JP2003527106A

JP2003527106A - 核パッキング効率

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Publication number: JP2003527106A
Application number: JP2001551431A
Authority: JP
Inventors: トマス、リチャード、エイ．
Original assignee: トマス、リチャード、エイ．
Priority date: 2000-01-11
Filing date: 2001-01-08
Publication date: 2003-09-16
Also published as: WO2001051007A2; KR20020073165A; EP1419370A4; CA2396716A1; AU3274501A; US6587792B1; EP1419370A2; US20040091906A1; WO2001051007A3; KR20080024242A

Abstract

(57)【要約】細胞核および他の生物学的粒子の核パッキング効率(NPE)を決定する方法および装置。NPEは、DNA含量のような少なくとも1個の生化学成分を様々な数学的手法を用いて核容積に相関させることによって決定することができる。フローサイトメトリーは、電子核容積(ENV)に関して核容積の測定に特に有用である。次に、NPEを用いて、種および組織供給源、性別、細胞分裂サイクルの段階、分化およびアポトーシス、並びに良性、悪性および転移状態を識別して癌の診断を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（発明の分野）本発明は、細胞生物学に関し、更に詳細には細胞の核パッキング効率(NPE)に
よる細胞の特性決定に関する。

【０００２】（背景情報）実質的に総ての真核細胞は、核、すなわち核膜によって取り囲まれており且つ
細胞のDNA並びに他の核成分のほとんどを含んでいる区画を有する。核の大きさ
および形状の異常は以前から癌や他の疾患の指標として認められてきたが、それ
らの特性決定は以前は顕微鏡観察に限定されていた。

【０００３】当時から、様々な核成分を定量し、比較することにより細胞を特性決定する試
みは行われてきた。例えば、DNA、RNAおよび核タンパク質の測定値が、互いに比
較されてきた。ある研究では、DNAの量を測定し、これを光散乱、飛行時間およ
び面積によって測定した核の大きさと相関させることが試みられた。しかしなが
ら、これらの相関は、核容積の信頼性のない間接的な推定値によって妨げられて
きた。

【０００４】光散乱を用いる直径の測定による容積の間接的推定値は、粒度範囲が一定であ
り且つ屈折率が比較的大きい均一な球状粒子を仮定することにより最も良好に働
いた。しかしながら、この手法は最適測定範囲外の理想的でない生物学的試料に
適用するときには、余り正確ではなくなる。「飛行時間」またはTOFと呼ばれる
他の測定法は、流体流が光線を横切って粒子を運ぶときに粒子の粒度を測定する
。しかしながら、この手法は、粒子の速度の動揺や粒子の相対的配向による変動
に敏感に変化するなど多くの制限を受けやすく、三次元粒子の一つの軸の測定値
のみを生じる。

【０００５】更に別の間接的測定値では、核の断面積に基づいて核容積を推定する。しかし
、これらの測定値もまた核で用いられる染色およびマウンティング(mounting)手
法における変動性によって限定される可能性がある。特に、共焦点顕微鏡を用い
て核の染色したDNAの面積を測定し、連続した断面を合計して総DNAの測定値を得
ている。核容積が染色したDNAに比例すると仮定することによって、この手法で
は次に核容積の推定値が得られる。しかしながら、この手法では、核内のDNAの
粒度を説明することができず、核の他成分であるRNA、核タンパク質、核脂質、
核膜および核水からの核容積に対する様々な寄与を無視している。

【０００６】従って、これまでの手法では、核の状態および全体としての細胞を特性決定す
るための他の測定値との有用な相関と組合わせて各容積の満足な測定値のニーズ
を満足させることができない。本発明はこのニーズを満足させ、関連した利益を
も提供するものである。

【０００７】（発明の概要）細胞の核は高度に組織化された構造であり、前駆体材料を核膜の細孔を介して
核へ通過させることができ、核生成物を細胞質へと輸送することができる。複雑
な核機構である核酸、タンパク質、脂質および他の成分は、核の容積内に密に充
填されている。

【０００８】天然では非常に組織化された構造を有しているため、核はその成分を最適効率
で密なパッケージの形状を仮定している。悪性細胞でのように細胞が疾患に罹る
と、核の組織は崩壊する。例えば、DNAは、ヒストンタンパク質の周りでヌクレ
オソームと呼ばれる組織化された構造へ効率的に折り畳まれる能力を喪失する。
タンパク質含量並びに核の他の生化学成分も変化する。核の容積は、この混乱に
適応するために増加されることになる。従って、このパッキングの効率は核の特
徴的なものであり、全体として細胞の状態を表示するのに有用なものである。

【０００９】本発明は、例えば、電子細胞容積(ENV)を測定するためフローサイトメトリー
を用いることによって核の空間的変位(SDN)を測定することによる細胞の核パッ
キング効率(NPE)を決定する方法および装置を提供する。この方法を原核生物ま
たはウイルスに応用すると、SDNは原核細胞またはウイルス自身である周囲の粒
子の容積と考えることができる。核酸、核タンパク質、核脂質または核水のよう
な核の1個以上の生化学成分(BC)も測定する。次に、BCとSDNについて測定した値
を相関させることによって、NPEを決定する。

【００１０】様々な手法を用いて、BCとSDNとを相関させ、NPEを得ることができる。比BC/S
DNからNPE=k_l(BC)^a/(SDN)^b+k₂(BC)+k₃(SDN)^d+k₄のような更に複雑な表現までの
多項式を用いて適合させることができる。グラフによる方法は、細胞の個体群に
ついてのNPEを評価し且つ細胞の別個の部分母集団を同定するのに特に有用であ
る。次に、部分母集団を、直径、離心率および勾配線の傾きのような幾何学的パ
ラメーターによって特性決定することができる。

【００１１】 NPEは、一旦決定されてしまうと、目的とする表現型を有する細胞の同定に有
用である。例えば、細胞は、組織供給源によって、および生物の性別および種に
よって、並びに分化の様々な状態および細胞分裂サイクルおよびアポトーシスの
段階によって同定することができる。NPEにより、様々な疾患状態を有する細胞
はその正常な状態、特に異数性を示す腫瘍細胞とは異なるので、同定し、良性、
悪性および転移細胞を識別することによって、癌の診断および予知を行うことも
できる。

【００１２】（発明の詳細な説明）細胞の核成分は、核の容積内に一括されている。このパッキングの効率は核に
特徴的なものであり、全体として細胞の状態を表示するのに有用なものである。
従って、本発明は、細胞の核パッキング効率(NPE)を決定する方法を提供する。
この方法では、核の空間的変位(SDN)と核の1個以上の生化学成分(BC)を測定する
。次に、SDNとBCの値を相関させることによって、NPEを決定する。

【００１３】本明細書で用いる「核の空間的変位」(SDN)とは、核によって占められている
空間の容積を意味する。その容積を占めることによって、核は、そうでない場合
にその空間を占拠した任意の核以外の物質に取って代わるということができる。

【００１４】本明細書で用いる「核」とは、一般的には染色体DNAを含む真核細胞の細胞質
によって囲まれている細胞小器官を意味する。この用語は、核膜の内壁および外
壁、およびそれらに会合したタンパク質を包含する。

