さ
れた基質（Ｌｏｎｅｒｇａｎら（１９９５） Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．６０：７
２−３，７８；Ｔｗｉｎｉｎｇ（１９８４） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４
３：３０−４）、あるいは比色検定的に標識された基質（Ｂｕｒｏｋｅｒ−Ｋｉ
ｌｇｏｒｅおよびＷａｎｇ（１９９３） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：
３８７−９２）が含まれるが、これらに限定されない。ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行った後のザイモグラフィー（ＷａｄｓｔｒｏｅｍおよびＳｍ
ｙｔｈ（１９７３） Ｓｃｉ．Ｔｏｏｌｓ ２０：１７−２１）、および蛍光共
鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づく方法（ＮｇおよびＡｕｌｄ（１９８９）
Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：５０−６）も、プロテアーゼＥＯＳタン
パク質分解活性を調節する化合物を検出するために用いられる方法である。作動
物質である化合物は、時間の関数として基質の分解速度を増加させ、残存してい
る基質の量を減少させる。拮抗物質である化合物は、時間の関数として基質の分
解速度を減少させ、残存している基質の量を増加させる。

【００７８】 プロテアーゼＥＯＳをエンコードするＤＮＡ配列に対して相補的なヌクレオチ
ド配列を、アンチセンス療法用に合成できる。これらのアンチセンス分子は、Ｄ
ＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートなどのＤＮＡの安定した
誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなどのＲＮＡの安定した誘導体、あ
るいは他のプロテアーゼＥＯＳアンチセンスオリゴヌクレオチドに似た物質であ
ってよい。プロテアーゼＥＯＳアンチセンス分子を、マイクロ注入、リポゾーム
カプセル封入、あるいはアンチセンス配列を含むベクターからの発現によって細
胞内に導入してよい。プロテアーゼＥＯＳアンチセンス療法は、プロテアーゼＥ
ＯＳ発現または活性を減少させるのが望ましい疾病治療にために特に有用である
可能性がある。

【００７９】 プロテアーゼＥＯＳ遺伝子療法を、プロテアーゼＥＯＳを標的たる生物体の細
胞へ導入するために用いてよい。プロテアーゼＥＯＳ遺伝子を、受け取り側であ
る宿主細胞への感染によってプロテアーゼＥＯＳＤＮＡの転移を仲介するウイル
ス性のベクター内に連結することができる。適当なウイルス性ベクターには、レ
トロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、種痘
症ウイルス、ポリオウイルスなどが含まれる。または、プロテアーゼＥＯＳＤＮ
Ａを、リガンドＤＮＡ共役もしくはアデノウイルスリガンドＤＮＡ共役を用いた
、レセプタによって仲介された標的ＤＮＡ転移、リポフェクション膜融合、ある
いは直接的なマイクロ注入を含む非ウイルス的技術によって、遺伝子療法のため
に細胞に転移することができる。これらの手法およびその変形例は、半ビボなら
びに生体内でのプロテアーゼＥＯＳ遺伝子治療のために適切である。プロテアー
ゼＥＯＳ遺伝子療法は、プロテアーゼＥＯＳの発現もしくは活性を高めることが
有益である疾病治療のために特に有用である可能性がある。

【００８０】 プロテアーゼＥＯＳＤＮＡ、プロテアーゼＥＯＳＲＮＡ、プロテアーゼＥＯＳ
タンパク質、もしくはプロテアーゼＥＯＳ活性の調節剤を含む薬剤として有用な
組成物は、薬剤に使用が認められる担体との混和などによる既知の方法によって
製剤されてよい。そのような担体および製剤方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出される。効果的な投与
をする上で適当な、薬剤として認め得る組成物を形成するためには、そうした組
成物が効果的な量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいは調節剤を含むことが必
要である。

【００８１】 本発明の治療用もしくは診断用組成物は、プロテアーゼＥＯＳ関連活性の調節
が示されている疾患を治療あるいは診断するのに十分な量で、各個人に投与され
る。効果的な量は、個人の体調、体重、性別および年齢などの各種のファクター
によって変動する可能性がある。他のファクターには、投与の形態が含まれる。
医薬組成物を、皮下注射、局所注射、経口投与、および筋肉内注射などの様々な
経路によって各個人にもたらしてよい。

【００８２】 「化学的誘導体」という用語は、ベースとなっている分子の一部では通常ない
付加的な化学的構成部分を含む分子を指す。そのような付加的な部分は、ベース
となっている分子の溶解度、半減期、吸収などを向上させる。あるいは、そのよ
うな付加的な部分は、ベースとなっている分子の望ましくない副作用を弱めたり
、ベースとなっている分子の毒性を減少させる可能性がある。そのような付加的
な部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓなど様々なテキストに記載されている。

【００８３】 いかなる毒性の可能性も最小限にしながらプロテアーゼＥＯＳ活性を最も好適
に抑制すべく、本明細書に開示された方法に基づいて確認された化合物を単独で
、通常の試験によって定義された適切な投与量で用いてよい。また、他の薬剤と
一緒に投与したり、他の薬剤と連続して投与することが望ましい場合がある。

【００８４】 プロテアーゼＥＯＳを、洗濯用洗剤、スキンケアローションもしくはクリーム
を含む、薬剤以外の商業産物における活性成分として製剤してもよい。これらの
製剤例において、プロテアーゼＥＯＳは、タンパク質を分解して産物の効き目を
高めるために利用される。たとえば、洗濯用洗剤として製剤される場合、含有さ
れているプロテアーゼＥＯＳは、タンパク質の汚染物質を劣化して繊維から落と
し、有機化合物を洗剤および水にさらに解けやすくすることにより、「しみ抜き
剤」として機能する。剥離すなわち角質層の表層を除去するプロセスを助けるべ
く、プロテアーゼＥＯＳをスキンケア産物に含めることができる。プロテアーゼ
ＥＯＳを薬剤以外の商業的製剤において利用するさらなる利点は、プロテアーゼ
ＥＯＳがヒト起源であるため、敏感な個人にもアレルギー反応を誘発する可能性
が低いことである。

【００８５】 本発明は、本発明の新規な治療法において使用する上で適当な、局所的、経口
的、システマチック、あるいは非経口的な医薬製剤を提供するという目的も有す
る。プロテアーゼＥＯＳ活性のモジュレーションにおける使用に関し本発明によ
り活性成分として確認された化合物すなわち調節剤を含む化合物を、投与のため
の従来のビヒクルにおいて、非常に様々な療法的投与形態で投与することができ
る。たとえば、化合物すなわち調節剤を、錠剤、カプセル（錠剤、カプセル共に
時限放出製剤および抑制放出製剤を含む）、ピル、粉末、顆粒、エリキシール、
チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップ、乳剤といった経口投与形態で、あるいは注
射によって投与することができる。同様に、化合物すなわち調節剤を、静脈注射
（ボーラス、点滴）、腹腔内注射、皮下注射、閉塞（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）あり
の（あるいはなしの）局所注射、筋肉内注射の形で、医薬品分野の当業者であれ
ば既知の形態を用いて投与することができる。プロテアーゼＥＯＳ調節剤として
、効力があるが毒性はない量の所望の化合物を用いることができる。

【００８６】 産物の一日の投与量は、患者一人当たり０．０１ｍｇから１０００ｍｇ／日の
広い範囲で変えてよい。経口投与に関して、治療すべき患者への投与量を症状に
合わせて調節するために、活性成分を０．０１、０．０５、０．１、０．５、１
．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０および５０．０ミリグラ
ム含んだスコアされた（あるいはスコアされていない）タブレットの形で提供す
ることが望ましい。効果的な量の薬は、通常、一日当たり約０．０００１ｍｇ／
ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇのレベルの投与により与えられる。この範囲は、
より正確には、一日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／体重ｋｇであ
る。プロテアーゼＥＯＳ調節剤の投与量は、所望の効果を達成するために複数種
が組み合わされる場合、調節される。一方、これらの各種の因子の投与量を個別
に最適化し、組み合わせることによって、因子のいずれかを単独で用いた場合よ
りも病状が軽くなる協力効果を達成してもよい。

【００８７】 本発明の化合物すなわち調節剤は、一日一回投与するのが便利であるが、一日
全体の投与量を一日に二回、三回あるいは四回の投与に分割して投与してもよい
。また、本発明の化合物すなわち調節剤を、適当な鼻腔内ビヒクルを局所的に用
いた鼻腔内形態で、あるいは当業者に既知の経皮的な皮膚パッチ形態を用いた経
皮的なルートを介して投与することができる。経皮的な配送システム形態で投与
するためには、もちろん、投与法全体にわたって断続的よりはむしろ連続的な投
与形態となる。

【００８８】 二つ以上の活性因子を用い、それらの活性因子が別々に投与されるように製剤
されるコンビネーション治療に関して、活性因子を同時に投与しても、別々に互
い違いに投与してもよい。

【００８９】 本発明の化合物すなわち調節剤を利用する投与法は、患者のタイプ、種、年齢
、体重、性別および医学的状態、治療すべき病状の程度、投薬の経路、患者の腎
肝機能、および本発明の化合物として用いられる特定の化合物を含む様々なファ
クターに応じて選択される。通常の能力を持つ外科医あるいは獣医であれば、病
状の進行を予防、阻止するのに必要な薬の効果的分量を容易に決定かつ処方でき
る。毒性を持たずに効き目を発揮する範囲内の薬の濃度を最適な精密さで達成す
るには、標的とする箇所に薬がどの程度到達するかに関する動力学に基づいた投
与法が必要である。これには、薬の分布、平衡および除去を考慮することが関わ
ってくる。

【００９０】 本発明の方法において、本明細書に詳細に記載された化合物すなわち調節剤は
活性成分を形成することができ、所望の投与形態すなわち経口タブレット、カプ
セル、エリキシール、シロップなどに対して適当に選択され且つ従来の薬剤の慣
行と一致する適当な医薬的希釈剤、付形剤、もしくは担体（本明細書においては
集合的に「担体」物質と称する）と通常、混和して投与される。

【００９１】 たとえば、タブレットもしくはカプセルの形態での経口投与に関して、活性を
有する薬品構成要素を、エタノール、グリコール、水などの経口性、無毒性の薬
剤に使用を認め得る不活性の担体を組み合わせることができる。そのうえ、所望
もしくは必要であれば、適当なバインダ、潤滑剤、粉末化剤および着色剤を、上
記の混合物に取り込むことができる。適当なバインダには、でんぷん、ゼラチン
、グルコースやベータラクトースなどの自然糖、トウモロコシ甘味料、アカシア
、トラガカントやアルギン酸ナトリウムなどの天然もしくは合成ゴム、カルボキ
メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれるが、これ
らに限定されない。上記の投与形態において用いられる潤滑剤には、オレイン酸
ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナ
トリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれるが、これに限定され
ない。粉末化剤には、でんぷん、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサ
ンゴムが含まれるが、これらに限定されない。

【００９２】 液体の形態に関して、活性を有する薬品構成要素を、合成および天然ゴム、た
とえばトラガカント、アカシア、メチルセルロースなどの適当に風味をつけた懸
濁もしくは分散剤と組み合わせることができる。使用してもよい他の分散剤には
、グリセリンなどが含まれる。非経口的投与に関しては、無菌の懸濁液および溶
液が望ましい。静脈内投与が望ましい場合は、等張性を有する調剤（一般に適当
な保存剤を含む）を用いる。

