JP2003528612A - 新規好熱性ポリメラーゼｉｉｉホロ酵素 - Google Patents

新規好熱性ポリメラーゼｉｉｉホロ酵素

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JP2003528612A JP2001570769A JP2001570769A JP2003528612A JP 2003528612 A JP2003528612 A JP 2003528612A JP 2001570769 A JP2001570769 A JP 2001570769A JP 2001570769 A JP2001570769 A JP 2001570769A JP 2003528612 A JP2003528612 A JP 2003528612A
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マクヘンリー，チャールズ・エス
ジャンジク，ネボジサ
ブラード，ジョン・ランドール
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レプリダイン・インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、好熱性生物由来のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット及び構造遺伝子をコードする遺伝子及びアミノ酸配列に関する。特定すれば、本発明は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット及びアクセサリー蛋白質を提供する。本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ分子を同定するために有用な抗体、プライマー、プローブ及び他の試薬も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 発明の分野 本発明は、好熱性生物由来のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット
及び構造遺伝子をコードする遺伝子配列及びアミノ酸配列に関する。特定すれば
、本発明は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵
素サブユニット及びアクセサリー蛋白質を提供する。本発明は、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩＩＩ分子を同定するのに有用な抗体及び他の試薬も提供する。
【０００２】 先行技術 細菌の細胞は、ポリメラーゼＩ，ＩＩ及びＩＩＩと命名された３種のＤＮＡポ
リメラーゼを含む。ＤＮＡＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）は染色体の大部分の複製に
必須である。ｐｏｌ ＩＩＩは複製ポリメラーゼと呼ばれ；複製ポリメラーゼは
高速であり且つ高度にプロセッシブな酵素である。ｐｏｌ Ｉ及びＩＩは非複製
酵素と呼ばれるが、両酵素は複製機能を有するらしい。ＤＮＡポリメラーゼＩは
もっとも豊富な酵素であり、いくつかのタイプのＤＮＡ修復に必須であり、ＤＮ
Ａ複製の間のオカザキフラグメントの連結を可能にする修復様反応を含む。ｐｏ
ｌ ＩはＵＶ照射及び放射線模倣性薬剤により誘導されたＤＮＡの損傷の修復に
必須である。ｐｏｌ ＩＩは、ＳＯＳ応答を誘導するＤＮＡ損傷を修復する際に
役割を担うと考えられ、そしてｐｏｌ Ｉ及びＩＩＩの両方を欠く変異体におい
て、ｐｏｌ ＩＩはＵＶ誘導障害を修復する。ｐｏｌ ＩとＩＩはモノマーのポ
リメラーゼであり、一方ｐｏｌ ＩＩＩは複数のサブユニットの複合体からなる
。
【０００３】 Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ｐｏｌ ＩＩＩはＥ．ｃｏｌｉレプリカーゼの触媒性
コアを含む。Ｅ．ｃｏｌｉにおいては、細胞あたり約４００コピーのＤＮＡポリ
メラーゼＩが存在するが、ｐｏｌ ＩＩＩはたった１０−２０コピーである（Ｋ
ｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，２ｄ
ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，［１９９２］，ｐｐ
．１６７；及びＷｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：１２１
１７−１２１２２［１９８４］）。ｐｏｌ ＩＩＩの富裕性の低さ及び一般的複
製アッセイとして典型的に使用されるギャップの入ったＤＮＡ鋳型上のその相対
的に弱い活性が、ＤＮＡポリメラーゼＩの欠損変異体の入手までの発見を遅らせ
た（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｇｅｆｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４
７：５３６９−５３７５［１９７２］）。
【０００４】 ｐｏｌ ＩＩＩの触媒サブユニットは、その固有の触媒活性によるのではなく
、フォークにおいて他の複製蛋白質と相互作用する能力により、Ｅ．ｃｏｌｉの
主要な複製複合体の成分として識別される。これらの相互作用は酵素の莫大なプ
ロセッシビティーを授与する。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素がプライムさ
れたＤＮＡに結合したら４０分以上解離せず、これは全４ ＭｂのＥ．ｃｏｌｉ
染色体の合成に必要な時間である（ＭｃＨｅｎｒｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，５７：５１９−５５０［１９８８］）。複製フォークの共役したロー
リングサークルモデルにおける研究は、上記酵素がインビトロにおいて解離せず
にＤＮＡ１５０ｋｂ以上を合成できたことを示唆する（Ｍｏｋ ａｎｄ Ｍａｒ
ｉａｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１６４４４−１６６５４［１９
８７］；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：４０３０−４０４
４［１９９２］）。この高いプロセッシビティーに要求される必須の相互作用は
、α触媒サブユニットとβのダイマーの間の相互作用であり、ブレスレットのよ
うにＤＮＡ鋳型を環状にするスライディングクランププロセッシビティー因子で
あり、結合したポリメラーゼに沿ってそれを迅速にスライドさせるが、それが離
反することを阻害する（ＬａＤｕｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２６１：７５５０−７５５７［１９８６］；Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅ
ｌｌ ６９：４２５−４３７［１９９２］）。β−α結合は、その他の場合に解
離するかもしれないとき、一過性の温度の変動の間、見かけ上ポリメラーゼを鋳
型上に保持させる。
【０００５】 β2ブレスレットは高分子量のＤＮＡに自発的に結合できず、ＡＴＰの加水分
解のエネルギーを用いてＤＮＡの回りで複合蛋白質ＤｎａＸ−複合体を開かせて
閉じさせることを必要とする（Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：３５４１１−３５１５［１９７６］；Ｎａｋｔｉｎｉ
ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１３３５８−１３３６
５［１９８５］；及びＤａｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７０：２９５５５−２９５６２［１９９５］）。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて
、ｄｎａＸ遺伝子は２つの蛋白質τ及びγをコードする。γはｄｎａＸのｍＲＮ
Ａを通した経路のプログラムされたリボソームフレームシフト機構５番目から７
番目により生成され、停止コドンに遭遇する直前である−１リーディングフレー
ム内にリボソームを配置させる（Ｆｌｏｗｅｒ ａｎｄ ＭｃＨｅｎｒｙ Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３７１３−３７１７［１９
９０］；Ｂｌｉｎｋｏｗａ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，１８：１７２５−１７２９［１９９０］；及びＴｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ
ａｎｄ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８７：２５１６−２５２０［１９９０］）。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ｄｎａＸ
−複合体は化学量論γ2τ2δ1δ’1χ1ι1を有する（Ｄａｌｌｍａｎｎ ａｎｄ
ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：２９５６３−２９５６
９［１９９５］）。τ蛋白質は、ポリメラーゼに強固に相互作用する付加的なカ
ルボキシルドメインを含み、同時に複製フォークのリーディング鎖及びラギング
鎖を等しく複製できる一つの複合体中に２つのポリメラーゼを維持させる（Ｍｃ
Ｈｅｎｒｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２６５７−２６６３［１９８
２］；Ｓｔｕｄｗｅｌｌ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，２６６：１９８３３−１９８４１［１９９１］；ＭｃＨｅｎｒｙ，Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：５１９−５５０［１９９８］）。
【０００６】 関連する複数のＡＴＰａｓｅを生じさせるフレームシフト機構の保存は、Ｅ．
ｃｏｌｉに関する類推によると、プライムされたＤＮＡ上にプロセッシビティー
因子を共に集合できる点において意義がある。Ｅ．ｃｏｌｉにおいては、リボソ
ームが配列Ａ ＡＡＡ ＡＡＧにおいて−１フレームにフレームシフトし、リジ
ンのＵＵＵアンチコドンのｔＲＮＡが伸長前に６つのＡと対合できる（Ｆｌｏｗ
ｅｒ ａｎｄ ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８７：３７１３−３７１７［１９９０］Ｂｌｉｎｋｏｗａ ａｎｄ Ｗａｌ
ｋｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：１７２５−１７２９［１９９
０］；及びＴｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２５１６−２５２０［１９９０］）
。
【０００７】 ｐｏｌ ＩＩＩは中温性ユーバクテリアを通して保存されていることが明らか
である。Ｅ．ｃｏｌｉ及び関連するプロテオバクテリアに加えて、該酵素がｆｉ
ｒｍｉｃｕｔｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓから精製された（Ｌｏｗ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１：１３１１−１３２５［１
９７６］；Ｈａｍｍｏｎｄ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ［１９９２］）。配列決定され
た細菌ゲノムの増加と、ＤＮＡ配列の推論によると、ｐｏｌ ＩＩＩは、Ｃａｕ
ｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ，Ｂ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ及びＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓとして広く分散して生物に存在
する。ｄｎａＸとｄｎａＮの存在も（βの構造遺伝子）、これらの生物において
明らかである。これらの一般的複製機構は生物においてさらにより広く保存され
ている。真核生物はｐｏｌ ＩＩＩに相同のポリメラーゼを含まないが、真核生
物は、染色体の複製に振り向けられた特別なポリメラーゼ及びβ様のプロセッシ
ビティー因子（ＰＣＮＡ）及びｄｎａＸ様ＡＴＰａｓｅｓ（ＲＦＣ，アクチベー
ターＩ）を含み、これらはＤＮＡ上でこれらのプロセッシビティー因子を集合さ
せる（Ｙｏｄｅｒ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
６：２２６８９−２２６９７［１９９１］；Ｂｒｕｓｈ ａｎｄ Ｓｔｉｌｌｍ
ａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６２：５２２−５４８［１９９５］；Ｕ
ｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３：６５２１−６５２６［１９９６］）。
【０００８】 ヘリカーゼはＤＮＡ代謝において様々な機能を担う。細胞性（Ｅ．ｃｏｌｉ
ｄｎａＢ，ｐｒｉＡ及びｒｅｐ蛋白質）、ファージ（Ｔ４遺伝子４１及びｄｄａ
蛋白質；Ｔ７遺伝子４蛋白質）、及びウイルス（ＳＶ４０ Ｔ抗原；ＨＳＶ−１
ＵＬ５／ＵＬ５２複合体及びＵＬ９蛋白質）のヘリカーゼは、ＤＮＡを巻き戻
すことにより複製複合体の他の蛋白質がｓｓＤＮＡ上に集合できることになり、
複製の開始に関与する。他のヘリカーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｒｅｃＢＣＤ
及びｒｅｃＱ蛋白質）は遺伝子の特徴による組換えにおいて関与する。他のクラ
スのヘリカーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉのｕｖｒＡＢ及びｕｖｒＤを含む。これらのヘ
リカーゼは、切断前（ＤＮＡの損傷又は変化の認識）及び切断後の（損傷断片の
置換）工程の両方の間のヌクレオチド切り出し修復又はメチル指向性ミスマッチ
修復において作用する。例えば、ＵＳＰＮ５，７４７，２４７を参照されたい。
【０００９】 ＤＮＡの対合ミスは生体内で起こり得ることであって、修復蛋白質により認識
されて修正される。ミスマッチ修復は、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、及びＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおいてもっとも広範
囲に研究されてきた。Ｅ．ｃｏｌｉのＭｕｔＳ，ＭｕｔＨ及びＭｕｔＬ蛋白質は
ＤＮＡミスマッチの修復に関与するが、Ｅ．ｃｏｌｉ内のｕｖｒＤ遺伝子の産物
であるヘリカーゼＩＩのようにである。例えば、ＵＳＰＮ５，７５０，３３５を
参照。
【００１０】 もっとも良好に定義されたミスマッチ修復の経路はＥ．ｃｏｌｉのＭｕｔＨＬ
Ｓ経路であり、ｍｕｔＨ，ｍｕｔＬ，ｍｕｔＳ及びｍｕｔＵ（ｕｖｒＤ）遺伝子
産物に依存する長いパッチの（約３ｋｂ）切り出し修復反応を促進させる。Ｍｕ
ｔＨＬＳ経路は、Ｅ．ｃｏｌｉのもっとも活性の高いミスマッチ修復経路である
らしく、そしてＤＮＡ複製の忠実度を増加させると共に対合ミスの塩基を含む組
換え中間体に作用することが知られている。上記の系はインビトロにて再構成さ
れて、ｍｕｔＨ，ｍｕｔＬ，ｍｕｔＳ及びｕｖｒＤ（ヘリカーゼＩＩ）蛋白質、
並びにＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、ＤＮＡリガーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合
蛋白質（ＳＳＢ）及び一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼＥｘｏ Ｉ，Ｅｘｏ Ｖ
ＩＩ又はＲｅｃＪのうちの一つを要求する。酵母の類似の経路は、ＭＳＨ２遺伝
子及びＰＭＳ１及びＭＬＨ１と呼ばれる２つのｍｕｔＬ様遺伝子を含む。例えば
、ＵＳＰＮ６，１９１，２６８を参照。
【００１１】 Ｅ．ｃｏｌｉの細菌性Ｕｖｒ蛋白質はＤＮＡ二重鎖のバックボーンの結合構造
を歪める広い範囲の化学薬品により引き起こされる損傷ＤＮＡ部位を切り出すこ
とができる。結果として、ＤＮＡが環境サンプル中の化学薬品により損傷を受け
たなら、Ｕｖｒ蛋白質が損傷領域を分断して切り出すことになる。ＤＮＡポリメ
ラーゼＩによる続く再合成が標識又は非標識ヌクレオチドをＤＮＡ内に取り込む
。例えば、ＵＳＰＮ６，０６０，２８８を参照。
【００１２】 ＤＮＡのラギング鎖の複製は、ｐｒｉＡ，ｄｎａＴ，ｄｎａＢ，ｄｎａＣ及び
ｄｎａＧからなる複合蛋白質複合体により媒介される。この複合体はプライモソ
ームと呼ばれる。精製されたｐｒｉＡはＡＴＰａｓｅ、ヘリカーゼ、トランスロ
カーゼ及びプライモソームの集合体活性を有する。この遺伝子は、Ｄループに結
合し、ｒｅｃＧと相互作用し、そしてヘリカーゼ活性を有するから、組換え及び
ＤＮＡ修復に必須かも知れない。ｐｒｉＡの３’−５’ＤＮＡヘリカーゼ活性は
組換えを阻害する。例えばＵＳＰＮ６，１４６，８４６を参照。
【００１３】 発明の簡単な概要 発明は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：（ｕｖｒＤヘリカーゼ）６８のア
ミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離さ
れたポリペプチドに関する。
【００１４】 発明は、配列番号：（ＤＮＡ−Ｇプライマーゼ）７２のアミノ酸配列に少なく
とも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに
関する。
【００１５】 発明は、配列番号：（ｐｒｉＡヘリカーゼ）７６のアミノ酸配列に少なくとも
９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関す
る。
【００１６】 発明は、配列番号：（デルタサブユニット）１０のアミノ酸配列に少なくとも
９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関す
る。
【００１７】 発明は、配列番号：（デルタプライムサブユニット）１７のアミノ酸配列に少
なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチ
ドに関する。
【００１８】 発明は、配列番号：（ベータサブユニット）２３のアミノ酸配列に少なくとも
９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関す
る。
【００１９】 発明は、配列番号：（ｓｓｂ蛋白質）３２のアミノ酸配列に少なくとも９５％
の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。 発明は、配列番号：（イプシロン−１，ｄｎａＱ−１）３７のアミノ酸配列に
少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプ
チドに関する。
【００２０】 発明は、配列番号：（イプシロン−２，ｄｎａＱ−２）８２のアミノ酸配列に
少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプ
チドに関する。
【００２１】 発明はヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを生成する方法に関
し、該ポリペプチドは配列番号６８、７２、７６、１０、１７、２３、３２、３
７及び８２の一つのアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有し、該ポ
リペプチドが発現されて回収されるような条件下で上記ヌクレオチド配列を含む
宿主細胞を培養することを含む。
【００２２】 発明はひとつ又は複数のポリペプチドを利用することを含むＤＮＡ合成方法に
関し、該ひとつ又は複数のポリペプチドは配列番号６８、７２、７６、１０、１
７、２３、３２、３７及び８２の一つのアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列
同一性を有する。
【００２３】 本発明のさらなる目的及び利点は、以下の記載から明らかになる。 発明の詳細な説明 Ａ．定義 そのような用語に付与される範囲を含めて、明細書及び特許請求の範囲の明快
且つ一貫した理解を提供するため、以下の定義を提供する。用語「ａ」又は「ａ
ｎ」の実体はひとつ又は複数のその実体を意味し、例えば「ａ ｐｏｌｙｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ」はひとつ又は複数のポリヌクレオチドを表すように理解される
ことにも注目されるべきである。
【００２４】 本明細書にて使用されるとおり、用語「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素」
は完全なＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ実体物を意味し（即ち、全てのサブユニット
、並びに染色体又はゲノムのプロセッシブな複製に必要な、他の結合したアクセ
サリー蛋白質、例えばｓｓｂ，ｄｎａＧ，ｕｖｒＤ及びｐｒｉＡ）、一方「ＤＮ
ＡポリメラーゼＩＩＩ」はコア（α、ε、θ）のみである。「ＤＮＡポリメラー
ゼＩＩＩホロ酵素サブユニット」は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を含む
サブユニット実在物のいずれかに関して使用される。即ち、用語「ＤＮＡポリメ
ラーゼＩＩＩ」は、「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット」及び「
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット」を包含する。
【００２５】 用語「５’エキソヌクレアーゼ活性」は、オリゴヌクレオチドの５’末端から
ヌクレオチドを除去できる蛋白質の活性の存在を意味する。５’エキソヌクレア
ーゼ活性は本明細書に提供されるアッセイの何れかを用いて測定してよい。
【００２６】 用語「３’エキソヌクレアーゼ活性」は、オリゴヌクレオチドの３’末端から
ヌクレオチドを除去できる蛋白質の活性の存在を意味する。３’エキソヌクレア
ーゼ活性は本明細書に提供されるアッセイの何れかを用いて測定してよい。
【００２７】 用語「ＤＮＡポリメラーゼ活性」、「合成活性」及び「ポリメラーゼ活性」は
、互いに交換可能に使用され、デオキシヌクレオシド３リン酸の取り込みにより
新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素の能力を意味する。以下の実施例は、ＤＮＡポリ
メラーゼ可能の測定のためのアッセイを提供する。鋳型依存性様式によりデオキ
シヌクレオシド３リン酸の取り込みにより新たな鎖の合成（ＤＮＡ合成）を指令
することができる蛋白質を「ＤＮＡ合成活性ができる」と言う。
【００２８】 特定のヌクレオチド塩基においてＤＮＡ合成を停止させるＤＮＡ合成停止試薬
は化合物であり、限定ではないが、２’，３’ジデオキシ構造を有するジデオキ
シヌクレオシド（例えば、ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰ
）を含む。特定の塩基においてＤＮＡ配列決定反応を特異的に停止させることが
可能な如何なる化合物も、ＤＮＡ合成停止試薬として用いてよい。
【００２９】 用語「遺伝子」は、ポリペプチド又は前駆体の生成に必要なコーディング配列
（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、ホロ酵素サブユニット、又は適
当なアクセサリー蛋白質）を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を意味する。上記
ポリペプチドは、完全長のコーディング配列によるか又は該完全長のポリペプチ
ド又は断片の所望の活性又は機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグ
ナルトランスダクション等）が保持されるならば上記コーディング配列の何れか
の部分によりコードされ得る。該用語は、構造遺伝子のコーディング領域も包含
し、そして遺伝子が完全長のｍＲＮＡの長さに相当するように、何れかの末端上
に約１ｋｂの距離で５’及び３’の両末端上のコーディング領域に隣接して位置
する配列を含む。
【００３０】 用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡ形態及びゲノミック形態の両方を包含す
る。遺伝子のゲノミック形態又はクローンは、「介在領域」又は「介在配列」と
呼ばれる非コーディング配列により中断されるコーディング領域を含む。ｍＲＮ
Ａは、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列又は順序を特定するために翻訳する
間に機能する。
【００３１】 特定すれば、用語「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素」及び「ホロ酵素サブ
ユニット遺伝子」は、それぞれ、完全長ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素及び
ホロ酵素サブユニットヌクレオチド配列を意味する。しかしながら、上記用語は
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素及びホロ酵素サブユニット配列の断片、例え
ばサブユニット蛋白質を含む興味のある特定のドメインをコードするもの、並び
に完全長のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニットヌクレ
オチド配列内の他のドメインを包含することも意図される。さらに、用語「ＤＮ
ＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素」、「ホロ酵素サブユニットヌクレオチド配列」
、「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素」及び「ホロ酵素サブユニットポリヌク
レオチド配列」は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の配列
を包含する。
【００３２】 本明細書にて使用されるとおり、用語「（単数又は複数の）アクセサリー蛋白
質」は、染色体又はゲノムのプロセッシブな複製に必要か又は関与する蛋白質又
はポリペプチドを意味する。該用語はさらに完全長のポリペプチド又は蛋白質を
包含する。アクセサリー蛋白質の断片を意図する場合、ポリペプチド又は蛋白質
の断片が明確に示されることになる。
【００３３】 「アミノ酸配列」を天然に生じる蛋白質分子のアミノ酸配列を意味するように
記載する場合、「アミノ酸」及び類似の用語、例えば「ポリペプチド」又は「蛋
白質」は、記載された蛋白質に関連する完全な天然アミノ酸配列に上記アミノ酸
配列を限定することを意味しない。さらに、「ポリペプチド」及び「蛋白質」は
他に明記しない限り交換可能に使用される。「ポリペプチド」と「蛋白質」の違
いを意図する場合、そのような違いは明確にされることになる。
【００３４】 遺伝子のゲノミック形態は、ＲＮＡ転写物上に存在する配列の５’及び３’両
末端上に位置する配列も含む。これらの配列は、「フランキング」配列又は領域
と呼ばれる（これらのフランキング配列はｍＲＮＡ転写物上に位置する転写され
た配列に対して５’又は３’に位置する）。５’フランキング領域は遺伝子の転
写を制御するか又は転写に影響するプロモーター及びエンハンサーのような制御
配列を含んでよい。３’フランキング領域は、転写の終結、翻訳後分割及びポリ
アデニル化を指令する配列を含んでよい。
【００３５】 用語「野生型」は、天然に生じる源から単離された遺伝子又は遺伝子産物を意
味する。野生型遺伝子は、集団においてもっとも頻繁に観察される遺伝子であっ
て、即ち遺伝子の「正常」又は「野生型」と任意に呼ぶ。対照的に、用語「修飾
された」又は「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」は、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比
較した場合に、配列中に修飾を表すか又は機能特性を表す（即ち、変更された特
性）遺伝子又は遺伝子産物を意味する。天然に生じる変異体が単離され得ること
は注目される；野生型の遺伝子又は遺伝子産物に比較してそれらが変更された特
性を有する事実が明らかにされる。
【００３６】 用語「をコードするヌクレオチド配列」、「をコードする核酸分子」、「をコ
ードするＤＮＡ配列」及び「をコードするＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸の鎖に
沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序又は配列を意味する。これらのデオキシ
リボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（蛋白質）鎖に沿ったアミノ酸の順序
を決定する。上記ＤＮＡ配列は即ち上記アミノ酸配列をコードする。
【００３７】 用語「オリゴヌクレオチド」は、２つ又はそれ以上の、好ましくは３つより多
い、そして通常は１０より多いデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド
からなる分子として定義される。正確なサイズは、多くの因子に依存し、さらに
オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途に依存する。上記オリゴヌクレオチ
ドはあらゆる様式にて生成されてよく、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、ＰＣＲ
又はそれらの組み合わせを含む。
【００３８】 一つのモノヌクレオチドのペントース環がホスホジエステル結合を通して一方
向に向かってその隣りの３’の酸素に結合するようにモノヌクレオチドを反応さ
せてオリゴヌクレオチドを作成するため、その５’リン酸がモノヌクレオチドの
ペントース環の３’酸素に結合していないならばオリゴヌクレオチドの一方の末
端を「５’末端」と呼び、そしてその３’酸素が次のモノヌクレオチドのペント
ース環の５’リン酸に結合していないならばオリゴヌクレオチドの一方の末端を
「３’末端」と呼ぶ。本明細書にて使用されるとおり、核酸配列は、たとえより
大きなオリゴヌクレオチドに対して内部であっても、５’及び３’末端を有する
と言ってもよい。
【００３９】 ２つの異なる非重複オリゴヌクレオチドを同じ直鎖の相補核酸配列の別の領域
にアニールさせ、そして一方のオリゴヌクレオチドの３’末端が他方の５’末端
の近くに向く場合、前者を「上流」ヌクレオチドと呼び、そして後者を「下流」
ヌクレオチドと呼ぶ。直鎖又は環状ＤＮＡ分子の何れにおいても、異なる要素を
「上流」又は「下流」の５’末端又は３’要素と呼ぶ。この用語は、転写がＤＮ
Ａ鎖に沿って５’から３’への様式にて進行する事実を反映する。結合した遺伝
子の転写を指令するプロモーター及びエンハンサー要素は一般的にコーディング
領域の５’又は上流に配置させる。しかしながら、エンハンサー要素は、プロモ
ーター要素及びコーディング領域の３’に位置する場合であっても、それらの影
響を及ぼし得る。転写の終結及びポリアデニル化のシグナルはコーディング領域
の３’又は下流に配置させる。
【００４０】 用語「コーディング領域」は、構造遺伝子に関して使用される場合、ｍＲＮＡ
分子の翻訳の結果として発生期のポリペントース中に見いだされるアミノ酸をコ
ードするヌクレオチド配列を意味する。該コーディング領域は、開始のメチオニ
ンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」により５’側に結合され、
そして停止コドン（即ち、ＴＡＡ，ＴＡＧ，ＴＧＡ）を特定する３つのトリプレ
ットの一つにより３’側に結合される。場合により、ＡＴＧはＧＴＧに置換えら
れる。
【００４１】 用語「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子」は
、遺伝子のコーディング領域を含む核酸配列、又は換言すれば遺伝子産物をコー
ドする核酸配列を意味する。コーディング領域は、ｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡ
又はＲＮＡ形態の何れかで存在してよい。ＤＮＡ形態で存在する場合、ポリヌク
レオチドは一本鎖（即ち、センス鎖）か又は二本鎖であってよい。正確な転写の
開始及び／又は初期ＲＮＡ転写物の正確なプロセシングを可能にする必要がある
なら、適切な制御要素、例えばエンハンサー／プロモーター、スプライス接合点
、ポリアデニル化シグナル等を遺伝子のコーディング領域の極めて近位に配置さ
せてよい。あるいは、本発明の発現ベクターにて利用されるコーディング領域は
、内在エンハンサー／プロモーター、スプライス接合点、介在配列、ポリアデニ
ル化シグナル等、又は内在及び外来の制御要素両方の組み合わせを含んでよい。
【００４２】 用語「制御要素」は、核酸配列の発現のいくつかの側面を制御する遺伝子要素
を意味する。例えば、プロモーターは操作可能なように連結されたコーディング
領域の転写の開始を促進させる制御要素である。他の制御要素はスプライシング
シグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル等である（下に定義した）。
【００４３】 真核生物の転写制御シグナルは「プロモーター」及び「エンハンサー」要素を
含む。プロモーター及びエンハンサーは、転写に関与する細胞蛋白質に特異的に
相互作用するＤＮＡ配列の短いアレイからなる（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ
．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７［１９８７］）。プロモーター及びエン
ハンサーの要素は様々な真核生物源から単離されており、酵母、昆虫及び哺乳類
細胞及びウイルスの遺伝子を含む（類似の制御要素、即ちプロモーターは原核生
物にも見いだされる）。特定のプロモーター及びエンハンサーの選択は、どの細
胞種を用いて興味のある蛋白質を発現させるかに依存する。いくつかの真核生物
のプロモーター及びエンハンサーは広い宿主範囲を有し、一方その他は限定され
たサブセットの細胞種において機能する（総説については、Ｖｏｓｓ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１：２８７［１９８６］；
及びＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，前記を参照）。例えば、ＳＶ４０の初期
遺伝子のエンハンサーは多くの哺乳類種由来の広い種類の細胞種において極めて
活性であり、哺乳類細胞の蛋白質の発現のために広く使用されてきた（Ｄｉｊｋ
ｅｍａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１［１９８５］）。哺乳類細胞
種において活性なプロモーター／エンハンサー要素の他の２例は、ヒト伸長因子
１α遺伝子（Ｕｅｔｓｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
４：５７９１［１９８９］；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ９１：２１７［
１９９０］；及びＭｉｚｕｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：５３２２［１９９０］）及びラウス肉腫ウイルス（Ｇ
ｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７９：６７７７［１９８２］）及びヒトサイトメガロウイルス（Ｂｏｓｈａｒｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４１：５２１［１９８５］）のロングターミナルリ
ピート由来のものである。
【００４４】 用語「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター及びエンハンサーの両
方の機能を提供し得る配列を含むＤＮＡのセグメントを意味する（即ち、プロモ
ーター要素とエンハンサー要素により提供される機能、これらの機能の考察に関
しては前記参照）。例えば、レトロウイルスのロングターミナルリピートはプロ
モーター及びエンハンサーの両方の機能を含む。エンハンサー／プロモーターは
「内在性」又は「外来」又は「異種」であってよい。「内在性」エンハンサー／
プロモーターはゲノム中の所定の遺伝子に天然において結合しているものである
。「外来」又は「異種」のエンハンサー／プロモーターは、その遺伝子の転写が
結合したエンハンサー／プロモーターにより指令されるように、遺伝子操作（即
ち、分子生物学の技術）により遺伝子に並列に（ｉｎ ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉ
ｏｎ ｔｏ）配置されたものである。多くのプロモーター／エンハンサー配列は
発明の蛋白質を発現させるのに使用することができる。
【００４５】 真核細胞中の組換えＤＮＡ配列の効率よい発現は、結果の転写物の効率よい終
結とポリアデニル化を指令するシグナルの発現を必要とする。転写終結シグナル
は、一般にポリアデニル化シグナルの下流に見いだされ、そして長さにして数百
ヌクレオチドである。用語「ポリＡ部位」又は「ポリＡ配列」は、新生ＲＮＡ転
写物の終結及びポリアデニル化の両者を指令するＤＮＡ配列を意味する。組換え
転写物の効率よいポリアデニル化は、ポリＡテイルを欠く転写物が不安定であり
且つ素早く分解するので、望まれる。発現ベクター中で利用されるポリＡシグナ
ルは「異種」又は「内在性」であってよい。内在性ポリＡシグナルは、ゲノム中
の所定の遺伝子のコーディング領域の３’末端に天然に見いだされるものである
。異種のポリＡシグナルは、一つの遺伝子から単離されて、別の遺伝子の３’に
位置するものである。共通に使用される異種ポリＡシグナルは、ＳＶ４０のポリ
Ａシグナルである。ＳＶ４０ポリＡシグナルは、２３７ｂｐのＢａｍＨＩ／Ｂｃ
ｌＩ制限断片上に含まれ、そして終結及びポリアデニル化の両者を指令する（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，前記、１６．６−１６．７）。
【００４６】 本明細書にて使用される、用語「ベクター」は、一つの細胞から別の細胞へＤ
ＮＡセグメントを輸送する核酸分子に関して使用される。用語「媒体（ｖｅｈｉ
ｃｌｅ）」はときどき「ベクター」と交換可能に使用される。「ベクター」は「
プラスミド」とも交換可能に使用される。違いを意図する場合は、その違いが明
確にされる。
【００４７】 用語「発現ベクター」は、特定の宿主生物中の、「所望のコーディング配列と
、操作可能なように連結されたコーディング配列の発現に必要な適切な核酸配列
を含む組換えＤＮＡ分子」を意味する。原核生物における発現のために必要な核
酸配列は、通常、プロモーター、オペレーター（任意）、及びリボソーム結合部
位、並びにしばしば別の配列を含む。真核生物細胞は、プロモーター、エンハン
サー、及び終結及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００４８】 本明細書にて使用される用語「形質転換」は、真核生物細胞への外来ＤＮＡの
導入を意味する。形質転換は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン−媒介トランスフェクション
、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、リポソーム融合、リポフェクチン、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染
、及びバイオリスティックスを含む当業界公知の様々な手段により達成してよい
。
【００４９】 用語「選択可能なマーカー」は、他の状態で必須の栄養であるはずのものを欠
く培地中で生育する能力を授与する酵素活性をコードする遺伝子の使用を意味す
る（例えば、酵母ＨＩＳ３遺伝子）；さらに、選択可能なマーカーは該選択可能
なマーカーが発現されるように細胞上で抗生物質又は薬剤に耐性を授与してよい
。選択可能なマーカーは「優性」であってよい；優性な選択可能マーカーは任意
の真核細胞系で検出できる酵素活性をコードする。優性な選択可能マーカーの例
は、哺乳類において薬剤Ｇ４１８に対する耐性を授与する細菌性アミノグリコシ
ド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ遺伝子とも呼ばれる）、抗生物
質ハイグロマイシンに対する耐性を授与する細菌性ハイグロマイシンＧホスホト
ランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子及びミコフェノリック酸存在下での生育能力
を授与する細菌性キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝
子（ｇｐｔ遺伝子とも呼ばれる）を含む。他の選択可能マーカーはそれらの用途
が関連する酵素活性を欠く細胞系と共になければならないという点で優性ではな
い。非優性の選択可能マーカーの例は、ｔｋ-細胞系と共に使用されるチミジン
キナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ＣＡＤ−欠損細胞と共に使用されるＣＡＤ遺伝子及び
ｈｐｒｔ-細胞系と共に使用される哺乳類ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子を含む。哺乳類細胞系における選択
可能マーカーの使用の総説は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）ｐｐ．１６．９−１６．１５に提供される。
【００５０】 真核生物の発現ベクターは、「ウイルスレプリコン」又は「ウイルスの複製オ
リジン」を含んでもよい。ウイルスレプリコンは、適切な複製因子を発現する宿
主細胞の染色体外複製を可能にするウイルスＤＮＡ配列である。ＳＶ４０又はポ
リオーマのウイルス複製オリジンの何れかを含むベクターは、高いコピー数に複
製する。ウシパピローマウイルス又はエプスタイン−バールウイルス由来のレプ
リコンを含むベクターは、低いコピー数で染色体外で複製する（約１００コピー
／細胞）。
【００５１】 好熱性ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアク
セサリー蛋白質（例えば、ｄｎａＧ，ｐｒｉＡ，ｕｖｒＤ）は、原核宿主生物又
は真核宿主生物の何れかにおいて発現させてよい。好熱性ＤＮＡポリメラーゼＩ
ＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質（例えば、ｄｎ
ａＧ，ｐｒｉＡ，ｕｖｒＤ）をコードする核酸は、塩化カルシウム処理によるか
又はエレクトロポレーションによる形質転換のためにコンピテントにされた細菌
細胞の形質転換を含む、多くの手段により細菌宿主細胞に導入してよい。好熱性
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー
蛋白質（例えば、ｄｎａＧ，ｐｒｉＡ，ｕｖｒＤ）を真核生物の宿主細胞におい
て発現させるなら、好熱性ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブ
ユニット又はアクセサリー蛋白質（例えば、ｄｎａＧ，ｐｒｉＡ，ｕｖｒＤ）を
コードする核酸を、リン酸カルシウム共沈殿、スフェロプラスト融合、エレクト
ロポレーション等を含む多くの手段により真核細胞に導入してよい。真核宿主細
胞が酵母細胞の場合、形質転換は、酢酸リチウムによる宿主細胞の処理又はエレ
クトロポレーション又は当業界公知の他の何れかの方法により、作用させてよい
。何れの宿主細胞も発明のペプチド又は蛋白質又はその断片を生成するのに有用
になることが予期される。
【００５２】 「ハイブリダイゼーション」方法は標的核酸（検出されるべき配列）に相補な
配列のアニーリングを含む。複数の相補配列を含む核酸の２つのポリマーが塩基
対相互作用を通して互いを見つけてアニールする能力は、よく認識された現象で
ある。ＭａｒｍｕｒとＬａｎｅによる「ハイブリダイゼーション」プロセスの初
期の観察（例えば、Ｍａｒｍｕｒ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４６：４５３［１９６０］；及びＤｏｔｙ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４６：４６１［１９６
０］）は、近代の生物学の必須の道具へのこのプロセスの改良へと続いてきた。
にもかかわらず、多くの問題が診断道具としてのハイブリダイゼーションの広い
スケールの使用を妨害してきた。より侮りがたい問題は、１）ハイブリダイゼー
ションの非効率性；２）ゲノミックＤＮＡ混合物中での特定の標的配列の低濃度
；そして、３）ほんの一部の相補プローブ及び標的のハイブリダイゼーションで
ある。
【００５３】 効率に関しては、プローブ−標的の可能な数の僅かな画分しかハイブリダイゼ
ーション反応において形成されないことが実験上観察される。これは特に短いオ
リゴヌクレオチドプローブには真実である（１００塩基未満の長さ）。３つの根
本的な原因がある：ａ）二次又は三次構造の相互作用のためにハイブリダイゼー
ションをおこすことができない；ｂ）標的配列を含むＤＮＡの鎖がそれらの相補
鎖へ再ハイブリダイズ（再アニール）する；そして、ｃ）いくつかの標的分子が
固相表面へ標的核酸を固定化するハイブリダイゼーションフォーマットにおいて
使用される場合に、それらがハイブリダイゼーションを妨害する。
【００５４】 プローブの配列が完全に標的の配列の相補である場合でさえ（即ち、標的の一
次構造）、標的配列は高次構造の再構成を通してプローブに接近可能に作成され
なければならない。これらの高次構造の再構成は、分子の二次構造又は三次構造
の何れかに関係してよい。二次構造は分子内結合により決定される。ＤＮＡ又は
ＲＮＡ標的の場合、これは単一の連続する塩基鎖内のハイブリダイゼーションか
らなる（２つの異なる鎖の間のハイブリダイゼーションとは対照に）。分子内結
合能力範囲及び位置に依存して、プローブはハイブリダイゼーションを妨害する
標的配列から置換され得る。
【００５５】 オリゴヌクレオチドプローブの二本鎖ＤＮＡへの溶液ハイブリダイゼーション
は、より長い相補標的鎖が再変性又は再アニールし得るという事実によりさらに
複雑化する。再び、ハイブリダイズしたプローブはこのプロセスにより置き換る
。これは、プローブと標的の初期濃度に関連して低収量のハイブリダイゼーショ
ンをもたらす（低い「適用範囲」）。
【００５６】 低い標的配列濃度に関して、標的配列を含むＤＮＡ断片は、通常、ゲノミック
ＤＮＡ中では相対的に低い富裕性である。これは多大な技術的困難を提示する；
オリゴヌクレオチドプローブを用いる殆どの慣用法はそのような低レベルにおい
てハイブリダイゼーションを検出するのに必要な感度を欠く。
【００５７】 標的配列の濃度の問題に対する解決における一つの試みは、検出シグナルの増
幅である。ほとんどの場合、これはオリゴヌクレオチドプローブ上にひとつ又は
複数の標識を配置させることを必要とする。非放射性標識の場合、もっとも高い
親和性の試薬でさえ、オリゴヌクレオチドプローブを用いてゲノミックＤＮＡ中
の単一コピーの遺伝子を検出するのに不適当であることがわかった（Ｗａｌｌａ
ｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６７：７５５［１９８５］を参照）
。放射性オリゴヌクレオチドプローブの場合、極端に高い比活性のみが満足の行
く結果を示すことがわかった（Ｓｔｕｄｅｎｃｋｉ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，
ＤＮＡ ３：１［１９８４］；及びＳｔｕｄｅｎｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ
ａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：４２［１９８５］を参照）。
【００５８】 相補に関しては、いくつかの診断適用について、ハイブリダイゼーションが完
全又は一部の相補を表すか否かを決定することに関して重要である。例えば、病
原体のＤＮＡの存否を簡単に検出することが望まれる場合（例えば、ウイルス、
細菌、真菌、マイコプラズマ、原生動物）、問題の配列が存在する場合に上記ハ
イブリダイゼーション法がハイブリダイゼーションを保証することのみが重要で
ある；条件は一部相補性のプローブ及び完全に相補なプローブの両方がハイブリ
ダイズする場合に選択され得る。他の診断応用は、しかしながら、一部相補と完
全相補の間を上記ハイブリダイゼーション法が識別することを要求するかもしれ
ない。遺伝子の多型性を検出することは重要かもしれない。例えば、ヒトのヘモ
グロビンは、一部分、４つのポリペプチド鎖からなる。これらの鎖の２つは１４
１アミノ酸の同一の鎖であり（アルファ鎖）、そしてこれらの鎖の２つは１４６
アミノ酸の同一の鎖である（ベータ鎖）。ベータ鎖をコードする遺伝子は多型性
を呈することが知られている。正常な対立遺伝子は６位にグルタミン酸を有する
ベータ鎖をコードする。変異対立遺伝子は６位にバリンを有するベータ鎖をコー
ドする。アミノ酸におけるこの違いは、鎌状赤血球性貧血として臨床上公知の根
深い（変異対立遺伝子に関して個体が同型接合体である場合にもっとも根深い）
生理学上の衝撃を有する。アミノ酸変化の遺伝学上の基礎は正常な対立遺伝子Ｄ
ＮＡ配列と変異対立遺伝子ＤＮＡ配列の間の１塩基違いを含む。
【００５９】 他の技術と組み合わせなければ（例えば、制限酵素分析）、一部相補並びに完
全相補の両方の場合に同じハイブリダイゼーションレベルを可能にさせる方法は
そのような応用には典型的に適さない；プローブは正常及び変異標的配列の両方
にハイブリダイズすることになる。使用される方法に拘わらず、ハイブリダイゼ
ーションは、アッセイされる配列（標的配列）と試験を実施するために使用され
るＤＮＡの断片（プローブ）の間のいくらかの程度の相補性を必要とする。もち
ろん、当業者は、何の相補性もなく結合を得ることはできるが、この結合が非特
異的であって回避すべきことを知っている。
【００６０】 本明細書にて用いられる、用語「相補」又は「相補性」は、塩基対合規則によ
り関係付けられるポリヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）に関して使用
される。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」に関しては、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補で
ある。相補性は、核酸の塩基のほんのいくつかが塩基対合規則により適合してい
るような、「部分的」であってよい。あるいは、核酸間が「完全」又は「全体」
補であってよい。核酸鎖間の相補の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーション
の効率及び強度に対して顕著な効果を有する。これは、増幅反応、並びに核酸間
の結合に依存する検出法において特に重要である。
【００６１】 用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は相補の程度を意味する。部分的相同性
又は完全相同性（即ち、同一）があってよい。部分的相同配列は、完全相補配列
が標的核酸配列にハイブリダイズすることを少なくとも一部阻害する配列であっ
て、「実質上相同」なる機能的な用語を用いて呼ばれる。標的配列に対して完全
相補な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、ハイブリダイゼーションアッセ
イ（サザン又はノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて低
いストリンジェンシー条件下で試験してよい。実質上相同な配列又はプローブは
、低いストリンジェンシーの条件下で、標的への完全相補な結合（即ち、ハイブ
リダイゼーション）に関して競合して阻害することになる。これは、低いストリ
ンジェンシーの条件が、非特異的結合を許容しないようなことであるとは言えな
い；低いストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いの結合が特異的（即ち、
選択的）相互作用であることを要求する。非特異的結合の不在は部分的な相補性
の程度さえも欠く第２の標的の使用により試験してよい（例えば、約３０％未満
の同一性）；非特異的結合の不在下では、プローブは非相補標的にハイブリダイ
ズしない。
【００６２】 多くの均等な条件が当業界公知であり、低いストリンジェンシー条件を含むよ
うに用いられてよい；プローブの長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）の
ような因子及び標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液で存在するかある
いは固定化されるか、等）及び塩及び他の化合物の濃度（例えば、ホルムアミド
、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの存在又は不在）が考慮され、そ
してハイブリダイゼーション溶液は上記のリストされた条件とは異なるが均等な
低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件を生じるように変更し
てよい。さらに、業界は高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーショ
ンを促進させる条件を知っている（例えば、ハイブリダイゼーション及び／又は
洗浄工程の温度を増加させること、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミ
ドの使用等）。
【００６３】 二本鎖核酸配列、例えばｃＤＮＡ又はゲノミッククローンに関して使用される
場合、用語「実質上相同」は、上記のとおり低いストリンジェンシー条件下で二
本鎖核酸配列の一方又は両方の鎖にハイブリダイズできるいかなるプローブをも
意味する。
【００６４】 以下の用語が、２つ又はそれ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係を記載す
るのに使用される：「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配
列同一性のパーセンテージ」、及び「実質上同一」。用語「配列同一性」は、２
つのポリヌクレオチド配列が比較ウインドウを通して同一であることを意味する
（即ち、ヌクレオチド対ヌクレオチドの基準の上で）。用語「配列同一性のパー
センテージ」は、比較ウインドウを通して２つの最適に整列化された配列を比較
し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｕ又はＩ）が両方の配列中に生
じることにより適合した位置の数を生じさせる位置の数を決定し、比較ウインド
ウにおいて位置の全数で適合した位置の数を割り（即ち、ウインドウサイズ）、
そして結果に１００を掛けることにより配列同一性のパーセンテージを生じさせ
ることにより、計算される。
【００６５】 「参照配列」は、配列比較のための基準として使用される、定義された配列で
ある；参照配列は、例えば配列表中に提供された完全長のｃＤＮＡ又は遺伝子配
列、例えば本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列の何れかのセグメントと
してより大きな配列のサブセットであってよく、あるいは完全ｃＤＮＡ配列又は
遺伝子配列を含んでよい。通常、しかしいつもではないが、参照配列は少なくと
も２０ヌクレオチドの長さ、頻繁には少なくとも２５ヌクレオチドの長さ、そし
てしばしば少なくとも５０ヌクレオチドの長さである。２つのポリヌクレオチド
は各々、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似の配列（即ち、全ポリヌクレオ
チド配列の一部）を含み、そして（２）２つのポリヌクレオチド間で相異する配
列をさらに含んでよく、２つ（又は複数）のポリヌクレオチド間の配列比較を「
比較ウインドウ」を通して２つのポリヌクレオチドの配列を比較することにより
典型的には実施され、そして配列類似性の局所領域を同定して比較する。本明細
書にて使用される「比較ウインドウ」は少なくとも２０の連続するヌクレオチド
配列の概念上のセグメントを意味し、但し、ポリヌクレオチド配列を少なくとも
２０の連続するヌクレオチドの参照配列と比較してよく、そして比較ウインドウ
中のポリヌクレオチド配列の一部は２つの配列の最適な整列化のために参照配列
（付加又は欠失を含まない）と比較して２０パーセント又はそれ未満の付加又は
欠失（即ち、ギャップ）を含んでよい。比較ウインドウを整列化するための配列
の最適な整列化は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ
．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムによるか、Ｎｅｅ
ｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８
：４４３の相同性整列化アルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉ
ｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．
）８５：２４４４の類似性研究法によるか、これらのアルゴリズムのコンピュー
ター処理手段（ウイスコンシンジェネティックスソフトウエアパッケージリリー
ス７．０，ジェネティックコンピューターグループ、５７サイエンスのＤｒ．，
Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，及びＴＦＡＳＴＡ）によ
るか、又は閲覧により実施してよく、そして様々な方法により生じさせた最良の
整列化（即ち、比較ウインドウを通して相同性のもっとも高いパーセンテージを
もたらす）を選択する。用語「実質上同一」は、少なくとも２０ヌクレオチド位
置の比較ウインドウを通して、常習的には少なくとも２５−５０ヌクレオチドの
比較ウインドウを通した、参照配列に比較しての、少なくとも８５％パーセント
の配列同一性、好ましくは少なくとも９０から９５パーセントの配列同一性、よ
り通常には少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドの
特徴を意味し、但し、配列同一性のパーセンテージは、参照配列を、比較のウイ
ンドウを通して２０パーセント又はそれ未満を占める欠失又は付加を含んでよい
ポリヌクレオチド配列と比較することにより計算される。参照配列は、より大き
な配列のサブセットであってよく、例えば完全長のポリヌクレオチド配列又は完
全長のｃＤＮＡ配列のセグメントである。
【００６６】 ポリペプチドに適用される場合の用語「実質上同一」は、例えばプログラムＧ
ＡＰ又はＢＳＥＳＴＦＩＴにより欠点ギャップウエイト（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａ
ｐ ｗｅｉｇｈｔｓ）を用いて最適に整列化した場合に、２つのポリペプチドが
少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセント
配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセント配列同一性又はそれ以上
（即ち、９９パーセント配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、
同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換により異なる。保存的アミノ酸置換は
類似の側鎖を有する残基の交換可能性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有する
アミノ酸の基はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンである
；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の基はセリンとスレオニンである；
アミド含有側鎖を有するアミノ酸の基はアスパラギンとグルタミンである；芳香
族側鎖を有するアミノ酸の基はフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン
である；塩基性側鎖を有するアミノ酸の基はリジン、アルギニン及びヒスチジン
である；そしてイオウ含有側鎖を有するアミノ酸の基はシステインとメチオニン
である。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、
フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、そして
アスパラギン−グルタミンである。
【００６７】 遺伝子は初期ＲＮＡ転写物の異なるスプライシングにより生成した複数のＲＮ
Ａ種を生産するかもしれない。同じ遺伝子の変異体をスプライスするｃＤＮＡは
、配列同一又は完全相同の領域（両ｃＤＮＡｓ上の同じエクソン又は同じエクソ
ンの一部の存在を表す）及び完全非同一の領域（例えば、ｃＤＮＡ １上のエク
ソン「Ａ」の存在を表し、その際ｃＤＮＡ ２は代わりにエクソン「Ｂ」を含む
）を含むことになる。２つのｃＤＮＡｓが配列同一性領域を含むため、それらは
両ｃＤＮＡｓ上に見いだされる配列を含む完全な遺伝子又は遺伝子の一部に由来
するプローブに共にハイブリダイズすることになる；２つのスプライス変異体は
従ってそのようなプローブに対して及び互いに実質上相同である。
【００６８】 一本鎖核酸配列に関して使用される場合、用語「実質上相同」は、記載された
とおり、低いストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸にハイブリダイズできる（
即ち、相補）いかなるプローブをも意味する。本明細書にて使用される用語「ハ
イブリダイゼーション」は、相補な核酸の対合に関して使用される。ハイブリダ
イゼーションとハイブリダイゼーション強度（即ち、核酸間の対合の強度）は、
核酸間の相補の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリ
ッドのＴｍ、及び核酸内のＧ：Ｃ比のような因子により影響される。
【００６９】 用語「Ｔｍ」は「融解温度」に関して使用される。融解温度は、二本鎖核酸分
子の集団が一本鎖に半分解離するようになる温度である。核酸のＴｍを計算する
反応式は当業界でよく知られている。標準の文献にて示されるとおり、Ｔｍ値の
簡単な見積もりは、核酸が１ＭのＮａＣｌ水溶液中にある場合、等式：Ｔｍ＝８
１．５＋０．４１％（％Ｇ＋Ｃ）により計算してよい（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ［１９８５］）。他の文献は、Ｔｍ計算のために構造上の特性並びに配列
特性を考慮に入れる、より洗練されたコンピューター処理を含む。
【００７０】 用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼーションを実施する際の
、温度、イオン強度、及び他の化合物、例えば有機溶剤の存在の条件に関して使
用される。高い「ストリンジェンシー」条件を用いると、核酸塩基対合は高い頻
度の相補塩基配列を有する核酸断片間でのみ起こることになる。即ち、「弱い」
か「低い」ストリンジェンシー条件は、しばしば遺伝上別種の生物由来の核酸に
必要とされるが、相補配列の頻度が通常低いからである。
【００７１】 「増幅」は鋳型特異性を含む核酸複製の特定のケースである。非特異的鋳型複
製とは対照的なはずである（即ち、鋳型依存性であるが特定の鋳型に依存しない
複製）。鋳型の特異性は、複製忠実度（即ち、正確なポリヌクレオチド配列の合
成）及びヌクレオチド（リボ−又はデオキシリボ−）特異性とは、本明細書にお
いては区別される。鋳型特異性は頻繁に「標的」特異性という用語で記載される
。標的配列は、それらが他の核酸から区別されるべきという意味において、「標
的」である。増幅技術はこの区別に関して主として計画されてきた。
【００７２】 鋳型特異性は酵素の選択により殆どの増幅技術において達成される。増幅酵素
は、それらが使用される条件下で、核酸の異種混合物中の特定の核酸配列のみを
加工処理することになる酵素である。例えば、Ｑベータレプリカーゼの場合、Ｍ
ＤＶ−１ ＲＮＡが該レプリカーゼの特異的鋳型である（Ｋａｃｉａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：３０３８［１
９７２］）。他の核酸はこの増幅酵素により複製されない。同様に、Ｔ７ ＲＮ
Ａポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自身のプロモーターに関してストリ
ンジェントな条件を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ ２２８：２２７［１９７０］）。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの場合、オリゴヌク
レオチド又はポリヌクレオチド基質と鋳型の間に連結接合部においてミスマッチ
がある場合、該酵素は２つのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを連結し
ない（Ｅｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０［１９８
９］）。最後に、Ｔａｑ及びＰｆｕポリメラーゼは高い温度で機能するそれらの
能力のために、プライマーにより結合されて即ち規定される配列に関して高い特
異性を表すことが見いだされる；高い温度は標的配列とのプライマーハイブリダ
イゼーションを好み、非標的配列とのハイブリダイゼーションを好まない熱力学
条件をもたらす（Ｅｒｌｉｃｈ（編纂）ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏ
ｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ［１９８９］）。
【００７３】 用語「増幅可能な核酸」は、如何なる増幅法によっても増幅してよい核酸に関
