JP2003528625A - シグナル発生特性と、標識核酸に対する親和性を有する少なくとも１種類の基とを有する粒子の使用 - Google Patents
シグナル発生特性と、標識核酸に対する親和性を有する少なくとも１種類の基とを有する粒子の使用Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
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Abstract
(57)【要約】
表面に固定化された核酸とハイブリダイズさせた標識核酸を検出するための、シグナル発生特性と、標識核酸に対する親和性を有する少なくとも１種類の基とを有する粒子の使用。本発明のもう１つの主題は、標識核酸を検出するために、シグナル発生特性と、標識核酸に対する親和性を有する少なくとも１種類の基とを有する粒子を含む担体である。
Description
【０００１】
本発明の主題は、請求項１に記載の使用および請求項８に記載の担体である。
【０００２】
本発明は、互いに独立してハイブリダイズしておいた２種類以上の別々に標識
した核酸を、表面に固定化された核酸と結合させることを可能にし、かつ担体中
に取り込まれる、またはその上に提供される、異なるシグナル発生分子を用いて
それらを測定可能にする担体に関する。
した核酸を、表面に固定化された核酸と結合させることを可能にし、かつ担体中
に取り込まれる、またはその上に提供される、異なるシグナル発生分子を用いて
それらを測定可能にする担体に関する。
【０００３】
マイクロアレイ（異なるアドレス可能位置でその上に固定化された核酸を有す
る固体担体）は、ポリ核酸（polynucleic acid）の転写プロファイルの同時同定
および作製にますます使用されるようになっている。ここで、ハイブリダイゼー
ションでは、分析すべき核酸を、それらが後に同定可能および定量可能（放射能
、化学発光、蛍光等）なように修飾する。その修飾は、それ自体によりシグナル
を放出できる分子（直接標識）またはその次に標識される第２分子により認識さ
れる分子（非直接標識）のいずれかであることが可能である。高感度検出を除く
マイクロアレイの使用での問題は、前記担体上の分析すべき核酸を認識できる感
度および分析すべき核酸酸混合物の開始量が制限されることである。
る固体担体）は、ポリ核酸（polynucleic acid）の転写プロファイルの同時同定
および作製にますます使用されるようになっている。ここで、ハイブリダイゼー
ションでは、分析すべき核酸を、それらが後に同定可能および定量可能（放射能
、化学発光、蛍光等）なように修飾する。その修飾は、それ自体によりシグナル
を放出できる分子（直接標識）またはその次に標識される第２分子により認識さ
れる分子（非直接標識）のいずれかであることが可能である。高感度検出を除く
マイクロアレイの使用での問題は、前記担体上の分析すべき核酸を認識できる感
度および分析すべき核酸酸混合物の開始量が制限されることである。
【０００４】
現況技術に従って、この問題を解決する２つの可能性がある。第一に、マイク
ロアレイでそれをハイブリダイズする前に、利用可能な核酸を異なる方法（２種
類の方法にのみ言及すると、インビトロ（in vitro）転写におけるＴ７（エバー
ウィン（Eberwine）等）またはＰＣＲ）で増幅することを試みる。第二に、既に
ハイブリダイズし、かつ非直接標識および直接標識を用いて化学修飾しておいた
核酸をそれと併用して認識し、認識位置と併用して第２反応によって、例えば酵
素反応（主要語：サンドイッチ法、チラミン、ホースラディッシュペルオキシダ
ーゼ等）によって強いシグナルを発生させることを試みる。このアプローチの欠
点は、使用される酵素法では、増幅が非直線性となることが多いことである。つ
まり、既存の異なる核酸の量が、異なる手法で増幅される。しかしながら、核酸
の量は、マイクロアレイ分析により決定することになっているため、不均一な増
幅によって、完全な分析が疑問視される。さらに、酵素および非酵素増幅反応の
どちらも、多段階反応である場合が多く、非常に複雑である。
ロアレイでそれをハイブリダイズする前に、利用可能な核酸を異なる方法（２種
類の方法にのみ言及すると、インビトロ（in vitro）転写におけるＴ７（エバー
ウィン（Eberwine）等）またはＰＣＲ）で増幅することを試みる。第二に、既に
ハイブリダイズし、かつ非直接標識および直接標識を用いて化学修飾しておいた
核酸をそれと併用して認識し、認識位置と併用して第２反応によって、例えば酵
素反応（主要語：サンドイッチ法、チラミン、ホースラディッシュペルオキシダ
ーゼ等）によって強いシグナルを発生させることを試みる。このアプローチの欠
点は、使用される酵素法では、増幅が非直線性となることが多いことである。つ
まり、既存の異なる核酸の量が、異なる手法で増幅される。しかしながら、核酸
の量は、マイクロアレイ分析により決定することになっているため、不均一な増
幅によって、完全な分析が疑問視される。さらに、酵素および非酵素増幅反応の