【００１５】真核細胞の他に、NPEは真核性という意味での核を欠いている原核細胞にも適
用することができる。従って、これに関しては、「核」という用語は全原核細胞
自身の粒度を表すのに用いられる。従って、「核」容積または空間的変位は、原
核細胞の容積または空間的変位を表すことができる。同様に、「核」の生化学成
分は、原核細胞の細胞成分を表すこともできる。

【００１６】更に、NPEは、ウイルスに適用することができる。ウイルスでは細胞は考えら
れないので、このような状況において「核」という用語はウイルス全体またはキ
ャプシドのような部分の粒度を表すことができる。従って、ウイルスに関連した
「核」の空間的変位容積および「核」の生化学成分という表現は、全体としての
ウイルス粒子の容積および成分を指すものと理解すべきである。ウイルスについ
ての容積決定は、当該技術分野では周知である(DeBlois and Wesley, J. Virol.
23 : 227-233 (1977)。

【００１７】電子細胞容積(ECV)法は、SDNを測定して「電子核容積」(ENV)を得るのに特に
有用な方法である。本明細書で用いられる「ENV」という用語は、ECV法で測定し
た核の容積を意味する。ECVを決定するときには、核のような粒子を導電性流体
に懸濁させ、これを小さな開口を通過させる。次に、DCまたはACの電場を開口に
かけ、電流を開口を通って流させる。粒子が開口を通過すると、電流が中断して
、電流に測定可能なパルスを生じる。このパルスを用いて、開口を通過するとき
の個々の粒子を計数することができる。パルスの次元を、粒子の粒度に関連づけ
ることもできる。

【００１８】基本的ECV法の改良点は、測定する開口の入口および出口容積を形作り、エッ
ジ効果(edge effects)を減少させ且つ測定した電流変化と粒子の容積との間に線
形関係を生じさせることを包含する。ENVの測定に特に有用な方法はThomasの米
国特許第4,818,103号明細書に記載されており、この特許明細書には改良された
フローサイトメトリーの開口が記載されている。

【００１９】前方角度光散乱のような従来の方法と比較して、粒子が流体で運ばれるので、
ECV法は粒子の形状によって余り影響されない。粒子が流れの中心に注入される
生物学的粒子のような非球形であり得るときには、これは特に重要である。有用
な方法は、Grovesの米国特許第4,298,836号明細書に記載されているように、こ
れらの変化を説明するための飛行時間(TOF)シグナルを用いる。TOF測定値は、核
が励起光線を横切るときに核によって生じた光学的蛍光パルス、または直接にEC
Vパルスから採ることができる。パルスの幅は、粒子の長軸に関連している。

【００２０】 SDNは、立方ミクロンまたは立方ミリメートルのような容積で表すことができ
る。SDNは、アナログまたはデジタルのECV装置から発生したシグナルで表すこと
もできる。図および下記の例において、ENVは256チャンネルの解像度を提供する
8ビット値として表すことができる。しかしながら、チャンネルから立方ミクロ
ンへの転換はそれぞれの図で提供される。SDNは表されているが、次にBC測定値
と相関させてNPEを決定する。この方法は、SDNとBCをいずれかの特定の次数で測
定する必要がないことにも留意すべきである。

【００２１】本明細書で用いる「生化学成分」(BC)は、物理的条件で定量することができる
細胞中の任意の同定可能な物質を意味する。例えば、BCは、表面積または断面積
のような量、容積または面積によって測定することができる。BCの例としては、
DNAおよびRNA、タンパク質、脂質、および核水のような各種の核酸、並びに個々
のBCの混合物およびサブセットが挙げられる。

【００２２】核のDNAは、フローサイトメトリー法によって好都合に測定することができる
。フローサイトメトリー法は、一般にM.G. Ormerod著, フローサイトメトリー(F
low Cytometry)(BIOS Sci. Pubs., 第2版, 1999年、およびそこに引用された文
献)に記載されている。核を蛍光染料のようなDNA染料で処理すると、核のDNAの
量を染色または蛍光の量を検出することによって測定することができる。DNA染
料としては、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、キナ
クリン、ミトラマイシン、クロモマイシンA3、および4',6-ジアミジノ-2-フェニ
ルインドール(DAPI)が挙げられる(Krishan, J. Cell Biol. 66: 188-193 (1975)
; Darzynkiewicz et al., Cytometry 5: 355-363 (1984); Kapuscinski, Biotec
hnic & Histochem. 70(5): 220-233 (1995)を参照されたい)(例Iを参照されたい
)。吸収または蛍光を測定する自動顕微鏡をDNA染色と共に用いて、細胞核のDNA
の量を測定することもできる(Tanke et al., J. Histochem. Cytochem. 27: 84-
86 (1979); Bjelkenkrantz, Histochemistry 79(2): 177-91 (1983))。

【００２３】 DNAは、核のDNA構造と会合したタンパク質および他の成分を測定することによ
って間接測定することができる。染色体DNAをヒストンタンパク質(H2A、H2B、H3
およびH4の2個ずつ)のオクトマーの周りに巻き付けて、ヌクレオソームと呼ばれ
る複合体を形成する。ヒストン以外の染色体タンパク質と共に、DNA-ヒストン構
造は集合的にクロマチンと呼ばれる繊維を形成し、これはそれ自身が代謝的に活
性なユークロマチンと転写的に不活性なヘテロクロマチンとに分けられる。従っ
て、これらのDNAに会合したタンパク質のいずれかの測定は、DNA含量の有用な尺
度となる可能性がある。例えば、これらのタンパク質のいずれかに特異的に結合
する標識タンパク質は、核DNAのこのような間接測定に特に有用である。特に、
ヒストンは、特異的ヒストンに対する抗体を用いてフローサイトメトリーおよび
自動顕微鏡によって測定することができる(Miller et al., Hybridoma 12(6): 6
89-698 (1993))。ヒストンは、銀染色を用いる電気泳動試験によって定量するこ
ともできる(Tsutsui et al., Anal. Biochem. 146(1): 111-117 (1985))。

【００２４】 RNAも、同様にアクリジンオレンジ染色を用いるフローサイトメトリーによっ
て測定した(Piwnicka et al., Cytometry 3(4): 269-75 (1983))。RNAは、メチ
ルグリーン-ピロニンY染料を用いる細胞測光法による画像分析によって測定する
こともできる(Schulte et al., Histomchem. J. 24(6): 305-310 (1992))。DNA
と同様に、RNA転写に関する核タンパク質のようなRNA関連タンパク質を用いて、
RNAを間接的に測定することができる。

【００２５】核小体は、多数のrRNAコピーを転写して、直ちにリボソームタンパク質で包装
してリボソームを形成する大型構造であるもう一つの核酸関連BCである。従って
、核小体組織のいずれかに対する抗体は、測定に有用なBCを提供することができ
る。