【００９３】 たとえばアルコール性溶液、局所洗浄剤、クレンジングクレーム、スキンジェ
ル、スキンローション、およびクリームやジェル製剤中のシャンプーを形成する
ために、活性を有する薬品構成要素を含む局所的調剤を、たとえばアルコール、
アロエベラのジェル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥオイル、
鉱油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどの当業者にとっては既知の各種の
担体物質と混和することができる。

【００９４】 本発明の化合物すなわち調節剤を、小型の単一ラメラ小胞、大型の単一ラメラ
小胞および複数ラメラ小胞などのリポゾーム配送システムの形態で投与すること
ができる。リポゾームはコレステロール、ステアリルアミンやホスファチジルコ
リンなどの各種のリン脂質から形成できる。

【００９５】 本発明の化合物は、化合物分子が結合した個々の担体としてのモノクローナル
抗体を用いることによっても配送できる。本発明の化合物すなわち調節剤を、標
的にできる薬品担体としての可溶ポリマーと結合させてもよい。そのようなポリ
マーには、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピルメ
タクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール
、あるいはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを含
む。また、本発明の化合物すなわち調節剤を、薬品の制御された放出を達成する
上で有用な生分解性の一群のポリマー、たとえばポリ乳酸、ポリエプシロンカプ
ロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリ
ジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋された、あ
るいは両親媒性のブロック共重合体などと結合させてよい。

【００９６】 経口投与に関して、化合物すなわち調節剤を、カプセル、タブレット、もしく
はボーラスの形で投与してよく、あるいは化合物を飼料い混ぜてもよい。カプセ
ル、タブレット、およびボーラスは、でんぷん、タルク、ステアリン酸マグネシ
ウムもしくはリン酸二カルシウムなどの適当な担体小胞と組み合わされた活性成
分から成る。これらのユニット投与形態は、希釈剤、充填剤、粉末化剤および／
またはバインダーを含む適当な微粉末化された不活性の成分と活性成分を均一な
混合物が得られるようによく混合することによって調製される。不活性な成分と
は、上記の化合物すなわち調節剤と反応せず、かつ治療されている動物にとって
毒性を有さない成分である。適当な不活性な成分には、でんぷん、ラクトース、
タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性ゴム、植物性油などが含まれる。こ
れらの製剤に含まれる活性成分の量および不活性成分の量は、治療される動物種
のサイズおよびタイプ、感染のタイプおよび程度などの数多くのファクターに応
じて、大きく変動してよい。化合物を単純に飼料と混合したり、あるいは化合物
を飼料の表面に施すことにより、活性成分を飼料への添加物として投与してもよ
い。あるいは、活性成分を不活性な担体と混合し、得られた組成物を飼料と混ぜ
るか、あるいは動物に直接与えてもよい。適当な不活性な担体には、ひきわりト
ウモロコシ、ひきわり柑橘類、発酵残留物、ダイズ粒、乾燥穀物などが含まれる
。活性成分は、粉砕、攪拌、摩砕あるいはタンブリングによって上記の不活性な
担体とよく混合され、最終的な組成物が０．００１〜５重量％の活性成分を含む
ようにする。

【００９７】 あるいは、不活性な液体担体に溶解した活性成分から成る製剤を注射すること
により、非経口的に化合物すなわち調節剤を投与してもよい。注射は、筋肉内注
射、直腸内注射、気管内注射、あるいは皮下注射のいずれでもよい。注射可能な
製剤は、適当な不活性の液体担体と混ぜ合わされた活性成分から成る。使用して
よい液体担体には、ピーナッツ油、ココナツ油、ゴマ油などの植物油、ならびに
ソルケタル、ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆｏｒｍａｌなどの有機溶剤を含む。別の方法
として、水溶性の非経口製剤も用いてよい。液体性の担体としては、植物油が好
ましい。上記の製剤は、活性成分を液体性の担体に最終的な製剤が０．００５〜
１０重量％の活性成分を含むように溶解あるいは懸濁することによって調製され
る。

【００９８】 本化合物すなわち調節剤の局所的な適用は、本化合物すなわ調節剤を水溶液あ
るいは水溶性懸濁液として含む液体で濡らしたりシャンプーすることによって可
能である。これらの製剤は、一般にベントナイトなどの懸濁剤を含み、また、通
常、消泡剤も含む。０．００５〜１０重量％の活性成分を含む製剤が、使用して
よい製剤である。本化合物すなわち調節剤を０．０１〜５重量％含む製剤が、好
適な製剤である。

【００９９】 プロテアーゼは、洗濯用洗剤、食物加工、繊維加工、およびスキンケア産物を
含む様々な商業目的のために、非自然環境で使用される。洗濯用洗剤において、
プロテアーゼは、溶解度の低い有機化合物を洗剤や水により容易に溶解可能な、
より溶解しやすい形態に分解するために用いられる。この能力において、プロテ
アーゼは「しみ抜き剤」として機能する。食品加工の例には、肉を柔らかくした
りチーズを製造することが含まれる。プロテアーゼは、繊維加工において、たと
えば繊維縮みを防止すべくウールを処理するために用いられる。剥離速度のアン
バランスのために肌の表面に集積したスケールを除去すべく、スキンケア産物が
プロテアーゼを含んでよい。これらの応用例のいくつかにおいて用いられる一般
的なプロテアーゼは、酵素の産業的生産のために培養しやすい原核細胞もしくは
真核細胞に由来し、用いられる一般的な種は、たとえば米国特許第５，２１７，
８７８号に記載のバチルスである。あるいは、米国特許第５，２７８，０６２号
は、洗濯用洗剤組成物において用いるべく、真菌であるＴｒｉｔｉｒａｃｈｉｕ
ｍ ａｌｂｕｍから分離されたセリーンプロテアーゼについて記載している。残
念なことに、プロテアーゼの中には、敏感な人にアレルギー反応を引き起こす可
能性により、あるいは非自然環境で用いられると効果が減少することにより、そ
の使用が制限されるものがある。ヒト以外の生物に由来するプロテアーゼタンパ
ク質を用いる場合、敏感な人において免疫反応を引き起こす可能性がさらに高く
なることが予測される。こうした制限のため、敏感な人々に対する抗原性が低く
且つ／または非自然環境において効果的なタンパク質加水分解活性をもたらす代
替的なプロテアーゼが必要とされている。組換え技術の到来により、産業的生産
に適した宿主内において、いかなる種のタンパク質でも発現可能である。

【０１００】 本発明の別の態様は、プロテアーゼＥＯＳおよび使用を認め得る担体を含む組
成物に関する。この組成物は、プロテアーゼ構成要素を必要とする様々な組成物
のいずれの組成物であってもよい。たとえば使用や製造を介して人間と接触する
可能性のある組成物が、特に好ましい。本発明のプロテアーゼＥＯＳの使用によ
り、使用者および／または取扱者が本発明のプロテアーゼＥＯＳでない既知のプ
ロテアーゼ、特にヒト以外の起源のプロテアーゼを含む類似の組成物を用いた場
合に経験する免疫原性反応が減少し、あるいは消滅すると考えられる。好ましい
組成物は、スキンケア組成物および洗濯用洗剤組成物である。

【０１０１】 本明細書において、「使用を認め得る担体」には、化粧品において使用を認め
得る担体、薬剤において使用を認め得る担体、洗浄剤組成物において使用を認め
得る担体を含まれるが、これらに限定されない。

【０１０２】 スキンケア組成物 本発明のスキンケア組成物は、プロテアーゼＥＯＳに加えて、化粧品において
、あるいは薬剤において使用を認め得る担体を含むことが好ましい。

【０１０３】 本明細書において、「化粧品において使用を認め得る担体」とは、ヒトおよび
下等動物の皮膚に接触させて使用するのに適当であり、不適切な毒性、不親和性
、不安定性、炎症、アレルギー反応などを起こさず、利益／危険率が釣り合った
、少なくとも１種類の、混合しても化学変化を起こさない固体もしくは液体の充
填希釈剤やカプセル封入物質を意味する。

【０１０４】 本明細書において、「薬剤において使用を認め得る担体」とは、ヒトおよび下
等動物の組織に接触させて使用するのに適当であり、不適切な毒性、不親和性、
不安定性、炎症、アレルギー反応などを起こさず、利益／危険率が釣り合った、
少なくとも１種類の、融和性を有する薬品、薬剤、もしくは不活性成分を意味す
る。薬剤において使用を認め得る担体は、治療されている哺乳動物への投与する
上で適当な、十分に高い純度および十分に低い毒性を有する必要があることは勿
論である。

【０１０５】 本明細書において、「融和性を有する」とは、化粧品組成物あるいは医薬組成
物の構成要素を、プロテアーゼＥＯＳおよび構成要素どうしと、通常の使用状況
において、組成物の化粧品あるいは薬剤としての効き目を実質的に減少させる相
互作用が全く起きないように混合できることを意味する。

【０１０６】 本発明のスキンケア組成物は、局所用組成物、つまり皮膚に直接置いたり塗り
広げることによって局所的に適用する組成物であることが好ましい。そのような
局所用組成物は、化粧品において使用を認め得る、あるいは薬剤において使用を
認め得る局所用担体を含むことが好ましい。

【０１０７】 局所用組成物は、様々な産物タイプに仕様することができる。これらの産物タ
イプには、ローション、クリーム、日焼け用（止め用）オイル、ジェル、スティ
ック、スプレー、軟膏、ペースト、ムース、および化粧品と、（たとえばフケ治
療／予防用の）シャンプーやコンディショナーなどのヘアケア組成物と、個人用
洗浄組成物が含まれるが、これらに限定されない。これらの産物タイプは、溶液
、乳剤、ジェル、固体を含む（ただしこれらに限定されない）いくつかのカーダ
ー（ｃａｒｄｅｒ）システムを含んでよい。

【０１０８】 担体は、化粧品もしくは薬剤において使用を認め得る水溶性もしくは有機性の
溶剤であることが好ましい。水は、好適な溶剤である。適当な有機溶剤の例には
、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（２００〜６００）、ポリプ
ロピレングリコール（４２５〜２０２５）、プロピレングリコール−１４ブチル
エーテル、グリセロール、１，２，４ブタントリオール、ソルビトールエステル
、１，２，６−ヘクサントリオール、エタノール、イソプロパノール、ブタンジ
オール、およびこれらの混合物が含まれる。本発明において有用なそのような溶
液は、好ましくは約０．００１％〜約２５％、より好ましくは約０．１％〜約１
０％、さらに好ましくは約０．５％〜約５％のプロテアーゼＥＯＳと、好ましく
は約５０％〜約９９．９９％、より好ましくは約９０％〜約９９％の使用を認め
得る水溶性あるいは有機性溶剤とを含む。

【０１０９】 本発明のスキンケア組成物は、局所用組成物において従来から用いられる、さ
らに別の様々な油溶性物質および／または水溶性物質を、その分野で確立された
レベルで含んでよい。そのようなさらに別の構成要素には、増粘剤、顔料、芳香
剤、湿潤薬、タンパク質およびポリペプチド、保存剤、鎮静剤、貫通促進剤、コ
ラーゲン、ｈｙｌａｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、エラスチン、加水分解物、サクラ
ソウ油、ホホバ（ｊｏｊｏｂａ）油、表皮成長ファクタ、ダイズサポニン、ムコ
多糖類、ビタミンＡおよびその誘導体、ビタミンＢ２、ビオチン、パントテン酸
、ビタミンＤ、およびこれらの混合物が含まれる。

