DE60028216T2

DE60028216T2 - Für die menschliche serinprotease eos kodierende dna

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Publication number: DE60028216T2
Application number: DE60028216T
Authority: DE
Inventors: L. Andrew Lansdale DARROW; Jensen Branchburg QI; Patricia Doylestown ANDRADE-GORDON; Cailin New Hope CHEN
Original assignee: Ortho McNeil Pharmaceutical Inc
Current assignee: Janssen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-08-31
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2020-08-19
Also published as: DE60028216D1; US20020110895A1; ES2264938T3; US6485957B1; WO2001016290A3; AU781420B2; AU6922800A; US6806059B2; US20070218026A1; EP1212410A2; US20040170973A1; ATE327323T1; CA2383601A1; JP2003529329A; EP1212410A4; US20020142446A1; DK1212410T3; WO2001016290A2; US6747134B2; EP1212410B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mitglieder der Trypsin/Chymotrypsin-artigen (S1) Serin-Proteasen-Familie spielen zentrale Rollen in einer Vielzahl von verschiedenen physiologischen Prozessen, einschließlich Verdauungsprozessen und regulatorischen Amplifikationskaskaden durch die proteolytische Aktivierung von inaktiven Zymogen-Vorläufern. In vielen Fällen sind Protease-Substrate innerhalb dieser Kaskaden selbst die inaktive Form, oder Zymogen, einer Serin-Protease „stromabwärts". Gut bekannte Beispiele für eine Serin-Protease-vermittelter Regulation schließen Blutkoagulation (Davie, et al (1991), Biochemistry 30: 10363–70), Kinin-Bildung (Proud and Kaplan (1988), Ann Rev Immunol 6: 49–83), und das Komplement-System (Reid and Porter (1981), Ann Rev Biochemistry 50: 433–464) ein. Obwohl diese proteolytischen Wege für eine gewisse Zeit bekannt gewesen sind, ist es wahrscheinlich, daß die Entdeckung von neuen Serin-Protease-Genen und ihren Produkten unser Verständnis der Regulation innerhalb dieser existierenden Kaskaden verbessern wird und zur Aufklärung von vollständig neuen Protease-Netzwerken führen wird.
Differenzierte Blutzellen exprimieren eine Ansammlung von Proteasen, die wahrscheinlich spezifische Rollen in verschiedenen pathologischen Zuständen spielen. Obwohl Granzyme aus zytotoxischen T-Zellen natürlichen Killer-Zellen (NK) (Smyth et al. (1996), J. Leukocyte Biol. 60: 555–562), Elastase und Collagenasen aus Neutrophilen (Simon (1993), Agents Actions Suppl. 42: 27–37) und Chymase und Tryptase aus Mastzellen (Caughey (1995), Clin. Allergy Immunol. 6: 305–29; Katunuma and Kido (1988), J. Coll. Biochem. 38: 291–301) gegenwärtig erforscht werden, werden ihre Rollen in pathophysiologischen Prozessen erst jetzt langsam aufgeklärt. Im Gegensatz dazu sind die Proteasen aus Leukocyten, wie etwa Eosinophilen und Makrophagen, nicht charakterisiert worden und werden nur gegenwärtig in molekularer Weise identifiziert. Zum Beispiel beschreibt Inoue et al. (1998, Biochemical and Biophysical Research Communications 252: 307–312) die Klonierung und Gewebeverteilung einer Serin-Protease aus humanen Eosinophilen. Ein Verständnis der physiologischen Rollen, die diese Proteasen spielen, wird zu einem besseren Verständnis der Eosinophilen- und Makrophagen-Funktion im gesunden und kranken Zustand führen (Abu-Ghazaleh et al. (1992), Immunol. Ser. 57: 137–67; Gleich (1996), Allergol. Int. 45: 35–44; De Villiers and Smart (1999), J. Leukocyte Biol. 66: 740–746; Gleich et al. (1993), Annu. Rev. Med. 44: 85– 101; Sherman and Truog (2000), Lung Biol. Health Dis. 137: 813–839; Yoon and Jun (1999), Arch. Pharmacal Res. 22: 437–447).
Proteasen werden in nicht-natürlichen Umgebungen für verschiedene kommerzelle Zwecke, einschließlich Wasch-Detergentien, Nahrungsverarbeitung, Textilverarbeitung und Hautpflegeprodukten, verwendet. In Wasch-Detergentien wird die Protease verwendet, um organische, schlecht lösliche Verbindungen in löslichere Formen zu zerlegen, die in Detergenz und Wasser leichter aufgelöst werden können. In dieser Kapazität wirkt die Protease als ein „Fleckentferner". Beispiele für Nahrungsverarbeitung schließen das Weichmachen von Fleisch und die Produktion von Käse ein. Proteasen werden bei der Textilverarbeitung verwendet, z.B. um Wolle zu behandeln, um das Schrumpfen von Stoff zu verhindern. Proteasen können in Hautpflegeprodukten enthalten sein, um Schuppen auf der Hautoberfläche zu entfernen, die aufgrund einer Unausgeglichenheit in der Abschuppungsrate akkumulieren. Übliche Proteasen, die in einigen dieser Anwendungen verwendet werden, stammen aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, die für die industrielle Herstellung ihrer Enzyme leicht kultiviert werden können, z.B. ist eine häufige verwendete Spezies Bacillus, wie in US-Patent 5,217,878 beschrieben. Alternativ beschreibt US-Patent 5,278,062 Serin-Proteasen, die aus einem Pilz isoliert sind, Tritirachium album, zur Verwendung in Wasch-Detergenz-Zusammensetzungen. Leider ist die Verwendung von einigen Proteasen aufgrund ihres Potentials zur Verursachung von allergischen Reaktionen in empfindlichen Individuen oder aufgrund einer verringerten Effizienz bei Verwendung in einer nicht-natürlichen Umgebung beschränkt. Es wird angenommen, daß Protease-Proteine, die aus nicht-humanen Quellen stammen, mit größerer Wahrscheinlichkeit eine Immunantwort in einem empfindlichen Individuum verursachen würden. Aufgrund dieser Beschränkungen gibt es einen Bedarf für alternative Proteasen, die weniger immunogen für empfindliche Individuen sind, und/oder eine effiziente proteolytische Aktivität in einer nicht-natürlichen Umgebung liefern. Die Ankunft von rekombinanten Technologien erlaubt die Expression der Proteine einer beliebigen Spezies in einem Wirt, der für die industrielle Herstellung geeignet ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Hier beschreiben wir die molekulare Identifizierung einer neuen Serin-Protease, die wir als Protease-EOS bezeichnet haben, und ihrer kodierenden DNA-Sequenz. Die Protease-EOS-cDNA-Sequenz sagt ein PräproEOS-Polypeptid von 284 Aminosäuren voraus, und eine ver gleichende Anordnung („alignment") mit anderen gut charakterisierten Serin-Proteasen weist deutlich darauf hin, daß sie ein Mitglied der S1-Serin-Proteasen-Familie ist.
Enzymatisch aktive Protease-EOS ist weiteren biochemischen Analysen zur Identifizierung von physiologischen Substraten und spezifischen Modulatoren zugänglich. Modulatoren, die im hierin offenbarten chromogenen Assay identifiziert werden, sind als therapeutische Mittel bei der Behandlung von Erkrankungen potentiell nützlich, die mit Makrophagen-Funktion oder erhöhten Eosinophil-Werten assoziiert sind, wie etwa, aber nicht beschränkt auf Bronchialasthma und Komplikationen, die aus einer Hypereosinophilie entstehen. Zusätzlich legt die Expression von Protease-EOS im Ovar, der Retina und dem Magen nahe, daß Modulatoren der Protease-EOS-Funktion verwendet werden könnten, um Krankheiten zu behandeln, die diese Gewebe betreffen. Aufgereinigte Protease-EOS kann als ein Bestandteil zur Verwendung in kommerziellen Produkten hergestellt werden, einschließlich Wasch-Detergentien, Fleckentferner-Lösungen und Hautpflegeprodukten.
Die rekombinanten DNA-Moleküle, die für EOS kodieren, und Teile davon sind zum Isolieren von Homologen der DNA-Moleküle, zum Identifizieren und Isolieren von genomischen Äquivalenten der DNA-Moleküle und zum Identifizieren, Nachweisen oder Isolieren von mutanten Formen der DNA-Moleküle nützlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 – Die Nukleotid-(SEQ ID NO: 1) und Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 7) der neuen Protease-EOS-cDNA wird gezeigt.
2 – Der phylogenetische Baum der Protease-EOS-Aminosäuresequenz wird relativ zu anderen S1-Serin-Proteasen gezeigt.
3 – Eine PCR-basierende Gewebeverteilung deutet darauf hin, daß die Protease-EOS-mRNA beschränkt ist. Es werden Autoradiogramme von Gelen mit der Position des EOS-spezifischen PCR-Produkts (EOS) gezeigt, nachgewiesen anhand der Hybridisierung einer markierten eingenisteten Sonde („nested probe"), was nach Elektrophorese von der freien Sonde (F. P.) aufgelöst wurde. Die cDNA-Bibliotheken der analysierten Gewebe und Zellinien sind wie angezeigt.
4 – Es werden die Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzen der katalytischen Protease-EOS-Domäne in dem Zymogen-Aktivierungskonstrukt gezeigt.
5 – Polyacrylamid-Gel- und Western-Blot-Analysen der rekombinanten Protease-PFEK-Protease-EOS-HA6XHIS. Gezeigt wird das Polyacrylamid-Gel, enthaltend Proben der neuen Serin-Protease-PFEK-Protease-EOS-HA6XHIS, gefärbt mit Coomassie-Brilliant-Blau (außen links 1,2). Die relativen molekularen Massen werden anhand der Positionen von Protein-Standards (M) angezeigt. In den angezeigten Spuren war das aufgereinigte Zymogen entweder unbehandelt (–) oder verdaut mit EK (+), das verwendet wurde, um das Zymogen zu spalten und in seine aktive Form zu aktivieren. Ebenso wird ein Western-Blot des Gels gezeigt, der mit dem anti-FLAG-MoAb M2 sondiert worden ist (außen rechts 1). Dies zeigt die quantitative Spaltung des exprimierten und aufgereinigten Zymogens, um die verarbeitete und aktivierte Protease zu erzeugen.
6 – Es wurden funktionelle amidolytische Aktivitäten der rekombinanten Protease EOS-HA6XHIS, die aus dem Aktivierungskonstrukt exprimiert, aufgereinigt und aktiviert worden war, unter Verwendung von chromogenen Substraten bestimmt.
7 – Anti-EOS-Antiserum reagiert spezifisch mit EOS-Protein. Halb-aufgereinigte Protease-EOS und ein verwandtes Protein, Protease H, exprimiert aus einem Baculovirus-Expressionssystem, wurden mittels SDS-PAGE aufgelöst und durch ImmunBloten mit dem gegen die neue Protease-EOS gezogenen Antikörper analysiert. Die Protein-Antikörper-Bindung wurde mittels ECL visualisiert. Da diese rekombinanten Proteasen an den FLAG-Epitop-Schwanz („tag") fusioniert waren, wurden sie ebenfalls unter Verwendung des anti-FLAG-M2-MoAb nachgewiesen, um eine gleiche Beladung zu bestätigen.
8 – Die neue Protease-EOS wird in einer Teilmenge von Makrophagen-artigen Zellen exprimiert. Die Lokalisierung des Protease-EOS-Proteins mittels Immunhistochemie (obere Tafel) und mRNA durch In-Situ-Hybridisierung (untere Tafel) in humaner Milz, Lunge und Colon. Unter den verwendeten Bedingungen zeigen die positiven anti-EOS-immunreagierenden Zellen eine braune Färbung, und der positive EOS-mRNA-Nachweis ist violett (Pfeilspitzen). 20-fache Vergrößerung.
9 – Übereinanderlegbare Färbung von EOS und Makrophagen-Marker CD68. Eine doppelte Immunfluoreszenz wurde unter Verwendung des anti-EOS-Antikörpers und eines Anti-CD68-Antikörpers, einem Makrophagen-spezifischen Marker, durchgeführt. Die Doppel-Immunfluoreszenz erzeugt ein übereinanderlegbares Färbungsmuster, wobei EOS in grün gezeigt wird (linke Tafel) und CD68 in rot gezeigt wird (rechte Tafel). Dies belegt, daß Protease-EOS in Makrophagen exprimiert wird (Pfeilspitzen). 60-fache Vergrößerung.
10 – Eine Hochregulierung des Protease-EOS-Proteins durch Phorbolester in U937-Zellen wird mittels Immuncytochemie nachgewiesen. Monoblasten-U937-Zellen waren unbehandelt (obere Tafel) oder mit Phorbolester PMA (50 ng/ml) für 5 Tage behandelt (untere Tafel). Die Zellen wurden in Objektträger mit Kammer gebracht, mit 10%-iger Formalin-Salzlösung fixiert und mittels Immunzytochemie analyisiert. Die Immunfärbung wurde mit Antikörpern gegen Vimentin, Protease-EOS und CD68 durchgeführt, wie angezeigt. Die positive Immunreaktion wird dunkelbraun unter den verwendeten Bedingungen gezeigt (Pfeilspitzen).
11 – Hochregulation von Protease-EOS-mRNA durch Phorbolester in U937-Zellen. Die Monoblasten-U937-Zellen waren unbehandelt oder mit Phorbolester PMA (50 ng/ml) für die angezeigten Tage behandelt. Die Gesamt-RNA (30 μg) wurde mittels Northern-Blot-Sondierung mit EOS, CD68 oder β-Aktin analysiert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DEFINITIONEN:
Der Begriff „Proteindomäne", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Region eines Proteins, die in eine stabile dreidimensionale Struktur falten kann, unabhängig vom Rest des Proteins. Diese Struktur kann eine spezifische Funktion aufrechterhalten, die mit der Funktion der Domäne innerhalb des Proteins assoziiert ist, einschließlich enzymatischer Aktivität, Erzeugung eines Erkennungsmotivs für ein anderes Molekül oder die notwendigen strukturellen Bestandteile für ein Protein bereitstellen, damit dieses in einer bestimmten Umgebung existieren kann. Proteindomänen sind gewöhnlich evolutionär konservierte Regionen von Proteinen, sowohl innerhalb einer Protein-Superfamilie als auch innerhalb von anderen Protein-Superfamilien, die ähnliche Funktionen erfüllen.
Der Begriff „Protein-Superfamilie", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Proteine, deren evolutionäre Beziehung nicht vollständig feststeht oder anhand akzeptierter phylogenetischer Standards einen Abstand haben kann, die aber ähnliche dreidimensionale Struktur zeigen oder einen einzigartigen Konsensus von kritischen Aminosäuren aufweisen. Der Begriff „Proteinfamilie", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Proteine, deren evolutionäre Beziehung anhand akzeptierter phylogenetischer Standards feststeht.
Der Begriff „Fusionsprotein", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Proteinkonstrukte, die das Ergebnis der Kombination von mehreren Proteindomänen oder Linker-Regionen zum Zwecke des Erhalts der Funktion von kombinierten Funktionen der Domänen oder Linker-Region sind. Dies wird am häufigsten durch molekulare Klonierung der Nukleotidsequenzen erzielt, um zur Erzeugung einer neuen Polynukleotidsequenz zu führen, die für das erwünschte Protein kodiert. Alternativ kann die Erzeugung eines Fusionsproteins durch chemische Verbindung zweier Proteine zusammen erzielt werden.
Der Begriff „Linker-Region" oder „Linker-Domäne" oder solche ähnlichen beschreibenden Begriffe, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Abschnitte von Polynukleotid- oder Polypeptid-Sequenzen, die bei der Konstruktion eines Klonierungsvektors oder Fusionsproteins verwendet werden. Die Funktion einer Linker-Region kann die Einführung von Klonierstellen in die Nukleotidsequenz, die Einführung eines flexiblen Bestandteils oder einer Raumschaffenden Region zwischen zwei Protein-Domänen oder durch die Erzeugung eines Affinitätsanhängsels („affinity tag") für spezifische molekulare Wechselwirkung beinhalten. Eine Linker-Region kann in ein Fusionsprotein ohne eine spezifischen Zweck eingebaut werden, aber aus während der Klonierung gemachten Wahlen resultieren.
Der Begriff „Prä-Sequenz", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die für eine Sekretionssignal-Aminosäuresequenz kodiert. Eine große Vielzahl von solchen Sekretionssignalsequenzen sind Fachleuten bekannt und sind zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet. Beispiele für geeignete Prä-Sequenzen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf ProlactinFLAG, Trypsinogen und ChymoFLAG.
Der Begriff „Pro-Sequenz", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die für eine Spaltstelle für eine Restriktionsprotease kodiert. Eine große Vielzahl von Spaltstellen für Restriktionsproteasen sind Fachleuten bekannt und sind zur Verwendung bei der vorlie genden Erfindung geeignet. Beispiele für geeignete Pro-Sequenzen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf EK, FXa und Thrombin.
Der Begriff „Klonierungsstelle" oder „Polyklonierungsstelle", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Region der in einem Klonierungsvektor enthaltenen oder innerhalb eines Fusionsproteins gentechnisch eingebauten Nukleotidsequenz, die eine oder mehrere verfügbare Restriktionsendonuklease-Konsensussequenzen hat. Die Verwendung einer korrekt ausgewählten Restriktionsendonuklease führt zur Fähigkeit, eine erwünschte Nukleotidsequenz zu isolieren, die für eine Sequenz innerhalb des Leserahmens relativ zu einem Startkodon kodiert, die ein erwünschtes Proteinprodukt nach Transkription und Translation ergibt. Diese Nukleotidsequenzen können dann in andere Klonierungsvektoren eingebaut, zur Erzeugung von neuen Fusionsproteinen verwendet oder zum Einführen von spezifischen ortsgerichteten Mutationen verwendet werden. Es ist Fachleuten wohlbekannt, daß Klonierungsstellen an einem gewünschten Ort durch stille Mutationen, konservierte Mutationen oder die Einführung einer Linker-Region, die die erwünschten Restriktionsenzym-Konsensussequenzen enthält, eingebaut werden können. Es ist Fachleuten ebenso bekannt, daß die genaue Lage einer Klonierungsstelle flexibel sein kann, solange wie die erwünschte Funktion des Proteins oder des klonierten Fragments beibehalten wird.
Der Begriff „Anhängsel" („tag"), wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die die Isolierung, Aufreinigung oder den Nachweis eines das Anhängsel enthaltenden Fusionsproteins erleichtert. Eine große Vielzahl von solchen Anhängseln sind Fachleuten bekannt und sind zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet. Geeignete „Tags" schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf HA-Tag, His-Tag, Biotin, Avidin und Antikörper-Bindungsstellen.
Wie hierin verwendet, werden „Expressionsvektoren" als DNA-Sequenzen definiert, die zur Transkription von klonierten Kopien von Genen und der Translation ihrer mRNAs in einem geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können verwendet werden, um eukaryotische Gene in einer Vielzahl von Wirten zu exprimieren, wie etwa Bakterien, einschließlich E. coli, blau-grünen Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen, einschließlich Hefezellen und tierischen Zellen.
Der Begriff „katalytische Domän-Kassette", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die für wenigstens die katalytische Domäne der interessierenden Serin-Protease kodiert. Eine große Vielzahl von katalytischen Proteasedomänen können in die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung eingeführt werden, einschließlich derjenigen, die gegenwärtig Fachleuten bekannt sind, ebenso wie diejenigen, die noch nicht eine isolierte Nukleotidsequenz haben, die dafür kodiert, wenn die Nukleotidsequenz isoliert ist.