【００２６】 BCである脂質としては、内壁または外壁の核膜脂質のような核の任意の測定可
能な脂質が挙げられる。これらの脂質は、直接または核膜会合タンパク質を測定
することによって間接的に測定することができる。外壁の核膜タンパク質は、リ
ボソームを包含する。核膜の内壁と会合したタンパク質としては、核膜孔タンパ
ク質、核ラミンタンパク質、およびラミンに会合したポリペプチドが挙げられる
。蛍光親油性色素(Collas et al., Dev. Biol. 169(1): 123-35 (1995))と核膜
孔抗原を認識するモノクローナル抗体(Matsouoka et al., Biochem. Biophys. R
es. Commun. 254(2): 417-423 (1999))を用いて、核膜の様々な成分を測定し、
脂質含量の尺度を提供することもできる。

【００２７】タンパク質は核酸および脂質を間接的に測定する手段として説明してきたが、
核タンパク質は本来的にBCである可能性がある。核タンパク質は、FITC蛍光をフ
ローサイトメトリーと組合わせて用いる非特異的染色によって検出することがで
きる(Roti et al., Cvtometry 3(2): 91-96 (1982))。もう一つの方法は、細胞
測光画像分析を用いるジニトロフルオロベンゼン(DNF)の吸光度を測定すること
である(Cohn et al., Histochemistry 79(3): 353-364 (1983)。更にもう一つの
方法は、AEDANSの蛍光を用いてタンパク質に結合したスルフヒドリル基を測定す
ることである(Schabronath et al., Cytometry 11(3): 333-340 (1990))。

【００２８】核マトリックスタンパク質(NMP)および他の特異的な核タンパク質も、BCとし
て測定することができる。NMPは、核マトリックスに配置された精製タンパク質
分子に対して調製された抗体を用いて測定することができる。上記の抗体と同様
に、次にそれらを蛍光染料と接合させて、フローサイトメトリーまたは免疫組織
化学的染色で用いて特異的NMPを検出することができる(Hughes et al., Am. J.
Clin. Path. 111(2): 267-274 (1999)。

【００２９】核水および会合した非有機塩が、核の容積の残りを構成する。核水は、等張お
よび等浸透圧条件ではENVによって測定することができる。

【００３０】上記のように、NPEはSDNとBC値を相関させることによって決定される。この相
関は、様々な数学的関数および操作によって達成することができる。例えば、NP
Eは、 NPE=k_l(BC)^a/(SDN)^b+k₂(BC)^c+k₃(SDN)^d+k₄ のような一般的多項式関数を用いることによって決定することができる。

【００３１】この式において、k₁、k₂、k₃、k₄、a、b、cおよびdは個々に予め選択された定
数であり、k₁は0ではない。特に有用なk₁、k₂、k₃、k₄、a、b、cおよびdの値は
、k₁が0ではないという条件で、独立して2、1、1/2、0、-1/2、-1、および-2で
ある。一般式の具体的応用は、k_l、aおよびbがそれぞれ1であり且つk₂、k₃およ
びk₄がそれぞれ0であり、比 NPE=BC/SDN となる場合である。

【００３２】しかしながら、NPEの決定は、単一のBCを測定して相関させることに限定され
ない。

【００３３】第二の生化学成分(BC₂)は、この方法における追加工程として測定することが
できる。BC₂は、これが第一のBCと異なる限り、核酸、脂質、タンパク質および
核水のような上記BCのいずれであることもできる。次に、BC₂を表式k₅(BC₂)^e(式
中、k5およびeはそれぞれ2、1、1/2、0、-1/2、-1、および-2のような予め選択
された定数である)を用いる様々な式によってNPEの限定値に組込むことができる
。例えば、k₅(BC₂)^eは一般式のBCに加えて、一般式が NPE=k₁(BC+k₅(BC₂)^e)^a/(SDN)^b+k₂(BC+k₅(BC₂)^e)^c+k₃(SDN)^d+k₄ となるようにすることができる。

【００３４】同様に、k₅(BC₂)^eを一般式のSDNに加えて、 NPE=k₁(BC)^a/(SDN+k₅(BC₂)^e)^b+k₂(BC)^c+k₃(SDN+k₅(BC₂)^e)^d+k₄ を得ることもできる。

【００３５】更に、一般多項式によって得られるNPEにk₅(BC₂)^eを掛けることもできる。 NPE=k₅(BC₂)^ex(k₁(BC)^a/(SDN)^b+k₂(BC)^c+k₃(SDN)^d+k₄)

【００３６】上記の多項式表現は、単にBCとSDNとの間で可能な有用な相関の範囲を例示し
ようとするものである。NPE相関の具体例としては、下記のものが挙げられる: NPE=DNA/ENV NPE=(DNAの蛍光)/ENV NPE=DNA/ENV^1/2 NPE=DNA/(原核細胞の容積) NPE=RNA/(ウイルス粒子の容積) NPE=NMP/ENV NPE=(ヌクレオソームの質量)/ENV NPE=(核膜の容積)/ENV NPE=(DNA-RNA)/ENV NPE=(DNA+RNA)/ENV² NPE=(DNAxRNA)/ENV² NPE=DNA/(ENV-(核水)) NPE=(DNA+核マトリックスタンパク質)/ENV NPE=DNA^-1/(ENV+RNA)^-1 NPE=(DNA+RNA)/ENV² NPE=2(DNA)²/ENV+0.5(DNA)-ENV²+5 NPE=(DNA+RNA)²/ENV-(DNA+RNA)^-1/2+ENV

【００３７】 BCとSDNの間のこれらの相関の数学的変動としては、それ自身多項式の厳密な
式の中には含まれないが、三角関数、対数関数、指数関数および他の超越関数を
挙げることができる。これらの変動は、NPEの有用な尺度である実質的に同様な
相関を得るための実質的に同様な方法でBCとSDNを数学的に関連付ける限り、同
等と考えるべきである。従って、NPEの決定は関数に限定されず、多数の更に精
巧な方法を用いて決定することができる。

【００３８】グラフによる方法は、NPEを決定し、視覚化するための強力な手段を提供する(
例II.DおよびIIIを参照されたい)。例えば、BCおよびSDNを細胞について測定し
、BCとSDNについて別々の軸でプロットし、細胞についてのデーター点を生じる
ことができる。「データー点」という用語は、本明細書では2個以上の値の間の
任意の数学的相関を意味する。従って、細胞についてのデーター点は、DNA、RNA
およびSDNと相関することもできる。この用語はグラフに表したまたはプロット
した点を表すことができるが、視覚的に表示され、数値的に表され、またはコン
ピューターのメモリーに保管されたBCおよびSDNの値の任意の表現を表すことも
できる。しかしながら、それぞれのデーター点の値は、単一細胞または小さな細
胞群を表すべきである。

【００３９】多細胞のデーター点も、別々にまたは同一プロット上にプロットすることもで
きる。同一プロット上にプロットする場合には、データー点は様々なグラフによ
る方法によって表すことができる。散布図は、単に同一グラフ上にそれぞれのデ
ーター点を示し、データー点の密度が一定の値または範囲のBCおよびSDNを有す
る細胞の数を表す。輪郭線プロットを用いて、輪郭線または表面をプロットする
ことによる一定範囲のデーター点の頻度を表し、異なる軸を用いて頻度を表すこ
とができる。