どちらも、多段階反応である場合が多く、非常に複雑である。
【０００５】
本発明の目的は、上述の欠点を回避し、かつ核酸のさらに正確な定量を確実に
することである。
することである。
【０００６】
本発明に従って、記述した目的は、表面上に固定化した核酸とハイブリダイズ
した標識核酸を検出するために、シグナル発生特性と標識核酸に対して親和性と
を有する少なくとも１種類の基を有する、リポソームおよび／またはミセルから
なる群から選択される粒子を使用することによって達成される。
した標識核酸を検出するために、シグナル発生特性と標識核酸に対して親和性と
を有する少なくとも１種類の基を有する、リポソームおよび／またはミセルから
なる群から選択される粒子を使用することによって達成される。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態において、核酸は異なる標識を有する。これによっ
て、例えば、健康な組織と疾患のある組織との区別が可能となる。
て、例えば、健康な組織と疾患のある組織との区別が可能となる。
【０００８】
この粒子は、２０〜４０００nm、好ましくは２００〜４００ｎｍの粒径を有す
ることが好ましい。その粒子およびその粒子の製造については、シェッフォルド
（Scheffold）A, ミルテニー（Miltenyi）S, ラドブランチ（Radbruch）A,免疫
蛍光の感度増大のための磁気蛍光リポソーム（Magnetofluorescent liposomes f
or increased sensitivity of immunofluorescence）. イミノテクノロジー（Im
munotechnology） 1995; 1(2): 127 - 37に記述されている。
ることが好ましい。その粒子およびその粒子の製造については、シェッフォルド
（Scheffold）A, ミルテニー（Miltenyi）S, ラドブランチ（Radbruch）A,免疫
蛍光の感度増大のための磁気蛍光リポソーム（Magnetofluorescent liposomes f
or increased sensitivity of immunofluorescence）. イミノテクノロジー（Im
munotechnology） 1995; 1(2): 127 - 37に記述されている。
【０００９】
シグナル発生特性は特に、電磁放射線、特に蛍光、放射能、ルミネセンス、リ
ン光、電磁共鳴によって得られる。
ン光、電磁共鳴によって得られる。
【００１０】
その親和性基は、抗体または抗体断片であることが好ましい。その親和性基は
、例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８；アミノ−３−デオキシジゴキシゲニ
ンヘミコハク酸アミド；ビオチン；ＢＯＤＩＰＹ、カスケードブルー（Ｃａｓｃ
ａｄｅ Ｂｌｕｅ）；Ｃｙ２；Ｃｙ３；Ｃｙ５；ダンシル（Ｄａｎｉｓｙｌ）；
ＤＮＰ（ジニトロフェノール）；ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）；Ａｌｅｘａ Ｆｌ
ｕｏｒ ４８８；５（６）−ＳＦＸ；フルオレセイン；ルシファーイエローヨー
ドアセトアミド；マリーナブルー（Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ）；オレゴングリー
ン（Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅＮ）４８８；５（６）−ＴＡＭＲＡ；ＰＥ（フィコ
エリトリン）；ローダミンレッド（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ）；テキサスレ
ッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）などのいずれかの種類の低分子量ハプテンに対して
作られることが可能である。核酸は、適切なハプテンで標識しなければならない
。
、例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８；アミノ−３−デオキシジゴキシゲニ
ンヘミコハク酸アミド；ビオチン；ＢＯＤＩＰＹ、カスケードブルー（Ｃａｓｃ
ａｄｅ Ｂｌｕｅ）；Ｃｙ２；Ｃｙ３；Ｃｙ５；ダンシル（Ｄａｎｉｓｙｌ）；
ＤＮＰ（ジニトロフェノール）；ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）；Ａｌｅｘａ Ｆｌ
ｕｏｒ ４８８；５（６）−ＳＦＸ；フルオレセイン；ルシファーイエローヨー
ドアセトアミド；マリーナブルー（Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ）；オレゴングリー
ン（Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅＮ）４８８；５（６）−ＴＡＭＲＡ；ＰＥ（フィコ