【０１１０】 洗浄剤組成物 本発明の洗浄剤組成物は、プロテアーゼＥＯＳに加えて、界面活性剤を含むこ
とが好ましい。洗浄剤組成物は幅広く様々な形態を取ってよく、固表面洗浄剤組
成物、食器洗い洗浄剤組成物、および洗濯用洗剤組成物を含むが、これらの例に
限定されない。

【０１１１】 好適な洗浄剤組成物は、洗濯用洗剤組成物である。そのような洗濯用洗剤組成
物は、顆粒状、液状および棒状の組成物を含むが、これらの例に限定されない。
洗濯用洗剤組成物は、さらにビルダーを含むことが好ましい。

【０１１２】 本発明の洗濯用洗剤組成物は、「洗浄効果量」をもたらす上で十分なレベルの
プロテアーゼＥＯＳを含む。「洗浄効果量」という用語は、繊維、食器類などの
基質に洗浄、しみ抜き、泥落とし、漂白、消臭、あるいは新しさ向上効果を生じ
させ得る任意の量を指す。現在の商業的調剤に関する実際例において、「洗浄効
果量」は、洗剤組成物１ｇ当たり一般的に約５重量ｍｇ以下、より一般的には０
．０１ｍｇ〜３ｍｇの活性酵素量を指す。別の言い方をすれば、本明細書におけ
る洗濯用洗剤組成物は、一般的に０．００１％〜５％、好ましくは０．０１〜３
％、より好ましくは０．０１％〜１％（％は重量％）の原料プロテアーゼＥＯＳ
調剤を含む。本明細書において、「原料プロテアーゼＥＯＳ調剤」とは、洗濯用
洗剤組成物に添加される前の、プロテアーゼＥＯＳを含んだ調剤もしくは組成物
を指す。プロテアーゼＥＯＳは、そのような原料プロテアーゼＥＯＳ調剤中に、
原料プロテアーゼＥＯＳ調剤１ｇ当たり０．００５〜０．１アンソン（Ａｎｓｏ
ｎ）単位（ＡＵ）の活性をもたらすのに十分なレベルで存在することが好ましい
。ある種の洗剤、たとえば自動食器洗い機用の洗剤に関しては、触媒活性を有し
ない物質の全量を最小限にしてスポッティング／フィルミングあるいは他の最終
的な結果を向上させるために、原料プロテアーゼＥＯＳ調剤の活性プロテアーゼ
ＥＯＳ含有量を増加させることが望ましい。高度に濃縮された洗剤製剤において
も、より高い活性レベルが望ましいことがある。

【０１１３】 液体組成物を含む（ただしこれに限定されない）本発明の洗濯用洗剤組成物は
、 約０．００１％〜約１０％、好ましくは約０．００５％〜約８％、最も好ましく
は約０．０１％〜約６％（％は重量％）の酵素安定システムを含んでよい。酵素
安定システムは、プロテアーゼＥＯＳ、あるいは組成物にさらに含まれる可能性
のある、他の任意の洗剤酵素に対して融和性を有する任意の安定システムであっ
てよい。そのようなシステムを、他の製剤活性因子によって製剤生来のものとし
て提供しても、あるいは、たとえば洗剤入り酵素の調剤者あるいは製造者によっ
て別に加えてもよい。そのような安定システムは、たとえばカルシウムイオン、
ホウ酸、プロピレングリコール、短鎖カルボン酸、ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、
およびその混合物を含んでよく、洗剤組成物のタイプおよび物理的形態に応じて
、異なる安定化に関する問題に対処すべく設計される。

【０１１４】 洗浄剤組成物は、洗剤界面活性剤も含む。洗剤組成物は、好ましくは少なくと
も約０．０１％、さらに好ましくは少なくとも約０．１％、さらに好ましくは少
なくても約１％、さらにいっそう好ましくは約１〜約５５％の洗剤界面活性剤を
含む。

【０１１５】 好適な洗剤界面活性剤は、以下でさらに説明するカチオン系、アニオン系、非
イオン系、両性系、双性系の界面活性剤およびそれらの混合物である。洗剤組成
物において有用な洗剤界面活性剤の例には、従来のＣ１１〜Ｃ１８アルキルベン
ゼンスルホン酸塩（“ＬＡＳ”）と、分岐鎖およびランダムＣ１０〜Ｃ２０の第
一アルキル硫酸塩（“ＡＳ”）と、分子式ＣＨ_３（ＣＨ_２）ｘ（ＣＨＯＳＯ_３−
Ｍ＋）ＣＨ_３およびＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｙ（ＣＨＯＳＯ_３−Ｍ＋）ＣＨ_２ＣＨ_３（
ここでｘおよび（ｙ＋１）は少なくとも約７（好ましくは少なくとも９）の整数
であり、Ｍは水への溶解度を高めるカチオンで、特にナトリウム、硫酸オレイル
などの不飽和硫酸塩）で表されるＣ１０〜Ｃ１８の第二（２，３）アルキル硫酸
塩と、Ｃ１０〜Ｃ１８アルキルアルコキシ硫酸塩（“ＡＥｘＳ”、特にＥＯ１〜
７のエトキシ硫酸塩）と、Ｃ１０〜Ｃ１８アルキルアルコキシカルボン酸塩（特
にＥＯ１〜５のエトキシカルボン酸塩）と、Ｃ１０〜Ｃ１８グリセロールエーテ
ルと、Ｃ１０〜Ｃ１８アルキルポリグリコシドおよびそれらの対応する硫酸塩ポ
リグリコシドと、およびＣ１２〜Ｃ１８アルファ−スルホン酸塩脂肪酸エステル
とを含むが、これらの例に限定されない。所望であれば、いわゆるナローピーク
のアルキルエトキシレートおよびＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレ
ート（特にエトキシレートおよびエトキシ／プロポキシ混合）を含むＣ１２〜Ｃ
１８アルキルエトキシレート（“ＡＥ”）や、Ｃ１２〜Ｃ１８ベタインおよびス
ルホベタイン（「スルタイン」（ｓｕｌｔａｉｎｅｓ））、Ｃ１０〜Ｃ１８アミ
ンオキシドなどの従来の非イオン性および両性界面活性剤も、組成物全体に含め
てよい。Ｃ１０〜Ｃ１８Ｎ−アルキルポリヒドロキシ脂肪酸アミドも、用いてよ
い。その一般的な例には、Ｃ１２〜Ｃ１８Ｎ−メチルグルカミドが含まれる。Ｗ
Ｏ９，２０６，１５４を参照。他の糖に由来の界面活性剤には、Ｃ１０〜Ｃ１８
Ｎ−（３−メトキシプロピル）グルカミドなどのＮ−アルコキシポリヒドロキシ
脂肪酸アミドが含まれる。泡立ちが低くてよい場合、Ｎ−プロピル〜Ｎ−ヘキシ
ルＣ１２〜Ｃ１８グルカミドを用いることができる。Ｃ１０〜Ｃ２０の従来の石
鹸も用いてよい。高度な泡立ち洗浄が望ましい場合は、分岐鎖のＣ１０〜Ｃ１６
石鹸を用いてよい。アニオン系および非イオン系界面活性剤の混合物は、特に有
用である。他の従来的に有用な界面活性剤は、標準的なテキストに列挙されてい
る。

【０１１６】 鉱物硬度の制御を助けるために、洗剤ビルダーも洗濯用洗剤組成物に含まれる
。有機ビルダー、無機ビルダーを用いることができる。ビルダーは、一般に、土
粒の除去を助けるべく繊維洗濯組成物において用いられる。

【０１１７】 ビルダーのレベルは、組成物の最終的な使用および組成物の所望の物理的形態
に応じて大きく変動させてよい。ビルダーを含む場合、組成物は一般に少なくと
も約１％のビルダーを含む。液体製剤は、一般に、約５％〜約５０％、より一般
的には約５％〜約３０％（％は重量％）の洗剤ビルダーを含む。顆粒状製剤は、
一般に、約１０％〜約８０％、より一般的には約１５％〜約５０％（％は重量％
）の洗剤ビルダーを含む。しかし、ビルダーの上記の範囲よりも低い、もしくは
高い含有量を排除するものではない。

【０１１８】 無機あるいはＰ含有洗剤ビルダーには、ポリリン酸塩（たとえばトリポリリン
酸塩、ピロリン酸塩、およびガラス質の高分子メタリン酸塩）のアルカリ金属、
アンモニウムおよびアルカノールアンモニウム塩と、ホスホネートと、フィチン
酸と、ケイ酸塩と、炭酸塩（重炭酸塩および三二炭酸塩を含む）と、硫酸塩と、
アルミノケイ酸塩が含まれるが、これらに限定されない。しかし、場所によって
は、リン酸塩以外のビルダーが必要とされる。重要なことは、本明細書に記載の
組成物が、クエン酸塩などのいわゆる（リン酸塩と比較して）「弱い」ビルダー
の存在下でも、あるいはゼオライトもしくは層状のケイ酸塩ビルダーの場合起こ
る可能性のあるいわゆる「アンダービルト」状態でも、驚くほど良く機能するこ
とである。

【０１１９】 ケイ酸塩ビルダーの例は、アルカリ金属ケイ酸塩、特に、ＳｉＯ_２対Ｎａ_２Ｏ
の比が１．６対１から３．２対１であるアルカリ金属ケイ酸塩と、米国特許第４
，６６４，８３９号（Ｈ．Ｐ．Ｒｉｅｃｋ、１９８７年５月１２日発行）に記載
の層状のケイ酸ナトリウムなどの層状のケイ酸塩である。ＮａＳＫＳ−６は、Ｈ
ｏｅｃｈｓｔ社によって販売されている結晶質の層状のケイ酸塩に対する商標で
ある（本明細書においては、「ＳＫＳ−６」と略称するものとする）。ゼオライ
トビルダーと異なり、ＮａＳＫＳ−６ケイ酸塩ビルダーは、アルミニウムを含ま
ない。ＮａＳＫＳ−６は、層状ケイ酸塩の、デルタ−Ｎａ_２ＳｉＯ_５形態を有す
る。ＮａＳＫＳ−６は、ドイツ特許ＤＥ−Ａ−３，４１７，６４９およびＤＥ−
Ａ−３，７４２，０４３に記載されているような方法によって調製できる。本発
明において用いる上で、ＳＫＳ−６は非常に好適な層状のケイ酸塩であるが、た
とえば一般式ＮａＭＳｉ_ＸＯ_２Ｘ＋１・ｙＨ_２Ｏ（Ｍはナトリウムもしくは水素
、ｘは１．９〜４の数字で好ましくは２、ｙは０〜２０の数字で好ましくは０）
を有する他の類似の層状ケイ酸塩を本発明において用いることができる。Ｈｏｅ
ｃｈｓｔ社から出ている他の様々な層状のケイ酸塩には、アルファ、ベータおよ
びガンマ形態としてのＮａＳＫＳ−５、ＮａＳＫＳ−７およびＮａＳＫＳ−１１
が含まれる。上述のように、デルタ−Ｎａ_２ＳｉＯ_５（ＮａＳＫＳ−６形態）が
、本発明における使用に関して最も好適である。顆粒状製剤において顆粒をぱり
っとさせる製剤として、酸素漂白用の安定剤として、また洗浄時の泡立ち制御シ
ステムの構成要素として機能し得る、ケイ酸マグネシウムなどの他のケイ酸塩も
また有用であろう。