Wie hierin verwendet besitzt ein „funtionelles Derivat" der Nukleotidsequenz, des Vektors oder des Polypeptids eine biologische Aktivität (entweder funktionell oder strukturell), die im wesentlichen den hierin beschriebenen Eigenschaften ähnlich ist. Der Begriff „funktionelle Derivate" soll „Fragmente", „Varianten", „degenerierte Varianten", „Analoge" und „Homologe" der Nukleotidsequenz, Vektor oder Polypeptid einschließen. Der Begriff „Fragment" soll sich auf jegliche Nukleotidsequenz, Vektor oder Polypeptid-Teilmenge der als Prä- und Pro-Sequenzen beschriebenen Module beziehen, die für die Aktivierung von exprimierten Zymogen-Vorläufern verwendet werden. Der Begriff „Variante" soll sich auf eine Nukleotid- oder Aminosäuresequenz beziehen, die im wesentlichen hinsichtlich Struktur und Funktion der vollständigen Nukleinsäuresequenz oder dem kodierten Protein oder einem Fragment davon ähnlich ist. Eine Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz ist „im wesentlichen ähnlich" mit einer anderen, wenn beide Moleküle ähnliche strukturelle Eigenschaften haben, oder wenn beide Moleküle ähnliche biologische Eigenschaften haben. Deshalb werden zwei Moleküle, wenn sie im wesentlichen ähnliche Aktivität haben, als Varianten angesehen, sogar wenn die Struktur eines der Moleküle nicht in dem anderen gefunden wird, oder sogar wenn die beiden Aminosäuresequenzen nicht identisch sind. Der Begriff „Analog" bezieht sich auf ein Proteinmolekül, das hinsichtlich seiner Funktion mit einem anderen verwandten Protein im wesentlichen ähnlich ist.
Hierin beschreiben wir eine Serin-Protease, die aus einer Eosinophil-cDNA-Bibliothek isoliert worden ist und als EOS bezeichnet wird. Die abgeleitete Protease-EOS-Aminosäuresequenz ist den klonierten Serin-Proteasen-Prostasin (Yu et al. (1996), Genomics 32: 334–40) und Tryptase (Miller et al. (1990), J. Clin. Invest. 86: 864–700) am ähnlichsten. Tryptase, die in großer Menge in Mastzellen erzeugt wird, ist mit asthmatischer Entzündung und Blockade in Verbindung gebracht worden (Johnson et al. (1997), Eur. Respir. J. 10: 38–43). Zusätzliche Homologie-Suchen der Genbank-Datenbank mit der Protease-EOS- Nukleotidsequenz zeigte eine Homologie mit den nicht-zusammenhängenden Regionen des humanen Cosmid-Klons (407D8, Genbank Hinterlegung #AC005570), das auf Chromosom 16p13.3 kartiert. Ein Zusammenbau einer kontinuierlichen Nukleinsäuresequenz aus den vorgeschlagenen Intron/Exon-Verbindungen, beschrieben in der Genbank-Hinterlegung #AC005570-Annotation, erzeugt eine Nukleinsäuresequenz, die kürzer und ebenfalls nicht-zusammenhängend und daher im wesentlichen verschieden von der Protease-EOS der vorliegenden Erfindung ist. Es ist daher wahrscheinlich, daß die in der Genbank-Hinterlegung #AC005570-Annotation beschriebenen Exons inkorrekt sind, da sie mit nicht-experimentellen Mitteln ermittelt wurden. Deshalb repräsentiert die Protease-EOS der vorliegenden Erfindung eine zuvor nicht-beschriebene Protease. Die Verwendung der zuvor nicht-beschriebenen Sequenz der vorliegenden Erfindung deutet darauf hin, daß Chromosom 16p13.3 die korrekte Position des Protease-EOS-Gens ist. Interessanterweise ist das Gen, das für Prostasin kodiert, auf Chromosom 16p11.2 lokalisiert worden (Yu et al. (1996), Genomics 32: 334–40) während mehrere Tryptase-Gene sogar innerhalb desselben genomischen Intervals des Chromosoms 16p13.3 in einem Cluster vorliegen (Pallaoro et al. (1999), J. Biol. Chem. 274: 3355–3362), und liegen deshalb mit dem Gen für Protease-EOS zusammen. Jüngere genetische Daten verknüpfen Determinanten einer Empfindlichkeit gegenüber Asthma mit Chromosom 16 in einigen Populationen (Daniels et al. (1996), Nature (London) 383: 247–253).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein in im wesentlichen reiner Form, das als ein Protease-EOS-Protein funktioniert, umfassend die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 7 dargestellt ist oder in 4 dargestellt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine DNA, die für diese Serin-Protease-EOS kodiert, die aus einer Eosinophil-Bibliothek identifiziert worden ist, die unter Verwendung von Poly-A-RNA konstruiert worden ist, welche aus vereinigten erkrankten Eosinophilen isoliert worden ist, welche von allergischen asthmatische Individuen erhalten worden sind. Die Protease-EOS, wie hierin verwendet, bezieht sich auf das Proteinprodukt, das spezifisch als eine Protease funktionieren kann, und umfaßt die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 aufgeführt ist. Bevorzugt hat die DNA-Sequenz, die für die Serin-Protease-EOS kodiert, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 8 aufgeführte Sequenz.
Die vollständige Aminosäuresequenz der Protease-EOS war zuvor nicht bekannt, noch war die vollständige Nukleotidsequenz, die für die Protease-EOS kodiert, bekannt. Dies ist die erste dokumentierte Klonierung eines DNA-Moleküls voller Länge, das für Protease-EOS kodiert. Basierend auf einer mRNA-Verteilung wird vorhergesagt, daß eine beschränkte Anzahl von Geweben und Zelltypen die beschriebene Protease enthalten wird. Vertebraten Zellen, die in der Lage sind, Protease-EOS zu erzeugen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Leukocyten, isoliert aus Blut. Andere Gewebetypen können menschliche Milz, Retina, Rückenmark und Ovar sein.
Andere Zellen und Zellinien können ebenso zur Verwendung zum Isolieren der Protease-EOS-cDNA nützlich sein. Eine Auswahl von geeigneten Zellen kann durch Screenen auf Protease-EOS-proteolytische Aktivität in konditionierten Zellmedien erfolgen. Zelltypen, die eine EOS-proteolytische Aktivitität in diesem Assay besitzen, können zur Isolierung der Protease-EOS-DNA oder mRNA geeignet sein.
Eine Vielzahl von Prozeduren, die auf dem Gebiet bekannt sind, kann zur molekularen Klonierung von Protease-EOS-DNA verwendet werden. Diese Verfahren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf direkte funktionale Expression von Protease-Genen nach der Konstruktion einer Protease-EOS-enthaltenden cDNA-Bibliothek in einem geeigneten Expressionsvektorsystem. Ein anderes Verfahren ist es, eine Protease-EOS enthaltende cDNA-Bibliothek, die in einem Bakteriophagen- oder Plasmid Shuttle-Vektor konstruiert worden ist, mit einer markierten Oligonukleotidsonde zu screenen, die anhand der Aminosäursequenz der Protase-EOS-DNA entworfen worden ist. Ein zusätzliches Verfahren besteht darin, eine Protease-EOS-enthaltende cDNA-Bibliothek, die in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Shuttle-Vektor konstruiert worden ist, mit einer partiellen cDNA zu screenen, die für das Proteasse-EOS-Protein kodiert. Diese partielle cDNA wird durch die spezifische Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation von Protease-EOS-DNA-Fragmenten durch den Entwurf von generierten Oligonukleotid-Primern anhand der Aminosäuresequenz des aufgereinigten Protease-EOS-Proteins erhalten. Exprimierte Sequenz-Tags (EST)s, die in Homologiesuchen von Nukleinsäuredatenbanken identifiziert worden sind (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10; Pearson and Lipman (1988), Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444–8), stehen ebenfalls zu diesem Zweck zur Verfügung. Diese besondere Protease ist ein Mitglied einer Multigen-Familie, enthaltend stark konservierte Reste und Motive. Daher ist ein cDNA-Bibliotheks-Screening unter verringerter Stringenz zum Identifizieren von verwandten, aber nicht-identischen homologen cDNAs möglich. Vor kurzem ist eine direkte PCR unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden von cDNA, revers transkribiert aus RNA eines gegebenen Zelltyps, ein fruchtbarer Ansatz gewesen, um neue verwandte interessierende cDNAs zu isolieren. Alternativ kann die cDNA-Sequenz voller Länge nach Publikation mittels spezifischer PCR-Amplifikation durch das Design von passenden Oligonukleotid-Primern erhalten werden, die die gesamte kodierende Sequenz flankieren.
Ein weiteres Verfahren ist es, RNA aus Protease-EOS-produzierenden Zellen zu isolieren und die RNA in Protein über ein in-vitro- oder ein in-vivo-Translationssystem zu translatieren. Die Translation der RNA in ein Protein wird zur Produktion von wenigstens einem Teil des Protease-EOS-Proteins führen, das beispielsweise anhand der immunologischen Reakivität mit einem Anti-Protease-EOS-Antikörper identifiziert werden kann. Sollte die gesamte katalytische Domäne translatiert werden, könnte die funktionelle protolytische Aktivität des EOS-Proteins begreiflicherweise verwendet werden, um RNA-Fraktionen zu identifizieren, die die Protease-EOS-mRNA enthalten. In diesem Verfahren können Pools von RNA, die aus Protease-EOS-produzierenden Zellen isoliert worden ist, auf die Anwesenheit einer RNA analysiert werden, die für wenigstens einen Teil des EOS-Proteins kodiert. Eine weitere Fraktionierung des RNA-Pool kann durchgeführt werden, um die Protease-EOS-RNA von Nicht-Protease-EOS-RNA aufzureinigen. Das mit diesem Verfahren erzeugte Peptid oder Protein kann analysiert werden, um Aminosäuresequenzen bereitzustellen, die wiederum verwendet werden können, um Primer für die Produktion von Protease-EOS cDNA zu liefern. In ähnlicher Weise kann RNA, die für die Translation verwendet wird, analysiert werden, um Nukleotidsequenzen zu liefern, und kann verwendet werden, um Sonden für die Produktion der Protease-EOS-cDNA zu erzeugen. Dieses Verfahren ist auf dem Gebiet bekannt und kann z.B. gefunden werden in (Maniatis et al. (1989), 1–1626).
Es ist Fachleuten in leichter Weise offensichtlich, daß andere Typen von Bibliotheken, ebenso wie Bibliotheken, die aus anderen Zellen oder Zelltypen konstruiert worden sind, zum Isolieren von Protease-EOS kodierender DNA nützlich sein können. Anderen Typen von Bibliotheken schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf cDNA-Bibliotheken, die aus anderen Zellen, aus nicht-humanen Organismen stammen, und genomische DNA-Bibliotheken, die YAC (künstliche Hefechromosomen) enthalten, und Cosmid-Bibliotheken.
Es ist Fachleuten in leichter Weise offensichtlich, daß geeignete cDNA-Bibliotheken aus Zellen oder Zellinien hergestellt werden können, die EOS-proteolytische Aktivität haben. Die Selektion von Zellen oder Zellinien zur Verwendung beim Herstellen einer cDNA-Bibliothek zum Isolieren der Protease-EOS cDNA kann durchgeführt werden, indem man zunächst die Zell-assoziierte EOS-proteolytische Aktivität unter Verwendung der Messung von Protease-EOS-assoziierter biologischer Aktivität oder einer EOS-spezifischen immunologischen Reaktivität mißt.
Die Herstellung von cDNA-Bibliotheken kann mit Standardtechniken durchgeführt werden, die auf dem Gebiet bekannt sind. Gut bekannte cDNA-Bibliotheks-Konstruktionstechniken können z.B. gefunden werden in (Maniatis et al. (1989), 1–1626).
Es ist ebenfalls Fachleuten in leichter Weise ersichtlich, daß die DNA, die für Protease-EOS kodiert, aus einer geeigneten genomischen DNA-Bibliothek isoliert werden kann. Die Konstruktion von genomischen DNA-Bibliotheken kann mittels Standardtechniken durchgeführt werden, die auf dem Gebiet gut bekannt sind. Gut bekannte genomische DNA-Bibliothek-Konstruktionstechniken können gefunden werden in Manitatis et al, (1989), 1–1626).
Um das Protease-EOS-Gen mittels der obigen Verfahren zu klonieren, kann die Aminosäuresequenz von Protease-EOS notwendig sein. Um dies zu erreichen, kann das Protease-EOS-Protein aufgereinigt und die partielle Aminosäuresequenz mittels automatisierter Sequenzieren bestimmt werden. Es ist nicht notwendig, die vollständige Aminosäuresequenz zu bestimmen, sondern es wird die lineare Sequenz von 2 Regionen von 6 bis 8 Aminosäuren aus dem Protein zur Herstellung von Primern für die PCR-Amplifikaiton eines partiellen Protease-EOS-DNA-Fragments bestimmt. Alternativ kann eine längere degenerierte Oligonukleotidsonde mit einem größeren zusammenhängenden Abschnitt der bestimmten Aminosäuresequenz synthetisiert werden. Diese Oligonukleotidsonde kann markiert und zum Screenen einer geeigneten cDNA- oder genomischen Bibliothek markiert und verwendet werden, unter der passenden Stringenz, um die DNA zu isolieren, die der Protease-EOS entspricht.
Wenn geeignete Aminosäuresequenzen identifiziert worden sind, werden die DNA-Sequenzen, die für sie kodieren können, synthetisiert. Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon verwendet werden, um für eine bestimmte Aminosäure zu kodieren, und deshalb kann die Aminosäuresequenz durch einen beliebigen eines Satzes von ähnlichen DNA-Oligonukleotiden kodiert werden. Nur ein Mitglied des Satzes wird mit der Protease-EOS-Sequenz identisch sein, wird aber in der Lage sein, an Protease-EOS-DNA zu hybridisieren, sogar in der Anwesenheit von DNA-Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen („mismat ches"). Die fehlgepaarten („mismatched") DNA-Oligonukleotide können immer noch in ausreichender Weise an die Protease-EOS-DNA hybridisieren, um die Identifizierung und Isolierung von Protease-EOS-kodierender DNA zu ermöglichen. DNA, die mit diesen Verfahren isoliert worden ist, kann verwendet werden, um auf DNA-Bibliotheken aus einer Vielzahl von Zelltypen, aus Invertebraten- und Vertebraten-Quellen, zu screenen und homologe Gene zu isolieren.
Aufgereinigte biologisch aktive Protease-EOS kann mehrere verschiedene physikalische Formen haben. Protease-EOS kann als ein naszierendes oder nicht-verarbeitetes Polypeptid voller Länge oder als partiell prozessierte Polypeptide oder Kombinationen von prozessierten Polypeptiden existieren. Das naszierende Protease-EOS-Polypeptid voller Länge kann posttranslational modifiziert werden mittels spezifischer proteolytischer Spaltungsereignisse, die zu der Bildung von Fragmenten des naszierenden Polypeptids voller Länge führen. Ein Fragment oder eine physikalische Assoziation von Fragmenten kann die volle biologische Aktivität haben, die mit Protease-EOS assoziiert ist, jedoch kann der Grad der Protease-EOS-Aktivität zwischen einzelnen Protease-EOS-Fragmenten und physisch assoziierten Protease-EOS-Peptid-Fragmenten variieren.
Die durch die hierin beschriebenen Verfahren erhaltene, klonierte Protease-EOS-DNA kann rekombinant exprimiert werden mittels molekularer Klonierung in einen Expressionsvektor, der einen geeigneten Promoter und andere passende regulatorische Transkriptionselemente enthält und in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen übertragen worden ist, um rekombantes Protease-EOS-Protein zu erzeugen. Techniken für solche Handhabungen sind vollständig beschrieben (Maniatis et al, (1989), 1–1626) und sind auf dem Gebiet gut bekannt.
Expressionsvektoren werden hierin definiert als DNA-Sequenzen, die für die Transkription von klonierten Kopien von Genen und die Translation ihrer mRNAs in einem geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können verwendet werden, um eukaryotische Gene in einer Vielzahl von Wirten zu exprimieren, wie etwa Bakterien, einschließlich E. Coli, blaugrünen Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen, einschließlich Hefezellen, und tierischen Zellen.
Spezifisch konstruierte Vektoren erlauben die Übertragung („Shuttling") von DNA zwischen Wirten, wie etwa Bakterien-Hefe- oder Bakterien-Tier-Zellen oder Bakterien-Pilz-Zellen oder Bakterien-Wirbellose-Zellen. Ein geeignet konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsursprung zur autonomen Replikation in Wirtszellen, selektierbare Marker, eine beschränkte Anzahl von nützlichen Restriktionsenzymstellen, ein Potential für eine hohe Kopienzahl und aktive Promoter. Ein Promoter ist als eine DNA-Sequenz definiert, die RNA-Polymerase dahingehend steuert, daß sie DNA bindet und die RNA-Synthese initiiert. Ein starker Promoter ist einer, der bewirkt, daß mRNAs in hoher Frequenz initiiert werden. Expressionsvektoren können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf Kloniervektoren, modifizierte Kloniervektoren, spezifisch konstruierte Plasmide oder Viren.
Eine Vielzahl von Säugetier-Expressionsvektoren können verwendet werden, um rekombinante Protease-EOS in Säugetierzellen zu exprimieren. Kommerziell erhältliche Säugetier-Expressionsvektoren, die für die rekombinante Proteinexpression geeignet sein können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf pCI Neo (Promega, Madison, WI, Madison WI), pMAMneo (Clontech, Palo Alto, CA), pcDNA3 (In Vitrogen, San Diego, CA), pMClneo (Stratagene, La Jolla, CA), pSG5 (Stratagene, La Jolla, CA), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1 (8-2)(ATCC37110), pdBPV-MMTneo (342-12)(ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), und IZD35 (ATCC 37565).
Eine Vielzahl von bakteriellen Expressionsvektoren kann verwendet werden, um rekombinante Protease-EOS in Bakterienzellen zu exprimieren. Kommerziell erhältliche bakterielle Expressionsvektoren, die für die rekombinante Proteinexpression geeignet sein können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf pET-Vektoren (Novagen, Inc., Madison WI) und pQE-Vektoren (Qiagen, Valencia, CA) pGEX (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ).
Eine Vielzahl von Pilzzell-Expressionsvektoren kann verwendet werden, um rekombinante Protease-EOS in Pilzzellen, wie etwa Hefe, zu exprimieren. Kommerziell erhältliche Pilzzell-Expressionsvektoren, die für eine rekombinante Protease-EOS-Expression geeignet sein können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf pYES2 (In Vitrogen, San Diego, CA) und Pichia-Expressionsvektor (InVitrogen, San Diego, CA).
Eine Vielzahl von Insektenzell-Expressionssystemen kann verwendet werden, um rekombinante Protease-EOS in Insektenzellen zu exprimieren. Kommerziell erhältliche Baculovirus-Transfer-Vektoren, die für die Erzeugung eines rekombinanten Baculovirus zur rekombinan ten Proteinexpression in Sf9-Zellen geeignet sein können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf pFastBac1 (Life Technologies, Gaithersberg, MD) pAcSG2 (Pharmingen, San Diego, CA) pBlueBacII (In Vitrogen, San Diego, CA). Zusätzlich steht auch eine Klasse von Insektenzell-Vektoren zur Verfügung, die die Expression von rekombinanten Proteinen in Drosophila Schneider-Linie 2 (S2)-Zellen erlauben (In Vitrogen, San Diego, CA).
DNA, die für die Protease-EOS kodiert, kann in einen Expressionsvektor zur Expression in einer rekombinanten Wirtszelle subkloniert werden. Rekombinante Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Bakterien, wie etwa E. coli, Pilzzellen, wie etwa Hefe, Säugetierzellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Zellinien von humanem, bovinem, Schweine-, Affen- und Nagetierursprung, und Insektenzellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Drosophila S2 (ATCC CRL-1963) und Seidenraupe Sf9(ATCC CRL-1711), -abgeleitete Zellinien. Zellinien, die aus Säugetierspezies stammen, die geeignet sein können und die kommerziell zur Verfügung stehen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), L-Zellen und HEK-293 (ATCC CRL 1573).
Der Expressionsvektor kann in Wirtszellen mit einer aus einer Anzahl von Techniken eingeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Transformation, Transfektion, Protoplastenfusion, Lipofektion und Elektroporation. Die Expressionsvektor-enthaltenden Zellen werden klonal propagiert und einzeln analysiert, um zu bestimmen ob sie Protease-EOS-Protein erzeugen. Die Identifizierung von Protease-EOS-exprimierenden Wirtszellen-Klonen kann mit mehreren Mitteln durchgeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf immunologische Reaktivität mit Anti-Protease-EOS-Antikörpern, und der Anwesenheit von Wirtszell-assoziierter EOS-proteolytischer Aktivität.
Die Expression von Protease-EOS-DNA kann ebenso unter Verwendung von in-vitro-erzeugter synthetischer mRNA durchgeführt werden. Synthetische mRNA oder mRNA, die aus Protease-EOS produzierenden Zellen isoliert worden ist, kann effizient in verschiedene zellfreie Systeme translatiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Weizenkeimextrakte und Retikulocytenextrakte, ebenso wie in Zell-basierenden Systemen effizient trans latiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Mikroinjektion in Frosch-Oocyten, wobei die Mikroinjektion in Frosch-Oocyten im allgemeinen bevorzugt wird.