エリトリン）；ローダミンレッド（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ）；テキサスレ
ッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）などのいずれかの種類の低分子量ハプテンに対して
作られることが可能である。核酸は、適切なハプテンで標識しなければならない
。
【００１１】
本発明の他の目的は、標識核酸とハイブリダイズさせた核酸を固定化する表面
を有する担体であって、シグナル発生特性と、標識核酸に対して親和性を有する
少なくとも１種類の基、したがって第１親和性基とを有する粒子が、標識核酸に
結合することを特徴とする担体である。
を有する担体であって、シグナル発生特性と、標識核酸に対して親和性を有する
少なくとも１種類の基、したがって第１親和性基とを有する粒子が、標識核酸に
結合することを特徴とする担体である。
【００１２】
ハイブリダイズした核酸を高感度免疫蛍光検出するために指定される、本発明
の担体に用いる粒子は、数千個の蛍光分子およびコロイド電磁粒子を含有する磁
気蛍光リポソームからなることが好ましい。
の担体に用いる粒子は、数千個の蛍光分子およびコロイド電磁粒子を含有する磁
気蛍光リポソームからなることが好ましい。
【００１３】
そのリポソームは、ホスファチジルコリン４０〜５０ｍｏｌ％、特に４５ｍｏ
ｌ％、ホスファチジルグリセロール５〜１５ｍｏｌ％、特に１０ｍｏｌ％、ホス
ファチジルエタノールアミン２〜１０ｍｏｌ％、特に５ｍｏｌ％、およびコレス
テロール３５〜４５ｍｏｌ％、特に４０ｍｏｌ％からなることが好ましい。
ｌ％、ホスファチジルグリセロール５〜１５ｍｏｌ％、特に１０ｍｏｌ％、ホス
ファチジルエタノールアミン２〜１０ｍｏｌ％、特に５ｍｏｌ％、およびコレス
テロール３５〜４５ｍｏｌ％、特に４０ｍｏｌ％からなることが好ましい。
【００１４】
水溶性蛍光体（例えば、カルボキシフルオレセイン）を用いる場合には、リポ
ソームは、適切に濃縮されたフルオロフォア溶液中にリポソームを浸漬し、リポ
ソーム中へのフルオロフォアの拡散によって得られる蛍光色素の１〜１００ｍＭ
溶液をフルオロフォアそれぞれの溶解性および蛍光挙動の関数として含有する。
ソームは、適切に濃縮されたフルオロフォア溶液中にリポソームを浸漬し、リポ
ソーム中へのフルオロフォアの拡散によって得られる蛍光色素の１〜１００ｍＭ
溶液をフルオロフォアそれぞれの溶解性および蛍光挙動の関数として含有する。
【００１５】
水溶性フルオロフォアを使用する場合、リポソームは、各フルオロフォアの可
溶性および蛍光挙動の関数として、モル比１：１００〜１：１０００で各フルオ
ロフォアを含有する。フルオロフォア含有リポソームは、各フルオロフォアの可
溶性および蛍光挙動の関数として、脂質のモル数に対して、モル比１：１００〜
１：１０００で各フルオロフォアを脂質混合物に添加することによって、リポソ
ームの調製中に得られる。
溶性および蛍光挙動の関数として、モル比１：１００〜１：１０００で各フルオ
ロフォアを含有する。フルオロフォア含有リポソームは、各フルオロフォアの可
溶性および蛍光挙動の関数として、脂質のモル数に対して、モル比１：１００〜
１：１０００で各フルオロフォアを脂質混合物に添加することによって、リポソ
ームの調製中に得られる。
【００１６】
そのリポソームは、直径５０〜１００ｎｍを有する超常磁性微粒子を含有する
。前記粒子は、４５０ｎｍでの吸収（光学濃度、ＯＤ450）５００を有する超常
磁性微粒子の溶液にリポソームを浸漬することによって得られる。
。前記粒子は、４５０ｎｍでの吸収（光学濃度、ＯＤ450）５００を有する超常
磁性微粒子の溶液にリポソームを浸漬することによって得られる。
【００１７】
リポソーム（擬似液体（pseudofluid）、二相表面を有する粒子）と他のすべ
ての微粒子との明確な相違は、流動性のために、親和性基がリポソーム表面上で
完全に移動性である。これは： Ａ）理論的、立体的かつ、わずか生産工学的理由で、有限数の親和性基を粒子
表面上に提供することができるにすぎないこと； Ｂ）密度が高すぎると、相互の斥力および障害が予想され、充填密度が低すぎ
ると、標的分子への結合の確率が大幅に減少するため、適用される親和性基の密
度を非常に正確に選択しなければならないこと；から、粒子の親和性または結合
力（いくつかの結合領域により影響を受ける２つの分子または粒子との間の全体
的な結合強度）にとって本質的に重要である。
ての微粒子との明確な相違は、流動性のために、親和性基がリポソーム表面上で
完全に移動性である。これは： Ａ）理論的、立体的かつ、わずか生産工学的理由で、有限数の親和性基を粒子
表面上に提供することができるにすぎないこと； Ｂ）密度が高すぎると、相互の斥力および障害が予想され、充填密度が低すぎ
ると、標的分子への結合の確率が大幅に減少するため、適用される親和性基の密
度を非常に正確に選択しなければならないこと；から、粒子の親和性または結合
力（いくつかの結合領域により影響を受ける２つの分子または粒子との間の全体
的な結合強度）にとって本質的に重要である。