して使用される。「増幅可能な核酸」は、通常は「サンプル鋳型」を含むことが
意図される。
【００７４】 用語「サンプル鋳型」は、「標的」（下に定義される）に関して分析されるサ
ンプルを起源とする核酸を意味する。対照的に、「バックグラウンド鋳型」は、
サンプル中に存在してもしなくてもよいサンプル鋳型以外の核酸に関して使用さ
れる。バックグラウンド鋳型は殆どの場合間違いである。それはキャリーオーバ
ーの結果かもしれず、あるいは、それはサンプルから精製され果てるべき核酸夾
雑物の存在によるかもしれない。例えば、検出されるべき生物以外の生物からの
核酸が試験サンプル中にバックグラウンドとして存在したかもしれない。
【００７５】 本明細書にて使用される用語「プライマー」は、精製された制限消化物として
天然に生じるか又は合成により生成されたかの何れかであって、核酸鎖に相補な
プライマー伸長生成物の合成が誘導される条件したで定められるとき、合成の開
始点として作用し得る、オリゴヌクレオチドを意味する（即ち、ヌクレオチド及
び誘導試薬、例えばＤＮＡポリメラーゼ存在下において、そして適切な温度及び
ｐＨにおいて）。プライマーは増幅における最大の効率のためには一本鎖が好ま
しいが、別に二本鎖でもよい。二本鎖なら、プライマーを最初に処理して、伸長
生成物を調製する前にその鎖を分離する。好ましくは、プライマーはオリゴデオ
キシリボヌクレオチドである。プライマーは誘導試薬の存在下で伸長生成物の合
成を開始するのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは多くの
因子に依存することになり、温度、プライマーの源及び上記方法の使用を含む。
【００７６】 プライマーは、鋳型の特定の配列の鎖に「実質上」相補であるように選択され
る。プライマーは、プライマー伸長が起こるためには、鋳型鎖とハイブリダイズ
するのに十分相補でなければならない。プライマー配列は鋳型の正確な配列を反
映する必要がない。例えば、非相補ヌクレオチド断片をプライマーの５’末端に
連結してよく、プライマー配列の残りは上記鎖に実質上相補である。非相補塩基
又は長い配列をプライマー中に散在させることができるが、プライマー配列が鋳
型配列とハイブリダイズしてそれによりプライマーの伸長生成物の合成のために
鋳型プライマー複合体を形成するのに十分相補である場合に限る。
【００７７】 用語「ネステッドプライマー」は、ＰＣＲを開始するのに使用されるアニーリ
ング境界内のエリア内の標的配列にアニールするプライマーを意味する（Ｍｕｌ
ｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓ
ｉａ，Ｖｏｌ．ＬＩ，ｐｐ．［２６３−２７３］を参照）。ネステッドプライマ
ーは開始プライマーののアニーリング境界の内部にて標的にアニールするため、
開始プライマーの優勢なＰＣＲ増幅産物は、ネステッドプライマーのアニーリン
グ境界により定義されたよりも必然に長い配列になる。ネステッドプライマーの
ＰＣＲ増幅生成物は、よって開始プライマーにアニールできない標的配列の増幅
されたセグメントである。
【００７８】 用語「プローブ」は、精製された制限消化物として天然に生じるか又は合成、
組換えあるいはＰＣＲ増幅により生成されたかの何れかであって、興味のある別
のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを意味する（
即ち、ヌクレオチドの配列）。プローブは一本鎖でも二本鎖でもよい。プローブ
は、特定の遺伝子の配列の欠失、同定及び単離に有用である。本発明において使
用される如何なるプローブも如何なる「レポーター分子」により標識されて、あ
らゆる検出系において検出可能であり、限定ではないが、酵素（例えば、ＥＬＩ
ＳＡ，並びに酵素に基づく組織化学アッセイ）、蛍光、放射性、及び発光系を含
む。本発明は如何なる特定の検出系又は標識にも限定されることを意図しない。
【００７９】 本明細書にて使用される用語「標識」は、検出可能な（好ましくは定量可能な
）シグナルを提供するのに使用でき、そして核酸又は蛋白質に結合できるあらゆ
る原子又は分子を意味する。標識は、蛍光、放射性、測色、重量測定、Ｘ−線回
折又は吸着、磁気、酵素活性等を提供してよい。
【００８０】 ポリメラーゼ鎖反応に関して使用される場合の用語「標的」は、ポリメラーゼ
鎖反応のために使用されるプライマーにより結合された核酸の領域を意味する。
即ち、「標的」は、他の核酸配列から分類されるべきである。「セグメント」は
標的配列内の核酸の領域として定義される。
【００８１】 用語「実質上一本鎖」は、核酸標的に関して使用される場合、鎖間の塩基対合
相互作用により共に保持される核酸の２つの鎖として存在する二本鎖標的とは対
照的に一本鎖の核酸として主に存在することを意味する。
【００８２】 核酸は、安定のために塩基対合に依存した二次構造を形成する。異なる配列の
複数の核酸の一本鎖（一本鎖ＤＮＡ、変性された二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、
密接な関係であるにせよ、それら自身が折り畳まれることが可能な場合、それら
は特徴的な二次構造をとる。標的の配列中の変更は、二重鎖の破壊を引き起こす
か、又はプローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションへのいくつかの
領域の接近性をそれにより変更する安定性の増加を引き起こすかもしれない。何
の理論にも拘束されないが、標的集団中の個々の分子はたったひとつ又はほんの
いくつかの構造を各々がとるかもしれないが（即ち、二重鎖領域）、サンプルを
全体として分析する場合、プローブのハイブリダイゼーションからの混成のパタ
ーンが創製され得る。プローブの結合を変更できる構造のほとんどはほんの僅か
な塩基対の長さであるらしく、そして不安定であるらしい。これらの構造のいく
つかはその領域内のプローブのハイブリダイゼーションにより置き換るかもしれ
ない；その他は近くのプローブのハイブリダイゼーションにより安定化するかも
しれず、プローブ／基質の二重鎖が標的の鎖内の二重鎖と共軸で群をなし得るよ
うなもので、それにより、両者の安定性を増加させる。小さな配列の変化への応
答におけるこれらの構造の形成又は破壊は、プローブ／標的複合体形成のパター
ンの変化をもたらす。本明細書にて使用される用語「ポリメラーゼチェイン反応
」（「ＰＣＲ」）は、クローニング及び精製なしにゲノミックＤＮＡの混合物中
の標的配列のセグメントの濃度を増加させる方法を記載する、引用により本明細
書に編入される、Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８
３，２０２号及び第４，９６５，１８８号の方法を意味する。標的配列を増幅す
るこのプロセスは、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に、過剰な２つのオリゴ
ヌクレオチドプライマーを導入し、次にＤＮＡポリメラーゼの存在下で正確な順
序の温度循環を行うことからなる。上記の２つのプライマーは二本鎖標的配列の
それぞれの各鎖に相補である。増幅させるためには、上記混合物を変性し、そし
てプライマーを次に標的分子中のそれらの相補配列に対してアニールさせる。ア
ニールさせた後、プライマーをポリメラーゼにより伸長させることにより、相補
鎖の新規な対を形成させる。変性、プライマー伸長及びポリメラーゼ反応の工程
を多数回繰り返し（即ち、変性、アニーリング及び伸長は一つの「サイクル」を
構成する；非常に多くの「サイクル」があり得る）、所望の標的配列の高濃度の
増幅セグメントを得る。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは互いに
関してプライマーの相対位置により決定され、よって、この長さは制御可能なパ
ラメーターである。上記プロセスの繰り返しの側面のおかげで、上記方法は「ポ
リメラーゼチェイン反応」（以後は「ＰＣＲ」）と呼ばれる。標的配列の所望の
増幅セグメントが混合物中で優勢な配列になるため、それらは「ＰＣＲ産物」と
言われる。
【００８３】 ＰＣＲを用いると、いくつかの異なる方法論により検出可能なレベルまで、ゲ
ノミックＤＮＡ中の特定の標的配列の単一コピーを増幅させることが可能である
（例えば、標識プローブを用いたハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマ
ーの取り込みとそれに続くアビジン−酵素コンジュゲート検出；32Ｐ−標識デオ
キシヌクレオチド３リン酸、例えばｄＣＴＰ又はｄＡＴＰの増幅されたセグメン
トへの取り込み）。ゲノミックＤＮＡに加えて、如何なるオリゴヌクレオチド又
はポリヌクレオチド配列もプライマー分子の適切なセットにより増幅できる。特
に、ＰＣＲプロセス自体により創製された増幅されたセグメントは、それら自体
が次のＰＣＲ増幅のための有効な鋳型である。
【００８４】 用語「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲ断片」及び「増幅産物」は、変性、アニーリン
グ及び伸長のＰＣＲ工程の２又はそれ以上の循環が完了した後の化合物の結果の
混合物を意味する。これらの用語は、ひとつ又は複数の標的配列のひとつ又は複
数のセグメントの増幅が存在した場合を含む。
【００８５】 用語「増幅試薬」は、プライマー、核酸鋳型及び増幅酵素以外の、増幅に必要
な試薬（デオキシリボヌクレオチド３リン酸、バッファー等）を意味する。典型
的には他の反応成分と共に増幅試薬を反応容器（試験管、マイクロウエル等）に
入れて含ませる。
【００８６】 ＰＣＲのような増幅法に関して使用される場合、用語「ポリメラーゼ」は、興
味のある核酸の増幅における使用のために適したあらゆるポリメラーゼを意味す
る。該用語は、本発明のポリメラーゼＩＩＩのようなＤＮＡポリメラーゼ、並び
にＴａｑポリメラーゼ（即ち、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓから得られ
るタイプＩのポリメラーゼ）を包含するが、他のポリメラーゼも、好熱性及び熱
不安定性の何れもが、この定義により包含される。
【００８７】 用語「ＲＴ−ＰＣＲ」は、ＲＮＡ配列の複製及び増幅を意味する。この方法に
おいては、逆転写をＰＣＲと共役させ、ほとんどの場合、好熱性ポリメラーゼを
用いるような一つの酵素の処置を用い、引用により本明細書に編入される、米国
特許第５，３２２，７７０に記載されるとおりである。ＲＴ−ＰＣＲにおいては
、上記ポリメラーゼの逆転写酵素活性によりＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに変換させ、
そして次にポリメラーゼの重合活性を用いて増幅する（即ち、他のＰＣＲ法にお
けるように）。発明の蛋白質及びポリペプチドは、ＤＮＡを合成又は複製する如
何なる方法にも使用できる。
【００８８】 用語「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」は、各々、特定のヌクレオ
チド配列においてか又は近辺において二本鎖ＤＮＡを切断する、細菌の酵素を意
味する。
【００８９】 本明細書にて使用される用語「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学の技術によ
り連結したＤＮＡのセグメントからなる分子を意味する。 用語「操作可能な組み合わせ」、「操作可能な順序」及び「操作可能に連結し
た」は、所定の遺伝子の転写及び／又は所望の蛋白質分子の合成を指令できる核
酸分子を生産するような、核酸配列の結合を意味する。上記用語は、機能性蛋白
質が生産されるような、アミノ酸配列の連結をも意味する。
【００９０】 本明細書にて使用される用語「単離された」は、核酸に関連して「単離された
オリゴヌクレオチド」又は「単離されたポリヌクレオチド」として使用される場
合、正体が確認され、そしてその天然源に通常関連する少なくとも一つの夾雑核
酸から分離される核酸配列を意味する。単離された核酸は、自然界において見い
だされるのとは異なる形態又はセッティングにおけるように存在する。対比して
、それらが自然界において存在する状態で発見される、ＤＮＡ及びＲＮＡのよう
な核酸としての非単離核酸である。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、又は
ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖形態の何れかにて存在してよい。単離さ
れた核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを利用して蛋白質を発現さ
せる場合、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドはセンス鎖又はコーディン
グ鎖を最小限含むことになる（即ち、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
は一本鎖であってよい）が、センス及びアンチセンス鎖の両方を含んでよい（即
ち、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは二本鎖であってよい）。
【００９１】 本明細書にて使用される、用語「精製された」又は「精製する」は、サンプル
からの夾雑物の除去を意味する。例えば、抗−ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵
素及びホロ酵素サブユニット及びアクセサリー蛋白質抗体は、混在する非イムノ
グロブリン蛋白質の除去により精製される；それらは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ
Ｉホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質を結合しないイム
ノグロブリンの除去によっても精製される。非イムノグロブリン蛋白質の除去及
び／又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアク
セサリー蛋白質を結合しないイムノグロブリンの除去は、サンプル中のＤＮＡポ
リメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質に
反応性のイムノグロブリンのパーセントの増加をもたらす。別の例においては、
組換えの、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はア
クセサリー蛋白質のポリペプチドを細菌宿主細胞中で発現させ、そしてポリペプ
チドを宿主細胞蛋白質の除去により精製する；組換えＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ
ホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質のポリペプチドはそ
れによりサンプル中で増加する。
【００９２】 本明細書にて使用される用語「組換えＤＮＡポリメラーゼ」は、分子生物学技
術により連結したＤＮＡのセグメントからなるＤＮＡ分子を意味する。 本明細書にて使用される用語「組換え蛋白質」又は「組換えポリペプチド」は
、組換えＤＮＡ分子から発現される蛋白質分子を意味する。
【００９３】 本明細書にて使用される用語「天然蛋白質」は、ベクター配列によりコードさ
れるアミノ酸残基を含まない；即ち、天然蛋白質は自然界において生じるとおり
に蛋白質中に見いだされるそれらのアミノ酸のみを含む。天然蛋白質は、組換え
手段により製造してよく、又は天然に生じる源から単離してよい。
【００９４】 本明細書にて使用される用語「融合蛋白質」は、興味のある蛋白質（即ち、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又は該ホロ酵素のア
クセサリー蛋白質及び断片）を、外来の蛋白質又はペプチド断片である融合パー
トナーに連結して含むキメラ蛋白質を意味する。融合パートナーは、非ＤＮＡポ
リメラーゼＩＩＩホロ酵素又は非ホロ酵素サブユニット又は非アクセサリー蛋白
質からなる。融合パートナーは、宿主細胞中で発現された、ＤＮＡポリメラーゼ
ＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質の可溶性を増
強させてよく、宿主細胞又は培養上清あるいは両方からの組換え融合蛋白質の精
製を可能にする親和性標識を供給してよい。望むならば、融合蛋白質は、当業界
公知の様々な酵素手段又は化学手段により、興味のある蛋白質から除去してよい
（即ち、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、ホロ酵素サブユニット又は前記の
如何なるもののアクセサリー蛋白質又は断片）。
【００９５】 本発明においては、発明のサブユニット及びアクセサリー蛋白質を、ヘキサヒ
スチジン部位、ビオチン化部位及びトロンビン分割部位を含むＮ−末端ペプチド
に融合させる。他の態様においては、サブユニット及びアクセサリー蛋白質を翻
訳上共役させた蛋白質として発現させる。さらに別の態様において、アミノ末端
標識はヘキサヒスチジン部位及びビオチン化部位を含む。さらに別の態様におい
て、サブユニット及びアミノ酸蛋白質はヘキサヒスチジン部位及びビオチン化部
位を含むＣ−末端ペプチドに融合させる。他のマーカー配列は当業界公知であり
、発明のサブユニット及びアクセサリー蛋白質に連結することができる。
【００９６】 ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリ
ー蛋白質の「変種（ｖａｒｉｅｔｙ）」は、ひとつ又は複数のアミノ酸が変更さ
れたアミノ酸配列を意味する。変種は「保存的」変化を有してよく、置換された
アミノ酸は類似の構造上の特性又は化学特性を有する（例えば、ロイシンのイソ
ロイシンへの置換）。より稀にではあるが、変種は「非保存的」置換（例えば、
グリシンのトリプトファンへの置換）を含むかもしれない。類似のマイナーな変
更はアミノ酸の欠失又は挿入又は両方を含んでもよい。生物活性又は免疫活性を
破壊することなしに、どのアミノ酸残基を置換するか、挿入するか、又は欠失さ
せるかを決定することにおけるガイダンスは、当業界公知のコンピュータープロ
グラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウエアを用いて見いだしてよい。
【００９７】 用語「配列の異形（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」は、２つの核酸配列間の核酸配列
の相異を意味する。例えば、野生型の構造遺伝子とこの構造遺伝子の変異形態は
、１塩基置換及び／又はひとつ又は複数のヌクレオチドの欠失又は挿入の存在に
より配列中で変更してよい。構造遺伝子のこれらの２つの形態は他方とは配列が
変異すると言う。構造遺伝子の第２の変異形態が存在してよい。この第２の変異
形態は、野生型遺伝子と遺伝子の第１の変異形態の両方から配列上変異すると言
う。しかしながら、発明は配列の異形を検出するためにひとつ又は複数の形態の
遺伝子の間に比較がなされることを必要としないことは注目すべきである。発明
の方法は所定の核酸標的に関しての複合体の形成の特徴的パターン及び再生可能
なパターンを生じるため、特徴的な「フィンガープリント」は野生型又は他の対
照を参照することなく、如何なる核酸からも得てよい。発明は、標的の変異形態
と野生型又は公知の変異体対照の比較により、対照に対する参照及び標的核酸の
変異形態の確認なしに、両方の「フィンガープリンティング」核酸のための方法
の使用を意図する。
【００９８】 用語「標的核酸」は、ポリメラーゼチェイン反応に使用されるプライマーに結
合した核酸の領域を意味する。即ち、「標的」は、別の核酸から分類されること
が望ましい。「セグメント」は標的配列内の核酸の領域として定義される。
【００９９】 用語「ヌクレオチド類似体」は、修飾されたか又は天然には生じないヌクレオ
チド、例えば７−デアザプリン（７−デアザ−ｄＡＴＰ及び７−デアザ−ｄＧＴ
Ｐ）を意味する。ヌクレオチド類似体は塩基の類似体を含み、そしてデオキシリ
ボヌクレオチド並びにリボヌクレオチドの修飾形態を含む。用語「ヌクレオチド
類似体」は、ＰＣＲ混合物に存在する標的に関して使用される場合、ｄＡＴＰ，
ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ以外のヌクレオチドの使用を意味する；即ち、
ｄＵＴＰ（天然に生じるｄＮＴＰ）のＰＣＲにおける使用は、ＰＣＲにおいてヌ
クレオチド類似体の使用を含むはずである。反応混合物中でｄＵＴＰ，７−デア
ザ−ｄＡＴＰ，７−デアザ−ｄＧＴＰ又はあらゆる他のヌクレオチド類似体を用
いて生成されたＰＣＲ産物は、ヌクレオチド類似体を含むと言う。
【０１００】 遺伝子配列にマッチしたか又は相補なオリゴヌクレオチドプライマーは、一本
鎖又は二本鎖核酸の鋳型依存性合成を促進することが可能なオリゴヌクレオチド
プライマーを意味する。遺伝子配列にマッチしたか又は相補なオリゴヌクレオチ
ドプライマーは、ＰＣＲｓ、ＲＴ−ＰＣＲ等において使用してよい。
【０１０１】 「コンセンサス遺伝子配列」は、２つ又はそれ以上の遺伝子配列の比較により
誘導され、そして遺伝子の所定のセグメントにもっとも存在するヌクレオチドを
記載する遺伝子配列を意味する；コンセンサス配列は標準の（ｃａｎｏｎｉｃａ
ｌ）配列である。「コンセンサス蛋白質」、「コンセンサスアミノ酸」、「コン
センサスペプチド」及びコンセンサスポリペプチド配列は、複数の生物又は蛋白
質間に共通の配列を意味する。
【０１０２】 用語「生物学上活性な」は、天然に生じる分子の構造上の機能、制御機能又は
生化学機能を有する蛋白質又は他の生物学上活性な分子（例えば、触媒性ＲＮＡ
）を意味する。同様に、「免疫学上活性な」は、天然、組換え又は合成の、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白
質又はそれらのあらゆるオリゴペプチド又はポリペプチドが、適切な動物又は細
胞において特定の免疫応答を誘導して特定の抗体と結合する能力を意味する。
【０１０３】 用語「アゴニスト」は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブ
ユニット又はアクセサリー蛋白質に結合したときに、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ
ホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質に変化を引き起こし
、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリ
ー蛋白質の活性を変調する分子を意味する。アゴニストは、蛋白質、核酸、糖質
、又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセ
サリー蛋白質に結合又は相互作用するあらゆる他の分子を含んでよい。
【０１０４】 用語「アンタゴニスト」又は「阻害剤」は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵
素又はホロ酵素サブユニットに結合した場合に、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ
酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質の生物活性又は免疫活性
をブロックするか又は変調させる分子を意味する。アンタゴニスト及び阻害剤は
、蛋白質、核酸、糖質、又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サ
ブユニット又はアクセサリー蛋白質に結合するか又は相互作用するあらゆる他の
分子を含んでよい。
【０１０５】 用語「変調する」は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユ
ニット又はアクセサリー蛋白質の変化又は変更を意味する。変調は、蛋白質活性
の増加又は減少、結合特性の変化、又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又は
ホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質の生物学上の特性、機能特性又は
免疫特性におけるあらゆる他の変化であってよい。
【０１０６】 用語「誘導体」は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニ
ット又はアクセサリー蛋白質をコードする核酸、又はコードされたＤＮＡポリメ
ラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質の化学
修飾を意味する。そのような修飾の例示は、水素の、アルキル、アシル又はアミ
ノ基による置き換えである。核酸誘導体は天然分子の必須の生物学上の特徴を保
持するポリペプチドをコードする。
【０１０７】 用語「サザンブロット（分析）」は、サイズに従いＤＮＡを分画するためのア
ガロース又はポリアクリルアミドゲル上のＤＮＡの分析、続くゲルから固相、例
えばニトロセルロース又はナイロン膜へのＤＮＡの移行を意味する。固定化され
たＤＮＡは次に標識されたプローブで釣り上げられることにより、使用されるプ
ローブに相補なＤＮＡ種を検出する。上記ＤＮＡは電気泳動前に制限酵素により
分割してよい。電気泳動後に、固相への移行前又は移行中に、ＤＮＡを部分的に
脱プリン化して変性してよい。サザンブロットは分子生物学者の標準の手段であ
る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ ９．３１−９．５８［１９８９］）。
【０１０８】 用語「ノーザンブロット（分析）」は、サイズに従いＲＮＡを分画するための
アガロース又はポリアクリルアミドゲル上のＲＮＡの分析、続くゲルから固相、
例えばニトロセルロース又はナイロン膜へのＲＮＡの移行を意味する。固定化さ
れたＲＮＡは次に標識されたプローブで釣り上げられることにより、使用される
プローブに相補なＲＮＡ種を検出する。ノーザンブロットは、分子生物学者の標
準の手段である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前記、ｐｐ ７．３９−７
．５２［１９８９］）。
【０１０９】 用語「ウエスタンブロット」又は「ウエスタン分析」は、ニトロセルロース又
は膜のような固相上に固定化された蛋白質の分析を意味する。蛋白質はアクリル
アミドゲル上を泳動されることにより分離され、そしてゲルから固相、例えばニ
トロセルロース又はナイロン膜への蛋白質の移行へと続く。固定化された蛋白質
は、次に、興味のある抗原に対して反応性を有する抗体に暴露される。抗体の結
合は、放射性標識抗体の使用を含む様々な方法により検出してよい。
【０１１０】 「免疫原性エピトープ」は、蛋白質が全体として免疫原である場合に、抗体応
答を顕在化させる蛋白質の一部として定義される。これらの免疫原性エピトープ
は、分子上の僅かな位置に限定されると信じられる。一方、抗体が結合できる蛋
白質分子の領域は「抗原性エピトープ」として定義される。蛋白質の多くの免疫
原性エピトープは抗原性エピトープの数よりも一般的に少ない。例えばＧｅｙｓ
ｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：
３９９８−４００２（１９８３）を参照。例えば、ＵＳＰＮ６，０１１，０１２
を参照。
【０１１１】 本明細書にて使用される用語「抗原決定基」は、特定の抗体へ接触させる抗原
の一部を意味する（即ち、エピトープ）。蛋白質又は蛋白質の断片を用いて宿主
動物を免疫する場合、蛋白質の多くの領域は蛋白質上の所定の領域又は３次元構
造に特異的に結合する抗体の生産を誘導するかもしれない；これらの領域又は構
造は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は抗体への結合に関して完全抗原（即ち
、免疫応答性を顕在化させるのに使用される「免疫原」）と競合するかもしれな
い。例えば、ＵＳＰＮ ６，０１１，０１２を参照。
【０１１２】 用語「特異的な結合」又は「特異的に結合」は、抗体と蛋白質又はペプチドの
相互作用に関して使用される場合、相互作用が蛋白質上の特定の構造（即ち、抗
原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する；換言すれば、一般
に、抗体は蛋白質よりむしろ特定の蛋白質構造を認識して結合する。例えば、抗
体がエピトープ「Ａ」に特異的であれば、標識された「Ａ」及び抗体を含む反応
におけるエピトープＡ（又はフリーの、非標識Ａ）を含む蛋白質の存在が抗体に
結合した標識Ａの量を減少させることになる。
【０１１３】 本明細書にて使用されるとおり、用語「細胞培養」は細胞のあらゆるインビト
ロ培養を意味する。この用語により含まれるのは、連続する細胞系（例えば、不
死の表現型）、初生細胞培養、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、及びイ
ンビトロで維持されたあらゆる他の細胞集団である。
【０１１４】 用語「試験ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素」及び「試験ホロ酵素サブユニ
ット」又は「試験蛋白質」は、それぞれ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又
はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質を含むと疑われるサンプルを意
味する。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアク
セサリー蛋白質の試験サンプル中の濃度は、様々な手段により測定してよく、そ
して「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセ
サリー蛋白質の定量された量」（即ち、公知の量のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホ
ロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質を含む陽性対照サンプ
ル）と比較することにより、サンプル中の試験ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵
素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質の濃度が野生型生物からの
サンプル内に見いだされる通常の範囲内か否かを決定してよい。
【０１１５】 本明細書にて使用される用語「微生物」又は「生物」は、肉眼で観察されない
程の小さな生物を意味し、限定ではないが、細菌、ウイルス、原生生物、真菌及
び繊毛虫を意味する。
【０１１６】 用語「微生物の遺伝子配列」は、微生物に由来する遺伝子配列を意味する。 用語「細菌」は、真正細菌及び古細菌種を含むあらゆる細菌種を意味する。 用語「ウイルス」は、自己複製可能な、偏性の、超顕微鏡的、細胞内の、寄生
体を意味する（即ち、複製は宿主細胞の機構の使用を必要とする）。 Ｂ．方法論 他に示さなければ、本明細書においてＤＮＡ配列を配列決定することにより決
定された全てのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機を用いて決定した
。様々な配列決定機が当業界において公知であり、例えばアプライドバイオシス
テムズ社のモデル３７３である。本明細書において決定されたＤＮＡ分子により
コードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、上記のとおりに決定されたＤＮＡ
配列の翻訳により予測された。あるいは、配列はポリペプチドを直接配列決定す
ることにより決定することができる。この自動化のアプローチにより決定される
ＤＮＡ配列に関して当業界において公知のとおり、本明細書において決定された
あらゆるヌクレオチド配列は幾つかのエラーを含むかもしれない。自動により決
定したヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配
列に対して、一般的には少なくとも約９０％同一、より一般的には少なくとも９
５％から９９％同一である。実際の配列は、当業界公知のマニュアルのＤＮＡ配
列決定法を含む他のアプローチにより、より正確に決定できる。当業界において
も知られているとおり、決定されたヌクレオチド配列中の単一の挿入又は欠失は
、実際の配列に比較された予測アミノ酸配列が、決定されたヌクレオチド配列に
よりコードされ、そのような挿入又は欠失の点から始まる配列決定された分子に
より実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なるように、ヌクレオチド配
列の翻訳のフレームシフトを引き起こす。例えば、ＵＳＰＮ ６，１７１，８１
６及び６，０４０，１５７を参照。
【０１１７】 「同一性」それ自体は、当業界においてよく認識された意味であり、公表され
た技術を用いて計算できる。（例えば、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＭＯＬＥ
ＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，編纂、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）；ＢＩＯＣＯ
ＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＥ ＰＲＯＪＥ
ＣＴＳ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，編纂、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，（１９９３）；ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＳＥ
ＱＵＥＮＣＥ ＤＡＴＡ，ＰＡＲＴ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ
Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，編纂、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒ
ｓｅｙ，（１９９４）；ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＩＮ ＭＯＬＥ
ＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８７）；及びＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＰＲ
ＩＭＥＲ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編纂、Ｍ
Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９１）を参照。）
２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の間の同一性を測定するための多
数の方法が存在するが、用語「同一性」は、当業者によく知られている（Ｃａｒ
ｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））。２つの配列の間の同一性又は類似性
を決定するために一般に採用される方法は、限定ではないが、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，編纂、Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，（１９９４）、及びＣａｒ
ｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８）に開示された方法を含む。ポリヌクレ
オチド又はポリペプチドを整列化する方法はコンピュータープログラムに体系化
されており、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８４）１２（１）
：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃ
ｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（
１９９０）），Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎ
ｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ
ｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅ
ｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｍｅｍａｔｉｃ
ｓ ２：４８２−４８（１９８１）の局所相同性計算式を用いる）を含む。ＵＳ
ＰＮ ６，０４０，１５７を参照。
【０１１８】 特定の態様において、発明のポリヌクレオチドは、配列番号：９、１６、２２
、３１、３６、６７、７１、７５及び８１又はそれらの相補配列からなる群から
選択される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％
、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一な配列の核酸を含む。
【０１１９】 その配列が例えば少なくとも９５％参照配列に同一な核酸を含むポリヌクレオ
チドは、上記核酸配列が参照配列に同一であるが、但し、上記核酸配列が参照配
列１００ヌクレオチドあたり５までの点変異を含んでよいことを意図する。言い
換えれば、参照核酸配列に少なくとも９５％同一の配列の核酸を得るためには、
参照配列中の５％までのヌクレオチドを欠失してよいか又は別のヌクレオチドで
置換されてよく、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの５％までのいくらかの
ヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこれらの変異は、参照ヌ
クレオチド配列の５’又は３’末端位置のいずれか又はそれら末端の間のどこか
で起きてよく、参照配列内のヌクレオチド間で個々にか又は参照配列内のひとつ
又は複数の連続する群の中に散在する。参照（質問）配列は、配列番号：９、１
６、２２、３１、３６、６７、７１、７５及び８１に示される全ヌクレオチド配
列の何れかひとつ、又はこれらの配列の何れかの断片であってよく、前記のとお
りである。ＵＳＰＮ６，０４０，１５７及び６，１７１，８１６を、例えば参照
されたい。
【０１２０】 実際の問題としては、何れかの特定の核酸分子が、例えば、配列番号：９、１
６、２２、３１、３６、６７、７１、７５及び８１に示されるヌクレオチド配列
に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるか
否かは、公知のコンピュータープログラム、例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム
（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ
，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａ
ｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７
１１）を使用して慣用的に決定できる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ
Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｍｅ
ｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８（１９８１）の局所相同性計算式を用いること
により、２つの配列間の最良の相同セグメントを発見する。Ｂｅｓｔｆｉｔ又は
他の配列整列化プログラムを用いて、特定の配列が、例えば本発明に従い参照配
列に少なくとも９５％同一であるか否かを決定する場合、もちろん、同一性のパ
ーセンテージが参照ヌクレオチド配列の完全長にわたり計算されるように、そし
て参照配列中のヌクレオチドの全数の５％までの相同におけるギャップが許容さ
れるように、パラメーター設定する。当業界公知の他の配列分析プログラムは、
パーセント同一性を測定するのに使用できる。ＵＳＰＮ６，０４０，１５７及び
６，１７１，８１６を参照。
【０１２１】 もちろん、遺伝子コードの縮重により、当業者は、配列番号：９、１６、２２
、３１、３６、６７、７１、７５及び８１に示されるヌクレオチド配列に対して
、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一な配列を有する多
数の核酸分子が、生物活性を有するポリペプチド又は蛋白質をコードすることに
なることを即座に認識する。事実、これらのヌクレオチド配列の縮重変異体は全
て同じポリペプチドをコードするから、これは比較アッセイを実施することさえ
無しに当業者には明らかである。当業界においては、縮重変異体ではないそのよ
うな核酸分子に関して、無理のない数が生物活性を有するポリペプチドをコード
することも、当業者には認識される。これは、蛋白質の機能に顕著に影響する可
能性が低いか又は無いアミノ酸置換を当業者は完全に承知しているからである（
例えば、一つの脂肪族アミノ酸の第二の脂肪族アミノ酸による置換）。ＵＳＰＮ
６，０１１，０１２；６，１７１，１８６；６，０４０，１５７を参照。
【０１２２】 本発明の一つの態様は、配列番号：９、１６、２２、３１、３６、６７、７１
、７５及び８１又はそれらの相補配列からなる群から選択される配列に対して、
少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％又は９９％同一な配列の核酸を含むポリヌクレオチドに向けられ、それ
らが機能性の活性を有するか否かは問わない。これは、特定のポリヌクレオチド
が機能活性をもたない場合でも、当業者は上記核酸を如何にして使用するのかを
知っているからであり、例えばハイブリダイゼーションプローブ、Ｓ１ヌクレア
ーゼマッピングプローブ又はポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）プライマーと
してである。
【０１２３】 好ましくは、しかしながら、本当に機能活性を有する蛋白質をコードする、配
列番号：９、１６、２２、３１、３６、６７、７１、７５及び８１又はそれらの
相補配列からなる群から選択される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、
９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一な配
列の核酸を含むポリヌクレオチドである。
【０１２４】 本発明は、さらに、ＤＮＡ ＩＩＩサブユニット及びアクセサリー蛋白質の一
部、類似体又は誘導体をコードする、本発明の核酸分子の変異体に関する。変異
体は、自然界の対立遺伝子変異体のように天然に生じてよい。「対立遺伝子」は
、生物の染色体上の所定の座を占有する遺伝子の幾つかの別の形態のひとつを意
図する。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編纂、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。
【０１２５】 非天然に生じる変異体は、当業界公知の変異導入技術を用いて生成してよい。
そのような変異体は、ヌクレオチドの置換、欠失又は付加により生じた変異体を
含んでよい。置換、欠失又は付加はひとつ又は複数のヌクレオチドを含んでよい
変異体は、コード領域、非コード領域又は両方を含んでよい。コード領域の変更
は、保存的又は非保存的なアミノ酸の置換、欠失又は付加を生じてよい。特定す
れば、とりわけ好ましいのは、サイレントな置換、欠失又は付加であり、ＤＮＡ
Ｐｏｌ ＩＩＩサブユニット及びアクセサリー蛋白質又はそれらの断片の特性
及び活性を変更しないものである。この点に関してまた特に好ましいのは、保存
的置換である。もっとも好ましいのは、配列番号：１０、１７、２３、３２、３
７、６８、７２、７６及び８２に示すアミノ酸配列を有する成熟蛋白質をコード
する核酸分子である。
【０１２６】 ポリペプチドの参照アミノ酸配列に例えば少なくとも５％同一なアミノ酸配列
を有するポリペプチドは、請求されたポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列に
同一であるが、但し、上記請求されたアミノ酸配列が参照配列１００アミノ酸あ
たり５アミノ酸までの変更を含んでよいことを意図する。言い換えれば、参照ア
ミノ酸配列に少なくとも９５％同一の配列のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の５％まで、参照アミノ酸配列の少
なくとも５％のアミノ酸残基が欠失してよいか又は別のアミノ酸で置換されてよ
く、あるいは参照配列中の全アミノ酸の全アミノ酸残基の５％までのいくらかの
アミノ酸が参照配列に挿入されてよい。参照配列のこれらの変異は、参照アミノ
酸配列のアミノ又はカルボキシル末端位置のいずれか又はそれら末端の間のどこ
かで起きてよく、参照配列内のアミノ酸間で個々にか又は参照配列内のひとつ又
は複数の連続する群の中に散在する。
【０１２７】 実際の問題としては、何れかの特定のポリペプチドが、例えば、配列番号：１
０、１７、２３、３２、３７、６８、７２、７６及び８２に示されるアミノ酸配
列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９
７％、９８％又は９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム
、例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ
（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖ
ｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）を使用して慣用的に決定できる。Ｂ
ｅｓｔｆｉｔ又は他の配列整列化プログラムを用いて特定の配列が、例えば本発
明に従い参照配列に少なくとも９５％同一であるか否かを決定する場合、もちろ
ん、同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の完全長にわたり計算されるよ
うに、そして参照配列中のアミノ酸の全数の５％までの相同におけるギャップが
許容されるように、パラメーター設定する。当業界公知の他の配列分析プログラ
ムは、パーセント同一性を測定するのに使用できる。ＵＳＰＮ６，０４０，１５
７及び６，１７１，８１６を参照。
【０１２８】 例えば、参照配列（質問配列、本発明の配列）と問題の配列の間の同一性は、
グローバル配列整列化とも呼ばれるが、Ｂｒｕｔｌａｇらの計算式に基づくＦＡ
ＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して測定される（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．
Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列
化において使用される好ましいパラメーターは：マトリックス＝ＰＡＭ ０、ｋ
−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、接合ペナルティ＝２０、ランダ
ム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ウインドウサイズ＝配列長、ギャ
ップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウインドウサイズ
＝５００又は問題のアミノ酸配列の長さの何れか短い方、である。この態様によ
ると、問題の配列が内部欠失ではなくＮ−又はＣ−末端欠損失のために質問配列
よりも短いなら、結果に対してマニュアルの補正がなされることにより、グロー
バルパーセント同一性を計算する際にＦＡＳＴＤＢプログラムが問題の配列のＮ
−及びＣ−末端削除を補償しないという事実を考慮する。Ｎ−及びＣ−末端削除
された問題の配列に関しては、質問配列に関して、質問配列の全塩基数のパーセ
ントとして、対応する問題残基に適合／整列化される問題配列のＮ−及びＣ−末
端である質問配列の残基の数を計算することにより、パーセント同一性を修正す
る。次に、このパーセンテージを、特定のパラメーターを用いて上記ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムにより計算されたパーセント同一性から引き、最終的なパーセント
同一性スコアに到達する。この最終的な同一性スコアは、この態様のために何が
使用されるかである。質問配列と適合しない／整列化されない、問題の配列のＮ
−及びＣ−末端の残基のみが、パーセント同一性スコアをマニュアルで調節する
ために考慮される。即ち、質問残基のみが、問題の配列のもっとも遠いＮ−及び
Ｃ−末端配列の外側に位置する。例えば、９０アミノ酸の問題の配列を１００残
基の質問配列と整列化することにより、パーセント同一性を測定する。問題の配
列のＮ−末端にて欠損がおこり、よって、ＦＡＳＴＤＢ整列化はＮ−末端におけ
る最初の１０残基の適合化／整列化を示さない。１０の不対残基は配列の１０％
に相当し（Ｎ−及びＣ−末端の非適合残基の数／質問配列中の全数）、そのため
ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセントスコアから１０％を差し引
く。残りの９０残基が完全に一致したら、最終的なパーセント同一性は９０％に
ある。別の例では、９０残基の問題の配列を１００残基の質問配列と比較する。
このとき、欠失は内部欠失であり、そのため問題の配列のＮ−及びＣ−末端には
質問配列と適合しない／整列化されない残基がない。この場合、ＦＡＳＴＤＢに
より計算されたパーセント同一性はマニュアルで修正されない。再び、ＦＡＳＴ
ＤＢ整列化により表示されるとおり、質問配列と適合しない／整列化されない、
問題の配列のＮ−及びＣ−末端の両エンドの外側の残基のみがマニュアルにより
修正される。例えば、ＵＳＰＮ６，０４０，１５７を参照。
【０１２９】 表現型上サイレントなアミノ酸置換を如何にして作るかのガイダンスは、Ｂｏ
ｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．，”Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓ
ａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｃｅ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔ
ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４７：１３０６−１３１０（１９９０）に適用され、著者らは、アミノ酸が変化
する寛容を研究するために２つの主なアプローチが存在することを示す。第１の
方法は、変異が自然選択により享受されるか拒絶されるかについて、進化のプロ
セスに依存する。第２のアプローチは、クローン化された遺伝子の特定の位置に
おいてアミノ酸の変更を導入するための遺伝子技術及び機能性を保持する配列を
同定するための選択又はスクリーンを使用する。著者らは、蛋白質の特定の位置
において許容されるらしいアミノ酸変化をさらに示す。例えば、もっとも覆い隠
されるアミノ酸残基は非極性鎖を必要とするが、表面の側鎖のほとんどの特徴は
通常保存されない。他のそのような表現型上サイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅ，
Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，前記に記載されており、当該文献は本明細書に引用され
る。ＵＳＰＮ６，０４０，１５７及び６，１７１，８１６を参照。
【０１３０】 発明のＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩサブユニットのポリペプチド及びアクセサリー
蛋白質は、断片又は融合蛋白質のような修飾された形態で発現してよく、そして
分泌シグナルのみならず付加的異種機能領域も含んでよい。例えば、追加のアミ
ノ酸、特に荷電したアミノ酸の領域をポリペプチドのＮ−末端に追加することに
より、精製の間、又は次の操作及び保存の間の宿主細胞中の安定性及び残留性を
改良してよい。あるいは、アミノ酸の領域をポリペプチドのＣ−末端に追加して
よい。Ｎ−末端結合したペプチド及びＣ−末端結合したペプチドを追加する方法
は当業界にて知られている。また、ペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）をポリペプチ
ドに追加することにより、精製を促進させてよい。そのような領域は、ポリペプ
チドの最終調製の前に除去してよい。分泌又は排泄を生じさせ、安定性を改善し
、そして精製を促進させるための、ペプチド部分のポリペプチドへの追加は、当
業界にて知られており、本明細書において発明の実施における使用のために意図
される。
【０１３１】 本発明は、抗−ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素及び抗−ホロ酵素サブユニ
ット及び抗−アクセサリー蛋白質の抗体の生成方法も提供し、免疫上コンピテン
トな細胞を有する動物を少なくともＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素（又はホ
ロ酵素サブユニット又はアクセサリー）蛋白質の抗原性部分（決定基）を含む免
疫原に対して免疫上コンピテントな細胞がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又
はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質の一部に対して向けられた抗体
を産生するような条件下で暴露することを含む。一つの態様において、上記の方
法は、さらに、抗体を回収する工程を含む。別の態様において、上記方法は、さ
らに、ハイブリドーマが生産される条件下で不死細胞に免疫上コンピテントな細
胞を融合させる工程を含む。
【０１３２】 上記方法発明に使用される抗体は、様々な免疫原を用いて作成してよい。一つ
の態様においては免疫原がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブ
ユニットペプチドであることにより、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホ
ロ酵素サブユニットを認識する抗体を生成させる。アクセサリー蛋白質に結合す
る抗体は、同一又は類似の方法を用いて調製する。そのような抗体は、限定では
ないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単一鎖、Ｆａｂ断片、及び
Ｆａｂ発現ライブラリーを含む。
【０１３３】 当業界公知の様々な手法を、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素
サブユニット又はアクセサリー蛋白質に対するポリクローナル抗体の生産に使用
してよい。抗体の生産のためには、様々な宿主動物をＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ
ホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質に相当するペプチド
で注射して免疫することができ、限定ではないが、ウサギ、マウス、ラット、ヤ
ギ、ヒツジ等を含む。好ましい態様において、上記ペプチドは免疫原担体（例え
ば、ジフテリア毒素、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はスカシガイヘモシア
ニン［ＫＬＨ］）に配合させる。様々なアジュバントを使用して免疫応答性を増
加させてよく、宿主種に依存し、限定ではないがフロイント（完全及び不完全）
、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリソレイイ
ン、プルロニックポリオール類ポリアニオン類、ペプチド類、オイルエマルジョ
ン類、スカシガイヘモシアニン、及びジニトロフェノールを含む。
【０１３４】 ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリ
ー蛋白質に対して向けられたモノクローナル抗体の製造のためには、培養におい
て連続細胞系により抗体分子の生産を提供するあらゆる技術を使用してよい（例
えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）
。これらは限定ではないが、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｈ
ｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７［
１９７５］）により最初に開発されたハイブリドーマ技術、並びに当業界公知の
他の技術を含む。
【０１３５】 発明によれば、単一鎖抗体の生産に関して記載された技術（米国特許４，９４
６，７７８；引用により本明細書に編入）は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵
素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質に特異的な単一鎖抗体を生
産するのに適合し得る。発明の追加の態様は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に
関して記載された技術を利用することにより（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１［１９８９］）、ＤＮＡポリメラーゼＩ
ＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質に望ましい特異
性を伴うモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にさせる。
【０１３６】 上記抗体分子のイディオタイプ（抗原結合領域）を含む抗体断片は公知の技術
により生成することができる。例えば、そのような断片は限定ではないが、抗体
分子のペプシン消化により生成され得るＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）断片
のジスルフィドブリッジを還元することにより生成され得るＦａｂ’断片、及び
パパイン及び還元剤を用いて抗体分子を処理することにより生成され得るＦａｂ
断片を含む。
【０１３７】 抗体の生産において、所望の抗体に関するスクリーニングは当業界公知の技術
により達成できる（例えば、免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ［酵素結合免疫収着剤ア
ッセイ］、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散プ
リシピチン反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ［金コロイド、
酵素又は放射性標識を例えば用いる］、ウエスタンブロット、沈殿アッセイ、凝
集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ等）、相補体固定化
アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセ
イ等）。
【０１３８】 一つの方法において、抗体の結合は一次抗体上で標識を検出することにより検
出される。別の方法においては、一次抗体は、一次抗体に対する二次抗体又は試
薬の結合を検出することにより、検出される。さらなる方法においては、二次抗
体を標識する。多くの手段が免疫アッセイにおいて結合を検出するために当業界
において知られており、本発明の範囲内である（当業界において知られていると
おり、免疫原性ペプチドは何れかの免疫化プロトコルにおいても使用される担体
分子を含まずに供給されるべきである。例えば、ペプチドをＫＬＨに配合するな
ら、スクリーニングアッセイにおいてはＢＳＡに配合させるか又は直接使用して
よい。）。
【０１３９】 前記の抗体は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット
又はアクセサリー蛋白質の局在及び構造に関して（ウエスタンブロッティングの
ため）、適切な生物学サンプル中のそのレベルを測定することに関して、当業界
公知の方法において使用することができる。生物学上のサンプルは、適切な戦略
（例えば、ＥＬＩＳＡ又は放射性免疫アッセイ）及びフォーマット（例えば、マ
イクロウエル、ディップスティック［例えば、国際特許公開ＷＯ９３／０３３６
７に記載されるとおり］）を用いて、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホ
ロ酵素サブユニット又はアクセサリー蛋白質の存在を直接に試験することができ
る。あるいは、サンプル中の蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在
又は不在下で、そして免疫ブロッティング（ウエスタンブロッティング）により
検出されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニットの存在
下で分離できる（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により
）。免疫ブロッティング技術は蛋白質のエピトープ又は抗原決定基に相当するペ
プチドに対して生成された抗体を用いると一般にはより効率よく、よって、特に
本発明には適している。
【０１４０】 本発明は、好熱性生物由来の単離されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サ
ブユニット及びアクセサリー蛋白質を提供する。好ましい態様において、上記好
熱性生物は好熱性生物である。好熱性生物はＴｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｔ
ｏｇａ属及びＡｑｕｉｆｅｘ属のメンバーから選択することができる。
【０１４１】 本発明は、完全長のポリペプチド又は蛋白質も提供する。上記発明は、あらゆ
るサイズの蛋白質並びに断片を提供する方法も提供する（即ち、蛋白質並びによ
り短いペプチドのの全アミノ酸配列）。プライマー及び遺伝子増幅技術を用いる
ことにより、興味のあるヌクレオチド領域をコードするヌクレオチド配列を増幅
し、連結に際してベクターへ、そして宿主細胞を形質転換し、そして興味のある
蛋白質又はペプチドの発現をもたらす。
【０１４２】 発明は、配列番号：（ｕｖｒＤヘリカーゼ）６８のアミノ酸配列に少なくとも
９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに向けられ
る。一つの態様において、上記ポリペプチドは配列番号：６８のアミノ酸配列を
有する。別の態様において、発明は、配列番号：（ｕｖｒＤヘリカーゼ）６８の
アミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子に向
けられる。別の態様において、単離されたポリヌクレオチド分子は配列番号：６
７の配列を有するヌクレオチド配列を含む。発明は、配列番号：（ｕｖｒＤヘリ
カーゼ）６８のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸を含
むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。発明
は、配列番号：（ｕｖｒＤヘリカーゼ）６８のアミノ酸配列に少なくとも９５％
の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含むベクターを含む宿主細胞も提供する。一つの態様において、上記ポリペ
プチドは好熱性生物由来のｕｖｒＤヘリカーゼである。別の態様において、上記
好熱性生物はＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである。
【０１４３】 発明は、配列番号：（ＤＮＡ−Ｇプライマーゼ）７２のアミノ酸配列に少なく
とも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドにも向
けられる。一つの態様において、上記ポリペプチドは配列番号：７２のアミノ酸
配列を有する。発明は、配列番号：（ＤＮＡ−Ｇプライマーゼ）７２のアミノ酸
配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
別の態様において、単離されたポリヌクレオチド分子は配列番号：７１の配列を
有するヌクレオチド配列を含む。発明は、配列番号：（ＤＮＡ−Ｇプライマーゼ
）７２のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸を含むポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。発明は、配
列番号：（ＤＮＡ−Ｇプライマーゼ）７２のアミノ酸配列に少なくとも９５％の
同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含むベクターを含む宿主細胞も提供する。発明は、上記ベクターを含む宿主細
胞も提供する。一つの態様において、上記単離されたポリペプチドは好熱性生物
由来のＤＮＡ Ｇプライマーゼである。別の態様において、上記好熱性生物はＴ
ｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである。
【０１４４】 発明は、配列番号：（ｐｒｉＡヘリカーゼ）７６のアミノ酸配列に少なくとも
９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドも提供する
。一つの態様において、上記ポリペプチドは配列番号：７６のアミノ酸配列を有
する。発明は、配列番号：（ｐｒｉＡヘリカーゼ）７６のアミノ酸配列に少なく
とも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子も提供する。一つの態様に
おいて、単離されたポリヌクレオチド分子は配列番号：７５の配列を有するヌク
レオチド配列を含む。発明は、配列番号：（ｐｒｉＡヘリカーゼ）７６のアミノ
酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。発明は、上記ベクターを含
む宿主細胞を提供する。一つの態様において、上記ポリペプチドは好熱性生物由
来のｐｒｉＡヘリカーゼである。別の態様において、上記好熱性生物はＴｈｅｒ
ｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである。
【０１４５】 発明は、配列番号：（デルタサブユニット）１０のアミノ酸配列に少なくとも
９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに向けられ
る。一つの態様において、上記ポリペプチドは配列番号：１０のアミノ酸配列を
有する。発明は、配列番号：（デルタサブユニット）１０のアミノ酸配列に少な
くとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子も提供する。別の態様に
おいて、単離されたポリヌクレオチド分子は配列番号：９の配列を有するヌクレ
オチド配列を含む。発明は、配列番号：（デルタサブユニット）１０のアミノ酸
配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。発明は、上記ベクターを含む
宿主細胞を提供する。一つの態様において、上記単離されたポリペプチドは好熱
性生物由来のデルタサブユニットである。一つの態様において、上記好熱性生物
はＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである。発明はさらに、配列番号
：（デルタサブユニット）１０のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有
するアミノ酸配列を含むポリペプチド上の少なくとも一つの抗原決定基に特異的
に結合する単離された抗体分子を提供する。
【０１４６】 発明は、配列番号：（デルタプライムサブユニット）１７のアミノ酸配列に少
なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを
提供する。一つの態様において、上記ポリペプチドは配列番号：１７のアミノ酸
配列を有する。発明は、配列番号：（デルタプライムサブユニット）１７のアミ
ノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子に向けら
れる。一つの態様において、単離されたポリヌクレオチド分子は配列番号：１６
の配列を有するヌクレオチド配列を含む。発明は、配列番号：（デルタプライム
サブユニット）１７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ
酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供する
。発明は、上記ベクターを含む宿主細胞も提供する。一つの態様において、上記
単離されたポリペプチドは好熱性生物由来のデルタサブユニットである。別の態
様において、上記好熱性生物はＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓであ
る。発明はさらに、配列番号：（デルタプライムサブユニット）１７のアミノ酸
配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド上の
少なくとも一つの抗原決定基に特異的に結合する単離された抗体分子を提供する
。
【０１４７】 発明は、配列番号：（ベータサブユニット）２３のアミノ酸配列に少なくとも
９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに向けられ
る。一つの態様において、上記ポリペプチドは配列番号：２３のアミノ酸配列を
有する。発明は、配列番号：（ベータサブユニット）２３のアミノ酸配列に少な
くとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子にも向けられる。一つの
態様において、単離されたポリヌクレオチド分子は配列番号：２２の配列を有す
るヌクレオチド配列を含む。発明は、配列番号：（ベータサブユニット）２３の
アミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。発明は、上記ベクタ
ーを含む宿主細胞も提供する。一つの態様において、上記単離されたポリペプチ
ドは好熱性生物由来のデルタサブユニットである。別の態様において、上記好熱
性生物はＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである。発明はさらに、配
列番号：（ベータサブユニット）２３のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一
性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド上の少なくとも一つの抗原決定基に
特異的に結合する単離された抗体分子を提供する。
【０１４８】 発明は、配列番号：（ｓｓｂ蛋白質）３２のアミノ酸配列に少なくとも９５％
の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに向けられる。一
つの態様において、上記ポリペプチドは配列番号：３２のアミノ酸配列を有する
。発明は、配列番号：（ｓｓｂ蛋白質）３２のアミノ酸配列に少なくとも９５％
の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含む単離されたポリヌクレオチド分子にも向けられる。一つの態様において
、単離されたポリヌクレオチド分子は配列番号：３１の配列を有するヌクレオチ
ド配列を含む。発明は、配列番号：（ｓｓｂ蛋白質）３２のアミノ酸配列に少な
くとも９５％の同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを含むベクターを提供する。発明は、上記ベクターを含む宿主細胞を
提供する。一つの態様において、上記単離されたポリペプチドは好熱性生物由来
のＳＳＢである。別の態様において、上記好熱性生物はＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓである。発明はさらに、配列番号：（ｓｓｂ蛋白質）のアミ
ノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
上の少なくとも一つの抗原決定基に特異的に結合する単離された抗体分子を提供
する。
【０１４９】 発明は、配列番号：（エプシロン−１，ｄｎａＱ−１）３７のアミノ酸配列に
少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド
に向けられる。一つの態様において、上記ポリペプチドは配列番号：２３のアミ
ノ酸配列を有する。別の態様において、発明は、配列番号：（エプシロン−１、
ｄｎａＱ−１）３７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ
酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリ
ヌクレオチド分子に向けられる。一つの態様において、単離されたポリヌクレオ
チド分子は配列番号：３６の配列を有するヌクレオチド配列を含む。発明は、配
列番号：（エプシロン−１、ｄｎａＱ−１）３７のアミノ酸配列に少なくとも９
５％の同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを含むベクターも提供する。発明は、さらに上記ベクターを含む宿主細胞も提
供する。一つの態様において、上記単離されたポリペプチドは好熱性生物由来の
エプシロン−１サブユニットである。別の態様において、上記好熱性生物はＴｈ
ｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである。発明はさらに、配列番号：（エ
プシロン−１、ｄｎａＱ−１）３７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性
を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド上の少なくとも一つの抗原決定基に特
異的に結合する単離された抗体分子を提供する。
【０１５０】 発明は、配列番号：（ｄｎａＱ−２）８２のアミノ酸配列に少なくとも９５％
の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに向けられる。一
つの態様において、上記ポリペプチドは配列番号：８２のアミノ酸配列を有する
。発明は、ｓａｒａｎｉ配列番号：（ｄｎａＱ−２）８２のアミノ酸配列に少な
くとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子に向けられる。一つの態
様において、単離されたポリヌクレオチド分子は配列番号：８１の配列を有する
ヌクレオチド配列を含む。発明は、配列番号：（エプシロン−２）８２のアミノ
酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを含むベクターに向けられる。発明は、上記ベクターを
含む宿主細胞にも向けられる。一つの態様において、上記単離されたポリペプチ
ドは好熱性生物由来のエプシロン−２サブユニットである。別の態様において、
上記好熱性生物はＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである。発明はさ
らに、配列番号：（エプシロン−２，ｄｎａＱ−２）８２のアミノ酸配列に少な
くとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド上の少なくとも
一つの抗原決定基に特異的に結合する単離された抗体分子を提供する。
【０１５１】 発明は、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを生産する方法に
向けられ、該ポリペプチドは配列番号：６８、７２、７６、１０、１７、２３、
３２、３７及び８２の一つのアミノ酸配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配
列を含み、上記ポリペプチドが発現されるような条件下で上記ヌクレオチド配列
を含む宿主細胞を培養し、そしてポリペプチドを回収することを含む。
【０１５２】 発明は、ひとつ又は複数のポリペプチドを利用することを含むＤＮＡ合成方法
にも向けられ、但し、上記ひとつ又は複数のポリペプチドは配列番号：６８、７
２、７６、１０、１７、２３、３２、３７及び８２からなる群から選択されるア
ミノ酸配列に少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一つの態様
において、上記方法はさらに、鋳型及びヌクレオチドを含む成分を含む反応混合
物を何れかの順序で提供し、そしてＤＮＡ合成を得るために十分な温度において
十分な長さの時間上記反応混合物をインキュベートすることを含む。上記方法の
別の態様において、該方法は、さらにＮ−末端結合ペプチド又はＣ−末端結合ペ
プチドを含む。
【０１５３】 精製されたＤｎａＱ−１蛋白質（エプシロンサブユニット１）及びＤｎａＱ−
２（エプシロンサブユニット２）がＰＣＲ及び高い忠実度のＤＮＡ合成が要求さ
れて望まれる他の応用において用途を見いだすことを意図する。上記の機構の理
解は本発明を使用するために必要ではないが、ＤｎａＱ−１蛋白質又はＤｎａＱ
−２蛋白質はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのαサブユニットに結合し、そしてそれ
と共に作用することにより、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩにより作られたエラーを
効率よく除去する。
【０１５４】 ＤｎａＱ−１又はＤｎａＱ−２がＰＣＲ及び他の増幅において付属物の校正ポ
リメラーゼに代わる用途を見いだすことも意図される。例えば、校正エキソヌク
レアーゼを欠くＤＮＡポリメラーゼを用いる増幅反応において化合される場合、
ＤｎａＱ−１又はＤｎａＱ−２はＰＣＲ産物内のミスマッチを除去できるため、
ＰＣＲ産物の伸長を促進することになる。即ち、本発明（ＤｎａＱ−１又はＤｎ
ａＱ−２）は、ロングレンジのＰＣＲ（例えば、５−５０ｋｂの標的を含むＰＣ
Ｒ）のような応用における用途を見いだすことが意図される。
【０１５５】 ＤｎａＮ蛋白質は、ｐｏｌ ＩＩＩがプロセッシブな（即ち、解離なしの長距
離の）増幅反応を触媒することを許容するβサブユニット（即ち、必須のサブユ
ニット）の精製における用途を見いだすことが意図される。ＤｎａＮは追加のサ
ブユニットの不在下で直鎖状鋳型上でｐｏｌ ＩＩＩのみ（例えば、α又はαプ
ラスβ）と共に有用であるか、又はＤＮａＸ複合体、並びに追加の蛋白質（例え
ば、一本鎖結合蛋白質、ヘリカーゼ、及び／又はアクセサリー因子）と共に使用
されることにより、極めて長いＰＣＲ反応を許容することができる。
【０１５６】 αサブユニット、βサブユニット、δサブユニット、δ’サブユニット、ε−
１サブユニット、ε−２サブユニット、γサブユニット、τサブユニット、ｓｓ
ｂ蛋白質、ｕｖｒＤ蛋白質、ｄｎａＧ蛋白質、及びｐｒｉＡ蛋白質が個別にか又
は組み合わせてＰＣＲ及び高い忠実度のＤＮＡ合成が要求されるか又は望まれる
他の応用、例えば極めて長いＰＣＲ反応（５−５０ｋｂの標的）において用途を
見いだすことが意図される。前記のＮ−末端及びＣ−末端結合サブユニット及び
蛋白質が個別にか又は組み合わせてＰＣＲ及び高い忠実度のＤＮＡ合成が要求さ
れるか又は望まれる他の応用、例えば極めて長いＰＣＲ反応（５−５０ｋｂの標
的）において用途を見いだすことが意図される。
【０１５７】 存在するＰＣＲ技術は相対的に非プロセッシブな修復様ＤＮＡポリメラーゼに
より制限される。本発明は、上昇温度において素早い複製及び高いプロセッシブ
特性が可能な好熱性レプリカーゼを提供する。本発明の組成物が多くの分子生物
学の応用において用途を見いだすことが意図され、現在の長さの制限を除き、ロ
ングレンジのＤＮＡ配列決定をし、そして高次二次構造によりＤＮＡを通して配
列決定することによるメガベースのＰＣＲ、並びに分子生物学における新しい技
術の前進を可能にすることを含む。
【０１５８】 本明細書にて引用された全ての特許及び刊行物はそれらの全体の引用により特
別に編入される。 実施例 以下の実施例は、本発明の特に好ましい態様及び側面を例示するために供給さ
れ、そしてそれらの範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１５９】 続く実験の開示においては、以下の略語を適用する：ｇ（グラム）；Ｌ（リッ
トル）；μｇ（マイクログラム）；ｍｌ（ミリリットル）；ｂｐ（塩基対）；℃
（摂氏温度）；ｋｂ又はＫＢ（キロベース）；ｋＤａ又はｋｄ（キロドルトン）
；ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）；ＤＴＴ（ジチオスレイトール）；
ＬＢ（ルリアブロス）；−ｍｅｒ（オリゴマー）；ＤＭＶ（ＤＭＶインターナシ
ョナル、フレイザー、ＮＹ）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；
ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＳＳＰＥ（２ｘ ＳＳＰＥが０．３６ｍ
ＭのＮａＣｌ．２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．４及び２０ｍＭのＥＤＴＡ，
ｐＨ７．４を含み；使用されるＳＳＰＥの濃度は変更してよい）；ＳＯＰ培地（
２０ｇ／ｌのトリプトン（ディフコ）、１０ｇ／ｌのイーストエキストラクト（
ディフコ）、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２．５ｇ／ｌのリン酸カリウム、二塩基酸（
フィッシャー）、１ｇ／ｌのＭｇＳＯ4・Ｈ2Ｏ（フィッシャー），ｐＨ７．２）
；ＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ，１ｍＭのＥＤＴＡ）；５０ｘＴＡＥ（
２４２ｇのＴｒｉｓ塩基、５７．１ｍｌの氷酢酸、１００ｍｌの０．０５ＭのＥ
ＤＴＡ ｐＨ８．０）；Ｂｌｏｔｔｏ（１０％スキムミルクをｄＨ2Ｏに溶解、
及び０．２％のアジ化ナトリウム）；ゲルローディング染料（０．２５％のブロ
ムフェノールブルー、０．２５％のキシレンシアノール、２５％のＦｉｃｏｌｌ
（タイプ４００）ｄＨ2Ｏ中）；プレ−ハイブリダイゼーションミックス（５０
％のホルムアミド、５Ｘ ＳＳＰＥ，１％のＳＤＳ、０．５％のＣＡＲＮＡＴＩ
ＯＮ（商標名）ノンファット乾燥ミルク、１０％のスキムミルク、０．２％のア
ジ化ナトリウム）；ＦＢＳ（胎児ウシ血清）；ＡＢＳ，Ｉｎｃ（ＡＢＳ社、ウイ
ルミントン、ＤＥ）；ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ（ジーンコード、アンアーバー、ＭＩ
）；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（ベーリンガーマンハイム、イン
ディアナポリス、ＩＮ）；Ｃｈａｍｐｉｏｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（チャンピ
オン工業、クリフトン、ＮＪ）；Ｅｎｚｙｃｏ（エンジコ社、デンバー、Ｃｏ）
；Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（フィッシャーサイエンティフィック、
フェアローン、ＮＪ）；ＦＭＣ（ＦＭＣ，ロックランド、メイン）；Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ（ギブコＢＲＬガイセルスベルグ、ＭＤ）；Ｈｙｃｌｏｎｅ（ハイクロ
ーン、ローガンＵＴ）；Ｉｎｔｅｒｍｏｕｎｔａｉｎ又はＩＳＣ（ＩＳＣバイオ
エクスプレス、バウンティフル、ユタ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジ
ェン、カールスバッド、ＣＡ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア、マルボロ、Ｍ
Ａ）；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＭＪリサーチ、ウオータータウン、ＭＡ）；Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（モリキュラープローブ、ユージーン、ＯＲ）
；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ナショナルダイアグノスティッ
クス、マンヴィル、ＮＪ）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ファルマシ
アバイオテック、ピスカタウエイ、ＮＪ）；Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ社、マジ
ソン、ＷＩ）；Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン、シャッツワース、ＣＡ）；Ｓｉｇｍａ
ＰＥ／ＡＢＩ（パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ部門、フォスタ
ーシティ、ＣＡ）；（シグマセントルイス、ＭＯ）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ス
トラタジーン、ラホヤ ＣＡ）；Ｔｅｃａｎ（テカン、リサーチトライアングル
パーク、ＮＣ）；Ｗｈａｔｍａｎ（ワットマン、メイドストーン、英国）；Ｌｏ
ｆｓｔｒａｎｄ Ｌａｂｓ（ロフストランドラブズ社、ガイセルスベルグ、メリ
ーランド）；及びＬＳＰ（ＬＳＰＩフィルトレーションプロダクツ、ライフサイ
エンスプロダクツ、デンバー、ＣＯ）；Ｉｒｖｉｎｅ（イルバインサイエンティ
フィック、イルバイン、ＣＡ）；及びＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ（ジャクソンラ
ブズ、バーハーバー、マイン）。
【０１６０】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに基づく分子量を蛋白質に関して報告する実施例におい
て、報告された分子量はおおよその値である。 実施例１ 最初のベクターの構築 ｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ−２の構築 プラスミドｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ−１は、引用により本明細書に編入される、
米国特許出願０９／１５１，８８８に記載された。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ遺伝子のいくつかの発現に有用なｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ−１プラスミドに関し
ては、修飾が必要であった。Ｃ−末端ビオチン標識の下流のＫｐｎＩ制限部位を
除去するため、ｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ−１プラスミドのＤＮＡを調製した。本実
施例及び以下に掲載された全てのプラスミドＤＮＡ調製物は、プロメガのＷｉｚ
ａｒｄ（登録商標）及びＷｉｚａｒｄ（登録商標）プラスＤＮＡ精製システムを
用いて、製造者の指示に従い精製した。ｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ−１のＤＮＡプラ
スミドをＫｐｎＩで消化した。その結果の３’及び５’の突出末端をクレノー断
片を用いて満たすことにより消し去り、そして１ｍＭのＡＴＰの存在下でＴ４
ＤＮＡリガーゼにより再び閉じた。プラスミドでＤＨ５αを形質転換し、そして
プラスミド含有コロニーをアンピシリン耐性に関して選択した。最初のベクター
の生育は、２ｘＹＴ培養培地（１６ｇ／Ｌバクト−トリプトン、１０ｇ／Ｌバク
ト−イーストエキストラクト、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）本実施例、次
のセクション）中である。これらのペプチド中のＫｐｎＩ部位の破壊は、ＤＮＡ
配列決定により確認した（ＡＴＧ ｓｅｑ．＃６３０−６３１；プライマーゼＰ
６４−Ａ２１５及びＰ３８−Ｓ５５７６）。ＫｐｎＩにより分割できなかった単
離物を含んだコロニーの一つを選択し、生育させ、そして中間体プラスミドｐＡ
１−ＣＢ−Ｃｌａ１（Ｋｐｎ-）（ＡＴＧグリセロールストック番号４２４）の
製造に使用した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホ
ロ酵素のサブユニットはＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。核酸（プラスミド）は多
くの手段により細菌細胞に導入してよく、塩化カルシウムによる処理又はエレク
トロポレーションによる形質転換のためにコンピテントに作成された細菌細胞の
形質転換を含む。形質転換技術の使用の総説は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）ｐｐ．１．７４−１．８４に提
供される。プラスミドをＤＨ５α細菌に導入するためにここで使用された戦略は
、以下の全ての形質転換反応においても使用される。
【０１６１】 プラスミドｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ１（Ｋｐｎ-）を制限エンドヌクレアーゼＣ
ｌａＩ及びＳｐｅＩにより消化することにより、制限部位：ＥａｇＩ，ＢａｍＨ
Ｉ，ＸｈｏＩ，ＸｂａｌＩ及びＤｒａＩＩＩを含むポリリンカーを除去した。２
つのオリゴヌクレオチド（ＡＴＧリンカー／アダプター ＃Ｐ６７−Ｓ１及びＰ
６７−Ａ１）をアニールさせて、アダプター／リンカー（以下に示す）（配列番
号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１）を作成した。
【０１６２】
【化１】 このアダプター／リンカーはＣｌａＩ及びＳｐｅＩ粘着末端を含むことにより
、プラスミドｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ１（Ｋｐｎ-）上に存在するこれらの制限部
位への挿入を可能にした。このアダプター／リンカーのＣｌａＩ／ＳｐｅＩ消化
したｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ１（Ｋｐｎ-）への導入は、制限部位ＣｌａＩ−スペ
ーサー−ＦｓｅＩ−ＮｈｅＩ ＫｐｎＩ−ＳｐｅＩを含む新規のポリリンカーを
作成し、そして新規プラスミドｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ２をもたらした。このプラ
スミドでＤＨ５αを形質転換し、そしてプラスミドを含むコロニーをアンピシリ
ン耐性に関して選択した。プラスミドを一つの陽性クローンから単離し、そして
挿入されたＤＮＡの配列をＤＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ ｓｅｑ．＃
６４９，プライマーＰ３８−Ｓ５５７６）。確認されたｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ２
プラスミドを含む単離物を生育させて、ストック培養液として保存した（ＡＴＧ
グリセロールストック＃４４０）。 ｐＡ１−ＣＢ−Ｎｃｏ−１の構築 ｐＡ１−ＣＢ−Ｎｃｏ−１を構築するため、ｐＤＲＫ−Ｃを最初に修飾した（
Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ ２７１，２０６９０−２０６９８を参照）。プラスミドｐＤＲＫＣ
のＤＮＡを調製してＫｐｎＩにより消化した。結果として生じる奥まった３’末
端及び突出した３’末端をクレノーにより平滑にし、そして該プラスミドを再び
閉じた。プラスミドでＤＨ５αを形質転換し、そしてプラスミドを含むコロニー
をアンピシリン耐性に関して選択した。該プラスミドを調製して、ＫｐｎＩ部位
の喪失に関して選択した。ＫｐｎＩで分割できなかったプラスミドを含む一つの
陽性コロニーを選択して、ＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ
ＳＥＱ ＃６２７及び６３２；プライマーＰ３８−Ｓ５５７６及びＰ６４−Ａ
２１５）。このプラスミドをｐＤＲＫ−Ｃ（Ｋｐｎ-）と命名し、そして単離物
をグリセロールストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃
４１４）。
【０１６３】 プラスミドｐＤＲＫ−Ｃ（Ｋｐｎ-）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ及び
ＳｐｅＩにより消化して、制限部位ＮｃｏＩ，ＥａｇＩ及びＤｒａＩＩＩを含む
ポリリンカーを除去した。２つのオリゴヌクレオチド（ＡＴＧリンカー／アダプ
ター＃Ｐ６３−１及びＰ６３−Ａ１）をアニールしてアダプターリンカーを作成
した（下に示す）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
【０１６４】
【化２】 このアダプター／リンカーはＸｂａＩ及びＳｐｅＩ粘着末端を含むことにより
、ｐＤＲＫ−Ｃ（Ｋｐｎ-）プラスミド上に存在する対応の制限部位への挿入を
可能にさせた。挿入された領域を含むプラスミドを再度閉じて、ＤＨ５αを形質
転換した。このアダプター／リンカーのｐＤＲＫ−Ｃ（Ｋｐｎ-）への導入は、
制限部位ＸｂａＩ−ＰａｃＩ−ＮｃｏＩ−スペーサー−ＫｐｎＩ−ＦｓｅＩ−Ｓ
ｐｅＩを含む新たなポリリンカーを作成した。その結果のアンピシリン耐性クロ
ーンをＫｐｎＩ制限部位の導入に関して選抜した（ｓｃｒｅｅｎｅｄ）。一つの
陽性クローンからのプラスミドを配列決定したところ、挿入されたリンカー／ア
ダプターの領域の正確な配列を有することが分かった（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃ ６
４６及び６４７；プライマーｐ３８−Ｓ５５７６及びＰ６５−Ａ１０６）。この
プラスミドｐＡ１−ＣＢ−Ｎｃｏ−１と命名した。この単離物を生育させて、ス
トック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃４３８）。 ｐＡ１−ＣＢ−Ｎｓｉ１の構築 ｐＡ１−ＣＢ−Ｎｓｉ１プラスミドを製造するため、ｐＡ１−ＣＢ−Ｎｃｏ−
１を制限エンドヌクレアーゼＰａｃＩ及びＫｐｎＩで消化することにより、制限
部位ＰａｃＩ−ＮｃｏＩ−スペーサー−ＫｐｎＩを含むポリリンカーを除去した
。２つのオリゴヌクレオチド（ＡＴＧリンカー／アダプター＃Ｐ６８−Ｓ１及び
Ｐ６８−Ａ１）をアニールして、アダプター／リンカー（下に示す）（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３）を作成した。
【０１６５】
【化３】 このアダプター／リンカーはＰａｃＩ及びＫｐｎＩ粘着末端を含むことにより
、対応するＰａｃＩ／ＫｐｎＩ消化ｐＡ１−ＣＢ−Ｎｃｏ−１プラスミドへの挿
入を可能にした。該プラスミドを再び閉じて、ＤＨ５αを形質転換した。このア
ダプター／リンカーのｐＡ１−ＣＢ−Ｎｃｏ−１の導入により、制限部位Ｘｂａ
Ｉ−ＰａｃＩ−ＮｓｉＩ−スペーサー−ＫｐｎＩ−スペーサー−ＦｓｅＩ−Ｓｐ
ｅＩを含む新規のポリリンカーを作成した。結果のクローンをアンピシリン耐性
に関して選択し、そして単離されたプラスミドをＮｓｉＩ制限部位の導入に関し
て選抜した。一つの陽性クローンからのプラスミドを配列決定したところ、挿入
されたリンカー／アダプターの領域を含む正確な配列を有することが分かった（
ＡＴＧ ＳＥＱ ＃６６３，プライマーＰ６５−Ａ１０６）。このプラスミドを
ｐＡ１−ＣＢ−Ｎｓｉ−１と命名し、そして単離物をストック培養液として保存
した（ＡＴＧグリセロールストック＃４４５）。 ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの構築 ｐＡ１−ＣＢ−Ｎｄｅ１プラスミドを製造するため、ｐＡ１−ＣＢ−Ｎｃｏ
−１をＮｄｅＩで消化した。突出をクレノー断片により平滑化することにより、
上記ポリリンカー領域の外側のＮｄｅＩ制限部位を破壊した。この直鎖状プラス
ミドを再び閉じて、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ（ＮｄｅＩ−）を作成した。このプ
ラスミドでＤＨ５αを形質転換し、プラスミドをその結果生じた一つのアンピシ
リン耐性コロニーから単離した。該プラスミドをＮｄｅＩ部位の損失に関して選
抜した。クレノー断片によりフィルインされた領域を配列決定することにより、
ＮｄｅＩ部位の損失を確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ６６１，プライマーＰ６５−
Ｓ２５２９）。ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ（ＮｄｅＩ−）をＰａｃＩ及びＳｐｅＩ
制限酵素により消化した。これにより、ＰａｃＩ−ＮｃｏＩ−スペーサー−Ｋｐ
ｎＩ−スペーサー−ＫｐｎＩ−スペーサー−ＦｓｅＩ−ＳｐｅＩ制限部位を含む
ポリリンカーを除去した。アニールしたＤＮＡ二重鎖又はアダプター／リンカー
（下に示す）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）はＰａｃＩ及びＳｐｅＩ粘着末端を含
み（ＡＴＧリンカー／アダプター＃Ｐ６５−Ｓ１及びＰ６５−Ａ１）、消化され
たｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ（ＮｄｅＩ−）プラスミドに挿入した。
【０１６６】
【化４】 このアダプター／リンカーのｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ（ＮｄｅＩ-）への導入
により、制限部位ＰａｃＩ−ＮｄｅＩ−スペーサー−ＮｈｅＩ−ＫｐｎＩ−Ｆｓ
ｅＩ−ＳｐｅＩを含む新規のポリリンカーを作成した。このプラスミドでＤＨ５
αを形質転換して、これらのプラスミドをその結果のアンピシリン耐性コロニー
から単離した。これらのプラスミドをＮｄｅＩ部位の導入に関して選抜した。挿
入された配列を含む領域をＤＮＡ配列決定に供することにより、正確な配列の挿
入を確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃７１８，プライマーＰ３８−Ｓ５５７６）。
このプラスミドをｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩと命名し、そして陽性単離物をストッ
ク培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃４６４）。 ｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ−２の構築 ｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ−２を構築するため、アミノ末端標識により蛋白質の
発現のためにデザインされたプラスミドであるＤＲＫ−Ｎ（Ｍ）を出発プラスミ
ドとして使用した。上記アミノ末端標識は、インビボにてビオチン化された３０
アミノ酸、ヘキサヒスチジン部位、及びトロンビン分割部位からなった（Ｋｉｍ
ａｎｄ ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２０６９０−
２０６９８［１９９６］を参照）。また、ｐＢＲ３２２の複製オリジン、ｌａｑ
ＩQリプレッサー蛋白質を発現する遺伝子、及びｌａｑＩQリプレッサーにより抑
制される半合成Ｅ．ｃｏｌｉプロモーター（ｐＡ１）が存在する。
【０１６７】 以下の２つのオリゴヌクレオチドを別々に合成してアニールすることにより、
粘着末端（ＡｖｒＩＩ及びＳａｌＩ）を有する二重鎖を作成し、そしてＡｖｒＩ
Ｉ／ＳａｌＩ消化したｐＤＲＫ−Ｎ（Ｍ）に挿入した。該リンカー／アダプター
は、２つのアニールされたオリゴヌクレオチドからなった（ＡＴＧリンカー／ア
ダプターＰ６４−Ｓ１及びＰ６４−Ａ１）（を下に示す）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：５）。
【０１６８】
【化５】 これらのアニールされたＤＮＡ断片のｐＤＲＫ−Ｎ（Ｍ）への挿入により、Ａ
ｖｒＩＩ−ＤｒａＩＩＩ−ＳａｌＩからＡｖｒＩＩ−スペーサー−ＫｐｎＩ−ス
ペーサー−ＦｓｅＩ−ＳｐｅＩ−ＳａｌＩへ、融合ペプチド後のポリリンカーが
変換された。これらのプラスミドでＤＨ５αを形質転換し、そしてその結果のア
ンピシリン耐性コロニーを上記リンカー／アダプターにより運ばれたＳｐｅＩ部
位を含んだプラスミドに関して選別した。一つの陽性クローンを選択して挿入さ
れた領域の配列をリンカー／アダプター領域を横切ってＤＮＡ配列決定した（Ａ
ＴＧ ＳＥＱ ＃６４８，プライマーＰ６４−Ａ２１５）。このプラスミドをｐ
Ａ１−ＮＢ−Ａｖｒ−２と命名し、そして単離物をグリセロールストック培養液
として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃４３９）。 ｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩの構築 ＡｖｒＩＩ−スペーサー−ＫｐｎＩ−スペーサー−ＦｓｅＩ−ＳｐｅＩ−Ｓａ
ｌＩを含むポリリンカーを制限部位ＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ−スペーサー−ＮｓｉＩ
−ＳａｃＩ−ＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−スペーサー−ＳｐｅＩを含むポリリン
カーに置き換えることにより、ｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ−２プラスミドを修飾して
、ｐＡ１−ＮＢ−Ｋｐｎ１を構築した。これは、ｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ−２のＰ
ｓｔＩ及びＳｐｅＩ制限酵素による消化及び以下に示すアニールされたＤＮＡ二
重鎖の挿入により達成した（ＡＴＧアダプター／リンカー＃Ｐ６４−Ｓ１及びＰ
６４−Ａ１）。アニールされた二重鎖ＤＮＡの末端はＰｓｔＩ−ＳｐｅＩ制限部
位に相当する粘着末端を形成した（下に示す）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）。
【０１６９】
【化６】 第１のスペーサーはＰｓｔＩ／ＮｓｉＩの二重消化を可能にし、そして最後の
スペーサーはＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩの二重消化を可能にした。該プラスミド
でＤＨ５α細菌を形質転換し、そしてアンピシリン耐性コロニーを、リンカー／
アダプターにより創製されたＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含んだプラスミドに関し
て選抜した。リンカー／アダプター領域のＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定により確
認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃６６２，プライマーＰ６４−Ａ２１５）。このプラ
スミドをｐＡ１−ＮＢ−Ｋｐｎ−１と命名し、そして単離物をグリセロールスト
ック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃４４６）。 ｐＡ１−ＮＢ−ＡｇｅＩの構築 ｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ−２プラスミドを修飾してｐＡ１−ＮＢ−ＡｇｅＩを構
築した。これは、制限部位ＰｓｔＩ−ＡｖｒＩＩ−ＫｐｎＩ−ＦｓｅＩ−Ｓｐｅ
Ｉを含んだｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ−２中のポリリンカーを、制限部位ＰｓｔＩ−
スペーサー−ＡｇｅＩ−ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩＩ−スペーサー−ＮｃｏＩ−Ｓｐ
ｅＩを含むポリリンカーに置き換えることにより、実施した。最初に、上記ポリ
リンカーの上流のＢａｍＨＩ部位を破壊した。これは、ｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ−
２をＢａｍＨＩで消化して、創製された粘着末端をクレノー断片の消化によりフ
ィルインすることにより達成した。上記ＤＮＡの平滑末端を再度閉じた。該プラ
スミドでＤＨ５αを形質転換し、そして陽性クローンをアンピシリン耐性に関し
て選択した。プラスミドを一つの陽性単離物から単離して、ＢａｍＨＩ制限部位
の損失により選抜した。ＢａｍＨＩ制限部位の損失はＤＮＡ配列決定により確認
した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１１７１，プライマーＰ６４−Ａ２１５）。このプラ
スミドをｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ（ＢａｍＨＩ）と命名し、そして陽性単離物をス
トック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃６８８）。
【０１７０】 ｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ２（ＢａｍＨＩ-）をＰｓｔＩ／ＳｐｅＩ制限酵素によ
り消化した。これにより、制限部位ＰｓｔＩ−ＡｒｖＩ−ＫｐｎＩ−ＦｓｅＩ−
ＳｐｅＩを含むポリリンカーを除去した。アニールされた二重鎖（ＡＴＧアダプ
ター／リンカー＃Ｐ１１６−Ｓ１及びＰ１１６−Ａ１）を、消化されたｐＡ１−
ＮＢ−Ａｖｒ２（ＢａｍＨＩ-）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）に挿入した。
【０１７１】
【化７】 上記のアニールされた二重鎖ＤＮＡの末端はＰｓｔＩ及びＳｐｅＩ制限部位に
相当する粘着末端を形成する。このプラスミドでＤＨ５αを形質転換し、そして
一つのクローンの生育から単離されたプラスミドを、ＡｇｅＩ，ＢａｍＨＩ，Ｓ
ａｃＩＩ及びＮｃｏＩ制限酵素による消化の可能性に関して選抜した。このプラ
スミドへの挿入領域の配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ
＃１１７６，プライマー＃６４−Ａ２１５）。このプラスミドをｐＡ１−ＮＢ
−ＡｇｅＩと命名し、そして陽性単離物をストック培養液として保存した（ＡＴ
Ｇグリセロールストック＃６９８）。 ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＣｌａＩの構築 うまく発現しなかったＥ．ｃｏｌｉ中においてＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
由来の天然蛋白質を発現させる試みにおいて、翻訳共役蛋白質として蛋白質を発
現させるために使用できるベクター系を構築した。プラスミド（ｐＴＡＣＣＣＡ
（ｐＴＣ９）は、Ｅ．ｃｏｌｉのＡＴＰ（ＣＴＰ）：ｔＲＮＡヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ（ＣＣＡ付加酵素と呼ぶ）をコードする遺伝子をｔａｃプロモ
ーター制御下に含む。この遺伝子は極めて高いレベルで発現される。この遺伝子
の全部を５’の１２コドン以外除去して、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎ
ａＥ遺伝子を、この残りの５’末端へ翻訳共役蛋白質としてカップリングするこ
とができた（ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥ）（下で考察される）。プラスミドｐＴＡ
Ｃ−ＣＣＣ−ＴＥから始めて、翻訳共役蛋白質として発現できる他の標的蛋白質
の挿入を可能にさせるポリリンカーを含むプラスミドを消化した。最初に、ｐＴ
ＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥをＮｓｉＩ及びＳｐｅＩにより消化した。ＮｓｉＩ制限部位
はＣＣＡ付加酵素の開始コドンの約３５ヌクレオチド下流であり、そしてＳｐｅ
Ｉ部位はＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＥ停止ＴＡＧの下流である。こ
れにより、完全なＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＥ（ＴＥ）遺伝子及び
ＴＥ遺伝子に対して５’末端にＣＣＡ付加酵素遺伝子を連結した領域を除去した
。次に、ＮｓｉＩ及びＳｐｅＩ粘着末端を含む、アニールされたＤＮＡ二重鎖（
下）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）（ＡＴＧアダプター／リンカー＃Ｐ１５２−Ｓ
Ｌ及びＰ１５２−ＡＬ）を、消化したｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥプラスミドに挿入
した。
【０１７２】
【化８】 このＤＮＡ二重鎖は、ＮｓｉＩ粘着末端の下流にリボソーム結合部位（ＲＢＳ
）「ＡＧＧＡＧＧ」（イタリック体）を含み、標的遺伝子の５’末端の挿入のた
めのＣｌａＩ制限部位（下線）へと続く。ＣｌａＩ制限部位は、リンカー領域を
含むＣＣＡ付加酵素遺伝子５’末端の翻訳を停止させるための「ｔａａ」停止の
「ｔ」を含む（下の場合）。アダプター／リンカーにより提供される付加された
配列（リボソーム結合部位及びＣｌａＩ制限部位を含む）は、コドンの維持がＣ
ＣＡ付加酵素遺伝子の５’末端から「ｔａａ」停止コドンまでがインフレームに
なるようなものである。本実施例及びこのテキストのその他においては、ＤＮＡ
の領域を他のＤＮＡ領域と「インフレーム」であるようにアドレスする場合、こ
れは、連続する蛋白質発現（翻訳）が「停止」コドンの遭遇なしに、従って蛋白
質の合成の停止が無いようにすることが可能なように２つの領域のコドンの維持
がなされる。停止の２番目の「ａ」は、標的の翻訳共役遺伝子の「ＡＴＧ」開始
コドンの１番目のヌクレオチドを形成するために使用され、ＣＣＡ付加酵素とは
フレームがずれる。上記アダプター／リンカーの残りは、制限部位ＣｌａＩ−ｔ
ａａ−スペーサー−ＡｇｅＩ−ＡｖｒＩＩ−ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩを含
むポリリンカーを含むことにより、標的遺伝子の挿入のために内部の制限部位又
は停止コドンの下流部位を適応させる。このプラスミドでＤＨ５αを形質転換し
、そしてプラスミドを含むコロニーをアンピシリン耐性に関して選択した。ひと
つの陽性コロニーを選択して、直鎖断片（５．５ｋｂ）をもたらす１カ所の切断
を生じるＮｓｉＩ，ＣｌａＩ及びＳｐｅＩで消化することにより、単離されたプ
ラスミドを選抜した。このプラスミドの中の挿入された領域の配列はＤＮＡ配列
決定により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１６１７，プライマー＃Ｐ１４４−Ｓ
２３）。このプラスミドをｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＣｌａＩと命名し、そして陽性単
離物を成育させて、ストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストッ
ク＃９８０）。
【０１７３】 標的遺伝子はフォワード／センスプライマーがＡＴＣＧＡＴＡａｔｇ．．．． ．．． を含むようにＰＣＲを用いて増幅する。下線の配列は標的の５’末端に相
補にし、一方、上の場合は非相補であって、ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＣｌａＩへの挿
入のために必要なＣｌａＩ部位を含む。ＣｌａＩ部位の隣りは停止コドンの５’
ＴＡである。「ａ」（イタリック体）は停止「ＴＡａ」の最後の「ａ」に対応し
、そしてオーバーラップする開始「ａｔｇ」の「ａ」でもある。リバース／アン
チセンスプライマーは上記ポリリンカー内の制限部位の一つを含むことにより、
標的遺伝子の３’末端のｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＣｌａＩへの挿入を可能にしなけれ
ばならない。翻訳共役の機構は、高発現蛋白質（ＣＣＡ付加酵素）のメッセージ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を部分的に翻訳して次にリボソームが未熟な（ｐｒｅｍ
ａｔｕｒｅ）停止コドンに遭遇することである。挿入されたＲＢＳは、リボソー
ムが新たな開始コドンを認識して標的蛋白質を翻訳続行させるまで、ｍＲＮＡか
らのリボソームの遊離を阻害する。我々の仮説は、リボソームＲＮＡのヘリカー
ゼ活性がＧＣリッチなＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ配列中の二次構造を破壊す
ることにより、より効率の良い翻訳開始を可能にさせることである。
【０１７４】 実施例２ ｐＡ１−ＮＢ−ＴＥ／ＭＧＣ１０３０によるヘキサヒスチジン 及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドへ融合されたＴ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αサブユニットの発現の証明 米国特許出願第０９／１５１，８８８号において、ＴｔｈのｄｎａＥ遺伝子の
ｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ−２へのクローン化及びＭＧＣ１０３０の形質転換が記載
された。ｄｎａＥ遺伝子のこのベクターへの挿入は、αサブユニットがＮ−末端
標識化蛋白質として発現されるのを可能にする。発現の証明は以下に記載される
。
【０１７５】 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＥでＭＣ１０３０ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌（ｍｃｒＡ，ｍｃｒＢ
，ｌａｍＢＤＡ（−）（ＲＲＮＤ−ＲＲＮＥ）１，ｌｅｘＡ３）（ＡＴＧグリセ
ロールストック＃９３８）及びＡＰ１．Ｌ１ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＧグリセロー
ルストック９３９）を形質転換した。ＡＰ１．Ｌ１細菌株に対する親は、Ｎｏｖ
ａｇｅｎのＢＬＲ細菌株［Ｆ−，ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ− ｍＢ−）ｇａ
ｌ ｄｃｍ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０］であった。このＢＬＲ株
のＴ１ファージ−耐性バージョンはＡＰ１．Ｌ１と命名した。アンピシリン耐性
により選択された形質転換細胞の単一のコロニー（各形質転換体から３コロニー
）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌの２ｘＹＴ培養培地へ接種し
、そして撹拌インキュベーター中で３７℃において一晩生育させた。朝に、一晩
生育からの濃い培養液０．５ｍｌを１．５ｍｌの新鮮な２ｘＹＴ培養培地に接種
した。培養液を１時間３７℃において撹拌しながら生育させ、発現は最終濃度１
ｍＭまでのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加
により誘導した。細胞を誘導３時間後に遠心分離により回収した。細胞沈殿物を
直後に１／１０培養容量の２ｘレムリサンプルバッファー（２ｘ溶液：１２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），２０％グリセロール、４％ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）、５％β−メルカプトエタノール、及び０．００５％ブロ
ムフェノールブルー ｗ／ｖ）に再懸濁し、そして音波処理により細胞を完全溶
解して、ＤＮＡを剪断した。サンプルを１０分間９０−１００℃において加熱し
、そして遠心分離により不溶性残渣を除去した。細胞蛋白質を含む少アリコート
の各上清（３μｌ）を４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏ
ｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒ
ｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。ミニゲ
ルをクマジーブルーで染色した。ギブコの１０ｋＤａ蛋白質ラダーの１２０ｋＤ
ａ分子量標準のすぐ上を移動する蛋白質が明確な蛋白質バンドとして検出できた
が、誘導しなかった対照においては観察されなかった。この蛋白質バンドは、Ｎ
−末端融合蛋白質に融合させたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαサブユニット
の予測された分子量（１４１ｋＤａ）に相当する。
【０１７６】 次に、各溶解物の中の全蛋白質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロー
スに移した（ブロットした）。Ｎｏｖｅｘ転写装置を用いて、３０Ｖ定圧にて１
２ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、９６ｍＭグリシン、０．０１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、及び
２０％メタノール（ｖ／ｖ）中で６０分間室温にて、各溶解物の中の全蛋白質を
ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースに移した（ブロットした）。膜は
、５％ノンファットドライミルク（ｗ／ｖ）を含む０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ
／ｖ）−ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）（ｔｒｉｓ−緩衝塩溶液；８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ，０
．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ，３ｇ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））中で、１時
間室温においてブロックした。ブロットされたニトロセルロースは、次にＴＢＳ
Ｔ洗浄し、そして次にＴＢＳＴ中の２μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ複合
ストレプトアビジン（ピアスケミカルズ社＃２１３２４）中で１時間室温におい
てインキュベートした。大規模のＴＢＳＴによる洗浄の後に、ブロットをＢＣＩ
Ｐ／ＮＢＴ（ＫＰＬ ＃５０−８１−０７；一成分系）により展開した。内在の
Ｅ．ｃｏｌｉビオチン−カルボキシル担体蛋白質（ビオチン−ＣＣＰ）約２０ｋ
Ｄａが誘導及び非誘導サンプルの両方において検出された。αに相当する極めて
強い蛋白質バンドがギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの１４０ｋＤａ分子量標準の
上を移動した。この蛋白質は誘導された培養物の中では明確なバンドとして観察
されたが、非誘導対照においては観察されなかった。
【０１７７】 細胞を溶解し、全細胞蛋白質を得て、そしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動及びビオチンブロット分析において蛋白質を分析することを含む、蛋白
質発現を評価するための本明細書に記載された手法は、天然の標識された蛋白質
の発現を評価するための以下の全ての手法において使用されることになる。本実
施例及び以下の全ての蛋白質濃度は、ピアスのクマジープロテインアッセイ試薬
及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として使用して測定される。 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＥ／ＭＧＣ１０３０の大規模生育 株ｐＡ１−ＮＢ−ＴＥ／ＭＧＣ１０３０を２５０Ｌの発酵機にて生育させて、
「ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥによる天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｎａＥ
（αサブユニット）の大規模な生育」と題されたセクションにおいて記載された
とおりに、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαの精製のために細胞を生成した。
細胞の回収を誘導の３時間後に７．２のＯＤ600にて開始し、そして回収の間は
１０℃に冷やした。回収容量は１７５Ｌであり、そして最終回収重量は約２．４
７ｋｇの細胞ペーストであった。等量の（ｗ／ｗ）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７
．５）及び１０％の蔗糖溶液を細胞ペーストに加えた。質に関するコントロール
の結果（Ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｓｕｌｔｓ）は、接種中におい
てアンピシリン含有培地上で１０の陽性コロニー中１０を示し、そして回収中で
１０／１０陽性コロニーを示した。細胞懸濁液を液体窒素に注ぐことにより細胞
を凍らせて、処理前まで−２０℃において保存した。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの精製 発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαサブユニットを含む細胞のスフ
ェロプラストの創製により溶解を達成した。最初に、−２０℃に凍らせておいた
Ｔｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞（３００ｇ細胞）の１：１懸濁液６００ｇから、Ｆ
ｒＩを調製した（８７５ｍｌ，２１．６ｍｇ／ｍｌ）。上記調製物は、「翻訳共
役蛋白質として発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαサブユニットの硫
酸アンモニウム沈殿条件の決定」と題されるセクションに記載されたとおりであ
った。Ｆｒ Ｉに、硫酸アンモニウム（各初期ｍｌ画分Ｉ−４５％飽和まで０．
２５８ｇ）を１５分間隔で加えた。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌し
、そして沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ ｘ ｇ，４５分、０
℃）。結果の沈殿物はすぐに液体窒素に浸すことにより素早く凍結させて、−８
０℃において保存した。
【０１７８】 Ｆｒ Ｉからの沈殿物を９０ｍｌのＮｉ++−ＮＴＡ懸濁バッファーに懸濁して
、ダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジェナイザーによりホモジェナイズした。サン
プルは遠心分離（１６，０００ ｘ ｇ）により透明にし、そして上清をＦｒ
ＩＩ（９８ｍｌ，２５ｍｇ／ｍｌ）とした。Ｆｒ ＩＩをＮｉ−ＮＴＡ樹脂の５
０％スラリー５０ｍｌに加え、そして１．５時間４℃において振盪した。このス
ラリーを次にバイオラッドＥｃｏｎｏ−カラム（２．５ ｘ ５ｃｍ）上に負荷
した。該カラムを２５０ｍｌのＮｉ++−ＮＴＡ洗浄バッファーで０．５ｍｌ／分
の流速にて洗浄した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αは１０−２００ｍＭイ
ミダゾール勾配を含むＮｉ++−ＮＴＡ溶出バッファー１５０ｍｌに溶出した。溶
出物は８０ ｘ ２ｍｌに集めた（図１）。画分３０−５０を保存し（図１参照
）、そしてＦｒＩＩＩとした（６３ｍｌ，２ｍｇ／ｍｌ）。 翻訳共役蛋白質としてＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαサブユニットを過剰発
現するプラスミド（ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥ）の構築 前の特許出願（米国出願＃０９／１５１８８８）において、αサブユニットを
発現するＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＥ遺伝子（ＴＥ）をｐＡ１−Ｃ
Ｂ−ＮｃｏＩにクローン化して、ｐＡ１−ＴＥをもたらした。このプラスミドは
αサブユニットの天然形態を発現するようにデザインされたが、αサブユニット
の収量は極めて低かった（前で論じたとおり）。天然のαサブユニットの発現レ
ベルを増加させるための試みにおいて、ベクターをデザインして、翻訳共役蛋白
質としてαサブユニットを発現させた。上流の高発現蛋白質との翻訳共役を用い
ることにより、ＢＣリッチのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｎａＥのｍＲＮ
Ａ中に存在する強固な二次構造を破壊し、より効率のよい翻訳開始及び高いレベ
ルのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ発現を可能にする。出発のプラスミドはｐＴ
ＡＣＣＣＡ（ｐＴＣ９）であり、そしてｐＴＡＣプロモーター制御下にＣＣＡ付
加酵素を含んだ。このプラスミドは、ＣＣＡ付加酵素を高いレベルで発現する。
上記戦略は、ｐＴＡＣＣＣＡプラスミドをＮｓｉＩ及びＫｐｎＩで消化すること
により５’−１２コドンのみを残してＣＣＡ付加酵素のほとんどを除去するため
であった。ＮｓｉＩ制限部位はＣＣＡ付加酵素のＡＴＧ開始部位の下流約１２コ
ドンであり、そしてＫｐｎＩ制限部位は上記停止コドンの下流である。
【０１７９】 ＴＥ遺伝子をＣＣＡ付加酵素の後ろに挿入し、そして２段階で翻訳共役させた
。第１に、ＴＥ遺伝子の５’末端をｐＡ１−ＴＥを鋳型として用いてポリメラー
ゼチェイン反応（ＰＣＲ）により増幅した。フォワードプライマー（ＡＴＧプラ
イマー＃Ｐ６９−Ｓ５４１）を下に示す。
【０１８０】
【化９】 上記プライマーの非相補部分を上部の場合として示し、そして該遺伝子の５’
末端に相補なプライマーの部分を下部の場合として示す。 ＮｓｉＩ部位（Ａ ＴＧＣＡＴ ）及びＣｌａＩ部位（ＡＴＣＧＡＴ）を下線を引いたイタリック体に
て示す。ＲＢＳ（ＡＧＧＡＧＧ）を下線を引いて示す。ＲＢＳとＣｌａＩ制限部
位は共にＣＡＡ付加酵素に関する構造遺伝子とインフレームのコドンを維持する
。プライマー「ＴＡ」の非相補部分の最後の２つのヌクレオチド及びプライマー
「ａ」の相補部分の最初のヌクレオチドは、未熟停止コドンを、ＣＣＡ付加酵素
の５’末端とインフレームにて形成する。「ａ」はＴＥ遺伝子の「ａｔｇ」開始
コドンの最初のヌクレオチドでもある。これは互いに関してフレームを外れたＣ
ＣＡ付加酵素遺伝子及びＴＥ遺伝子を置き換える。リバースプライマーの配列（
５’−ＣＧＧＣＴＣＧＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＣＡＧＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２１）（ＡＴＧプライマー＃Ｐ６９−Ａ９７１）は、開始「ＡＴＧ」コド
ンの約３１６ｂｐ下流に位置する唯一のＫｐｎＩ部位のちょうど下流の領域に相
補である。
【０１８１】 前の段落に記載されたフォワードプライマー及びリバースプライマーよりもた
らされるＰＣＲ産物（４３０塩基対の長さ）はＮｓｉＩとＫｐｎＩにより切断さ
れて、３５０ｂｐの断片を生じて、ＮｓｉＩ／ＫｐｎＩで消化されたｐＴＡＣＣ
ＣＡプラスミドに挿入された。これらの２つの酵素でｐＴＡＣＣＣＡプラスミド
を切断することにより、ＣＡＡ付加酵素遺伝子並びに６００ｂｐの停止コドン下
流配列のＣ−末端（３’）の計算上９５％が除去された。結果のプラスミドでＤ
Ｈ５αを形質転換して、陽性単離物をアンピシリン耐性に関して選択した。一つ
の陽性単離物から単離されたプラスミドが、ＮｓｉＩとＫｐｎＩによる消化によ
り証明された（予測された０．３５及び５．３ｋｂの断片を生じる）。挿入物の
配列はＤＮＡ配列決定により確認された（それぞれ、ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１５１
２及び１５１３、プライマー＃Ｐ１４４−Ｓ２３及びＰ１４４−Ａ１９６５）。
このプラスミドをｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥｍｐと命名し、単離物をグリセロール
ストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃８９８）。
【０１８２】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＥ遺伝子の残りを構築するため、ｐＡ
１−ＴＥプラスミドを制限酵素ＫｐｎＩとＳａｌＩで消化した。ＳａｌＩ制限部
位はＴＥ遺伝子の末端の約２５４ｂｐ下流である。それはＣ−末端ビオチン−ヘ
キサヒスチジン融合ペプチドの下流にも位置する。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓのｄｎａＥ遺伝子のＣ−末端（３）９５％を包含するその結果の３６０１塩基
対のＫｐｎＩ−ＳａｌＩ断片を、ＫｐｎＩ／ＳａｌＩ消化したｐＴＡＣ−ＣＣＡ
−ＴＥｍｐプラスミドに挿入した。プラスミドを連結し、ＤＨ５αを形質転換し
、そして陽性単離物をアンピシリン耐性に関して選択した。一つの陽性単離物か
ら単離されたプラスミドをＫｐｎＩとＳａｌＩ制限酵素による消化により証明し
た（予測された３．６及び５．６ｋｂの断片を生じる）。挿入物の配列はＤＮＡ
配列決定により確認した（それぞれ、ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１５５０及び＃１５５
１，プライマー＃Ｐ１４４−Ｓ２３及びＰ１４４−Ａ１９６５）。このプラスミ
ドをｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥと命名し、そして単離物ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥ／
ＤＨ５αをグリセロールストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールス
トック＃９３３）。 ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥによる翻訳共役蛋白質としての天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ ｄｎａＥ遺伝子（αサブユニット）の発現の証明 ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥプラスミドでＭＧＣ１０３０（ＡＴＧグリセロールス
トック＃９３８）及びＡＰ１．Ｌ１ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＧグリセロールストッ
ク＃９３９）を形質転換した。上記のとおり、各形質転換体からの３つの単離物
を生育させて、全蛋白質を単離した。各上清のアリコート（３μｌ）を、２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ ＳＤＳ中の４−２０％
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚
、１５ウエル／ゲル）中の電気泳動に供した。その結果のゲルをクマジーブリリ
アントブルーで染色した。ギブコの１０ｋＤａ蛋白質ラダーの１２０ｋＤａの分
子量標準スタンダードのわずかに上を移動するＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１
細菌調製物の両方からの特有な蛋白質バンドが、誘導された培養物において特有
なバンドとして観察されたが、非誘導対照においては観察されなかった。これら
の蛋白質は、天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αに関して予測された分子量
（１３７．５ｋＤａ）に一致すると決定された。検出された蛋白質は、ゲル上の
蛋白質バンドのクマジーブリリアントブルーの強度に基づくと、全Ｅ．ｃｏｌｉ