Um die Protease-EOS-DNA-Seuquenz(en) zu bestimmen, die optimale Konzentrationen an EOS-proteolytischer Aktivität und/oder EOS-Protein ergibt, können Protease-EOS-DNA-Moleküle einschließlich, aber nicht beschränkt auf die folgenden konstruiert werden: der offene Leserahmen voller Länge der Protease-EOS cDNA, kodierend für das 30-kDa-Protein von näherungsweise Base 69 bis näherungsweise Base 920 (diese Zahlen entsprechen dem ersten Nukleotid des ersten Methionins und dem letzten Nukleotid vor dem ersten Stopcodon; 1), und mehrere Konstrukte, die Teile der cDNA enthalten, die für die EOS-Protease kodieren. Alle Konstrukte können dahingehend konstruiert werden, daß sie kein, die gesamte oder Teile der 5'- oder der 3'-nicht-translatierten Region der Protease-EOS cDNA enthalten. Die Protease-EOS-Aktivität und die Niveaus der Proteinexpression können nach der Einführung, sowohl einzeln als auch in Kombination dieser Konstrukte für geeignete Wirtszellen bestimmt werden. Nach der Bestimmung der Protease-EOS-DNA-Cassette, die eine optimale Expression in transienten Assays ergibt, wird dieses Protease-EOS-DNA-Konstrukt in eine Vielzahl von Expressionsvektoren übertragen, zur Expression in Wirtszellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Säugetierzellen, Baculovirus-infizierten Insektenzellen, E. coli und die Hefe S. cerevisiae.
Wirtszell-Transfektanten und mikroinjizierte Oocyten können verwendet werden, um sowohl die Niveaus der Protease-EOS-protolytischen Aktivität als auch Niveaus des EOS-Proteins mit den folgenden Verfahren zu bestimmen. Im Falle von rekombinanten Wirtszellen beinhaltet dies die Co-Transfektion von einem oder möglicherweise zwei oder mehreren Plasmiden, enthaltend die Protease-EOS-DNA, die für ein oder mehrere Fragmente oder Untereinheiten kodiert. Im Falle von Oocyten beinhaltet dies die Co-Injektion von synthetischen RNAs, die für Protease-EOS kodieren. Nach einer geeigneten Zeitperiode, um die Expression zu ermöglichen, wird ein zelluläres Protein metabolisch mit beispielsweise ³⁵S-Methionin für 24 Stunden markiert, wonach die Zell-Lysate und Zellkulturüberstände geerntet und einer Immunfällung mit gegen das Protease-EOS-Protein gerichteten polyklonalen Antikörpern unterzogen werden.
Andere Verfahren zum Nachweis der Protease-EOS-Expression beinhalten die direkte Messung von EOS-proteolytischer Aktivität in ganzen Zellen, die mit Protease-EOS-cDNA trans fiziert worden sind, oder in Oocyten, denen Protease-EOS-mRNA injiziert worden ist. Die proteolytische Aktivität kann durch Analyse von konditionierten Medien oder Zell-Lysaten mittels Hydrolyse eines chromogenen oder fluorogenen Substrats gemessen werden. Im Falle von rekombinanten Wirtszellen, die Protease-EOS exprimieren, würden höhere Niveaus der Substrathydrolyse relativ zu schein-transfizierten Zellen oder Zellen beobachtet werden, die mit Expressionsvektor transfiziert worden sind, dem das Protease-EOS-DNA-Insert fehlt. Im Falle von Oocyten würden Lysate oder konditionierte Medien von denjenigen Oocyten, denen RNA, die für Protease-EOS kodiert injiziert worden ist, höhere Niveaus der Substrathydrolyse zeigen als diejenigen Oocyten, die mit einer irrelevanten RNA programmiert sind.
Andere Verfahren zum Nachweis von proteolytischer Aktivität schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die Messung der Produkte des proteolytischen Abbaus von radioaktiv markierten Proteinen (Coolican et al. (1986), J. Biol. Chem. 261: 4170–6), fluorometrische (Lonergan et al. (1995) J. Food Sci. 60: 72–3, 78; Twining (1984), Anal. Biochem. 143: 30–4) oder kolorimetrische Analysen von abgebauten Proteinsubstraten. Eine Zymographie nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Wadstroem and Smyth (1973), Sci Tools 20: 17–21) ebenso wie Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)-basierende Verfahren (Ng and Auld (1989), Anal. Biochem. 183: 50–6) sind ebenso Verfahren, die verwendet werden, um proteolytische Aktivität nachzuweisen.
Die Konzentration an Protease-EOS-Protein in Wirtszellen kann mittel Immunaffinität quantifiziert werden. Protease-EOS-spezifische-Affinitätskügelchen oder Protease-EOS spezifische Antikörper werden verwendet, um z.B. ³⁵S-Methionin-markiertes oder nicht-markiertes Protease-EOS-Protein zu isolieren. Markiertes Protease-EOS-Protein wird mittels SDS-PAGE isoliert. Nicht-markiertes Protease-EOS-Protein wird mittels Western-Blotting, ELISA- oder RIA-Assays nachgewiesen, die Protease-EOS-spezifische Antikörper verwenden.
Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon verwendet werden, um für eine bestimmte Aminosäure zu kodieren, und deshalb kann die Aminosäuresequenz durch einen aus einem Satz von ähnlichen DNA-Oligonukleotiden kodiert werden. Nur ein Mitglied des Satzes wird mit der Protease-EOS-Sequenz identisch sein, wird aber in der Lage sein, mit Protease-EOS-DNA sogar in der Anwesenheit von DNA-Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen unter geeigneten Bedingungen zu hybridisieren. Unter anderen Bedingungen können die fehlgepaarten DNA-Oligonukleotide immer noch an die Protease-EOS-DNA hybridisieren, um eine Identifizierung und Isolierung von Protease-EOS-kodierender DNA zu ermöglichen.
DNA-kodierende Protease-EOS von einem bestimmten Organismus kann verwendet werden, um Homologe der Protease-EOS-DNA von anderen Organismen zu isolieren und aufzureinigen. Um dies zu erreichen kann die erste Protease-EOS-DNA mit einer Probe unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen gemischt werden, die DNA-kodierende Homologe von Protease-EOS enthält. Der hybridisierte DNA-Komplex kann isoliert werden, und die DNA, die für die homologe DNA kodiert, kann davon aufgereinigt werden.
Es ist bekannt, daß es eine beträchtliche Menge an Redundanz in den verschiedenen Codons gibt, die für spezifische Aminosäuren kodieren. Deshalb ist diese Erfindung auch auf diejenigen DNA-Sequenzen gerichtet, die alternative Codons enthalten, die für die mögliche Translation der identischen Aminosäure kodiert. Für die Zwecke dieser Beschreibung wird eine Sequenz, die ein oder mehrere ersetzte Kodons trägt, als eine degenerierte Variation definiert werden. Ebenso im Umfang dieser Erfindung eingeschlossen sind Mutationen, entweder in der DNA-Sequenz oder dem translatierten Protein, die nicht wesentlich die ultimativen physischen Eigenschaften des exprimierten Proteins verändern. Zum Beispiel verursacht möglicherweise eine Substitution von Valin gegen Leucin, Arginin gegen Lysin oder Asparagin gegen Glutamin keine Veränderung hinsichtlich der Funktionalität des Polypeptids.
Es ist bekannt, daß DNA-Sequenzen, die für ein Peptid kodieren, verändert werden können, um für ein Peptid zu kodieren, das Eigenschaften hat, die gegenüber denjenigen des natürlich vorkommenden Peptids unterschiedlich sind. Verfahren zum Verändern der DNA-Sequenzen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf ortsgerichtete Mutagenese. Beispiele von veränderten Eigenschaften schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Veränderungen hinsichtlich der Affinität eines Enzyms für ein Substrat oder eines Rezeptors für einen Liganden.
Mehrere rekombinante Serin-Protease-Aufreinigungsprozeduren stehen zur Verfügung und sind zur Verwendung geeignet (Hansson et al. 1994). J. Biol. Chem. 269: 19420–6; Little et al. (1997). J. Biol. Chem. 272: 25135–25142: Takayama et al. (1997). J. Biol. Chem. 272: 21582–21588; Yamaoka et al. (1998). J. Biol. Chem. 273: 11895–11901). Wie oben für die Aufreinigung von Protease-EOS aus natürlichen Quellen beschrieben, kann rekombinante Protease-EOS aus Zelllysaten und Extrakten oder aus konditionierten Kulturmedium aufgereinigt wer den, mittels verschiedener Kombinationen von oder der einzelnen Anwendung einer Salzfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Größenauschlußchromatographie, Hydroxylapatitadsorbtionschromatographie und hydrophobe Wechselwirkungschromatographie. Nach einer Expression von Protease-EOS in einer rekombinanten Wirtszelle, wie im Falle für viele Mitglieder der S1-Serin-Protease-Familie, kann Protease-EOS-Protein als eine inaktive Zymogen-Vorläuferform erhalten werden, die eine limitierte Proteolyse erfordern kann, um proteolytisch aktiv zu werden.
Ein Hauptnachteil bei der Expression von Serin-Protease-cDNAs voller Länge für biochemische und enzymologische Analysen ist das überwiegende Potential zur Erzeugung von großen Mengen des inaktiven Zymogens. Diese Zymogen-Vorläufer haben oft wenig oder keine signifikante proteolytische Aktivität und müssen daher mit einem der beiden gegenwärtig verfügbaren Verfahren aktiviert werden. Ein Verfahren beruht auf der Autoaktivierung (Little et al. (1997). J. Biol. Chem. 272: 25135–25142), die in homogenen aufgereinigten Protease-Zubereitungen unter den korrekten Umständen auftreten kann. Forscher müssen diese Bedingungen genauestens ermitteln, die oft hohe Proteinkonzentrationen erfordern. Das zweite Verfahren ist die Verwendung einer aktivierenden Ersatzprotease, wie etwa Trypsin, um die zu erforschende Serinprotease zu spalten und die kontaminierende Protease nach der Aktivierung entweder zu inaktivieren (Takayama et al. (1997). J. Biol. Chem. 272: 21582–21588) oder physisch zu entfernen (Hansson et al. (1994). J. Biol. Chem. 269: 19420–6). In beiden Verfahren müssen jedoch die genauen Bedingungen empirisch etabliert werden und die Aktivierungsreaktionen sorgfältig überwacht werden, da eine inadäquate Aktivierung oder ein Überverdau, der zu Abbau und Probenverlust führt, immer mögliche Konsequenzen dieser Aktivierungstechniken sein könnten. Forscher, die die individuellen Mitglieder der S1-Serin-Proteasfamilie studieren, haben die Verwendung von Restriktionsproteinasen auf die Aktivierung von exprimierten Zymogenen in Bakterien (Wang et al. (1995). Biol. Chem. Hoppe-Seyler 376: 681–4) und Säugetierzellen (Yamashiro et al. (1997). Biochim. Biophys. Acta 1350: 11–14) ausgenutzt. In einem Bericht konstruierten die Autoren erfolgreich die Sekretion von proteolytisch-prozessiertem und aktiviertem murinem Granzym B, indem sie sich der endogenen Hefe-KEX2-Signalpeptidase in einem Pichia Pastoris-Expressionssystem bedienten (Pham et al. (1998). J. Biol. Chem. 273: 1629–1633). Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert ein Fusionsgen, umfassend Protease-EOS, die für eine Protease-EOS kodiert, die die Aktivierung der Protease erleichtert.
DNA-Klone, einschließlich Protease-EOS-DNA, werden identifiziert, die für Proteine kodieren, die bei Expression in einem rekombinanten Wirt Protein mit der Aminosäuresequenz von Protease-EOS erzeugen, welche eine proteolytische Aktivität besitzen kann oder nicht. Die Expression von Protease-EOS-DNA führt zur Rekonstituierung der Eigenschaften, die in Oocyten beobachtet werden, denen Protease-EOS kodierende Poly(A)⁺RNA injiziert worden ist.
Rekombinante Protease-EOS kann von anderen zellulären Proteinen durch Verwendung einer Immunaffinitätssäule getrennt werden, die mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gemacht worden ist, welche für naszierende Protease-EOS-Polypeptidfragmente voller Länge von Protease-EOS spezifisch sind.
Monospezifische Antikörper auf Protease-EOS werden aus Säugetier-Antiseren aufgereinigt, die Antikörper enthalten, die gegen Protease-EOS reaktiv sind, oder werden als monoklonale Antikörper, die mit Protease-EOS reaktiv sind, unter der Verwendung der Technik von (Kohler and Milstein (1976). Eur J Immunol 6: 511–9) hergestellt. Ein monospezifischer Antikörper, wie hierin verwendet, wird als eine einzelne Antikörperspezies oder multiple Antikörperspezies mit homogenen Bindungseigenschaften für Protease-EOS definiert. Eine homogene Bindung, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit der Antikörper-Spezies, an ein spezifisches Antigen oder Epitop zu binden, wie etwa diejenigen, die mit der Protease-EOS assoziiert sind, wie oben beschrieben. Protease-EOS-spezifische Antikörper werden durch Immunisieren von Tieren gezogen, wie etwa Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziegen, Pferden, oder ähnlichem, wobei Kaninchen bevorzugt sind, mit einer geeigneten Konzentration an Protease-EOS entweder mit oder ohne ein Immun-Adjuvans.
Ein Präimmun-Serum wird vor der ersten Immunisierung gesammelt. Jedes Tier erhält zwischen ungefähr 0,1 mg und ungefähr 1000 mg an Protease-EOS-Protein oder -Peptid(en), stammend von der abgeleiteten Protease-EOS-DNA-Sequenz oder möglicherweise durch den chemischen Abbau oder enzymatischen Verdau des Protease-EOS-Proteins selbst, assoziiert mit einem akzeptablen Immunadjuvans. Solche akzeptablen Adjuvantien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Freundsches vollständiges, Freund unvollständiges, Alaun-Niederschlag, Wasser-in-Öl-Emulsion, enthaltend Corynebacterium parvum und tRNA, oder Titermax (CytRx, Norcross, GA). Die anfängliche Immunisierung besteht aus Protease-EOS-Antigen in bevorzugt Freudschem vollständigem Adjuvans an mehreren Stellen, entweder subkutan (SC), intraperitoneal (IP) oder beides. Jedes Tier wird in regulären Intervallen bluten gelassen, bevorzugt wöchentlich, um den Antikörpertiter zu bestimmen. Die Tiere können Booster-Injektionen nach der anfänglichen Immunisierung erhalten oder nicht. Denjenigen Tieren, die Booster-Injektionen erhalten, wird im allgemeinen eine gleiche Menge des Antigens in Freundschem unvollständigem Adjuvans auf dem selben Weg gegeben. Booster-Injektionen werden in ungefähr dreiwöchigen Intervallen gegeben, bis maximale Titer erhalten werden. Ungefähr sieben Tage nach jeder Booster-Immunisierung oder ungefähr wöchentlich nach einer einzelnen Immunisierung läßt man die Tiere bluten, das Serum wird gesammelt, und die Aliquots werden bei ungefähr –20°C gelagert.
Monoklonale Antikörper (MoAb), die mit Protease-EOS reaktiv sind, werden hergestellt durch Immunisieren von Inzuchtmäusen, bevorzugt Balb/c, mit Protease-EOS-Protein oder -Peptid(en), die aus der abgeleiteten Protease-EOS-DNA-Sequenz oder vielleicht aus dem chemischen Abbau oder enzymatischen Verdau des Protease-EOS-Proteins selbst stammen. Die Mäuse werden über die IP- oder SC-Route mit ungefähr 0,1 mg bis ungefähr 10 mg, bevorzugt ungefähr 1 mg an Protease-EOS-Antigen in ungefähr 0,5 ml Puffer oder Kochsalzlösung, eingebaut in ein gleiches Volumen akzeptables Adjuvans, wie oben diskutiert, immunisiert. Freundsches vollständiges Adjuvans wird bevorzugt. Die Mäuse erhalten eine anfängliche Immunisierung am Tag 0 und werden für ungefähr 3 bis ungefähr 30 Wochen ruhen gelassen. Immunisierten Mäusen wird eine oder mehrere Booster-Immunisierungen von ungefähr 0,1–10 mg an Protease-EOS-Antigen in einer Pufferlösung, wie etwa Phosphatgepufferter Salzlösung über die intravenöse (IV)-Route gegeben. Lymphocyten von Antikörper-postiven Mäusen, bevorzugt Milzlymphozyten, werden erhalten durch Entfernen der Milzen aus immunisierten Mäusen mittels Standardprozeduren, die auf dem Gebiet gut bekannt sind. Hybridom-Zellen werden durch Mischen der Milz-Lymphocyten mit einem geeigneten Fusionspartner, bevorzugt Myeloma-Zellen, unter Bedingungen erzeugt, die die Bildung von stabilen Hybridomen erlauben. Fusionspartner können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf Mausmyelome P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 und Sp 2/0, wobei Sp 2/0 im allgemeinen bevorzugt wird. Die Antikörper-erzeugenden Zellen und Myelom-Zellen werden in Polyethylenglycol, ungefähr 1000 Mol.Gew., in Konzentrationen von ungefähr 30% bis ungefähr 50%, fusioniert. Fusionierte Hybridom-Zellen werden durch Wachstum in Hypoxanthin-, Thymidin- und Aminopterin-supplementiertem Dulbecco-modifiziertem Eagles Medium (DMEM) mittels auf dem Gebiet bekannten Prozeduren ausgewählt. Überstandflüssigkeiten werden aus wachstumspositiven Näpfen ungefähr an den Tagen 14, 18 und 21 gesammelt und werden auf Antikörperproduktion mittels eines Immun-Assay gescreent, wie etwa Festphasenimmunradio-Assay (SPIRA) unter Verwendung von Protease-EOS oder antigenischem (antigenischen) Peptid(en) als das Antigen. Die Kulturflüssigkeiten werden ebenso in dem Ouchterlony-Fällungsassay getestet, um den Isotyp des MoAb zu bestimmen. Hybridom-Zellen aus Antikörper-positiven Näpfen werden mittels einer Technik kloniert, wie etwa der Weichagartechnik von MacPherson, Weichagartechniken, in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, Eds., Academic Press, 1973.
Monoklonale Antikörper werden in vivo durch Injektion von erstmalig geprimten („pristane primed") Balb/c-Mäusen, näherungsweise 0,5 ml pro Maus, mit ungefähr 2 × 10⁶ bis ungefähr 6 × 10⁶ Hybridomzellen ungefähr 4 Tage nach dem Priming erzeugt. Ascites-Flüssigkeit wird näherungsweise 8–12 Tage nach der Zellübertragung gesammelt, und die monoklonalen Antikörper mit auf dem Gebiet bekannten Techniken aufgereinigt.
Die in-vitro-Produktion von Anti-Protease-EOS-MoAb wird durchgeführt durch Wachsenlassen des Hybridoms in DMEM, enthaltend ungefähr 2% fötales Kälberserum, um hinreichende Quantitäten des spezifischen MoAb zu erhalten. Die monoklonalen Antikörper werden mit auf dem Gebiet bekannten Techniken aufgereinigt.
Antikörper-Titer der Ascites oder Hybridom-Kulturflüssigkeiten werden mit verschiedenen serologischen oder immunologischen Assays bestimmt, die einschließen, aber nicht beschränkt sind auf Fällung, passive Agglutination, Enzym-verknüpfte immunsorbierende Antikörper-Technik (ELISA) und Radioimmunassay (RIA-)Techniken. Ähnliche Assays werden verwendet, um die Anwesenheit von Protease-EOS in Körperflüssigkeiten oder Gewebe und Zellextrakten nachzuweisen.
Es ist Fachleuten in leichter Weise offensichtlich, daß die oben beschriebenen Verfahren zum Erzeugen von monospezifischen Antikörpern verwendet werden können, um Antikörper zu erzeugen, die für Protease-EOS-Polypeptid-Fragmente oder naszierendes Protease-EOS-Polypeptid voller Länge spezifisch sind. Insbesondere ist es Fachleuten in leichter Weise offensichtlich, daß monospezifische Antikörper erzeugt werden können, die für nur ein oder mehrere Protease-EOS-Epitope spezifisch sind.