【００１８】
このように、立体的な理由で、直径２０〜４０００ｎｍを有する硬質な球状粒
子（微粒子）と、直径約２ｎｍを有する比較的硬質なチューブ（二本鎖ＤＮＡ）
との間の結合強度は、実質的に親和性基１種類のみにより決定される。しかしな
がら、直径２０〜４０００ｎｍを有する液体球状粒子（リポソームおよびミセル
）と、直径約２ｎｍを有する比較的硬質なチューブ（二本鎖ＤＮＡ）との間の結
合強度は、２種類以上の親和性基によって最も高い確率で決定される。これは以
下のように説明することができる：第１親和性基により標的分子の結合が行われ
た後、同一リポソームの追加の親和性基は、脂質二重層で大いに知られる一定の
側方拡散（約１０-6〜１０-7ｍ／ｓ）のために、隣接する標的分子に移動し、第
２結合が行うことができる。
子（微粒子）と、直径約２ｎｍを有する比較的硬質なチューブ（二本鎖ＤＮＡ）
との間の結合強度は、実質的に親和性基１種類のみにより決定される。しかしな
がら、直径２０〜４０００ｎｍを有する液体球状粒子（リポソームおよびミセル
）と、直径約２ｎｍを有する比較的硬質なチューブ（二本鎖ＤＮＡ）との間の結
合強度は、２種類以上の親和性基によって最も高い確率で決定される。これは以
下のように説明することができる：第１親和性基により標的分子の結合が行われ
た後、同一リポソームの追加の親和性基は、脂質二重層で大いに知られる一定の
側方拡散（約１０-6〜１０-7ｍ／ｓ）のために、隣接する標的分子に移動し、第
２結合が行うことができる。
【００１９】
一次近似において、抗原（標的分子）は、可逆性２分子反応において抗体の両
方の結合部位のうちの１つによって結合する。大部分の抗体の場合、親和定数Ｋ
＝１０5〜１０11Ｌ／ｍｏｌである。その単純な２分子反応は、エピトープおよ
び均一な抗体を有する抗原の反応でのみ適用することが可能である。１つの抗体
または２つの結合した抗体の結合部位の両方（例えば、ＩｇＭ、または本明細書
に記載の抗体を与えられたリポソーム）が、同一もしくは２つの隣接する結合し
た抗原分子（標識した二本鎖ＤＮＡ）と反応するような距離で、２つの同一エピ
トープが抗原上に存在する場合、その反応は、免疫複合体形成の速度論で適用さ
れるべき複雑な等式を必要とする２分子手法ではもはや進行しない。両方の抗体
結合部位が反応することができる場合、例えば第２結合部位が第１結合部位より
もかなり速くエピトープに結合する（エントロピー効果）場合、抗原分子は、見
かけの親和性（結合力）が少なくとも１０4倍に増大する結果をもたらす抗体に
既に非常に接近しているからである。
方の結合部位のうちの１つによって結合する。大部分の抗体の場合、親和定数Ｋ
＝１０5〜１０11Ｌ／ｍｏｌである。その単純な２分子反応は、エピトープおよ
び均一な抗体を有する抗原の反応でのみ適用することが可能である。１つの抗体
または２つの結合した抗体の結合部位の両方（例えば、ＩｇＭ、または本明細書
に記載の抗体を与えられたリポソーム）が、同一もしくは２つの隣接する結合し
た抗原分子（標識した二本鎖ＤＮＡ）と反応するような距離で、２つの同一エピ
トープが抗原上に存在する場合、その反応は、免疫複合体形成の速度論で適用さ
れるべき複雑な等式を必要とする２分子手法ではもはや進行しない。両方の抗体
結合部位が反応することができる場合、例えば第２結合部位が第１結合部位より
もかなり速くエピトープに結合する（エントロピー効果）場合、抗原分子は、見
かけの親和性（結合力）が少なくとも１０4倍に増大する結果をもたらす抗体に
既に非常に接近しているからである。
【００２０】
親和性の増大（結合力）によって、増大しかつさらに特異的な結合が得られ、
それによって、他の球状粒子に対するリポソーム、つまり二相の液体表面を有す
る粒子のさらに高い感度および特異性が説明される。
それによって、他の球状粒子に対するリポソーム、つまり二相の液体表面を有す
る粒子のさらに高い感度および特異性が説明される。
【００２１】
抗体、例えば抗ＤＮＰ、抗ＤＩＧ等を、Ｓ−Ｓ基を低減する試薬にさらすこと
ができるチオール基によって、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル
）シクロヘキサン−１−カルボキシレートを用いて、リポソーム中に存在するホ
スファチジルエタノールアミンのアミノ基に結合させた。通常の反応条件は、ジ
チオスレイトールで調節した。
ができるチオール基によって、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル
）シクロヘキサン−１−カルボキシレートを用いて、リポソーム中に存在するホ
スファチジルエタノールアミンのアミノ基に結合させた。通常の反応条件は、ジ
チオスレイトールで調節した。
【００２２】
試験すべきＲＮＡを、従来の逆転写酵素（ＲＴ）反応によって、対応するｃＤ
ＮＡへと転写した。ここで、形成されたｃＤＮＡに取り込まれる、ＤＮＰ−ｄＣ
ＴＰ、ＤＩＧ−ＣＴＰ等の誘導体化されたヌクレオチドを添加する。異なる手法