蛋白質の約５％を表した。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ蛋白質発現の最適化 発現された組換えＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ蛋白質の収量を最適化するた
めの試みにおいて、誘導時間を各新規蛋白質に関して分析した。Ｆ−培地（バク
トイーストエキストラクト、１４ｇ／Ｌ，バクトトリプトン、８ｇ／Ｌ，リン酸
１水素２カリウム、１２ｇ／Ｌ，リン酸２水素１カリウム、１．２ｇ／Ｌ（ｐＨ
７．２），１％グルコース）を生育培地として使用する。アンピシリンを含む少
量のＦ−培地（１０−２０ｍｌ）に標的細菌を接種して、撹拌しながら一晩３７
℃において生育させた。この一晩の生育を使用して、予め３７℃に温めた新鮮な
アンピシリン含有Ｆ−培地に接種する。この新鮮な培地は一晩生育させた培養物
を使用して２０：１の比で接種する。これは、誘導前の３−４倍に細胞密度を倍
増させるのに十分な時間を与える。新たに接種された培養物をＯＤ600＝０．６
−０．８に生育させ（最適な密度のＯＤ600は溶液中の細胞密度を計算すること
において６００ナノメーターにおける溶液中の細胞により散乱される光を測定す
るために使用される）、そして発現を１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘導する。
誘導のときに、ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位含有蛋白質に、ｄ−ビオチ
ンを最終濃度１０μＭにて加える。対照の培養物はｄ−ビオチンのみを摂取させ
た――それらはＩＰＴＧで誘導しなかった。
【０１８３】 培養物と等量のサンプル容量（５ｍｌ）を誘導のときに回収し、そして誘導後
は誘導後５時間まで毎時間最適生育時間を測定するため分析した。ＯＤ600を各
サンプルに関して測定した。回収されたサンプルをフィッシャーセントリフィッ
クモデル２２８（１３８０ ｘ ｇ）中で１０分間遠心分離した。上清を捨てて
、細胞沈殿物を分析のために残した。各サンプル中の全蛋白質の濃度を等しく保
つため、５０μｌのレムリ溶解バッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（
ｐＨ６．８），２０％グリセロール、５％ ＳＤＳ）を、サンプル容量（５ｍｌ
）を掛けた各サンプルのＯＤ600あたり加えた。細胞沈殿物を再懸濁し、そして
９０−１００℃にて１０分間加熱する。サンプルを最大のｒｐｍ（１６，０００
ｘ ｇ）にて１０分間、テーブルトップ遠心分離管中で遠心分離して、そして
上清を残す。各上清（５μｌ）中の全細胞蛋白質を含む少量のアリコートを、２
５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ ＳＤＳ中の１０％
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１６ ｘ １８ ｘ ０．７５ｃｍ）に負荷
する。ゲルを２時間２５ボルトにおいて電気泳動する。ゲルをクマジーブルーで
染色するか又は（ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位含有蛋白質に関して）ニ
トロセルロースに転写して、ビオチンブロット分析により分析する。ビオチンブ
ロット分析は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜に転写
された蛋白質及びビオチン化部位を含むＮ−又はＣ−末端ペプチドに結合したビ
オチンにより検出された蛋白質に適用するように使用される。通常のように生育
する細胞においては、ビオチン化部位を含む特定のパーセンテージの蛋白質をビ
オチンにより結合した。これらの蛋白質の検出は、融合蛋白質へ結合したビオチ
ンに結合するアビジンによる。アルカリホスファターゼ配合ストレプトアビジン
（ピアスケミカルズ社、＃２１３２４）を使用し、そしてアルカリホスファター
ゼを許容する化学試薬を使用して検出でき、それにより興味のある蛋白質が可視
化される。 ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥによるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＥ遺伝子
（αサブユニット）の発現の最適化 予備実験において、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαはＡＰ１．Ｌ１株にお
いてより高いレベルで合成されるらしい。よって、ＡＰ１．Ｌ１中に保有される
ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥからのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの発現のための最
適な誘導時間を分析した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαの収量を、「Ｔ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ蛋白質発現の最適収量」のセクションにて上で記載さ
れるとおりに１、２、３、４、及び５時間の誘導時間で分析した。Ｔ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓのαの最適収量は誘導３時間後に達成した；この誘導時間は次
の実験において使用した（図２）。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαサブユニット活性の測定のためのギャップフ
ィリングアッセイ 複製型複合体の触媒サブユニットはプライムされた鋳型上において他のホロ酵
素サブユニットの不在下で極めて低いプロセッシビティしか有さない。しかしな
がら、触媒サブユニットは、低塩条件において素早い対合及び解離反応により極
めて効率よくヌクレアーゼ活性化（ギャップの入った）ＤＮＡのギャップを埋め
ることができる（下参照）（ＭｃＨｅｎｒｙ ａｎｄ Ｃｒｏｗ（１９７９），
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４，１７４８−１７５３）。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓのαサブユニットの別の精製工程における活性のアッセイを可能に
するため、ギャップフィリングアッセイを使用した。
【０１８４】 アッセイ混合物（２５μｌ）は、３２ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５），１３
％のグリセロール、０．０１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，０．１３ ｍｇ／ｍ
ｌのＢＳＡ，１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２ｍｇ／ｍｌの活性化子ウシ胸腺ＤＮ
Ａ、５７μＭ）の各ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＡＴＰ及びｄＣＴＰ、及び２１μＭ
の［3Ｈ］ＴＴＰ（約１００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を含んだ。上記混合物を氷上で
混合し、そしてＤＮＡポリメラーゼのサンプルの希釈物の添加及び６０℃におけ
る５分間の放置により、反応を開始した。反応は、試験管を氷の上に置くことに
より停止し、そして０．２Ｍのピロリン酸ナトリウム（ＰＰｉ）及び１０％のＴ
ＣＡの添加によりＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡの捕獲及び取り込まれな
かったヌクレオチド３リン酸の除去は、混合物をＧＦＣフィルター（ワットマン
）により濾過して、当該フィルターを１２ｍｌの０．２Ｍ ＰＰｉナトリウム／
１Ｍ ＨＣｌで洗浄し、そして次にエタノールで洗浄することにより達成した。
上記フィルターを次に乾燥させて、フィルターを５ｍｌの液体シンチレーション
液体（Ｅｃｏｓｃｉｎｔ−Ｏ，ナショナルダイアグノスティックス）中に浸して
、ベックマンＬＳ ３８０１シンチレーションカウンター中で計数することによ
り、［3Ｈ］ＴＴＰ取り込みを定量した。１ユニットの酵素活性を、６０℃にお
いて１分あたり取り込まれる全ヌクレオチドの１ピコモルと定義する。陽性対照
はＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（３０℃においてアッセイした）を
含み、そして陰性対照はポリメラーゼを含まず、各アッセイセットに含ませた。
ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥ／ＡＰ１．Ｌ１による天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ αの大規模な生育 株ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥ／ＡＰ１．Ｌ１を２５０Ｌの発酵機中で生育させる
ことにより、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＥ生成物（α）の精製のた
めの細胞を生産した。Ｆ−培地（１．４％イーストエキストラクト、０．８％ト
リプトファン、１．２％ Ｋ2ＨＰＯ4，及び１．２％ ＫＨ2ＰＯ4，ＮａＯＨに
よりｐＨを７．２に）を滅菌して、グルコースを１％まで、４０％滅菌溶液から
加え、そしてアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を加えた。大規模な接種（２８Ｌ
）は、１ｍｌグリセロールストック培養液から開始し（即ち、―８０℃において
１５％グリセロール中で培養）、そして３７℃において４０Ｌ／分の通気にて一
晩生育させた。接種物は、１％グルコース及び１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを
含む１８０ＬのＦ−培地を含む２５０Ｌの発酵機に移した（０．０６のＯＤ600
から開始）。１８０Ｌの初期Ｆ−培地が存在したこの発酵において、発酵機へ添
加する一晩培養物の量を計算するには、発酵機中に存在する培地をＯＤ600＝０
．０６にするのに十分加えるべきである。これは、誘導前の３−４倍に細胞密度
を倍増させるのに十分な時間を与える。培養物を３７℃においてインキュベート
したが、４０ ＬＰＭの通気を伴い、そして２０ｒｐｍにて撹拌した。Ｔ．ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αの発現は、培養物が０．７９のＯＤ600に到達した時
に、１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘導した（Ｅ．ｃｏｌｉ中の外来蛋白質の発
現は細胞密度がおおよそ０．６−０．８のＯＤ600に到達したときに誘導する）
。追加のアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を誘導と同時に加えた。温度は生育中
を通じて約３７℃に保った。ｐＨはＮＨ4ＯＨの添加により生育を通して７．２
に保った。細胞の回収はＯＤ600＝４．８８において誘導３時間後に開始し、そ
して回収の間は細胞を１０℃に冷却した。回収容量は１８０Ｌであって、最終回
収重量は１．９ｋｇの細胞ペーストであった。等量（ｗ／ｗ）の５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０％蔗糖溶液を上記細胞ペーストに加えた。上記細胞
懸濁液を液体窒素に注ぐことにより細胞を凍結して、加工まで−２０℃に保存し
た。質のコントロールの結果は、接種物中アンピシリン含有培地上の１０の陽性
コロニー中１０を示し、そして回収時のアンピシリン含有培地上の１０の陽性コ
ロニー中１０を示した。陽性コロニーは選択性抗生物質を含むＬＢ培地にコロニ
ーを移した場合でも生育する、ＬＢプレート上でストリークされたサンプルから
生育したコロニーをである。ルリア−ベルターニ（ＬＢ）生育培地（バクトトリ
プトン、１０ｇ／Ｌ，バクトイーストエキストラクト、５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ，１
０ｇ／Ｌ）を本実施例及び以下のセクションにおいて陽性コロニーの選択に使用
する。 翻訳共役蛋白質として発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αの最適な硫
酸アンモニウム沈殿条件の決定 発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαサブユニットを保有する細胞の
スフェロプラストの創製により、溶解を達成した。最初に、−２０℃に保存され
ていたＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞の１：１懸濁液５０ｇ（２５ｇ細胞）を、予
め５５℃に温めておいた６９ｍｌのＴｒｉｓ−蔗糖に加えた（２．７５ｍｌ／細
胞のｇ）。撹拌した混合物に対して、１．２５ｍｌの０．５Ｍ １，４−ジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）（０．０５ｍｌ／細胞のｇ）及び６．２５ｍｌの溶解バ
ッファー（２Ｍ ＮａＣｌ，０．３ＭスペルミジンをｐＨ７．５に調節したＴｒ
ｉｓ−蔗糖中に含む）を加えた（０．２５ｍｌ／細胞のｇ）。１８ｍＭのスペル
ミジンの存在は、部分破壊された細胞及び置換されたＤＮＡ結合蛋白質中で濃縮
した核様体を保った。上記スラリーのｐＨは２ＭのＴｒｉｓ塩基０．５ｍｌの添
加によりｐＨ８．０に調節し（ｐＨは２ＭのＴｒｉｓ塩基により８．０に調節す
る）、そして１２５ｍｇのリゾチームを４．５ｍｌのＴｒｉｓ−蔗糖バッファー
に加えた（５ｍｇリゾチーム／細胞のｇ）。上記スラリーは、５分間の撹拌後に
２５０ｍｌの遠心分離管に分注して、４℃において１時間インキュベートした。
２５０ｍｌの遠心分離管を次に３７℃の渦巻き水浴槽に入れて、４分毎に３０秒
間、穏やかに倒置した。遠心分離により（２３，０００ ｘ ｇ，６０分間、４
℃）、上清を不溶性細胞残渣から分離した。回収された上清（０．１ Ｉ）は画
分Ｉ（Ｆｒ Ｉ）とした（１３ｍｇ蛋白質／ｍｌ）。本実施例及び以下の全ての
蛋白質濃度は、ピアスのクマジープロテインアッセイリージェント及びウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードとして用いて測定した。ＦｒＩは５つの等
しい容量に分割し、そして０．１６４、０．２２６、０．２９１、０．３６１及
び０．４３６ｇの硫酸アンモニウム（３０％、４０％、５０％、６０％及び７０
％飽和）をそれぞれの分離されたサンプル中のＦｒＩの各ｍｌに関して１５分の
間隔にて４℃において加えた。沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００
ｘ ｇ，４５分、０℃）。結果の沈殿物を２ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ懸濁バッファ
ー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），４０ｍＭ ＫＣｌ，７ｍＭ
ＭｇＣｌ2，及び１０％グリセロール）に懸濁した。各サンプルの蛋白質濃度は
クマジープロテインアッセイリージェント（ピアス）及びウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ）をスタンダードとして用いて測定した。３０％、４０％、５０％、６０
％及び７０％の硫酸アンモニウム沈殿サンプルは、それぞれ、２．４、８．０、
１８．０、３５．０及び３８．０ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度を含んだ。
【０１８５】 サンプルはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した（図４）
。４０％の硫酸アンモニウム沈殿サンプルが９０％を超えるαサブユニットを含
んだ。
【０１８６】 各硫酸アンモニウムカットは、「Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαサブユニ
ットの活性の測定のためのギャップフィリングアッセイ」と題したセクションに
おいて上で記載されたギャップフィリングアッセイにおける活性に関してもアッ
セイした。活性は４０％硫酸アンモニウム飽和においてもっとも高いと思われ、
増加したパーセント硫酸アンモニウム飽和として低下する（図５）。これは、高
い塩濃度が懸濁した沈殿物において保持されてギャップフィリング反応をもたら
すか又は阻害する夾雑物が高い濃度の硫酸アンモニウムにおいて沈殿してＴ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαサブユニットの活性をもたらすかの何れかによる。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び活性アッセイは、ほとんどのαサ
ブユニットが４０％硫酸アンモニウムカットに回収されることを示すため、この
硫酸アンモニウムの濃度が次の調製に使用された。 ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥからのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＥ産物（
α−サブユニット）の精製 発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αを保有する細胞のスフェロプラ
ストの創製により、溶解を達成した（７−１０−２０００の大規模な調製）。最
初に、−２０℃にて保存されたＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞の１：１懸濁液５０
０ｇ（２５０ｇ細胞）を用いてＦｒＩを調製した（７７０ｍｌ，２７．４ｍｇ／
ｍｌ）。調製物は「翻訳共役蛋白質として発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓのα−サブユニットの最適な硫酸アンモニウム沈殿条件の測定」と題される
セクションにおいて記載されたとおりであった。Ｆｒ Ｉに対して、硫酸アンモ
ニウム（各初期ｍｌ画分Ｉ−４５％飽和まで０．２５８ｇ）を１５分間隔で加え
た。混合物をさらに３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回
収した（２３，０００ ｘ ｇ，４５分、０℃）。結果の沈殿物を液体窒素に浸
すことにより素早く凍結して、−８０℃に保存した。
【０１８７】 Ｆｒ Ｉからの沈殿物を１６０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ７
．５），２５％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴに懸濁して、
ダウンスホモジェナイザーを使用してホモジェナイズした。サンプルを遠心分離
により透明化（１６，０００ ｘ ｇ）したところ、上清はＦｒ ＩＩとした（
１６４ｍｌ，１１．４ｍｇ／ｍｌ）。Ｆｒ ＩＩはブチルセファロースファスト
フロー（ファルマシアバイオテック）カラムを使用してさらに精製した。ブチル
樹脂（３６０ｍｌ）をブチル平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
（ｐＨ７．５），２５％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，０
．５Ｍ硫酸アンモニウム）中で平衡化した。２５０ｍｌのブチル樹脂を使用して
カラムを流出させた。残る１１０ｍｌのブチル樹脂をＦｒ ＩＩと混合して、２
７４ｍｌにした。この混合物に対して、０．５容量の飽和硫酸アンモニウムをゆ
っくりと１時間にわたり撹拌しながら加えた。この混合物を１．３ｍｌ／分にて
カラムに加えた。カラムは次に１Ｌの平衡化バッファーで洗浄した。蛋白質は、
ブチル平衡化バッファーで開始して、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ７．
５），２５％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌを含むバッファーで終了する、１０カラム容量の勾配にて溶出した。残る蛋
白質を追加の１０カラム容量「突沸（ｂｕｍｐ）」終了バッファーで溶出するこ
とによりカラムから除去した。αサブユニットは最初の突沸の半分において溶出
し、そしてプールした（２４２ｍｌ，０．１５ｍｇ／ｍｌ）。ギャップフィリン
グアッセイを使用することにより、活性に関して画分をアッセイした。
【０１８８】 プールは粉末形態のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００（フィッシャ
ー）を用いることにより２７ｍｌに濃縮した（１．５ｍｇ／ｍｌ）。Ｔ．ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαをさらに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ７．５
），２０％グリセロール、１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ
ＤＴＴで平衡化したセファクリルＳ３００ＨＲ（ファルマシアバイオテック）ゲ
ル濾過カラム（５１０ｍｌ，３ｃｍ ｘ １２０ｃｍ）を用いて精製した。カラ
ムを負荷して、蛋白質を０．７ｍｌ／分の流速にて溶出した。αサブユニットは
精製度の高い蛋白質として単離された（３５ｍｌ，０．２３ｍｇ／ｍｌ）。１０
％ポリアクリルアミドゲルが天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αの精製の段
階を要約した（図６）。
【０１８９】 実施例３ ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させた Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＸ（τ及びγ−サブユニット）を 発現するｐＡ１−ＮＢ−ＴＸの構築 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＸ遺伝子を予めｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ
Ｉに挿入することにより、天然（ｐＡ１−ＴＸ）且つＣ−末端標識された蛋白質
（ｐＡ１−ＣＢ−ＴＸ）として発現させた（米国出願番号０９／１５１，８８８
）。τ−サブユニット及びγ−サブユニット共に両構築物から低レベルで発現さ
れた。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＸ遺伝子も予めｐＥＴ−ＣＢ−Ｃ
ｌａＩプラスミドに挿入することにより、天然（ｐＥＴ−ＴＥ）且つＣ−末端標
識された蛋白質（ｐＥＴ−ＣＢ−ＴＸ）として発現させた（米国出願番号０９／
１５１，８８８）。ｐＡ１プロモーターの制御下にある場合のように、Ｔ７プロ
モーターの制御下で発現した場合、τ−サブユニット及びγ−サブユニットの両
者が低レベルで発現された。τ及びγ−サブユニットの発現レベルを増加させる
試みにおいて、ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドを
コードするＤＮＡにｄｎａＸ遺伝子を融合するようにプラスミドをデザインした
（ＡＴＧプロジェクトＳ）。最初に、プラスミドｐＡ１−ＴＸからｄｎａＸのＮ
−末端（５’）の断片を増幅するように、ＰＣＲ反応をデザインした。フォワー
ド（ＡＴＧプライマー＃Ｐ３８−Ｓ１５８６，５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧ ＣＣＣＴＣＴＡＣＣＧ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）は、ＰｓｔＩ部位
をｄｎａＸ遺伝子の５’末端に付加することにより、実際のＰＣＲ産物はＡＴＧ
開始コドンを除外してコドン２枚から始まる。コドン２の隣りのＰｓｔＩ制限部
位は、Ｎ−末端融合ペプチドコード配列にインフレームにてｄｎａＸ遺伝子の５
’部分をもたらす。リバースプライマー（ＡＴＧプライマー＃Ｐ３８−Ａ２０５
０，５’−ＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＡＧＡＣＧＡＡＧＡＧ−３’）（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４８）をデザインして、それがＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄ
ｎａＸ内のＢａｍＨ１制限部位の下流になるようにした（ＢａｍＨ１制限部位は
開始コドンの約３１８塩基下流である）。このＰＣＲ産物をＰｓｔＩ及びＢａｍ
Ｈ１で切断して、同じ２つの制限酵素により切断してあったｐＡ１−ＮＢ−Ａｇ
ｅＩに連結した。このプラスミドでＤＨ５αを形質転換して、陽性単離物をアン
ピシリン耐性に関して選択した。一つの陽性クローンからのプラスミドをＢａｍ
ＨＩ／ＰｓｔＩ制限消化（予測された５．５ｋｂ及び０．３２ｋｂの断片を生じ
る）及びＮｃｏＩ消化（予測された５．６及び０．１６ｋｂの断片を生じる）に
より証明した。挿入された領域の配列はＤＮＡ配列決定により確認して（ＡＴＧ
ＳＥＱ＃１１８５及び１１８６、プライマーＰ６４−Ｓ１０及びＰ６４−Ａ２
１５）、そしてｐＡ１−ＴＸの配列と比較した。この前駆体プラスミドをｐＡＩ
−ＮＢ−ＴＸ５’と命名し、単離物（ｐＡ１−ＮＢ−ＴＸ５’／ＤＨ５α）をス
トック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃７０２）。
【０１９０】 次に、ｄｎａＸ遺伝子の３’領域（Ｃ−末端）（１．６ｋｂ）を制限酵素Ｂａ
ｍＨ１及びＳｐｅＩを用いてｐＡＩ−ＴＸプラスミドから切り出した。この断片
を、同じ上記２つの制限酵素で切断してあった前駆体プラスミドｐＡＩ−ＮＢ
ＴＸ５’に連結した。このプラスミドでＤＨ５αを形質転換して、陽性単離物を
アンピシリン耐性に関して選択した。陽性単離物を、予測された５．９及び１．
６ｋｂ断片を生じるＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ消化により証明した。Ｎ−末端融合ペ
プチドに結合したＴＸに関する完全な遺伝子を含むこのプラスミドをｐＡＩ−Ｎ
Ｂ−ＴＸと命名し、単離物（ｐＡ１−ＮＢ−ＴＸ／ＤＨ５α）をストック培養液
として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃７４０）。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＸ（τ及びγ−サブユニット）のｐＡ１−Ｎ
Ｂ−ＴＸ／ＡＰ１．Ｌ１による発現の証明 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＸプラスミドを製造して、ＭＧＣ１０３０（ＡＴＧグリセロ
ールストック＃７４０）及びＡＰ１．Ｌ１細菌（ＡＴＧグリセロールストック＃
７４１）を共に形質転換した。細菌の生育及び全蛋白質の単離は実施例２に記載
されたとおりであった。全蛋白質を含む上清のアリコート（３μｌ）を、２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ ＳＤＳ中の４−２０％
ポリアクリルアミドミニゲル（ノベックス、ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウ
エル／ゲル）に負荷した。ミニゲルをクマジーブルーで染色して、一つの蛋白質
（二重のバンド）が、ギブコの１０ｋＤａ蛋白質ラダーの、６０ｋＤａの下を移
動すること及び他方の蛋白質バンドが６０ｋＤａ分子量スタンダードのわずかに
下を移動すること観察した。これらの蛋白質バンドは両細菌株からの誘導された
培養物においては明確なバンドとして観察されたが、誘導されなかった対照にお
いては観察されなかった。これらの蛋白質は予測された分子量５３．６ｋＤａ及
び６１．９ｋＤａに一致すると決定された。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤ
ｎａＸを示す検出された蛋白質バンドは、ゲル上の蛋白質バンドのクマジーブル
ーの強度に基づくと、全Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質の２％未満を表した。
【０１９１】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいては、τ及びγの両サブユニットの発現
を可能にする仮想フレームシフト部位が配列Ａ ＡＡＡ ＡＡＡ Ａを有し、そ
れが＋１又は−１のフレームシフトの何れかを可能にさせる。＋１のフレームシ
フト産物はＬｙｓ−Ｌｙｓコーディング配列を超えてたった一つの残基しか伸長
せず、Ｅ．ｃｏｌｉの−１フレームシフト産物に類似している。しかしながら、
−１フレームシフトは１２アミノ酸の伸長を伴う蛋白質をコードするはずである
。これは、サイズにして１１アミノ酸異なる２つのγサブユニットの発現を可能
にする。あるいは、最近の研究は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのγサブユニ
ットが２つの異なる長さのガンマサブユニットをコードする異なる長さのｍＲＮ
Ａの亜集団を生じさせる転写のずれの結果として発現されるのかもしれない（Ｌ
ａｒｓｅｎ，Ｂ．，Ｗｉｌｌｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．９７：１６８３−１６８８（２０００））。我々は、二重の蛋白質バ
ンドとしてγサブユニットを観察したことから、これらのプロセスの一つが起こ
ることを確証する。
【０１９２】 次に、発現された蛋白質を実施例２に記載されたとおりにビオチンブロット分
析に供した。内在のＥ．ｃｏｌｉのビオチン−ＣＣＰ蛋白質〜２０ｋＤａが誘導
されたサンプル及び誘導されなかったサンプルの両方において検出できた。等し
い強度の２つのバンドを可視化して、ギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの、６０ｋ
Ｄａのすぐ下のバンド及び他方の６０ｋＤａ分子量スタンダードのわずかに上の
バンドが両細菌株からの誘導された培養液において観察されたが、誘導されなか
った対照において観察されなかった。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤｎａＸのｐＡ１−ＮＢ−ＴＸによる発現の最
適化 天然及びＣ−末端融合ペプチドにカップリングさせて発現させると共にＴ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＸ遺伝子の発現が低いか又は検出不可能な蛋白
質しか生じないので、最適な発現を達成するために、Ｎ−末端融合ペプチドに結
合したｄｎａＸに関して細心の注意を払った。発現は、ｐＡ１−ＮＢ−ＴＸを保
有するＥ．ｃｏｌｉのＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１の両方を用いて、異なる
誘導時間において、そして異なる生育温度においても（２５及び３７℃）、分析
した。細菌培養物の生育及び分析は実施例２に記載されたとおりに実施した。ビ
オチンブロット分析は、発現レベルが３７℃において高く、そしてＡＰ１．Ｌ１
細菌株中で発現した場合にわずかに良好であったことも示した（図７）。Ｔ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮａＸの最大収量は３７℃において誘導の４時間後
に達成された；この誘導時間を次の実験において使用する。 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＸ／ＡＰ１．Ｌ１の大規模な生育 株ｐＡ１−ＮＢ−ＴＸ／ＡＰ１．Ｌ１を２５０Ｌの発酵機中で生育させて（発
酵ラン＃９９−１７）、実施例２に記載されたとおりに、ヘキサヒスチジン及び
ビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓのｄｎａＸ（τ及びγ−サブユニット）の精製のための細胞を製造した。細
胞の回収は、ＯＤ600＝７．０において誘導の４時間後に開始して、回収の間は
細胞を１０℃まで冷却した。回収容量は１７２Ｌであり、最終回収重量は約２．
２ｋｇの細胞ペーストであった。等容量（ｗ／ｗ）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）及び１０％の蔗糖溶液を用いて上記の細胞ペーストを懸濁した
。細胞は細胞懸濁液を液体窒素に注ぐことにより凍結して、加工までは−２０℃
において保存した。質のコントロールの結果は、接種物中のアクリルアミド含有
培地上の１０クローン陽性コロニー中１０を示し、そして回収の１０の陽性コロ
ニーのうち１０を示した。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＸ（τ及びγ−サブユニット）の精製 −２０℃においてＴｒｉｓ−蔗糖中で保存されたｐＡ１−ＮＢ−ＴＸを含む凍
結細胞の１：１懸濁液８００ｇ（４００ｇの細胞）の溶解を、実施例２に記載さ
れたとおりに実施した。回収された上清（１．７５ｌ）は、画分Ｉ（Ｆｒ Ｉ）
（１３．５ｍｇ／ｍｌ）とした。Ｆｒ Ｉに対して、硫酸アンモニウム（各初期
ｍｌ画分Ｉ−４０％飽和まで０．２２６ｇ）を１５分間隔で加えた。混合物を４
℃においてさらに３０分間撹拌し、そして沈殿物を遠心分離により回収した（２
３，０００ ｘ ｇ，４５分、０℃）。結果の沈殿物を液体窒素に浸すことによ
り素早く凍結して、−８０℃に保存した。
【０１９３】 Ｆｒ Ｉからの沈殿物を１２５ｍｌのＮｉ++−ＮＴＡ懸濁バッファー（５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），４０ｍＭ ＫＣｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ2
，１０％グリセロール、７ｍＭ βＭＥ，０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）に懸濁して、
ダウンスのホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離
により透明にし（１６，０００ ｘ ｇ）、上清をＦｒＩＩ（１３．３ｍｇ／ｍ
ｌ）とした。Ｆｒ ＩＩは、Ｎｉ++−ＮＴＡ懸濁バッファー中のＮｉ−ＮＴＡ樹
脂の５０％スラリー６０ｍｌに加え、そして１．５時間４℃において振動させた
。このスラリーを次にバイオラッドエコノ−カラム（２．５ ｘ ５ｃｍ）上に
負荷した。カラムをＮｉ++−ＮＴＡ洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５），１Ｍ ＫＣｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０％グリセロール、
１０ｍＭイミダゾール、７ｍＭ βＭＥ）３００ｍｌで０．５ｍｌ／分の流速で
洗浄した。ＮＢ−ＴＸ蛋白質は、１０−２００ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）勾配を含む、３００ｍｌのＮｉ++−ＮＴＡ溶出バッファー（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），４０ｍＭ ＫＣｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ2，１
０％グリセロール、７ｍＭ βＭＥ）に溶出した。溶出物を１５０ ｘ ２ｍｌ
画分に回収した。各画分の蛋白質濃度を測定した（図８）。
【０１９４】 画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、（図９Ａ及び
９Ｂ）そしてたった一つの主要な高い分子量の夾雑物を含むことが観察された。
この夾雑物はτサブユニットのちょうど上を移動して、画分９６で消失した。画
分６６−９５と９６−１１３をプールして、蛋白質を硫酸アンモニウムの添加に
より沈殿させた（各初期ｍｌ画分Ｉ−４０％飽和まで０．２２６ｇ）。沈殿物は
、遠心分離より回収し（２３，０００ ｘ ｇ，４５分、０℃）、そして−８０
℃に保存した。Ｎｉ++−ＮＴＡカラムクロマトグラフィーを用いてＮ−末端標識
されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤｎａＸの一部をラボラトリーストック
として保存した。
【０１９５】 抗体産生のための追加の精製工程において、硫酸アンモニウム沈殿させたＮ−
末端標識Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤｎａＸを含む沈殿物を、３０ｍｌの
リン酸緩衝塩（ＰＢＳ）（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，４．３
ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4：７Ｈ2Ｏ，１．４ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．３））プラ
ス１０％グリセロールに懸濁して、ダウンス７５ホモジェナイザーを用いてホモ
ジェナイズした。結果の溶液を遠心分離により透明にし（１６，０００ ｘ ｇ
）、そして上清をＦｒ ＩＩＩとした（２．９ｍｇ／ｍｌ）。
【０１９６】 Ｆｒ ＩＩＩを、ＰＢＳプラス１０％グリセロールで平衡化した、２ｍｌのＵ
ｌｔｒａＬｉｎｋ（商標名）固定化モノマーアビジンカラム（１．１ｃｍ ｘ
２．５ｃｍ）（ピアス）上に製造者の指示に従い負荷した。サンプルを０．０９
ｍｌ／分の流速で負荷した。パススルーは３回カラムを戻して通すことにより、
全てのビオチン化蛋白質がアビジンに結合することを可能にさせた。カラムは次
に１０ｍｌのＰＢＳプラス１０％グリセロールにより０．０８ｍｌ／分の流速で
洗浄した。蛋白質をカラムから２０ｍｌの溶出バッファー（２ｍＭ Ｄ−ビオチ
ン、１０％グリセロール、ＰＢＳ中）中にて０．０９ｍｌ／分の流速にて溶出し
た（画分１０Ａ及び１０Ｂ）。
【０１９７】 この精製工程は、Ｎｉ++−ＮＴＡカラム精製において観察された高い分子量の
夾雑物を除去した。画分１−２４（１９ｍｌ）をプールして（０．４３ｍｇ／ｍ
ｌ）、硫酸アンモニウムの添加により蛋白質を沈殿させ（プールされた画分の各
ｍｌに対して０．２５８ｇ）、そして上記のとおりに遠心分離して−８０℃にお
いて保存した。このサンプルを以下に記載されるポリクローナル抗体の産生に用
いた。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＸ（τ及びγ−サブユニット）に対する
ポリクローナル抗体の産生 ポリクローナル抗体の産生のため、アビジン精製からのＮ−標識Ｔ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤｎａＸを含む沈殿物を２ｍｌのＰＢＳに溶解して、５００
ｍｌのＰＢＳに対して２回透析した（２．５ｍｇ／ｍｌ，２ｍｌ）。サンプルを
ＰＢＳ中にて５０μｇ／ｍｌに希釈して、２ｍｌをアジュバント（ＲＩＢＩアジ
ュバントシステムズ（ＲＡＳ））を含むバイアルに直接注射した。この溶液を混
合して、室温まで戻した。１ｍｌのアジュバント／ＮＢ−ＴＸ混合物を用いてウ
サギを接種した（＃５９８）；６カ所の皮内注射の各々において０．０５ｍｌ、
各後肢の筋肉内注射において０．３ｍｌ、そして頸部の皮下注射において０．１
ｍｌ。注射の開始前に、５ｍｌの注射前採血をした。上記ウサギは接種開始から
２８日後に初期注射容量の１倍半を用いて追加抗原刺激を受けた。試験血液（１
０ｍｌ）を３７日目に採取した。ウサギは５８日目にオリジナルの接種と同じ製
剤を用いた２回目の追加抗原刺激を受けた。
【０１９８】 ＮＢ−ＴＸ結合に関する抗血清の最適な希釈は、試験採血後及び最終採血後に
測定した。これは、小アリコートのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＮ−末端標
識ＤｎａＸ（１．０μｇ／ウエル）を１０％ポリアクリルアミドミニゲル（１０
ｘ １０ｃｍ）上で電気泳動するＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
用いて実施し、そして次に蛋白質をニトロセルロース膜に移した。該膜をストリ
ップに切断したが、各ストリップはＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＮ−末端標
識ＤｎａＸの同一のバンドを含んだ。膜を、５％ノンファットドライミルクを含
む（ｗ／ｖ）０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ｖ／ｖ）−ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で１
時間室温においてブロックし、ＴＢＳＴで洗浄した。ストリップは抗血清／ＴＢ
ＳＴ（１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、１：
３２００、１：６４００及び１：１２８００の希釈）中に１時間入れて、ＴＢＳ
Ｔ中で５分間４回洗浄した。次に、ストリップを、アルカリホスファターゼに配
合した二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＴＢＳＴ中で１：３０００に
希釈）（バイオラッド）中に１時間入れた。ストリップを次に４回５分間ＴＢＳ
Ｔで洗浄した。この大規模な洗浄後に、ブロットをＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＫＰＬ
＃５０−８１−０７；１成分系）により発色させた。τ及びγ−サブユニットに
相当する蛋白質は、もっとも高い希釈の抗血清においてさえ明確なベンドとして
可視化された。これらのバンドは抗血清の希釈が低下するにつれてより強くなっ
た。陰性対照は、抗原で接種する前にウサギから採られた抗血清を含んだ。陽性
対照は、抗血清検出において使用されたのと同じ濃度（１．０μｇ）における抗
原のビオチンブロット分析である（図１１）。
【０１９９】 次に、抗体血清による認識のために必要なＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＮ
−末端標識ＤｎａＸの最少量を測定した。これは、小アリコートのＴ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓのＮ−末端標識ＤｎａＸ（０．０２，０．０４，０．０８，０
．１６，０．３２，０．６２５，１．２５，２．５０，及び５．０μｇ／ウエル
）を１０％ポリアクリルアミドミニゲル（１０ ｘ １０ｃｍ）上で電気泳動す
るＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて実施した。蛋白質をニトロ
セルロース膜に移した。ブロットされたニトロセルロースを、５％ノンファット
ドライミルクを含む（ｗ／ｖ）０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ｖ／ｖ）−ＴＢＳ
（ＴＢＳＴ）で１時間室温においてブロックし、ＴＢＳＴで洗浄した。ブロット
は、抗血清／ＴＢＳＴ（１：６４００の希釈）中に１時間入れて、次に、ＴＢＳ
Ｔ中で５分間４回洗浄した。次に、ブロットを、アルカリホスファターゼに配合
した二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＴＢＳＴ中で１：３０００に希
釈）（バイオラッド）中に１時間入れた。ストリップを次に４回５分間ＴＢＳＴ
で洗浄した。この大規模な洗浄後に、ブロットをＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＫＰＬ ＃
５０−８１−０７；１成分系）により発色させた。
【０２００】 τ及びγ−サブユニットに相当する蛋白質は、０．０２μｇのＤｎａＸにおい
て明確なベンドとして可視化された。これらのバンドはＤｎａＸの濃度が増加す
るにつれてより強くなった（図１２）。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＸ（τ及びγ−サブユニット）に対する
モノクローナル抗体の産生 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤｎａＸのサンプル２ｍｌをＰＢＳ中で５０
μ／ｍｌに希釈し（上記）、アジュバント（ＲＩＢＩアジュバントシステムズ（
ＲＡＳ））を含むバイアルに直接注射した。０日目に、３匹のマウスにＤｎａＸ
−アジュバントサンプルを接種した（０．２ｍｌ／マウス）。２１日目に、各マ
ウスはＤｎａＸ−アジュバントサンプル０．２ｍｌの追加抗原刺激を受けた。４
１日目に、試験採血を尾のクリッピングから採取した。これら３匹のマウスに、
４４日目に第２回の追加抗原刺激を行い、そして尾のクリッピングからの２回目
の採血を５８日目に行った。この採血からの抗血清を「Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓのｄｎａＸ（τ及びγ−サブユニット）に対するポリクローナル抗体の産
生」と題されるセクションに記載されたとおりにしてウエスタン分析に使用した
。抗血清は１：４００の希釈にて使用することにより、１μｇ／レーンのＴ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤｎａＸを検出した。該抗血清はＥＬＩＳＡスクリー
ニングにも使用した（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ／Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，ＵＣＨＳＣ）。マウス＃２及び＃３は、
ウエスタン分析及びＥＬＩＳＡスクリーニングの両方においてＴ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ ＤｎａＸに対して等しい応答を生じたのに対し、マウス＃１は低
い応答を生じた。マウス＃２を選択して、Ｎ−末端標識Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＤｎａＸに対するモノクローナル抗体の産生のために、Ｔｉｓｓｕｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ／Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ
（ＵＣＨＳＣ）に供した。 翻訳共役ベクターｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＣｌａＩへのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ｄｎａＸ遺伝子（τ／γ）のクローン化 天然蛋白質としてτ／γを効率よく発現させるため、翻訳共役蛋白質としてτ
／γを発現するようにデザインした。ここでの到達点は、再び、実施例＃２に記
載されたとおりに翻訳共役を使用することである。天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ αに関して記載されたとおり、ｄｎａＸ遺伝子をＣＣＡ付加酵素の後ろ
に挿入して、翻訳上共役させた。最初に、ｄｎａＸ遺伝子を、ｐＡ１−ＴＸを鋳
型として用いてＰＣＲにより増幅した。フォワード／リバースプライマー（ＡＴ
Ｇプライマー ＃Ｐ３８−Ｓ１ｃｌａ２，５’−ＡＣＴＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧ ＡＧＣＧＣＣＣＴＣＴＡＣＣＧＣＣ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）は非
相補領域中にＣｌａＩ制限部位を有する。非相補領域は、上流のＣＣＡ付加蛋白
質断片のための停止（ＴＡＡ）の「ＴＡ」も含む。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓのｈｏｌＡ遺伝子の５’末端に相補なプライマーの領域は、「ＡＴＧ」開始コ
ドンの最初のヌクレオチドの「Ａ」及び「ＴＡＡ」停止コドンの最後の「Ａ」で
始まる。リバース／アンチセンスプライマー（ＡＴＧプライマー ＃Ｐ３８−Ａ
１６０３ＳＴＯＰｓｐｅ，５’−ＧＡＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＴＡＴＡＴＡＣ ＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＴＡＴＣ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）は、プラ
イマーの非相補部分中のＳｐｅＩ制限部位及び天然の停止コドンに隣接した追加
の停止コドンも含み、タンデムに２つの停止コドンを提供した。ＳｐｅＩによる
効率よい切断のためのクランプ領域も存在した。次に、ＰＣＲ産物をＣｌａＩ／
ＳｐｅＩ制限酵素で消化して、同じ酵素で消化したｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＣｌａＩ
プラスミドに挿入した。該プラスミドで５ＤＨαを形質転換して、アンピシリン
耐性陽性単離物からのプラスミドをＣｌａＩ／ＳｐｅＩ制限消化により１．６及
び５．５ｋｂの断片を生じることに関して選抜した。上記挿入物の両鎖の配列は
、ＤＮＡ配列決定により証明した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１６６６−１６７４，１
６１７，１７１９；プラスミド、Ｐ１４４−Ｓ２３，Ｐ１４４−Ａ１９６５，Ｐ
３８−Ｓ３９４，Ｐ３８−Ｓ８０９，Ｐ３８−Ｓ１１６９，Ｐ３８−Ａ１２７２
，Ｐ３８−Ａ９４６，Ｐ３８−Ａ５４１，Ｐ３８−Ａ２８２，Ｐ３８−Ａ１０６
）。配列の分析は上記挿入された領域内に正確な配列が含まれたことを証明した
。このプラスミドをｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＸと命名して、単離物をストック培養
液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃１０３０）。 ＰＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＸ／ＭＧＣ１０３０及びｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＸ／ＡＰ１
．Ｌ１による天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤｎａＸ蛋白質の発現の証明 ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＸプラスミドを製造して、ＭＧＣ１０３０（ＡＴＧグリ
セロールストック＃１０６７，１０６８，１０６９）及びＡＰ１．Ｌ１（ＡＴＧ
グリセロールストック＃１０７５，１０７６，１０７７）を形質転換した。細菌
の生育及び全細胞蛋白質の単離は、実施例２に記載されたとおりであった。全細
胞蛋白質を含む小アリコートの各上清（３μｌ）を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、
１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ ＳＤＳ中の４−２０％ポリアクリルアミド
ミニゲル（ノベックス、ＥＣ６０２５５：１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で電
気泳動した。該ミニゲルはクマジーブルーで染色した。τ（５８．３ ｋＤａ）
又はγ（５１．０ｋＤａ）を含むことが予測されたゲルの領域は多くの天然Ｅ．
ｃｏｌｉ蛋白質を含み、そしてτ又はγは如何なる単離物においても可視化でき
なかった。
【０２０１】 実施例４ Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ遺伝子（δサブユニット）の同定 Ｅ．ｃｏｌｉ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のδサ
ブユニット及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ａｑｕｉｆｌｅｘ ａｅ
ｏｌｉｃｕｓ由来の仮想δサブユニットの配列を用いて、ゲッチンゲンゲノミッ
クス研究所のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムのデータベースを検索した。
仮想Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ遺伝子を含むＴ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓのゲノムの領域の部分的に加工していない配列を同定して（ＢＬＡＳ
Ｔを用いて）、そして得た（Ｄｒ．Ｃａｒｓｔｅｎ Ｊａｃｏｂｉ，Ｇｏｅｔｔ
ｉｎｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｒｉｓｅｂａ
ｃｈｓｔｒａｓｓｅ ８，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，独国）。全てＡＴＧであった
いくつかの可能な開始部位及び多数の可能な停止コドンも存在するらしい。加工
していない配列の正確さの不確定さ故、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌ
Ａ遺伝子及び周辺配列を含む疑いのあるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムの
領域をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲプライマーは上記の非加工配列に由来する
配列を用いてデザインした。フォワード／リバースプライマー（ＡＴＧプライマ
ーＰ１３４−Ｓ４１５，５’−ＣＧＧＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＧＣＡＡＧＡＴＧ
ＴＣ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）及びリバース／アンチセンスプライ
マー（ＡＴＧプライマーＰ１３４−Ａ２０９９，５’−ＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣ
ＧＣＣＣＣＧＴＡＧＴ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）は、Ｔ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓゲノミックＤＮＡを鋳型として用いることにより、１６８５ｂ
ｐの長さのＰＣＲ産物を生じ、ｈｏｌＡをコードするＤＮＡの領域を含んだ。こ
のＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（商標名）（プロメガ）ベクターへ製造
者の指示に従い挿入した。ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（商標名）ベクター系は、幾
つかの好熱性ＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲ産物の３’末端上に１つのデオキ
シアデノシンを鋳型と独立に追加する利点を有する。上記ＰＣＲ断片を、Ｅｃｏ
ＲＶ部位で切断されていた直鎖状ベクターＤＮＡに連結し、そして両末端に追加
された単一の３’末端チミジンを有した。これらのベクターを使用することによ
り、粘着末端連結の高い効率の利点を享受しながら、さらなる酵素操作無しにＰ
ＣＲ産物を直接クローン化することができる。このプラスミドでＤＨ５α細菌を
形質転換して、陽性単離物をアンピシリン耐性に関して選択した。ひとつの陽性
クローン由来のプラスミドを単離して、１．７及び３．１ｋｂの断片を生じるＥ
ｃｏＲＩ制限消化による消化により選抜した。挿入されたＤＮＡ領域の配列はＤ
ＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１３３６−１３４５；プライ
マー、ＳＰ６，Ｔ７，Ｐ１３４−Ｓ６２１，Ｐ１３４−Ｓ１０１６，Ｐ１３４−
Ｓ１２７９，Ｐ１３４−Ｓ１６３３，Ｐ１３４−Ａ１８４９，Ｐ１３４−Ａ１４
６４，Ｐ１３４−Ａ１０９１及びＰ１３４−Ａ６５５）。ゲッチンゲンゲノミッ
クス研究所から得た非加工配列に比較して、多数の塩基の変化がＰＣＲクローン
に観察された。８７６ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が仮想Ｔ
．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ遺伝子を含む領域中に同定された。この
単離物をストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃７８７
）。
【０２０２】 ＰＣＲ産物中に同定されたＯＲＦをＰＣＲによりＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓゲノミックＤＮＡを鋳型として用いて増幅した。フォワード／センスプライマ
ー（ＡＴＧプラスミド＃Ｐ１３４−Ｓ５８５ｄｅ，５’−ＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣ
ＴＴＣＡＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：５３）は上記ＯＲＦの５’末端に相補な領域を含んだ。ＮｄｅＩ部位はＡＴＧ
開始コドンとオーバーラップし、そして上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＢａｍＨ
Ｉ部位もあった。リバース／アンチセンスプライマー（ＡＴＧプライマー＃Ｐ１
３４−Ａ１４９３ｋｐｎ，５’−ＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＡＡＣＧ ＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）は相補領域内
の天然の停止コドンに隣接した追加の停止コドンを含んだから、２つの停止コド
ンをタンデムに提供する。停止コドンの上流にＫｐｎＩ部位及び当該ＫｐｎＩ制
限部位の上流にＢｇｌＩＩ制限部位があった。このＰＣＲ断片を製造者の指示に
従いｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（商標名）プラスミド（プロメガ）に挿入した。次
に、当該プラスミドでＤＨ５α細菌を形質転換して、アンピシリン耐性陽性単離
物由来のプラスミドを、０．９及び３．０ｋｂの断片を生じるＮｄｅＩ／Ｋｐｎ
Ｉ制限消化により選抜した。挿入された領域の両ＤＮＡ鎖の配列はＤＮＡ配列決
定により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１３９２−１３９７，１４０８；プライ
マー、ＳＰ６，Ｔ７，Ｐ１３４−Ｓ１２７９，Ｐ１３４−Ｓ１６３３，Ｐ１３４
−Ａ１４６４，Ｐ１３４−Ａ７９０及びＰ１３４−Ａ１８４９）。このプラスミ
ドをｐＴ−ＴＤ（Ｋｐｎ）と命名し、そして単離物をストック培養液として保存
した（ＡＴＧグリセロールストック＃８１７）。
【０２０３】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ遺伝子のＤＮＡコーディング配列（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を図１３に示す。開始コドン（ａｔｇ）及び停止コド
ン（ｔｇａ）を太線で印字する。図１４には、上記ＤＮＡ配列に由来する蛋白質
（アミノ酸）配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）も示す。
【０２０４】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδサブユニットのアミノ酸配列をＥ．ｃｏｌ
ｉのδサブユニットと比較した（図１５）。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのデ
ータベースにおいて使用されたδサブユニット配列、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＨａｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ及びＡｑｕｉｆｌｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来の仮想δサブユニット配列全て
の整列化も行った（図１６）。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδサブユニット
は、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓ及びＢ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓのδサブユニットと、それぞれ、１９３、１８２、１１０及び
１６９アミノ酸にわたり、３４％、２９％、３１％及び２７％同一であった。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合したＴ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ（δサブユニット）を過剰発現するプラスミ
ド（ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ）の構築 Ｃ−末端ペプチドに融合したδサブユニットは発現が乏しかったので（以下に
記載される）、Ｎ−末端融合ペプチドにｈｏｌＡ遺伝子をカップリングすること
により発現を増強しようと試みることを決定した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓのｈｏｌＡ遺伝子をｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ２プラスミドに挿入することにより
、ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合して発現
させた。ｈｏｌＡ遺伝子はｐＡ１−ＴＤプラスミドを鋳型として用いてＰＣＲに
より増幅した。フォワード／センスプライマーはＰｓｔＩ部位を上記遺伝子の５
’末端に付加して、実際のＰＣＲ産物はＡＴＧ開始コドンを伸長してコドン２に
おいて開始するがＰｓｔＩ部位はコドン２に隣接する（ＡＴＧプライマー Ｐ１
３４−Ｓ５９２ｐｓｔ，５’−ＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴ ＴＣＡＣＣＧ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）。上記ＰｓｔＩ部位はｈｏ
ｌＡ遺伝子をＮ−末端融合ペプチドのフレームに持ち込み、そして２つのアミノ
酸（ＬｅｕとＧｌｎ）をｈｏｌＡ遺伝子のＮ−末端融合ペプチドと第２コドンの
間に付加することになる。リバースプライマーはｐＡ１−ＴＤを作成するときに
使用したのと同じプライマーであった（Ｐ１３４−Ａ１４９３ｋｐｎ）。このプ
ライマーは２つのことが達成できるようにデザインした。第１に、ＴＧＡ（停止
コドン）が遺伝子の末端に付加されることにより、タンデムに２つの停止コドン
を提供した（天然の停止コドンと別の停止コドンが上記プライマーの非相補部分
に加えられた）。第２に、ベクターへの挿入のため、ＫｐｎＩ制限部位を上記プ
ライマーの非相補領域内に加えた。ＫｐｎＩによる効率よい消化のためのクラン
プ領域もあった。ＰＣＲ産物はＰｓｔＩとＫｐｎＩ制限酵素により消化して、同
じ酵素で消化されたｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ２プラスミドに挿入した。当該プラス
ミドでＤＨ５α細菌を形質転換して、アンピシリン耐性陽性単離物からのプラス
ミドを、０．９と５．６２ｋｂの断片を生じるＰｓｔＩとＫｐｎＩ制限酵素によ
る消化により選抜した。このプラスミドを選択して、挿入物の両鎖の配列をＤＮ
Ａ配列決定により証明した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１５３０−１５３６；プライマ
ー、Ｐ６４−Ｓ１０，Ｐ６４−Ａ２１５，Ｐ１３４−Ｓ１２７９，Ｐ１３４−Ｓ
１６３３，Ｐ１３４−Ａ１８４９，Ｐ１３４−Ａ１４６４，Ｐ１３４−Ａ７９０
）。このプラスミドをｐＡ１−ＮＢ−ＴＤと命名して、単離物をストック培養液
として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃９１５）。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合したＴ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ δサブユニットのｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ／ＭＧＣ１０３
０による発現の証明 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤプラスミドを製造して、ＭＧＣ１０３０細菌を形質転換し
た（ＡＴＧグリセロールストック＃９３１）。細菌の生育及び全細胞蛋白質の単
離は実施例２に記載されたとおりであった。全細胞蛋白質を含む小アリコートの
各上清（３μｌ）を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．
１％ ＳＤＳ中の４−２０％ポリアクリルアミドミニゲル（ノベックス、ＥＣ６
０２５５：１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で電気泳動した。該ミニゲルはクマ
ジーブルーで染色した。ギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの４０ｋＤａ分子量スタ
ンダードのすぐ下を移動する蛋白質が明確な蛋白質バンドとして検出できたが、
非誘導対照においては観察できなかった。この蛋白質バンドは、Ｎ−末端融合蛋
白質に融合したＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδサブユニットの予測された分
子量に相当する（３６．２ｋＤａ）。
【０２０５】 次に、各溶解物の中の全蛋白質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロー
スへ実施例２に記載されるように転写した。各レーンは１．５ｕｌの上清を含ん
だ。内在Ｅ．ｃｏｌｉビオチン−カルボキシル担体蛋白質（ビオチン−ＣＣＰ）
約２０ｋＤａが誘導及び非誘導サンプルの両方において検出可能であった。δサ
ブユニットに相当する強度の極めて強い蛋白質バンドは、ギブコ１０ｋＤａ蛋白
質ラダーの４０ｋＤａ分子量スタンダードのすぐ下を移動した。この蛋白質は誘
導培養液においては明確なバンドとして観察されたが、非誘導対照においては観
察されなかった。 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤによるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ遺伝子（δ
サブユニット）の発現の最適化 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤプラスミドを保有する細菌株ＡＰ１．Ｌ１を用いて異なる
誘導時間にて発現を分析した。細菌の生育及び分析は実施例２に記載されるとお
りに実施した。生育及び分析は３７℃においてであった。全蛋白質は、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びビオチンブロット分析の両者を用いて分析
した（図１７）。δサブユニットに相当する明確な蛋白質バンドが両方式の分析
において観察された。ビオチンブロット分析は、殆どのδサブユニットが３７℃
において４時間発現され続けることを示し、これらの生育条件を次の調製物に用
いた。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合されたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ遺伝子産物（δサブユニット）のｐＡ１−
ＮＢ−ＴＤ／ＭＧＣ１０３０による大規模な生育 株ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ／ＭＧＣ１０３０を２５０Ｌの発酵機で生育させること
により、実施例２に記載されたとおりにＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδサブ
ユニットの精製のための細胞を製造した。細胞の回収は、７．２のＯＤ600にお
いて、誘導の３時間後に開始して、細胞は回収の間１０℃に冷却した。回収容量
は１７５Ｌであって、最終回収重量は約２．４７ｋｇの細胞ペーストであった。
等量の（ｗ／ｗ）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０％蔗糖溶液を細胞
ペーストに加えた。質のコントロールの結果は、接種物中アンピシリン含有培地
上の１０の陽性コロニーのうち１０を示し、そして回収中の１０／１０の陽性コ
ロニーを示した。細胞懸濁液を液体窒素に注ぐことにより、細胞を凍結して、加
工まで−２０℃において保存した。 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ／ＭＧＣ１０３０によるヘキサヒスチジン及びビオチン化部
位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたδの最適硫酸アンモニウム沈殿条件の決
定 発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδサブユニットを保有する細胞の
スフェロプラストの創製により溶解を達成した。最初に、−２０℃において保存
されていたＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞の１：１懸濁液１００ｇから（５０ｇ細
胞）、ＦｒＩを調製した（１６０ｍｌ，２３ｍｇ／ｍｌ）。調製は、実施例２に
記載されたとおりであった。ＦｒＩを、Ｎｉ−ＮＴＡ懸濁バッファー（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ７．５），４０ｍＭ ＫＣｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ2
，１０％グリセロール、７ｍＭ βＭＥ）中で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ樹脂の５
０％スラリー２．４ｍｌに添加した。樹脂とサンプルを１．５時間４℃にて振動
させた。次に、サンプルは５ｍｌのフリット化ポリプロピレンカラム（キアゲン
）を通過させて、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂及び結合したδを濾過した。樹脂は、５０ｍ
ｌのＮｉ−ＮＴＡ洗浄バッファーを上記カラムに通過させることにより洗浄して
、９ｍｌのＮｉＮＴＡ溶出バッファー（２．６ｍｇ／ｍｌ）に溶出した。
【０２０６】 溶出したサンプルはＮｉ−ＮＴＡ懸濁バッファーを添加することにより４０ｍ
ｌにした。次に、サンプルを４等容量（１０ｍｌ）に分割して、１．６４、２．
２６、２．９１及び３．６１ｇの硫酸アンモニウム（３０％、４０％、５０％及
び６０％飽和）を各分離サンプルにそれぞれ１５分間隔で４℃において加えた。
混合物は、追加の３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収
した（２３，０００ ｘ ｇ，４５分、０℃）。結果の沈殿物を１ｍｌのＮｉ−
ＮＴＡ懸濁バッファーに懸濁した。各サンプルの蛋白質濃度はクマジー蛋白質ア
ッセイ試薬（ピアス）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードとして
用いて測定した。３０％、４０％、５０％及び６０％硫酸アンモニウムで沈殿さ
せたサンプルは、それぞれ０．４、２．６、３．２及び３．５ｍｇ／ｍｌの蛋白
質濃度を含んだ。サンプルはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し
た（図１８）。
【０２０７】 ５０％と６０％の硫酸アンモニウム沈殿サンプルは等しい量のδサブユニット
を含んだ。４０％硫酸アンモニウム沈殿サンプルは５０％と６０％の硫酸アンモ
ニウム沈殿サンプルの約９０％を含んだが、３０％硫酸アンモニウム沈殿サンプ
ルは極めて少量のδサブユニットしか含まなかった。δサブユニットの以後の全
ての調製物は硫酸アンモニウム４０％飽和にて沈殿させた。 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ／ＭＧＣ１０３０によるヘキサヒスチジン及びビオチン化部
位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌ
Ａ産物（δサブユニット）の精製 発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ δを保有する細胞のスフェロプラ
ストの創製により溶解を達成した。最初に、−２０℃において保存されていたＴ
ｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞の１：１懸濁液８００ｇから（４００ｇ細胞）、Ｆｒ
Ｉを調製した（１２８０ｍｌ，３０．８ｍｇ／ｍｌ）。調製は、実施例２に記載
されたとおりであった。ＦｒＩに、硫酸アンモニウム（画分Ｉ−４０％飽和各々
に対して０．２２６ｇ）を１５分間隔で加えた。混合物をさらに３０分間４℃に
おいて撹拌し、そして沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ ｘ ｇ
，４５分、０℃）。結果の沈殿物を液体窒素に浸すことにより素早く凍結させ、
−８０℃において保存した。
【０２０８】 ＦｒＩからの沈殿物を１６０ｍｌのＮｉ++−ＮＴＡ懸濁バッファーに懸濁して
、ダウンスホモジェナイザー用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離に
より透明にし（１６，０００ ｘ ｇ）、上清をＦｒ ＩＩとした（２７．６ｍ
ｇ／ｍｌ）。Ｆｒ ＩＩは、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂の５０％スラリー５０ｍｌに添加
して、１．５時間４℃にて振動させた。次に、このスラリーをバイオラッドＥｃ
ｏｎｏ−カラム（２．５ ｘ ５ｃｍ）に負荷した。カラムは２５０ｍｌのＮｉ++ −ＮＴＡ洗浄バッファーを流速０．５ｍｌ／分にて洗浄した。蛋白質は、１０
−２００ｍＭのイミダゾール勾配を含むＮｉ++−ＮＴＡ洗浄バッファー２３０ｍ
ｌに溶出した。溶出物は９２ ｘ ２．５ｍｌの画分に回収した。画分はＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析して、画分２５−９２が９５％を
超える純度のδを含むことが分かった（図１９Ａ及び１９Ｂ）。画分２５−９２
をプールして（１６０ｍｌ，２．３ｍｇ／ｍｌ）、３．５ＬのＨＧ．０４バッフ
ァー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，（ｐＨ７．６），４０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，６ｍＭ βＭＥ，１０％グリセロール）に対
して透析した。透析したサンプルはＦｒＩＩＩとした（１６０ｍｌ，２．１ｍｇ
／ｍｌ）。サンプルは、次に、等分して、液体窒素中で素早く凍結して、−８０
℃において保存した。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ（δサブユニット）に対するポリクロ
ーナル抗体の産生 抗体産生のための超純粋蛋白質を回収するため、上記（２．１ｍｇ／ｍｌ）か
らの３０ｍｌのδサブユニットのＦＩＩＩを硫酸アンモニウムを用いて沈殿させ
た（ＦｒＩＩＩの初期ｍｌあたり７．７５ｇ、４５％飽和）。沈殿した沈殿物を
２０ｍｌのＰＢＳに懸濁して、実施例３に記載されたとおりにＵｌｔｒａＬｉｎ
ｋ（商標名）固定化モノマーアビジンカラムを用いて精製した。アビジンカラム
の蛋白質溶出プロフィール図２０に示す。画分２−６（５ｍｌ）をプールした（
０．３５ｍｇ／ｍｌ）。図２１は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδに関する
アビジンカラムのプールしたのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【０２０９】 プールされたサンプルを用いて、実施例３に記載されたとおりにＴ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ遺伝子産物（δサブユニット）に対するポリクロー
ナル抗体を産生させた。 天然蛋白質としてＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ遺伝子（δサブユニ
ット）を過剰に発現するプラスミド（ｐＡ１−ＴＤ）の構築 Ｎ−末端標識蛋白質としてδを発現させるためのベクターｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ
の構築の前に、まずδを天然でＣ−末端が標識された蛋白質を発現させるために
いくつかの試みを行った。これらの試みは十分な収量のδを生産して精製の試み
を正当化することにおいて不成功であった。これらの試みはこのセクションに記
載される。
【０２１０】 プラスミドｐＴ−ＴＤ（Ｋｐｎ）中に含まれたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
のｈｏｌＡ遺伝子を、該プラスミドのＮｄｅＩ／ＫｐｎＩ制限酵素消化により抽
出した。この０．９ｋｂの断片を、同じ制限酵素で消化してあったｐＡ１−ＣＢ
−ＮｄｅＩに挿入した。ＮｄｅＩ部位の「ＡＴＧ」は、ｈｏｌＡ遺伝子の開始コ
ドンとして機能した。これは、開始コドンを最適な翻訳のためにＲＢＳから正し
い距離で（１１ヌクレオチド）配置した。このプラスミドで次にＤＨ５α細菌を
形質転換して、アンピシリン耐性陽性単離物からのプラスミドを、０．９及び５
．６５ｋｂ断片を生じるＮｄｅＩとＫｐｎＩ制限酵素による消化に関して選抜し
た。一つのプラスミドを選択して、挿入物の配列をＤＮＡ配列決定により証明し
た（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１４２８及び１４２９、プライマーＰ３８−Ｓ５５７６
及びＰ１３４−１６３３）。このプラスミドをｐＡ１−ＴＤと命名して、単離物
をストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃８４１）。 ｐＡ１−ＴＤ／ＭＧＣ１０３０から天然蛋白質としてＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓのｈｏｌＡ遺伝子（δサブユニット）を過剰に発現するプラスミド（ｐＡ１
−ＴＤ）の発現の証明 プラスミドｐＡ１−ＴＤをＤＨ５α細菌から調製して、ＭＧＣ１０３０細菌を
形質転換した（ＡＴＧグリセロールストック＃８５６，８５７，８５８）。３つ
の単離物の細菌の生育と全細胞蛋白質の単離は実施例２に記載されたとおりであ
った。３つの単離物各々からの全細胞蛋白質を含む小アリコート（３μｌ）の上
清を、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６
０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９
２ｍＭグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。ミニゲルをクマジーブ
ルーで染色した。δの予測された分子量に相当する単離物の如何なるものからの
可視蛋白質バンドもなかった。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＣ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ遺伝子（δサブユニット）を過剰に発現す
るプラスミド（ｐＡ１−ＣＢ−ＴＤ）の構築 再び、天然δサブユニットを発現させる試みは失敗したため、我々は、Ｃ−末
端融合蛋白質にカップリングさせたこの蛋白質を発現することを次に試みた。ｈ
ｏｌＡ遺伝子をＰＣＲによりＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノミックＤＮＡを
鋳型として用いて増幅した。フォワード／リバースプライマー（ＡＴＧプライマ
ー＃Ｐ１３４−Ｓ５８５’ｄｅ）は、ｐＴ−ＴＤ（Ｋｐｎ）と命名された構築物
において使用されたのと同じプライマーであり、遺伝子の５’末端に相補な領域
を含んだ。また、ＮｄｅＩ部位はＡＴＧ開始コドンとオーバーラップし、そして
上流のＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位もあった。リバース／アンチセンスプラ
イマーは停止コドンを除いたＯＲＦの３’末端に相補であった（ＡＴＧプライマ
ー＃Ｐ１３４−Ａ１４８６ｓｐｅ，５’−ＧＡＧＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＣＧ ＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＣ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）。このプライ
マーはプライマーの相補領域に隣接してＳｐｅＩ制限部位を含んだ。当該Ｓｐｅ
Ｉ部位は、発現された蛋白質がδサブユニットのＣ−末端アミノ酸とＣ−末端融
合ペプチドの間に２つの追加のアミノ酸（Ｔｈｒ及びＳｅｒ）を含むことを可能
にした。この９０１ｂｐのＰＣＲ産物を、「Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈ
ｏｌＡ遺伝子（δサブユニット）の同定」と題されるセクションにおいて前に記
載されたとおりにｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（商標名）に挿入した。このプラスミ
ドでＤＨ５α細菌を形質転換して、アンピシリン耐性陽性単離物からのプラスミ
ドを、０．９及び３．０ｋｂ断片を生じるＮｄｅＩ及びＫｐｎＩによる消化によ
り選抜した。挿入物両鎖はＤＮＡ配列決定により証明した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃
１３９８−１４０３及び１４０９−１４１１；プライマー、ＳＰ６，Ｔ７，Ｐ１
３４−Ｓ１２７９，Ｐ１３４−Ｓ１６３３，Ｐ１３４−Ａ１４６４，Ｐ１３４−
Ａ７９０，Ｐ１３４−Ｓ１２７９，Ｐ１３４−Ａ１８４９）。このプラスミドを
ｐＴ−ＴＤ（Ｓｐｅ）と命名し、単離物をストック培養液として保存した（ＡＴ
Ｇグリセロールストック＃８１８）。
【０２１１】 プラスミドｐＴ−ＴＤ（ｓｐｅ）を調製して、ｈｏｌＡ遺伝子をＮｄｅＩとＫ
ｐｎＩ制限酵素による消化により抽出した。この０．９ｋｂの断片を、同じ制限
酵素により消化したｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩプラスミドに挿入した。このプラス
ミドでＤＨ５α細菌を形質転換して、アンピシリン耐性陽性単離物からのプラス
ミドを、０．９及び５．６５ｋｂ断片を生じるＮｄｅＩ及びＫｐｎＩによる消化
により選抜した。挿入されたＤＮＡ断片の配列はＤＮＡ配列決定により証明した
（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１４３０，１４３１；プライマー、Ｐ３８−Ｓ５５７６及
びＰ１３４−Ｓ１６３３）。このプラスミドをｐＡ１−ＣＢ−ＴＤと命名し、単
離物をストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃８４２）
。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＣ−末端オエに融合させたＴ．ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδサブユニットのｐＡ１−ＣＢ−ＴＤ／ＭＧＣ１０３０
による発現の証明 ｐＡ１−ＣＢ−ＴＤプラスミドを調製して、ＭＧＣ１０３０細菌を形質転換し
た（ＡＴＧグリセロールストック＃８５９）。３つの単離物の細菌の生育及び全
細胞蛋白質の単離は実施例２に記載されたとおりであった。各単離物からの全細
胞蛋白質を含む小アリコートの各上清（３μｌ）を、４−２０％のＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル
／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％Ｓ
ＤＳ中で電気泳動した。ミニゲルをクマジーブルーで染色した。ＣＢ−ＴＤが予
測されたゲルの領域は他の強い蛋白質バンドを含み、そしてδは可視化されなか
った。
【０２１２】 次に、実施例２に記載されたとおりに、各溶解物の中の全蛋白質をポリアクリ
ルアミドゲルからニトロセルロースに移した。各レーンは、１．５ｕｌの上清を
含んだ。内在Ｅ．ｃｏｌｉビオチン−ＣＣＰ，〜２０ｋＤａが誘導サンプル及び
非誘導サンプルの両方で検出可能であった。δに相当する極めて弱いバンドが、
ギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの４０ｋＤａ分子量スタンダードのすぐ下を移動
した。δの予測された分子量は３６．２ｋＤａであった。この蛋白質は誘導され
た培養物中で弱いバンドとして観察されたが、溶解物の中の非誘導対照において
は観察されなかった。蛋白質バンドの強度は、δが極めて低いレベルで発現され
つつあったことを示した。 翻訳共役ベクターｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＣｌａＩへのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓのｈｏｌＡ遺伝子（δ）のクローン化 天然蛋白質として効率よくδを発現するため、我々は、翻訳共役蛋白質として
δを発現するベクターをデザインした。翻訳共役蛋白質としてのＤｎａＸの発現
におけるように、ここでの我々の到達点は実施例２に記載されたとおりに翻訳共
役を用いることでもある。ｈｏｌＡ遺伝子をＣＣＡ付加酵素の後ろに挿入して、
２工程で翻訳共役させた。最初に、ｈｏｌＡ遺伝子をｐＡ１−ＴＤを鋳型として
用いてＰＣＲにより増幅した。フォワード／センスプライマー（ＡＴＧプライマ
ー＃Ｐ１３４−Ｓ５５８ｃｌａ２，５’−ＡＣＴＧＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＧＴＣ ＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）は、非相補領域
中にＣｌａＩ制限部位を含む。ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＸに関して開発されたクロ
ーン化戦略におけるように、非相補領域は、上流のＣＣＡ付加蛋白質断片のため
の停止（ＴＡＡ）の「ＴＡ」も含む。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ
遺伝子の５’末端に相補なプライマーの領域は、「ＡＴＧ」開始コドンの第１ヌ
クレオチドであり「ＴＡＡ」停止コドンの最後の「Ａ」である、「Ａ」で始まる
。リバース／アンチセンスプライマー（ＡＴＧプライマー＃Ｐ１３４−Ａ１４９
ｓｔｏｐｓｐｅ，５’−ＧＡＧＧＴＡＣＴＡＧＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＣＧＡＧ ＧＣＧＧＡＧＧＡ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）は、プライマーの非相
補部分中のＳｐｅＩ制限部位を含み、天然停止コドンに隣接した追加の停止コド
ンも含むから、タンデムに２つの停止コドンを提供する。次に、ＰＣＲ産物をＣ
ｌａＩ／ＳｐｅＩ制限酵素で消化して、同じ酵素で消化したｐＴＡＣ−ＣＣＡ−
ＣｌａＩプラスミドに挿入した。当該プラスミドでＤＨ５αを形質転換して、ア
ンピシリン耐性陽性単離物からのプラスミドを、０．９及び５．５ｋｂ断片を生
じるＣｌａＩ／ＳｐｅＩ制限酵素による消化により選抜した。挿入物の両方の鎖
の存在はＤＮＡ配列決定により証明した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１６７５−１６８
１；プライマー，Ｐ１４４−Ｓ２３，Ｐ１４４−Ａ１９６５，Ｐ６５−Ａ１０６
，Ｐ１３４−Ｓ１２７９，Ｐ１３４−Ｓ１６３３，Ｐ１３４−Ａ１８４９，Ｐ１
３４−Ａ１４６４，Ｐ１３４−Ａ７９０）。正確な配列が挿入領域中に含まれた
ことを配列分析が確証した。このプラスミドをｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＤと命名し
て、単離物をストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃１
０３１）。 ＰＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＤ／ＭＧＣ１０３０及びｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＤ／ＡＰ１
．Ｌ１による天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδサブユニットの発現の証明 ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＤプラスミドを調製して、ＭＧＣ１０３０細菌（ＡＴＧ
グリセロールストック＃１０７０）及びＡＰ１．Ｌ１（ＡＴＧグリセロールスト
ック＃１０７８）を形質転換した。細菌プラスミド及び全細胞蛋白質の単離は、
実施例#２に記載されたとおりであった。全細胞蛋白質を含む小アリコートの各
上清（３μｌ）を、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖ
ｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉ
ｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。ミニゲル
をクマジーブルーで染色した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδの分子量（３
２．５ｋＤａ）に相当する蛋白質バンドが可視化され、ギブコ１０ｋＤａ蛋白質
ラダーの３０ｋＤａと４０ｋＤａの分子量スタンダードの間の中間を移動した。
ｐＡ１−ＣＣＡ−ＴＤ／ＡＰ１．Ｌ１の大規模生育 実施例＃２に記載されたとおりに、株ｐＡ１−ＣＣＡ−ＴＤ／ＡＰ１．Ｌ１を
２５０Ｌの発酵機中で生育して、天然のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδの精
製のために細胞を製造した。最適誘導時間は実施例＃２に記載されたとおりに決
定した。細胞の回収は、３．３８のＯＤ600において誘導から３時間後に開始し
て、回収の間は細胞を１０℃に冷却した。回収容量は１８０Ｌであって、最終回
収重量は約１．５６ｋｇの細胞ペーストであった。等量（ｗ／ｗ）の５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０％蔗糖溶液を細胞ペーストに加えた。質のコン
トロールの結果は、接種物中アンピシリン含有培地上の１０の陽性コロニー中１
０を示し、そして回収時のアンピシリン含有培地上の１０の陽性コロニー中１０
を示した。細胞は細胞懸濁液を液体窒素に注ぐことにより凍結して、加工まで−
２０℃に保存した。 ｐＡ１−ＣＣＡ−ＴＤからの天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ δの精製 発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδサブユニットを保有する細胞の
スフェロプラストの創製により、溶解を達成した。最初に、−２０℃にて保存し
てあったＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞の１：１懸濁液３００ｇ（１５０ｇ細胞）
を調製した（９３０ｍｌ，１６．４ｍｇ／ｍｌ）。調製は実施例２に記載された
とおりであった。Ｆｒ Ｉに、硫酸アンモニウム（各初期ｍｌ画分Ｉ−４５％飽
和まで０．２５８ｇ）を１５分間隔で加えた。混合物をさらに３０分間４℃にお
いて撹拌して、沈殿物を遠心分離（２３，０００ ｘ ｇ，４５分、０℃）によ
り回収した。結果の沈殿物を液体窒素に浸すことにより素早く凍結させて、−８
０℃に保存した。
【０２１３】 次の精製工程においては、精製カラムからの画分を再構成アッセイを用いてア
ッセイすることにより（実施例７に記載される）、活性を、従ってδサブユニッ
トを含んだ画分を決定した。最初の精製工程は、Ｑセファロース高性能（アマシ
ャムファルマシア）カラムクロマトグラフィー（２００ｍｌ，５．５ ｘ １３
ｃｍ）により実施した。Ｑセファロース樹脂はＱ−セファロース平衡バッファー
（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ７．５），１０％グリセロール、１ｍＭ
ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，１０ｍＭ ＫＣｌ）中で平衡化した。Ｆｒ Ｉか
らの沈殿物をＱセファロース再懸濁バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
（ｐＨ７．５），１０％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ）に
再懸濁して、ダウンスホモジェナイザーによりホモジェナイズして、遠心分離（
１６，０００ ｘ ｇ）により透明にした。平衡化されたカラムの伝導率に達す
るまで、サンプルをＱ−セファロース再懸濁バッファーにて希釈し、Ｆｒ ＩＩ
とした（２２５０ｍｌ，０．８ｍｇ／ｍｌ）。画分ＩＩは１．８４ ｘ １０6
ユニット／ｍｇ蛋白質にて３．５ ｘ １０9ユニットの活性を含んだ。サンプ
ルを上記カラムに負荷して、５カラム容量のＱ−セファロース平衡化バッファー
で洗浄した。洗浄物を１７ｍｌ画分（５０画分）に回収した。カラム負荷（ロー
ド）（ｌｏａｄ）からのフロースルー及び分画された洗浄物の分析は、δがカラ
ム負荷からのフロースルー及びカラム洗浄物からの第１の画分の中に存在したこ
とを示した。カラムフローからのフロースルー及びカラム洗浄物の画分１−１３
をプールし、Ｆｒ ＩＩＩとした（２４７０ｍｌ，０．０５ｍｇ／ｍｌ）。プー
ルのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル分析は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓのδがこの精製工程により１６倍以上精製されて、３．２ ｘ １０7 ユニット／ｍｇ蛋白質にて３．５ ｘ １０9ユニットの活性を含んだことを示
した。
【０２１４】 Ｆｒ ＩＩＩはＭａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣ Ｓｕｐｐｏｒ
ｔ（バイオラッド）カラムクロマトグラフィーを用いてさらに精製した。メチル
樹脂（６０ｍｌ）をメチル平衡バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐ
Ｈ７．５），１０％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ、１Ｍ硫
酸アンモニウム）中で平衡化した。メチル樹脂４０ｍｌを用いて、カラムを流し
た。残りの２０ｍｌのメチル樹脂をＦｒ ＩＩＩと混合して、２４９０ｍｌにし
た。この混合物に、飽和した硫酸アンモニウム（０．５サンプル容量）をゆっく
りと１時間かけて撹拌しながら加えた。この混合物をカラムに加えて、重力によ
りカラムを通過させた。次に、カラムを５カラム容量（３００ｍｌ）のメチル平
衡バッファーで洗浄した。蛋白質を１０カラム容量の、０．９から０．１Ｍの硫
酸アンモニウム勾配を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ７．５），１０
％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴバッファーに溶出して、７
ｍｌの画分（８０画分）に回収された。画分２９−４２は９０％を超える純度の
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδを含んだ。これらの画分をプールして、再構
成アッセイ（実施例７を参照）及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて分
析した。プールされた画分（１００ｍｌ，０．１４ｍｇ／ｍｌ）はＦｒ ＩＶを
含み、そして１．２３ ｘ １０8ユニット／ｍｇ蛋白質において１．７ ｘ
１０9ユニットの活性を含んだ。
【０２１５】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδをさらに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
（ｐＨ７．５），２０％グリセロール、１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｍＭ ＥＤＴＡ
，５ｍＭ ＤＴＴで平衡化した、セファクリルＳ３００ ＨＲ（ファルマシアバ
イオテック）ゲル濾過カラム（５１０ｍｌ，３ｃｍ ｘ １２０ｃｍ）を用いて
精製した。Ｆｒ ＩＶの容量はＰＥＧ８０００を用いて３５ｍｌまで減少させた
（０．２２ｍｇ／ｍｌ，８．２ ｘ １０8ユニット）。サンプルをセファクリ
ルＳ−３００カラムに負荷して、蛋白質を０．７ｍｌ／分の流速にて溶出した。
δサブユニットは高い精製度の蛋白質として単離された（２４ｍｌ，０．２ｍｇ
／ｍｌ）。プールされた画分はＦｒ Ｖとし、１．２３ ｘ １０8ユニット／
ｍｇ蛋白質において５．８ ｘ １０8ユニットの活性を含んだ 実施例５ Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺伝子（δ’サブユニット）の同定 Ｅ．ｃｏｌｉからのδ’のアミノ酸配列を用いて、ゲッチンゲンゲノミックス
研究所においてＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノムデータベースを検索した
。仮想Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺伝子を含むＴ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓゲノムの領域の部分的な未加工の配列が同定されて、得られた（Ｄ
ｒ．Ｃａｒｓｔｅｎ Ｊａｃｏｂｉ，ゲッチンゲンゲノミックス研究所、微生物
学及び遺伝学研究所、グリーゼバッハ通り８、ゲッチンゲン、独国）。上記未加
工の配列の正確さが不明確なため、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺
伝子及び周囲の領域を含む疑いのあるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノム領
域をＰＣＲにより増幅した。正確な配列が同定されることを確かにするために未
加工の配列に由来する配列を用いて、２セットのＰＣＲプライマーをデザインし
た。最初のＰＣＲ反応（ＡＴＧプライマーＰ１３９−Ｓ１８１，５’−ＧＧＧＧ
ＧＡＣＣＧＧＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）及び
Ｐ１３９−Ａ１０８２，５’−ＧＴＡＣＧＣＣＣＡＣＧＧＴＣＡＴＧＴＣＴＣＴ
ＡＡＧＴＣＴ ＡＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３））は、Ｔ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓゲノミックＤＮＡを鋳型として用い、９０１ｂｐ断片のＰＣＲ
産物を生じた。このＰＣＲ産物を製造者の指示書に従いｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ
（商標名）（プロメガ）ベクターに挿入した。このプラスミドでＤＨ５αを形質
転換して、アンピシリン耐性陽性単離物を、０．９及び３．０ｋｂ断片を生じる
ＥｃｏＲＩ制限消化による消化に関して選抜した。挿入された領域の中のＤＮＡ
の両鎖の正確な配列は、挿入された領域を横切ってＤＮＡ配列決定により確認し
た（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１３６３，１３６５−１３６７，１３７９−１３８０；
プライマー、ＳＰ６，Ｔ７，Ｐ１３９−Ｓ６５１，Ｐ１３９−Ｓ３２１，Ｐ１３
９−Ａ６８１，Ｐ１３９−Ａ２８７）。これらの塩基の変化（８４５及び８４９
位における「Ｃ」の欠失、及び６８１位におけるＧ＞Ｃの変化）が、ゲッチンゲ
ンゲノミックス研究所から得た未加工の配列に比較して、ＰＣＲクローン中にお
いて観察された。上記欠失は、未加工配列において観察されたよりも大きなオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（８０４ｂｐ）を導くフレームシフトを引
き起こした。このプラスミドをｐＴ−ＴＤ’−１と命名して、単離物をストック
培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃８１１）。
【０２１６】 第２のＰＣＲ反応は、仮想ｈｏｌＢ遺伝子から離れて位置するプライマーを利
用して（ＡＴＧプライマー＃Ｐ１３９−Ｓ９１，５’−ＣＴＣＣＣＣＣＣＣＴＣ
ＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）及
び＃１３９−Ａ１４０７，５’−ＣＴＣＧＧＣＧＣＴＧＴＡＧＴＧＧＡＴＧＡＣ
Ｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５））、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノ
ミックＤＮＡも鋳型として用い、１３６１ｂｐ断片のＰＣＲ産物を生じた。この
ＰＣＲ断片もｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（商標名）（プロメガ）ベクターにも製造
者の指示に従い挿入した。このプラスミドでもＤＨ５α細菌を形質転換して、ア
ンピシリン耐性陽性単離物を、１．３及び３．０ｋｂ断片を生じるＥｃｏＲＩ制
限消化による消化に関して選抜した。挿入された領域の中のＤＮＡの両鎖の正確
な配列は、挿入された領域を横切ってＤＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ
ＳＥＱ ＃１３６８−１３７２，１３８１−１３８３；プライマー、ＳＰ６，Ｔ
７，Ｐ１３９−Ｓ６５１，Ｐ１３９−Ｓ３２１，Ｐ１３９−１０４２，Ｐ１３９
−Ａ６８１，Ｐ１３９−Ａ２８７，Ｐ１３９−Ａ１０８２）。ゲッチンゲンゲノ
ミックス研究所から得た未加工の配列に比較して、３’非翻訳領域において他の
塩基の変化が観察された。このプラスミドをｐＴ−ＴＤ’−２と命名して、単離
物をストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃８１２）。
【０２１７】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺伝子のＤＮＡコーディング配列（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）は図２２にある。開始コドン（ａｔｇ）と停止コド
ン（ｔｇａ）を太字で印字する。また、図２３には、ＤＮＡコーディング配列由
来の蛋白質（アミノ酸）配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）も示す。
【０２１８】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’のアミノ酸配列をＥ．ｃｏｌｉのδ’サ
ブユニットのそれと比較した（図２４）。他の配列整列化をＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｅ．ｃｏｌｉ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａｅ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａからのδ’配列及びＡｑｕｉｆｌｅｘ ａｅｏｌ
ｉｃｕｓからの仮想δ’配列と実施した（図２５）。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓのδ’サブユニットは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｅ．ｃｏｌ
ｉ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ
からのδ’配列及びＡｑｕｉｆｌｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓからの仮想δ’配列と
、それぞれ、１６３、１４９、２２９、１０４及び１０４アミノ酸オーバーラッ
プにわたり、３０％、２９％、３１％、３９％及び３１％同一であった。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ（δ’）を過剰発現するプラスミド（ｐＡ
１−ＮＢ−ＴＤ’）の構築 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ δ’サブユニットの発現を増強するために、
ｈｏｌＢ遺伝子をｐＡ１−ＮＢ−ＡｇｅＩプラスミドにクローン化して、ヘキサ
ヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチド認識され融合させて発現
させた。ｈｏｌＢ遺伝子はＰＣＲによりｐＡ１−ＴＤ’プラスミド（下記）を鋳
型として用いて増幅した。フォワード／センスプライマーは上記遺伝子の５’末
端にＰｓｔＩ部位を付加することにより、実際のＰＣＲ産物がＡＴＧコドンを排 除 して、コドン２から始まり、ＰｓｔＩ部位はコドン２に隣接する（ＡＴＧプラ
イマーＰ１３９−Ｓ２５４ｐｓｔ，５’−ＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＴＡ ＣＡＣＣＣＧＧＣＴＣＡＣＣＣ −３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８））。Ｐｓｔ
Ｉ部位はｈｏｌＢ遺伝子をＮ−末端融合ペプチドのインフレームに導き、そして
Ｎ−末端融合ペプチドとｈｏｌＢ遺伝子の第２コドンの間に追加の２アミノ酸（
ＬｅｕとＧｌｎ）を付加することになる。リバースプライマー（ＡＴＧプライマ
ーＰ１３９−Ａ１０８１ｓｔｏｐｓｐｅ，５’−ＧＧＡＣＡＣＴＡＧＴＴＣＡＴ ＣＡＴＧＴＣＴＣＴＡＡＧＴＣＴＡＡ −３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９））は
、追加のＡＴＧ（停止コドン）を含むｈｏｌＢ遺伝子の３’末端に相補であった
。また、ＳｐｅＩ制限部位を上記ベクターへの挿入のためにプライマーの非相補
領域内に加えた。ＳｐｅＩにより効率よく切断するためのクランプ領域も存在し
た。ＰＣＲ産物はＰｓｔＩ／ＳｐｅＩ制限酵素により消化して、同じ制限酵素に
より消化したｐＡ１−ＮＢ−ＡｇｅＩプラスミドへ挿入した。該プラスミドでＤ
Ｈ５αを形質転換して、アンピシリン耐性陽性単離物からのプラスミドを、０．
８及び５．６ｋｂの断片を生じるＰｓｔＩ／ＳｐｅＩ制限酵素による消化に関し
て選抜した。挿入物の両鎖の配列はＤＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ Ｓ
ＥＱ ＃１５３７−１５４１，１５４３；プライマー，Ｐ６４−Ｓ１０．Ｐ６４
−Ａ２１５，Ｐ１３９−Ｓ３２１，Ｐ１３９−Ｓ６５１，Ｐ１３９−Ａ６８１，
Ｐ６４−Ａ２１５）。配列分析は、正確な配列が挿入領域に含まれたことを確証
した。このプラスミドをｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ’と命名して、単離物をストック培
養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃９１３）。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ δ’サブユニットのｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ’／ＭＧＣ
１０３０による発現の証明 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ’プラスミドを製造して、ＭＧＣ１０３０細菌を形質転換
した（ＡＴＧグリセロールストック＃９３０）。細菌の生育及び全細胞蛋白質の
単離は実施例２に記載されたとおりであった。全細胞蛋白質を含む小アリコート
の各上清（３μｌ）を、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎ
ｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴ
ｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。ミニ
ゲルをクマジーブルーで染色した。ギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの４０ｋＤａ
スタンダードのすぐ下を移動する蛋白質は溶解物中に検出できなかった。
【０２１９】 次に、実施例２に記載されたとおりに、各溶解物の中の全蛋白質をポリアクリ
ルアミドゲルからニトロセルロースに写した（ブロットした）。内在Ｅ．ｃｏｌ
ｉビオチン−ＣＣＰ、〜２０ ｋＤａは誘導及び非誘導サンプルの何れにおいて
も検出可能であった。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’に相当する強い蛋白
質バンドが、ギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの３０ｋＤａと４０ｋＤａ分子量ス
タンダードの間の中間を移動した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’の予測
された分子量は３３ｋＤａである。この蛋白質は誘導培養物の中では明確なバン
ドとして検出されたが、非誘導対照においては溶解物の中に観察されなかった。
ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ’によるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺伝子（
δ’サブユニット）の発現の最適化 異なる誘導時間においてｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ’プラスミドを保有する細菌株Ａ
Ｐ１／Ｌ１を用いて発現を分析した。細菌の生育と分析は実施例２に記載された
とおりに実施した。生育と分析は３７℃においてであった。全蛋白質をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電泳動及びビオチンブロット分析の両方を用いて分析し
た（図２６）。δ’に相当する明確な蛋白質のバンドが両形態の分析において観
察された。ビオチンブロット分析は、ほとんどのδ’サブユニットが４時間以内
に３７℃において発現されつつあることを示したため、これらの条件を次の調製
において使用した。 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ’／ＭＧＣ１０３０によるヘキサヒスチジン及びビオチン化
部位を含むＮ−末端ペプチドに融合されたδ’サブユニットの最適な硫酸アンモ
ニウム沈殿条件の測定 発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’サブユニットを保有する細胞
のスフェロプラストの創製により、溶解を達成した。最初に、実施例２に記載さ
れたとおりに、−２０℃に保存されていたＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞の１：１
懸濁液７６．４ｇ（３８．２ｇ細胞）から、ＦｒＩＩを調製して、Ｎｉ++−ＮＴ
Ａカラムを用いて精製した。溶出したサンプルは、Ｎｉ−ＮＴＡ懸濁バッファー
の添加により４０ｍｌにした。次に、サンプルを４つの等容量に分割（１０ｍｌ
）して、１．６４，２．２６，２．９１及び３．６１ｇの硫酸アンモニウム（３
０％、４０％、５０％及び６０％飽和）を各別々のサンプルにそれぞれ１５分間
隔で４℃にて加えた。混合物はさらに３０分間４℃において放置して、次に、０
℃において２３，０００ ｘ ｇにて４５分間遠心分離した。結果の沈殿物を１
ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ懸濁バッファーに懸濁した。３０％、４０％、５０％及び６
０％の硫酸アンモニウムで沈殿させたサンプルは、それぞれ０．４７，０．５５
，１．３及び１．２ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度を含んだ。サンプルは、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。４つの硫酸アンモニウム沈殿サ
ンプルの全てが等量のδ’サブユニットを含んだ。δ’サブユニットの以後の全
ての調製は３５％飽和の硫酸アンモニウムである。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺伝子産物（δ’サブユニット）のｐＡ１
−ＮＢ−ＴＤ’／ＭＧＣ１０３０による大規模な生育 株ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ’／ＭＧＣ１０３０を２５０Ｌの発酵機にて生育させて
、実施例２に記載されたとおりに、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’サブユ
ニット濃度を精製のために細胞を生成した。細胞の回収は５．８のＯＤ600にお
いて誘導の３時間後に開始して、回収の間は細胞を１０℃に冷却した。回収した
容量は１８６Ｌであり、最終の回収重量は約２．１ｋｇの細胞ペーストであった
。等量の（ｗ／ｗ）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０％蔗糖溶液を細
胞ペーストに加えた。細胞懸濁液を液体窒素に注ぐことにより、細胞を凍結させ
て、加工まで−２０℃において保存した。質のコントロールの結果は、接種物中
アンピシリン含有培地上で１０の陽性コロニー中１０であり、誘導中１０／１０
陽性コロニーであり、そして回収物中７／１０陽性コロニーであった。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ産物（δ’サブユニット）のｐＡ１−ＮＢ
−ＴＤ□／ＭＧＣ１０３０による精製 実施例２に記載されたとおりに、発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの
δ’サブユニットを保有する細胞のスフェロプラストの創製により、溶解を達成
した。最初に、−２０℃に保存されていたＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞の１：１
懸濁液８００ｇ（４００ｇ細胞）から、ＦｒＩを調製した（１２００ｍｌ，１７
ｍｇ／ｍｌ）。ＦｒＩに対して、硫酸アンモニウム（各初期ｍｌ画分Ｉ−３５％
まで０．１９４ｇ）を１５分間隔で４℃にて加えた。混合物はさらに３０分間４
℃において放置して、遠心分離により沈殿物を回収した（０℃において２３，０
００ ｘ ｇにて４５分間）。結果の沈殿物を液体窒素への浸潤により素早く凍
結させて、−８０℃に保存した。
【０２２０】 Ｆｒ Ｉからの沈殿物を１５０ｍｌのＮｉ++−ＮＴＡ懸濁バッファー中に懸濁
して、ダウンスのホモジェナイザーによりホモジェナイズした。サンプルは遠心
分離（１６，０００ ｘ ｇ）により透明にして、上清をＦｒ ＩＩ（４ｍｇ／
ｍｌ）とした。Ｆｒ ＩＩを５０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂の５０％スラリーに加
え、１．５時間４℃において振盪させた。このスラリーを次にバイオラッドのＥ
ｃｏｎｏ−カラム（２．５ ｘ ５ｃｍ）に負荷した。カラムを４００ｍｌのＮ
ｉ++−ＮＴＡ洗浄バッファー中で１．５ｍｌ／分の流速で洗浄した。ＮＢ−ＴＤ
’蛋白質を、１０−２００ｍＭのイミダゾール勾配を含む２００ｍｌのＮｉ++−
ＮＴＡ溶出バッファーに溶出した。溶出物を９２ ｘ ２ｍｌ画分中に回収した
。画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析して、画分４０―
７５が９５％を超える純度でδ’を含んだことがわかった（図２７Ａ及び２７Ｂ
）。
【０２２１】 画分４０−７５をプールして（７０ｍｌ，０．７ｍｇ／ｍｌ）、２．５ＬのＨ
Ｇ．０４バッファー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，（ｐＨ７．６），４０ｍＭ ＫＣ
ｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，６ｍＭ βＭＥ，１０％グリ
セロール）に対して透析した。透析したサンプルはＦｒ ＩＩＩとした（７０ｍ
ｌ，０．５ｍｇ／ｍｌ）。プールから、７５％のサンプルをアリコートにして、
液体窒素中で素早く凍結して、−８０℃に保存した。残りの２５％を抗体産生の
ためにさらに精製した。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’に対するポリクローナル抗体の産生 上で論じた２５％のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ δ’ ＦｒＩＩＩは、硫
酸アンモニウムを４０％飽和まで添加することにより沈殿させた（初期ｍｌあた
り０．２２６ｇの硫酸アンモニウム）。蛋白質沈殿物を２ｍｌの２０ｍＭリン酸
カリウム、ｐＨ６．５，１００ｍＭ ＫＣｌ，２５％グリセロール及び５ｍＭ
ＤＴＴのバッファーに懸濁した。サンプルを同じバッファーで平衡化したセファ
クリルＳ−３００カラム（８８ｍｌ；４０：１の高さ：幅比率）上に負荷した。
これは、カラムの上部を樹脂ベッドに対して下にして稼働させ、サンプルを加え
（２ｍｌ）、サンプルを樹脂内へ移動させてカラム上部を再構成させることによ
り達成した。次に、サンプルを流速０．２ｍｌ／分にて同じバッファー中に溶出
して、１．５ｍｌ画分中へ回収した。各画分の蛋白質濃度は、クマジーブルー蛋
白質アッセイ試薬を用いて測定した（図２８）。画分はＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分析して、画分が均質なδ’を含むことが観察された（
図２９）。
【０２２２】 画分３０から４０をプールして、前記のとおりに硫酸アンモニウムを４０％飽
和まで添加することにより、蛋白質を沈殿させた。次に、蛋白質を３ｍｌのＰＢ
Ｓに再懸濁して、５００ｍｌのＰＢＳに対して２回透析した。これをＦｒ ＩＶ
とし、抗体産生に使用した。透析したサンプルを使用して、実施例３に記載され
たとおりに、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺伝子産物（δ’サブユ
ニット）に対するポリクローナル抗体を産生した。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺伝子（δ’サブユニット）を天然蛋
白質として過剰発現するプラスミド（ｐＡ１−ＴＤ’）の構築 Ｎ−末端標識蛋白質としてδ’サブユニットを発現するためのベクターｐＡ１
−ＮＢ−ＴＤ’の構築の前に、天然及びＣ−末端標識蛋白質としてδ’をまず発
現させるためのいくつかの試みがなされた。これらの試みは、δ’の十分な収量
を生じて精製の試みを正当であると理由付けするには不成功であった。これらの
試みがこのセクションに記載される。
【０２２３】 ｈｏｌＢ遺伝子をＰＣＲによりｐＴ−ＴＤ’−２を鋳型として用いて増幅して
、天然蛋白質として発現させた。フォワード／センスプライマー（ＡＴＧプライ
マー ＃Ｐ１３９−Ｓ２５３，５’−ＣＴＴＴＣＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＡＣ ＡＣＣＣＧ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）は、上記遺伝子の５’末端に
相補な領域を含んだ。ＮｃｏＩ部位はＡＴＧ開始コドンとオーバーラップした。
リバース／アンチセンスプライマー（ＡＴＧプライマー ＃Ｐ１３９−Ａ１０８
５，ＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＴＣＴＣＴＡＡＧＴＣＴＡ ＡＧＧＣ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）は、天然の停止コドンに隣接し
て追加の停止コドンを含むことにより、タンデムに２つの停止コドンを提供した
。第２の停止コドンに隣接してＦｓｅＩ部位が存在し、そしてＦｓｅＩ制限部位
に隣接してＢａｍＨＩ制限部位が存在する。このＰＣＲ断片をＮｃｏＩとＦｓｅ
Ｉ制限酵素により消化して、同じ２つの酵素により消化したプラスミドｐＡ１−
ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入した。当該プラスミドを再度閉じて、ＤＨ５α細菌を形質
転換した。アンピシリン耐性陽性単離物からのプラスミドは、０．８及び５．６
ｋｂの断片を生じるＮｃｏＩとＦｓｅＩ制限消化により選抜した。挿入された領
域の配列はＤＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１４４７−１４
５０；プライマー、Ｐ３８−Ｓ５５７６，Ｐ６５−Ａ１０６，Ｐ１３９−Ｓ６５
１及びＰ１３９−Ａ６８１）。上記クローンの配列はＦｓｅＩ制限部位の下流の
予測されなかった追加の塩基を示したが、挿入物の残りは正確な配列を有した。
よって、ＮｃｏＩ／ＦｓｅＩ断片は正確な配列を有した。このプラスミドをｐＡ
１−ＴＤ’（ａ）と命名して、単離物をストック培養液として保存した（ＡＴＧ
グリセロールストック＃８４４）。下流の領域が正確な配列を含んだことを確認
するため、ｐＡ１−ＴＤ’（ａ）をＮｃｏＩ／ＦｓｅＩ制限酵素で消化して、同
じ制限酵素で消化した別のｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミドに挿入した。この
プラスミドを再度閉じて、これでもＤＨ５α細菌を形質転換した。０．８及び５
．６ｋｂの断片を生じるＮｃｏＩとＦｓｅＩ制限消化により、アンピシリン耐性
コロニーからのプラスミドを再び選抜した。挿入された領域の配列は、再び、Ｄ
ＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１４７３−１４７６，１４８
５；プライマー、Ｐ３８−Ｓ５５７６，Ｐ６５−Ａ１０６，Ｐ１３９−Ｓ６５１
，Ｐ１３９−Ａ６８１及びＰ１３９−Ｓ３２１）。配列分析は、配列決定された
領域を通して正確な配列を証明した。このプラスミドをｐＡ１−ＴＤ’と命名し
て、単離物をストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃８
７８）。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺伝子（δ’サブユニット）を天然蛋
白質としてｐＡ１−ＴＤ’／ＭＧＣ１０３０から過剰発現するプラスミド（ｐＡ
１−ＴＤ’）の発現の証明 プラスミドｐＡ１−ＴＤ’をＤＨ５α細菌から調製した。該プラスミドでＭＧ
Ｃ１０３０細菌を形質転換した（ＡＴＧグリセロールストック＃８９３，８９４
，８９５）。３つの単離物の細菌の生育及び全細胞蛋白質の単離は実施例２に記
載されたとおりであった。３つの単離物の各々からの全細胞蛋白質を含む小アリ
コート（３μｌ）の上清を、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル
（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭ
のＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。
ミニゲルをクマジーブルーで染色した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’の
予測された分子量に相当する単離物の何れからの可視蛋白質バンドもなかった。
ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＣ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ（δ’サブユニット）を過剰発現するプラ
スミド（ｐＡ１−ＣＢ−ＴＤ’）の構築 再び、天然のδ’を発現する試みが失敗したので、Ｃ−末端融合ペプチドに該
蛋白質をカップリングさせることにより、この蛋白質の発現を試みた。Ｔ．ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢをコードする遺伝子をＰＣＲによりｐＴ−ＴＤ
’−２プラスミドを鋳型として用いて増幅した。フォワード／センスプライマー
（ＡＴＧプライマー＃Ｐ１３９−Ｓ２５３）は、ｐＡ１−ＴＤ’の構築において
使用したのと同じプライマーであり、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ
遺伝子の５’末端に相補な領域を含んだ。前のように、ＮｃｏＩ部位はＡＴＧ開
始コドンとオーバーラップした。リバース／アンチセンスプライマーは、停止コ
ドンを除くＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺伝子の３’末端に相補で
あった（ＡＴＧプライマー＃Ｐ１３９−Ａ１０７５，５’−ＧＡＧＧＡＣＴＡＧ
ＴＴＧＴＣＴＣＴＡＡＧＴＣＴＡＡ ＧＧＣ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
６）。このプライマーは、プライマーの相補領域に隣接してＳｐｅＩ制限部位を
含んだ。ＳｐｅＩ部位は、発現された蛋白質が、δ’サブユニットのＣ−末端ア
ミノ酸とＣ−末端融合ペプチドの間に２つの追加のアミノ酸（ＴｈｒとＳｅｒ）
を含むことを可能にさせる。この８２２ｂｐのＰＣＲ産物をＮｃｏＩとＳｐｅＩ
制限酵素により消化して、同じ制限酵素で消化したプラスミドｐＡ１−ＣＢ−Ｎ
ｃｏＩに挿入した。このプラスミドでＤＨ５α細菌を形質転換して、アンピシリ
ン耐性陽性単離物からのプラスミドを、０．８及び５．６ｋｂの断片を生じるＮ
ｃｏＩとＦｓｅＩによる消化に関して選抜した。挿入された領域の配列は、ＤＮ
Ａ配列決定により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１５００−１５０３；プライマ
ー、Ｐ３８−Ｓ５５７６，Ｐ６５−Ａ１０６，Ｐ１３９−Ｓ６５１，Ｐ１３９−
Ｓ３２１）。このプラスミドをｐＡ１−ＣＢ−ＴＤ□と命名し、そして単離物を
ストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃８９６）。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＣ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’サブユニットのｐＡ１−ＣＢ−ＴＤ’／ＭＧＣ
１０３０による発現の証明 ｐＡ１−ＣＢ−ＴＤ’プラスミドを製造して、ＭＧＣ１０３０細菌（ＡＴＧグ
リセロールストック＃９２０）を形質転換した。３つの単離物の細菌の生育及び
全細胞蛋白質の単離は実施例２に記載されたとおりであった。３つの単離物の各
々からの全細胞蛋白質を含む小アリコート（３μｌ）の上清を、４−２０％のＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、
１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び
０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。ミニゲルをクマジーブルーで染色した。δ’
が予測されたゲルの領域は他の強い蛋白質バンドを含み、そしてδ’は可視化で
きなかった。
【０２２４】 次に、実施例２に記載されたとおりに、各溶解物中の全蛋白質をポリアクリル
アミドゲルからニトロセルロースへ転写（ブロット）した。各レーンは、１．５
ｕｌの上清を含んだ。ブロットされたニトロセルロース上の蛋白質は、上記のと
おりにホスファターゼ−配合ストレプトアビジンとの相互作用により可視化した
。内在のＥ．ｃｏｌｉビオチン−ＣＣＰ、〜２０ｋＤａが誘導及び非誘導サンプ
ルの両方において検出可能であった。δ’に相当する極めて弱い蛋白質バンドが
ギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの３０ｋＤａと４０ｋＤａの分子量スタンダード
の間の中間を移動した。この蛋白質は誘導培養物中で弱いバンドとして観察され
たが、非誘導の対照の溶解物の中では観察されなかった。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓのδ’は生育と精製を正当に理由付けするに際立って十分なほどの量で
発現されなかった。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺伝子（δ’）の翻訳共役ベクターｐ
ＴＡＣ−ＣＣＡ−ＣｌａＩへのクローン化 δ’を天然蛋白質として効率よく発現させるため、我々は、翻訳共役蛋白質と
してδ’を発現させるためのベクターをデザインした。到達点は、実施例＃２に
記載されたとおりの翻訳共役を使用することである。ｈｏｌＢ遺伝子をＣＣＡ付
加酵素の後ろに挿入して、２段階で翻訳共役させた。最初に、ｈｏｌＢ遺伝子を
ｐＡ１−ＴＤ’を鋳型としてＰＣＲにより増幅した。フォワード／センスプライ
マー（ＡＴＧプライマー＃Ｐ１３９−Ｓ２５０ｃｌａ２，５’−ＡＣＴＧＡＴＣ
ＧＡＴＡＡＴＧＧＣＴＣＴＡＣＡＣＣＣＧＧＣＴＣＡＣＣＣ−３’）（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：５７）は、非相補領域中にＣｌａＩ制限部位を含んだ。上記非相補
領域は、上流のＣＣＡ付加蛋白質断片のための停止（ＴＡＡ）の「ＴＡ」も含む
。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺伝子の５’末端に相補なプライマ
ーの領域は「Ａ」から始まるが、「ＡＴＧ」開始コドンの最初のヌクレオチドで
あり且つ「ＴＡＡ」停止コドンの最後の「Ａ」である。リバース／アンチセンス
プライマー（ＡＴＧプライマー＃Ｐ１３９−Ａ１０８１ｓｔｏｐｓｐｅ，５’−
ＧＧＡＣＡＣＴＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＴＣＴＣＴＡＡＧＴＣＴＡＡ−３’）（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）は、プライマーの非相補領域内にＳｐｅＩ制限部位
を含み、そして天然の停止コドンに隣接して追加の停止コドンも含むため、タン
デムに２つの停止コドンを提供する。ＳｐｅＩによる効率よい切断のためのクラ
ンプ領域も存在した。第２段階においては、ＰＣＲ産物をＣｌａＩ／ＳｐｅＩ制
限酵素により消化し、そして同じ制限酵素により消化したｐＴＡ−ＣＣＡ−Ｃｌ
ａＩプラスミドに挿入した。当該プラスミドでＤＨ５α細菌を形質転換して、ア
ンピシリン耐性陽性単離物からのプラスミドを、０．８及び５．５ｋｂの断片を
生じるＣｌａＩ／ＳｐｅＩによる消化に関して選抜した。挿入物の両方の鎖の配
列は、ＤＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１７３７−１７４２
；プライマー、Ｐ１４４−Ｓ２３，Ｐ６５−Ａ１０６，Ｐ１３９−Ｓ３２１，Ｐ
１３９−Ｓ６５１，Ｐ１３９−Ａ６８１，Ｐ１３９−Ａ１０８１ｓｔｏｐｓｐｅ
）。配列分析は、正確な配列が挿入領域中に含まれたことを証明した。このプラ
スミドをｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＤ’と命名し、そして単離物をストック培養液と
して保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃１０５５）。 ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＤ’／ＭＧＣ１０３０及びｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＤ’／Ａ