【０１２０】 炭酸塩ビルダーの例は、ドイツ特許出願Ｎｏ．２，３２１，００１（１９７３
年１１月１５日公開）に開示されているようなアルカリ土類炭酸塩およびアルカ
リ金属炭酸塩である。

【０１２１】 アルミノケイ酸塩ビルダーは、本発明において有用である。アルミノケイ酸塩
ビルダーは、最も最近に発売された強力顆粒状洗剤組成物において非常に重要で
あると共に、液体洗剤製剤においても重要なビルダー成分として用いることがで
きる。アルミノケイ酸塩ビルダーは、以下の実験式を有するものを含む。

【０１２２】 Ｍ_ｚ（ｚＡｌＯ_２）_ｙ−ｘＨ_２Ｏ ここで、ｚおよびｙは少なくとも６である整数、ｚのｙに対するモル比は１．
０〜約０．５の範囲であり、ｘは約１５〜約２６４の整数である。

【０１２３】 有用なアルミノケイ酸塩イオン交換物質は、商業的に入手可能である。これら
のアルミノケイ酸塩は、構造的には結晶質でも非晶質でもよく、自然界で生成さ
れたアルミノケイ酸塩でも合成されたアルミノケイ酸塩でもよい。アルミノケイ
酸塩イオン交換物質を生成する方法は、米国特許第３，９８５，６６９号（Ｋｒ
ｕｍｍｅｌら、１９７６年１０月１２日発行）に記載されている。本発明におい
て有用な、好適な合成結晶質アルミノケイ酸塩イオン交換物質は、ゼオライトＡ
、ゼオライトＰ（ｂ）、ゼオライトＭＡＰおよびゼオライトＸという名称で入手
可能である。特に好適な実施の形態において、結晶質のアルミノケイ酸塩イオン
交換物質は以下の式を有する。

【０１２４】 Ｎａ_１２［（ＡｌＯ_２）_１２（ＳｉＯ_２）_１２］・ｘＨ_２Ｏ ここで、ｘは約２０〜約３０で、具体的には約２７である。この物質はゼオラ
イトＡとして知られている。脱水されたゼオライト（ｘ＝０〜１０）も本発明に
おいて用いてよい。アルミノケイ酸塩は、直径約０．１〜１０ミクロンの粒子サ
イズを有することが好ましい。

【０１２５】 本発明の目的のために適当な有機質の洗剤ビルダーは各種のポリカルボン酸塩
化合物を含むが、これらに限定されない。本明細書において、「ポリカルボン酸
塩」は、複数のカルボン酸基（好ましくは少なくとも３個のカルボン酸基）を有
する化合物を指す。ポリカルボン酸塩ビルダーは、一般に酸の形で組成物に添加
することができるが、中和された塩の形でも添加することができる。塩の形で利
用される場合、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属の塩、ある
いはアルカノールアンモニウム塩が好適である。

【０１２６】 ポリカルボン酸塩ビルダーの中には、様々な部類の有用な物質が含まれる。ポ
リカルボン酸塩ビルダーの重要な部類には、Ｂｅｒｇ（米国特許第３，１２８，
２８７号、１９６４年４月７日発行）およびＬａｍｂｅｒｔｉら（米国特許第３
，６３５，８３０号、１９７２年１月１８日発行）に記載されているようなオキ
シジスクシナートを含むエーテルポリカルボン酸塩が含まれる。米国特許第４，
６６３，０７１号（Ｂｕｓｈら、１９８７年５月５日発行）の“ＴＭＳＦＴＤＳ
”ビルダーも参照のこと。適当なエーテルポリカルボン酸塩には、また、米国特
許第３，９２３，６７９号（Ｒａｐｋｏ、１９７５年１２月２日発行）、米国特
許第３，８３５，１６３号（Ｒａｐｋｏ、１９７４年９月１０日発行）、米国特
許第４，１５８，６３５号（Ｃｒｕｔｃｈｆｉｅｌｄら、１９７９年６月１９日
発行）、米国特許第４，１２０，８７４号（Ｃｒｕｔｃｈｆｉｅｌｄら、１９７
８年１０月１７日発行）、および米国特許第４，１０２，９０３号（Ｃｒｕｔｃ
ｈｆｉｅｌｄら、１９７８年７月２５日発行）に記載されている例を含む環式化
合物、具体的には脂環式化合物も含まれる。

【０１２７】 他の有用な洗剤ビルダーには、エーテルヒドロキシポリカルボン酸塩、無水マ
レイン酸とエチレンあるいはビニルメチルエーテルとの共重合体、１，３，，５
−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−ｔ６スルホン酸およびカルボキシメチ
ルオキシコハク酸、各種のアルカリ金属、アンモニア、エチレンジアミン四酢酸
およびニトリロ三酢酸などのポリ酢酸の置換アンモニウム塩、ならびにメリト酸
、コハク酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカ
ルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸などのポリカルボン酸、およびこれ
らの可溶性を有する塩が含まれる。

【０１２８】 クエン酸およびその可溶性を有する塩（特にナトリウム塩）などのクエン酸塩
ビルダーは、循環再生資源から入手可能であり且つ生物分解性を有することから
、強力液体洗剤製剤にとって特に重要なポリカルボン酸塩ビルダーである。カル
ボン酸塩は、顆粒状組成物において、具体的にはゼオライトおよび／または層状
のケイ酸塩ビルダーとの組み合わせにおいても用いることができる。オキシジス
クシナートもまた、そのような組成物および組み合わせにおいて特に有用である
。

【０１２９】 本発明の洗剤組成物において、米国特許第４，５６６，９８４号（Ｂｕｓｈ、
１９８６年１月２８日発行）に開示されている３，３−ジカルボキシ−４−オキ
サ−１，６−へキサンジオエートおよび関連化合物もまた適当である。有用なコ
ハク酸ビルダーには、Ｃ５〜Ｃ２０アルキルおよびアルケニルコハク酸およびそ
の塩が含まれる。このタイプの化合物のうち特に好適なものは、ドデセニルコハ
ク酸である。コハク酸塩ビルダーの具体的な例には、ラウリルスクシナート、ミ
リスチルスクシナート、パルミチルスクシナート、２−ドデセニルスクシナート
（これが好ましい）、２−ペンタデセニルスクシナートなどが含まれる。ラウリ
ルスクシナートがこの群の中で好適なビルダーであり、欧州特許出願２００，２
６３（Ｂａｒｒａｔら、１９８６年１１月５日公開）に記載されている。

【０１３０】 他の適当なポリカルボン酸塩が、米国特許第４，１４４，２２６号（Ｃｒｕｔ
ｃｈｆｉｅｌｄら、１９７９年３月１３日発行）および米国特許第３，３０８，
０６７号（Ｄｉｅｈｌ、１９６７年３月７日発行）に開示されている。米国特許
第３，７２３，３２２号（Ｄｉｅｈｌ、１９７３年３月２７日発行）も参照され
たい。

【０１３１】 Ｃ１２〜Ｃ１８モノカルボン酸などの脂肪酸もまた、さらなるビルダー活性を
もたらすべく、それのみで、あるいは上記のビルダー（具体的にはクエン酸塩お
よび／またはコハク酸塩ビルダー）と組み合わせて組成物に取り込むことができ
る。そのように脂肪酸を使用すると一般に泡立ちが減少するので、製剤者はこの
点を考慮すべきである。

【０１３２】 リン系ビルダーを用いることができる状況、具体的には手洗い洗濯用の石鹸バ
ーの製剤において、既知のナトリウムトリポリリン酸塩、ナトリウムピロリン酸
およびナトリウムオルトリン酸などの各種のアルカリ金属リン酸塩を用いること
ができる。エタン−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホナートおよび他の既知の
ホスホン酸塩などのホスホン酸塩ビルダー（たとえば米国特許第３，１５９，５
８１号（Ｄｉｅｈｌ、１９６４年１２月１日発行）、米国特許第３，２１３，０
３０号（Ｄｉｅｈｌ、１９６５年１０月１９日発行）、米国特許第３，４００，
１４８号（Ｑｕｉｍｂｙ、１９６８年９月３日発行）、米国特許第３，４２２，
０２１号（Ｒｏｙ、１９６９年１月１４日発行）、および米国特許第３，４２２
，１３７号（Ｑｕｉｍｂｙ、１９６９年１月４日発行）を参照）も用いることが
できる。

【０１３３】 本発明の洗濯洗剤組成物において使用してよい更に別の構成要素には、（たと
えばグリースしみを除去する機能を追加するための）アルコキシ化ポリカルボン
酸塩、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、光沢剤、キレート剤、粘土除去／再沈
着防止剤、染料転移抑制剤、さらに別の酵素（リパーゼ、アミラーゼ、ヒドロラ
ーゼ、および他のプロテアーゼなど）、繊維軟化剤、高分子土壌開放（ｐｏｌｙ
ｍｅｒｉｃ ｓｏｉｌ ｒｅｌｅａｓｅ）剤、高分子分散剤および発泡抑制剤が
含まれるが、これらに限定されない。

【０１３４】 本発明の組成物は、洗浄効果を補助もしくは高めるための、洗浄されている基
質を処理するための、あるいは洗剤組成物の美観を変えるための少なくとも一種
類の他の洗剤補助物質もしくは他の物質（たとえば香水、色素、染料など）をさ
らに含んでよい。そのような補助物質の例には。 本発明の洗剤組成物は、アルコキシ化ポリカルボン酸塩、漂白化合物、光沢剤
、キレート剤、粘土除去／再沈着防止剤、染料転移抑制剤、酵素類、酵素安定シ
ステム、繊維軟化剤、高分子土壌開放剤、高分子分散剤および発泡抑制剤を含む
他の既知の洗剤洗浄構成要素をさらに含んでよい。洗剤組成物は、担体、屈水性
誘発物質、プロセス補助剤、染料もしくは顔料、液体製剤のための溶剤、棒状組
成物のための固形充填剤も含んでよい。

【０１３５】 皮膚剥落治療法あるいは皮膚剥落予防法 本発明のさらに別の態様は、皮膚剥落の治療もしくは予防法に関する。この方
法は、プロテアーゼＥＯＳを含む組成物の、安全でかつ効果を期待できる量を局
所に適用することを含む。

【０１３６】 本明細書において、「安全でかつ効果を期待できる量」とは、治療される条件
を顕著に改善する上で十分なだけ高いが、健全な医学的判断の範囲内で（納得の
いく利益／危険比率であり）深刻な副作用を避ける上で十分に低いプロテアーゼ
ＥＯＳ含有量を意味する。プロテアーゼＥＯＳの安全でかつ効果を期待できる量
は、治療されている特定の条件、治療されている被検者の年齢および体調、条件
の程度、治療期間、同時に行われる療法の性質などのファクターに応じて変動す
る。

【０１３７】 本方法において適当に使用できる組成物は、（たとえば、皮膚剥落によって引
き起こされたフケの治療／予防用）ヘアケア組成物を含む上述のスキンケア組成
物を含む。

【０１３８】 本発明を以下の実施例により例証するが、本発明はこれらの実施例によって限
定されない。

【０１３９】 実施例１ プラスミド操作 全ての分子生物学的方法は、先行文献（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８９） １
−１６２６）に基づいて行われた。特にそうでないという記載がない限り、オリ
ゴヌクレオチドはＲａｎｓｏｍ Ｈｉｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒａｎｓ
ｏｍ Ｈｉｌｌ，ＣＡ）から購入され、全ての制限エンドヌクレアーゼおよび他
のＤＮＡ修飾酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ
，ＭＡ）から購入された。プロテアーゼＥＯＳ発現構築は、上述のように、バキ
ュロウイルス発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｅｒｇ、 ＭＤ）でなされた。全ての構築操作は、ア
ライド・バイオシステムズ（Ａｌｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７７蛍光
シークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）
を用いて、色素ターミネーター周期的配列決定によって確認された。