で誘導体化したヌクレオチドを用いて、個別の反応において、異なる方法で、異
なるｃＤＮＡを標識することができる。ハイブリダイゼーションでは、異なる手
法で標識した、例えば健康な組織および疾患のある組織の前記ｃＤＮＡ全部をマ
イクロアレイに適用する。ハイブリダイゼーション後、誘導体化され、かつハイ
ブリダイズされたｃＤＮＡを、それに対して作られる抗体を用いて認識し、リポ
ソームと結合させ、異なる蛍光を測定することによって同定かつ定量することが
できる。したがって酵素増幅を避けて、相当する高い感度の分析を１段階で行う
ために数千の蛍光分子を使用することができる。
ＮＡへと転写した。ここで、形成されたｃＤＮＡに取り込まれる、ＤＮＰ−ｄＣ
ＴＰ、ＤＩＧ−ＣＴＰ等の誘導体化されたヌクレオチドを添加する。異なる手法
で誘導体化したヌクレオチドを用いて、個別の反応において、異なる方法で、異
なるｃＤＮＡを標識することができる。ハイブリダイゼーションでは、異なる手
法で標識した、例えば健康な組織および疾患のある組織の前記ｃＤＮＡ全部をマ
イクロアレイに適用する。ハイブリダイゼーション後、誘導体化され、かつハイ
ブリダイズされたｃＤＮＡを、それに対して作られる抗体を用いて認識し、リポ
ソームと結合させ、異なる蛍光を測定することによって同定かつ定量することが
できる。したがって酵素増幅を避けて、相当する高い感度の分析を１段階で行う
ために数千の蛍光分子を使用することができる。
【００２３】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。
【００２４】
実施例１
シグナル増幅に用いるリポソーム
ＰＣＲ（それぞれ、「ＥＣ２０ビチオン」および「ＥＣ２０ジゴキシゲニン」
）により、ビチオンｄＵＴＰおよびジゴキシゲニンｄＵＴＰをそれぞれ取り込み
、長さ約３００ｂｐを有するｃＤＮＡ断片を作製し、コーティングされたガラス
スライド（３００ｐｇ）上に２回滴下し、共有結合させた（ＰＣＴ／ＥＰ９９／
０４０１４を参照のこと）。これらの「ＥＣビオチン−ＥＣジゴキシゲニンアレ
イ」上の各スポットは、１０００：１、２００：１、４０：１、８：１、１：１
、１：８、１：４０、１：２００、１：１０００のＥＣ２０：ＥＣ２０ジゴキシ
ゲニン比でｃＤＮＡ断片の両方の混合物を含有した。
）により、ビチオンｄＵＴＰおよびジゴキシゲニンｄＵＴＰをそれぞれ取り込み
、長さ約３００ｂｐを有するｃＤＮＡ断片を作製し、コーティングされたガラス
スライド（３００ｐｇ）上に２回滴下し、共有結合させた（ＰＣＴ／ＥＰ９９／
０４０１４を参照のこと）。これらの「ＥＣビオチン−ＥＣジゴキシゲニンアレ
イ」上の各スポットは、１０００：１、２００：１、４０：１、８：１、１：１
、１：８、１：４０、１：２００、１：１０００のＥＣ２０：ＥＣ２０ジゴキシ
ゲニン比でｃＤＮＡ断片の両方の混合物を含有した。
【００２５】
さらに、２種類のネガティブコントロール：１）スポットバッファー、２）ニ
シンの精液のＤＮＡを滴下した。ＴＮＴバッファー中、アレイを室温で１５分間
洗浄し、室温で３０分間ＴＮＢバッファーでブロッキングし、続いて、全容積５
０μｌ中で室温にて振とうしながら（１５０ｒｐｍ）、Ｃｙ３およびＣｙ５標識
リポソーム（それぞれ、抗ビオチン−Ｃｙ３および抗ジゴキシゲニン−Ｃｙ５リ
ポソーム）またはＣｙ３標識ストレプトアビジン（ストレプトアジピンＣｙ３）
で染色した。このために、前もってリポソームを１０倍容量のＰＢＳで洗浄し、
４℃にて１，３００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
シンの精液のＤＮＡを滴下した。ＴＮＴバッファー中、アレイを室温で１５分間
洗浄し、室温で３０分間ＴＮＢバッファーでブロッキングし、続いて、全容積５
０μｌ中で室温にて振とうしながら（１５０ｒｐｍ）、Ｃｙ３およびＣｙ５標識
リポソーム（それぞれ、抗ビオチン−Ｃｙ３および抗ジゴキシゲニン−Ｃｙ５リ
ポソーム）またはＣｙ３標識ストレプトアビジン（ストレプトアジピンＣｙ３）
で染色した。このために、前もってリポソームを１０倍容量のＰＢＳで洗浄し、
４℃にて１，３００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
【００２６】
続いて、染色したアレイを、振とうしながらＴＮＴバッファーで２０分間洗浄
し、０．０６×ＳＳＣで２分間洗浄した。アレイをレーザースキャナ（Ｇｅｎｅ
ｒａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ社、ＳｃａｎＡｒｒａｙ３０００）で分析し、シグナ
ル強度を計算した（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｉｍａｇｅｎｅ２．０）。図
１および図２を参照のこと。その組み合わせ図（オーバーレイ）では、緑色が、
結合した抗ジゴキシゲニン−Ｃｙ５リポソームを表し、赤色は、抗ビオチン−Ｃ
ｙ３リポソームを表す。ａ）ｃＤＮＡ断片の呈色が特異的であり、ｂ）適用した
ｃＤＮＡ断片の混合比が検出可能であり、ｃ）抗ビオチンＣｙ３リポソームのシ