【００４０】データー点のグラフ的表現の一例は図2bであり、正常なヒトリンパ節由来のデ
ーターを示す。水平軸はDNA蛍光であり、それぞれの核におけるDNAの量を表し、
奥行軸はENVであり、核容積を表す。垂直軸は、水平および奥行軸上のそれぞれ
の所定の値のデーター点を有する細胞の数である。従って、ENV対DNAに対して、
頻度輪郭線が提供される。

【００４１】この斜視図に示されるように、リンパ節細胞の大半は単一ピークであり、二倍
性G0/G1細胞である細胞2のクラスターを表している。二番目の最大ピークは内部
コントロールとして試料に加えたマス赤血球の核(TRBC)のクラスター1を表す(例
I.C.を参照されたい)。ずっと小さなピークも見られ、リンパ節細胞の試料中の
二倍性G²+M細胞のクラスター4を表している。

【００４２】同一データーは、輪郭線グラフで表すことができる。図2aにおいて、水平軸は
DNA蛍光であり、垂直軸はENVである。それぞれのENV対DNAデーター点を有する細
胞の頻度は、地形測量地図では等高線を用いるが、等頻度線を表す輪郭線によっ
て示される。前と同様に、TRBC内部標準のクラスター1並びに二倍性G⁰/G¹細胞2
および二倍性G²+M細胞4のリンパ節細胞の二種類の部分母集団を表すクラスター
が見られる。

【００４３】意外なことには、原点からクラスター2および4の中心を通って線5を引くこと
ができる。これは、ENVとDNAについての個々の値は約2倍だけ異なっているが、
2個のクラスターがENVとDNAとの間で共通の相関を共有しているからである。簡
単に言えば、リンパ節細胞の2個のクラスターはリンパ節細胞に特徴的な共通のN
PEを共有している。線が式BC=NPE(SDN)を有するグラフ的表現では、線の傾き(NP
E)はBC/SDNである。あるいは、線は式SDN=NPE(BC)を有することができ、傾き(NP
E)はSDN/BCである。NPEを表す線または実質的に直線状の曲線は、手で図表を用
いて、計算機によって決定することができ、または多種多様な数学的および統計
的ソフトウェアパッケージによって決定することができる。従って、NPEは、多
細胞を表すデーター点について図表を用いて決定することができる。

【００４４】データー点を図表を用いて表すことのもう一つの利点は、別個のデーター点の
クラスターであって、それぞれが元の試料における細胞の部分母集団を表すもの
を同定することができることである。例えば、図2aでは、クラスター2および4は
別々の細胞の部分母集団で容易に同定される。「クラスター」という用語は、本
明細書では細胞の母集団についてまたは予め選択した母集団における代表的な数
の細胞についてプロットしたデーター点の全セットの任意のサブセットを意味す
る。同様に、「部分母集団」という用語は、本明細書ではクラスター中のデータ
ー点によって表される細胞を意味する。例えば、図6aでは、細胞の別個の部分母
集団をクラスター2a、2b、3、4aおよび4bによって識別することができる。しか
しながら、実質的に総てのデーター点が詳細に定義された群、例えば、図1aにお
けるクラスター2を形成するときにも、クラスターおよび部分母集団という用語
が当てはまることに留意すべきである。

【００４５】更に形式的には、クラスターはデーター点の極大に隣接するデーター点の近傍
として定義し、且つ極大からの距離が増加するにつれて頻度を減少することによ
って特性決定することができる。所望ならば、頻度閾値またはカットオフを用い
てクラスター間の分離およびクラスターによって表される部分母集団を説明する
ことができる。

【００４６】次に、幾何学的パラメーターを用いて、それぞれのクラスターの特徴を記載す
ることができる。「幾何学的パラメーター」という用語は、本明細書ではクラス
ターの任意の幾何学的または数学的特性を意味する。ほぼ円形のクラスターの中
心は、平均中心点、重心または極大として定義することができるパラメーターで
ある。原点とクラスターの中心を通過する線の傾きは、特に有用なパラメーター
である。部分母集団輪郭線の形状が楕円体である場合には、他の有用な幾何学的
パラメーターとしては、離心率、長軸の最大範囲、短軸の最大範囲、および長軸
と短軸の標準偏差が挙げられる。もう一つの有用な幾何学的パラメーターは、所
定の閾値で図解的に表すときにはクラスターの周辺の長さである。

【００４７】クラスターについてのこれらの幾何学的パラメーターの他の数学的変動は、上
記のパラメーターのリストに含まれないが、様々な多項式、三角関数、対数関数
、指数関数、および他の超越関数を包含することができる。これらの変動は、ク
ラスターの有用な記載である実質的に同様の説明を行うために実質的に同様な方
法でクラスターの幾何学的特徴を数学的に記載している限り同等であると考える
べきである。

【００４８】勾配線はもう一つの特に有用な幾何学的パラメーターであり、楕円状または細
長いクラスターの一般的傾斜を示す。「勾配線」という用語は、クラスターにお
ける最大傾斜の方向に直交している線を意味する。勾配線の例は、図2dで6と番
号を付けた線である。勾配線に直交する線も、クラスターの有用な幾何学的パラ
メーターであることができる。勾配線は点検によって手書きできることが多いが
、この線は部分母集団におけるデーター点の線形回帰を行うことによって更に正
確に決定することができる。

【００４９】データー点の輪郭線を生成し、試料中の細胞の部分母集団を表すクラスターを
同定したならば、次に細胞のNPEが少なくとも一つの所定のNPE範囲内にある場合
には、同定した幾何学的パラメーターを用いて、細胞を同定することにより細胞
の母集団内の異なる細胞を同定することができる。別々にまたは同時に、この方
法は、同定した細胞を同定されていない細胞から隔離することをも包含すること
ができる。本明細書で用いる「隔離する」という用語は、細胞を分離して、元の
状態や均一混合物ではない全く別の領域または容器に移すことを意味する。

【００５０】細胞の母集団についてNPEを決定する方法は図解に限定されず、数値的にも同
様に良好に行うことができることを強調すべきである。例えば、BCおよびSDNに
ついてのデーター点の決定、データー点のクラスターの同定、および予め選択し
た幾何学的パラメーターによるNPEの決定などの細胞の母集団についてNPEを決定
するための開示された方法の各工程は、数値的に行うことができる。例えば、こ
れらの工程は、必ずしも図表形式でデーターを表すことなくコンピューターで行
うことができる。例えば、NPEについて開示されたアプリケーションおよびNPE
輪郭線も、同様に両者に適用されると理解すべきである。

【００５１】 NPEおよびNPE輪郭線を用いて、目的とする表現型を有する細胞を同定すること
ができる。細胞は、そのNPEを他のNPEと比較することによって同定することがで
きる。例えば、目的とする細胞のNPEを、細胞の参照母集団についての所定範囲
のNPEまたは試料中の他の細胞と比較することができる。結果として、NPEおよび
NPE輪郭線は、試料中の細胞の表現型を同定するための有用な特徴である。