【０１４０】 プロテアーゼＥＯＳｃＤＮＡの取得 好酸球ＲＮＡが、アレルギー性喘息患者から得られた、プールされた疾病状態
の好酸球から分離された。好酸球は採取し、イソチオシアネートグアニジニウム
を含んだ緩衝液で精製した後、溶解された。溶解液をＣｓＣｌを介して遠心して
全てのＲＮＡを得、続いて、オリゴテックスラテックスビーズを用いてポリＡ分
離が行われた。ＮｏｔＩオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてｃＤＮＡ合成を開始
し、二本鎖ｃＤＮＡを平滑にし、Ｓａｌ Ｉアダプタに連結し、Ｎｏｔ Ｉで消
化し、サイズを選別し、ｐＳＰＯＲＴ１ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｇｅｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）のＮｏｔ ＩおよびＳａｌ Ｉ部
位にクローン化された。プロテアーゼＥＯＳｃＤＮＡ全長に対応するクローンは
、８５５個のヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含むと共に（図１
）、他のＳ１セリーンプロテアーゼと相同であった。また、ＡＡＴＡＡＡモチー
フが５０個のヌクレオチドのポリＡストレッチのヌクレオチド１８個の上流にあ
るので、このクローンは３’−非翻訳の全体を含む可能性が高い（この特定のク
ローンに関するデータは示されていない）。そのサブセットが図１に示されてい
る。ＧｅｎｂａｎｋデータベースをプロテアーゼＥＯＳｃＤＮＡで相同検索する
と、これは新規なｃＤＮＡであるが、ヒトのコスミドクローン（４０７Ｄ８、Ｇ
ｅｎｂａｎｋ受理＃ＡＣ００５５７０）と同一であることが示された。ヒトのコ
スミドクローンは、染色体１６ｐ１３．３に位置し、これがプロテアーゼＥＯＳ
遺伝子の位置を示唆している。推定されたオープンリーディングフレームは、予
測分子量（Ｍ_ｒ）が約３０−Ｋｄで他のセリーンプロテアーゼに対して強い相同
性を有する、２８４個のアミノ酸から成るプロテアーゼＥＯＳタンパク質（図１
）をエンコードする。触媒トライアド残基Ｈ、ＤおよびＳが、各々ポジション７
７、１２６および２３１に位置している。酵素原活性化配列ＭＳＳＲ−ＩＶＧＧ
（ポジション３３〜４０）は、他のＳ１セリーンプロテアーゼのそれに非常に類
似しており、２８４個のアミノ酸から成る成熟タンパク質を予測する。２２個の
アミノ酸から成るシグナルペプチドが統計的な方法によって予測され（Ｖｏｎ
Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６
８３〜９０）、これは１４個のアミノ酸から成るプロペプチドを示唆する。ＳＷ
ＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースに対するＦＡＳＴＡ相同は、プロテアーゼＥＯＳ
に最もマッチするのがヒトのプロスタジン先駆体ＥＣ３．４．２１ ＳＷ：Ｑ１
６６５１（Ｙｕら（１９９５） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３４８３
〜９；Ｙｕら（１９９６） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３２：３３４〜４０）（２７６
ａａ．の重複で４７．１％の同一性）であることを示唆している。次にマッチす
るのはイヌのトリプターゼ先駆体ＥＣ３．４．２１．５９ ＳＷ：Ｐ１５９４４
（Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅら（１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：
４１４８−５５）（２７４ａａ．の重複で４８．２％の同一性）である。既知の
タンパク質のうち次にマッチするのは、ヒトのベータトリプターゼ先駆体；トリ
プターゼ２ ＥＣ ３．４．２１．５９ ＳＷ：Ｐ２０２３１（Ｍｉｌｌｅｒら
（１９９０） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６：８６４−７００）（２７３
ａａ．の重複で４４．３％の同一性）である。類推されたプロテアーゼＥＯＳア
ミノ酸配列とＳ１セリーンプロテアーゼファミリーの他のメンバーとの整合性の
系統樹は、ＭｅｇＡｌｉｇｎ３．１．7プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．
，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて決定され、図２に示されている。

【０１４１】 実施例２ プロテアーゼＥＯＳｍＲＮＡの組織分布 プロテアーゼＥＯＳｍＲＮＡの組織分布を同定するために、非常に鋭敏なＰＣ
Ｒプロファイリング技術を用いた。この適用に関して、いくつかのヒトのｃＤＮ
Ａライブラリーが用いられた（ＺＡＰ発現ｃＤＮＡシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて発明者が構築したＣＨＲＦ−２８８巨
大核細胞系統およびヒトのゲル濾過血小板ライブラリーを除く、全てのヒトｃＤ
ＮＡライブラリーをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，（ＣＡ）から購入
した）。プロファイリング分析のためのＰＣＲプライマーは、以下のとおりであ
った。

【０１４２】 配列番号２：５’−ＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＧＡＴＴＣＡＣＡＧＣ−３’ 配列番号３：５’−ＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＣＴＣＴＴＴＡＧＧ−３’ 簡潔に言うと、ＰＣＲ反応物５０μｌに、試験された各ｃＤＮＡライブラリー
由来の希釈されたファージストック１μｌ（〜１０^８から１０^１０ｐｆｕ／ｍｌ
）が用いられた。反応物は最初に９４℃で５分間変性され、次に、９４℃で２０
秒間、５６℃で２０秒間そして７２℃で３０秒間のサイクルに３５回かけられ、
最後に７２℃で１０分間処理された。得られた配列、配列番号４：５’−ＴＧＡ
ＧＣＧＧＣＣＴＴＴＡＡＧＡＧＴＴＧＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＧＣＡＧＧＧＡＡ
Ｔ３のプライマープローブは、ガンマ^３２Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ
，ＭＤ）を用いて放射線標識を付けられた。この反応に続き、ＱＩＡクイックヌ
クレオチドリムーバルコラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用い
て、取り込まれなかった標識が除去された。^３２Ｐ末端標識された、得られたプ
ライマープローブ（１×１０^５ｃｐｍ）を、各サンプル１０μｌと合わせ、ＰＣ
Ｒ反応を行った。ＰＣＲ産物プローブ混合物は、９４℃で５分間変性され、６０
℃で１５分間ハイブリッド形成され、４℃で冷却された。アニールされたサンプ
ル（１０μｌ）は、６％トリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ非変性ポリアクリルアミド
ゲル（Ｎｏｖｅｘ）で電気泳動され、乾燥され、自動放射線検査機で露出された
。ベータアクチンＰＣＲプライマーおよび、得られた、標識の付けられたプライ
マープローブと共に用いられたｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲプロフィール（図
３）は、試験された全てのサンプルにおいてベータアクチンＰＣＲ産物を生成し
た。

【０１４３】 図３に示されるように、プロテアーゼＥＯＳｍＲＮＡの分配は、特定の組織お
よび細胞のタイプに顕著に制限されている。プロテアーゼＥＯＳ転写物を発現す
る組織タイプは、網膜、卵巣、脾臓、胃であり、発現の程度は低いものの胸腺、
子宮および視床もこれに含まれる。特に重要なのは、ＥＯＳプロテアーゼｍＲＮ
Ａが、膵臓、肝臓あるいは前立腺といった、数多くのセリーンプロテアーゼ遺伝
子の発現が通常見出される組織において発現されないことである。ヒトのゲル濾
過された血小板から構築されたｃＤＮＡライブラリーにおいてプロテアーゼＥＯ
ＳＰＣＲ産物が検出されることは、興味深い。このことは、プロテアーゼＥＯＳ
がヒトの血小板において発現されることを強く示唆している。図３のＰＣＲ組織
プロフィールで分析されたｃＤＮＡライブラリーを構築するのに用いられた血小
板は、汚染として含まれている赤血球および他の血球のレベル値が非常に低かっ
たので（１０^６個の血小板当たり１個未満）、この鋭敏なＰＣＲ検定において偽
陽性シグナルを生成するであろう白血球汚染の可能性を完全に否定できない。原
位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成による細胞の偏り、原位置ＰＣＲの敏
感さ、およびプロテアーゼＥＯＳ特異性抗血清を用いた確認を、この問題を扱う
上で採用できよう。

【０１４４】 実施例３ 活性を有するプロテアーゼＥＯＳ発現のための構築物生成 Ｓ１プロテアーゼファミリーのメンバーは不活性な酵素原先駆体として合成さ
れることが非常に多く、タンパク質分解活性を有するためには制限されたタンパ
ク質分解が必要なので、発明者らは異種のセリーンプロテアーゼｃＤＮＡの一般
的活性化を可能にし、発現する酵素原活性化構築物を開発した。この構築物は、
分泌、抗体検出それぞれの目的のための（ＰＦ）、上述のＭｏＡｂＭ２抗ＦＬＡ
Ｇ抗体エピトープとイン・フレームで融合されたウシのプレプロラクチンシグナ
ル配列を特徴とする（Ｉｓｈｉｉら（１９９３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６８：９７８０−６）。重要なのは、この構築物が、シグナル配列からダウンス
トリームにイン・フレームで融合されたヒトのトリプシノーゲンＩ（ＥＫ）に由
来するエンテロキナーゼ切断部位も含むことである。Ｃターミナルにおいて、停
止コドンに先立ち、抗ＨＡ抗体ＭｏＡｂ１２ＣＡ５（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いた検出
およびニッケル樹脂における親和性精製それぞれのためのヘマグルチニン（ＨＡ
）エピトープおよび６ヒスチジン（６ＸＨＩＳ）コドンをエンコードするさらに
別の配列がある。エピトープ／親和性タグ配列のすぐ上流かつ上述のＰＦＥＫプ
レプロ配列の下流にある独自のＸｂａＩ制限酵素部位は、異種のセリーンプロテ
アーゼｃＤＮＡの触媒領域のイン・フレーム挿入の地点である（図４）。上述の
酵素原活性化ベクターは、修飾されたｐＦａｓｔＢａｃ１トランスプレースメン
トプラスミドにクローン化され、ＰＦＥＫ−ＨＡ６ＸＨＩＳ−ＴＡＧＦＢが生成
された。

【０１４５】 プロテアーゼＥＯＳｃＤＮＡ全長の精製されたプラスミドＤＮＡは、アドバン
テージＧＣｃＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，ＣＡ）を用いた１００μｌの調製ＰＣＲ反応において、製造者の勧めに従
ってテンプレートとして用いられた。用いられたプライマーすなわち 配列番号５：ＥＯＳ Ｘｂａ−Ｕ５’−ＧＧＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧ
ＡＧＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣ−３’ 配列番号７：ＥＯＳ Ｘｂａ−Ｕ５’−ＣＴＣＡＴＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＡＧ
ＡＡＧＴＧＡＣＧＣＧＡＧＣＣＴＧ−３’ はＸｂａＩ切断末端を含み、プロテアーゼＥＯＳの触媒領域の側面に位置してプ
ロテアーゼＥＯＳＸｂａＩ触媒カセットを生成するように設計された。調製ＰＣ
Ｒ反応は、９４℃で３０秒間および６８℃で２．５分間のサイクルに１８回かけ
られた。