グナル強度が、ストレプトアジピンＣｙ３の場合よりも大きいことが分かる。
し、０．０６×ＳＳＣで２分間洗浄した。アレイをレーザースキャナ（Ｇｅｎｅ
ｒａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ社、ＳｃａｎＡｒｒａｙ３０００）で分析し、シグナ
ル強度を計算した（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｉｍａｇｅｎｅ２．０）。図
１および図２を参照のこと。その組み合わせ図（オーバーレイ）では、緑色が、
結合した抗ジゴキシゲニン−Ｃｙ５リポソームを表し、赤色は、抗ビオチン−Ｃ
ｙ３リポソームを表す。ａ）ｃＤＮＡ断片の呈色が特異的であり、ｂ）適用した
ｃＤＮＡ断片の混合比が検出可能であり、ｃ）抗ビオチンＣｙ３リポソームのシ
グナル強度が、ストレプトアジピンＣｙ３の場合よりも大きいことが分かる。
【００２７】
実施例２
この実験は、蛍光標識ヌクレオチドの従来の直接取り込みと比較して、リポソ
ームを用いた呈色によって、シグナルの増大が生じるかどうかを証明することを
意図する。
ームを用いた呈色によって、シグナルの増大が生じるかどうかを証明することを
意図する。
【００２８】
このために、１８種類の異なるｃＤＮＡ（３００ｐｇ）を有するｃＤＮＡアレ
イを作製し、各ｃＤＮＡを合計８回適用した（２つのスポットにそれぞれに対し
て、同一の４象限）。適用したｃＤＮＡを表１にまとめる。各象限におけるｃＤ
ＮＡ配列は、例えばｃＤＮＡのＮｏ．１「ＥＣ７」を、各象限の右下の角で見つ
けることができるように、右側の下から左側の上である。試験を行うために、マ
ウスの脾臓およびマウスの肝臓からＲＮＡを抽出した。これから、ｍＲＮＡを単
離した。ａ）蛍光標識ヌクレオチド（それぞれ、脾臓に対してＣｙ３−ｄＣＴＰ
および肝臓に対してＣｙ５−ｄＣＴＰ）と、ｂ）ビチオン化（脾臓）およびジゴ
キシゲニン化（肝臓）ｄＵＴＰとを取り込んで、ｍＲＮＡ１μｇ、０．１μｇお
よび０．０１μｇをそれぞれ、逆転写でｃＤＮＡに転写した。従来法で標識した
Ｃｙ３およびＣｙ５ｃＤＮＡそれぞれを、アレイ上で共にハイブリダイズした。
図３には、初期量０．０１μｇでかろうじてシグナルが同定可能なような初期量
の減少に伴って、シグナル強度が減少することを表す。ビオチンおよびジゴキシ
ゲニンそれぞれで標識した試料もまた、アレイ上で共にハイブリダイズし、実施
例１に記載のように、続いて抗ビオチン−Ｃｙ３リポソームおよび抗ジゴキシゲ
ニン−Ｃｙ５リポソームそれぞれで標識した。ここで、そのシグナル強度もまた
、初期量の減少に伴って減少することが認められる。しかしながら、０．０１μ
ｇでもまた、すべてのシグナルが同定可能である。これは、リポソーム標識が、
従来の直接標識よりもかなり感度が高いことを示している。
イを作製し、各ｃＤＮＡを合計８回適用した（２つのスポットにそれぞれに対し
て、同一の４象限）。適用したｃＤＮＡを表１にまとめる。各象限におけるｃＤ
ＮＡ配列は、例えばｃＤＮＡのＮｏ．１「ＥＣ７」を、各象限の右下の角で見つ
けることができるように、右側の下から左側の上である。試験を行うために、マ
ウスの脾臓およびマウスの肝臓からＲＮＡを抽出した。これから、ｍＲＮＡを単
離した。ａ）蛍光標識ヌクレオチド（それぞれ、脾臓に対してＣｙ３−ｄＣＴＰ
および肝臓に対してＣｙ５−ｄＣＴＰ）と、ｂ）ビチオン化（脾臓）およびジゴ
キシゲニン化（肝臓）ｄＵＴＰとを取り込んで、ｍＲＮＡ１μｇ、０．１μｇお
よび０．０１μｇをそれぞれ、逆転写でｃＤＮＡに転写した。従来法で標識した
Ｃｙ３およびＣｙ５ｃＤＮＡそれぞれを、アレイ上で共にハイブリダイズした。
図３には、初期量０．０１μｇでかろうじてシグナルが同定可能なような初期量
の減少に伴って、シグナル強度が減少することを表す。ビオチンおよびジゴキシ
ゲニンそれぞれで標識した試料もまた、アレイ上で共にハイブリダイズし、実施
例１に記載のように、続いて抗ビオチン−Ｃｙ３リポソームおよび抗ジゴキシゲ
ニン−Ｃｙ５リポソームそれぞれで標識した。ここで、そのシグナル強度もまた
、初期量の減少に伴って減少することが認められる。しかしながら、０．０１μ
ｇでもまた、すべてのシグナルが同定可能である。これは、リポソーム標識が、
従来の直接標識よりもかなり感度が高いことを示している。
【００２９】
図４には、棒グラフに単一アレイのシグナル比を示す。ここで、基本シグナル
の絶対シグナル強度が低すぎるため、標準法で黄色の棒が（初期量０．０１μｇ
）が一部の遺伝子では存在しないことを除いては、どちらの方法のシグナル比も
比較に値する。表２には再度、表形式でシグナル比を示す。さらに、検出可能な
遺伝子の数をここに示す。両方の蛍光管（fluorescence canal）のうちの少なく
とも１つにおけるシグナル強度が、ネガティブコントロール（ニシンの精液のＤ
ＮＡおよび塩）の対応するシグナル強度の平均値よりも少なくとも２倍高いとい
う結果となるそれらの遺伝子は、「検出可能な遺伝子」と呼ばれる。これによっ