Protease-EOS-Antikörper-Affinitätssäulen werden durch Zugabe der Antikörper zu Affigel-10 (Bio-Rad) gemacht, einem Gel-Träger, der mit N-Hydroxysuccinimidestern aktiviert ist, so daß die Antikörper kovalente Bindungen mit dem Agarose-Gelkügelchen-Träger bilden. Die Antikörper werden dann an das Gel über Amid-Bindungen mit dem Spacer-Arm gekoppelt. Die verbleibenden aktivierten Ester werden dann mit 1 MEthanolamin-HCl (pH 8) gequencht. Die Säule wird mit Wasser gewaschen, gefolgt von 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6), um jeglichen nicht-konjugierten Antikörper oder unwesentliches Protein zu entfernen. Die Säule wird dann in Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,3) äquilibriert, und die Zellkulturüberstände oder Zellextrakte, enthaltend Protease-EOS, werden langsam durch die Säule passiert. Die Säule wird dann mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen, bis die optische Dichte (A₂₈₀) auf Hintergrundniveau fällt, dann wird das Protein mit 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6) eluiert. Das aufgereinigte Protease-EOS-Protein wird dann gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung dialysiert.
Protease-EOS-mRNA wird in Retina, Ovar und Magen exprimiert, wo das kodierte Protease-EOS-Protein wichtige Funktionen während der normalen Physiologie und möglicherweise in pathologischen Zuständen erfüllen kann. Daher könnten Modulatoren der Protease-EOS-Funktion verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die diese Gewebe betreffen. Wir haben ebenso gefunden, daß die Protease-EOS-mRNA in menschlichen Blutplättchen und der Milz, die eine Hauptstelle des Blutzellenstoffwechsels ist, ebenso wie in Leukocyten und genauer in Eosinophilen exprimiert wird. Eosinophilie ist eine Bedingung, die durch erhöhte zirkulierende Eosinophile gekennzeichnet ist, und ist mit zahlreichen allergischen Zuständen, einschließlich Bronchial-Asthma assoziiert (Gleich (1996). Allergol. Int. 45: 35–44). Daher legt die Protease-EOS-Expression in Blutplättchen und bestimmten Zellen des Immunsystems nahe, daß es Rollen bei der Hämostase und einer Teilmenge von Immunprozessen spielen kann. Modulatoren der Protease-EOS-Funktion könnten deshalb potentiell verwendet werden, um Krankheiten bei der Hämostase zu behandeln und/oder bestimmte Immunantworten zu moderieren. EOS wird in Makrophagen exprimiert, und diese Zellen spielen wichtige Rollen bei verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen, wie etwa Wundheilung, Arteriosklerose und Immun- und Entzündungsantworten.
Macrophagen- und nicht-spezifische (angeborene) Immunantwort: Die Gesamtfunktion des Immunsystems ist es, den Wirt vor jeglichem fremdem Material zu schützen, indem das Material als nicht-selbst erkannt wird und indem dieses Material eliminiert oder neutralisiert wird. Diese Gesamtfunktion wird durch zwei getrennte, jedoch miteinander in Wechselwirkung stehende Antworten des Immunsystems erzielt, nämlich die unspezifische (angeborene) und die spezifische (erworbene) Antwort. Die Makrophagen tragen hauptsächlich zu der unspezifischen Immunität bei und spielen eine wichtige Rolle in den sekundären Verteidigungslinien. Makrophagen stammen aus zirkulierenden Monocyten. Wenn sie zu einem Zielgewebe migrieren, wachsen Monocyten sehr stark und werden zu Gewebemakrophagen. Gewebemakrophagen sind im allgemeinen in Gebieten des Körpers vorhanden, die in leichter Weise infektiösen Agentien ausgesetzt werden. Sie schließen die Makrophagen in der Milz, die die fremden Materialien aus dem Blut und die gealterten roten Blutkörperchen entfernen, die Kupfer-Zellen in den Leber-Sinusoiden, die gegen Invasion durch Bakterien durch den Gastrointestinaltrakt schützen, Makrophagen in den Lymphknoten, die beim Zerstören von fremden Partikeln helfen, welche nicht in lokalen Geweben zerstört worden sind, und die Alveolar-Makrophagen ein, die gegen inhalierten Schmutz, wie etwa Feinstaub, Kohlenstoff und/oder Bakterien schützen.
Makrophagen und Wundheilung: Wenn die Haut zerrissen ist, wird eine temporäre Reparatur in der Form eines Gerinnsels erzielt, das den Defekt abdichtet, und in den darauf folgenden Tagen wird eine Sequenz von Schritten initiiert, um die Wunde zu regenerieren und zu heilen. Entzündungszellen (Neutrophile und Monocyten) und dann Fibroblasten und Kapillaren wandern in das Gerinnsel ein, um ein kontraktiles Granulationsgewebe zu bilden, das die Wundränder zusammenzieht. Monocyten aus dem Blut werden an Wundstellen über eine Vielzahl von chemotaktischen Signalen angezogen, die Makrophagen werden (Martin P, 1997). Die Makrophagen sind für eine effektive Wundheilung essentiell. Wenn die Makrophagen-Infiltration verhindert wird, dann ist die Heilung stark beeinträchtigt (Leibovich SJ and Ross R, 1975). Makrophagenaufgaben schließen Phagocytose von jeglichen verbleibenden pathogenen Organismen und andere Zell- und Matrix-Trümmer ein. Makrophagen setzen ebenfalls eine Batterie an Wachstumsfaktoren und Cytokinen an der Wundstelle frei und amplifizieren so die früheren Wundsignale, die durch degranulierende Blutplättchen und Neutrophile freigesetzt worden sind. Zahlreiche Wachstumsfaktoren werden von Makrophagen sezerniert, einschließlich TGF-α, TGF-β, HB-EGF, FGF1, 2 und 4, PDGF, VEGF. Makrophagen erzeugen ebenfalls viele Proteasen, die bei der Fibrin-Ablagerung und Kollagenbildung ebenso wie bei dem Umsatz der extrazellulären Matrix beteiligt sind. Alle diese Faktoren bewirken, daß relativ ansässige Zelllinien am Wundrand proliferieren und invasiv werden und dann eine neue Matrix in der Wundspalte ablegen. Die meisten Hautläsionen werden rasch und effizient innerhalb einer Woche oder zwei geheilt. Jedoch ist das Endprodukt weder ästhetisch noch funktionell perfekt. Epidermis-Anhängsel, die an der Schadstelle verloren worden sind, rege nerieren nicht, und wenn die Wunde abgeheilt ist, bleibt eine Bindegewebsnarbe, auf der die Kollagenmatrix in schlechter Weise rekonstruiert worden ist, in dichten parallelen Bündeln zurück.
Makrophagen und Arteriosklerose: Frühe arteriosklerotische Läsionen sind durch Lipidbeladene Zellen (Schaumzellen) charakterisiert, die hauptsächlich Makrophagen hinsichtlich ihres Ursprungs sind. Obwohl der Prozeß der Schaumzellbildung nicht klar ist, ist berichtet worden, daß ein chemisch modifiziertes LDL-Molekül, Acetyl-LDL, von Makrophagen durch den Fänger-Rezeptor („scavenger receptor") aufgenommen werden könnte, was zu einer Lipidakkumulation und Schaumzellentwicklung führt (Goldstein et al, 1979). Darüberhinaus kann das LDL, das durch die Endothelzellen modifiziert worden ist, aufgenommen und durch Makrophagen metabolisiert werden (Henriksen et al., 1981). Die aus Makrophagen freigesetzten Proteasen können beim Modifizieren des LDL oder in einer darauf folgenden Destabilisierung des Plaque in den späteren Stadien der Arteriosklerose beteiligt sein.
Kits, enthaltend Protease-EOS-DNA oder -RNA, Antikörper gegen Protease-EOS oder Protease-EOS-Protein, können hergestellt werden. Solche Kits werden verwendet, um DNA nachzuweisen, die an Protease-EOS-DNA hybridisiert, oder um die Anwesenheit von Protease-EOS-Protein oder Peptidfragmenten in einer Probe nachzuweisen. Eine solche Charakterisierung ist für eine Vielzahl von Zwecken nützlich, einschließlich, aber nicht beschränkt auf forensische Analysen, diagnostische Anwendungen und epidemiologische Studien.
Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls auf Verfahren zum Screenen auf Verbindungen gerichtet, die die Expression von DNA- oder RNA, die für Protease-EOS kodiert, ebenso wie die Funktion von Protease-EOS-Protein in vivo modulieren können. Verbindungen, die diese Aktivitäten modulieren, können DNA, RNA, Peptide, Proteine oder nicht-proteinartige organische Moleküle sein. Verbindungen können modulieren, indem sie die Expression von DNA oder RNA, die für Protease-EOS kodiert, oder die Funktion von Protease-EOS-Protein verstärken oder abschwächen. Verbindungen, die die Expression von DNA oder RNA, die für Protease-EOS kodiert, oder die Funktion von Protease-EOS-Protein modulieren, können mit einer Vielzahl von Assays nachgewiesen werden. Der Assay kann ein einfacher „ja/nein"-Assay sein, um zu bestimmen, ob es eine Veränderung hinsichtlich der Expression oder Funktion gibt. Der Assay kann quantitativ gemacht werden durch Vergleich der Expression oder Funktion einer Testprobe mit den Expressionsniveaus oder der Funktion in einer Standard probe. Modulatoren, die in diesem Verfahren identifiziert werden, sind potentiell als therapeutische Mittel nützlich. Verfahren zum Nachweis von Verbindungen, die Protease-EOS-proteolytische Aktivität modulieren, umfassen das Kombinieren einer Verbindung, Protease-EOS und eines geeigneten markierten Substrats und Überwachen eines Effekts der Verbindung auf die Protease durch Veränderungen hinsichtlich der Menge an Substrat als eine Funktion der Zeit. Markierte Substrate schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Substrate, die radioaktiv markiert sind (Coolican et al. (1986), J. Biol. Chem. 261: 4170–6), fluorometrische (Lonergan et al. (1995), J. Food Sci. 60: 72–3, 78; Twining (1984), Anal. Biochem. 143: 30–4) oder kolorimetrische (Buroker-Kilgore and Wang (1993), Anal. Biochem. 208: 387–92). Zymographie nach SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Wadstroem and Smyth (1973), Sci. Tools 20: 17–1), ebenso wie Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)-basierende Verfahren (Ng and Auld (1989), Anal. Biochem. 183: 50–6) sind ebenso Verfahren, die verwendet werden, um Verbindungen nachzuweisen, die die Protease-EOS-proteolytische Aktivität modulieren. Verbindungen, die Agonisten sind, werden die Rate des Substratabbaus verstärken und werden zu weniger verbleibendem Substrat als eine Funktion der Zeit führen. Verbindungen, die Antagonisten sind, werden die Rate des Substratabbaus verringern und werden zu mehr verbleibenden Substrat als eine Funktion der Zeit führen.
Nukleotidsequenzen, die zu der Protease-EOS-kodierenden DNA-Sequenz komplementär sind, können für eine Antisense-Therapie synthetisiert werden. Diese Antisense-Moleküle können DNA, stabile Derivate von DNA, wie etwa Phosphorthioate oder Methylphosphonate, RNA, stabile Derivate von RNA, wie etwa 2'-O-AlkylRNA, oder andere Protease-EOS-Antisense-Oligonukleotid-Mimetika sein. Protease-EOS-Antisense-Moleküle können in Zellen mittels Mikroinjektion, Liposomenverkapselung oder durch Expression aus Vektoren, die die Antisense-Sequenz enthalten, eingeführt werden. Protease-EOS-Antisense-Therapie kann besonders nützlich für die Behandlung von Krankheiten sein, bei denen es von Vorteil ist, die Protease-EOS-Expression oder -Aktivität zu verringern.
Protease-EOS-Gentherapie kann verwendet werden, um Protease-EOS in die Zellen von Zielorganismen einzuführen. Das Protease-EOS-Gen kann in virale Vektoren ligiert werden, die die Übertragung der Protease-EOS-DNA durch Infektion von Empfängerwirtszellen vermitteln. Geeignete virale Vektoren schließen Retrovirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpes-Virus, Vaccinia-Virus, Poliovirus und Ähnliche ein. Alternativ kann die Protease-EOS-DNA in Zellen zur Gentherapie mittels nicht-viraler Techniken übertragen werden, einschließlich Rezeptor-vermitteltem, gezieltem DNA-Transfer unter Verwendung von Ligand-DNA-Konjugaten oder Adenovirus-Ligand-DNA-Konjugaten, Lipofektion-Membranfusion oder direkte Mikroinjektion. Diese Prozeduren und Variationen davon sind für ex-vivo- ebenso wie in-vivo-Protease-EOS-Gentherapie geeignet. Protease-EOS-Gentherapie kann besonders für die Behandlung von Krankheiten nützlich sein, bei denen es von Vorteil ist, die Protease-EOS-Expression oder -Aktivität zu erhöhen.
Pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen, umfassend Protease-EOS-DNA, Protease-EOS-RNA oder Protease-EOS-Protein oder Modulatoren der Protease-EOS-Aktivität, können gemäß bekannten Verfahren formuliert werden, wie etwa mittels der Beimischung eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers. Beispiele für solche Träger und Verfahren zur Formulierung können in Remington's Pharmaceutical Sciences gefunden werden. Um eine pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung zu bilden, die für eine effektive Verabreichung geeignet ist, werden solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge des Proteins, DNA, RNA oder Modulator enthalten.
Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen der Erfindung werden an ein Individuum in Mengen verabreicht, die ausreichen, um Krankheiten zu behandeln oder zu diagnostizieren, bei denen eine Modulation der Protease-EOS-verwandten Aktivität angezeigt ist. Die effektive Menge kann gemäß einer Vielzahl von Faktoren variieren, wie etwa dem Zustand, dem Gewicht, dem Geschlecht und dem Alter des Individuums. Andere Faktoren schließen den Verabreichungsmodus ein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können an das Individuum über eine Vielzahl von Routen verabreicht werden, wie etwa subkutan, topisch, oral und intramuskulär.
Der Begriff „chemisches Derivat" beschreibt ein Molekül, das zusätzliche chemische Gruppen enthält, die nicht normalerweise ein Teil des Basismoleküls sind. Solche Gruppen können die Löslichkeit, die Halbwertszeit, die Absorption etc. des Basismoleküls verbessern. Alternativ können die Gruppen unerwünschte Nebenwirkungen des Basismoleküls abschwächen oder die Toxizität des Basismoleküls verringern. Beispiele für solche Gruppen werden in einer Vielzahl von Texten beschrieben, wie etwa Remington's Pharmaceutical Sciences.
Verbindungen, die gemäß den hierin offenbarten Verfahren identifiziert werden, können alleine in geeigneten Dosierungen verwendet werden, definiert durch Routine-Tests, um eine optimale Inhibition der Protease-EOS-Aktivität zu erhalten, während gleichzeitig jegliche potentielle Toxizität minimiert wird. Zusätzlich kann die Co-Verabreichung oder sequentielle Verabreichung von anderen Mitteln erwünscht sein.
Die Protease-EOS kann als ein aktiver Inhaltsstoff in nicht-pharmazeutischen kommerziellen Produkten formuliert werden, einschließlich Wasch-Detergenzien, Hautpflegelotionen oder Cremes. In diesen Formulierungen wird die Protease-EOS verwendet, um Proteine abzubauen, um die Wirksamkeit des Produktes zu erhöhen. Zum Beispiel würde in Wasch-Detergenz-Formulierungen der Einschluß der Protease-EOS als ein „Fleckentferner" fungieren, indem proteinartige Kontaminierungen aus dem Stoff abgebaut werden, so daß die organische Verbindung in Detergenz und Wasser löslicher würde. Die Protease-EOS kann in Hauptpflegeprodukten eingebaut werden, um bei der Entschuppung, dem Prozeß der Eliminierung der oberflächlichen Schichten des Stratum corneum, zu helfen. Ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung der Protease-EOS in nicht-pharmazeutischen kommerziellen Formulierungen ist, daß es unwahrscheinlich ist, daß sie allergische Antworten in empfindlichen Individuen induziert, da die Protease-EOS humanen Ursprungs ist.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls die Aufgabe, geeignete topische, orale, systemische und parenterale pharmazeutische Formulierungen zur Verwendung bei den neuen Verfahren der Behandlung der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Die Zusammensetzungen, enthaltend Verbindungen oder Modulatoren, identifiziert gemäß dieser Erfindung als der aktive Inhaltsstoff, zur Verwendung bei der Modulation der Protease-EOS-Aktivität, kann in einer großen Vielzahl von therapeutischen Dosierungsformen in konventionellen Trägern zur Verabreichung verabreicht werden. Zum Beispiel können die Verbindungen oder Modulatoren in solchen oralen Dosierungsformen, wie etwa Tabletten, Kapseln (von denen jede zeitlich abgestimmte Freisetzungs- und verzögerte Freisetzungsformulierungen einschließt), Pillen, Pulvern, Granula, Elixieren, Tinkturen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Emulsionen, oder mittels Injektion verabreicht werden. In ähnlicher Weise können sie in intravenöser (sowohl Bolus als auch Infusion), interperitonealer, subkutaner, topischer mit oder ohne Verschluß, oder in intramuskulärer Form verabreicht werden, die alle Gebrauchsformen sind, die Fachleuten auf dem Gebiet der Pharmazie bekannt sind. Eine wirksame, aber nicht toxische Menge der erwünschten Verbindung kann als ein Protease-EOS modulierendes Agens verwendet werden.
Die tägliche Dosierung der Produkte kann über einen weiten Bereich von 0,01 bis 1000 mg pro Patient, pro Tag variiert werden. Zur oralen Verabreichung werden die Zusammensetzungen bevorzugt in der Form von bewerteten oder nicht-bewerteten Tabletten bereitgestellt, enthaltend 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0 und 50,0 mg des aktiven Inhaltsstoffes für die symptomatische Einstellung der Dosierung an den zu behandelnden Patienten. Eine wirksame Menge der Arznei wird normalerweise in einer Dosierungskonzentration von ungefähr 0,0001 mg/kg bis ungefähr 100 mg/kg an Körpergewicht pro Tag verabreicht. Der Bereich ist insbesondere von ungefähr 0,001 mg/kg bis 10 mg/kg an Körpergewicht pro Tag. Die Dosierungen der Protease-EOS-Modulatoren werden eingestellt, wenn eine Kombination zum Erzielen der erwünschten Effekte erfolgt. Andererseits können die Dosierungen dieser verschiedenen Agentien unabhängig optimiert und kombiniert werden, um ein synergistisches Ergebnis zu erzielen, bei dem die Pathologie verringerter ist als sie wäre, wenn jedes der Mittel alleine verwendet würde.
Vorteilhafterweise können Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung in einer einzelnen täglichen Dosis verabreicht werden, oder die gesamte tägliche Dosis kann in geteilten Dosen von zwei, drei oder viermal täglich verabreicht werden. Darüberhinaus können Verbindungen oder Modulatoren für die vorliegende Erfindung in intranasaler Form über eine topische Verwendung geeigneter intranasaler Vehikel oder über Transdermal-Routen unter Verwendung derjenigen Formen der transdermalen Hautpflaster, die Fachleuten gut bekannt sind, verabreicht werden. Um in der Form eines transdermalen Abgabesystems verabreicht zu werden, wird die Dosierungsverabreichung natürlich eher kontinuierlich als intermittierend während des gesamten Dosierungsschemas sein.
Für Kombinationsbehandlungen mit mehr als einem aktiven Mittel, bei denen die aktiven Mittel in separaten Dosierungsformulierungen vorliegen, können die aktiven Mittel zusammen verabreicht werden, oder sie können in separat verschobenen Zeiten verabreicht werden.
Das Dosierungsschema, das die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung verwendet, wird in Übereinstimmung mit einer Vielzahl von Faktoren ausgewählt, einschließlich Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischem Zustand des Patienten, der Schwere des zu behandelnden Zustands, der Verabreichungsroute, der Nieren- und Leber-Funktion des Patienten, und der verwendeten individuellen Verbindung. Ein Arzt oder Tierarzt kann in leichter Weise die wirksame Menge der Arznei, die erforderlich ist, um das Fortschreiten des Zustands zu verhindern, zu bekämpfen oder aufzuhalten, bestimmen und verschreiben. Eine optimale Genauigkeit beim Erzielen der Konzentrationen der Arznei innerhalb des Bereichs, der eine Wirksamkeit ohne Toxizität ergibt, erfordert ein Schema, basierend auf der Kinetik der Verfügbarkeit der Arznei an den Zielstellen. Dies beinhaltet eine Berücksichtigung der Verteilung, des Gleichgewichts und der Eliminierung einer Arznei.
Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung können die Verbindungen oder Modulatoren, die hier im Detail beschrieben worden, den aktiven Inhaltsstoff bilden und werden typischerweise in Beimischung mit geeigneten pharmazeutischen Vedünnungsmitteln, Bindemitteln oder Trägern verabreicht (kollektiv hierin bezeichnet als „Träger"-Materialien), die in geeigneter Weise im Hinblick auf die beabsichtigte Verabreichungsform ausgewählt werden, d.h. orale Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirups und Ähnliches, und in Übereinstimmung mit herkömmlichen pharmazeutischen Praktiken.
Zum Beispiel kann zur oralen Verabreichung in der Form einer Tablette oder Kapsel der aktive Arzneibestandteil mit einem oralen, nicht-toxischen pharmazeutisch akzeptablen inerten Träger, wie etwa Ethanol, Glycerin, Wasser und Ähnlichem kombiniert werden. Darüberhinaus können, sofern gewünscht oder notwendig, geeignete Bindemittel, Schmiermittel, Zersetzungsmittel und Farbstoffe ebenfalls in die Mischung eingebaut werden. Geeignete Bindemittel schließen ein, ohne Beschränkung, Stärke, Gelatine, natürliche Zucker wie etwa Glukose oder beta-Lactose, Maissüßstoff, natürliche und synthetische Gummis, wie etwa Akaziengummi, Tragant oder Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglycol, Wachse und Ähnliches. Schmiermittel, die in diesen Dosierungsformen verwendet werden, schließen ein, ohne Beschränkung, Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid und Ähnliches. Zersetzungsmittel schließen ein, ohne Beschränkung, Stärke, Methylcellulose, Agar, Bentonit, Xanthan-Gummi und Ähnliches.
Für flüssige Formen kann der aktive Arzneibestandteil mit mit geeigneten Geschmacksstoffen versehenen Suspensions- oder Dispersionsmitteln kombiniert werden, wie etwa die synthetischen und natürlichen Gummis, z.B. Tragant, Akaziengummi, Methylcellulose und Ähnli ches. Andere Dispersionsmittel, die verwendet werden können, schließen Glycerin und Ähnliches ein. Für die parenterale Verabreichung sind sterile Suspensionen und Lösungen erwünscht. Isotonische Zubereitungen, die im allgemeinen geeignete Konservierungsmittel enthalten, werden verwendet, wenn eine intravenöse Verabreichung erwünscht ist.
Topische Zubereitungen, enthaltend den aktiven Arzneibestandteil, können mit einer Vielzahl von Trägermaterialien gemischt werden, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, wie etwa z.B. Alkohole, Aloe vera – Gel, Allantoin, Glycerin, Vitamin A- und E-Öle, Mineralöl, PPG2-Myristyl-Propionat und Ähnliches, um z.B. alkoholische Lösungen, topische Reiniger, Reinigungscremes, Hautgele, Hautlotionen und Shampoos in Creme- oder Gelformulierungen zu bilden.
Die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung können ebenso in der Form von Liposom-Abgabesystemen verabreicht werden, wie etwa unilamellaren Vesikeln, großen unilamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln. Liposomen können aus einer Vielzahl von Phospholipiden gebildet werden, wie etwa Cholesterol, Stearylamin oder Phosphatidylcholinen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ebenso mittels der Verwendung von monoklonalen Antikörpern als einzelnen Träger abgegeben werden, an die die Verbindungsmoleküle gekoppelt sind. Die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung können ebenso mit löslichen Polymeren als zielgerichtet einsetzbare Arzneiträger gekoppelt werden. Solche Polymere können Polyvinyl-Pyrrolidon, Pyran-Copolymer, Polyhydroxypropylmethacryl-amidphenol, Polyhydroxy-ethylaspartamidphenol oder Polyethyl-Enoxidpolylysin, substituiert mit Palmitoyl-Resten, einschließen. Darüberhinaus können die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung an eine Klasse von bioabbaubaren Polymeren gekoppelt sein, die beim Erzielen der kontrollierten Freisetzung einer Arznei nützlich sind, z.B. Polymilchsäure, Polyepsiloncaprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetal, Polydihydro-Pyrane, Polycyanoacrylate und quervernetzte oder amphipathische Block-Copolymere von Hydrogelen.
Für die orale Verabreichung können die Verbindungen oder Modulatoren in Kapsel-, Tabletten- oder Bolus-Form verabreicht werden, oder alternativ können sie in die Tiernahrung gemischt werden. Die Kapseln, Tabletten und Boli umfassen den aktiven Inhaltsstoff in Kombi nation mit einem geeigneten Trägervehikel, wie etwa Stärke, Talcum, Magnesiumstearat oder Di-Calciumphosphat. Diese Einheitsdosierungsformen werden durch inniges Mischen des aktiven Inhaltsstoffs mit geeigneten feingepulverten inerten Inhaltsstoffen hergestellt, einschließlich Verdünnungsmitteln, Füllstoffen, Zersetzungsmitteln und/oder Bindemitteln, so daß eine uniforme Mischung erhalten wird. Ein inerter Inhaltsstoff ist einer, der nicht mit den Verbindungen oder Modulatoren reagieren wird, und der gegenüber dem zu behandelnden Tier nicht toxisch ist. Geeignete inerte Inhaltsstoffe schließen Stärke, Lactose, Talcum, Magnesiumstearat, pflanzliche Gummi und Öle und Ähnliches ein. Diese Formulierungen können eine stark variable Menge der aktiven und inaktiven Inhaltsstoffe enthalten, abhängig von zahlreichen Faktoren, wie etwa der Größe und dem Typ der zu behandelnden tierischen Spezies und dem Typ und der Heftigkeit der Infektion. Der aktive Inhaltsstoff kann ebenso als ein Zusatzstoff zu der Nahrung verabreicht werden, durch einfaches Mischen der Verbindung mit der Nahrung oder durch Aufbringen der Verbindung auf die Oberfläche der Nahrung. Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff mit einem inerten Träger gemischt werden, und die resultierende Zusammensetzung kann dann entweder mit der Nahrung gemischt oder direkt an das Tier verfüttert werden. Geeignete inerte Träger schließen Maismehl, Zitrusmehl, Fermentationsrückstände, Soja-Schrot, getrocknete Körner und Ähnliches ein. Die aktiven Inhaltsstoffe werden intensiv mit diesen inerten Trägern durch Reiben, Rühren, Mahlen oder Taumeln gemischt, so daß die endgültige Zusammensetzung von 0,001 bis 5 Gew.-% des aktiven Inhaltsstoffs enthält.
Die Verbindungen oder Modulatoren können alternativ parenteral über eine Injektion einer Formulierung verabreicht werden, bestehend aus dem aktiven Inhaltsstoff, aufgelöst in einem inerten flüssigen Träger. Die Injektion kann entweder intramuskulär oder intraruminal, intratracheal oder subkutan sein. Die injizierbare Formulierung besteht aus dem aktiven Inhaltsstoff, gemischt mit einem geeigneten inerten flüssigen Träger. Akzeptable flüssige Träger schließen die pflanzlichen Öle, wie etwa Erdnußöl, Baumwollsamenöl, Sesamöl und Ähnliches, ebenso wie organische Lösungsmittel, wie etwa Solketal, Glycerinformal und Ähnliches ein. Als eine Alternative können ebenfalls wäßrige parenterale Formulierungen verwendet werden. Die pflanzlichen Öle sind die bevorzugten flüssigen Träger. Die Formulierungen werden hergestellt durch Auflösen oder Suspendieren des aktiven Inhaltsstoffes in dem flüssigen Träger, so daß die endgültige Formulierung 0,005 bis 10 Gew.-% des aktiven Inhaltsstoffs enthält.
Eine topische Anwendung der Verbindungen oder Modulatoren ist durch die Verwendung einer flüssigen Dusche oder eines Shampoos möglich, das die vorliegenden Verbindungen oder Modulatoren als eine wäßrige Lösung oder Suspension enthält. Diese Formulierungen enthalten im allgemeinen ein Suspendiermittel wie etwa Bentonit, und werden normalerweise ebenfalls ein Anti-Schaummittel enthalten. Formulierungen, enthaltend von 0,005 bis 10 Gew.-% des aktiven Inhaltsstoffs, sind akzeptabel. Bevorzugte Formulierungen sind diejenigen, von 0,01 bis 5 Gew.-% der vorliegenden Verbindungen oder Modulatoren enthalten.
Proteasen werden in nicht-natürlichen Umgebungen für verschiedene kommerzielle Zwecke verwendet, einschließlich Wasch-Detergenzien, Nahrungsverarbeitung, Textilverarbeitung und Hautpflegeprodukten. In Wasch-Detergenzien wird die Protease verwendet, um organische, schlecht lösliche Verbindungen in löslichere Formen zu zersetzen, die leichter in Detergens und Wasser aufgelöst werden können. In dieser Fähigkeit wirkt die Protease als ein „Fleckentferner". Beispiele für Textilverarbeitung schließen das Weichmachen von Fleisch und die Produktion von Käse ein. Proteasen werden bei der Nahrungsverarbeitung verwendet, z.B. um Wolle zu behandeln, um das Schrumpfen des Stoffs zu verhindern. Proteasen können in Hautpflegeprodukten eingeschlossen sein, um Schuppen auf der Hautoberfläche zu entfernen, die aufgrund einer Unausgeglichenheit in der Abschuppungsrate akkumulieren. Häufige Proteasen, die in einigen dieser Anwendungen verwendet werden, stammen aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, die in leichter Weise zur industriellen Herstellung ihrer Enzyme kultiviert werden können. Zum Beispiel ist eine häufige verwendete Spezies Bacillus, wie in US-Patent 5,217,878 beschrieben. Alternativ beschreibt US-Patent 5,278,062 Serinproteasen, die aus einem Pilz isoliert sind, Tritirachium album, zur Verwendung in Wasch-Detergenz-Zusammensetzungen. Leider ist die Verwendung einiger Proteasen aufgrund ihres Potentials für allergische Reaktionen in empfindlichen Individuen oder aufgrund ihrer reduzierten Wirksamkeit bei Verwendung in einer nicht-natürlichen Umgebung beschränkt. Es wird angenommen, daß Protease-Proteine, die aus nicht-humanen Quellen stammen, wahrscheinlicher eine Immunantwort in einem sensitiven Individuum induzieren. Wegen dieser Beschränkungen gibt es einen Bedarf für alternative Proteasen, die weniger immunogen für sensitive Individuen sind und/oder die eine effiziente proteolytische Aktivität in einer nicht-natürlichen Umgebung bieten. Die Ankunft von rekombinanter Technologie erlaubt die Expression von Proteinen einer jeglichen Spezies in einem Wirt, der zur industriellen Herstellung geeignet ist.
Zusammensetzungen können die Protease-EOS und einem akzeptablen Träger umfassen. Die Zusammensetzung kann eine Vielzahl von Zusammensetzungen sein, die einen Protease-Bestandteil erfordert. Besonders bevorzugt sind Zusammensetzungen, die in Kontakt mit Menschen kommen können, z.B. durch die Verwendung oder die Herstellung. Es wird geglaubt, daß die Verwendung der Protease-EOS der vorliegenden Erfindung die immunogene Antwort verringert oder eliminiert, die Benutzer und/oder Personen, die damit hantieren, ansonsten mit einer ähnlichen Zusammensetzung erfahren könnten, die eine bekannte Protease enthält, insbesondere eine Protease von nicht-humanem Ursprung. Bevorzugte Zusammensetzungen sind Hautpflegezusammensetzungen und Wasch-Detergenz-Zusammensetzungen.
Ein „akzeptabler Träger" schließt hierin ein, ist aber nicht beschränkt auf kosmetisch akzeptable Träger, pharmazeutisch akzeptable Träger und Träger, die zur Verwendung bei Reinigungszusammensetzungen akzeptabel sind.
Hautpflegezusammensetzungen
Hautpflegezusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen bevorzugt, zusätzlich zu der Protease-EOS, einen kosmetisch oder pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Hierin bedeutet „kosmetisch akzeptabler Träger" ein oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füll-Verdünnungsmittel oder verkapselnde Substanzen, die zur Verwendung beim Kontakt mit der Haut von Menschen und niederen Tieren ohne übermäßig Toxizität, Inkompatibilität, Instabilität, Irritation, allergische Antwort und Ähnliches geeignet sind, und einem vernünftigen Vorteil/Risiko-Verhältnis entsprechen.
„Pharmazeutisch akzeptabel" bedeutet hierin ein oder mehrere kompatible Arzneien, Medikamente oder inerte Inhaltsstoffe, die zur Verwendung in Kontakt mit dem Geweben von Menschen und niederen Tieren ohne übermäßige Toxizität, Inkompatibilität, Instabilität, Irritation, allergische Antwort und Ähnliches geeignet sind und einem vernünftigen Vorteil/Risiko-Verhältnis entsprechen.
Pharmazeutisch akzeptable Träger müssen natürlich von hinreichend hoher Reinheit und hinreichend niedriger Toxizität sein, um sie zur Verabreichung an das behandelte Säugetier geeignet zu machen.
„Kompatibel" bedeutet hierin, daß die Bestandteile der kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen in der Lage sind, mit der Protease-EOS und miteinander gemischt zu werden, auf eine solche Weise, daß es keine Wechselwirkung gibt, die die kosmetische oder pharmazeutische Wirksamkeit der Zusammensetzung unter normalen Verwendungssituationen wesentlich reduzieren würde.
Bevorzugt sind die Hautpflegezusammensetzungen der vorliegenden Erfindung topische Zusammensetzungen, d.h. sie werden topisch durch das direkte Beschichten oder Ausbreiten der Zusammensetzung auf der Haut aufgetragen. Bevorzugt umfassen solche topischen Zusammensetzungen einen kosmetisch oder pharmazeutisch akzeptablen topischen Träger.
Die topische Zusammensetzung kann zu einer großen Vielzahl von Produkttypen gemacht werden. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Lotionen, Cremes, Strandöle, Gels, Sticks, Sprays, Salben, Pasten, Muse („mousses") und Kosmetika, Haarpflegezusammensetzungen, wie etwa Shampoos und Conditioners (z.B. zum Behandeln/Verhindern von Schuppen), und Reinigungspflegezusammensetzungen. Diese Produkttypen können mehrere Carder-Systeme („carder systems") umfassen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Lösungen, Emulsionen, Gele und Feststoffe.
Bevorzugt ist der Träger ein kosmetisch oder pharmazeutisch akzeptables wäßriges oder organisches Lösungsmittel. Wasser ist ein bevorzugtes Lösungsmittel. Beispiele für geeignete organische Lösungsmittel schließen ein: Propylenglycol, Polyethylenglycol (200–600), Polypropylenglycol (425–2025), Propylenglycol-14-butylether, Glycerin, 1,2,4-Butanetriol, Sorbitolester, 1,2,6-Hexantriol, Ethanol, Isopropanol, Butandiol und Mischungen davon. Solche Lösungen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, enthalten bevorzugt von ungefähr 0,001% bis ungefähr 25%, bevorzugt von ungefähr 0,1% bis ungefähr 10%, und bevorzugter von ungefähr 0,5% bis ungefähr 5% der Protease-EOS; und bevorzugt von ungefähr 50% bis ungefähr 99,99%, bevorzugter von ungefähr 90% bis ungefähr 99% eines akzeptablen wäßrigen oder organischen Lösungsmittels.
Hautpflegezusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können weiterhin eine große Vielzahl von zusätzlichen öl-löslichen Materialien und/oder wasserlöslichen Materialien enthalten, die in topischen Zusammensetzungen herkömmlich verwendet werden, in den auf ih rem Gebiet festgelegten Konzentrationen. Solche zusätzlichen Bestandteile, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Verdickungsmittel, Pigmente, Duftstoffe, Feuchthaltemittel, Proteine und Polypeptide, Konservierungsmittel, Pacifiers, Penetrationsverstärkungsmittel, Collagen, Hyaluronsäure, Elastin, Hydrolysate, Primelöl, Jojobaöl, epidermaler Wachstumsfaktor, Sojabohnen-Saponine, Mucopolysaccharide, Vitamin A und Derivate davon, Vitamin B2, Biotin, Pantothensäure, Vitamin D und Mischungen davon.
Reinigugsgszusammensetzungen
Reinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen bevorzugt zusätzlich zu der Protease-EOS ein oberflächenaktives Mittel. Die Reinigungszusammensetzung kann in einer großen Vielfalt von Formen vorliegen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen, Geschirrspülzusammensetzungen und Wasch-Detergenz-Zusammensetzungen.
Bevorzugte Reinigungszusammensetzungen sind Wasch-Detergenz-Zusmmensetzungen. Solche Wasch-Detergenz-Zusammensetzungen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf granuläre, flüssige und blockförmige Zusammensetzungen. Bevorzugt umfaßt die Wasch-Detergenz-Zusammensetzung weiterhin einen Builder.
Die Wasch-Detergenz-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthält die Protease-EOS in einer Konzentration, die ausreicht, um eine „reinigungswirksame Menge" bereitzustellen. Der Begriff „reinigungswirksame Menge" bezieht sich auf jegliche Menge, die in der Lage ist, einen reinigenden, fleckentfernenden, schmutzentfernenden, weißmachenden, deodorierenden oder Frische-verbessernden Effekt auf Substrate zu erzeugen, wie etwa Textilien, Geschirr und Ähnliches. In praktischen Begriffen sind für gegenwärtige kommerzielle Zubereitungen typische Mengen bis zu ungefähr 5 mg pro Gewicht, typischerweise 0,01 mg bis 3 mg an aktivem Enzym pro Gramm der Detergenz-Zusammensetzung. Auf andere Weise ausgedrückt, die Wasch-Detergenz-Zusammensetzung hierin wird typischerweise 0,01 Gew.-% bis 5 Gew.-%, bevorzugt 0,001 Gew.-% – 3 Gew.-%, bevorzugter 0,001 Gew.-% bis 1 Gew.-% der rohen Protease-EOS-Zubereitung umfassen. „Rohe Protease-EOS-Zubereitung" bezieht sich hierin auf Zubereitungen oder Zusammensetzungen, in denen die Protease-EOS-enthalten ist, vor ihrer Zugabe zu der Wasch-Detergenz-Zusammensetzung. Bevorzugt liegt die Protease-EOS in solchen rohen Protease-EOS-Zubereitungen in Konzentrationen vor, die ausreichen, um 0,005 bis 0,1 Anson-Einheiten (AU) einer Aktivität pro Gramm der rohen Protease-EOS-Zubereitung zu liefern. Für bestimmte Detergenzien, wie etwa bei der automatischen Geschirrspülung, kann es wünschenswert sein, den Gehalt an aktiver-Protease-EOS der rohen Protease-EOS-Zubereitung zu erhöhen, um die Gesamtmenge an nicht-katalytisch aktiven Materialien zu minimieren und damit die Abdeckung/Benetzung oder andere Endresultate zu verbessern. Höhere aktive Konzentrationen können ebenfalls in hochkonzentrierten Detergenzformulierungen wünschenswert sein.
Bevorzugt können die Wasch-Detergenz-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die einschließlich, aber nicht auf flüssige Zusammensetzungen beschränkt sind, von ungefähr 0,001% bis ungefähr 10%, bevorzugt von ungefähr 0,005% bis ungefähr 8%, am bevorzugtesten von ungefähr 0,01% bis ungefähr 6% umfassen, bezogen auf das Gewicht eines Enzymstabilisierenden Systems. Das Enzym-stabilisierende System kann jegliches stabilisierende System sein, das mit der Protease-EOS kompatibel ist oder jegliche andere detersive Enzyme, die in der Zusammensetzung enthalten sein können. Ein solches System kann inhärent durch andere aktive Formulierungsinhaltsstoffe bereitgestellt werden oder kann separat hinzugegeben werden, z.B. durch den Formulierer oder Hersteller von Detergenz-fertigen Enzymen. Solche stabilisierenden Systeme können z.B. Calciumion, Borsäure, Propylenglycol, kurzkettige Carbonsäuren, Boronsäuren und Mischungen davon umfassen und sind darauf angelegt, verschiedene Stabilisierungsprobleme anzusprechen, abhängig vom Typ und der physikalischen Form der Detergenz-Zusammensetzung.