【０１４６】 調製ＰＣＲ産物は、まずフェノール／ＣＨＣｌ_３（１：１）で抽出され、ＣＨ
Ｃｌ_３で抽出され、それからグリコーゲン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）および担体を用いてＥ
ｔＯＨ沈殿を行った。沈殿したペレットを７０％ＥｔＯＨですすぎ、真空で乾燥
し、８０μｌのＨ_２Ｏ、１０μｌの１０制限バッファナンバー２および１μｌの
１００×ＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，
ＭＡ）で再懸濁した。この産物は、２００単位のＸｂａＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）によって、３７℃で３
時間消化された。ＸｂａＩで消化された産物をまずフェノール／ＣＨＣｌ_３（１
：１）で抽出し、ＣＨＣｌ_３で抽出し、ＥｔＯＨ沈殿を行い、７０％ＥｔＯＨで
すすぎ、真空で乾燥した。汚染物してのテンプレートプラスミドＤＮＡから精製
するため、ＴＡＥバッファ（４０ｍＭのトリス−酢酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ
８．３）を用い、１．０％低融点アガロース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）ゲルを介して産物を電気泳動し、ゲル
から切除した。切除された産物のアリクウォットは、次に、上述のようにＸｂａ
Ｉで消化され、脱リン化され、ゲル精製された酵素原活性化ベクターとのイン・
ゲル連結反応に用いられる。ＰＦＥＫプロテアーゼＥＯＳ−ＨＡ６ＸＨＩＳ−Ｔ
ＡＧ６４構築物を生成すべく正確な向きで挿入されたＥＯＳＸｂａカセットを含
むクローンは、ＮＨ_２端末ＰＦＥＫプレプロ配列およびＣ端末ＨＡ６ＸＨＩＳエ
ピトープ／親和性タグに対する適切な翻訳レジスタが維持されていることを確実
にするため、配列分析によって確認された。

【０１４７】 実施例４ 組換えプロテアーゼＥＯＳの発現 ＰＦＥＫプロテアーゼＥＯＳ−ＨＡ６ＸＨＩＳ構成物を含む組換えバクミド（
ｂａｃｍｉｄ）を、細菌の形質転換、選別、成長、精製、およびＰＣＲ確認によ
って、製造者の勧めに従って調製した。培養されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１７１１）を精製されたバクミドＤＮＡでトランスフェクトし、数日後
、組換えＰＦＥＫ−ＥＯＳ−ＨＡ６ＸＨＩＳバキュロウイルスを含む馴致培地を
ウイルスストック増幅のために採取した。Ｓｆ−９００ＩＩ ＳＦＭにおいて密
度２×１０^６／ｍｌで成長していたＳｆ９細胞を、２７℃、８０時間で二回感染
させ、細胞のペレットをＰＦＥＫ−ＥＯＳ−ＨＡ６ＸＨＩＳの精製のために採取
した。

【０１４８】 実施例５ 組換えプロテアーゼＥＯＳの精製および活性化 細胞を氷上で、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％
のトリトンＸ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＰＭＳ
Ｆ、ロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）およびペプスタチン（１μｇ／ｍｌ）で溶菌
した。細胞の溶菌液を、抗ＦＬＡＧ Ｍ２親和性ゲル（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄ
ａｋ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）と混合し、静かに回転しながら４℃
、３時間で結合させた。酵素原が結合した樹脂を、ＴＢＳバッファ（５０ｍＭト
リス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、最終的なｐＨが７．５）で三回洗い、Ｔ
ＢＳバッファにＦＬＡＧペプチド（１００μｇ／ｍｌ）を用いて競合によって溶
出させた。溶出した酵素原を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ膜（ＭＷＣＯ：１２，０
００〜１４，０００）（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｓｔｏｎ，ＴＸ）で、ＴＢＳから一晩透析した。Ｎｉ−ＮＴ
Ａ（酵素原１００μｇ当たり５０％スラリ１５０μｌ）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌ
ｅｎｃｉａ，ＣＡ）を透析されたサンプル５ｍｌに加え、４℃で６０分間、振と
うによって混合した。酵素原が結合した樹脂を洗浄バッファ［１０ｍＭのトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、および１５ｍＭのイミダゾー
ル］で三回洗い、次に１．５ｍｌのｄｓＨ_２Ｏで洗った。酵素原の切断は、少量
のエンテロキナーゼ（酵素原５０μｇ当たり１０Ｕ）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ
．，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ；もしくはＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を
、酵素原が結合したＮｉ−ＮＴＡビーズに加え、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．４）、５０ｍＭのＮａＣｌおよび２．０ｍＭのＣａＣｌ_２を含むバッファ
を用いて常温で一晩静かに振とうすることによって行った。その後、樹脂を１．
５ｍｌの洗浄バッファで二回洗った。活性化されたプロテアーゼＥＯＳＨＡ６Ｘ
ＨＩＳを、溶出バッファ［２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、２５０ｍ
ＭのＮａＣｌおよび２５０ｍＭのイミダゾール］を用いて溶出させた。溶出した
タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを基準として用いて、ＭｉｃｒｏＢＣＡ
キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって測定された。活性化
されたプロテアーゼＥＯＳＨＡ６ＸＨＩＳのアミド分解活性は、図６に示された
合成基質からのパラニトロアニリン（ｐＮＡ）の放出によってモニターされた。
これらの研究において用いられた色素原基質は、全て商業的に入手可能である（
Ｂａｃｈｅｍ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＰＡ；Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，Ｃ
Ｔ；Ｋａｂｉ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｈｅｐａｒ Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ
，ＯＨ）。検定混合物は、５００μＭの色素原基質、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（
ｐＨ７．８）、２５ｍＭのＮａＣｌおよび２５ｍＭのイミダゾールを含んでいた
。ｐＮＡの放出は、４０５ｎｍ吸光度フィルターを用い、マイクロプレートリー
ダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）で
３７℃、１２０分間にわたり測定された。最初の反応速度（Ｖｍａｘ、ｍＯＤ／
分）は、Ｓｏｆｔｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ
Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用い、吸光度と時間との関係をプロットすることにより測定
された。各種の基質に対する活性化されたプロテアーゼＥＯＳ−ＨＡ６ＸＨＩＳ
の特定の活性（生産されたｎモルｐＮＡ／分／タンパク質μｇ）が、図６に示さ
れている。精製された、活性化されていないＰＦＥＫプロテアーゼＥＯＳ−ＨＡ
６ＸＨＩＳ酵素原の場合、計測可能な色素原アミド分解活性は全く検出されなか
った。

【０１４９】 組換えプロテアーゼＥＯＳの電気泳動およびウェスタンブロッティング検出 還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下で変性された、精製されたＰＦ
ＥＫプロテアーゼＥＯＳ−ＨＡ６ＸＨＩＳ酵素原すなわち活性化されたプロテア
ーゼＥＯＳ−ＨＡ６ＸＨＩＳのサンプルを、クーマシーブリリアントブルーで染
色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）によっ
て分析した。ウェスタンブロッティングに関して、ゲルはＨｙｂｏｎｄ ＥＣＬ
膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に電気的
に転移された。感染したＳｆ９細胞から発現されたＦＬＡＧでタグを付けられた
ＰＦＥＫプロテアーゼＥＯＳ−ＨＡ６ＸＨＩＳ酵素原が、抗ＦｌａｇＭ２抗体（
Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）で検出され
た。二次抗体は、ヤギの抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ダイコンペロキシダーゼ結
合Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃ
ｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）であり、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）によって検出された。

【０１５０】 実施例６ 色素原検定 活性化されたセリーンプロテアーゼのアミドール的活性は、商業的に入手可能
な合成基質（Ｂａｃｈｅｍ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃ
ｅ，ＰＡ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｇｒｅｅｎ
ｗｉｃｈ，ＣＴ；Ｋａｂｉ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｈｅｐａｒ Ｉｎｃ．，Ｆｒ
ａｎｋｌｉｎ，ＯＨ）からのパラニトロアニリン（ｐＮＡ）の放出によってモニ
ターされる。検定混合物は、５００μＭの色素原基質、１０ｍＭのトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．８）、２５ｍＭのＮａＣｌおよび２５ｍＭのイミダゾールを含む。ｐ
ＮＡの放出は、４０５ｎｍ吸光度フィルターを用い、マイクロプレートリーダー
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）で３７
℃、１２０分間にわたり測定される。最初の反応速度（Ｖｍａｘ、ｍＯＤ／分）
は、Ｓｏｆｔｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａ
ｒｋ，ＣＡ）を用い、吸光度と時間との関係をプロットすることにより測定され
る。本発明のセリーンプロテアーゼを調節する化合物は、加速に関するスクリー
ニングを通して、あるいはもっと一般的には、タンパク質分解活性の抑制に関す
るスクリーニングを通して確認される。この場合、色素原的活性は吸光度の増加
によってモニターされるが、上述のような、タンパク質分解活性を測定するため
の蛍光光度法検定あるいはＦＲＥＴなどの他の方法を用いてよい。化合物はＤＭ
Ｆ、ＤＭＳＯ、メタノールなどの適当な溶媒に溶解され、通常は１００μＭを超
えない濃度範囲に水で希釈され、プロテアーゼ濃度の１０００倍の濃度（ただし
これに限定されない）が試験される。次に、化合物をタンパク質ストック溶液と
混合し、これを反応混合物に加える。あるいは、タンパク質、化合物溶液を反応
混合物に別々に加えてもよい。この場合、化合物をプロテアーゼタンパク質添加
の前に加えても、直後に加えてもよい。

【０１５１】 実施例７−抗体を用いたＥＯＳタンパク質の検出 ＥＯＳタンパク質に対して反応性を有するポリクローナル抗体の生成： プロテアーゼＥＯＳオープンリーディングフレームのヌクレオチド３３４〜３
７２によってエンコードされたアミノ酸配列を有する抗原ペプチドを、Ｃ端末シ
ステインを用いて合成した。ペプチドは、マレイド活性化ＫＬＨ（Ｐｉｅｒｃｅ
，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に、製造者の指示に従って連鎖された。連鎖してい
ないペプチドは、ＰＢＳから一晩透析することによって除去された。続いて、ウ
サギのポリクローナル抗体を二匹の別個の動物において生成した。抗血清を、Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）アフィニティーコラム（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によ
って精製した。

【０１５２】 ウェスタンブロット： ＥＯＳタンパク質を、上述のように昆虫Ｓｆ９発現システムから精製した。タ
ンパク質は、トリス−グリシン−メタノールバッファを用い、ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離され
ると共にニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に転移
された。膜は、５％の無脂乾燥乳を含むＰＢＳＴ（８０ｍＭの無水オルトリン酸
水素二ナトリウム、２０ｍＭのオルトリン酸二水素ナトリウム［ｐＨ７．５］、
１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のトゥイーン２０）でブロックされた。膜を
免疫血清と共にインキュベートし、さらにロバの抗ウサギダイコンペロキシダー
ゼ（ＨＲＰ）連鎖二次抗体と共にインキュベートし、増強化学発光（ＥＣＬ）（
Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）によって検出
が行われた。プロテアーゼＥＯＳタンパク質は、上述のようにウサギのポリクロ
ーナル抗体を用いて検出された。ＦＬＡＧエピトープに対するＭ２モノクローナ
ル抗体は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。