て再度、リポソーム標識が、従来の直接標識よりも感度が高いことが実証されて
いる。
の絶対シグナル強度が低すぎるため、標準法で黄色の棒が（初期量０．０１μｇ
）が一部の遺伝子では存在しないことを除いては、どちらの方法のシグナル比も
比較に値する。表２には再度、表形式でシグナル比を示す。さらに、検出可能な
遺伝子の数をここに示す。両方の蛍光管（fluorescence canal）のうちの少なく
とも１つにおけるシグナル強度が、ネガティブコントロール（ニシンの精液のＤ
ＮＡおよび塩）の対応するシグナル強度の平均値よりも少なくとも２倍高いとい
う結果となるそれらの遺伝子は、「検出可能な遺伝子」と呼ばれる。これによっ
て再度、リポソーム標識が、従来の直接標識よりも感度が高いことが実証されて
いる。
【図１】実施例１におけるリポソームを用いたシグナル増幅実験結果。
【図２】実施例１におけるリポソームを用いたシグナル増幅実験結果。
【図３】実施例２における、リポソームを用いてシグナルの増大が生じることを
示す実験結果。
示す実験結果。
【図４】実施例２における、リポソームを用いてシグナルの増大が生じることを
示す実験結果。
示す実験結果。
【図５】実施例２において適用したｃＤＮＡを示す表１。
【図６】実施例２において得られた、シグナル比及び検出可能な遺伝子の数を示
す表２。
す表２。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１０月１６日（２００２．１０．１６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４１ Ｇ０１Ｎ 33/544 Ａ
33/544 33/566
33/566 37/00 １０２
37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA11 HA12
HA15
4B029 AA07 AA23 BB17 BB20 CC03
CC05 FA15
4B063 QA18 QA19 QQ08 QQ43 QR08
QR42 QR56 QS24 QS25 QS33
QS34 QS39 QX02
Claims (9)
- 【請求項１】 表面に固定化された核酸とハイブリダイズされる標識核酸を
検出するための、シグナル発生特性と、標識核酸に対する親和性を有する少なく
とも１種類の基とを有する、リポソームおよび／またはミセルからなる群から選
択される粒子の使用。 - 【請求項２】 前記粒子が異なる親和性基を有するか、かつ／または異なる
シグナル発生特性を有する、請求項１に記載の使用。 - 【請求項３】 前記粒子が、２０〜４０００ｎｍの粒径を有する、請求項１
または２のいずれか一項または複数項に記載の使用。 - 【請求項４】 前記シグナル発生特性が、電磁放射、特に蛍光、放射能、ル
ミネセンス、リン光、電磁共鳴またはそれらの組み合わせに基づく、請求項１か
ら３のいずれか一項または複数項に記載の使用。 - 【請求項５】 前記親和性基が、抗体または抗体断片である、請求項１から
４のいずれか一項または複数項に記載の使用。 - 【請求項６】 前記親和性基が、低分子量ハプテンに対して向けられる、請
求項１から５のいずれか一項または複数項に記載の使用。 - 【請求項７】 前記核酸が、低分子量ハプテンで標識される、請求項１から
６のいずれか一項または複数項に記載の使用。 - 【請求項８】 標識核酸とハイブリダイズした核酸を固定化する表面を有す
る担体であって、シグナル発生特性と、その標識核酸に対する親和性を有する少
なくとも１種類の基、その後に第１親和性基とを有する粒子が、その標識核酸に
結合する担体。 - 【請求項９】 前記粒子が、異なる親和性基を有するか、かつ／または異な
るシグナル発生特性を有する、請求項８に記載の担体。
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| DE10016115.4 | 2000-03-31 | ||
| DE10016115 | 2000-03-31 | ||
| EP00113549.0 | 2000-06-27 | ||
| EP00113549 | 2000-06-27 | ||
| PCT/EP2001/003702 WO2001073117A1 (de) | 2000-03-31 | 2001-03-31 | Verwendung von partikeln, die signalgebende eigenschaften und mindestens eine affinitätsgruppierung für markierte nukleinsäuren besitzen |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=26005127