Die Detergenz-Zusammensetzung umfaßt ebenfalls ein detersives oberflächenaktives Mittel. Bevorzugt umfaßt die Detergenz-Zusammensetzung wenigstens ungefähr 0,01% eines detersiven oberflächenaktiven Mittels, bevorzugter wenigstens ungefähr 0,1%, bevorzugter wenigstens ungefähr 1%, noch bevorzugter von ungefähr 1% bis 55%.
Bevorzugte detersive oberflächenaktive Mittel sind kationisch, anionisch, nicht-ionisch, ampholytisch, zwitterionisch und Mischungen davon, die weiter unten hierin beschrieben werden. Nicht-beschränkende Beispiele für detersive oberflächenaktive Mittel, die in der Detergens-Zusammensetzung nützlich sind, schließen ein: Die herkömmlichen C11-C18-Alkyl-Benzolsulfonate („LAS") und die primären, verzweigtkettigen und statistischen („random") C10-C20 Alkylsulfate („AS"), die sekundären C10-C18 (2,3) Alkylsulfate der Formel CH₃(CH₂)x(CHOSO₃-M+)CH₃ und CH₃(CH₂)_y(CHOSO₃-M+)CH₂CH₃, wobei x und (y + 1) ganze Zahlen von wenigstens ungefähr 7, bevorzugt wenigstens ungefähr 9 sind, und M ein Wasser-löslichmachendes Kation ist, insbesondere Natrium, ungesättigte Sulfate wie etwa Oleyl-Sulfat, die C10-C18-Alkyl-Alkoxy-Sulfate („AExS", insbesondere EO 1–7 Ethoxysulfate), C10-C18-Alkyl-Alkoxy-Carboxylate (insbesondere die EO 1–5 Ethoxycarboxylate), die C10-18-Glycerolether, die C10-C18-Alkyl-Polyglycoside und ihre entsprechenden sulfatierten Polyglycoside, und C12-C18-alpha-sulfonierten Fettsäureester. Sofern erwünscht, können die herkömmlichen nicht-ionischen und amphoterischen oberflächenaktiven Mittel, wie etwa die C12-C18-Alkyl-Ethoxylate („AE"), einschließlich der sogenannten Alkylethoxylate mit enger Verteilung („narrow peaked") und der C6-C12-Alkylphenolalkoxylate (insbesondere Ethoxylate und gemischt Ethoxy/Propoxy), C12-C18-Betaine und Sulfobetaine („Sultaine"), C10-C18-Aminoxide und Ähnliches, in den Gesamtzusammensetzungen enthalten sein. Die C10-C18-N-Alkyl-Polyhydroxy-Fettsäureamide können ebenso verwendet werden. Typische Beispiele schließen die C12-C18-N-Methylglucamide ein. Siehe WO 9,206,154. Andere von Zucker abgeleitete oberflächenaktive Mittel schließen die N-Alkoxy-Polyhydroxy-Fettsäureamide, wie etwa C10-C18-N-(3-Methoxypropyl)-Glucamid ein. Die N-Propyl- bis N-Hexyl-C12-C18-Glucamide können für eine geringe Seifenlaugenbildung („low sudsing") verwendet werden. Herkömmliche C10-C20 Seifen können ebenso verwendet werden. Wenn eine starke Seifenlaugenbildung erwünscht ist, können die verzweigtkettigen C10-C16-Seifen verwendet werden. Mischungen von anionischen und nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln sind insbesondere nützlich. Andere herkömmliche nützliche oberflächenaktive Mittel sind in Standardlehrbüchern aufgelistet.
Detergenz-Builder sind ebenfalls in der Wasch-Detergenz-Zusammensetzung enthalten, um beim Kontrollieren der mineralischen Härte zu helfen. Anorganische wie organische Builder können verwendet werden. Builder werden typischerweise in Textil-Wasch-Zusammensetzungen verwendet, um bei der Entfernung von partikulärem Schmutz zu helfen.
Die Konzentration an Builder kann in breiter Weise variieren, abhängig von der endgültigen Verwendung der Zusammensetzung und ihrer erwünschten physikalischen Form. Die Zusammensetzungen werden typischerweise wenigstens ungefähr 1% Builder, sofern vorhanden, umfassen. Flüssige Formulierungen umfassen typischerweise von ungefähr 5% bis ungefähr 50%, typischer ungefähr 5% bis ungefähr 30%, bezogen auf das Gewicht, an Detergenz-Builder. Granuläre Formulierungen umfassen typischerweise von ungefähr 10% bis ungefähr 80%, typischer von ungefähr 15% bis ungefähr 50%, bezogen auf das Gewicht, an Detergenz- Builder. Niedrigere oder höhere Konzentrationen an Builder sollen jedoch nicht ausgeschlossen werden.
Anorganische oder P-enthaltende Detergenz-Builder schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die Alkalimetall-, Ammonium- und Alkanolammonium-Salze der Polyphosphate (beispielhaft veranschaulicht durch die Tripolyphosphate, Pyroposphate und polymeren Glas-Metaphosphate), Phosphonate, Phytinsäure, Silicate, Carbonate (einschließlich der Hydrogencarbonate und Sesquicarbonaten), Sulphate und Aluminosilicate. Jedoch sind in einigen Schauplätzen Nicht-Phosphat-Builder erforderlich. Wichtig, die Zusammensetzungen hierin funktionieren überraschend gut sogar in der Anwesenheit von sogenannten „schwachen" Buildern (im Vergleich mit Phosphaten), wie etwa Citrat, oder in der sogenannten „underbuilt"-Situation, die mit Zeolit- oder geschichteten Silicat-Buildern auftreten kann.
Beispiele für Silicat-Builder-Stoffe sind die Alkalimetall-Silicate, insbesondere diejenigen mit einem SiO2:Na2O-Verhältnis im Bereich 1,6:1 bis 3,2:1, und die geschichteten Silicate, wie etwa die geschichteten Natriumsilicate, beschrieben in US-Patent 4,664,839, erteilt am 12. Mai 1987 an H. P. Rieck. NaSKS-6 ist die Handelsmarke für kristallines geschichtetes Silicat vermarktet von Hoechst (häufig abgekürzt hierin als „SKS-6"). Anders als die Zeolit-Builder, enthält der NaSKS-6-Silikat-Builder kein Aluminium. NaSKS-6 hat die Delta-Na2SiO5-Morphologieform eines geschichteten Silicats. Es kann mit Verfahren hergestellt werden, wie diejenigen, die beschrieben sind in DE-A-3,417,649 und DE-A-3,742,043. SKS-6 ist ein stark bevorzugtes geschichtetes Silicat zur Verwendung hierin, aber andere geschichtete Silicate, wie etwa diejenigen mit der allgemeinen Formel NaMSixO2x + 1yH2O, wobei M Natrium- oder Wasserstoff ist, x eine Zahl von 1,9 bis 4, bevorzugt 2 ist, und y eine Zahl von 0 bis 20, bevorzugt 0 ist, können hierin verwendet werden. Verschiedene andere geschichtete Silicate von Hoechst schließen NaSKS-5, NaSKS-7 und NaSKS-11, als die Alpha-, Beta- und Gammaformen ein. Wie oben bemerkt ist die delta-Na2SiO5 (NaSKS-6-Form) am bevorzugtesten zur Verwendung hierin. Andere Silicate können ebenfalls nützlich sein, wie etwa z.B. Magnesiumsilicat, das als ein Kräuselungsmittel in granulären Formulierungen, als ein Stabilisierungsmittel für Sauerstoffbleichmittel und als ein Bestandteil von Kontrollsystemen für die Seifenlaugenbildung („suds control systems") dienen können.
Beispiele für Carbonat-Builder sind die Erdalkali- und Alkalimetallcarbonate, wie in der deutschen Patentanmeldung Nr. 2,321,001 offenbart, veröffentlicht am 15. November 1973.
Aluminosilicat-Builder sind in der vorliegenden Erfindung nützlich. Aluminosilicat-Builder sind von großer Wichtigkeit in den meisten gegenwärtig vermarkteten granulären Hochleistungs-Detergenz-Zusammensetzungen und können ebenfalls ein signifikanter Builder-Inhaltstoff in flüssigen Detergenz-Formulierungen sein. Aluminosilicat-Builder schließen diejenigen ein mit der empirischen Formel M₂(zAlO₂)_y-xH₂O wobei z und y ganze Zahlen von wenigstens 6 sind, das molare Verhältnis von z zu y im Bereich von 1,0 bis ungefähr 0,5 ist, und x eine ganze Zahl von ungefähr 15 bis ungefähr 264 ist.
Nützliche Aluminosilicat-Ionen-Austauschmaterialien sind kommerziell erhältlich. Diese Aluminosilicate können kristallin oder amorph in der Struktur sein und können natürlich vorkommende Aluminosilicate oder synthetische sein. Ein Verfahren zum Herstellen von Aluminosilicat-Ionenaustauschmaterialien wird in US-Patent 3,985,669, Krummel et al., erteilt am 12. Oktober 1976, offenbart. Bevorzugte synthetische kristalline Aluminosilicat-Ionenaustauschmaterialien, die hierin nützlich sind, sind erhältlich unter den Bezeichnungen Zeolite A, Zeolite P(b), Zeolite MAP und Zeolite X. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hat das kristalline Aminosilicat-Ionenaustauschmaterial die Formel: Na₁₂[(AlO₂)₁₂(SiO₂)₁₂]·xH₀O wobei x von ungefähr 20 bis ungefähr 30, insbesondere ungefähr 27 beträgt. Dieses Material ist bekannt als Zeolite A. Dehydrierte Zeolite (x = 0–10) können ebenfalls hierin verwendet werden. Bevorzugt hat das Aluminosilicat eine Partikelgröße von ungefähr 0,1–10 Mikron Durchmesser.
Organische Detergenz-Builder, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf eine große Vielzahl von Polycarboxylatverbindungen. Wie hierin verwendet, bezieht sich „Polycarboxylat" auf Verbindungen mit einer Vielzahl von Carboxylatgruppen, bevorzugt wenigstens drei Carboxylaten. Polycarboxylat-Builder können im allgemeinen zu der Zusammensetzung in Säureform zugegeben werden, können aber ebenfalls in der Form eines neutralisierten Salzes zugegeben werden. Bei Ver wendung in Salzform werden Alkalimetalle, wie etwa Natrium, Kalium und Lithium oder Alkanolammoniumsalze bevorzugt.
Enthalten in den Polycarboxylat-Buildern sind eine Vielzahl von Kategorien von nützlichen Materialien. Eine wichtige Kategorie der Polycarboxylat-Builder umfaßt die Etherpolycarboxylate, einschließlich Oxydisuccinat, wie in Berg offenbart, US-Patent 3,128,287, erteilt am 7. April 1964, und Lamberti et al., US-Patent 3,635,830, erteilt am 18. Januar 1972. Siehe ebenfalls die „TMSFTDS"-Builder von US-Patent 4,663,071, erteilt an Bush et al. am 5. Mai 1987. Geeignete Etherpolycarboxylate schließen ebenso zyklische Verbindungen ein, insbesondere alizyklische Verbindungen, wie etwa diejenigen, beschrieben in US-Patenten Nr. 3,923,679 an Rapko, erteilt am 2. Dezember 1975, 3,835,163 an Rapko, erteilt am 10. September 1974, 4,158,635 an Crutchfield et al., erteilt am 19. Juni 1979, 4,120,874 an Crutchfield et al., erteilt am 17. Oktober 1978, und 4,192,903 an Crutchfield et al., erteilt am 25. Juli 1978.
Andere nützliche Detergenz-Builder schließen die Etherhydroxypolycarboxylate, Copolymere von Maleinsäureanhydrid mit Ethylen oder Vinylmethylether, 1,3,5-Trihydroxybenzol-2,4,6-t6sulphonsäure und Carboxymethyloxybernsteinsäure, die verschiedenen Alkalimetall-, Ammonium- und substituierten Ammonium-Salze von Polyessigsäure, wie etwa Ethylendiamintetraessigsäure und Nitrilotriessigsäure, ebenso wie Polycarboxylate, wie etwa Mellitinsäure, Bernsteinsäure, Oxydibernsteinsäure, Polymaleinsäure, Benzol-1,3,5-Tricarbonsäure, Carboxymethyloxybernsteinsäure und lösliche Salze davon, ein.
Citrat-Builder, z.B. Zitronensäure und lösliche Salze davon (insbesondere Natriumsalz), sind Polycarboxylat-Builder von besonderer Wichtigkeit für flüssige Hochleistungs-Detergenz-Formulierungen aufgrund ihrer Verfügbarkeit aus erneuerbaren Quellen und ihrer Bio-Abbaubarkeit. Citrate können ebenfalls in granulären Zusammensetzungen, insbesondere in Kombination mit Zeolit- und/oder geschichteten Silicat-Buildern verwendet werden. Oxydisuccinate sind ebenfalls besonders nützlich in solchen Zusammensetzungen und Kombinationen.
Ebenso geeignet in den Detergenz-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind die 3,3-Dicarboxy-4-oxa-1,6-hexandioate und die verwandten Verbindungen, die in US-Patent 4,566,984 an Bush offenbart sind, erteilt am 28. Januar 1986. Nützliche Bernsteinsäure- Builder schließen die C5-C20-Alkyl- und -Alkenyl-Bernsteinsäuren und Salze davon ein. Eine besonders bevorzugte Verbindung dieses Typs ist Dodecenylbernsteinsäure. Spezifische Beispiele für Succinat-Builder schließen ein: (Laurylsuccinat, Myristylsuccinat, Palmitylsuccinat, 2-Dodecenylsuccinat (bevorzugt), 2-Pentadecenylsuccinat und Ähnliche. Laurylsuccinate sind die bevorzugten Builder dieser Gruppe und werden in Europäischer Patentanmeldung 200,263 an Barrat et al. beschrieben, veröffentlicht am 5. November 1986.
Andere geeignete Polycarboxylate werden in US-Patent 4,144,226, Crutchfield et al., erteilt am 13. März 1979 und US-Patent 3,308,067, Diehl, erteilt am 7. März 1967, offenbart. Siehe ebenfalls US-Patent 3,723,322 an Diehl, erteilt am 27. März 1973.
Fettsäuren, z.B. C12-C18-Monocarbonsäuren, können ebenfalls in die Zusammensetzungen allein oder in Kombination mit den vorgenannten Buildern eingebaut sein, insbesondere Citrat- und/oder den Succinat-Buildern, um zusätzliche Builder/Aktivität bereitzustellen. Eine solche Verwendungen von Fettsäuren wird im allgemeinen zu einer Verringerung der Seifenlaugenbildung („sudsing") führen, was berücksichtigt werden sollte von der Person, die die Formulierung macht.
In Situationen, in denen Phosphor-basierende Builder verwendet werden können und insbesondere bei der Formulierung von Stücken („bars"), die zu Waschschritten mit der Hand verwendet werden, können die verschiedenen Alkalimetallphosphate, wie etwa die gut bekannten Natrium-Tripolyphosphate, Natriumpyrophosphat und Natriumorthophosphat verwendet werden. Phosphonat-Builder, wie etwa Ethan-1-hydroxy-1,1-diphosphonat und andere bekannte Phosphonate (siehe z.B. US-Patente 3,159,581 an Diehl, erteilt am 1. Dezember 1964, 3,213,030 an Diehl, erteilt am 19. Oktober 1965, 3,400, 148 an Quimby, erteilt am 3. September 1968, 3,422,021 an Roy, erteilt am 14. Januar 1969 und 3,422,137 an Quimby, erteilt am 4. Januar 1969) können ebenfalls verwendet werden.
Zusätzliche Bestandteile, die in den Wasch-Detergenz-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf:
Alkoxylierte Polycarboxylate (um z.B. eine zusätzliche Fettfleckentfernungsleistung bereitzustellen), Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Bleichkatalysatoren, Aufheller, Cheliermittel, Tonerdeentferner/Mittel zur Verhinderung von erneuter Ablagerung („anti-redepostion agents"), Farbstoffübertragungs-Inhibitionsmittel, zusätzliche Enzyme (einschließlich Lipasen, Amylasen, Hydrolasen und anderen Proteasen), Textil-Weichspüler, polymere Schmutzfreisetzungsmittel, polymere Dispersionsmittel, und Seifenlaugen-Unterdrücker.
Die Zusammensetzungen hierin können darüber hinaus ein oder mehrere andere beigefügte Detergenz-Materialien oder andere Materialien enthalten zum Unterstützen oder Verbessern der Reinigungsleistung, der Behandlung des zu reinigenden Substrats, oder um die ästhetischen Eigenschaften der Detergenz-Zusammensetzung zu modifizieren (z.B. Parfüms, Färbemittel, Farbstoffe etc.). Nicht-beschränkende Beispiele für solche zusätzlichen Materialien schließen ein.
Die Detergenz-Zusammensetzungen hierin können weiterhin andere bekannte Detergenz-Reinigungsbestandteile umfassen, einschließlich alkoxylierten Polycarboxylaten, Bleichverbindungen, Aufhellern, Cheliermitteln, Tonerdeentferner/Mittel zur Verhinderung der erneuten Ablagerung, Farbstoffübertragungs-Inhibitionsmittel, Enzyme, Enzym-stabilisierende Systeme, Textil-Weichspüler, polymere Schmutzfreisetzungsmittel, polymere Dispersionsmittel, Seifenlaugen-Unterdrücker. Die Detergenz-Zusammensetzung kann ebenfalls andere Inhaltstoffe umfassen, einschließlich Trägern, Hydrotropen, Verarbeitungshilfen, Farbstoffen oder Pigmenten, Lösungsmitteln für Flüssigformulierungen, festen Füllstoffen für stückige Zusammensetzungen.
Verfahren zum Behandeln oder Verhindern von Hautschuppung
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zum Behandeln oder Verhindern von Hautschuppung verwendet werden. Das Verfahren umfaßt die topische Verabreichung einer sicheren und wirksamen Menge einer Zusammensetzung, umfassend die Protease-EOS.
Eine „sichere und wirksame" Menge bedeutet hierin eine Menge an Protease-EOS, die genügend hoch ist, um eine signifikante positive Modifizierung des zu behandelnden Zustands bereitzustellen, die aber niedrig genug ist, um nachteilige Nebenwirkungen zu vermeiden (bei einem vernünftigen Vorteil/Risiko-Verhältnis), innerhalb des Umfangs einer vernünftigen medizinischen Beurteilung. Eine sichere und wirksame Menge an Protease-EOS wird mit dem jeweiligen zu behandelnden Zustand, dem Alter und dem physischen Zustand des zu behan delnden Patienten, der Schwere des Zustands, der Dauer der Behandlung, der Natur der gerade verwendeten Therapie und ähnlichen Faktoren variieren.
Geeignete Zusammensetzungen zur Verwendung bei dem vorliegenden Verfahren schließen die oben beschriebenen Hautpflegezusammensetzungen, einschließlich Haarpflegemittelzusammensetzungen ein (z.B. Behandeln/Verhindern von Schuppen, die durch Hautschuppung verursacht werden).
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.
BEISPIEL 1
Plasmidbearbeitungen:
Alle molekular-biologischen Verfahren stimmten mit denjenigen überein, die zuvor beschrieben worden sind (Maniatis et al. (1989). 1–1626). Oligonucleotide wurden von Ransom Hill Biosciences (Ransom Hill, CA) gekauft, und alle Restriktionsendonucleasen und anderen DNA-modifizierenden Enzyme stammten von New England Biolabs (Beverly, MA), sofern nicht anderweitig spezifiziert. Das Protease-EOS-Expressionskonstrukt wurde in dem Baculovirus-Expressionsvektor pFastBac1 (Life Technologies, Gaithersberg, MD) hergestellt, wie unten beschrieben. Alle Konstrukt-Bearbeitungen wurden mittels zyklischer Sequenzierung mit Farbstoffterminatoren unter Verwendung des Fluoreszenzsequenzierers 377 von Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City, CA) bestätigt.