【０１５３】 上述のように、ＰＣＲプロフィールは、プロテアーゼＥＯＳが、いたるところ
にというよりはむしろ末梢白血球、脾臓、胸腺および胃などの特定の組織に強く
発現されることを示している。この遺伝子産物の機能および生物学的な今日性を
より良く理解するために、このタンパク質のサブセルラー（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ）発現パターンを調べることが重要である。この目的のために、プロテア
ーゼＥＯＳｃＤＮＡから類推された抗原ペプチドを用い、ウサギにおいてポリク
ローナル抗ＥＯＳ抗体を生成した。アフィニティーコラム精製によって精製され
た抗体の特異性を、ウェスタンブロット分析によって試験した。図７Ｂに示され
ているように、抗体は半精製されたＥＯＳタンパク質に特異的に結合し、同様の
条件下で発現されたプロテアーゼＨに指定された別の関連Ｓ１セリーンプロテア
ーゼには結合しない。結合は、この抗体を生成するために用いられるＥＯＳ特異
的ペプチドによるプレアブソーベント（ｐｒｅ−ａｂｓｏｒｂｅｎｔ）である前
免疫血清あるいは抗体では検出できない（図７ＡおよびＣ）。プロテアーゼＥＯ
ＳおよびＨはどちらもＦＬＡＧエピトープを含むように作られたので、同じ量の
タンパク質が負荷されるように、膜を抗ＦＬＡＧ抗体でプローブした（図７Ｄ）
。

【０１５４】 細胞培養： ヒトのモノブラスチック（ｍｏｎｏｂｌａｓｔｉｃ）細胞系統Ｕ９３７を、Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａ
ｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培養基で、１０％の熱で
不活性化されたウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバ
ッファ、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１．０
ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および抗生物質（１００Ｕのペニシリン／ｍｌお
よび１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌ）の存在下で培養された。培養は、
加湿された空気中（ＣＯ_２濃度５％、３７℃）でインキュベートされ、週に二度
副次培養された。懸濁Ｕ−９３７細胞を中性に緩衝された１０％ホルマリンで１
５分間室温（ＲＴ）で固定し、ＰＢＳで三回洗い、Ｃｙｔｏ−Ｔｅｋ遠心分離機
（Ｍｉｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で遠心分離してスライドに置いた。スラ
イドを、室温で少なくとも一晩乾燥してから免疫細胞化学的に染色した。付着細
胞をチャンバスライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）
で培養し、同様に固定し、使用時まで４℃で保存した。

【０１５５】 免疫組織化学： ヒトの複数の組織ブロックを、ＤＡＫＯコーポレーション（Ｃａｒｐｅｎｔｅ
ｒｉａ，ＣＡ）から購入した。組織の切片を脱パラフィン化し、水和させ、ター
ゲット・リトリーバル・ソルーション（ＤＡＫＯ；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，Ｃ
Ａ）に浸し、８００Ｗの市販の電子レンジで二回、３分間高出力で加熱した。 スライドが冷えてから、内因性ペロキシダーゼを３．０％のＨ_２Ｏ_２で１０分間
ブロックした。組織スライドを、アビジン−ビオチンブロッキングシステムを介
して、製造者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）の指示
に従って加工した。次に、バックグラウンドを減少させるために、スライドを通
常のブロッキング血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）で１０分間インキュベートし
た。一次抗体をスライドに３０分間置き、続いて、ビオチニル化された二次抗体
（ヤギの抗ウサギもしくはウマの抗マウス、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を３０分
間スライドに置いた。自動化バッファ（Ｂｉｏｍｅｄａ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔ
ｙ，ＣＡ）ですすいだ後、アビジン−ビオチンＨＲＰ錯体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｓ）を加えて３０分置いた。スライドを色原体３，３’−ジアミノベンジ
ジン（Ｂｉｏｍｅｄａ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で二回洗い、処理し（
５分間）、ｄＨ_２Ｏですすぎ、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色し、脱水
し、カバーガラスを置いた。全ての試薬のインキュベーションおよび洗浄は、室
温で行われた。自動化バッファによる洗浄を、各工程間で行った。細胞の免疫細
胞化学的な細胞染色を、Ｈ_２Ｏ_２、アビジン−ビオチンブロッキング工程以外は
全て同様に行った。負の制御は、一次抗体の抗体希釈剤バッファ（Ｚｙｍｅｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）との交換、同
じ動物もしくは同じ種の免疫化されていない血清に由来の前免疫化血清の使用を
含んだ。新規のプロテアーゼＥＯＳに対する抗体の特異性を、（モル濃度が抗体
のそれに対して１００倍過剰の）抗原と共に抗体を一晩４℃で前インキュベート
することによって確認した。正の制御は、既知の細胞マーカーを用いて行った。

【０１５６】 免疫蛍光法： ＥＯＳおよびマクロファージメーカーＣＤ６８用の複数の組織ブロックの同一
区間に、二重の免疫蛍光法染色を続けて行った。ＥＯＳタンパク質の発現は、ポ
リクローナルＥＯＳ抗体、およびｃｙ３−共役ヒツジ抗ウサギ二次抗体（Ｓｉｇ
ｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で検出された。ＥＯＳタンパク質の発現は、ポ
リクローナルＥＯＳ抗体、およびＦＩＴＣ共役ヒツジ抗ウサギ二次抗体（Ｓｉｇ
ｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で検出された。モノクローナル抗ＣＤ６８抗体
（ＤＡＫＯ；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）、およびテキサスレッドで標識を
付けられたウマ抗マウス二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を、ＣＤ６８の発
現用に用いた。抗体のインキュベーション手順は、上述の免疫組織化学法で説明
したそれと同じである。スライドを洗い、最後の二次抗体を加え、ＤＡＰＩ核対
比染色剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を含むベク
タシールドマウンティング（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ｍｏｕｎｔｉｎｇ）媒体
でカバーガラスを掛けた。

【０１５７】 甲状腺、脾臓、子宮、前立腺、睾丸、卵巣、膵臓、肺、肝臓、腎臓、心臓、胃
、小腸、大腸、脳、副腎組織を含む異なる６０種類のヒトの組織標本から成る複
数の組織ブロックにおいて、免疫組織化学法により、ＥＯＳタンパク質の局在化
を行った。免疫染色された細胞は、脾臓、肺、小腸および大腸において最も目立
った。図８の上のパネルは、脾臓、肺および結腸における例を示す。脾臓におい
て、強くＥＯＳ染色している細胞が、赤色脾髄柔組織領域の全体に散らばってい
るが、白色髄にはほとんど存在しない。肺において、陽性細胞は、肺胞裏打ち細
胞の頂部にあるか、肺胞空間を漂っているかのいずれかである。陽性細胞の中に
は、貪食された物質を含むものがあった。陽性細胞は、結腸の粘膜下組織層にお
いて観察された。対照的に、（共に負の制御として用いられた）正常なラット血
清および前免疫血清の場合、バックグラウンド染色のみが観察された。

【０１５８】 実施例８−細胞内ＥＯＳｍＲＮＡの検出 原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成： リボ−ＲＮＡプローブ調製：ＥＯＳｃＤＮＡの３’非翻訳領域に由来の４５０
ｂｐフラグメントを、ＰＣＲ増幅によって作った。ｃＤＮＡを発現ベクターｐ ＳＰＴ−１９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に結合させた。次に
、プラスミドをＢａｍＨＩで直線状にし、ＲＮＡを転写するテンプレートとして
用いた。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識を付けられたアンチセンスリボプロー
ブを、ＤＩＧ ＲＮＡ標識キット（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を
用い、ＤＩＧ−ＵＴＰの存在下で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて生体外で合
成した。リボプローブの特異性を全長ｃＤＮＡに対するドットプロットによって
確認した。

【０１５９】 ハイブリッド形成：複数の組織スライドを脱ろうし、水和して、３％のＨ_２Ｏ_２ に室温で１０分間置いた。次に、スライドをペプシン溶液（Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｓｔｖｉｌｌｅ，ＡＬ）で、３７℃で１０分間消化
した。切片を十分に洗い、１００％アルコールで脱水し、５分間空気乾燥した。
ＥＯＳリボプローブを、ハイブリッド形成バッファ（Ｂｉｏｍｅｄａ；Ｆｏｓｔ
ｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で０．１μｇ／ｍｌに希釈した。プローブ溶液２００μ
ｌを各スライドに置き、９８℃で１０分間加熱し、さらに３７℃で２時間インキ
ュベートした。次に、スライドを室温で、低ストリンジェンシー洗浄（２×ＳＳ
Ｃ）続いて高ストリンジェンシー洗浄（０．１×ＳＳＣ）した。検出は、スライ
ドを抗ジゴキシゲニン−アルカリフォスファターゼＦａｂフラグメント（Ｂｅｒ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と共に３０分間インキュベートすることと
、ひき続いてのアルカリフォスファターゼ基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｅｎｚｏ Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ；ＮＹ，ＮＹ）反応とによって行われた。スライ
ドは、その後、核ファスト・レッド（Ｂｉｏｍｅｄａ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ
，ＣＡ）で対比染色され、脱水され、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理された。

【０１６０】 ノーザンブロット分析： モノブラスト（ｍｏｎｏｂｌａｓｔ）Ｕ９３７細胞（５×１０^５／ｍｌ）をフ
ォルボールエステルＰＭＡ（１６０ｎＭ／ｍｌ）で０日間、２日間、および５日
間処理した。ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ）で抽出されたＲＮＡ全体（３０μｇ）を１％アガロース−ホルムアルデヒ
ドゲルで分別し、Ｈｙｂｏｎｄ（商標）−Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。
膜を真空下、８０℃で２時間焼き、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）でＵＶ架橋した。プロテアーゼＥＯＳ用のハイブリッド形成プローブを
生成するためにＰＣＲが用いられ、一方、ＣＤ６８ｃＤＮＡフラグメントが、Ｐ
ＭＡで誘導されたＵ９３７細胞から室温のＰＣＲ反応によって得られた。アクチ
ンｃＤＮＡフラグメントは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した。プローブは、^{３ ２} Ｐで標識を付けられたα−ｄＣＴＰの存在下、クレノウＤＮＡポリメラーゼを
用いたランダムプライミングによって生成された。ハイブリッド形成は、Ｅｘｐ
ｒｅｓｓＨｙｂ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で、製造者の手順に従って行われ
た。膜を、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（室温）で二回、１×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ（５０℃）で二回洗い、自動放射線検査機にかけた。

【０１６１】 ＤＩＧで標識を付けられたｃＲＮＡリボプローブを用いた原位置ハイブリッド
形成によって、プロテアーゼＥＯＳｍＲＮＡが検出された。図８（下のパネル）
に示されているように、抗ＥＯＳ抗体を用いた免疫反応性と比較した場合、類似
した発現パターンが得られた。陽性のハイブリッド形成された細胞は、明るい紫
色で視覚化されている。

【０１６２】 上述の組織における免疫反応細胞の独自性を有する局在化、ならびに免疫染色
された細胞を高倍率で調べた結果から、これらの組織において優勢な陽性細胞の
タイプはマクロファージとみられることが判明した。マクロファージは腎臓（豆
）のような形の核を示し、その核は、断面内部の多くの向きにおいて、二つの別
々の核のように見える傾向がある。また、マクロファージは強力な食作用能力を
持つ。脾臓において、これらの食作用を有するマクロファージは、赤血球に由来
する物質を蓄積することが予想される。肺において、これらの細胞は非常に活発
な食細胞であり、肺胞のガス交換面からゴミを取り除く責任を担っている。これ
らの細胞内部において、免疫染色は、別個の細胞質顆粒に局在していた。