【００５２】 NPEについては、具体的には生物の性別のその細胞による決定に用いられる。
多くの種の体細胞では、雌性動物由来の細胞は2本のX染色体を有し、雄性動物由
来の細胞は1本のXとより小さなY染色体を有する。その結果、雄性細胞はDNA含量
が雌性細胞より少ないが、核容積は雌性細胞に匹敵する。この差は、パッキング
効率が低いことによって反映される。図2aにおいて、クラスター2は、細胞が雄
性由来であるときにはDNA含量が低く(DNA蛍光チャンネルは76付近)、細胞が雌性
由来であるときにはDNA含量が高くなる傾向がある(DNA蛍光チャンネルは80.5付
近)。これらの変化は、雄性については傾きが大きく且つ雌性については傾きが
小さくなって表れる。従って、異なる性別の動物由来の細胞を識別することがで
きる。この方法は、性染色体が逆になっているある種の水鳥のような他の動物で
も適用される。

【００５３】 NPEは、細胞が異なる組織由来であるかどうかを決定するのに用いることもで
きる。例えば、図1a、1b、1c、2a、3a、および5aは、異なる組織由来の細胞であ
ってそれぞれが特徴的なNPEを有するもののNPE輪郭線を示している。従って、未
知起源の細胞は、そのNPEを既知組織のNPEと比較することによって同定すること
もできる。同様に、異なる分化段階の細胞を、それらのNPEによって同定するこ
とができる(例III.C.を参照されたい)。

【００５４】更に、NPEは、細胞が異なる種由来であるかどうかを決定するのにも用いられ
る。図1aにおいて、例えば、マス由来の核についてのNPEは、ヒトリンパ球につ
いてのNPEから識別される。同様に、マウス細胞系由来の細胞を表す図6のクラス
ターのNPEは、図1aのNPEと区別される。例えば、異なる種由来の細胞は、それら
のNPEによって識別される。

【００５５】細胞分裂サイクルの異なる段階にある細胞は、NPE法を用いて同定することも
できる。正常に分裂する細胞は、詳細に画定された段階シリーズを行い、2個の
娘細胞への細胞分裂および娘細胞の完全な染色体のセットを保持するのに必要な
相当するDNAの複製を調整する。S(「合成」)相中に、細胞はその核DNAを複製し
、核のDNA含量が二倍になる。G₂相中に静止した後、核はM(「有糸分裂」)相中に
分裂して、複製したDNAを均等に分離した後、細胞分裂し、細胞自身が別々の娘
細胞に分割される。次に、細胞分裂の後にG₀およびG₁相が続いた後、再度S相を
開始する。例III.Dに示されるように、NPEを用いて、細胞サイクルの様々な段階
で細胞を同定することができる。

【００５６】細胞のNPEは細胞サイクル中は極めて厳密に保持されるので、細胞の状態およ
び正常な増殖の崩壊はそのNPEに反映されることになる。従って、細胞がプログ
ラミングされた細胞死であるアポトーシスを行うときには、NPEを用いてアポト
ーシス状態の細胞を同定することができる(例III.Eを参照されたい)。

【００５７】更に、NPEを用いて、病理または疾病状態のような異常状態を同定することが
できる。疾病状態としては、鎌状赤血球貧血のような遺伝病が挙げられる。例え
ば、ダウン症候群およびクラインフェルター症候群に見られる余分な染色体を、
NPEを用いて検出することができる。同様に、自己免疫疾患に関連した遺伝子異
形を検出することもできる。

【００５８】 NPEは、腫瘍状態を同定する上で特に有用である。本明細書で用いられる「腫
瘍性」という用語は、正常な組織より速やかに増殖する異常組織の形成および増
殖を特徴とすることを意味する。腫瘍組織は、構造的組織および正常な組織と同
等な機能を部分的または完全に欠落していることがある。腫瘍細胞は、異数性を
特徴とすることが多い。「異数性」という用語は、本明細書では異常数の染色体
を有することを意味する。正確な染色体数は細胞分裂サイクル中の分裂の段階に
よって変化する可能性があるが、異数性細胞は正常な染色体数を有する細胞と対
照的である。例えば、この方法により、腫瘍細胞を正常細胞から区別することが
できる。

【００５９】例IIIに記載されるように、正常細胞(図2a参照)は比較的円形クラスターによ
って特性決定することができ、腫瘍細胞は比較的細長いクラスターによって特性
決定することができる(図2c、2dおよび2e参照)。クラスターは、標識した2c、2d
および4cである異数性細胞の存在によって細長くなる可能性がある。次いで、こ
れらの異数性細胞のクラスターは1種類以上の異数性NPE系5c、5d(図2d、2e参照)
を生じる可能性がある。

【００６０】腫瘍細胞の中でも、良性腫瘍は比較的垂直な勾配線6(図2c参照)を有するクラ
スターを有する可能性があるが、悪性の原発性腫瘍由来の細胞(図2dおよび3b参
照)は傾斜した勾配線6を有する可能性がある。また、転移が起きている場合には
、原発性腫瘍クローンは転移部位におけるその傾斜した勾配線およびそのNPEに
よって同定することができる(図2d、2e、3b、3c参照)。

【００６１】更に、腫瘍細胞は、G₀/G₁クラスター2およびG₂+Mクラスター4において細胞が
異常比を有することによって特性決定することができる。例えば、G₀/G₁細胞2
は、図2bに示される正常なヒトリンパ球節細胞ではG₂+M細胞4に比較して明らか
に支配的である。しかしながら、図4eの卵巣癌細胞では、ほぼ同数のG₀/G₁二倍
性細胞2およびG₂+M二倍性細胞4があり、細胞分裂サイクルのG₂およびM段階にお
ける細胞の比が異常になっていることを示している。従って、NPEを用いて、斜
視図での腫瘍状態を同定することができる。

【００６２】これらの方法は、リンパ節(図2e)、胸部(図2c、2d)、結腸(図3bおよび3c)、胃
(図4a)、前立腺(図4c)、卵巣(図4d)、肺(図4f)、白血病(図5b)、並びに子宮頸部
および精巣組織、膵臓、肝臓、脳および小腸などの癌になりやすい任意の種類の
組織に応用することができる。これらの方法に支配される他の組織としては、脳
、卵巣、精巣、骨および剥落した循環組織が挙げられる。

【００６３】上記の方法を行うための装置も、本発明によって提供される。細胞のNPEを決
定する装置は、1個以上のBCを測定し且つSDNを測定する手段、およびNPEを決定
するための手段を有する。このような装置の一態様のブロック図を、図7に示す
。特定の測定手段は、上記、下記の例、および本明細書に引用されている公表文
献および特許明細書に詳細に記載されている。

【００６４】本明細書に引用されている公表文献および特許明細書のそれぞれの内容は、そ
の開示の一部として本明細書に引用される。特許請求の範囲の主文で用いられる
などの本明細書で用いる「含んでなる」（「含む」）という用語は、範囲を限定
せず、列記されている要素または工程を包含し、並びに追加要素または工程を有
する態様も包含するものである。下記の例は例示のためのものであり、発明を制
限しようとするものではない。