Ｐ１．Ｌ１から発現された天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’サブユニッ
トの発現の証明 ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＤ’プラスミドを製造して、ＭＧＣ１０３０細菌（ＡＴ
Ｇグリセロールストック＃１０８３）及びＡＰ１．Ｌ１（ＡＴＧグリセロールス
トック＃１０８０，１０８１，１０８２）を形質転換した。細菌の生育と全細胞
蛋白質の単離は実施例＃２に記載されたとおりであった。全細胞単を含む各上清
の小アリコート（３μＬ）を、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲ
ル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍ
ＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した
。ミニゲルをクマジーブルーで染色した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’
蛋白質バンドの予測された位置は天然のＥ．ｃｏｌｉの蛋白質の多くのバンドを
含むエリアの中にあり、そしてＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’はこれらの
他の蛋白質バンドをから分離することができなかった。 ｐＡ１−ＣＣＡ−ＴＤ’／ＡＰ１．Ｌ１の大規模な生育 実施例＃２に記載されたとおりに、株ｐＡ１−ＣＣＡ−ＴＤ’／ＡＰ１．Ｌ１
を２５０Ｌの発酵機中で生育させることにより、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
のδ’の精製のための細胞を生じさせた。最適な誘導時間は実施例＃２に記載さ
れた通りに決定した。細胞の回収は、３．１２のＯＤ600における誘導の３時間
後であり、回収の間は細胞を１０℃に冷却した。回収された容量は１７５Ｌであ
って、最終回収重量は約１．３７ｋｇの細胞ペーストであった。等量の（ｗ／ｗ
）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０％蔗糖の溶液を細胞ペーストに加
えた。質のコントロールの結果は、接種物中アンピシリン含有培地上で１０の陽
性コロニー中１０、そして誘導時における１０／１０陽性コロニー、そして回収
における１０／１０陽性コロニーであった。細胞懸濁液を液体窒素に注ぐことに
より細胞を凍結させて、加工まで−２０℃に保存した。 ｐＡ１−ＣＣＡ−ＴＤ’からの天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’の精製 発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’を保有する細胞のスフェロプ
ラストの創製により溶解を達成した。最初に、−２０℃において保存されていた
Ｔｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞の１：１懸濁液４００ｇから（２００ｇ細胞）、Ｆ
ｒＩを調製した（７００ｍｌ，１３．７ｍｇ／ｍｌ）。調製は、実施例＃２に記
載されたとおりであった。ＦｒＩに、硫酸アンモニウム（画分Ｉ−４５％飽和各
々に対して０．２５８ｇ）を１５分間隔で加えた。混合物をさらに３０分間４℃
において撹拌し、そして沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ ｘ
ｇ，４５分、０℃）。結果の沈殿物を液体窒素に浸すことにより素早く凍結させ
、−８０℃において保存した。
【０２２５】 次の精製工程においては、精製カラムからの画分を再構成アッセイを用いてア
ッセイして（実施例７に記載された）、活性を含んだ、即ちδ’サブユニットを
含んだ画分を決定した。Ｆｒ Ｉからの沈殿物の半分を２７０ｍｌの５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ７．５），２５％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ，
１ｍＭ ＤＴＴに懸濁して、ダウンスのホモジェナィザーを用いてホモジェナイ
ズした。サンプルを遠心分離により透明にし（１６，０００ ｘ ｇ）、そして
上清をＦｒ ＩＩとした（２７０ｍｌ，７．７ｍｇ／ｍｌ）。Ｆｒ ＩＩをさら
にブチルセファロースファストフロー（ファルマシアバイオテック）カラムを用
いて精製した。ブチル樹脂（４００ｍｌ）をブチル平衡化バッファー（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ７．５），２５％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ
，１ｍＭ ＤＴＴ、０．５硫酸アンモニウム）中で平衡化した。カラムを２６０
ｍｌのブチル樹脂を用いて流した。残りの１４０ｍｌのブチル樹脂をＦｒ ＩＩ
と混合して４１０ｍｌにした。この混合物に、飽和した硫酸アンモニウム（０．
５サンプル容量）をゆっくりと１．３ｍｌ／分にて加えた。次に、カラムは４Ｌ
のブチル平衡化バッファーで洗浄した。蛋白質は、ブチル平衡化バッファーで始
まり、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ７．５），２５％グリセロー
ル、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＫＣｌを含むバッファーで
終了する１０カラム容量の勾配に溶出した。残りの蛋白質は追加の７．５容量の
終了バッファーの「揺らし（ｂｕｍｐ）」により溶出することにより、カラムか
ら取り出した。最初の半分の「揺らし」からδ’サブユニットが溶出して、プー
ルした（４８５ｍｌ，０．１ｍｇ／ｍｌ）。Ｆｒ Ｉの沈殿の他方の半分は、記
載されたとおりに同じく正確に精製した。２つの調製物を混合して、９７２ｍｌ
（０．１ｍｇ／ｍｌ）のＦｒ ＩＩになった。
【０２２６】 Ｆｒ ＩＩＩを、オクチルセファロースファスフロー（ファルマシアバイオテ
ック）カラムを用いてさらに精製した。オクチル樹脂（２０ｍｌ）は、オクチル
平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ７．５），２５％グリ
セロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，０．５Ｍ硫酸アンモニウム）中
で平衡化した。カラムは１３ｍｌのオクチル樹脂を用いて流した。この混合物に
、飽和した硫酸アンモニウム（０．５サンプル容量）をゆっくりと撹拌しながら
１時間かけて加えた。この混合物を１．３ｍｌ／分にてカラムに加えた。次に、
カラムは６００ｍｌのオクチル洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
（ｐＨ７．５），２５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，２
００ｍＭ硫酸アンモニウム）で洗浄した。洗浄物は画分（１０ｍｌ）に回収した
。蛋白質は、オクチル洗浄バッファーで始まり、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，（ｐＨ７．５），２５％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴ
Ｔ，５０ｍＭ ＫＣｌを含むバッファーで終了する１０カラム容量（２００ｍｌ
）の勾配に溶出した。δ’サブユニットを画分に回収して、洗浄を完全にした。
これらの画分をプールして（２１０ｍｌ，０．０７ｍｇ／ｍｌ）、ＰＥＧ８００
０を用いて濃縮して、Ｆｒ ＩＶ（３８ｍｌ，０．２６ｍｇ／ｍｌ）とした。
【０２２７】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐ
Ｈ７．５），２０％グリセロール、１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，
５ｍＭ ＤＴＴで平衡化したセファクリルＳ３００ ＨＲ（ファルマシアバイオ
テック）ゲル濾過カラム（５１０ｍｌ，３ｃｍ ｘ １２０ｃｍ）を用いてさら
に精製した。カラムを負荷して、蛋白質は０．７ｍｌ／分の流速で溶出した。δ
’サブユニットは高い精製度の蛋白質として単離された（５４ｍｌ，０．０８ｍ
ｇ／ｍｌ）。翻訳共役蛋白質として発現されたδ’に関する異なる精製工程の生
成物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより分析した（図３０）。
【０２２８】 実施例６ ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに 融合させたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮ（βサブユニット） を過剰発現するプラスミド（ｐＡ１−ＮＢ−ＴＮ）の構築 Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、βサブユニットはホモダイマーとして機能する（Ｊｏ
ｈａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｏ．ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓ．”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ β−ｓｕｂ
ｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ Ｈｏｌｏｅ
ｎｚｙｍｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２５５：１０９８４−１０９９０（１９８０）を参照）。このダイマー
は、プロセッシビティの高い合成能力をコアのポリメラーゼに付与する。以前の
特許出願において（米国出願＃０９／１５１８８８）、βサブユニットをコード
するＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの遺伝子の同定が記載された。以前の出願（
米国出願＃０９−１５１８８８）の実施例９に記載されたラムダベクター調製物
から、２．２ｋｂのＤｒａＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ
ＳＫ+ベクター（ストラタジーン）にクローン化した。このサブクローンで、
次に、ＸＬ Ｉ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。成功クローンを成し遂げる前に
、１０の連結反応の全てを試みた。このクローン（ＵＣＯ９）を生育させて、プ
ラスミドＤＮＡを単離した。挿入された領域からのＤＮＡの両鎖を配列決定した
（Ｌａｒｋテクノロジー社、ＤＮＡ ＳＥＱ ＃ＵＣ０：９．２．Ｔ７Ｘ，９．
２３．ＡＰ１２４，９．ＡＰ１１０，９．２．ＡＰ１１４，９．２３．ＡＰ１２
５，９．２．ＡＰ１１２，９．２．ＡＰ１１３，９．２３．ＡＰ１２８，９．６
．ＡＰ１１９，９．２５．ＡＰ３５，９．６．ＡＰ１１８，９．２５．ＡＰ３６
，９．２３．ＡＰ１２６，９．２５．ＡＰ３４Ｂ，９．２３．ＡＰ３２Ｂ，９．
６．ＡＰ１２１，９．２５．ＡＰ４０，９．２３．ＡＰ１２１，９．２．４８Ｒ
，９．６．ＡＰ１１６，９．２３．ＡＰ１３１，９．６．ＡＰ１２２，９．２３
．ＡＰ１２２）挿入された領域中の各ヌクレオチドは少なくとも３つの個々のプ
ライマーを用いて確認した。このサブクローンをＵＣＯ９と命名した。
【０２２９】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２
（図６２）のＤＮＡコーディング配列中で、開始コドン（ａｔｇ）及び停止コド
ン（ｔａｇ）を太字で示す。５’と３’のＵＴＲｓも示す（下の場合）。ＤＮＡ
コーディング配列由来の蛋白質（アミノ酸）配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
（図６３）も示す。
【０２３０】 精製を単純化するため、ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端
ペプチドに融合させたβサブユニットを最初に発現させた。ヘキサヒスチジン及
びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドをコードするＤＮＡに、ｄｎａＮ遺伝
子を融合させるように、プライマーをデザインした。最初に、ＴｔｈのｄｎａＮ
遺伝子の５’部分を含むＰＣＲ断片を、プラスミドＵＣＯ９から、上記遺伝子の
５’末端にＰｓｔＩ部位を付加するフォワードプライマー（ＡＴＧ ＃Ｐ１１８
−Ｓ８５，５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡ ＡＣＴＣＣ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）を用いて増幅して、実際のＰ
ＣＲはＡＴＧ開始コドンを排除して、コドン２つのから始まる。フォワードプラ
イマーの下線の領域は、上記遺伝子の５’末端に相補なヌクレオチドがここでそ
して他の全てのプライマーにおいて使用されることを示す。ＰｓｔＩ部位がコド
ン２に隣接しており、この断片をｐＡ１−ＮＢ Ａｇｅ−１プライマーに挿入し
た場合、ｄｎａＮ遺伝子はＮ−末端融合ペプチドをコードするＤＮＡにインフレ
ームになった。リバースプライマー（ＡＴＧ ＃Ｐ１１８−Ａ７３１，５’−Ｇ ＡＣＣＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＣＧＴＣＣＡＣＧ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２５）は、ＳａｃＩＩ制限部位の下流である（ＡＴＧ開始コドンの下流４９６位
の近傍である）。結果のＰＣＲ産物はＰｓｔＩとＳａｃＩＩで消化して、Ｐｓｔ
Ｉ／ＳａｃＩＩで切断したｐＡ１−ＮＢ Ａｇｅ１に連結して、ＤＨ５αを形質
転換した。アンピシリン選択陽性単離物からのプラスミドを、予測される０．５
及び５．５ｋｂの断片を生じるＰｓｔＩ／ＳａｃＩＩ制限消化により確認した。
このプラスミド（ｐＡ１−ＮＢ−ＴＮ５’）をＰＣＲ挿入された領域を横切るよ
うに配列決定して、正確な配列を確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１１８７−１１
９０，プライマーＰ６４−Ｓ１０，Ｐ６４−Ａ２１５，Ｐ１１８−Ｓ２９０及び
Ｐ１１８−Ａ４１１）。この配列もＵＣＯ９挿入物由来の配列と比較した。この
前駆体プラスミドをｐＡ１−ＮＢ−ＴＮ５’と命名して、陽性単離物（ｐＡ１−
ＮＢ−ＴＮ５’／ＤＨ５α）をストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロ
ールストック＃７０８）。
【０２３１】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮ遺伝子の３’領域（Ｃ−末端）を、
２つの制限酵素ＳａｃＩＩとＮｃｏＩを用いた部分消化によりＵＣＯ９から切り
出した。ＮｃｏＩ消化された部位は停止コドンの約１５０塩基下流である。これ
は、約８００塩基の断片サイズを提供した。ＮｃｏＩ制限部位の約４００塩基下
流にはさらに第２のＳａｃＩＩ制限部位も存在する。この第２の部位は約４００
塩基の長さの追加の断片を提供した。正確な断片は容易に同定され、第２のＳａ
ｃＩＩ制限部位により提供される断片の２倍であった。上記断片を電気泳動によ
り分離して、８００ｂｐの断片を水の中に溶出した。ＴＮ遺伝子の３’部分を含
むこの断片を、ＳａｃＩＩとＮｃｏＩの両制限酵素で消化してあったｐＡ１−Ｎ
Ｂ−ＴＮ５’プラスミドに挿入した。このプラスミド（ｐＡ１−ＮＢ−ＴＮ）は
、Ｎ−末端融合ペプチドをコードするＤＮＡに融合させた完全なＴ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮを含んだ。このプラスミドでＤＨ５αを形質転換した
。アンピシリン耐性コロニーからのプラスミドを、予測される６．１ｋｂと０．
８ｋｂの断片を生じるＳａｃＩＩ／ＮｃｏＩによる分解により確認した。陽性単
離物（ｐＡ１−ＮＢ−ＴＮ／ＤＨ５α）をストック培養液として保存した（ＡＴ
Ｇグリセロールストック＃７２２）。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβサブユニットの発現の証明 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＮを製造して、ＭＧＣ１０３０（ＡＴＧグリセロールストッ
ク＃７６５）及びＡＰ１．Ｌ１細菌（ＡＴＧグリセロールストック＃７４３）を
形質転換した。３つの単離物の細菌の生育及び全細胞蛋白質の単離は実施例２に
記載された通りであった。全細胞蛋白質を含む各上清のアリコート（４μｌ）を
、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２
５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍ
Ｍグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。ミニゲルをクマジーブルー
で染色した。Ｎ−標識されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβが予測されたゲ
ルの領域は、多くの他の強く染色された蛋白質バンドを含み、そしてＮ−末端標
識されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβは可視化できなかった。
【０２３２】 実施例２に記載されたとおりに、各溶解物の中の全蛋白質をビオチンブロット
分析により分析した。内在Ｅ．ｃｏｌｉビオチン−ＣＣＰ，〜２０ｋＤａは、誘
導及び非誘導サンプルの両方において検出できた。βサブユニットに相当する蛋
白質バンドは、ギブコ１０ｋＤａラダーの４０と５０の分子量スタンダードの間
のほぼ中間を移動した。この蛋白質は誘導培養液中において明確なバンドとして
観察されたが、ＡＰ１．Ｌ１株からの溶解物中の非誘導対照においては観察され
なかった。ＭＧＣ１０３０株においては発現が検出できなかった。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮ遺伝子（βサブユニット）の発現の最
適化 異なる誘導時間及び異なる生育温度においても（２５℃と３７℃）、ｐＡ１−
ＮＢ−ＴＮプラスミドを保有する細菌株ＡＰ１．Ｌ１を用いて、発現を分析した
。細菌培養液の生育と分析は、実施例２に記載されたとおりに実施した。ビオチ
ンブロット分析は、発現レベルが３７℃においてもっとも高かったことを示した
（図３１）。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ほとんどのβサブユ
ニットが４時間において３７℃にて発現されつつあることを示すので、これらの
生育条件を次の調製において使用した。 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＮ／ＡＰ１．Ｌ１の大規模な生育 実施例２に記載されたとおり、株ｐＡ１−ＮＢ−ＴＮ／ＡＰ１．Ｌ１を２５０
Ｌの発酵機の中で生育させることにより、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβサ
ブユニットの精製のための細胞を生成した。細胞の回収は、６．７のＯＤ600に
おいて誘導の４時間後に開始して、細胞は回収の間１０℃に冷却した。回収され
た容量は１８０Ｌであり、そして最終回収重量は約２．２ｋｇの細胞ペーストで
あった。小量（ｗ／ｗ）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０％グリセ
ロール溶液を細胞ペーストに加えた。細胞は、細胞懸濁液を液体窒素に注ぐこと
により凍結させ、そして加工されるまで−２０℃に保存した。質のコントロール
の結果は、接種物中アンピシリン含有培地上で１０の陽性コロニーから１０、そ
して回収時に１０／１０陽性コロニーを示した。 Ｎ−末端標識されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβのための最適な硫酸アン
モニウム沈殿条件の決定 発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβサブユニットを保有する細胞の
スフェロプラストの創製により、溶解を達成した。最初に、−２０℃において保
存されていたＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞の１：１懸濁液１００ｇ（５０ｇ細胞
）から、ＦｒＩを調製した（３９０ｍｌ，９．８ｍｇ／ｍｌ）。調製は実施例２
に記載されたとおりであった。ＦｒＩを５つの等しい容量に分割して、０．１６
４、０．２２６、０．２９１、０．３６１及び０．４３６ｇの硫酸アンモニウム
（３０％、４０％、５０％、６０％及び７０％飽和）を各分離サンプルにそれぞ
れ１５分間隔で４℃において加えた。混合物は、追加の３０分間４℃において撹
拌して、沈殿物を遠心分離により回収した（２３，０００ ｘ ｇ，４５分、０
℃）。結果の沈殿物を１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ懸濁バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），４０ｍＭ ＫＣｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ2及び１０％
グリセロール）に懸濁した。各サンプルの蛋白質濃度はクマジー蛋白質アッセイ
試薬（ピアス）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードとして用いて
測定した。３０％、４０％、５０％、６０％及び７０％硫酸アンモニウムで沈殿
させたサンプルは、それぞれ２．４、８．０、１８．０、３５．０及び３８．０
ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度を含んだ。サンプルはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動で分析した。４０％の硫酸アンモニウム沈殿サンプルは９０％を超える
βサブユニットを含み、この濃度の硫酸アンモニウムを、以後の調製において使
用した。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＮ−末端標識βの精製 発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβサブユニットを保有する細胞の
スフェロプラストの創製により、溶解を達成した。最初に、−２０℃において保
存されていたＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞の１：１懸濁液６００ｇ（３００ｇ細
胞）から、ＦｒＩを調製した（１．０５Ｌ，１５．４ｍｇ／ｍｌ）。調製は実施
例２に記載されたとおりであった。ＦｒＩに対して、硫酸アンモニウム（各初期
ｍｌ画分Ｉ−４０％飽和まで０．２６６ｇ）を１５分間隔で加えた。当該混合物
を追加の３０分間４℃において撹拌して、沈殿物を遠心分離により回収した（２
３，０００ ｘ ｇ，４５分、０℃）。結果の沈殿物は、液体窒素への浸潤によ
り素早く凍結させて、−８０℃に保存した。
【０２３３】 ＦｒＩ硫酸アンモニウム沈殿からの沈殿物は、１００ｍｌのＮｉ++−ＮＴＡバ
ッファーに懸濁して、ダウンスのホモジェナイザーによりホモジェナイズした。
サンプルを遠心分離により透明にした（１６，０００ ｘ ｇ）、そして上清は
Ｆｒ ＩＩとした（１９．５ｍｇ／ｍｌ，１００ｍｌ）。Ｆｒ ＩＩを３０ｍｌ
のＮｉ−ＮＴＡ樹脂の５０％スラリーに加え、そして１．５時間４℃において振
盪させた。このスラリーを次にバイオラッドのＥｃｏｎｏカラム（２．５ ｘ
５ｃｍ）に負荷した。カラムを２００ｍｌのＮｉ++−ＮＴＡ洗浄バッファーによ
り０．５ｍｌ／分の流速にて洗浄した。Ｎ−末端標識したβは、Ｎｉ++−ＮＴＡ
溶出バッファー中の１５０ｍｌの１０−２００ｍＭイミダゾール勾配に溶出した
。溶出物を７５ ｘ ２ｍｌの画分に回収した。画分はＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分析して、画分２６−６０が９０％を超える全βサブユ
ニット蛋白質を含んだことが分かった（図３２）。これらの画分は、プライマー
伸長アッセイにおいてβサブユニットを刺激する殆どの能力をも含んだ（以下に
論じる）。
【０２３４】 画分２６−６０をプールして（６７ｍｌ）、２回、１ＬのバッファーＨＧ．０
４バッファー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，（ｐＨ７．６），４０ｍＭ ＫＣｌ，１
ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリセロール及び６ｍＭ β
ＭＥ）に対して透析した。サンプルはＦｒＩＩＩとして（６５ｍｌ，３．８ｍｇ
／ｍｌ）、等分して、液体窒素中で素早く凍結して、−８０℃において保存した
。 規定された直鎖状鋳型上のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ βの単純なプロセッ
シビティアッセイの開発 直鎖状鋳型の上に高い非生理濃度において存在するなら、Ｅ．ｃｏｌｉから酵
母の範囲にわたる複製型ポリメラーゼを、それぞれ、それらの同じ起源の「スラ
イディングクランププロセッシビティ因子」、β及びＰＣＮＡにより、他のホロ
酵素サブユニットの不在下で刺激する（Ｃｒｕｔｅ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１１３４４−１１４９（１９８３）を参照）
。これは、高い濃度のクランプローダー（ＤｎａＸ又はＲＦＣ）の不在下で直鎖
状ＤＮＡ上に因子が集合する能力による。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβの
検出のためのアッセイを開発するため、我々は、複製型複合体の他のメンバーの
不在下でのＤＮＡ複製型ポリメラーゼの低いプロセッシビティを利用した。βの
複製型下では、ＤＮＡポリメラーゼ（αサブユニット）が各結合事象あたり約１
０ヌクレオチドしかプライマーを伸長しなくなる（Ｃｒｕｔｅ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１１３４４−１１３４９（１９８
３）参照）。基質（以下に示す）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）はβによる刺激
の検出を可能にする。
【０２３５】
【化１０】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβは、プライマー／鋳型に結合して、βの不
在下で結合事象あたり相対的に短い距離に関してプライマーを伸長することが予
測される。鋳型は、最初の３０ヌクレオチドに関して「Ａ」を欠き、よって「Ａ
」の糸を含む。鋳型プライマーの大過剰において進行するように複製が許容され
て、ポリメラーゼを制限するなら、平均して鋳型はアッセイの間に一度だけポリ
メラーゼに遭遇することになる。即ち、βの不在下では、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓのαは「Ａ」の末端配列に対して放射性標識されたｄＴＴＰｓの有意な
レベルを取り込むことが予測されない。よって、βの存在下でＤＮＡポリメラー
ゼのプロセッシビティの刺激を検出するためにこの系を使用することが可能にな
るべきである。
【０２３６】 アニーリングを可能にするため、鋳型（ＥＯ７）とプロセッシブ（ＥＯ８）を
、アニーリングバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ）中で各１０μＭまで希釈して、加熱ブロック中で９０℃に加熱
して、ゆっくりと室温に冷やした。反応（２５μｌ）は３０℃において５分間酵
素希釈バッファー（ＥＤＢ）（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５），２０％グ
リセロール、０．０２％ノニデットＰ４０，０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，１０ｍ
Ｍ ＤＴＴ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2）、ｄＮＴＰミックス（５０μＭ ｄＡＴＰ
，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及び１８μＭ［3Ｈ］ｄＴＴＰ，１００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ
）及び量を変えたＤＮＡポリメラーゼ（１μｌ）、β及びアニールしたＤＮＡ中
で実施した。
【０２３７】 Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼαを用いた反応において、プライマー／鋳
型の濃度を０．１−１．３μＭの間で変更させることにより、単一の結合事象の
ためにバックグラウンドシグナルのレベルに対して放射活性の取り込みレベルを
保持するために必要な量を決定した。これらの反応は、０．３、０．６及び１．
２ｎＭのαにおいてβの不在下で実施した。０．６と１．３μＭのプライマー／
鋳型の間の取り込まれる全ｄＴＴＰの増加はなかった。よって、Ｔ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓのαのレベルを最適にするための反応においては、１．３μＭプ
ライマー／鋳型を使用した。
【０２３８】 使用される最適な量のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼを決定する
ため（１ｍｇ／ｍｌ）、１００，２５０，５００，１０００，２０００及び４０
００：１希釈比のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｎ−末端標識Ｔ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓのαを用いて設定した（１−４μｌポリメラーゼ／反応）。２５
０：１希釈のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαを含むサンプルがバックグラウ
ンドレベルに等しいシグナルを与えたため、この濃度のＮ−末端標識Ｔ．ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αをβ刺激に関して選抜する反応において使用した。
【０２３９】 様々な量のＮ−末端標識Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ βの、Ｔ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ αの活性を刺激する能力に関してアッセイするため、プライ
マー伸長アッセイを使用した。２５０：１希釈のαサブユニット（１ｍｇ／ｍｌ
）及び１．３μＭのアニールされたプライマー／鋳型を用いて、アッセイを０、
０．２５、０．５、１．０、２．０及び４．０μＭのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ βにて実施した（図３３）。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαは、機能
性βと一致してβの濃度を増加させることにより刺激されたことから（図３３）
、精製されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαとβの上昇温度におけるプロセ
ッシブな複製反応における協調能力が証明された。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβに対するポリクローナル抗体の産生 「ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させた
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮ産物（βサブユニット）のｐＡ１−Ｎ
Ｂ−ＴＮ／ＡＰ１．Ｌ１による精製」と題されたセクションにおいて記載された
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＮ−末端標識ＦｒＩＩＩから、２ｍｌ（３．８
ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ６．５，１００ｍＭ ＫＣｌ，
２５％グリセロール及び５ｍＭ ＤＴＴ中に平衡化されたセファクリルＳ−３０
０カラム（８８ｍｌ，４０：１高さ：幅比率）に負荷した。これは、カラムの土
台上から樹脂の土台へとバッファーを流し、サンプル（２ｍｌ）を添加し、サン
プルを樹脂に流し、そしてカラム土台上にバッファーを再度構築することにより
、達成した。次に、サンプルを同じバッファーで流速０．２ｍｌ／分にて溶出し
て、１ｍｌ画分に回収した。各画分の蛋白質濃度は、クマジー蛋白質アニール試
薬を用いることにより測定した（図３４）。当該画分をＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分析して、画分４３−６６をプールした（２０ｍｌ，０
．１５ｍｇ／ｍｌ）（図３５）。
【０２４０】 プールされた画分中の蛋白質を硫酸アンモニウムの添加により沈殿させ（プー
ルされた画分の各ｍｌに対して０．４３６ｇ−７０％飽和）、そして沈殿物を遠
心分離により回収した（２３，０００ ｘ ｇ，４５分、０℃）。硫酸アンモニ
ウム沈殿させた沈殿を２ｍｌのＰＢＳに溶解して（０．２４ｍｇ／ｍｌ）、５０
０ｍｌのＰＢＳに対して２回透析した。この透析したサンプルをＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分析した（図３６）。
【０２４１】 実施例３に記載されたとおりに、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβに対する
ポリクローナル抗体を、Ｎ−末端標識したＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβを
ウサギに接種することにより産生し、そしてウサギから回収した。Ｎ−標識され
たＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβを結合することに関する抗血清の最適な希
釈は、試験採血後及び最終採血後に測定した。これは、小アリコートのＮ−末端
標識Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ βを１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ミニゲル（１０ ｘ １０ｃｍ）上で電気泳動する、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により実施した。実施例３に記載されたとおりに、蛋白質をニト
ロセルロース膜へ移した。各ストリップがＮ−末端標識Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ βの同一のバンドを含むように、膜をストリップに切り出した。膜を５
％ノンファットドライミルク（ｗ／ｖ）を含む０．２％のツイーン２０（ｖ／ｖ
）−ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）中で１時間室温においてブロックし、ＴＢＳＴで洗浄し
た。ストリップを抗血清／ＴＢＳＴ中に（希釈：１：１００，１：２００，１：
４００，１：８００，１：１６００，１：３２００，１：６４００，及び１：１
２８００）１時間おいて、次に４回ＴＢＳＴ中で５分間洗浄した。次に、ストリ
ップを、アルカリホスファターゼに配合させた二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ（
Ｈ＋Ｌ），ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）（バイオラッド）中に１時間おいた。
次に、ストリップを４回５分間ＴＢＳＴで洗浄した。この大規模な洗浄の次に、
ブロットをＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＫＰＬ ＃５０−８１−０７；１成分系）により
発色させた。βに対応する蛋白質はもっとも高い希釈の抗血清中でさえも明確な
バンドとして目に見えた（図３７）。これらのバンドは抗血清の希釈が低下する
につれてより強くなった。陰性対照は、抗原を接種する前にウサギから取り出し
た抗血清を含んだ。陽性対照は、抗血清検出において使用されたのと同じのウド
における（０．５μｇ）、抗原のビオチンブロット分析である。
【０２４２】 次に、抗体血清による認識に要求される最少量のβを測定した。これは、小ア
リコートのβ（０．０２，０．０４，０．０８，０．１６，０．３２，０．６４
，１．２５，２．５０及び５．０μｇ／ウエル）を１０％のＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドミニゲル（１０ ｘ １０ｃｍ）上で電気泳動する、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により実施した。蛋白質をニトロセルロース膜に移した
。ブロットされたニトロセルロースを、５％のノンファットドライミルク（ｗ／
ｖ）を含むＴＢＳＴ中で１時間室温においてブロックし、ＴＢＳＴ中で洗浄した
。ブロットを抗血清／ＴＢＳＴ（１：６４００の希釈）中に１時間おいて、次に
４回ＴＢＳＴ中で５分間洗浄した。次に、ブロットを、アルカリホスファターゼ
に配合させた二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＴＢＳＴ中１：３００
０希釈）（バイオラッド）中に１時間おいた。次に、ストリップを４回５分間Ｔ
ＢＳＴ中で洗浄した。この大規模な洗浄の次に、ブロットをＢＣＩＰ／ＮＢＴ（
ＫＰＬ ＃５０−８１−０７；１成分系）により発色させた（図３８）。もっと
も低いレベルの（０．０２μｇ）、Ｎ−標識されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓのβが検出できた。 天然のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮ（βサブユニット）を過剰発現
するプラスミド（ｐＡ１−ＴＮ）の構築 天然の（未−標識）Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβを発現させるため、ｄ
ｎａＮ遺伝子をベクターｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩに挿入した。このプラスミドに
より保有されたＣ−末端のビオチンヘキサヒス（ｈｅｘａｈｉｓ）標識は、挿入
されたｄｎａＮ遺伝子の下流になり、そしてフレーム外になる。ＣＡＴをプライ
マーの非相補領域中に加えて、ＡＴＧ開始コドンへすぐ続くように、フォワード
プライマーをデザインした。これは、ＮｄｅＩ制限部位ＣＡＴＡＴＧをもたらし
た（ＡＴＧプライマー ＃１１８−Ｓ７４、５’−ＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＣ
ＡＴＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡ−３’）（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４１）。追加の停止コドンが非相補領域中に加えられてタンデムに２
つの停止コドンを生じるように、リバースプライマーをデザインした。領域中に
プライマーの非相補領域は、ＮｈｅＩ制限部位と該制限酵素によるＰＣＲ産物の
有効な消化のための追加のヌクレオチドを含む（ＡＴＧプライマー ＃Ｐ１１８
−１２３１，５’−ＧＡＧＣＡＧＣＴＡＧＣＣＴＡＣＴＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧ ＧＧＣＡＣＣＡ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）。ＰＣＲ反応は、完全な
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮ遺伝子を含み、ＮｄｅＩ部位が開始コ
ドンとオーバーラップし、追加の停止コドンが天然の停止コドン（ＴＡＧ）とタ
ンデムになり、ＮｈｅＩ部位が当該タンデム停止の下流にあるさうぶつをもたら
した。上記ＰＣＲ産物とｐＧＥＭ−Ｔ ＥａｓｙプラスミドのＮｄｅＩとＮｈｅ
Ｉによる消化は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮ遺伝子がｐＧＥＭ−
Ｔ Ｅａｓｙプラスミドに挿入されることを可能にさせた。挿入領域の配列決定
の予備プラスミドとして、ＰＣＲ産物をｐＢＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙプラスミドに連
結した。このプラスミドでＤＨ５αを形質転換し、そしてアンピシリン耐性陽性
単離物を選択した。一つの陽性単離物からのプラスミドを単離して、１．１５ｋ
ｂと３．０ｋｂの断片を生じるプラスミドのＥｃｏＲＩ消化により選抜した。ｄ
ｎａＮ遺伝子を含む挿入物の両ＤＮＡ鎖の正確な配列は、ＤＮＡ配列決定により
確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１４２０−１４２７；プライマー，ＳＰ６配列決
定プライマー、Ｔ７配列決定プライマー、Ｐ１１８−Ｓ２９０，Ｐ１１８−Ｓ６
３９，Ｐ１１８−Ｓ１００３，Ｐ１１８−Ａ９９６，Ｐ１１８−Ａ７３１及びＰ
１１８−Ａ４１１）。この配列を、「ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含
むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮ（β
サブユニット）を過剰発現させるプラスミド（ｐＡ１−ＮＢ−ＴＮ）の構築」と
題されるセクションにおいて得られた配列と比較した。このプラスミドをｐＴ−
ＴＮと命名して、陽性単離物（ｐＴ−ＴＮ／ＤＨ５α）をストック培養液として
保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃８３９）。
【０２４３】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮ遺伝子を予備ｐＴ−ＴＮプラスミド
から回収して、発現ベクターに挿入した。ｐＴ−ＴＮプラスミドをＮｄｅＩ／Ｎ
ｈｅＩ制限酵素により消化して、同じ制限酵素により消化したｐＡ１−ＣＢ−Ｎ
ｄｅＩプラスミドに挿入した。これは、ｄｎａＮ遺伝子をｐＡ１−ＣＢ−Ｎｄｅ
Ｉプラスミド内へ、下流のビオチン−ヘキサヒス標識とフレームをはずして配置
させた。これは、ＰＢＳの下流に開始コドン１１ヌクレオチドも配置した。当該
プラスミドでＤＨ５αを形質転換して、陽性の単離物をアンピシリン耐性により
選択した。一つの陽性単離物からのプラスミドをＮｄｅＩ／ＮｈｅＩにより確認
して、ＸｂａＩ制限消化により、予測された１．１と５．６ｋＤａ及び０．１と
６．７ｋＤａの断片をそれぞれ生じた。挿入された領域の配列はＤＮＡ配列決定
により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１４４３及び＃１４４４，プライマーＰ１
１８−Ｓ１００３及びＰ３８−Ｓ５５７６）。この配列を、「ヘキサヒスチジン
及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓのｄｎａＮ（βサブユニット）を過剰発現させるプラスミド（ｐＡ１−
ＮＢ−ＴＮ）の構築」と題されるセクションにおいて得られた配列と比較した。
このプラスミドをｐＡ１−ＴＮと命名して、単離物（ｐＡ１−ＴＮ／ＤＨ５α）
をストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃８４５）。 ｐＡ１−ＴＮ／ＡＰ１．Ｌ１によるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβの発現の
証明 ｐＡ１−ＴＮプライマーを製造して、ＡＰ１．Ｌ１細菌を形質転換した（ＡＴ
Ｇグリセロールストック＃８６０，８６１，８７１）。３つの単離物の細菌の生
育及び全細胞蛋白質の単離は実施例２に記載されたとおりであった。３つの単離
物の各々からの上清の各小アリコート（３μｌ）を、４−２０％のＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル
／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％Ｓ
ＤＳ中で電気泳動した。ミニゲルをクマジーブルーで染色した。βの予測された
移動領域に相当する如何なる単離物からも、目で見えるバンドはなかった。おそ
らく、高いＧＣのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ配列の二次構造が開始を干渉し
ていた。この困難を克服する試みにおいて、我々は、高発現のＥ．ｃｏｌｉのｃ
ｃａ遺伝子に翻訳共役された天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβをコードす
る遺伝子を有するベクターを構築した。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮ遺伝子（β）の翻訳共役ベクターｐＴ
ＡＣ−ＣＣＡ−ＣｌａＩへのクローン化 βを天然蛋白質として発現させるため、我々は、翻訳共役された蛋白質を発現
するベクターをデザインした。他の天然形態のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ蛋
白質の発現におけるように、ここでの我々の到達点は、再び実施例＃２に記載さ
れたとおりに翻訳共役を使用することである。ｄｎａＮ遺伝子をＣＣＡ付加酵素
の後ろに挿入して、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβに関して記載されたとお
りに翻訳共役させた。最初に、ｄｎａＮ遺伝子をｐＡ１−ＴＮを用いてＰＣＲに
より増幅した。フォワード／センスプライマー（ＡＴＧプライマー ＃Ｐ１１８
−Ｓ７８ｃｌ２，５’−ＡＧＴＣＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＣＧＧＴ ＴＣＣＣＡＡＧ ＡＡＡ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）は、非相補領域
中にＣｌａＩ部位を有する。ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＸに関して開発されたクロー
ン化戦略におけるように、非相補領域は、上流のＣＣＡ付加蛋白質断片のための
停止（ＴＡＡ）の「ＴＡ」も含む。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ遺
伝子の５’末端に相補なプライマーの領域は、「ＡＴＧ」開始コドンの最初のヌ
クレオチドであって且つ「ＴＡＡ」停止コドンの最後の「Ａ」である「Ａ」で始
まる。リバース／アンチセンスプライマー（ＡＴＧプライマー ＃Ｐ１１８−Ａ
１２３０ｓｐｅ，５’−ＧＡＧＧＡＣＴＡＧＴＣＴＡＣＴＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧ ＧＧＧＣＡＣＣＡＣ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）は、上記プライマー
の非相補部分内にＳｐｅＩ制限部位を含み、また、天然停止コドンに隣接して追
加の停止コドンも含むことにより、タンデムに２つの停止コドンを提供する。Ｓ
ｐｅＩによる有効な切断のためのクランプ領域も存在した。次に、ＰＣＲ産物を
ＣｌａＩ／ＳｐｅＩ制限酵素により消化して、同じ酵素で消化したｐＴＡＣ−Ｃ
ＣＡ−ＣｌａＩプラスミドへ挿入した。当該プラスミドでＤＨ５α細菌を形質転
換して、アンピシリン耐性陽性単離物からのプラスミドを、１．１ｋｂと５．５
ｋｂの断片を生じるＣｌａＩ／ＳｐｅＩ制限酵素による消化により選抜した。挿
入物の両鎖の配列はＤＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１７４
９−１７５６；プライマー、Ｐ１４４−Ｓ２３，Ｐ１４４−Ａ１９６５，Ｐ１１
８−Ｓ２９０，Ｐ１１８−Ｓ６３９，Ｐ１１８−Ｓ１００３，Ｐ１１８−Ａ９９
６，Ｐ１１８−Ａ７３１，Ｐ１１８−Ａ４１１）。配列分析は、正確な配列が挿
入領域内に含まれたことを確証した。このプラスミドをｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＮ
と命名して、単離物をストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールスト
ック＃１０７４）。 ＰＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＮ／ＭＧＣ１０３０及びｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＮ／ＡＰ１
．ｌ１による天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβサブユニットの発現の証明 ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＮプラスミドを製造して、ＭＧＣ１０３０細菌（ＡＴＧ
グリセロールストック＃１０８７，１０８８，１０８９）及びＡＰ１．Ｌ１（Ａ
ＴＧグリセロールストック＃１０９０，１０９１）を形質転換した。細菌の生育
と全細胞蛋白質の単離は、実施例２に記載されたとおりであった。全細胞蛋白質
を含む上清の小アリコート（３μｌ）を、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上
で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電
気泳動した。ミニゲルをクマジーブルーで染色した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓのβの予測された分子量（４０ｋＤａ）に相当する弱い蛋白質バンドが、ギ
ブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの４０ｋＤａ分子量スタンダードのわずか上に、Ｍ
ＧＣ１０３０単離物から可視化できたが、ＡＰ１．Ｌ１単離物からは可視化でき
なかった。 ｐＡ１−ＣＣＡ−ＴＮ／ＡＰ１．Ｌ１の大規模な生育 実施例＃２に記載されたとおりに、株ｐＡ１−ＣＣＡ−ＴＮ／ＡＰ１．Ｌ１を
２５０Ｌの発酵機（発酵機ラン＃００−１３）中で生育させて、Ｔ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓのβの精製のための細胞を生成した。最適な誘導時間は、実施例
＃２に記載されたとおりに決定した。細胞の回収は誘導の３時間後に３．０４の
ＯＤ600において開始して、回収の間は細胞を１０℃に冷却した。回収容量は１
７０Ｌであり、最終回収重量は約０．９ｋｇの細胞ペーストであった。等容量の
（ｗ／ｗ）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０％蔗糖溶液を細胞ペース
トに加えた。質のコントロールの結果は、接種物中アンピシリン含有培地上で１
０の容積コロニー中１０であり、誘導時１０／１０陽性コロニーであり、そして
回収時１０／１９陽性コロニーを示した。細胞懸濁液を液体窒素に注ぐことによ
り細胞を凍結させて、加工まで−２０℃において保存した。
【０２４４】 実施例７ Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の再構築 我々の努力の最初の到達点は、上昇させた温度においてプロセッシブな好熱性
のレプリカーゼの必須サブユニットの最少の集合体を得ることであった。我々は
、最低限、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのα、β、ＤｎａＸ，δ及びδ’が必
要であろうと仮定した。これらの蛋白質のＮ−末端標識形態における利用可能性
により、これらの蛋白質を、最初に成功した試みにおいて再構成に際して使用し
た。Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のための標準アッセイの
修飾形を用いた。当該方法は、ＲＮＡプライマーにより開始した長い一本鎖環状
鋳型上の合成からなった。Ｍ１３ Ｇｏｒｉ一本鎖ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄ
ｎａＧプライマーゼの作用により、全ての報告されたアッセイにおいてアリコー
ト化して直ちに凍結させた大容量の反応において、開始した。ＲＮＡプライムし
たＭ１３ Ｇｏｒｉ一本鎖ＤＮＡは、０．５ｍｌ ＭｇＯＡｃ（２５０ｍＭ），
１．１２５ｍｌ Ｍ１３ Ｇｏｒｉ（２４０μＭ，ｎｔ），０．２ｍｌ 精製さ
れたＥ．ｃｏｌｉ ＳＳＢ蛋白質（４．３ｍｇ／ｍｌ），１．５ｍｌ ｄＮＴＰ
混合物（４００μＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及び１５０μＭ［3Ｈ］−
ｄＴＴＰ（１００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ），０．５ｍｌ ｒＮＴＰ混合物（５ｍＭの
各ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ及びＵＴＰ），０．０２５ｍｌ 精製されたＥ．ｃｏ
ｌｉプライマーゼ（０．６６５ｍｇ／ｍｌ）及び５．６５ｍｌ ＥＤＢ（５０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），２０％グリセロール、０．０２％ ＮＰ４０，
０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を加えることにより、調製した（９．５ｍｌ）。放
射性ｄＮＴＰ混合物は上記プライミング反応物の中で使用しなかったが、実際の
複製反応において加えられる場合には（Ｍ１３ Ｇｏｒｉ反応）、複製ポリメラ
ーゼにより使用された。プライミング混合物は３０℃において５分間インキュベ
ートして、次に氷の上に置いた。混合物を４００ｕｌのアリコートに分注して、
使用までは−８０℃に保存した。この混合物を全てのＭ１３ Ｇｏｒｉアッセイ
において使用して、プライムされた鋳型混合物と呼ぶ。
【０２４５】 最初に、精製されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのサブユニット全て（Ｎ−
末端標識されたα，β，ＤｎａＸ，δ及びδ’）を共にアッセイして、上記複合
体がＭ１３ Ｇｏｒｉでプライムされた混合物のプロセッシブな重合を指示でき
たか否かを測定した。この初期アッセイにおいて使用された各Ｔ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓサブユニットの初期濃度は、類似のアッセイ（Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９５７０−２９５７７（１９９５
））において使用されたＥ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＩＩサブユニットの濃度の１
０倍に任意に設定した。サブユニットをＥＤＢバッファー中で希釈することによ
り、化合して（６ｕｌトータル）そして１９ｕｌのプライムされた鋳型混合物と
化合して２５ｕｌ反応物を生じる場合、α，β，ＤｎａＸ，δ及びδ’の全レベ
ルをそれぞれ、１．２５，１．２５，１．０，１．０及び２．０ｐｍｏｌであっ
た（全サブユニットの濃度はモノマーとしてである）。上記酵素混合物とプライ
ムされた鋳型混合物を化合して、５分間５０℃においてインキュベートすること
により反応を開始した。反応は反応試験管を氷上において、２滴の０．２Ｍ Ｎ
ａＰＰI及び０．５ｍｌの１０％ ＴＣＡを添加することにより停止した。溶液
をワットマンＧＦ／Ｃグラスマイクロファイバーフィルターで真空したで濾過し
た。次に、フィルターを３ｍｌの１Ｍ ＨＣｌ／０．２Ｍ ＮａＰＰI及び１ｍ
ｌの９５％ ＥｔＯＨで洗浄して、加熱ランプを用いて乾燥した。取り込まれた
ヌクレオチドのｐｍｏｌをシンチレーション計数により定量した。他の反応は異
なるサブユニットを反応物から連続して取り去ることにより実施した（図３９）
。最後の反応（一番右、図３９）は、全てのサブユニットが存在したがαの濃度
を４．０ｐｍｏｌｓに増加させた。図３９のこれらの反応のグラフから、如何な
るサブユニットが反応から取り去られても、ＤＮＡの合成が極めて低いレベルに
低下するが、しかしながら、全ての反応物の存在下では、最大の合成が観察され
る。これらのアッセイの結果は、各サブユニットが機能し、そしてプロセッシブ
な重合に必要であることを示した。
【０２４６】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＰｏｌ ＩＩＩサブユニットを用いたＭ１３
Ｇｏｒｉアッセイのための最適な温度を測定した。再構成されたホロ酵素反応
を前に記載されたとおりに実施した（４ｐｍｏｌのαを使用して）。反応物を５
分間示された時間インキュベートした。結果は、５０−６５℃がＴ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓの複製型複合体サブユニットをアッセイするのに最適な温度を提
供したことを示した（図４０）。さらなるアッセイは６０℃において実施する。
【０２４７】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓホロ酵素を再構成するのに使用されるサブユニ
ットの各々の活性は、過剰レベルの他の４つのサブユニットの存在下で個々に評
価した。Ｍ１３ Ｇｏｒｉアッセイを最初にデザインして、全てのサブユニット
がαを除いて上記実験に記載された濃度で存在した（β，ＤｎａＸ，δ及びδ’
がそれぞれ１．２５，１．０，１．０及び２．０ｐｍｏｌｓ）。αサブユニット
は０．１２５から４．２ｐｍｏｌの範囲の量にて別々の反応に加えた。反応は６
０℃において５分間実施した。結果は、全ての利用可能なＭ１３ Ｇｏｒｉの鋳
型が１ｐｍｏｌのαの存在下で複製されたことを示す（図４１Ａ）。
【０２４８】 他のサブユニットの不在下では、αにより触媒された非プロセッシブな合成の
バックグラウンドレベルがある。バックグラウンドを規定するため、αをＭ１３
Ｇｏｒｉ反応中で量を変えてアッセイした（０．１２５から８．４ｐｍｏｌ）
（図４２）。
【０２４９】 αをＭ１３ Ｇｏｒｉホロ酵素アッセイにおいて力価測定するアッセイにおい
て、全ての利用可能な鋳型が２ｐｍｏｌのαの存在下で複製した。２ｐｍｏｌの
濃度においてαのバックグラウンド活性を測定するために使用したアッセイにお
いては、たったの１７ｐｍｏｌのヌクレオチドしか取り込まれなかった。よって
、以後の全てのアッセイは２ｐｍｏｌのαを含む。
【０２５０】 プライムさえた鋳型をαがプロセッシブに複製する能力に対するβの影響を測
定するため、βを除く他の全てのサブユニットの存在したでαを量を変えてアッ
セイした（図４３）。αのみの活性と比較した場合に観察できるとおり（図４２
）、βサブユニットの不在したでは他のホロ酵素サブユニットの存在により、α
はほんのわずか刺激された。
【０２５１】 上で考察したとおり、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＸ遺伝子の翻訳
は、τサブユニットとγサブユニットの両方の発現をもたらす。Ｅ．ｃｏｌｉ中
のｄｎａＸ遺伝子産物は、βスライディングクランプの集合を触媒するクランプ
ローディング装置の一部として機能する。τサブユニットはαとの直接の接触に
よりＰｏｌを二量体化する機能も有する（Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．，ａｎｄ
ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９５６３−
２９５６９（１９９５））。τ及びγのクマジーブルー染色ゲル（図１０）から
、約６０％の発現がγサブユニットのであり、約４０％の発現がτサブユニット
のであるらしい。よって、Ｍ１３ Ｇｏｒｉアッセイにおいて使用するためのτ
及びγの最適な量を測定するため、広い範囲の濃度をアッセイした（０．３１２
から２０ｐｍｏｌ）。これらのアッセイを図４１Ｂに示し、そして約４ｐｍｏｌ
のτ及びγが、複製型複合体の最大の再構成を達成するのに必要である。以後の
Ｍ１３ Ｇｏｒｉアッセイにおいては、４ｐｍｏｌのＤｎａＸを使用する。
【０２５２】 複製型ポリメラーゼのβサブユニットは、触媒サブユニットをＤＮＡに結合さ
せることにより劇的にプロセッシビティを増大させた。βがＴ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓの系においてホロ酵素活性を再構成する能力を試験するため、βをＭ
１３ Ｇｏｒｉアッセイ中で力価測定した（０．０８から１０．０ｐｍｏｌ）（
図４１Ｃ）。以下のＭ１３ Ｇｏｒｉアッセイにおける最大活性を保証するため
、βは４ｐｍｏｌにて存在する。
【０２５３】 δ及びδ’の両者は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてはクランプローディング複合体の
構成要素であって、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいても類似の機能を担う
らしい。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、それらは共に単一コピーとして存在し、よって
プロセッシブな複製を完全に刺激するには少量しか要求されないかもしれない。
【０２５４】 以後のＭ１３ Ｇｏｒｉ反応においては、δとδ’を２ｐｍｏｌにて存在させ
る。これらのアッセイ（図４１Ｄと４１Ｅ）は、触媒サブユニット（α）による
最適な重合に必要なホロ酵素サブユニットの全ての濃度を測定することを可能に
させた。全てのサブユニットがプロセッシブな複製に必要である。以後、天然の
サブユニットの精製に関しては、ここで決定したアッセイ条件を使用して、別々
の精製工程を通した各天然蛋白質を追跡する。上記アッセイをデザインして、天
然標的サブユニットに相当するＮ−末端標識されたサブユニットを反応混合物か
ら取り去り、そしてカラム溶出画分からのアリコートを置き換える。この様式に
おいて、標的天然蛋白質を含む画分が検出される。
【０２５５】 実施例８ Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＰｏｌ ＩＩＩの サブユニットを含む蛋白質−蛋白質相互作用 Ｅ．ｃｏｌｉとＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ遺
伝子の間の相当な相同性の見地から、我々は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のサブユニットの
公知の相互作用のいくつかがＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓでも起きるか否かを
試験した。Ｐｏｌ ＩＩＩサブユニットの相互作用のゲル濾過分析を、ＨＧ．０
４バッファーで平衡化したセファクリル（登録商標）Ｓ−２００（ファルマシア
バイオテック）カラム（０．７ ｘ ３０ｃｍ）を用いて実施した。全てのゲル
濾過実験において、サブユニット（単独又は化合して）を６０℃において５分間
（３００μｌ）、セファクリルＳ−２００に負荷する前にインキュベートした。
最初の３つの画分（各１ｍｌ）は空隙容量を含み、そして続く全ての画分が３０
０μｌを含んだ。画分を、クマジーブリリアントブルーで染色した１０％のＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲルで分析した。画分は、サブユニットを分析すること
以外は、実施例７に記載されたとおりに全てのサブユニットが存在する再構成活
性アッセイにおいても分析した。これらの反応においては、２μｌの各画分を再
構成アッセイに添加した。観察された活性が存在したなら、その画分中に分析さ
れたサブユニットが存在することの指標であった。 クランプ−ローディング装置を構成するサブユニットの蛋白質相互作用 Ｅ．ｃｏｌｉのクランプ−ローディング複合体において、δとδ’は互いに相
互作用して、共にＤｎａＸサブユニット（τとγ）と相互作用する。よって、こ
の相互作用がＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのクランプ−ローディング複合体を
構成するサブユニット間に存在するか否かを決定するため、我々は、δ、δ’及
びτ／γを単独か又は異なる組み合わせを用いて、最初にゲル濾過実験を実施し
た。δ、δ’及びτ／γ単独の分析は、それぞれ２００、１００及び７０μｇを
用いて実施した。単独でアッセイした蛋白質の溶出プロフィールを図４４のパネ
ルＡ，Ｂ及びＤに示す。δ（画分１８）はδ’（画分２０）の２つ前の画分に溶
出した。τ／γは同様に、δの２つ前の画分（画分１６）に溶出した。再構成ア
ッセイにおいて画分に関して観察された活性は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル上のボックス中に示し（図４４）、そして蛋白質バンドを含む画分に相当する
。次に、δ（１５０μｇ）とδ’（１５０μｇ）を共にアッセイして相互作用が
起こるか否かを測定した。溶出位置のシフトは、何れかのサブユニットのみより
大きな複合体を形成するための、試験されたサブユニット間の相互作用を示すは
ずである。このアッセイにおいては（図４４、パネルＣ）、δとδ’がδ単独の
ときより２つ早い画分に溶出したことから、これら２つの蛋白質の相互作用が起
こったことを示す。活性プロフィールが蛋白質溶出プロフィールを確証し、さら
に２つのサブユニット間の相互作用を支持するシフトもある。不幸なことに、δ
とδ’はサイズが類似しており、１０％又は勾配ポリアクリルアミドゲルの何れ
でも解析できなかった（データ示さず）。τ／γ（３５μｇ）をδ（７０μｇ）
とδ’（８５μｇ）とアッセイしたとき、溶出プロフィールはサブユニット単独