【０１６３】 マクロファージにおけるプロテアーゼＥＯＳの発現を確認するために、二重の
免疫蛍光染色が行われた。ＥＯＳに対する特異性を有する抗体およびマクロファ
ージ特異性マーカーＣＤ６８に対する抗体を用い、対応するシグナルを、マクロ
ファージのオーバーラッピングする組に同じ局在部位を定めることができた。図
９に示されるように、マクロファージマーカーＣＤ６８を発現する細胞も、ＥＯ
Ｓタンパク質発現に対して陽性であった。抗ＥＯＳ一次抗体に対する蛍光共役二
次抗体が用いられ、この二次抗体は細胞を緑（左のパネル）に染色した。一方、
抗ＣＤ６８一次抗体に対するテキサスレッド共役抗体は、細胞を赤（右のパネル
）に染色した。この実験で得られた証拠により、プロテアーゼＥＯＳがマクロフ
ァージに発現されることが確認される。

【０１６４】 実施例９−Ｕ９３７細胞において、プロテアーゼＥＯＳをフォルボールエステ
ルＰＭＡによって上向き調節する ＥＯＳとマクロファージ活性化との間の機能的連係をさらに調べるために、活
性を有するマクロファージへのモノブラストの分化と、プロテアーゼＥＯＳ遺伝
子の調節との相関をモニターした。ヒトのモノブラスチックＵ９３７細胞を、フ
ォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で処理した。通常は
懸濁状態で成長し滑らかな表面を示すＵ９３７細胞が、上記の処理により仮足を
伸ばし、互いに対する、また培養皿の表面に対する付着性を示した。免疫細胞化
学によって検出されたように、マクロファージ面マーカーＣＤ６８は、刺激を受
けていない細胞には発現されなかった（図１０Ｅ）。しかし、ＰＭＡによる刺激
の後、９０％以上の細胞がこのマーカーによって染色された（図１０Ｆ）。重要
なのは、ＰＭＡで処理された細胞において、抗プロテアーゼＥＯＳ免疫染色細胞
が劇的に増加したことである（８０％）（図１０Ｄ）。また、ＰＭＡ処理の前に
は、細胞の５％未満しか陽性のＥＯＳ染色を示さなかった（図１０Ｃ）。対照と
して、「ハウスキーピング」タンパク質であるビメンチンに関する細胞も染色し
た。未処理細胞および処理された細胞を抗ビメンチンで染色した結果（図１０Ａ
およびＢ）は、未処理のＵ９３７細胞が免疫反応性を有し、よって抗体で染色さ
れ得ることを示している。

【０１６５】 図１１に示されているように、上向き調節も、ノーザンブロット分析によりＲ
ＮＡレベルで示された。ＰＭＡ処理されないと、新規なセリーンプロテアーゼＥ
ＯＳ、ＣＤ６８マクロファージマーカーの両方は検出されなかった（０日後）。
ＰＭＡによる処理の２日後には、レベルが上昇しているのが分かる。処理後５日
目には、プロテアーゼＥＯＳとＣＤ６８ｍＲＮＡの両方におけるさらなる増加が
観察された。平等なサンプル負荷であることを示すために、β−アクチンを基準
として用いた。以上、これらのデータは、新規なプロテアーゼＥＯＳがＰＭＡに
よって上向き調節され、またおそらくマクロファージ活性化で上向き調節される
ことを示唆している。

【０１６６】

【参考文献】

【０１６７】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 新規プロテアーゼＥＯＳｃＤＮＡのヌクレオチド（配列番号１）を示す。

【図１Ｂ】 新規プロテアーゼＥＯＳのアミノ酸配列（配列番号７）を示す。

【図２】 他のＳ１セリーンプロテアーゼと比較するプロテアーゼＥＯＳアミノ酸配列の
系統樹を示す。

【図３】 プロテアーゼＥＯＳｍＲＮＡのＰＣＲに基づく組織分布を示す。

【図４パネル１】 酵素原の活性構築物におけるプロテアーゼＥＯＳ触媒領域のヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示す。

【図４パネル２】 酵素原の活性構築物におけるプロテアーゼＥＯＳ触媒領域のヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示す。

【図４パネル３】 酵素原の活性構築物におけるプロテアーゼＥＯＳ触媒領域のヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示す。

【図４パネル４】 酵素原の活性構築物におけるプロテアーゼＥＯＳ触媒領域のヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示す。

【図４パネル５】 酵素原の活性構築物におけるプロテアーゼＥＯＳ触媒領域のヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示す。

【図４パネル６】 酵素原の活性構築物におけるプロテアーゼＥＯＳ触媒領域のヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示す。

【図５】 組換えプロテアーゼＰＦＥＫ−プロテアーゼＥＯＳ−ＨＡ６ＸＨＩＳのポリア
クリルアミドゲルおよびウエスタンブロット分析の結果を示す。

【図６】 活性構築物から発現され、精製され活性化された組換えプロテアーゼＥＯＳ−
ＨＡ６ＸＨＩＳの機能的アミド分解活性の測定結果を示す。

【図７】 バキュロウイルス発現システムから発現された半精製プロテアーゼＥＯＳおよ
び関連したタンパク質プロテアーゼＨの、新規プロテアーゼＥＯＳに対する抗体
を用いた免疫ブロット特性分析の結果を示す。

【図８】 新規プロテアーゼＥＯＳおよびｍＲＮＡの局在部位分析結果を示す。

【図９】 ＥＯＳおよびマクロファージマーカーＣＤ６８の二重焼付け染色の結果を示す
。

【図１０】 Ｕ９３７細胞におけるフォルボールエステルによるプロテアーゼＥＯＳタンパ
ク質の上向き調節の測定結果を示す。

【図１１】 Ｕ９３７細胞におけるフォルボールエステルによるプロテアーゼＥＯＳｍＲＮ
Ａの上向き調節の測定結果を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/00 Ｃ１１Ｄ 3/386 ４Ｂ０６５ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８３ Ｃ１１Ｄ 3/386 1/19 ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｈ００３ 1/19 9/76 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/37 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/76 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/547 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アンドレイド−ゴードン，パトリシア アメリカ合衆国、ペンシルバニア・18901、 ドイルズタウン、ウインデイ・ラン・301 (72)発明者 チヨン，ツアイリン アメリカ合衆国、ペンシルバニア・18938、 ニユー・ホープ、クライドズデイル・ドラ イブ・513 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 BA14 CA03 CA04 HA01 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 LL04 4B063 QA01 QA18 QQ36 QR16 QS03 QX01 QX02 QX07 4B064 AG27 CA21 DA13 4B065 AB01 BA02 CA33 CA44 CA46 CA57 4C083 AD411 CC38 EE21 4C084 AA02 AA07 AA17 BA01 BA03 BA08 BA22 BA23 BA44 CA53 DC03 NA14 ZA892 4H003 DA01 DA02 DA05 DA17 EC02 FA01 FA47 4H045 AA11 DA76 EA50 【要約の続き】

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロテアーゼＥＯＳをエンコードする分離され且つ精製され
   たＤＮＡ分子、 およびその機能性誘導体。
2. 【請求項２】 （配列番号１）、（配列番号８）およびそれらの機能性誘導
   体から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の分離され且つ精
   製されたＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 前記ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の分
   離され且つ精製されたＤＮＡ分子。
4. 【請求項４】 プロテアーゼＥＯＳタンパク質をエンコードするヌクレオチ
   ド配列を含む組換え宿主におけるプロテアーゼＥＯＳタンパク質の発現用の発現
   ベクター、およびその機能性誘導体。
5. 【請求項５】 前記発現ベクターが、（配列番号１）、（配列番号８）およ
   びそれらの機能性誘導体から選択される、プロテアーゼＥＯＳタンパク質をエン
   コードするヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の発現ベクター。
6. 【請求項６】 発現ベクターが、プロテアーゼＥＯＳタンパク質をエンコー
   ドするゲノムＤＮＡを含む、請求項４に記載の発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項４の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
8. 【請求項８】 前記発現ベクターが、（配列番号１）、（配列番号８）から
   選択されるヌクレオチド配列およびそれらの機能性誘導体を有する、請求項７に
   記載の組換え宿主細胞。
9. 【請求項９】 前記ヌクレオチド配列がゲノムＤＮＡである、組換え宿主細
   胞。
10. 【請求項１０】 プロテアーゼＥＯＳタンパク質として機能する実質的に純
    粋な形態のタンパク質。
11. 【請求項１１】 （配列番号７）、（配列番号９）およびそれらの機能性誘
    導体から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載のタンパク質。
12. 【請求項１２】 プロテアーゼＥＯＳタンパク質に対して免疫学的に反応す
    る単一特異性抗体。
13. 【請求項１３】 前記抗体が、前記タンパク質のプロテアーゼ活性を遮断す
    る、請求項１２に記載の抗体。
14. 【請求項１４】 （ａ）請求項４の発現ベクターを適切な宿主細胞に移すこと、 （ｂ）前記ステップ（ａ）の宿主細胞を、前記発現ベクターからの前記プロテ
    アーゼＥＯＳタンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること、を含む組換
    え宿主細胞におけるプロテアーゼＥＯＳタンパク質の発現のための方法。
15. 【請求項１５】 （ａ）プロテアーゼＥＯＳタンパク質活性の調節剤と、プロテアーゼＥＯＳタ
    ンパク質と、標識付け基質とを合わせること、 （ｂ）前記標識付け基質における変化を測定すること、を含むプロテアーゼＥ
    ＯＳタンパク質活性を調節する化合物を特定する方法。
16. 【請求項１６】 前記標識付け基質が、蛍光原基質、比色分析基質、放射分
    析基質、および蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）基質から選択される、請求
    項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 プロテアーゼＥＯＳセリーンプロテアーゼ活性の調節剤で
    ある、請求項１５の方法において活性を有する化合物。
18. 【請求項１８】 前記化合物が、プロテアーゼＥＯＳセリーンプロテアーゼ
    活性のアゴニストもしくはアンタゴニストである、請求項１６に記載の化合物。
19. 【請求項１９】 プロテアーゼＥＯＳセリーンタンパク質の発現の調節剤で
    ある、請求項１６に記載の化合物。
20. 【請求項２０】 請求項１６の化合物の投与を含む、プロテアーゼＥＯＳが
    介在する疾病状態の治療を必要とする患者を治療する方法。
21. 【請求項２１】 配列番号１および配列番号８およびそのフラグメントから
    選択される核酸配列を含むキット。
22. 【請求項２２】 配列番号７および配列番号９、およびそれらフラグメント
    もしくはそれらの誘導体から選択されるセリーンプロテアーゼＥＯＳタンパク質
    を含むキット。
23. 【請求項２３】 請求項１０のタンパク質を含む、医薬組成物。
24. 【請求項２４】 前記組成物が、局所スキンケア組成物である、請求項２３
    に記載の医薬組成物。
25. 【請求項２５】 請求項１０のタンパク質を含む、非医薬組成物。
26. 【請求項２６】 調剤が、洗濯用洗剤、シャンプー、固面洗浄用組成物、食
    器洗い用組成物から選択される、請求項２５に記載の非医薬組成物。
27. 【請求項２７】 請求項２４の組成物を局所的に適用することを含む、落屑
    の不均衡を、予防処置または急性処置する方法。