【００６５】例I: 染色した核の調製下記の例により、組織試料から単離した核の調製を例示する。

【００６６】 A. 固形組織由来固形組織標本から単離した核を、下記のようにして調製した。約1-2立方ミリ
メートルの組織を、下記の核を単離して染色するための核単離溶液2mlが入って
いるペトリ皿に入れた: pH7.2の等張リン酸緩衝食塩溶液中、10mg/ml 4',6-ジア
ミジノ-2-フェニルインドール(DAPI) DNA染料(Sigma Chemical Co.; セントルイ
ス, ミズーリー); 0.6%NP-40(v/v) (Accurate Scientific & Chemical Co.; ヒ
ックスビル, ニューヨーク)。単離して染色した核を35μmポリプロピレンフィル
ター(RATCOM, Inc.; マイアミ, フロリダ)で濾過し、氷上に置いた。この方法を
用いて単離して染色した核の試料を、リンパ節、腸、胸部、結腸、甲状腺、卵巣
、前立腺、胃、および口の表面上皮細胞などの様々な固形組織供給源から調製し
た。

【００６７】 B. ヒトリンパ球ヒトリンパ球をフィコールハイペートを用いて静脈全血から単離し、等張食塩
水で洗浄し、濃度を約1x10⁷個のリンパ球/mlに調整した。次に、このリンパ球溶
液0.1mlを上記の核単離溶液1mlに加え、濃度が約1x10⁶個の核/mlのリンパ細胞核
の溶液を生じた。染色した核を、35μmポリプロピレンフィルターで濾過し、氷
上に置いた。

【００６８】 C. マス赤血球核(TRBC) マス赤血球由来の核を内部標準として用いた。マス(Salmo gairdnerii irideu
s)赤血球(U.S. Fish Hatchery; アーウィン, テネシー)を下記のように貯蔵溶液
に調製した: 市販のTRBC溶液150μl(RATCOM, Inc.; マイアミ, フロリダ)を2ml
の上記の核単離溶液に加え、濃度が約2x10⁶個の核/mlのTRBC核の貯蔵溶液を生じ
た。次に、染色したTRBC溶液を、35μmポリプロピレンフィルターで濾過し、氷
上に置いた。

【００６９】例II: NPEの決定 A. DNAnalyzerフローサイトメーター DNAnalyzer(登録商標)フローサイトメーター(RATCOM Inc.; マイアミ, フロリ
ダ)により、蛍光によってDNA含量および装置の測定開口を通過するときに各粒子
の容積(ENV)を同時に分析した。容積は、Coulterの米国特許第2,656,508号明細
書に記載のCoulter Electronic Cell Volume原理およびThomas and Egg1estonの
米国特許第4,818,103号明細書の教示に準じて決定した。

【００７０】 DNAnalyzerは、辺当たり70μmの断面および長さが70μmの独特な正三角形フロ
ーセルを用いた。入口および出口も断面が正三角形であり、寸法は辺当たり1cm
から出発し、辺当たり1cmを上回るサイズを70μmまで減少させた。この装置では
、外付け照明および集光光学装置(すなわち、励起光と同じ試料の側からの集光
装置)を用い、410nmの二色性鏡を用いて試料を励起し、蛍光放射線を集めた。

【００７１】励起源は、ほぼ均一な領域のアークにおける30ミクロンスポットサイズの100
ワットの安定化した水銀アークランプであった。UG1フィルターにより、水銀ア
ークランプの放射から365nmのDAPIについての最適励起波長を選択した。マイク
ロ対物レンズは、蛍光放射線の集光のため集光角が120度に相当する1.25N.A.を
有した。次に、DNAnalyzerではDigital Pulse Processing(DPP)を用いて、蛍光
放射線のピーク値および各核からの核容積を決定した。

【００７２】 B. 試料分析例Iに記載の方法で調製した染色した核の試料を、下記のようにして分析した
。TRBC貯蔵懸濁液約50μlを、それぞれの試料に内部DNA標準として加えた。次に
、試料を60-120個の核/秒の流速でDNAnalyzerで分析し、少なくとも15,000件の
結果を集めた。データーをENVおよびDNA蛍光の両方について8ビットの解像度で
集め、FCS 2.0標準ファイルフォーマットに提出した(The Institute of Electri
cal and Electronics Engineers, Inc; ニューヨーク, ニューヨーク)。

【００７３】データーを、Modfit 5.11版(Verity Software House Inc.; トップシャム, メ
イン)を用いて分析した。2個のパラメーターのグラフは、WinMDI 2.7版(http :/
/facs. scripps. eduで無料で入手可能)を用いて調製した。輪郭線および斜視図
プロットは、間隔セット85%、スムース(smooth)6、および閾値0.5で対数モード
で分析した。表示解像度は、輪郭線および斜視図ディスプレーについて256x265
であった。

【００７４】較正を、4μm較正球および5pg DNA/TRBC核のマスRBCについての既知値を用い
て容積について行った。

【００７５】 C. NPEの決定正常細胞を例Iに記載の方法で調製し、核容積(立方μm)およびDNA含量(ピコグ
ラムDNA)について測定した。NPEは、DNA/ENVによって決定した。

【００７６】 NPEについて他の処方も決定した。

【００７７】 D. グラフによるNPEの決定法正常なヒト組織についてのNPE輪郭線の例を、口(図1a)、腸(図1b)、甲状腺(図
1c)、リンパ節(図2a)、結腸(図3a)およびリンパ球(図5a)由来の表面上皮組織に
ついて図に示す。図2aの斜視図は、ピークの相対的高さを強調するための図2bと
して提供される。

【００７８】図のそれぞれにおいて、内部標準TRBCはクラスター1として表れる。チャンネ
ル当たりDNAの立方μmおよびピコグラムについての値が、それぞれの軸に付随す
る。線5は、原点およびG₀/G₁ピーク2および可視の任意の二倍性G₂+Mピーク4を通
過する。次に、NPE(ENV/DNA)を、線5の傾きとして決定することができる。ある
いは、逆の傾き(DNA/ENV)をNPEとして用いることもできる。

【００７９】例III: 細胞を特性決定するためのNPEの使用この例では、例えば、正常および腫瘍細胞、および様々な分化およびアポトー
シス段階の細胞を識別することにより細胞を特性決定するためのNPEの使用を維
持する。

【００８０】 A. ヒトリンパ節細胞参照用に、図2aは正常なヒトリンパ節由来の細胞のNPE輪郭線を示す。G₀/G₁ク
ラスター2および二倍性G₂+Mクラスター4は比較的円形であり、それらの中心はNP
E線5上に整列されている。

【００８１】図2aと対照的に、図2cは良性の胸部腫瘍由来の細胞のNPE輪郭線を示す。正常
細胞2,4は、正常なNPE線5として示されるNPEが約0.145(pg DNA/立方μm)である
。G₀/G₁クラスター2の形状は、図示されているように、異数性細胞2cの存在によ
って垂直方向に伸びている。2cクラスターの上端では、NPEは0.023(pgDNA/立方
μm)程度まで下がる可能性がある。このクラスター形状の変化は、腫瘍状態を示
唆している。勾配線6はこの図では本質的に垂直であり、1041のほぼ垂直な傾き
として表すことができる(容積変化/DNA変化)。また、TRBC内部標準1も、異種粒
子がTRBCに付着するため人工産物として幾分伸びている。

【００８２】図2dは、悪性の原発性胸部腫瘍由来の細胞についてのNPE輪郭線を示す。G₀/G₁ クラスター2および二倍性G₂+Mクラスター4は、図示されているように、異数性細
胞2cおよび2dによって伸張している。重要なことは、勾配線6は垂直線から時計
方向に傾いており、9.4の余り垂直でない傾きとして表すことができる。従って
、クラスターの勾配線の傾きの変化は、悪性の腫瘍状態のような異常状態を示す
可能性がある。