の何れよりも早い画分にシフトした（図４４、パネルＥ）。ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルは、全てのサブユニットがシフトした画分中に含まれたこと、そし
て全てのサブユニットがこの観察を支持することを示す。
【０２５６】 クランプローディング複合体がδ又はδ’及びτ／γの何れかとの相互作用を
通して形成されたか否かを決定するため、τ／γ（６０μｇ）及びδ（７５μｇ
）又はδ’（４０μｇ）を分析するようなゲル濾過実験を実施した。τ／及びγ
／γをいっしょにアッセイした場合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルと活性ア
ッセイの何れにおいても相互作用が観察されなかった。しかしながら、τ／γと
δ’をいっしょにアッセイした場合、ＤｎａＸとδ’の両方が、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルにおいても、溶出プロフィールの活性アッセイの何れにおいて
も、いっしょにシフトすることが観察された（データは示さず）。これらのデー
タから、我々は、クランプ−ローディング装置が、δ’と、τ／γ及びδの両方
の間の相互作用を通して形成すると理論付ける。 触媒性サブユニットαとクランプローディング装置を構成するサブユニットの蛋
白質相互作用 Ｅ．ｃｏｌｉのＰｏｌ ＩＩＩホロ酵素においては、リーディングＤＮＡ鎖及
びラギングＤＮＡ鎖を複製する２つのα触媒サブユニットがＤｎａＸ蛋白質τと
の相互作用により結合している。（ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２５７：２６５７−２６６３，［１９８２］を参照）。Ｔ．ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓホロ酵素内で生じる類似の相互作用が存在するか存在するか
否かを決定するため、αサブユニットとＤｎａＸ蛋白質及びクランプローディン
グ装置の他のメンバーとの相互作用をゲル濾過によりアッセイした。α（７５μ
ｇ）を他のサブユニット不在下でゲル濾過に供すると、ピークの画分が画分１６
に溶出した（図４５、パネルＡ）。τ／γの存在下では（１７０μｇ）、溶出が
画分１４にシフトした（図４５、パネルＢ）。前のセクションから、τ／γのみ
が画分１６に溶出した（図４４、パネルＤ）。これらの観察は、αはτ／γと相
互作用するが、おそらくはτとの相互作用によるらしく、α存在下では大相対量
のτがγよりもシフトすることが明白だからである（図４４のパネルＤと図４５
のパネルＢを比較すると）。
【０２５７】 次に、δとδ’もα及びτ／γの存在下でシフトするか否かを測定するため、
α（４０μｇ）、τ／γ（１１５μｇ）、δ（５０μｇ）及びδ’（５０μｇ）
をいっしょにアッセイした。これらのアッセイにおいて、δ／δ’はいっしょに
アッセイすると画分１８（図４４、パネルＤ）から画分１４（図４５、パネルＣ
）へ明白にシフトする。
【０２５８】 βのダイマーはＤＮＡ上へ装填される環構造を形成して、複製の間はＤＮＡに
対して複製型複合体にいっしょに作用して、それによりＥ．ｃｏｌｉにおいてＰ
ｏｌ ＩＩＩホロ酵素へのプロセッシビティの特性が解釈できる。Ｔ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓのβとＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのホロ酵素βの他のメン
バーとの相互作用を測定する試みにおいて、βをゲル濾過実験においてアッセイ
した。最初に、βを単独でアッセイして（２５０μｇ，２０μＭ）、他の蛋白質
の不在下で溶出プロフィールを測定した。βサブユニットはセファクリルＳ−２
００カラムから画分１２−２０に溶出したので、大きな分子量のマルチマーの形
成が示唆される（図４６）。マルチマーの形成が濃度依存性かもしれない可能性
に接近するため、βを再び１０倍低い濃度においてアッセイした（２５μｇ，２
０μＭ）。これらのアッセイの結果は、高い濃度において観察された結果と同一
であった。よって、βサブユニットとＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の他の
成分との相互作用はこの方法により試験できなかった。
【０２５９】 実施例９ Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓｓｂ遺伝子の同定 Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓ，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｅ．ｃｏｌｉ，及びＨ．ｉｎ
ｆｌｕｅｎｚａｅ由来のｓｓｂ遺伝子配列を用いて、ゲッチンゲンゲノミックス
研究所におけるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムのデータベースを検索した
。仮想Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｓｂ遺伝子を含むＴ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓの領域の配列が同定され（ＢＬＡＳＴを用いて）、そして得られた（
Ｄｒ．Ｃａｒｓｔｅｎ Ｊａｃｏｂｉ，ゲッチンゲンゲノミックス研究所、微生
物学及び遺伝学研究所、グリーゼバッハ通り、ゲッチンゲン、独国）。未加工の
配列を用いて、２つのＰＣＲプライマーをデザインしてｓｓｂ遺伝子を増幅した
。ＰＣＲ反応においては、フォワード／センスプライマー（ＡＴＧプライマー
Ｐ１３８−Ｓ５４０，５’−ＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣ ＣＧＣ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）をデザインして、ＮｃｏＩ部位を
開始「ＡＴＧ」コドンとオーバーラップさせた。リバース／アンチセンスプライ
マー（Ｐ１３８−Ａ１３４８，５’−ＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＡＡＡＡＣ ＧＧＣＡＡＡＴＣＣＴＣ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）は、天然の「Ｔ
ＧＡ」コドンに隣接して追加の「ＴＧＡ」コドンを、そして非相補領域にＫｐｎ
Ｉ制限部位を追加するようにデザインした。両プライマーは、ＮｃｏＩとＫｐｎ
Ｉ制限酵素による有効な消化を可能にするための追加のヌクレオチドを含んだ。
ＰＣＲはＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノミックＤＮＡを鋳型として用い、そ
して８０８ｂｐの長さのＰＣＲ産物を生じた。このＰＣＲ断片を製造者の指示に
従いｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（商標名）（プロメガ）ベクターに挿入した。この
プラスミドでＤＨ５α細菌を形質転換して、陽性単離物を０．８および３．０ｋ
ｂの断片を生じるＥｃｏＲＩ制限消化によるプラスミドの消化に関して選抜した
。一つの陽性単離物からのプラスミドを選択して、当該ＤＮＡの両鎖の正確な配
列が、挿入された領域を通るＤＮＡ配列決定により同定された（ＡＴＧ ＳＥＱ
＃１４３２−１４３６；プライマー、ＳＰ６，Ｔ７，Ｐ１３８−Ｓ９１３，Ｐ
１３８−Ａ１１４８，Ｐ１３８−Ａ８２４）。このプラスミドをｐＴ−ＴＳＳＢ
と命名して、単離物をグリセロールストック培養液として保存した（ＡＴＧグリ
セロールストック＃８３８）。
【０２６０】 図４７のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓｓｂ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：３１）のＤＮＡコーディング配列。開始コドン（ａｔｇ）と停止コドン（ｔｇ
ａ）を太字で示す。下（図４８）は上記ＤＮＡ配列由来の蛋白質（アミノ酸）配
列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）も示す。
【０２６１】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢ蛋白質のアミノ酸配列を、いくつかの
他のＳＳＢ蛋白質の配列との配列アラインメントにより比較した（図４９）。Ｔ
．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢの配列はこれらの比較において追加の５０
−７０アミノ酸を含むことが示された。これは、全蛋白質の約２５％である。
【０２６２】 我々は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＳＳＢがホモ四量体の形態で機能するとの以前の
研究を知っている（Ｌｏｗｍａｎ ａｎｄ Ｆｅｒｒａｒｉ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：５２７−５３０（１９９４））。Ｅ．ｃｏｌｉのＳＳ
ＢのＮ−末端の１１５アミノ酸はｓｓＤＮＡ結合性領域を含む。他の同定された
ＳＳＢ蛋白質はＥ．ｃｏｌｉのＳＳＢと類似性を共有し、そしてＮ−末端領域に
ｓｓＤＮＡ結合性領域を含む。これらの他のＳＳＢ蛋白質も四量体として活性で
あると考えられる。示される通り（図４９）、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの
ＳＳＢはＥ．ｃｏｌｉのＳＳＢ及びその他に類似のＮ−末端領域を含むが、Ｅ．
ｃｏｌｉのＳＳＢよりも約５０％大きい。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳ
Ｂの追加の領域（Ｃ−末端領域）の配列を、それ自身のＮ−末端ｓｓＤＮＡ結合
領域と比較した（図５０）。驚くことに、広い範囲の配列相同性が存在したこと
から、この追加領域は第２のｓｓＤＮＡ結合領域を含むかもしれないことを示唆
する。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢが２つのｓｓＤＮＡ結合領域を含
むなら、それは既に研究されたＳＳＢ蛋白質中で唯一なはずであり、そしてＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢが上昇温度においてｓｓＤＮＡに結合する能
力を説明するかもしれない。 天然蛋白質としてＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓｓｂ遺伝子（ＳＳＢ）を過
剰発現するプラスミド（ｐＡ１−ＴＳＳＢ）の構築 ＴＳＳＢ遺伝子は内部にＫｐｎＩ制限部位を含んだので、ＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ
の部分消化により、完全なＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓｓｂ遺伝子がｐＴ
−ＴＳＳＢプラスミドから抽出されるのを可能にした。完全なＴ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓのｓｓｂ遺伝子を含むＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ制限断片を、同じ２つの
制限酵素により消化したｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミドに挿入した。ｐＡ１
−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミドは下流のヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含
むが、それはｓｓｂ遺伝子の停止コドンの下流であって、フレームをはずれてお
り、そして発現されない。このプラスミドでＤＨ５α細菌を形質転換して、陽性
単離物を、１６１ｂｐ，６４２ｂｐ及び３．０ｋｂの断片を生じるＮｃｏＩ／Ｋ
ｐｎＩ制限酵素によるプラスミドの消化により選抜した。一つの陽性単離物から
のプラスミドを選択して、挿入されたＤＮＡの正確な配列を挿入領域を通したＤ
ＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１４４５及び１４４６，Ｐ１
３８−Ｓ５５７６，Ｐ１３８−Ｓ９１３）。このプラスミドをｐＡ１−ＴＳＳＢ
と命名して、単離物をグリセロールストック培養液として保存した（ＡＴＧグリ
セロールストック＃８４６）。 ｐＡ１−ＴＳＳＢ／ＭＧＣ１０３０から天然蛋白質としてＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓのｓｓｂ遺伝子を過剰発現するプラスミド（ｐＡ１−ＴＳＳＢ）の発現
の証明 前に記載されたとおりに、プラスミドｐＡ１−ＴＳＳＢをＤＨ５αから調製し
た。当該プラスミドでＭＧＣ１０３０細菌（ＡＴＧグリセロールストック＃８７
２，８７３，８７４）を形質転換した。細菌の生育と全細胞蛋白質の単離は実施
例２に記載された通りであった。上記３つの単離物各々からの全細胞蛋白質を含
む上清の小アリコート（３μｌ）を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリ
シン、及び０．１％ ＳＤＳ中の４−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲ
ル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）中の電気泳動
に供した。ミニゲルをクマジーブルーで染色した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓのＳＳＢの予測された分子量に相当する単離物の何れからも目に見える蛋白質
バンドは存在しなかった。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＣ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢ遺伝子を過剰発現するプラスミド（ｐＡ１−
ＣＢ−ＴＳＳＢ）の構築 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢをコードする遺伝子をＰＣＲによりｐ
Ａ１−ＴＳＳＢプラスミドを鋳型として用いて増幅した。フォワード／センスプ
ライマー（ＡＴＧプライマー ＃Ｐ１３８−Ｓ５４０）は、ｐＡ１−ＴＳＳＢの
構築において使用されたのと同じプライマーであって、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓのＳＳＢ遺伝子の５’末端に相補な領域を含んだ。前のとおり、ＮｃｏＩ
部位はＡＴＧ開始コドンとオーバーラップした。リバース／アンチセンスプライ
マーは、停止コドンを除いたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢ遺伝子の３
’末端に相補であった（ＡＴＧプライマー ＃Ｐ１３８−Ａ１３４３ｓｐｅ，５
’−ＧＡＣＧＡＣＴＡＧＴＡＡＡＣＧＧＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣ−３’）（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）。このプライマーはプライマーの相補領域に隣接し
てＳｐｅＩ制限部位を含んだ。ＳｐｅＩ部位は、発現された蛋白質が、ＳＳＢ蛋
白質のＣ−末端アミノ酸とＣ−末端融合ペプチドの間の２つの追加のアミノ酸（
ＴｈｒとＳｅｒ）を含むことを可能にさせた。この８００ｂｐのＰＣＲ産物をＮ
ｃｏＩ／ＳｐｅＩにより消化して、前記のとおり同じ制限酵素により消化したプ
ラスミドｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入した。このプラスミドでＤＨ５α細菌を
形質転換して、陽性単離物からのプラスミドを、０．８及び５．６ｋｂの断片を
生じるＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ制限酵素による消化により選抜した。一つの陽性プラ
スミドを選択して、挿入物の配列をＤＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ Ｓ
ＥＱ ＃１５０４−１５０７；プライマー，Ｐ３８−Ｓ５５７６，Ｐ６５−Ａ１
０６，Ｐ１３８−Ｓ９１３，Ｐ１３８−Ａ１１４８）。このプラスミドをｐＡ１
−ＣＢ−ＴＳＳＢと命名して、単離物をグリセロールストック培養液として保存
した（ＡＴＧグリセロールストック＃８９７）。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＣ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢ蛋白質のｐＡ１−ＣＢ−ＴＳＳＢ／ＭＧＣ１
０３０による発現の証明 プラスミドｐＡ１−ＴＳＳＢを調製して、ＭＧＣ１０３０細菌（ＡＴＧグリセ
ロールストック＃９１９）を形質転換した。細菌の生育と全細胞蛋白質の単離は
実施例２に記載された通りであった。全細胞蛋白質を含む上清の小アリコート（
３μｌ）を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ Ｓ
ＤＳ中の４−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６
０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）中の電気泳動に供した。ミニゲルをク
マジーブルーで染色した。ＣＢ−ＴＳＳＢが予測されたゲルの領域は他の強い蛋
白質バンドを含み、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢ蛋白質は可視化でき
なかった。
【０２６３】 次に、各溶解物中の全蛋白質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース
へ実施例２に記載されたとおりに移した（ブロットした）。各レーンは、１．５
μｌの上清を含んだ。ブロットされたニトロセルロース上の蛋白質は、前記のと
おり、ホスファターゼ配合ストレプトアビジンによる相互作用により可視化した
。内在のＥ．ｃｏｌｉのビオチン結合蛋白質〜２０ｋＤａは誘導及び非誘導サン
プルの両者において検出できた。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢ蛋白質
に相当する蛋白質バンドはギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの４０ｋＤａ分子量ス
タンダードのすぐ下を移動した。ＣＢ−ＴＳＳＢの予測された分子量は３３．５
ｋＤａであった。この蛋白質は誘導培養液中では弱いバンドとして観察されたが
、非誘導の対照溶解物中では観察されなかった。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＣ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓｓｂ遺伝子産物の大規模な生育 株ｐＡ１−ＣＢ−ＴＳＳＢ／ＭＧＣ１０３０を２５０Ｌの発酵機中で生育させ
ることにより、実施例２に記載されたとおりにＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの
ＳＳＢ蛋白質の精製のための細胞を生成した。細胞回収は、８．４のＯＤ600に
おいて、誘導の３時間後に開始して、細胞は回収の間１０℃に冷却した。回収容
量は１７８Ｌであって、最終回収重量は約２．４ｋｇの細胞ペーストであった。
等量の（ｗ／ｗ）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０％蔗糖溶液を細胞
ペーストに加えた。質のコントロールの結果は、接種物中アンピシリン含有培地
上の１０の陽性コロニーのうち１０を示し、誘導において８／１０陽性コロニー
、そして回収において８／１０の陽性コロニーを示した。細胞懸濁液を液体窒素
に注ぐことにより、細胞を凍結して、加工まで−２０℃において保存した。 ｐＡ１−ＣＢ−ＴＳＳＢ／ＭＧＣ１０３０によるヘキサヒスチジン及びビオチン
化部位を含むＣ−末端ペプチドに融合させたＳＳＢの最適硫酸アンモニウム沈殿
条件の決定 発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢを保有する細胞のスフェロ
プラストの創製により溶解を達成した。最初に、−２０℃において保存されてい
たＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞の１：１懸濁液１００ｇから（５０ｇ細胞）、Ｆ
ｒＩを調製した（１７０ｍｌ，１４ｍｇ／ｍｌ）。調製は、実施例２に記載され
たとおりであった。次に、サンプルを４つの等容量に分割して（４０ｍｌ）、６
．５６，９．０４，１１．６４及び１４．４４ｇの硫酸アンモニウム（３０％、
４０％、５０％及び６０％飽和）をそれぞれ各別々のサンプルに１５分間隔で４
℃において加えた。混合物はさらに３０分間４℃において放置して、次に２３，
０００ ｘ ｇにて４５分間０℃において遠心分離した。結果の沈殿物を２ｍｌ
のＮｉ−ＮＴＡ懸濁バッファーに懸濁した。３０％、４０％、５０％及び６０％
硫酸アンモニウム沈殿サンプルは、それぞれ、０．０４，０．１８，１．６及び
２．９ｍｇ／ｍｌの濃度の蛋白質を含んだ。上記サンプルをＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により分析した。３０％及び４０％の硫酸アンモニウム沈
殿サンプルは検出可能なＳＳＢ蛋白質を含まなかった。５０％及び６０％サンプ
ルは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢの分子量に相当する領域に移動す
る蛋白質の等しい強度のバンドを含んだ。このバンドは、上記引用の他の蛋白質
に比べて弱かったし、当該蛋白質の大規模な調製による収量は低いと考えられた
。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用したが硫酸アンモニウム沈殿を使用しないで精製され
たサンプルのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析も、別々のＴ
．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ蛋白質バンドを可視化できなかった。 ｐＡ１−ＣＢ−ＴＳＳＢ／ＭＧＣ１０３０によるヘキサヒスチジン及びビオチン
化部位を含むＣ−末端ペプチドに融合させたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳ
ＳＢ蛋白質の精製 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢの発現レベルの最初の分析が低い収量
を示したとしても、抗体産生のための十分な蛋白質が大規模調製物から得ること
ができた。発現されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢを保有する細胞の
スフェロプラストの創製により、溶解を達成した。実施例２に記載されたとおり
、−２０℃において保存されていたＴｒｉｓ−蔗糖中の凍結細胞の１：１懸濁液
８００ｇから（４００ｇ細胞）ＦｒＩを調製した（１２７０ｍｌ，１０．６ｍｇ
／ｍｌ）。ＦｒＩに対して、硫酸アンモニウム（各初期ｍｌ画分Ｉ−５０％飽和
まで０．２９１ｇ）を１５分間隔で加えた。上記混合物をさらに３０分間４℃に
おいて放置して、次に２３，０００ ｘ ｇにおいて４５分間０℃において遠心
分離した。液体窒素への浸潤により結果の沈殿物を素早く凍結させて、−８０℃
において保存した。
【０２６４】 蛋白質沈殿物を１５０ｍｌのＮｉ++−ＮＴＡ懸濁バッファーに懸濁して、ダウ
ンスホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離により
透明にして（１６，０００ ｘ ｇ）、上清はＦｒ ＩＩとした（３０ｍｇ／ｍ
ｌ）。Ｆｒ ＩＩを５０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂の５０％スラリーに加えて、１
．５時間４℃において振盪させた。次にこのスラリーをバイオラッドＥｃｏｎｏ
−カラム（２．５ ｘ ５ｃｍ）に負荷した。当該カラムを４００ｍｌのＮｉ++ −ＮＴＡ洗浄バッファーで１．５ｍｌ／分の流速で洗浄した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓのＳＳＢを１０−２００ｍＭイミダゾール試薬を含む２５０ｍｌの
Ｎｉ++−ＮＴＡ溶出バッファーで溶出した。溶出物を９６ ｘ ２．５ｍｌ画分
に回収した。画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びビオチンブロ
ット分析に供したところ、画分２８−７０が９５％を超える全ＳＳＢ蛋白質を含
むことがわかった（図５１）。Ｅ．ｃｏｌｉのδを対照として使用したが、分子
量がＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢに類するからである。クマジーブル
ー染色ゲル中で、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢに相当する明確な蛋白
質バンドは限定できなかったが、しかしながら、ビオチンブロット分析は、Ｔ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢ蛋白質を含む画分を我々が決定することを可
能にした。画分２８−７０をプールして（１００ｍｌ，０．７６ｍｇ／ｍｌ）、
硫酸アンモニウムを５０％飽和まで加えることにより沈殿させた。このサンプル
を前記の通りに遠心分離して、２つの蛋白質沈殿物をもたらした。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢ蛋白質に対するポリクローナル抗体の産
生 上からの２つのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢ沈殿した蛋白質沈殿物
の一つを２０ｍｌのＰＢＳに懸濁して、Ｆｒ ＩＩＩとした（１．５ｍｇ／ｍｌ
）。製造者の指示に従い、２ｍｌのＵｌｔｒａＬｉｎｋ（商標名）固定化モノマ
ーアビジンカラム（１．１ｃｍ ｘ ２．５ｃｍ）（ピアス）をＰＢＳプラス１
０％グリセロールで平衡化した。ＦｒＩＩＩサンプルをアビジンカラムに負荷し
、次に実施例３に記載されたとおり、洗浄（１５ｍｌ）して、画分に溶出した。
画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、Ｔ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢに相当する弱い蛋白質バンドが画分４−３５に
検出できた。これらの画分をプールして（２７ｍｌ，０．０１ｍｇ／ｍｌ）、硫
酸アンモニウムを５０％飽和まで添加することにより蛋白質を沈殿させ、そして
沈殿物を遠心分離により回収し（２３，０００ ｘ ｇ，４５分、０℃）、そし
て−８０℃において保存した。次に、沈殿物を２ｍｌのＰＢＳに懸濁して（０．
０１ｍｇ／ｍｌ）、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びビオチンブロ
ット分析に供した。このサンプルは２つの弱い上部の（ｕｐｐｅｒ）分子量の汚
染蛋白質を含んだが、しかしながら、ＳＳＢ蛋白質の低い収量のため、我々はこ
のサンプルを抗体の産生に使用することを決定した。
【０２６５】 透析したサンプルを使用して、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓｓｂ遺伝子
産物（ＳＳＢ蛋白質）に対するポリクローナル抗体を実施例３に記載されたとお
りにして生成した。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端蛋白質に融合させたＴ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓｓｂ遺伝子を過剰に発現するプラスミド（ｐＡ１−
ＮＢ−ＴＳＳＢ）の構築 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢの発現を増加させるため、ＳＳＢをＮ
−末端標識蛋白質として発現するようにベクターをデザインした。フォワード／
センスプライマー（ＡＴＧプライマー Ｐ１３８−Ｓ５３９ｐｓｔ，５’−ＡＡ
ＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＣＧＣＧＴＴＴＴＣＣ−３’）
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）をデザインして、非相補部分が「ＡＡＡ」クラン
プ部位及びＰｓｔＩ部位を含むようにした。当該プライマーの相補部分はコドン
２から始まるｓｓｂ遺伝子の最初の２５ヌクレオチドに相補であり、最初のコド
ン（「ＡＴＧ」開始コドン）を排除する。これは、ＰＣＲ産物がベクターｐＡ１
−ＮＢ−ＡｇｅＩへＰｓｔＩ部位において挿入されることを可能にし、よって、
ｓｓｂ遺伝子をＮ−末端標識ペプチドとインフレームで融合させる。リバース／
アンチセンスプライマー（ＡＴＧプライマー Ｐ１３８−Ａ１３４８ｓｔｏｐｓ
ｐｅ，５’−ＧＡＣＡＡＣＴＡＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＡＴＣＣＴＣ Ｃ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）は、非相補領域に「ＧＡＣＡ」クラン
プ領域及びＳｐｅＩ制限部位を含む。非相補領域は、天然の「ＴＧＡ」停止コド
ンに隣接することになる追加の「ＴＧＡ」（ＴＣＡ）停止コドンも含み、タンデ
ムに２つの停止コドンを提供する。
【０２６６】 ＰＣＲ反応はｐＡ１−ＴＳＳＢを鋳型として用いて、８１５ｂｐの長さのＰＣ
Ｒ産物を生じた。ＰｓｔＩとＳｐｅＩで消化したこのＰＣＲ産物をＰｓｔＩとＳ
ｐｅＩで消化したｐＡ１−ＮＢ−ＡｇｅＩに挿入し、そしてＴ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓのＳｐｅＩをコードする完全遺伝子を含んだプラスミドｐＡ１−ＮＢ
−ＴＳＳＢをもたらした。ｐＡ１−ＮＢ−ＴＳＳＢでＤＨ５α細菌を形質転換し
て、陽性の単離物を，５．６及び０．８ｋｂの断片を生じるＰｓｔＩ及びＳｐｅ
Ｉ制限消化によるプラスミド消化により選抜した。一つの陽性単離物からのプラ
スミドを選択して、当該ＤＮＡの両鎖の正確な配列が挿入領域を横切るＤＮＡ配
列決定により確認された（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１８５５−１８５９及び＃１８８
４−１８８５；プライマー：Ｐ１３８−Ｓ９１３，Ｐ１３８−Ａ１１４８，Ｐ１
３８−Ａ８２４，ＮＢ−Ｓｓｅｑ，ｐ６４−Ａ２１５）。この単離物をグリセロ
ールストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃１１０１）
。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢの発現の証明 プラスミドｐＡ１−ＮＢ−ＴＳＳＢを調製して、ＭＧＣ１０３０細菌（ＡＴＧ
グリセロールストック＃１１２８）及びＡＰ１．Ｌ１細菌（ＡＴＧグリセロール
ストック＃１１２９）を形質転換した。各形質転換体からの３つの単離物をさら
なる研究のために選択した。細菌の生育と全細胞蛋白質の単離は実施例＃２に記
載された通りであった。３つの単離物各々からの全細胞蛋白質を含む上清の小ア
リコート（３μｌ）を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０
．１％ ＳＤＳ中の４−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅ
ｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）中の電気泳動に供した。ミ
ニゲルをクマジーブルーで染色した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢの
予測された移動領域（約３３．５ｋＤａ）に相当する単離物すべてからの明確な
蛋白質バンドが可視化された。
【０２６７】 次に、各溶解物中の全蛋白質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース
へ実施例＃２に記載されたとおりに移した（ブロットした）。各レーンは、全蛋
白質を含む１．５μｌの上清を含んだ。ブロットされたニトロセルロース上の蛋
白質は、前記のとおり、ホスファターゼ配合ストレプトアビジンによる相互作用
により可視化した。内在のＥ．ｃｏｌｉのビオチン結合蛋白質〜２０ｋＤａは誘
導及び非誘導サンプルの両者において検出できた。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓのＳＳＢ蛋白質に相当する蛋白質バンドはギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの３
０と４０ｋＤａ分子量スタンダードの間の中間を移動した。この蛋白質は誘導培
養液中では極めて強いバンドとして観察されたが、非誘導の対照溶解物中では観
察されなかった。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢのｐＡ１−ＮＢ−ＴＳＳＢによる発現の
最適化 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓｓｂ遺伝子の発現は天然又はカップリング
されたＣ−末端融合ペプチドの両者として発現させた場合に、検出可能な蛋白質
の収量が低いか又は無かったので、細心の注意をＮ−末端融合ペプチドに連結し
たＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢに払って最適な発現を達成した。ｐＡ
１−ＮＢ−ＴＳＳＢを保有するＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１
の両方を用いて、異なる誘導時間において発現を分析した。細菌培養液の生育及
び分析は実施例＃２に記載されたとおりに実施した。ビオチンブロット分析は、
発現レベルが３７℃において高く、そしてＡＰ１／Ｌ１細菌株中で発現させた場
合にわずかに良好であったことを示した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳ
Ｂの最適な収量は３７℃において誘導の３時間後に達成された；この誘導時間を
次の実験において使用する。 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＳＳＢ／ＡＰ１．Ｌ１の大規模な生育 株ｐＡ１−ＮＢ−ＴＳＳＢ／ＡＰ１．Ｌ１を２５０Ｌの発酵機中で生育させる
ことにより、実施例＃２に記載されたとおりに、ヘキサヒスチジン及びビオチン
化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳ
ＳＢ蛋白質の精製のための細胞を生成した。細胞回収は、５．０のＯＤ600にお
いて、誘導の３時間後に開始して、細胞は回収の間１０℃に冷却した。回収容量
は１８０Ｌであって、最終回収重量は約２．０７ｋｇの細胞ペーストであった。
等量の（ｗ／ｗ）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０％蔗糖溶液を細胞
ペーストに加えた。細胞懸濁液を液体窒素に注ぐことにより、細胞を凍結して、
加工まで−２０℃において保存した。質のコントロールの結果は、接種物中アン
ピシリン含有培地上の１０の陽性コロニーのうち１０を示し、誘導において１０
陽性コロニーのうち１０、そして回収において１０の陽性コロニーのうち１０を
示した。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓｓｂ産物の精製 実施例２に記載されたとおりに、−２０℃において保存されていたＴｒｉｓ−
蔗糖中の凍結細胞の１：１懸濁液８００ｇ（４００ｇ細胞）の溶解を実施した。
回収した上清（１．４ ｌ）をＦｒ Ｉとした（１０．７ｍｇ／ｍｌ）。ＦｒＩ
に、硫酸アンモニウム（各初期ｍｌ画分Ｉ−５０％飽和まで０．２９１ｇ）を１
５分間隔で加えた。混合物はさらに３０分間４℃において撹拌して、次に遠心分
離した（２３，０００ ｘ ｇ，４５分間，０℃）。結果の沈殿物を液体窒素へ
浸潤することにより、素早く凍結させ、そして−８０℃において保存した。
【０２６８】 １００ｍｌのＮｉ++−ＮＴ懸濁バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），４０ｍＭ ＫＣｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０％グリセロール、７
ｍＭ βＭＥ，０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）に懸濁して、ダウンスのホモジェナイザ
ーを用いてホモジェナイズした。サンプルを遠心分離により透明にし（１６，０
００ ｘ ｇ）、そして上清をＦｒ ＩＩとした。Ｆｒ ＩＩをＮｉ++−ＮＴＡ
懸濁バッファー中のＮｉ++−ＮＴＡ樹脂の５０％スラリー４０ｍｌに加えて、１
．５時間４℃において振盪した。次に、このスラリーをバイオラッドＥｃｏｎｏ
−カラム（２．５ ｘ ５ｃｍ）に負荷した。当該カラムを、Ｎｉ++−ＮＴＡ溶
出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），４０ｍＭ ＫＣｌ
，７ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０％グリセロール、１０ｍＭイミダゾール、７ｍＭ
βＭＥ）３００ｍｌで０．５ｍｌ／分の流速で洗浄した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓのＳＳＢを１０−２００ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）勾配
を含む３００ｍｌのＮｉ++−ＮＴＡ溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５），４０ｍＭ ＫＣｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０％グリセロー
ル、７ｍＭ βＭＥ）で溶出した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢは勾
配の半分より後半に溶出し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより測定したと
ころ、多数の汚染蛋白質を含んだ。これらの画分をプールして、硫酸アンモニウ
ムによる沈殿により蛋白質を単離した。
【０２６９】 沈殿蛋白質の１／３を１０％グリセロール含有ＰＢＳに懸濁して、実施例＃３
に記載されたとおりにモノマーのアビジンを用いてさらに精製した。このカラム
からの生産はほとんど均質なＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢであった（
２０ｍｌ，０．２３ｍｇ／ｍｌ）。
【０２７０】 沈殿蛋白質の残りの２／３を２０ｍｌのＮｉ++−ＮＴＡ懸濁バッファーに懸濁
して、Ｎｉ++−ＮＴＡ樹脂の５０％スラリー１０ｍｌと混合して、１．５時間４
℃において振盪した。前のように、樹脂をカラムに注ぎ、そして精製した。この
カラムからの生産はほとんど均質なＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢであ
った（６８ｍｌ，０．５ｍｇ／ｍｌ）。両蛋白質精製物を液体窒素への浸潤によ
り凍結して、−８０℃において後の分析のために保存した。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓｓｂ遺伝子（ＳＳＢ）の翻訳共役ベクターｐ
ＴＡＣ−ＣＣＡ−ＣｌａＩへのクローン化 ＳＳＢを効率よく天然蛋白質として発現するため、我々は、ＳＳＢを翻訳共役
蛋白質として発現するようにベクターをデザインした。我々は、再び、実施例２
に記載されたとおりに翻訳共役を使用した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓ
ｓｂ遺伝子をＣＣＡ付加酵素の後ろに挿入し、そして翻訳共役により発現させた
他のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ蛋白質に関して記載されたとおりに翻訳共役
させた。最初に、ｓｓｂ遺伝子をｐＡ１−ＴＳＳＢを鋳型として用いてＰＣＲに
より増幅した。フォワード／センスプライマー（ＡＴＧプライマー ＃Ｐ１３８
−Ｓ５３３ｃｌａ２，５’−ＡＣＴＧＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＴＣＧＡＧＧＣ ＣＴＧＡＡＣＣＧＣ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）は非相補領域中にＣ
ｌａＩ制限部位を有する。非相補領域は、上流のＣＣＡ−付加蛋白質断片のため
の停止（ＴＡＡ）の「ＴＡ」も含む。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ
遺伝子の５’末端に相補なプライマーの領域は「Ａ」から始まるが、「ＡＴＧ」
開始コドンの最初のヌクレオチドであり且つ「ＴＡＡ」停止コドンの最後の「Ａ
」である。リバース／アンチセンスプライマー（ＡＴＧプライマー ＃Ｐ１３８
−Ａ１３４８ｓｔｏｐｓｐｅ，５’−ＧＡＣＡＡＣＴＡＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡＣ ＧＧＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）はプライマー
の非相補部分内にＳｐｅＩ制限部位を含み、また天然の停止コドンに隣接して追
加の停止コドンも含み、タンデムに２つの停止コドンを提供する。ＳｐｅＩによ
る効率よい切断のためのクランプ領域も存在した。次に、ＰＣＲ産物をＣｌａＩ
／ＳｐｅＩ制限酵素により消化して、同じ制限酵素で消化したｐＴＡＣ−ＣＣＡ
−ＣｌａＩプラスミドに挿入した。当該プラスミドでＤＨ５α細菌を形質転換し
て、アンピシリン耐性陽性単離物からのプラスミドを、０．８と５．５ｋｂの断
片を生じるＣｌａＩ／ＳｐｅＩ制限酵素による消化により選抜した。挿入物の両
鎖の配列をＤＮＡ配列決定により証明した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１６８８−１６
９２；プライマー，Ｐ１４４−Ｓ２３，Ｐ１４４−Ａ１９６５，Ｐ６５−Ａ１０
６，Ｐ１３８−Ｓ９１３，Ｐ１３８−Ａ１１４８，Ｐ１３８−Ａ８２８）。配列
分析は、正確な配列が挿入領域中に含まれたことを確証した。このプラスミドを
ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＳＳＢと命名して、単離物をストック培養液として保存し
た（ＡＴＧグリセロールストック＃１０３３）。 天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢのＰＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＳＳＢ／Ｍ
ＧＣ１０３０及びｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＳＳＢ／ＡＰ１．Ｌ１による発現の証明 ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＳＳＢプラスミドを調製して、ＭＧＣ１０３０細菌（Ａ
ＴＧグリセロールストック＃１０７１，１０７２、１０７３）及びＡＰ１．Ｌ１
（ＡＴＧグリセロールストック＃１０７９）を形質転換した。細菌の生育と全細
胞蛋白質の単離は実施例２に記載された通りであった。全細胞蛋白質を含む上清
の小アリコート（３μｌ）を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、
及び０．１％ ＳＤＳ中の４−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎ
ｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）中の電気泳動に供し
た。ミニゲルをクマジーブルーで染色した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳ
ＳＢの予測された分子量（２９．８ｋＤａ）に相当する弱い蛋白質バンドが可視
化され、ＡＰ１．Ｌ１単離物中で、ギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの３０ｋＤａ
分子量スタンダードのすぐ上を移動した。
【０２７１】 実施例１０ ２つのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの ｄｎａＱ遺伝子（εサブユニット）の同定 以前のＴｔｈ特許出願（米国出願＃０９／１５１８８８）から、プローブ５’
−ＣＣＴ ＣＧＡ ＡＣＡ ＣＣＴ ＣＣＴ ＧＣＣ ＧＣＡ ＡＧＡ ＣＣＣ
ＴＴＣ ＧＡＣ ＣＣＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）を用いて、Ｔ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノミックＤＮＡを含むラムダライブラリーを選抜
した。このプローブを用いて、１００を超える強い陽性プラークが同定されて、
再プレーティングにより確認した。３つを十分成長させ、ｄｎａＥに関して記載
されたとおりにＤＮＡを精製した。一つ（ｃｌ＃５．１．１）を次の配列決定の
ために選択した。ｄｎａＱ遺伝子の主要部分の配列は、ＰＣＲ産物から選択され
た配列を用いて単離されたラムダＤＮＡ中の挿入物の配列を直接決定して配列決
定を開始することにより、得た。前に記載されたとおり（米国出願＃０９／１５
１８８８）、配列の予備実験の際、他の細菌由来の他のＤＮＡポリメラーゼＩＩ
Ｉのεサブユニットに対する有意な相同性を示すオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）を一つコードすることがわかった（ＢＬＡＳＴ検索に基づき）。強い
二次構造あるいは他のブロックがＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ遺伝
子のさらに３’側の配列を得ることを妨害した。
【０２７２】 上記の同定されたＯＲＦの配列を用いて、ゲッチンゲンゲノミックス研究所に
おけるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノムのデータベースを検索した。それ
は、我々の部分的なＴｔｈのｄｎａＱ配列によく似ていることを示す２つのオー
プンリーディングフレームを示した。密接にマッチしたものをｄｎａＱ−１と命
名して、スコアリングマッチが低かったものをｄｎａＱ−２と命名した。ｄｎａ
Ｑ−２は実施例１４に記載する。相同性スコアのみで、実際の配列データはウエ
ブサイトから利用できなかった。Ｄｒ．Ｃａｒｓｔｅｎ Ｊａｃｏｂｉ（ゲッチ
ンゲンゲノミックス研究所、微生物学及び遺伝学研究所、グリーゼバッハ通り８
、ゲッチンゲン、独国）は、彼らのウエブサイト上で、我々のＢＬＡＳＴのヒッ
トの領域内の未加工の非自動化不完全配列情報を提供することに同意した。配列
の調査は、２つの明確に異なるが相同なｄｎａＱ様遺伝子を示唆した。最初に、
ｄｎａＱ−１に焦点を絞ると、いくつかの制限部位（ＮｇｏＭＩＶ，ＢａｍＨＩ
，ＮｃｏＩ及びＳａｃＩ）がｄｎａＱ−１遺伝子の上流及び下流に同定された。
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−１遺伝子の完全に正確な配列を得る
ため、ラムダクローン＃５．１．１（米国出願＃０９／１５１８８８に記載され
た）をＮｇｏＭＩＶ，ＢａｍＨＩ，ＮｃｏＩ及びＳａｃＩ制限酵素により消化し
た。制限消化は、５μｌ（約２．８μｇのＤＮＡ）のラムダクローン＃５．１．
１において実施した。消化したＤＮＡサンプルを１％アガロースゲル上で電気泳
動して、キャピラリーによりＭＳＩマグナグラフナイロン膜に移した。ブロット
（１０ ｘ １５ｃｍ）を２０ｍｌのＡｍｂｉｏｎ Ｕｌｔｒａｈｙｂ（商標名
）ハイブリダイゼーション溶液で４２℃において２時間処理し、次に、２０ｎｇ
のビオチン化プローブ（プローブ５’−ＣＣＴ ＣＧＡ ＡＣＡ ＣＣＴ ＣＣ
Ｔ ＧＣＣ ＧＣＡ ＡＧＡ ＣＣＣ ＴＴＣ ＧＡＣ ＣＣＡ−３’）（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：３５）をハイブリダイゼーションバッグに加え、そしてブロッ
トを４２℃において一晩インキュベートした。ＮＥＢ Ｐｈｏｔｏ ＣＤＰ−Ｓ
ｔａｒ化学発光検出キット（ニューイングランドバイオラブズ）を製造者の指示
に従い使用して、ブロットを処理して検出した。プローブは１ｋｂ ＮｇｏＭＩ
Ｖ／ＳａｃＩ制限断片にハイブリダイズした。この１ｋｂのＮｇｏＭＩＶ／Ｓａ
ｃＩ制限断片をサブクローン化及び配列決定のために選択した。
【０２７３】 ｐＵＣ２１クローニングベクター（シグマ）を受容ＤＮＡとして選択して、Ｎ
ｇｏＭＩＶ／ＳａｃＩ消化に供した。ラムダクローン＃５．１．１のＮｇｏＭＩ
Ｖ／ＳａｃＩ断片を、消化いたｐＵＣ２１内に連結した。結果のプラスミドでＤ
Ｈ５αを形質転換して、単離物をアンピシリン耐性に関して選択した。プラスミ
ドを一つの陽性単離物から精製して、予測された１．０及び２．７ｋｂ及び４８
０ｂｐ及び３．３ｋｂｎｏ断片をそれぞれ生じるＮｇｏＭＩＶ／ＳａｃＩ及びＸ
ｈｏＩによるプラスミドの消化により選抜した。挿入された領域の両ＤＮＡ鎖を
配列決定した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１４３７−１４４２；プライマー，Ｍ１３リ
バースプライマー，Ｐ１４０−Ｓ８３９，Ｐ１４０−Ｓ１２０９，Ｐ１４０−Ａ
１４４３，Ｐ１４０−Ａ１０８９及びｐＵＣ２１−Ａ８２９）。このプラスミド
をｐＵＣ２１−ＴＱと命名して、単離物をストック培養液として保存した（ＡＴ
Ｇグリセロールストック＃８４３）。
【０２７４】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−１遺伝子のＤＮＡコーディング配
列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）を図５２に示す。開始コドン（ａｔｇ）及び停
止コドン（ｔｇａ）を太字で示す。図５３にも示すのは、上記ＤＮＡコーディン
グ配列に由来する蛋白質（アミノ酸）配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）である
。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−１遺伝子を発現するプラスミド（ｐ
Ａ１−ＴＱ）の構築 天然蛋白質としてＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−１遺伝子産物（
ε１サブユニット）の発現を達成した。ｐＡ１−ＴＱの構築は、天然Ｔ．ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−１遺伝子のｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ−２プラスミ
ドへの挿入により実施した。ｐＵＣ２１−ＴＱプラスミドを調製して、Ｔ．ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−１遺伝子をｐＵＣ２１−ＴＱプラスミドから
ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応において使用したフォワード／センスプライ
マー（ＡＴＧプライマー ＃Ｐ１４０−Ｓ９６ｃｌａ；５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴ
ＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）を
デザインして、ｄｎａＱ−１遺伝子のために使用したＡＴＧ開始コドンのＡＴと
オーバーラップする上流のＣｌａＩ部位を有するようにした。ｄｎａＱ−１遺伝
子の天然の停止コドンはＧＴＧであり、これは上記プライマー中でＡＴＧ開始コ
ドンにより置換ることにより、Ｅ．ｃｏｌｉ内の発現を可能にさせた。リバース
／アンチセンスプライマー（ＡＴＧプライマー ＃Ｐ１４０−Ａ７１３ｋｐｎ；
５’−ＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）をデザインして、天然停止コドンにタン
デムに配置された追加の停止コドンを有するようにした。この追加の停止コドン
は上記プライマーの非相補領域においてＫｐｎＩ制限部位に隣接した。ＰＣＲ産
物をＣｌａＩとＫｐｎＩ制限酵素により消化した。消化したＰＣＲ産物をＣｌａ
Ｉ／ＫｐｎＩ消化したｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ−２プラスミドに挿入した。これら
のプラスミドでＤＨ５α細菌を形質転換して、陽性の単離物をアンピシリン耐性
により選択した。プラスミドを一つのクローンから精製して、０．６と５．６ｋ
ｂの断片を生じる精製プラスミドのＣｌａＩ／ＫｐｎＩ消化により選抜した。こ
のプラスミド内の挿入領域をＤＮＡ配列決定に供することにより、正確な配列を
確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１５０８−１５１１；プライマー，Ｐ３８−Ｓ５
５７６，Ｐ６５−Ａ１０６，Ｐ１４０−Ｓ８３９及びＰ１４０−Ａ１０８９）。
このプラスミドをｐＡ１−ＴＱと命名して、単離物をストック培養液として保存
した（ＡＴＧグリセロールストック＃９００）。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−１遺伝子（εサブユニット）を天然
蛋白質としてｐＡ１−ＴＱ／ＭＧＣ１０３０から過剰発現するプラスミド（ｐＡ
１−ＴＱ）の発現の証明 ｐＡ１−ＴＱプラスミドを調製して、ＭＧＣ１０３０細菌を形質転換した。３
つの単離物を次の研究のために選択した（ＡＴＧグリセロールストック＃９２１
，９２２，９２３）。細菌の生育及び部位に細胞蛋白質の単離は実施例２に記載
されたとおりに実施した。３つの単離物各々からの全細胞単を含む小アリコート
（３μｌ）を、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ
，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩
基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。ミニゲルをク
マジーブルーで染色した。εサブユニットの予測された移動領域に相当する単離
物の如何なるものからの可視蛋白質バンドもなかった。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＣ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−１（ε１サブユニット）を過剰発現する
プラスミド（ｐＡ１−ＣＢ−ＴＱ）の構築 天然のεサブユニットを発現させる初期の試みは失敗に終わったため、ヘキサ
ヒスチジン及びビオチン化部位を含む融合ペプチドにＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓのｄｎａＱ−１遺伝子をカップリングさせるようにベクターをデザインした
。ｐＡ１−ＣＢ−ＴＱの構築も、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−１
遺伝子のｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ２プラスミドへの挿入により実施した。リバース
／アンチセンスプライマーは、しかしながら、当該遺伝子の３’末端上にＳｐｅ
Ｉ部位を付加することにより、ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＣ−
末端ペプチドをコードするＤＮＡとフレームが合うようなｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ
２プラスミドへの挿入を可能にした。ｐＵＣ２１−ＴＱプラスミドをＰＣＲ鋳型
として使用するために調製した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−１
遺伝子を、ｐＵＣ２１−ＴＱプラスミドからＰＣＲを用いて増幅した。フォワー
ド／センスプライマー（ＡＴＧプライマー ＃Ｐ１４０−Ｓ９６ｃｌａ）はｐＡ
１−ＴＱを生成するのに使用したのと同じであった。リバース／アンチセンスプ
ラスミド（ＡＴＧプライマー ＃Ｐ１４０−Ａ７０８Ｓｐｅ；５’−ＣＣＴＣＡ
ＣＴＡＧＴＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：４０）は、ＳｐｅＩ制限部位が終わりから２番目のコドンに隣接するように
デザインした（停止コドンは除去した）。当該ＳｐｅＩ部位は、上記の発現され
た蛋白質が、εサブユニットのＣ−末端アミノ酸とＣ−末端融合ペプチドの間に
２つの追加のアミノ酸（ＴｈｒとＳｅｒ）を含むことを可能にさせた。上記ＰＣ
Ｒ産物をＣｌａＩとＳｐｅＩ制限酵素により消化して、ＣｌａＩ／ＳｐｅＩ消化
したｐＡ１−ＣＢ−Ｃｌａ２プラスミドへ挿入した。次に、上記プラスミドでＤ
Ｈ５α細菌を形質転換して、陽性単離物からのプラスミドをアンピシリン耐性に
関して選択した。プラスミドを一つの陽性単離物から単離して、０．６と５．６
ｋｂの断片を生じるＣｌａＩとＳｐｅＩ制限酵素による消化により選抜した。挿
入された領域の正確な配列はＤＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ
＃１５２６−１５２９；プライマー，Ｐ３８−Ｓ５５７６，Ｐ６５−Ａ１０６，
Ｐ１４０−Ｓ８３９及びＰ１４０−Ａ１０８９）。このプラスミドをｐＡ１−Ｃ
Ｂ−ＴＱと命名して、単離物をストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロ
ールストック＃９１１）。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＣ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−１遺伝子（ε１サブユニット）をｐＡ１
−ＣＢ−ＴＱ／ＭＧＣ１０３０から過剰発現するプラスミド（ｐＡ１−ＣＢ−Ｔ
Ｑ１）の発現の証明 ｐＡ１−ＣＢ−ＴＱ１プラスミドを調製して、ＭＧＣ１０３０細菌を形質転換
した。３つの単離物（ＡＴＧグリセロールストック＃９２９）を次の研究のため
に選択した。細菌の生育と全細胞蛋白質の単離は実施例２に記載された通りに実
施した。３つの単離物各々からの全細胞蛋白質を含む小アリコート（３μｌ）を
、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２
５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍ
Ｍグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。ミニゲルをクマジーブルー
で染色した。ε１サブユニットの予測された移動領域に相当する単離物の如何な
るものからの可視蛋白質バンドもなかった。
【０２７５】 次に、溶解物からの全蛋白質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース
へ、実施例２に記載されたとおりに移した。ブロットされたニトロセルロース上
の蛋白質は、ホスファターゼ−配合ストレプトアビジンとの相互作用により可視
化した。内在のＥ．ｃｏｌｉビオチン−ＣＣＰ、〜２０ｋＤａが誘導及び非誘導
サンプルの両方において検出可能であった。ε１サブユニットに相当する蛋白質
バンドがギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの２０ｋＤａと３０ｋＤａの分子量スタ
ンダードの間のほぼ中間を移動した。これは、２５．８ｋＤａの予測され分子量
に一致する。この蛋白質は誘導培養物中で弱いバンドとして観察されたが、ＡＰ
１．Ｌ１からの溶解物中においては非誘導の対照中に観察されなかった。当該蛋
白質は精製の試みが正当であると理由付けするのにはあまりに低いレベルでしか
発現されなかった。
【０２７６】 実施例１１ Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＵｖｒＤヘリカーゼ Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｕｖｒＤ遺伝子の同定とクローン化 Ｅ．ｃｏｌｉの由来のＵｖｒＤ蛋白質配列を用いて、ゲッチンゲンゲノミック
ス研究所におけるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノムのデータベースを検索
した。仮想Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｕｖｒＤ遺伝子を含む、Ｔ．ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノムの領域（２−４−２０００コンティーグワーキング
．０．１５３７２，領域４０２０１−４６７４０）が同定されて（ＢＬＡＳＴを
使用して）、得られた（Ｄｒ．Ｃａｒｓｔｅｎ Ｊａｃｏｂｉから、ゲッチンゲ
ンゲノミックス研究所、微生物学及び遺伝学研究所、グリーゼバッハ通り８、ゲ
ッチンゲン、独国）。未加工の配列を用いて、ｕｖｒＤ遺伝子を増幅するために
２つのＰＣＲプライマーをデザインした。Ｎ−末端標識蛋白質を発現するのに我
々が有する全てのベクターは、当該ベクターへ上記遺伝子の５’末端を挿入する
ためのＰｓｔＩ部位を必要とする。しかしながら、ｕｖｒＤ遺伝子内にＰｓｔＩ
がある。この問題を克服するため、ＮｓｉＩ部位をフォワード／センスプライマ
ー（ＡＴＧプライマーＰ１５９−Ｓ１６８９，５’−ＧＡＣＴＡＴＧＣＡＴＡＧ ＣＧＡＣＧＣＣＣＴＣＣＴＡＧＣＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：６５）の非相補領域に加えた。ＰＣＲ産物のＮｓｉＩ制限切断部位は、
ｐＡ１−ＮＢ−ＡｇｅＩプラスミド上でＰｓｔＩ制限切断部位により利用（アニ
ール）され得る４つのヌクレオチド突出を残すことになる。ＰｓｔＩとＮｓｉＩ
部位は連結により破壊されるが、ｕｖｒＤ遺伝子はＮ−末端融合ペプチドをコー
ドするＤＮＡ内にフレームが合って挿入される。ＰＣＲ産物はＧＴＧ開始コドン
を排除して、コドン２から始まり、コドン２にＮｓｉＩ部位が隣接する。リバー
ス／アンチセンスプライマー（ＡＴＧプライマーＰ１５９−Ａ３７８６，５’−
ＧＡＣＴＡＣＴＡＧＴＣＴＡＴＣＡＴＧＣＣＧＧＣＴＴＡＡＧＣＴＣＣＧＣＧ−
３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）は、天然の「ＴＧＡ」停止コドンに隣接し
て追加の「ＴＡＧ」停止コドンを、そしてＳｐｅＩ制限部位を非相補領域中に含
むようにデザインした。両プライマーは、ＮｓｉＩとＳｐｅＩ制限酵素による効
率よい消化を可能にするための追加のヌクレオチドを含んだ。ＰＣＲ反応はＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノミックＤＮＡを鋳型として用いて、２４１０ｂ
ｐの長さのＰＣＲ産物を生成した。ＮｓｉＩとＳｐｅＩで消化したこのＰＣＲ断
片をＰｓｔＩとＳｐｅＩで消化したｐＡ１−ＮＢ−ＡｇｅＩに挿入して、Ｔ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＵｖｒＤヘリカーゼをコードする完全遺伝子を含んだ
プラスミドｐＡ１−ＮＢ−ＴｕｖｒＤをもたらした。
【０２７７】 ｐＡ１−ＮＢ−ＴｕｖｒＤでＤＨ５α細菌を形質転換して、陽性単離物を５．
５と２．４５ｋｂの断片を生じるＮｄｉＩとＳｐｅＩ制限消化によるプラスミド
の消化に関して選抜した。一つの陽性単離物からのプラスミドを選択して、当該
ＤＮＡの両方の鎖の正確な配列を挿入領域を横切るＤＮＡ配列決定により確認し
た（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１９９３−２００５；プライマー：Ｐ１５９−Ｓ１９２
６，Ｐ１５９−Ｓ２３２６，Ｐ１５９−Ｓ２７３３，Ｐ１５９−Ｓ３１３４，Ｐ
１５９−Ｓ３５４０，Ｐ１５９−Ａ３５９２，Ｐ１５９−Ａ３３３２，Ｐ１５９
−Ａ３１５４，Ｐ１５９−Ａ２７７０，Ｐ１５９−Ａ２４７１，Ｐ１５９−Ａ２
０６０，ＮＢ−Ｓｓｅｑ，ｐ６４−Ａ２１５）。この単離物をグリセロールスト
ック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃１１６１）。
【０２７８】 このＤＮＡ配列を、ゲッチンゲンゲノミックス研究所におけるＴ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓのゲノムのデータベースから得た未加工の配列と比較するに際し
て、不一致が観察された。よって、この単離物の挿入領域を配列決定することに
より得たｕｖｒＤ遺伝子をコードするＤＮＡの配列を適合させるため、第２のク
ローンを不可欠なエリアにおいて配列決定した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃２００７−
２００８，プライマー；Ｐ１５９−Ａ３１５４及びＰ１５９−Ａ２４７１）。未
加工のＤＮＡ配列に関して報告されたものからの上記遺伝子の配列決定により観
察された変化は：３３７位のＣ＞Ｇ（アミノ酸変化なし）；４６６位のＣ＞Ｔ（
アミノ酸変化なし）；７３１位のＧの欠失（フレームシフト）；７７６位のＧの
挿入（フレームシフト）；１４７４位のＴ＞Ｃ（アミノ酸変化なし）；１４７５
位のＴ＞Ｃ（Ｓｅｒ＞Ｐｒｏのアミノ酸変化）；１４８１位のＧ＞Ｃ（Ｐｒｏ＞
Ａｌａのアミノ酸変化）であった。
【０２７９】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｕｖｒＤ遺伝子のＤＮＡコーディング配列を
示す（図５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）。開始コドン（ｇｔｇ）停止コドン
（ｔｇａ）を太字で示す。また、上記ＤＮＡ配列由来の蛋白質（アミノ酸）配列