Erhalt von Protease-EOS-cDNA
Eosinophilen-RNA wurde aus vereinigten kranken Eosinophilen isoliert, die aus allergischen Asthma-Individuen erhalten worden waren. Eosinophile wurden unmittelbar nach dem Einsammeln und der Aufreinigung in einem Puffer, enthaltend Guandidinium-Isothiocyanat, lysiert. Das Lysat wurde durch CsCl zentrifugiert, um die Gesamt-RNA zu erhalten, gefolgt von einer Poly-A-Isolierung unter Verwendung von Oligotex-Latex-Kügelchen. Die cDNA-Synthese wurde unter Verwendung eines NotI-Oligo(dT)-Primer initiiert, und die doppelsträngige cDNA wurde stumpfendig gemacht, an SalI-Adaptoren ligiert, mit NotI verdaut, nach Größe ausgewählt und in die NotI- und Sal-I-Stellen des pSPORT1-Vektors einkloniert (Life Technologies, Gaithersberg, MD). Ein Klon, entsprechend der Protease-EOS-cDNA voller Länge, enthielt einen offenen Leserahmen von 855 Nukleotiden (1) und hatte Homologie mit anderen S1-Serinproteasen. Dieser Klon enthält wahrscheinlich die gesamte 3'-nicht-translatierte Region, da ein AATAAA-Motiv 18 Nukleotide stromauf von einem einem Poly-A-Abschnitt von 50 Nukleotiden liegt (in diesem bestimmten Klon, Daten werden nicht gezeigt), wovon eine Teilmenge in 1 dargestellt ist. Homologiesuchen der Genbank-Datenbank mit der Protease-EOS-cDNA deutete darauf hin, daß dies eine neue cDNA war, aber Identität mit dem humanen Cosmid-Klon (407D8, Genbank-Hinterlegung #AC005570) hatte, der auf Chromosom 16p13.3 kartiert, was auf die Position des Protease-EOS-Gens hinweist. Der abgeleitete offene Leserahmen kodiert für ein Präpro-EOS-Protein von 284 Aminosäuren (1), mit einer geschätzten molekularen Masse (M_r) von ungefähr 30 Kd und einer starken Homologie mit anderen Serinproteasen. Die Reste H, D und S der katalytischen Triade befinden sich an Positionen 77, 126 bzw. 231. Die Zymogen-Aktivierungssequenz MSSR-IVGG (Positionen 33–40) ist sehr ähnlich derjenigen von anderen S1-Serin-Proteasen und sagt ein reifes Protein von 284 Aminosäuren voraus. Ein Signalpeptid von 22 Aminosäuren wird mittels statistischer Verfahren vorhergesagt (Von Heijne (1986). Nucleic Acids Res. 14: 4683–90), was auf ein Pro-Peptid von 14 Aminosäuren hinweist. Eine FASTA-Homologie gegen die SWISS-PROT-Datenbank deutet darauf hin, daß die beste Paarung mit Protease-EOS der humane Prostasin-Vorläufer EC 3.4.21 SW: Q16651 ist (Yu et al. J. Biol. Chem. 270: 13483–9; Yu et al. (1996). Genomics 32: 334–40) (47.1%-Identität in 276 Aminosäurenüberlappung). Die nächste Paarung ist Hunde-Tryptase-Vorläufer EC 3.4.21.59 SW: P15944 (Vanderslice et al. (1989). Biochemsistry 28: 4148–55) (48.2%-Identität in 274 Aminosäurenüberlappung). Die nächste Paarung, die einem bekannten Protein entspricht, ist humaner Beta-Tryptase-Vorläufer, Tryptase 2 EC 3.4.21.59 SW: P20231 (Miller et al. (1990). J. Clin. Invest. 86: 864–700) (44.3%-Identität in 273 Aminosäurenüberlappung). Ein phylogenetischer Baum eines Alignment der abgeleiteten Protease-EOS-Aminosäuresequenz mit anderen Mitgliedern der S1-Serin-Protease-Familie wird in 2 gezeigt, wie bestimmt unter Verwendung des MegAlign 3.1.7-Programms (DNASTAR Inc., Madison, WI).
BEISPIEL 2
Gewebeverteilung der Protease-EOS-mRNA
Wir verwendeten eine hochempfindliche PCR-Profilierungstechnik, um die Gewebeverteilung von Protease-EOS-mRNA zu identifizieren. Für diese Anwendung wurden mehrere humane cDNA-Bibliotheken (alle waren von Clontech, (Palo Alto, CA) außer der CHRF-288 Megakaryocyten-Zelllinie und der Gel-filtrierten humanen Blutplättchenbibiliotheken, die wir unter Verwendung des ZAP-Express-cDNA-Systems konstruierten (Stratagene, La Jolla, CA). Die PCR-Primer für die Profilierungsanalyse waren wie folgt:
Kurz gesagt verwendeten die 50 μl PCR-Reaktionen 1 μl einer verdünnten Phagenstammlösung (~10⁸ bis 10¹⁰ pfu/ml) von jeder der getesteten cDNA-Bibliotheken. Die Reaktionen wurden anfänglich bei 94°C für 5 Minuten denaturiert und 35 Zyklen von 94°C für 20 Sekunden, 56°C für 20 Sekunden und dann 72°C für 30 Sekunden unterzogen, gefolgt von einer finalen 72°C-Elongation von 10 Minuten. Eine eingenistete Primer-Sonde der Sequenz
wurde unter Verwendung von Gamma ³²P-ATP und T4-Polynukleotidkinase (Life Technologies, Gaithersberg, MD) radioaktiv markiert, und nicht-eingebaute Markierung wurde entfernt nach der Reaktion unter Verwendung einer QIAquick-Nukleotidentfernungssäule (Qiagen, Valencia, CA). Die ³²P-endmarkierte eingenistete Primer-Sonde (1 × 10⁵cpm) wurde mit 10 μl einer jeden Probe nach der PCR-Reaktion kombiniert. Die PCR-Produkt-Sonden-Mischungen wurden bei 94°C für 5 Minuten denaturiert, bei 60°C für 15 Minuten hybridisiert und auf 4°C gekühlt. Die angelagerten („annealed") Proben (10 μl) wurden in 6%-Tris-Borat-EDTA-nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen (Novex) elektrophoresiert, getrocknet und einer Autoradiographie ausgesetzt. Ein PCR-Profil der cDNA-Bibliotheken, die in 3 mit Beta-Actin-PCR-Primern und markierter eingenisteter Primersonde verwendet wurden, erzeugte ein Beta-Actin-PCR-Produkt in allen untersuchten Proben.
Wie in 3 gesehen werden kann, ist die Verteilung der Protease-EOS-mRNA stark auf spezifische Gewebe und Zelltypen beschränkt. Die Gewebetypen, die das Protease-EOS-Transkript exprimieren, sind Retina, Ovar, und Milz, Magen und zu einem geringen Ausmaß Thymus, Uterus und Thalamus. Von besonderer Bedeutung ist, daß Protease-EOS-mRNA nicht in Pancreas, Leber, oder Prostata exprimiert ist, Gewebe, von denen normalerweise gefunden wird, daß sie zahlreiche Serin-Protease-Gene exprimieren. Es ist von Interesse, daß wir das Protease-EOS-PCR-Produkt in cDNA-Bibliotheken nachweisen, die aus Gelfiltrierten humanen Blutplättchen konstruiert worden sind. Dies legt in starker Weise nahe, daß Protease-EOS in humanen Blutplättchen exprimiert wird. Die Blutplättchen, die verwendet wurden, um die cDNA-Bibliothek zu konstruieren, welche in dem PCR-Gewebeprofil von 3 analysiert worden war, enthielten extrem geringe Konzentrationen an kontaminierenden Erythrocyten und andern Blutzellen (< 1 pro 10⁶ Blutplättchen), so daß wir nicht die Möglichkeit einer Leukocytenkontaminierung ausschließen können, die ein falsches positives Signal in diesem empfindlichen PCR-Assay erzeugen würde. Eine Zelllokalisierung durch In-situ-Hybridisierung oder empfindliche In-situ-PCR und eine Bestätigung mit Protease-EOS-spezifischen Antiseren könnte verwendet werden, um diesen Punkt zu behandeln.
BEISPIEL 3
Konstrukterzeugung für die Expression von aktiver Protease-EOS
Da Mitglieder der S1-Protease-Familie am häufigsten als inaktive Zymogen-Vorläufer synthetisiert werden und eine beschränkte Proteolyse erfordern, um proteolytisch aktiv zu werden, haben wir ein Zymogen-Aktivierungskonstrukt entwickelt, um die generische Aktivierung von heterologen Serin-Protease-cDNAs zu exprimieren und zu ermöglichen. Dieses Konstrukt weist eine bovine Präprolactin-Signalsequenz auf, die im Leserahmen mit dem MoAb M2-Anti-FLAG-Antikörperepitop fusioniert ist, wie zuvor beschrieben (Ishii et al. (1993). J. Biol. Chem. 268: 9780–6), für Sekretions- bzw. Antikörpernachweiszwecke (PF). Signifikanterweise enthält dieses Konstrukt auch die Enterokinase-Spaltstelle aus humanem Trypsinogen I (EK), fusioniert im Leserahmen und stromabwärts von der Signalsequenz. Am C-Terminus, vor einem Stop-Codon, sind zusätzliche Sequenzen, die für das Hämagglutinin (HA)-Epitop und 6 Histidin (6XHIS)-Codons zum Nachweis mit dem Anti-HA-Antikörper-MoAb 12 CA5 kodieren (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) bzw. zur Affinitätsaufreinigung auf Nickelharzen. Eine einzigartige Xba-I-Restriktionsenzymstelle, unmittelbar stromaufwärts von der Epitop/Affinitäts-Tag-Sequenz und stromabwärts von der PFEK-Präprosequenz, oben beschrieben, und ist der Punkt einer Insertion der katalytischen Domäne einer heterologen Serin-Protease-cDNA im Leserahmen (4). Der Zymogen-Aktivierungsvektor, der oben beschrieben ist, ist in ein modifiziertes pFastBac1-Transplacement-Plasmid einkloniert worden, um PFEK-HA6XHIS-TAG-FB zu erzeugen.
Die aufgereinigte Plasmid-DNA der Protease-EOS-cDNA voller Länge wurde als ein Templat in einer präparativen PCR-Reaktion von 100 μl unter Verwendung des Advantage-GC-cDNA-Polymerase-Mix (Clontech, Palo Alto, CA) in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Die verwendeten Primer
enthielten Xba-I-spaltbare Enden und waren so konstruiert, daß sie die katalytische Domäne der Protease-EOS flankierten und die Protease-EOS-Xba-I-katalytische Kassette erzeugten. Die präparative PCR-Reaktion wurde mit 18 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 68°C für 2,5 Minuten laufengelassen.
Das präparative PCR-Produkt wurde einmal Phenol/CHCl₃ (1:1)-extrahiert, CHCl₃-extrahiert und dann EtOH-gefällt mit Glycogen (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) und Träger. Das gefällte Pellet wurde mit 70% EtOH gewaschen, im Vakuum getrocknet und in 80 μl H₂O, 10 μl 10-Restriktionspuffer Nummer 2 und 1 μl 100 × BSA (New England Biolabs, Beverly, MA) resuspendiert. Da Produkt wurde für 3 h bei 37°C mit 200 Einheiten Xba-I-Restriktionsenzym verdaut (New England Biolabs, Beverly, MA). Das Xba-I-verdaute Produkt wurde einmal Phenol/CHCl₃ (1:1)-extrahiert, CHCl₃-extrahiert, EtOH-gefällt, mit 70% EtOH gewaschen und im Vakuum getrocknet. Für die Reinigung von kontaminierender Templat-Plasmid-DNA wurde das Produkt durch 1,0% niedrig schmelzender Agarose (Life Technologies, Gaithersberg, MD)-Gelen in TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH 8,3) elektrophoresiert und aus dem Gel ausgeschnitten. Ein Aliquot des ausgeschnittenen Produkts wurde dann für In-Gel-Ligationen mit dem Xba-I-verdauten, dephosphorylierten und Gel-aufgereinigten Zymogenaktivationsvektor, oben beschrieben, verwendet. Klone, die die EOS-Xba-Kassette enthielten, eingebaut in der korrekten Orientierung, um das Konstrukt PFEK-Protease-EOS-HA6XHIS-TAG 64 zu erzeugen, wurden mittels Sequenzanalysen bestätigt, um sicher zu sein, daß die richtige Translationsausrichtung in Bezug auf die NH2-terminale PFEK-Präpro-Sequenz und den C-terminalen HA6XHIS-Epitop/Affinitätstag beibehalten wurde.
BEISPIEL 4
Expression von rekombinanter Protease-EOS
Das rekombinante Bacmid, enthaltend das PFEK-Protease-EOS-HA6XHIS-Konstrukt, wurde aus einer bakteriellen Transformation, Selektion, Wachstum, Aufreinigung und PCR-Bestätigung in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Herstellers hergestellt. Kultivierte Sf9-Insektenzellen (ATCC CRL-1711) wurden mit aufgereinigter Bacmid-DNA transfiziert, und mehrere Tage später wurde konditioniertes Medium, enthaltend rekombinantes PFEK-EOS-HA6XHIS-Baculovirus, für eine Amplifikation des viralen Stamms gesammelt. Sf-9-Zellen, die in SF-900 II SFM in einer Dichte von 2 × 10⁶/ml wuchsen, wurden mit einer Infektionsmultiplizität von 2 bei 27°C für 80 Stunden infiziert, und Zellpellets wurden zur Aufreinigung von PFEK-EOS-HA6XHIS eingesammelt.
BEISPIEL 5
Aufreinigung und Aktivierung von rekombinanter Protease-EOS
Zellen wurden auf Eis in 20 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, Leupeptin (1 μg/ml) und Pepstatin (1 μg/ml) lysiert. Zelllysate wurden mit Anti-FLAG-M2-Affinitätsgel (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) gemischt und bei 4°C für 3 Stunden unter leichter Rotation gebunden. Das Zymogen-gebundene Harz wurde 3-mal mit TBS-Puffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl bei einem End-pH von 7,5) gewaschen und durch Wettbewerb mit FLAG-Peptid (100 μg/m) in TBS-Puffer eluiert. Das eluierte Zymogen wurde über Nacht gegen TBS in Spectra/Por-Membran (MWCO: 12 000–14 000) (Spectra Medical Industries, Inc., Huston, TX) dialysiert. Ni-NTA (150 μl eines 50% Schlamm/pro 100 μg Zymogen) (Qiagen, Valencia, CA) wurde zu 5 ml der dialysierten Probe zugegeben und durch Schütteln bei 4°C für 60 Minuten gemischt. Das Zymogen-gebundene Harz wurde 3-mal mit Waschpuffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl und 15 mM Imidazol] gewaschen, gefolgt von einer 1,5 ml-Waschung mit ds H₂O. Eine Zymogen-Spaltung wurde durch die Zugabe von Enterokinase (10 U pro 50 μg Zymogen) (Novagen, Inc., Madison WI; oder Sigma, St. Louis, MO) zu den Zymogen-gebundenen Ni-NTA-Kügelchen in einem kleinen Volumen bei Zimmertemperatur über Nacht unter leichtem Schütteln in einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl und 2,0 mM CaCl₂ durchgeführt. Das Harz wurde dann zweimal mit 1,5 ml Waschpuffer gewaschen. Die aktivierte Protease-EOS-HA6XHIS wurde mit Elutionspuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,8) 250 mM NaCl und 250 mM Imidazol] eluiert. Die Konzentration des eluierten Proteins wurde mittels eines Mikro-BCA-Kit (Pierce, Rockford, IL) unter Verwendung von bovinem Serumalbumin als einem Standard bestimmt. Die amidolytischen Aktivitäten der aktivierten Protease-EOS-HA6XHIS wurde durch Freisetzung von para-Nitroanilin (pNA) von den in 6 angezeigten synthetischen Substraten überwacht. Die chromogenen Substrate, die in diesen Studien verwendet wurden, waren alle kommerziell erhältlich (Bachem California Inc., Torrance, PA; American Diagnostica Inc., Greenwich, CT; Kabi Pharmacia Hepar Inc., Franklin, OH). Die Assay-Mischungen enthielten chromogene Substrate bei 500 μM und 10 nM Tris-HCl (pH 7,8), 25 mM NaCl und 25 mM Imidazol. Die Freisetzung von pNA wurde über 120 Minuten bei 37°C auf einem Microtiterplatten-Lesegerät (Molecular Devices, Menlo Park, CA) mit einem 405 nm-Absorptionsfilter gemessen. Die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten (V_max, mOD/min) wurden anhand von Auftragungen der Absorption gegen die Zeit unter Verwendung von Softmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA) bestimmt. Die spezifischen Aktivitäten (nmol pNA erzeugt/min/μg Protein) der aktivierten Protease-EOS-HA6XHIS für die verschiedenen Substrate werden in 6 dargestellt. Keine messbare chromogene amidolytische Aktivität wurde mit dem aufgereinigten, nicht-aktivierten PFEK-Protease-EOS-HA6XHIS-Zymogen nachgewiesen.
Elektrophorese und Western-Blot-Nachweis von rekombinanter Protease-EOS
Proben der aufgereinigten PFEK-Protease-EOS-HA6XHIS-Zymogen oder aktivierter Protease-EOS-HA6XHIS, denaturiert in der Anwesenheit von Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT), wurden mittels SDS-PAGE analysiert (Bio Rad, Hercules CA), gefärbt mit Coomassie-Brilliantblau. Für Western-Blots wurden die Gele auf Hybond-ECL-Membrane (Amersham, Arlington Heights, IL) elektrotransferiert. Das mit einem FLAG-Tag versehene PFEK-Protease-EOS-HA6XHIS-Zymogen, exprimiert aus infizierten Sf9-Zellen wurde mit Anti-FLAG-M2-Antikörper nachgewiesen (Eastman Kodak Co., New Haven, CT). Der sekundäre Antikörper war ein Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L) Meerrettichperoxidase-verknüpftes F(ab')2-Fragment (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) und wurde mit dem ECL-Kit nachgewiesen (Amersham, Arlington Heights, IL).
BEISPIEL 6
Chromogener Assay
Amidolytische Aktivitäten der aktivierten Serinproteasen werden anhand der Freisetzung von para-Nitroanilin (pNA) von synthetischen Substraten überwacht, die kommerziell erhältlich sind (Bachem California Inc., Torrance, PA; American Diagnostica Inc., Greenwich, CT; Kabi Pharmacia Hepar Inc., Franklin, OH). Die Assaymischungen enthalten chromogene Substrate in 500 μM und 10 mM TRIS-HCl (pH 7,8), 25 mM NaCl und 25 mM Imidazol. Die Freisetzung von pNA wird über 120 Min. bei 37°C auf einem Mikrotiterplatten-Lesegerät gemessen (Molecular Devices, Menlo Park, CA) mit einem 405 nm Absorptionsfilter. Die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten (V_max, mOD/min) werden anhand von Auftragungen der Absorption gegen die Zeit unter Verwendung von Softmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA) bestimmt. Verbindungen, die eine Serin-Protease der vorliegenden Erfindung modulieren, werden durch Screening auf die Beschleunigung oder, häufiger, die Inhibition der proteolytischen Aktivität identifiziert. Obwohl im vorliegenden Falle die chromogene Aktivität durch eine Zunahme in der Absorption überwacht wird, können fluorogene Assays oder andere Verfahren, wie etwa FRET, zum Messen der proteolytischen Aktivität, wie oben erwähnt, verwendet werden. Die Verbindungen werden in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst, wie etwa DMF, DMSO, Methanol, und in Wasser auf einen Konzentrationsbereich verdünnt, der normalerweise 100 μM nicht überschreitet, und werden typischerweise getestet bei einer Konzentration der 1000-fachen Konzentration der Protease, obwohl nicht hierauf beschränkt. Die Verbindungen werden dann mit der Protein-Stammlösung vor der Zugabe zu der Reaktionsmischung gemischt. Alternativ können die Protein- und Verbindungslösungen unabhängig zu der Reaktionsmischung zugegeben werden, wobei die Verbindung entweder vor oder unmittelbar nach der Zugabe des Protease-Proteins zugegeben werden.
BEISPIEL 7 – Nachweis des EOS-Proteins unter Verwendung von Antikörpern
Herstellung eines polyklonalen Antikörpers, der gegen EOS-Protein reaktiv ist:
Ein antigenes Peptid, bei dem die Aminosäuresequenz durch Nukleotide 334–372 des Protease-EOS-offenen Leserahmens kodiert wurde, wurde mit einem C-terminalen Cystein synthetisiert. Die Peptide wurden an Maleid-aktiviertes KLH (Pierce; Rockford, LL), gemäß den Anweisungen des Herstellers geknüpft. Nicht-verknüpftes Peptid wurde mittels Dialyse gegen PBS über Nacht entfernt. Polyklonale Kaninchen-Antikörper wurden im Anschluß an zwei separaten Tieren erzeugt. Das Antiserum wurde mittels Protein-A-Sepharose^TM-Affinitätssäule (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) aufgereinigt.