【００８３】図2eは、図2dにおける原発性胸部腫瘍由来の転移細胞についてのNPE輪郭線を
示している。図2dからの2種類の異数性クラスター2cおよび2dは、図2eの転移性
異数性母集団2cおよび2dにおけるクラスターの傾き、勾配傾き、およびNPEの傾
きによって明確に認識することができる。例えば、ピークの幅、広さまたは形状
の変化は、転移のような異常細胞状態を有意に示している可能性がある。更に、
図2eは、異数性母集団2dを二倍性G₂+M母集団4から明確に識別することができる
ことを示している。

【００８４】更に、図2eにおいて、第二の異数性母集団2dは、二倍性G₂+M母集団4における
細胞が0.9%であるのに対して細胞が3.4%であり、G₂+M細胞と比較した第二の異数
性細胞の比が高いことを説明している。以前は、G₂+M母集団が15%を上回るとき
には、四倍性のみが確認された。ここでは、この比は、当該技術分野で以前に知
られており且つDNA蛍光のみのプロフィールから以前に観察することができたも
のより低いG₂+M水準で観察することができる(Hankey et al., Cytometry 14: 47
2-477 (1993)参照)。

【００８５】 B. ヒト結腸細胞図3aは、正常なヒト結腸由来の細胞についてのNPE輪郭線を示す。

【００８６】図3bは、原発性腫瘍由来の細胞についてのNPE輪郭線を示す。重要なことは、G ₀ /G₁クラスター2が異数性細胞2cによって伸張し、傾斜した勾配線6を有すること
である。異数性NPE線5cは、異数性細胞のクラスター2cを通過することが示され
ている。

【００８７】図3cは、図3bに示される転移腫瘍を外科的に除去する際の切除の終了時点から
採取した細胞についてのNPE輪郭線を示す。異数性細胞2cは、図示されているよ
うに、未だ存在しており且つ傾斜した勾配線6を有し、切除試料が転移細胞を含
んでいることを示唆している。

【００８８】図4a-4fは、他の癌組織源、すなわち胃(図4aおよび斜視図4b)、前立腺(図4c)
、卵巣(図4dおよび斜視図4e)および肺(図4f)についてのNPE輪郭線を示す。特に
、肺癌細胞の図4fは、異数性S細胞のクラスター3cおよび異数性G₂+M細胞のクラ
スター4c(TRBC標準は縮尺上の理由により省略した)、並びに2c、3cおよび4cを通
過する別個の異数性NPE線5cを示している。

【００８９】 C. ヒトリンパ球図5aは、正常な血液リンパ球についてのNPE輪郭線を示す。G₀/G₁クラスター2
は、極めて僅かであるが垂直方向に伸張している。

【００９０】図5bは、白血病リンパ球についてのNPE輪郭線を示す。図示されているように
、異数性細胞2cの存在によってG₀/G₁クラスター2の形状が変化して、傾斜した勾
配線6と二倍体NPE線5から明確に識別できる異数性母集団についてのNPE線5cを生
じた。NPE輪郭線は、異数性細胞2cが試料中に存在することを明確に示唆してい
る。

【００９１】図5cは、活性化したリンパ球を含む正常血液の細胞試料についてのNPE輪郭線
を示す。G₀/G₁クラスター2の他に、活性化したリンパ球のもう一つのクラスター
2eであって、別個の垂直な勾配線6eを有するものが識別可能である。従って、NP
E輪郭線は、異なる分化状態を有する細胞の検出に有用である。

【００９２】 D. 細胞サイクル細胞サイクルの進行を、細胞サイクルの様々な段階の細胞を含むマウス細胞系
の試料からのデーター点の輪郭線を示している図6aで追跡することができる。G₀ 相の細胞は、クラスター2aに示されている。核容積の若干の増加は、クラスター
2bでのG₁相における細胞によって反映される。S相中に細胞がそれらのDNAの複製
を開始すると、DNA蛍光についての値は、G₀相の細胞についての値の二倍になる
まで増加し始め、G₂相4aに留まっている。S相3cおよびG₂+M相4cにおける相当す
る異数性細胞を、図4fに示す。

【００９３】核分裂を開始すると、M相の細胞4bは核容積が若干増加する。核分裂が完了す
ると、G₀相2aへ戻ることによって示されるように、DNA量および核容積はいずれ
も半分になる。従って、細胞サイクルの各段階を通る細胞の進行は、図6aで同定
可能なクラスターで反映される。細胞サイクルは、図2aおよび2bでも見ることが
できる。珍しいことには、クラスターはNPE線5上に終始整列されたままであり、
核および細胞が分割していても細胞系の特徴的なNPEは保持されることを示して
いる。

【００９４】 E. アポトーシス細胞 WEHI-231ネズミBリンパ腫細胞系(Lombardi Cancer Institute; ワシントンD.C
.)由来のWEHI細胞を、アポトーシス薬剤で処理することなくまたは処理して得た
。図6bに示されるように、非アポトーシス細胞のNPE輪郭線は、上記のように細
胞サイクルの様々な段階の細胞を含んでいる(クラスター2a、2b、3、4a、4b)。
アポトーシス細胞は、異なるNPE線5fを有する別個のクラスター2fにある。非ア
ポトーシス細胞とアポトーシス細胞の分離は、斜視図6bで強調される(原点は離
れている上部右隅にある)。核の容積はアポトーシス性であろうとなかろうと比
較的一定のままであるが、DNA測定値はアポトーシスの際にDNA含量またはDNA染
色の減少によって減少することが分かる。これは、アポトーシスの際に核の容積
がDNA含量によってではなく、核マトリックスのような他の成分によって保持さ
れることを示している。

【００９５】本発明を上記の例によって説明してきたが、本発明の精神から離反することな
く様々な変更を行うことができることを理解すべきである。従って、本発明は、
特許請求の範囲によってのみ制限される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図1a-1cは、表面口腔上皮(surface oral epithelium; 図1a)、腸(図1b)および
甲状腺(図1e)由来の正常なヒト細胞のNPE輪郭線(電子核容積対DNA蛍光)を示す。
他の正常なヒト細胞のNPE輪郭線は、図2a、3aおよび5aに示す。

【図２】図2a-2eは、様々な状態のヒトリンパ節および胸部細胞、すなわち正常なヒト
リンパ節細胞(図2aおよび斜視図2b)、良性胸部腫瘍由来の細胞(図2c)、胸部組織
由来の悪性の原発性腫瘍から採取した細胞(図2d)、および図2dに示した腫瘍から
リンパ節への転移胸部細胞から採取した細胞(図2e)についてのNPE輪郭線を比較
する。

【図３】図3a-3cは、様々な状態のヒト結腸由来の細胞、すなわち正常な結腸細胞(図3a
)、原発性結腸腫瘍由来の細胞(図3b)、および図3bに示した腫瘍を除去する目的
で行った外科切除の終了時点から採取した転移細胞(図3c)のNPE輪郭線を比較す
る。