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001570831A Pending JP2003528625A (ja) | 2000-03-31 | 2001-03-31 | シグナル発生特性と、標識核酸に対する親和性を有する少なくとも１種類の基とを有する粒子の使用 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030077636A1 (ja) |
| EP (1) | EP1268858A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003528625A (ja) |
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| WO (1) | WO2001073117A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN101580967B (zh) | 2004-01-01 | 2011-07-06 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 高性能聚乙烯多丝纱 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4704355A (en) * | 1985-03-27 | 1987-11-03 | New Horizons Diagnostics Corporation | Assay utilizing ATP encapsulated within liposome particles |
| DE3813278A1 (de) * | 1988-01-12 | 1989-07-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis von nukleinsaeuren |
| US5837194A (en) * | 1993-04-23 | 1998-11-17 | Potter; Colin G. | Apparatus for measuring chemiluminescence of multiple samples on a continuous matrix |
| GB9314394D0 (en) * | 1993-07-12 | 1993-08-25 | Slater James H | A security device using an ultrasensitive microtrace for protecting materials,articles and items |
| DE19612356B4 (de) * | 1996-03-28 | 2007-04-26 | Clondiag Chip Technologies Gmbh | Optischer Nachweis von Hybridisierungs-Signalen |
| US6506895B2 (en) * | 1997-08-15 | 2003-01-14 | Surmodics, Inc. | Photoactivatable nucleic acids |
| EP1023464B1 (en) * | 1997-10-14 | 2017-07-26 | Luminex Corporation | Precision fluorescently dyed particles and methods of making and using same |
| AU1926899A (en) * | 1997-12-19 | 1999-07-12 | Affymetrix, Inc. | Exploiting genomics in the search for new drugs |
| US6203989B1 (en) * | 1998-09-30 | 2001-03-20 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays |
| US6383749B2 (en) * | 1999-12-02 | 2002-05-07 | Clontech Laboratories, Inc. | Methods of labeling nucleic acids for use in array based hybridization assays |
-
2001
- 2001-03-31 WO PCT/EP2001/003702 patent/WO2001073117A1/de not_active Application Discontinuation
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- 2001-03-31 US US10/239,424 patent/US20030077636A1/en not_active Abandoned
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|---|---|---|---|
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