Western-Blot:
EOS-Protein wurde aus dem Insekten-Sf9-Expressionssystem aufgereinigt, wie zuvor beschrieben. Das Protein wurde mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgelöst und auf NitrocelluloseMembrane (Schleicher & Schnell) in Tris-Glycin-Methanol-Puffer übertragen. Die Membrane wurden in PBST (80 mM wasserfreies Dinatriumhydrogenorthophosphat, 20 mM Natriumdihydrogenorthophospat [pH 7,5] 100 mM NaCl, 0,05% Tween 20), enthaltend 5% fettfreie Trockenmilch, blockiert. Die Membrane wurden mit Immunserum inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Esel-Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase (HRP)-verknüpftem Sekundär-Antikörper und einem Nachweis mittels verstärkter Chemolumineszenz (ECL) (Amersham, Arlington Heights, IL). Das Protease-EOS-Protein wurde mittels polyklonalem Kaninchen-Antikörper, oben beschrieben, nachgewiesen.
Der monoklonale M2-Antikörper auf das FLAG-Epitop wurde von Sigma gekauft (St. Louis, MO).
Wie zuvor festgestellt, zeigt das PCR-Profil, daß Protease-EOS eher in bestimmten Geweben stark exprimiert wird, wie etwa peripheren Leukocyten, Milz, Thymus und Magen, statt überall. Um die Funktion und biologische Relevanz dieses Genprodukts besser zu verstehen, ist es wichtig, das subzelluläre Expressionsmuster dieses Proteins zu erforschen. Zu diesem Zweck haben wir einen polyklonalen Anti-EOS-Antikörper in Kaninchen unter Verwendung eines antigenen Peptids erzeugt, abgeleitet von der Protease-EOS-cDNA. Die Spezifität des Antikörpers, aufgereinigt mittels Affinitätssäulenaufreinigung, wurde mittels Western-Blot-Analyse getestet. Wie in 7B zu sehen, bindet der Antikörper spezifisch an halbaufgereinigtes EOS-Protein, aber nicht an eine andere verwandte S1-Serin-Protease, bezeichnet als Protease-H, die unter ähnlichen Bedingungen exprimiert wird. Die Bindung kann mit einem Prä-Immunserum oder dem Antikörper nicht nachgewiesen werden, der für das EOS-spezifische Peptid präabsorbierend ist, das verwendet wird, um diesen Antikörper zu erzeugen (7A und C). Da sowohl Protease-EOS als auch H so konstruiert waren, daß sie ein FLAG-Epitop enthielten, wurde die Membran mit dem Anti-FLAG-Antikörper sondiert, um gleiche Mengen an Protein-Beladung sicher zu stellen (7D).
Zellkultur:
Eine humane Monoblasten-Zelllinie U937 wurde von der American Type Culture Collection (Manassas, VA) erworben. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium in der Anwesenheit von 10% Hitze-inaktiviertem fötalem bovinem Serum (Life Technologies, Gaithersberg, MD), 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES-Puffer, 1,5 g/L Natrium-Hydrogencarbonat, 4,5 g/L Glukose, 1,0 mM Natriumpyruvat und Antibiotika (100 U Penicillin pro ml und 100 μg Streptomycin pro ml) wachsengelassen. Die Kulturen wurden in befeuchteter Luft mit 5% CO₂ bei 37°C inkubiert und zweimal pro Woche subkultiviert. Die U-937-Suspensionszellen wurden in 10% neutralem gepuffertem Formalin für 15 min. bei Zimmertemperatur (RT) fixiert, 3× in PBS gewaschen, auf die Objektträger mittels einer Cyto-Tek-Zentrifuge (Miles Scientific) zentrifugiert. Die Objektträger ließ man an der Luft bei Zimmertemperatur vor einer immuncytochemischen Färbung wenigstens über Nacht trocknen. Die Adhäsionszellen wurden auf den Kammerobjektträgern (Nalge Nunc International) wachsen gelassen, auf dieselbe Weise fixiert und bei 4°C bis zu Verwendung gelagert.
Immunhistochemie:
Die humanen vielfachen Gewebeblöcke wurden von DAKO Corporation (Carpenteria, CA) gekauft. Gewebeschnitte wurden deparaffinisiert, hydratisiert, in Target-Retrieval-Solution (DAKO; Carpenteria, CA) eingetaucht und 2× für 3 min. bei hoher Leistung in einem kommerziellen 800 W-Mikrowellenofen erhitzt. Nach Abkühlung der Objektträger wurde die endogene Peroxidase mit 3,0% H₂O₂ für 10 min. blockiert. Gewebeobjektträger wurden mit einem Avidin-Biotin-Blockiersystem gemäß den Anweisungen des Herstellers verarbeitet (Vector Labs; Burlingame, CA). Um den Hintergrund zu verringern, wurden die Objektträger dann mit normalem Blockierserum für 10 min. inkubiert (Vector Labs). Primäre Antikörper wurden auf Objektträger für 30 min. gebracht, gefolgt von biotinylierten Sekundär-Antikörpern, Ziege-anti-Kaninchen oder Pferd-anti-Maus für 30 min. (Vector Labs). Nach Spülen in Automationspuffer (Biomeda, Foster City, CA) wurde das Avidin-Biotin-HRP-Komplex-Reagenz (Vector Labs) für 30 min. zugegeben. Die Objektträger wurden dann gewaschen und mit dem Chromogen 3,3'-Diaminobenzidin (Biomeda; Foster City, CA) zweimal für 5 min. behandelt und in dH₂O gespült, in Maier'schem Hämatoxylin gegengefärbt, dehydratisiert und dann mit einem Deckgläschen versehen. Alle Reagenzinkubationen und Waschungen wurden bei Zimmertemperatur durchgeführt. Die automatischen Pufferwaschungen wurden zwischen den Schritten durchgeführt. Die immuncytochemische Färbung der Zellen wurde auf dieselbe Weise ausgeführt, mit der Ausnahme der H₂O₂, Avidin-Biotin-Blockierungsschritte. Negative Kontrollen beinhalteten den Ersatz des Primär-Antikörpers mit dem Antikörper-Verdünnungsmittel-Puffer (Zymed Laboratories; San Francisco, CA) und die Verwendung des prä-immunisierten Serum vom selben Tier oder des nicht-immunisierten Serums derselben Spezies. Eine Spezifität des Antikörpers für die neue Protease-EOS wurde bestätigt durch ein Vorinkubieren des Antikörpers mit seinem Antigen, das in einem 100-fachen molaren Überschuß gegenüber dem Antikörper war, über Nacht bei 4°C. Positive Kontrollen wurden unter Verwendung von bekannten zellulären Markern durchgeführt.
Immunfluoreszenz:
Die doppelte Immunfluoreszenzfärbung wurde sequentiell auf demselben Schnitt von mehreren Gewebeblöcken auf EOS und Makrophagen-Marker CD68 durchgeführt. Die Expression von EOS-Proteinen wurde mit polyklonalem EOS-Antikörper und Cy3-konjugiertem Schaf-anti-Kaninchen-Sekundär-Antikörper (Sigma, St Louis, MO) nachgewiesen. Die Expression von EOS-Protein wurde mit polyklonalem EOS-Antikörper und FITC-konjugiertem Schaf-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (z19) nachgewiesen. Der monoklonale anti-CD68-Antikörper (DAKO; Carpenteria, CA) und ein Texas-Rot-markierter Pferde-anti-Maus-Sekundärantikörper (Vector Labs) wurden zur Expression von CD68 verwendet. Die Antikörperinkubationsprozeduren sind die selben, wie oben beschrieben in dem Immunhistochemie abschnitt. Die Ojektträger wurden nach dem letzten Sekundärantikörper gewaschen und mit einem Deckgläschen mit Vectashield-Mounting-Medium versehen, enthaltend DAPI-Kern-Gegenfärbung (Vector Labs; Burlingame, CA).
Die Lokalisierung von EOS-Protein wurde mittels Immunhistochemie in mehreren Gewebeblöcken durchgeführt, enthaltend 60 verschiedene humane Gewebeproben, einschließlich Schilddrüse, Milz, Uterus, Prostata, Testis, Ovar, Pancreas, Lunge, Leber, Niere, Herz, Magen, Dünndarm, Dickdarm, Gehirn und Nebennierengewebe. Immungefärbte Zellen waren am auffälligsten in der Milz, der Lunge, dem Dünn- und Dickdarm. Die obere Tafel von 8 zeigt die Beispiele in Milz, Lunge und Colon. In der Milz waren die stark EOS-anfärbenden Zellen in dem gesamten roten Fleischparenchymgebiet verstreut und nahezu abwesend im weißen Fleisch. In der Lunge liegen die positiven Zellen entweder auf den Alveolarwandzellen oder sind frei im Alveolarraum. Einige von ihnen enthielten Material, das mittels Phagocytose aufgenommen worden war. Die positiven Zellen wurden in der Submucosa-Schicht des Colon beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde nur eine Hintergrundfärbung mit normalem Rattenserum und Prä-Immunserum beobachtet, beide wurden als negative Kontrollen verwendet.
BEISPIEL 8 – NACHWEIS VON EOS-mRNA IN ZELLEN
In situ Hybridisierung:
Ribo-RNA-Sonden-Zubereitung: Ein 450-bp-Fragment von der 3'-nicht-translatierten Region von EOS-cDNA wurde mittels PCR-Amplifikation gemacht. Die cDNA wurde in den Expressionsvektor pSPT-19 ligiert (Boehringer Mannheim). Das Plasmid wurde dann mit BamHI linearisiert und als ein Templat verwendet, um RNA zu transkribieren. Die Digoxigenin (DIG)-markierte Anti-Sense-Ribo-Sonde wurde in-vitro mit T7-RNA-Polymerase in der Anwesenheit von DIG-UTP synthetisiert, unter Verwendung des DIG-RNA-Markierungskit (Boehringer Mannheim). Die Spezifität der Ribo-Sonde wurde mit einem Dot-Blot gegen cDNA voller Länge identifiziert.
Hybridisierung: Die Multi-Gewebe-Objektträger wurden entwachst, hydratisiert und in 3% H₂O₂ für 10 Min. bei Zimmertemperatur gebracht. Die Objekträger wurden dann mit Pepsin-Lösung (Research Genetics, Huntsville, AL) für 10 Min. bei 37°C verdaut. Die Schnitte wurden sorgfältig gewaschen und dann in 100% Alkohol dehydratisiert, und für 5 Minuten in Luft getrocknet. Die EOS-Ribo-Sonde wurde auf 0,1 μg/ml in Hybridisierungspuffer verdünnt (Biomeda; Foster City, CA). 200 μl der Sondenlösung wurde auf jeden Objektträger gebracht und dann für 10 Min. bei 98°C erhitzt und bei 37°C für zwei Stunden inkubiert. Die Objektträger wurden dann sequenziell in eine Waschung niedriger (2 × SSC) und hoher (0,1 × SSC)-Stringenz bei Zimmertemperatur gebracht. Der Nachweis wurde durchgeführt durch Inkubieren der Objektträger mit Anti-Digoxigenin-alkalischer-Phosphatase-Fab-Fragmenten (Boehringer Mannheim) für 30 Min, gefolgt von einer alkalischen Phosphatase-Substrat-NBT/BCIP(Enzo Diagnostics, Inc; NY, NY)-Reaktion. Die Objektträger wurden dann mit Kern-Fast-Red-(Biomeda, Foster City, CA gegegefärbt, dehydratisiert und mit Permount aufgezogen (Sigma, St. Louis, MO).
Northern-Blot-Analyse:
Monoblasten-U-937-Zellen (5 × 10⁵/ml) wurden mit Phorbolester PMA (160 nM/ml) für 0, 2 bzw. 5 Tage behandelt. Gesamt-RNA-(30 μg), extrahiert mit TRIzol-Reagenz (Life Techno logies), wurde in 1% Agarose-Formaldehyd-Gele fraktioniert und auf Hybond^TM-N-Membrane übertragen (Amersham). Die Membranen wurden für 2 h bei 80°C unter Vakuum gebacken und UV-quervernetzt mit einem Stratalinker (Stratagene). PCR wurde verwendet, um eine Hybridisierungssonde für Protease-EOS zu erzeugen, während ein CD68-cDNA-Fragment mittels RT-PCR aus PMA-induzierten U937-Zellen erhalten wurde. Das Aktin-cDNA-Fragment wurde von Clontech erworben. Die Sonden wurden durch Zufallspriming mit Klenow-DNA-Polymerase in Anwesenheit von ³²P-markiertem α-dCTP erzeugt. Die Hybridisierung wurde in ExpressHyb^TM (Clontech) gemäß der Prozedur des Herstellers durchgeführt. Die Membranen wurden zweimal in 2 × SSC, 0,1% SDS bei Zimmertemperatur und zweimal in 1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C gewaschen, gefolgt von einer Autoradiographie.
Wir wiesen eine Protease-EOS-mRNA durch In-situ-Hybridisierung unter Verwendung der DIG-markierten cRNA-Ribosonde nach. Wir erhielten ein ähnliches Expressionsmuster im Vergleich mit Immunreaktivität unter Verwendung des Anti-EOS-Antikörpers, wie in 8 zu sehen (untere Tafel). Die positiven hybridisierten Zellen werden hellviolett sichtbar gemacht.
Die einzigartige Lokalisierung der immunreaktiven Zellen in den oben beschriebenen Geweben, zusammen mit der Untersuchung von immungefärbten Zellen bei großen Vergrößerungen, offenbarten, daß der überwiegende positive Zelltyp in diesen Geweben der Makrophage zu sein scheint. Die Makrophagen weisen einen Kidney-Bohnen-geformten Kern auf, der, in vielen Orientierungen innerhalb der Schnitte die Tendenz hat, wie zwei getrennte Kerne auszusehen. Zusätzlich haben die Makrophagen eine starke Phagocytosefähigkeit. In der Milz würde erwartet, daß diese phagocytotischen Makrophagen das aus roten Blutkörperchen stammende Material zu akkumulieren. In der Lunge sind diese Zellen extrem aktive Phagocyten und sind für das Säubern von Trümmern aus der Alveolar-Gasaustausch-Oberfläche verantwortlich. Innerhalb dieser Zellen war die Immunfärbung auf diskrete cytoplasmatische Körnchen lokalisiert.
Um die Expression von Protease-EOS in Makrophagen zu bestätigen, führten wir eine doppelte Immunfluoreszenzfärbung durch. Unter Verwendung des spezifischen Antikörpers gegen EOS und eines Antikörpers gegen den Makrophagen-spezifischen Marker CD68 waren wir in der Lage, die entsprechenden Signale an überlappenden Mengen von Makrophagen gemeinsam zu lokalisieren. Wie in 9 gesehen werden kann, waren die Zellen, die den Makrophagen-Marker-CD68 exprimierten, ebenso positiv im Hinblick auf eine EOS-Protein-Expression. Der Fluoreszenz-konjugierte Sekundärantikörper gegen den Anti-EOS-Primärantikörper wurde verwendet und färbte Zellen grün (linke Tafel), während der Texas-Red-konjugierte Antikörper gegen den Anti-CD68-Primärantikörper die Zellen rot färbte (rechte Tafel). Diese experimentellen Daten bestätigen, daß die Protease-EOS in Makrophagen exprimiert wird.
BEISPIEL 9
Protease-EOS wird durch Phorbolester
PMA in U937-Zellen hochreguliert.
Um weiter die funktionelle Verknüpfung zwischen EOS und Makrophagen-Aktivierung zu erforschen, überwachten wir die Korrelation zwischen der Differenzierung von Monoblasten zu aktiven Makrophagen und die Regulation des Protease-EOS-Gens. Humane Monoblasten-U937-Zellen wurden mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) behandelt. U937-Zellen, die normalerweise in Suspension wachsen und eine glatte Oberfläche zeigen, streckten Pseudopodien aus und hängten sich aneinander und an die Oberfläche der Kulturschale nach der Behandlung an. Wie mittels Immuncytochemie nachgewiesen, wurde der Makrophagen-Oberflächenmarker CD68 in nicht-stimulierten Zellen nicht exprimiert (10E). Jedoch färbten mehr als 90% der Zellen mit diesem Marker nach einer PMA-Stimulation (10F). In signifikanter Weise wurde eine dramatische Zunahme an Anti-Protease-EOS-immungefärbten Zellen (80%) in den Zellen erhalten, die mit PMA behandelt worden waren (10D). Darüberhinaus zeigten weniger als 5% der Zellen eine positive EOS-Färbung vor einer PMA-Behandlung (10C). Als Kontrolle färbten wir auch die Zellen für das „Haushalts"-Protein Vimentin. Sowohl unbehandelte als auch behandelte Zellen färbten mit Anti-Vimentin an (10A und B), was darauf hinweist, daß die nicht-behandelten U937-Zellen immun-reaktiv sind und somit in der Lage sind, von Antikörpern angefärbt zu werden.
Die Hochregulierung wurde ebenso auf dem RNA-Niveau mittels Northern-Blot-Analyse demonstriert, wie in 11 gesehen. Ohne PMA-Behandlung konnten am Tag 0 sowohl die neue Serin-Protease-EOS als auch der CD68-Makrophagen Marker nicht nachgewiesen werden. Die erhöhten Niveaus können zwei Tage nach der Behandlung mit PMA beobachtet werden. Eine weitere Zunahme sowohl an Protease-EOS als auch CD68-mRNA wurde nach fünf Tagen Behandlung beobachtet. β-Actin wurde als eine Normalisierung verwendet, um gleiche Probenbeladung zu zeigen. Zusammen legen diese Daten nahe, daß die neue Protease-EOS durch PMA und vermutlich nach Makrophagen-Aktivierung hochreguliert ist.
Zitierte Literaturangaben

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protein in im wesentlichen reiner Form, das als ein Protease-EOS-Protein funktioniert, umfassend die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 7 dargestellt ist oder die in 4 dargestellt ist.
Isoliertes und aufgereinigtes DNA-Molekül, das für das Protein nach Anspruch 1 kodiert.
Isoliertes und aufgereinigtes DNA-Molekül, umfassend die Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist oder die in 4 dargestellt ist, die für die Protease EOS kodiert.
Isoliertes und aufgereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 3, wobei das DNA-Molekül genomische DNA ist.
Expressionsvektor zur Expression von Protease-EOS-Protein in einem rekombinanten Wirt, wobei der Vektor ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 2–4 umfaßt.
Rekombinante Wirtszelle, enthaltend den Expressionsvektor nach Anspruch 5.
Monospezifischer Antikörper, der immunologisch an ein Protease-EOS-Protein nach Anspruch 1 bindet.
Antikörper nach Anspruch 7, wobei der Antikörper ein aufgereinigter monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 7, wobei der Antikörper aus Säugetier-Antiserum aufgereinigt ist.
Antikörper nach Anspruch 9, wobei das Säugetier-Antiserum aus Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziegen oder Pferden stammt.
Verfahren zur Expression von Protease-EOS-Protein in einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend: (a) Übertragen des Expressionsvektors nach Anspruch 5 in geeignete Wirtszellen; und (b) Kultivieren der Wirtszellen von Schritt (a) unter Bedingungen, die die Expression des Protease-EOS-Proteins von dem Expressionsvektor ermöglichen.
Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die Protease-EOS-Proteinaktivität modulieren, umfassend: (a) Kombinieren einer Testverbindung, eines Protease-EOS-Proteins nach Anspruch 1 und eines markiertes Substrats; und (b) Messen einer Veränderung in dem markierten Substrat.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das markierte Substrat ein fluorogenes, kolorimetrisches, radiometrisches oder Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer(FRET)-Substrat ist.
Kit, umfassend das DNA-Molekül nach Anspruch 2 oder Anspruch 3.
Kit, umfassend das Protease-EOS-Protein nach Anspruch 1.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Protease-EOS-Protein nach Anspruch 1.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die Zusammensetzung eine topische Hautpflegezusammensetzung ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Verwendung beim Behandeln, entweder prophylaktisch oder akut, einer nicht-ausgeglichenen Abschuppung.
Nicht-pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Protein nach Anspruch 1.
Nicht-pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei die Formulierung ein Waschmitteldetergenz, ein Shampoo, eine Zusammensetzung zum Säubern harter Oberflächen oder eine Geschirrspülzusammensetzung ist.