（図５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）も示す。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＵｖｒＤの発現の証明 ｐＡ１−ＮＢ−ＴｕｖｒＤプラスミドを調製して、ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１
．Ｌ１細菌を形質転換した。各形質転換体からの３つの単離物を次の研究のため
に選択した。細菌の生育と全細胞蛋白質の単離は実施例２に記載された通りであ
った。３つの単離物各々からの全細胞蛋白質を含む小アリコート（３μｌ）を、
４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５
５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭ
グリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。ミニゲルをクマジーブルーで
染色した。ｕｖｒＤ（約８０ｋＤａ）の予測された移動領域に相当する単離物の
如何なるものからの可視蛋白質バンドもなかった。
【０２８０】 次に、各溶解物からの全蛋白質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロー
スへ、実施例２に記載されたとおりに移した。各レーンは１．５ｕｌの上清を含
んだ。ブロットされたニトロセルロース上の蛋白質は、前記のとおりにホスファ
ターゼ−配合ストレプトアビジンとの相互作用により可視化した。内在のＥ．ｃ
ｏｌｉビオチン−ＣＣＰ、〜２０ｋＤａが誘導及び非誘導サンプルの両方におい
て検出可能であった。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｕｖｒＤ蛋白質に相当す
る蛋白質バンドがギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの８０ｋＤａの分子量スタンダ
ードのすぐ下を移動した。この蛋白質は誘導培養物中で弱いバンドとして観察さ
れたが、非誘導の対照溶解物中に観察されなかった。ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１
．Ｌ１中のｐＡ１−ＮＢ−ＴｕｖｒＤのグリセロールストック（ＡＴＧグリセロ
ールストックそれぞれ＃１１７７及び１１７８）を−８０℃において保存した。
【０２８１】 実施例１２ Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤｎａＧ−プライマーゼ Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＧ遺伝子の同定とクローン化 Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤｎａＧ蛋白質配列を用いて、ゲッチンゲンゲノミックス
研究所におけるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノムのデータベースを検索し
た。仮想Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｎａＧ遺伝子を含む、Ｔ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノムの領域（２−４−２０００コンティーグワーキング．
０．２４６２４，領域４２９６１−４８０６０）が同定されて（ＢＬＡＳＴを使
用して）、得られた（Ｄｒ．Ｃａｒｓｔｅｎ Ｊａｃｏｂｉから、ゲッチンゲン
ゲノミックス研究所、微生物学及び遺伝学研究所、グリーゼバッハ通り８、ゲッ
チンゲン、独国）。未加工の配列を用いて、ｄｎａＧ遺伝子を増幅するために２
つのＰＣＲプライマーをデザインした。フォワード／センスプライマー（ＡＴＧ
プライマーＰ１６１−Ｓ１９２２，５’−ＧＡＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＧＧ ＧＣＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９）
は、非相補部分が「ＧＡＣＴ」クランプ領域及びＰｓｔＩ部位を含むようにデザ
インされる。当該プライマーゼの非相補部分はコドン２から始まるｄｎａＧ遺伝
子の最初の２５ｎｔに相補であり、最初のコドン（「ＡＴＧ」開始コドン）が排
除される。これは、ＰＣＲ産物がＰｓｔＩ部位においてベクターｐＡ１−ＮＢ−
Ａｖｒ２（ＢａｍＨＩ−）に挿入されることを可能にし、当該遺伝子をＮ−末端
標識されたペプチドとインフレームに融合させる。リバース／アンチセンスプラ
イマー（ＡＴＧプライマーＰ１６１−Ａ３７１４，５’−ＧＡＣＴＡＣＴＡＧＴ
ＣＴＡＣＴＡＧＧＴＧＧＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７０）は、「ＧＡＣＴ」クランプ領域及びＳｐｅＩ制限部位を非相補領
域に含む。当該非相補領域は、天然の「ＴＧＡ」停止コドンに隣接することにな
る追加の「ＴＡＧ」（ＣＴＡ）停止コドンも含むことにより、タンデムに２つの
停止コドンを提供する。
【０２８２】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＧ遺伝子の配列は、（図５６、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：７１）である。開始（ａｔｇ）コドン及び停止（ｔｇａ）コドン
を太字で示す。当該ＤＮＡ配列由来の蛋白質（アミノ酸）配列も示す（図５７、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）。
【０２８３】 ＰＣＲ反応はＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノミックＤＮＡを鋳型として
用いて、２１４８ｂｐの長さのＰＣＲ産物を生成した。ＰｓｔＩとＳｐｅＩで消
化したこのＰＣＲ断片をＰｓｔＩとＳｐｅＩで消化したｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ２
（ＢａｍＨＩ−）に挿入して、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤｎａＧプライ
マーゼをコードする完全遺伝子を含んだプラスミドｐＡ１−ＮＢ−ＴｄｎａＧを
もたらした。ｐＡ１−ＮＢ−ＴｄｎａＧでＤＨ５α細菌を形質転換して、陽性単
離物を５．６と２．１５ｋｂの断片を生じるＰｓｔＩとＳｐｅＩ制限消化による
プラスミドの消化に関して選抜した。一つの陽性単離物からのプラスミドを選択
して、当該ＤＮＡの両方の鎖の正確な配列を挿入領域を横切るＤＮＡ配列決定に
より確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃２０２２−２０３１；プライマー：Ｐ１６１
−Ｓ２２６０，Ｐ１６１−Ｓ２６５０，Ｐ１６１−Ｓ３０５６，Ｐ１６１−Ｓ３
３４９，Ｐ１６１−Ａ３３７５，Ｐ１６１−Ａ３０４８，Ｐ１６１−Ａ２６９４
，Ｐ１６１−Ａ２３８９，ＮＢ−Ｓｓｅｑ，ｐ６４−Ａ２１５）。ここで決定し
たＤＮＡ配列をゲッチンゲンゲノミックス研究所におけるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓのゲノムのデータベースから得た未加工の配列と比較したが、違いは観
察されなかった。この単離物をグリセロールストック培養液として保存した（Ａ
ＴＧグリセロールストック＃１１７３）。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤｎａＧの発現の証明 ｐＡ１−ＮＢ−ＴｄｎａＧプラスミドを調製して、ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１
．Ｌ１細菌を形質転換した。各形質転換体からの３つの単離物を次の研究のため
に選択した。細菌の生育と全細胞蛋白質の単離は実施例２に記載された通りであ
った。３つの単離物各々からの全細胞蛋白質を含む小アリコート（３μｌ）を、
４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５
５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭ
グリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。ミニゲルをクマジーブルーで
染色した。ＤｎａＧ（約８０ｋＤａ）の予測された移動領域に相当する単離物の
全てから明確な蛋白質バンドが可視化された。
【０２８４】 次に、各溶解物からの全蛋白質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロー
スへ、実施例２に記載されたとおりに移した。各レーンは１．５ｕｌの上清を含
んだ。ブロットされたニトロセルロース上の蛋白質は、前記のとおりにホスファ
ターゼ−配合ストレプトアビジンとの相互作用により可視化した。内在のＥ．ｃ
ｏｌｉビオチン−ＣＣＰ、〜２０ｋＤａが誘導及び非誘導サンプルの両方におい
て検出可能であった。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤｎａＧ蛋白質に相当す
る蛋白質バンドがギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの７０と８０ｋＤａの分子量ス
タンダードの間の中間を移動した。この蛋白質は誘導培養物中で弱いバンドとし
て観察されたが、非誘導の対照溶解物中に観察されなかった。ＭＧＣ１０３０及
びＡＰ１．Ｌ１中のｐＡ１−ＮＢ−ＴｄｎａＧのグリセロールストック（ＡＴＧ
グリセロールストックそれぞれ＃１１８２及び１１８３）を−８０℃において保
存した。
【０２８５】 実施例１３ Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＰｒｉＡ−ヘリカーゼ Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｐｒｉＡ遺伝子の同定とクローン化 Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＰｒｉＡ蛋白質配列を用いて、ゲッチンゲンゲノミックス
研究所におけるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノムのデータベースを検索し
た。仮想Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐｒｉＡ遺伝子を含む、Ｔ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノムの領域（２−４−２０００コンティーグワーキング．
０．２１９６，領域３６５４１−４２８４０）が同定されて（ＢＬＡＳＴを使用
して）、得られた（Ｄｒ．Ｃａｒｓｔｅｎ Ｊａｃｏｂｉから、ゲッチンゲンゲ
ノミックス研究所、微生物学及び遺伝学研究所、グリーゼバッハ通り８、ゲッチ
ンゲン、独国）。未加工の配列及び開始コドン及び停止コドンの正確な配置が不
確実なため、我々は、仮想開始コドンの約２００ｂｐ上流から始まる領域から、
仮想停止コドンの約２００ｂｐ下流まで配列決定することに決定した。未加工の
配列を用いて、ｐｒｉＡ遺伝子を増幅するために２つのＰＣＲプライマーをデザ
インした。フォワード／センスプライマー（ＡＴＧプライマーＰ１６２−Ｓ９６
３，５’−ＣＣＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧ ＧＡＡＣＣＡ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）及びリバース／アンチセン
スプライマー（ＡＴＧプライマー１６２−Ａ３６２５、５’−ＧＧＧＧＣＡＧＣ ＣＧＣＡＡＧＧＧＧＴＡＡＧＧＧＴＡＧＡＡＡＡ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：７４）を、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノミックＤＮＡを鋳型として用
いて、２６７６ｂｐのＤＮＡ断片を生じさせた。このＤＮＡ断片を製造者の指示
に従いｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙプラスミドのＴ／Ａクローニング部位へ挿入するこ
とにより、ｐＴ−ＴｐｒｉＡを創製した。このプラスミドでＤＨ５α細菌を形質
転換して、陽性単離物を２．７と３．０ｋｂの断片を生じるＥｃｏＲＩ制限消化
によるプラスミドの消化、及び０．６と５．１ｋｂの断片を生じるＨｉｎｄＩＩ
Ｉ制限消化によるプラスミドの消化に関して選抜した。一つの陽性単離物からの
プラスミドを選択して、当該ＤＮＡの両方の鎖の正確な配列を挿入領域を横切る
ＤＮＡ配列決定により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１９６９−１９８２，２０
０９−２０１７，及び２０４２−２０４３；プライマー：ＳＰ６，Ｔ７−Ｓｐｅ
２，Ｐ１６２−Ｓ１２９２，Ｐ１６２−Ｓ１６５６，Ｐ１６２−Ｓ２０２６，Ｐ
１６２−Ｓ２４０８，Ｐ１６２−Ｓ２７８１，Ｐ１６２−Ｓ３１７３，Ｐ１６２
−Ａ３２５７，Ｐ１６２−Ａ２８２５，Ｐ１６２−Ａ２４４６，Ｐ１６２−Ａ２
０３８，Ｐ１６２−Ａ１７０９，Ｐ１６２−Ａ１２４３，Ｐ１６２−Ｓ９６３，
Ｐ１６２−Ａ１３３５，Ｐ１６２−Ｓ１１４６）。ここで決定したＤＮＡ配列を
ゲッチンゲンゲノミックス研究所におけるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノ
ムのデータベースから得た未加工の配列と比較したが、不一致は認められなかっ
た。この単離物をグリセロールストック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロ
ールストック＃１１５５）。
【０２８６】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｐｒｉＡ遺伝子の配列は、（図５８、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：７５）である。開始（ｇｔｇ）コドン及び停止（ｔａｇ）コドン
を太字で示す。当該ＤＮＡ配列由来の蛋白質（アミノ酸）配列も示す（図５９、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）。
【０２８７】 発現ベクターｐＡ１−ＮＢ−ＡｇｅＩ中にＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝
子を挿入してＮ−末端標識蛋白質として発現させるため、５’ＰｓｔＩ制限部位
及び３’ＳｐｅＩ制限部位を必要とした。これは、非相補領部分が「ＧＡＣＴ」
クランプ領域及びＰｓｔＩ制限部位を含むようにデザインされたフォワード／セ
ンスプライマー（ＡＴＧプライマーＰ１６２−Ｓ１０５２，５’−ＧＡＣＴＣＴ
ＧＣＡＧＣＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＴＴＣ−３’）（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：７７）を用いて、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子をＰＣＲによ
り増幅して達成した。上記プライマーの相補部分はコドン２で始まるｐｒｉＡの
最初の２２ｎｔに相補であり、最初のコドン（このケースでは開始コドンが「Ｇ
ＴＧ」）が排除される。リバース／アンチセンスプライマー（ＡＴＧプライマー
Ｐ１６２−Ａ３１８０，５’−ＣＡＧＴＡＣＴＡＧＴＣＴＡＧＴＣＣＴＣＣＡＡ ＡＡＧＣＣＣＣＡＣＧＡ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）は、非相補領領
域に「ＧＡＣＴ」クランプ領域及びＳｐｅＩ制限部位を含む。このＰＣＲプライ
マーは追加の停止コドンを含むことができないか、又は天然の「ＴＡＧ」（ｃｔ
ａ）に隣接することになる追加のＳｐｅＩを創製する。ＰＣＲ反応はｐＴ−Ｔｐ
ｒｉＡを鋳型として用いて、２１３０ｂｐの長さのＰＣＲ産物を生じた。このＰ
ＣＲ断片をＰｓｔＩとＳｐｅＩで消化して、ＰｓｔＩとＳｐｅＩで消化したｐＡ
１−ＮＢ−ＡｇｅＩに挿入して、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＰｒｉＡヘリ
カーゼをコードする完全な遺伝子を含んだプラスミドｐＡ１−ＮＢ−ＴｐｒｉＡ
をもたらした。ｐＡ１−ＮＢ−ＴｐｒｉＡでＤＨ５α細菌を形質転換して、陽性
単離物を、５．６と２．１３ｋｂの断片を生じるＰｓｔＩとＳｐｅＩ制限消化に
よるプラスミドの消化に関して選抜した。一つの陽性単離物からのプラスミドを
選択して、当該ＤＮＡの両方の鎖の正確な配列を挿入領域を横切るＤＮＡ配列決
定により確認した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃２０５７−２０７０；プライマー：Ｐ１
６２−Ｓ１１４６，Ｐ１６２−Ｓ１２９２，Ｐ１６２−Ｓ１６５６，Ｐ１６２−
Ｓ２０２６，Ｐ１６２−Ａ２４０８，Ｐ１６２−Ｓ２７８１，Ｐ１６２−Ａ２８
２５，Ｐ１６２−Ａ２４４６，Ｐ１６２−Ａ２０３８，Ｐ１６２−Ａ１７０９，
Ｐ１６２−Ａ１３３５，Ｐ１６２−Ａ１２４３，ＮＢ−Ｓｓｅｑ，ｐ６４−Ａ２
１５）。この単離物をグリセロールストック培養液として保存した（ＡＴＧグリ
セロールストック＃１１９２）。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＮ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＰｒｉＡの発現の証明 ｐＡ１−ＮＢ−ＴｐｒｉＡプラスミドを調製して、ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１
．Ｌ１細菌を形質転換した。各形質転換体からの３つの単離物を次の研究のため
に選択した。細菌の生育と全細胞蛋白質の単離は実施例２に記載された通りであ
った。３つの単離物各々からの全細胞蛋白質を含む小アリコート（３μｌ）を、
４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５
５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭ
グリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。ミニゲルをクマジーブルーで
染色した。ｐｒｉＡ（約８１．５ｋＤａ）の予測された移動領域に相当する単離
物の全てから明確な蛋白質バンドが可視化された。
【０２８８】 次に、各溶解物からの全蛋白質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロー
スへ、実施例２に記載されたとおりに移した。各レーンは１．５ｕｌの上清を含
んだ。ブロットされたニトロセルロース上の蛋白質は、前記のとおりにホスファ
ターゼ−配合ストレプトアビジンとの相互作用により可視化した。内在のＥ．ｃ
ｏｌｉビオチン−ＣＣＰ、〜２０ｋＤａが誘導及び非誘導サンプルの両方におい
て検出可能であった。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＰｒｉＡ蛋白質に相当す
る蛋白質バンドがギブコ１０ｋＤａ蛋白質ラダーの８０と９０ｋＤａの分子量ス
タンダードの間の中間を移動した。この蛋白質は誘導培養物中で弱いバンドとし
て観察されたが、非誘導の対照溶解物中に観察されなかった。ＭＧＣ１０３０及
びＡＰ１．Ｌ１中のｐＡ１−ＮＢ−ＴｐｒｉＡのグリセロールストック（ＡＴＧ
グリセロールストックそれぞれ＃１１９６及び１１９７）を−８０℃において保
存した。
【０２８９】 実施例１４ Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−２のクローン化 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−２遺伝子をコードするＯＲＦは互
いにフレームが一致しない２つの可能な開始部位を含んだ。よって、正確な開始
コドンを決定するため、及びＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＴ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｎａＱ−２遺伝子をコードする遺伝子の配列を確認するた
め、ゲノミックＤＮＡをＰＣＲにより開始コドン及び停止コドンの約２００ｂｐ
上流及び下流に位置する２つをプライマーを用いて増幅した。フォワード／セン
スプライマー（ＡＴＧプライマー＃Ｐ１３３−Ｓ１５０，５’−ＴＧＧＧＧＧＣ ＧＡＡＣＣＴＣＡＣＧ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）及びリバース／ア
ンチセンスプライマー（ＡＴＧプライマー＃Ｐ１３３−Ａ１２３７，５’−ＡＣ ＣＣＣＧＧＣＣＴＴＣＣＡＧＴＣＣＡ −３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）及
びＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノミックＤＮＡを鋳型として用いて、１０
８８ｂｐのＰＣＲ産物をもたらした。このＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ
プラスミドに挿入して、ＤＨ５αを形質転換して、アンピシリン耐性に関して単
離物を選択した。プラスミドを一つの単離物から精製して、予測された１．１と
３．０ｋｂの断片を生じるＥｃｏＲＩ消化により選抜した。挿入された領域の両
ＤＮＡ鎖を配列決定した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１３３０−１３３５，ＳＰ６，Ｔ
７，Ｐ１３３−Ｓ４５６，Ｐ１３３−Ｓ８９４，Ｐ１３３−Ａ８９６，Ｐ１３３
−Ａ５２７）。未加工の配列と比較すると、上記ＤＮＡ配列と１塩基対の不一致
が存在した。最初のＧＴＧ開始コドンの下流６１塩基から始まる未加工の配列に
示された４つの「Ｔ」が存在した。ＡＴＧ社によるＤＮＡ配列決定は３つの「Ｔ
」のみを示唆及び確認した。これは、両方の可能なＧＴＧ開始コドンがインフレ
ームに存在したこと、及び最初のＧＴＧが天然の開始コドンであるらしかったこ
とを示した。このプラスミドをｐＴ−ＴＱ−２と命名して、単離物をストック培
養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃７８５）。
【０２９０】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−１遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
８１）を図６０に示す。２つの可能な開始コドン（ｇｔｇ）及び停止コドン（ｔ
ｇａ）を太字で示す。図６１には、上記ＤＮＡコーディング配列由来の、蛋白質
（アミノ酸）配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）も示す。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−２遺伝子を発現するプラスミド（ｐ
Ａ１−ＴＱ２）の構築 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−２遺伝子産物（ε２サブユニット
）の天然蛋白質としての発現を達成した。ｐＡ１−ＴＱ２の構築は、天然Ｔ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｎａＱ−２遺伝子のｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラス
ミドへの挿入により実施した。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−２遺
伝子はＰＣＲを用いてＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノミックＤＮＡから増幅
した。ＰＣＲ反応に用いたフォワード／センスプライマー（ＡＴＧプライマー＃
Ｐ１３３−Ｓ４４２ｎｃｏ；５−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＣＧＧＧＴＧＧＴＧ ＣＧＧＣＣＣＣＴＴＣＴＧ −３）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）は、ｄｎａＱ−
２遺伝子のために使用されたＡＴＧ開始コドンのＴＧＧとオーバーラップする上
流のＮｃｏＩ部位を有するようにデザインした。ｄｎａＱ−２遺伝子のための天
然開始コドンはＧＴＧであり、これをプライマー中でＡＴＧ開始コドンに代える
ことによりＥ．ｃｏｌｉ中での発現を可能にさせた。リバース／アンチセンスプ
ライマー（ＡＴＧプライマー＃Ｐ１３３−Ａ１０９ｋｐｎ；５−ＡＡＧＣＴＡＧ
ＧＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＣＣＧＡＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧ−３）（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：８４）は、天然の停止コドンにタンデムに配置された追加の停止コ
ドンを含むようにデザインされた。この追加の停止コドンはプライマーの非相補
領域中においてＫｐｎＩ制限部位に隣接した。ＰＣＲ産物はＮｃｏＩとＫｐｎＩ
制限酵素により消化した。消化したＰＣＲ産物をＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ消化したｐ
Ａ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミドに挿入した。これらのプラスミドでＤＨ５α細
菌を形質転換して、陽性単離物をアンピシリン耐性により選択した。プラスミド
を一つの単離物から精製して、０．６５と５．７ｋｂの断片を生じるＮｃｏＩ／
ＫｐｎＩ消化により選抜した。このプラスミド中の挿入された領域の両ＤＮＡ鎖
を配列決定した（ＡＴＧ ＳＥＱ ＃１３８４−１３８７，１４０４−１４０５
；プライマー，Ｐ３８−Ｓ５５７６，Ｐ６５−Ａ１０６，Ｐ１３３−Ｓ６３５，
及びＰ１３３−Ａ８１７）。このプラスミドをｐＡ１−ＴＱ２と命名して、スト
ック培養液として保存した（ＡＴＧグリセロールストック＃８１５）。 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−２遺伝子（ε２サブユニット）を天
然蛋白質として過剰発現するプラスミド（ｐＡ１−ＴＱ２）の発現のｐＡ１−Ｔ
Ｑ２／ＭＧＣ１０３０及びｐＡ１−ＴＱ２／ＡＰ１．Ｌ１による証明 ｐＡ１−ＴＱ２プラスミドを調製して、ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１細菌
を形質転換した。３つの単離物をｐＡ１−ＴＱ２／ＭＧＣ１０３０から（ＡＴＧ
グリセロールストック＃８２８，８２９，８３０）そしてＡＰ１．Ｌ１から（Ａ
ＴＧグリセロールストック＃８４７，８４８，８４９）次の研究のために選択し
た。細菌の生育と全細胞蛋白質の単離は、実施例２に記載された通りに実施した
。６つの単離物各々からの全細胞蛋白質を含む小アリコート（３μｌ）を、４−
２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；
１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリ
シン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。ミニゲルをクマジーブルーで染色
した。ε２サブユニットの予測された移動領域に相当する何れの単離物からも周
囲の内在Ｅ．ｃｏｌｉから分離され得る蛋白質バンドはなかった。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＣ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−２（ε２サブユニット）を過剰発現する
プラスミド（ｐＡ１−ＣＢ−ＴＱ２）の構築 天然のεサブユニットを発現させる初期の試みが失敗したので、ヘキサヒスチ
ジン及びビオチン化部位を含む融合ペプチドにＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの
ｄｎａＱ−２遺伝子をカップリングさせるようにベクターをデザインした。ｐＡ
１−ＣＢ−ＴＱ２の構築も、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−２遺伝
子のｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミドへの挿入により実施した。フォワード／
センスプライマーはｐＡ１−ＴＱ２の構築に使用したのと同じであった（ＡＴＧ
プライマー＃Ｐ１３３−Ｓ４４２ｎｃｏ）。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲ
ノミックＤＮＡをＰＣＲ鋳型として使用した。リバース／アンチセンスプライマ
ー（ＡＴＧプライマー＃Ｐ１３３−Ａ１０８４Ｓｐｅ；５−ＣＣＴＣＡＣＴＡＧ ＴＣＣＴＣＣＣＧＡＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＣＧＴ −３）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
８５）は、ＳｐｅＩ制限部位が終わりから２番目のコドンに隣接するようにデザ
インした（停止コドンは除去した）。ＳｐｅＩ部位は発現された上記蛋白質が、
ε２サブユニットのＣ−末端アミノ酸とＣ−末端融合ペプチドの間に２つの追加
のアミノ酸（ＴｈｒとＳｅｒ）を含ませることを可能にした。当該ＰＣＲ産物を
ＮｃｏＩとＳｐｅＩ制限酵素で消化して、ＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ消化したｐＡ１−
ＣＢ−ＮｃｏＩプラスミドに挿入した。これらのプラスミドでＤＨ５α細菌を形
質転換して、陽性単離物をアンピシリン耐性により選択した。プラスミドを一つ
の単離物から精製して、０．６５と５．７ｋｂの断片を生じるＮｃｏＩ／Ｓｐｅ
Ｉ消化により選抜した。挿入された領域の正確な配列を配列決定した（ＡＴＧ
ＳＥＱ ＃１３８８−１３９１，１４０６−１４０７；プライマー，Ｐ３８−Ｓ
５５７６，Ｐ６５−Ａ１０６，Ｐ１３３−Ｓ６３５，及びＰ１３３−Ａ８１７）
。このプラスミドをｐＡ１−ＴＱ２と命名して、ストック培養液として保存した
（ＡＴＧグリセロールストック＃８１６）。 ヘキサヒスチジン及びビオチン化部位を含むＣ−末端ペプチドに融合させたＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−２遺伝子（ε２サブユニット）を過剰発
現するプラスミド（ｐＡ１−ＣＢ−ＴＱ）のｐＡ１−ＣＢ−ＴＱ／ＭＧＣ１０３
０からの発現の証明 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＱ２プラスミドを調製して、ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ
１細菌を形質転換した。３つの単離物をｐＡ１−ＴＱ２／ＭＧＣ１０３０から（
ＡＴＧグリセロールストック＃８３１，８３２，８３３）そしてＡＰ１．Ｌ１か
ら（ＡＴＧグリセロールストック＃８５０，８５１，８５２）次の研究のために
選択した。細菌の生育と全細胞蛋白質の単離は実施例２に記載された通りであっ
た。６つの単離物各々からの全細胞蛋白質を含む小アリコート（３μｌ）を、４
−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５
；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）上で、２５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグ
リシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動した。ミニゲルをクマジーブルーで染
色した。ε２サブユニットの予測された移動領域において内在Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白
質から分離され得る、何れの単離物からの可視蛋白質バンドもなかった。
【０２９１】 次に、各溶解物からの全蛋白質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロー
スへ、実施例２に記載されたとおりに移した（ブロットした）。ブロットされた
ニトロセルロース上の蛋白質は、前記のとおりにホスファターゼ−配合ストレプ
トアビジンとの相互作用により可視化した。内在のＥ．ｃｏｌｉビオチン−ＣＣ
Ｐ、〜２０ｋＤａが誘導及び非誘導サンプルの両方において検出可能であった。
ε２サブユニットに相当する蛋白質バンドは検出できなかった。当該蛋白質は精
製の試みが正当であると理由付けするのにはあまりに低いレベルでしか発現され
なかった。
【０２９２】 理解の明確化の目的に例示及び実施例によりいくらか詳細に本発明を今完全に
記載したが、広い犯意及び均等な範囲の条件、系統化及び他のパラメータを用い
て発明を修飾又は変化させることにより同じことが実施可能なこと、あるいはそ
のような修飾又は変化が請求された範囲内に包含されることを意図することが当
業者には明らかになる。
【０２９３】 この明細書に言及された全ての刊行物、特許及び特許出願は、この発明の属す
る分野における当業者のレベルの指標であり、そして各々の刊行物、と特許及び
特許出願が特に且つ個別に引用により取り込まれたことを示すような同じ範囲に
引用により取り込まる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｎ−末端標識されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αのＮｉ++−ＮＴＡカラ
ム精製の蛋白質濃度プロフィール。
【図２】 ｐＴＡＣ−ＣＣＡ−ＴＥの発現最適化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図３】 天然のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αの硫酸アンモニウム沈殿最適化の蛋
白質濃度プロフィール。
【図４】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αの硫酸アンモニウム沈殿最適化のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析。
【図５】 ギャップフィリングアッセイを使用したＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αの
硫酸アンモニウム沈殿最適化の活性アッセイ分析。
【図６】 翻訳上共役された蛋白質として発現された天然Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
の異なる精製工程のＳＤＳ−ポリアクリルアミドサマリーゲル。
【図７】 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＸ／ＡＰ１．Ｌ１からのＮ−末端標識されたＴ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓのＤｎａＸサブユニットの発現のための生育最適化のビオチンブ
ロット分析。
【図８】 Ｎ−末端標識されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤｎａＸのＮｉ＋＋−Ｎ
ＴＡカラム精製からの画分の蛋白質濃度プロフィール。
【図９】 Ａ及びＢ。Ｎ−末端標識されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤｎａＸのＮ
ｉ++−ＮＴＡカラム精製からの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図１０】 Ａ及びＢ。Ｎ−末端標識されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤｎａＸのア
ビジンカラム精製からの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図１１】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤｎａＸ検出において使用するための希釈の
測定のための様々な抗血清希釈のウエスタン分析。
【図１２】 １：６４００の抗血清希釈におけるＤｎａＸ検出の限界の測定のための様々な
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤｎａＸのウエスタン分析。
【図１３】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ遺伝子（δサブユニット）のＤＮＡ
配列（配列番号：９）。
【図１４】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＡ遺伝子（δサブユニット）のアミノ
酸配列（配列番号：１０）。
【図１５】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓとＥ．ｃｏｌｉからのδのアミノ酸配列の整列
化。
【図１６】 Ａ．ａｅｒｏｌｉｃｕｓ，Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ，Ｅ．ｃｏｌｉ及びＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのδサブユニットのアミノ酸
配列の整列化。
【図１７】 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ／ＡＰ１．Ｌ１によるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ
の発現の生育／誘導時間最適化のビオチンブロット分析。
【図１８】 硫酸アンモニウムによるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδの沈殿の最適化。
【図１９】 Ａ及びＢ。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδのＮｉ++−ＮＴＡカラム精製か
らの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図２０】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδのアビジンカラム精製からの画分の蛋白質
濃度プロフィール。
【図２１】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδのアビジンカラム精製からの画分のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析。
【図２２】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＰｏｌ ＩＩＩホロ酵素のδ’サブユニット
をコードするＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺伝子のＤＮＡ配列（配
列番号：１６）。
【図２３】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｈｏｌＢ遺伝子のＤＮＡ配列から演繹された
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’サブユニットのアミノ酸配列（配列番号：
１７）。
【図２４】 Ｅ．ｃｏｌｉとＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’を比較するアミノ酸配列
の整列化。
【図２５】 Ａ．ａｅｒｏｌｉｃｕｓ，Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ及びＲｉｃｋｅｔｔｓｉａｋ
ａｒａのδ’サブユニットのアミノ酸配列の整列化。
【図２６】 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ／ＡＰ１．Ｌ１によるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ δ
’の発現の生育／誘導時間最適化のビオチンブロット分析。
【図２７】 Ａ及びＢ。Ｎ−末端標識されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’のＮｉ++ −ＮＴＡカラム精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図２８】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’のセファクリルＳ−３００ゲル濾過カラ
ム精製から溶出する画分の蛋白質濃度プロフィール。
【図２９】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’のセファクリルＳ−３００カラム精製か
らの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図３０】 翻訳上共役された蛋白質としてのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ’の精製
のＳＤＳ−ＰＡＧＥサマリー。
【図３１】 ｐＡ１−ＮＢ−ＴＤ／ＡＰ１．Ｌ１によるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ β
の発現の異なる温度における生育／誘導時間最適化のビオチンブロット分析。
【図３２】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ βのＮｉ++−ＮＴＡカラム精製から溶出する
画分の蛋白質濃度プロフィール。
【図３３】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ βによるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ α
の刺激を測定するためのプライマー伸長アッセイ。
【図３４】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ βのセファクリルＳ−３００ゲル濾過カラム
精製から溶出する画分の蛋白質濃度プロフィール。
【図３５】 Ａ及びＢ。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ βのセファクリルＳ−３００カラ
ム精製からの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図３６】 βに対して向けられた抗体の生成において使用されたセファクリルＳ−３００
ゲル濾過カラムからのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ βのプールされた画分。
【図３７】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ βの検出において使用するための希釈の測定
のための様々な抗血清希釈のウエスタン分析。
【図３８】 １：６４００の抗血清希釈におけるβの検出の限界の測定のための様々なＴ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ βののウエスタン分析。
【図３９】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｐｏｌ ＩＩＩサブユニットのＭ１３ｇｏｒ
ｉ再構成。
【図４０】 再構成アッセイにおける機能性Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓホロ酵素の温度
依存性。
【図４１】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ａ．α，Ｂ．ι／γ，Ｃ．β，Ｄ．δ及びＥ
．δ’を、他のサブユニットを一定に保って、力価測定する再構成アッセイ。
【図４２】 αのみの鋳型へのための結合及び各結合事象にてプライマーを短い距離伸長す
るために存在するバックグラウンド活性を測定するためのα以外の全てのサブユ
ニットの不在下での再構成アッセイ。
【図４３】 αの偽の結合のための測定するためのバックグラウンド活性に対する他のサブ
ユニットの作用を測定するための、β不在下であるが他のサブユニットの存在下
での再構成アッセイ。
【図４４】 Ａ−Ｅ。蛋白質−蛋白質相互作用を示すクランプローディング複合体のサブユ
ニットのセファクリルＳ−２００ゲル濾過。
【図４５】 Ａ−Ｃ。蛋白質−蛋白質相互作用を示すクランプローディング複合体のサブユ
ニットによるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαのセファクリルＳ−２００ゲル
濾過。
【図４６】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβのセファクリルＳ−２００ゲル濾過。
【図４７】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢをコードする遺伝子のＤＮＡ配列（配
列番号：３１）。
【図４８】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：３
２）。
【図４９】 Ａｑｕｉｆｅｘ，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｅ．ｃｏｌｉ及びＨ．ｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ由来のＳＳＢのアミノ酸配列と比較したＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
のＳＳＢの配列整列化。
【図５０】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢのＮ−末端配列とＴ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓのＳＳＢのＣ−末端領域との配列整列化。
【図５１】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＳＳＢのＮｉ++−ＮＴＡカラム精製からの関
連画分のビオチンブロット分析。
【図５２】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのエプシロン−１（ε−１，ｄｎａＱ−１）を
コードする遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号：３６）。
【図５３】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのエプシロン−１サブユニット（ε−１）のア
ミノ酸配列（配列番号：３７）。
【図５４】 ｔ．ＴのＵＶＲｄをコードする遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号：６７）。
【図５５】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｕｖｒＤ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：
６８）。
【図５６】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＧ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号：７
１）。
【図５７】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＧ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：
７２）。
【図５８】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｐｒｉＡ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号：７
５）。
【図５９】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｐｒｉＡ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：
７６）。
【図６０】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＱ−２遺伝子（ε２サブユニット）の
ＤＮＡ配列（配列番号：８１）。
【図６１】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのε２サブユニットのアミノ酸配列（配列番号
：８２）。
【図６２】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮ遺伝子（βサブユニット）のＤＮＡ
配列（配列番号：２２）。
【図６３】 Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのβサブユニットのアミノ酸配列（配列番号：
２３）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:01 9/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/12 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブラード，ジョン・ランドール アメリカ合衆国コロラド州80504，ロング モント，イースト・ウェットランズ・ドラ イブ 5762 (72)発明者 ケリー，ウラディミール アメリカ合衆国ユタ州84108，ソルト・レ イク・シティ，ドナー・ウェイ 939，ナ ンバー 201 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 CA04 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 GA11 4B050 CC03 DD02 LL01 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AB01 BA02 CA29 CA44 CA46 4H045 AA11 DA75 FA72

Claims (82)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：（ｕｖｒＤヘリカーゼ）６
    ８のアミノ酸配列に少なくとも５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    単離されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 配列番号：６８のアミノ酸配列を有する、請求項１記載のポリ
    ペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項１記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
    含む単離されたポリヌクレオチド分子。
  4. 【請求項４】 配列番号：６７の配列を有する核酸を含む、請求項３記載の単
    離されたポリヌクレオチド分子。
  5. 【請求項５】 請求項３記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
  6. 【請求項６】 請求項５記載のベクターを含む宿主細胞。
  7. 【請求項７】 好熱性生物由来のｕｖｒＤヘリカーゼである、請求項１記載の
    単離されたポリペプチド。
  8. 【請求項８】 好熱性生物がＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓであ
    る、請求項７記載の単離されたポリペプチド。
  9. 【請求項９】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：（ＤＮＡ−Ｇプライマーゼ
    ）７２のアミノ酸配列に少なくとも５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含
    む、単離されたポリペプチド。
  10. 【請求項１０】 配列番号：７２のアミノ酸配列を有する、請求項９記載のポ
    リペプチド。
  11. 【請求項１１】 請求項９記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
    を含む単離されたポリヌクレオチド分子。
  12. 【請求項１２】 配列番号：７１の配列を有する核酸を含む、請求項１１記載
    の単離されたポリヌクレオチド分子。
  13. 【請求項１３】 請求項１１記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクタ
    ー。
  14. 【請求項１４】 請求項１３記載のベクターを含む宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 好熱性生物由来のＤＮＡ Ｇプライマーゼである、請求項９
    記載の単離されたポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 好熱性生物がＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓで
    ある、請求項１５記載の単離されたポリペプチド。
  17. 【請求項１７】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：（ｐｒｉＡヘリカーゼ）
    ７６のアミノ酸配列に少なくとも５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
    、単離されたポリペプチド。
  18. 【請求項１８】 配列番号：７６のアミノ酸配列を有する、請求項１７記載の
    ポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 請求項１７記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配
    列を含む単離されたポリヌクレオチド分子。
  20. 【請求項２０】 配列番号：７５の配列を有する核酸を含む、請求項１９記載
    の単離されたポリヌクレオチド分子。
  21. 【請求項２１】 請求項１９記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクタ
    ー。
  22. 【請求項２２】 請求項２１記載のベクターを含む宿主細胞。
  23. 【請求項２３】 好熱性生物由来のｐｒｉＡヘリカーゼである、請求項１７記
    載の単離されたポリペプチド。
  24. 【請求項２４】 好熱性生物がＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓで
    ある、請求項２３記載の単離されたポリペプチド。
  25. 【請求項２５】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：（デルタサブユニット）
    １０のアミノ酸配列に少なくとも５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
    、単離されたポリペプチド。
  26. 【請求項２６】 配列番号：１０のアミノ酸配列を有する、請求項２５記載の
    ポリペプチド。
  27. 【請求項２７】 請求項２５記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配
    列を含む単離されたポリヌクレオチド分子。
  28. 【請求項２８】 配列番号：９の配列を有する核酸を含む、請求項２７記載の
    単離されたポリヌクレオチド分子。
  29. 【請求項２９】 請求項２７記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクタ
    ー。
  30. 【請求項３０】 請求項２９記載のベクターを含む宿主細胞。
  31. 【請求項３１】 好熱性生物由来のデルタサブユニットである、請求項２５記
    載の単離されたポリペプチド。
  32. 【請求項３２】 好熱性生物がＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓで
    ある、請求項３１記載の単離されたポリペプチド。
  33. 【請求項３３】 請求項２５記載のポリペプチド上の少なくとも一つの抗原決
    定基に特異的に結合する単離された抗体分子。
  34. 【請求項３４】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：（デルタプライムサブユ
    ニット）１７のアミノ酸配列に少なくとも５％の配列同一性を有するアミノ酸配
    列を含む、単離されたポリペプチド。
  35. 【請求項３５】 配列番号：１７のアミノ酸配列を有する、請求項３４記載の
    ポリペプチド。
  36. 【請求項３６】 請求項３４のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
    含む単離されたポリヌクレオチド分子。
  37. 【請求項３７】 配列番号：１６の配列を有する核酸を含む、請求項３６記載
    の単離されたポリヌクレオチド分子。
  38. 【請求項３８】 請求項３６記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクタ
    ー。
  39. 【請求項３９】 請求項３８記載のベクターを含む宿主細胞。
  40. 【請求項４０】 好熱性生物由来のデルタプライムサブユニットである、請求
    項３４記載の単離されたポリペプチド。
  41. 【請求項４１】 好熱性生物がＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓで
    ある、請求項４０記載の単離されたポリペプチド。
  42. 【請求項４２】 請求項３７記載のポリペプチド上の少なくとも一つの抗原決
    定基に特異的に結合する単離された抗体分子。
  43. 【請求項４３】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：（デルタサブユニット）
    ２３のアミノ酸配列に少なくとも５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
    、単離されたポリペプチド。
  44. 【請求項４４】 配列番号：２３のアミノ酸配列を有する、請求項４３記載の
    ポリペプチド。
  45. 【請求項４５】 請求項４３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
    含む単離されたポリヌクレオチド分子。
  46. 【請求項４６】 配列番号：２２の配列を有する核酸を含む、請求項４５記載
    の単離されたポリヌクレオチド分子。
  47. 【請求項４７】 請求項４５記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクタ
    ー。
  48. 【請求項４８】 請求項４７記載のベクターを含む宿主細胞。
  49. 【請求項４９】 好熱性生物由来のデルタサブユニットである、請求項４３記
    載の単離されたポリペプチド。
  50. 【請求項５０】 好熱性生物がＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓで
    ある、請求項４９記載の単離されたポリペプチド。
  51. 【請求項５１】 請求項４３記載のポリペプチド上の少なくとも一つの抗原決
    定基に特異的に結合する単離された抗体分子。
  52. 【請求項５２】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：（ｓｓｂ蛋白質）３２の
    アミノ酸配列に少なくとも５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離
    されたポリペプチド。
  53. 【請求項５３】 配列番号：３２のアミノ酸配列を有する、請求項５２記載の
    ポリペプチド。
  54. 【請求項５４】 請求項５２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
    含む単離されたポリヌクレオチド分子。
  55. 【請求項５５】 配列番号：３１の配列を有する核酸を含む、請求項５４記載
    の単離されたポリヌクレオチド分子。
  56. 【請求項５６】 請求項５４記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクタ
    ー。
  57. 【請求項５７】 請求項５６記載のベクターを含む宿主細胞。
  58. 【請求項５８】 好熱性生物由来のｓｓｂ蛋白質である、請求項５２記載の単
    離されたポリペプチド。
  59. 【請求項５９】 好熱性生物がＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓで
    ある、請求項５８記載の単離されたポリペプチド。
  60. 【請求項６０】 請求項５５記載のポリペプチド上の少なくとも一つの抗原決
    定基に特異的に結合する単離された抗体分子。
  61. 【請求項６１】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：（エプシロン１、ｄｎａ
    Ｑ−１）３７のアミノ酸配列に少なくとも５％の配列同一性を有するアミノ酸配
    列を含む、単離されたポリペプチド。
  62. 【請求項６２】 配列番号：３７のアミノ酸配列を有する、請求項６１記載の
    ポリペプチド。
  63. 【請求項６３】 請求項６１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
    含む単離されたポリヌクレオチド分子。
  64. 【請求項６４】 配列番号：３６の配列を有する核酸を含む、請求項６３記載
    の単離されたポリヌクレオチド分子。
  65. 【請求項６５】 請求項６３記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクタ
    ー。
  66. 【請求項６６】 請求項６５記載のベクターを含む宿主細胞。
  67. 【請求項６７】 好熱性生物由来のエプシロンサブユニットである、請求項６
    １記載の単離されたポリペプチド。
  68. 【請求項６８】 好熱性生物がＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓで
    ある、請求項６７記載の単離されたポリペプチド。
  69. 【請求項６９】 請求項６１記載のポリペプチド上の少なくとも一つの抗原決
    定基に特異的に結合する単離された抗体分子。
  70. 【請求項７０】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：（ｄｎａＱ−２蛋白質）
    ８２のアミノ酸配列に少なくとも５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
    、単離されたポリペプチド。
  71. 【請求項７１】 配列番号：８２のアミノ酸配列を有する、請求項７０記載の
    ポリペプチド。
  72. 【請求項７２】 請求項７０のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
    含む単離されたポリヌクレオチド分子。
  73. 【請求項７３】 配列番号：８１の配列を有する核酸を含む、請求項７２記載
    の単離されたポリヌクレオチド分子。
  74. 【請求項７４】 請求項７２記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクタ
    ー。
  75. 【請求項７５】 請求項７４記載のベクターを含む宿主細胞。
  76. 【請求項７６】 好熱性生物由来のエプシロン−２サブユニットである、請求
    項７０記載の単離されたポリペプチド。
  77. 【請求項７７】 好熱性生物がＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓで
    ある、請求項７６記載の単離されたポリペプチド。
  78. 【請求項７８】 請求項７３記載のポリペプチド上の少なくとも一つの抗原決
    定基に特異的に結合する単離された抗体分子。
  79. 【請求項７９】 配列番号：６８、７２、７６、１０、１７、２３、３２、３
    ７及び８２の一つのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有す
    るアミノ酸配列を含む、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを生
    産する方法であって、ポリペプチドが発現される条件したでヌクレオチド配列を
    含む宿主細胞を培養し、そして、ポリペプチドを回収することを含む方法。
  80. 【請求項８０】 配列番号：６８、７２、７６、１０、１７、２３、３２、３
    ７及び８２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の
    配列同一性を有するアミノ酸配列を含むひとつ又は複数のポリペプチドを利用す
    ることを含む、ＤＮＡ合成方法。
  81. 【請求項８１】 何れかの順序にて鋳型及びヌクレオチドを含む成分を含む反
    応混合物を用意し、そして該反応混合物をＤＮＡ合成を得るのに十分に長い時間
    及び温度にてインキュベートすることをさらに含む、請求項８０記載の方法。
  82. 【請求項８２】 ひとつ又は複数のポリペプチドがＮ−末端結合又はＣ−末端
    結合ペプチドをさらに含む、請求項８１記載の方法。
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