【図４】図4a-4fは、4種類の癌組織供給源、すなわち胃(図4aおよび斜視図4b)、前立腺
(図4c)、卵巣(図4dおよび斜視図4e)、および肺(図4f)から採取したヒト細胞のNP
E輪郭線を示す。

【図５】図5a-5cは、様々な状態のヒトリンパ球、すなわち正常なリンパ球(図5a)、白
血病リンパ球(図5b)、および活性化したリンパ球(図5c)のNPE輪郭線を示す。

【図６】図6aはマウス細胞系P388由来の細胞のNPE輪郭線を示す。図6bは、WEHI-231ネ
ズミBリンパ腫細胞系由来の正常およびアポトーシス細胞のNPE輪郭線を示す(図6
bおよび斜視図6c)。

【図７】本発明の方法を行うための装置のブロック図。

【符号の説明】

１マス赤血球の核(TRBC)、内部標準２二倍性G₀/G₁クラスター２ａ二倍性G₀細胞のクラスター２ｂ二倍性G₁細胞のクラスター２ｃ異数性G₀細胞のクラスター２ｄ異数性G₀細胞の第二のクラスター２ｅ活性化したリンパ球のクラスター２ｆアポトーシス細胞のクラスター３ S相における二倍性細胞３ｃ異数性S細胞のクラスター４二倍性G₂+Mクラスター４ａ二倍性G₂細胞のクラスター４ｂ二倍性M細胞のクラスター４ｃ異数性G₂+M細胞のクラスター５正常な二倍性NPE系５ｃ異数性NPE系５ｄ第二の異数性NPE系５ｆアポトーシスNPE系６クラスターの勾配線６ｅ活性化したリンパ球の勾配線総てのクラスターは、表示および印刷出力のために選択された特定の閾値のた
め、所定の輪郭線で見ることができるとは限らない。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年２月２７日（２００２．２．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞の核パッキング効率(NPE)の決定方法であって、 (a) 細胞の核の生化学成分(BC)を測定し、 (b) 細胞の核の空間的変位(SDN)を測定し、 (c) BCとSDNの値を相関させることによって核パッキング効率(NPE)を決定する
工程を含んでなる、上記方法。
【請求項２】 SDNが原核細胞およびウイルスからなる群から選択される粒
子の容積である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】 SDNが真核生物の核の容積である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】 SDNを電子細胞容積(ECV)を用いて測定して、電子核容積(ENV
)を得る、請求項3に記載の方法。
【請求項５】 ENVをフローサイトメトリーによる飛行時間(TOF)を用いて調
節する、請求項4に記載の方法。
【請求項６】 BCが核酸を包含する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】核酸がDNAである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】 DNAを蛍光によって測定する、請求項7に記載の方法。
【請求項９】核酸がRNAである、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】 BCが核のエンベロープ脂質を包含する、請求項1に記載の
方法。
【請求項１１】 BCが核タンパク質を包含する、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】核タンパク質が核マトリックスタンパク質(NMP)である、
請求項11に記載の方法。
【請求項１３】核タンパク質がヒストンである、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】核タンパク質が核膜会合タンパク質である、請求項11に記
載の方法。
【請求項１５】核膜会合タンパク質が核膜孔タンパク質である、請求項14
に記載の方法。
【請求項１６】 BCが核水である、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】工程(c)を、式 NPE=k₁(BC)^a/(SDN)^b+k₂(BC)^c+k₃(SDN)^d+k₄ (式中、k₁、k₂、k₃、k₄、a、b、cおよびdは予め選択された定数であり、k₁は0で
はない) に準じて行う、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】 k₁が正である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】 k₂が0である、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】 k₄が0である、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】 k_l=1、a=1およびb=1であり、従ってNPE=BC/SDNである、請
求項17に記載の方法。
【請求項２２】第二の生化学成分(BC₂)を測定する工程を更に含む、請求
項17に記載の方法。
【請求項２３】 BC₂が総核酸、DNA、RNA、核タンパク質、核マトリックス
タンパク質、ヒストン、核膜脂質、および核膜会合タンパク質からなる群から選
択される、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】 k₅(BC₂)^eの量を工程(a)で測定したBCの値に加え、但し、k ₅ とeは予め選択された定数である、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】 BC₂がDNAであり、k₅=1であり、e=1である、請求項２４に
記載の方法。
【請求項２６】 k₅(BC₂)^eの量を工程(b)で測定したSDNの値に加え、但し、
k₅とeは予め選択された定数である、請求項22に記載の方法。
【請求項２７】 BC₂がRNAであり、k₅=1であり、e=1である、請求項26に記
載の方法。
【請求項２８】工程(c)のNPEにk₅(BC₂)^eを掛け、k₅およびeが予め選択さ
れた定数である、請求項22に記載の方法。
【請求項２９】 BC₂が核タンパク質であり、k₅=1であり、e=1である、請求
項28に記載の方法。
【請求項３０】工程(c)を (c1) BCおよびSDNについての別々の軸上でBCおよびSDNについてのデーター点を
決定し、 (c2) データー点と軸の原点を通過する線の傾きとしてNPEを決定する工程を行うことによって行う、請求項1に記載の方法。
【請求項３１】細胞の個体群についてNPEを決定する方法であって、 (a) 個体群の細胞の代表的数について (1) 細胞の核の生化学成分(BC)を測定し、 (2) 細胞の核の空間的変位(SDN)を測定し、 (3) BCおよびSDNについての別々の軸上でBCおよびSDNについてのデーター点
を決定し、 (b) データー点の少なくとも1個のクラスターを同定し、 (c) データー点のクラスターの予め選択された幾何学的パラメーターに準じて
NPEを決定する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項３２】幾何学的パラメーターが少なくとも1個のクラスターの極
大値およびBCおよびSDN軸の原点を通過する実質的に線形の曲線の傾きである、
請求項31に記載の方法。
【請求項３３】幾何学的パラメーターがデーター点のクラスターの勾配線
の傾きである、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】幾何学的パラメーターが離心率、長軸の最大範囲、短軸の
最大範囲、長軸の標準偏差、短軸の標準偏差、勾配線に直交する線の傾き、およ
び周辺の長さからなる群から選択される、請求項31に記載の方法。
【請求項３５】細胞の個体群内の様々な細胞を同定する方法であって、 (a) 個体群の少なくとも1個の細胞について請求項1に記載の方法を行い、 (b) 細胞のNPEが少なくとも1個の所定のNPE範囲内にあるときに、この細胞を
同定する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項３６】 (c) 同定した細胞を同定されていない細胞から分離する工程を更に含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】目的とする表現型を有し、細胞の個体群に含まれている細
胞を同定する方法であって、 (a) 細胞の個体群について請求項31に記載の方法を行って、データー点の少な
くとも1個のクラスターからNPEを決定し、 (b) NPEが幾何学的パラメーターについての所定の範囲内にあるかどうかを決
定する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項３８】所定の範囲がBCの範囲内であり且つSDNの範囲内である、
請求項37に記載の方法。
【請求項３９】表現型が異なる性のものである、請求項37に記載の方法。
【請求項４０】表現型が異なる組織のもの、請求項37に記載の方法。
【請求項４１】表現型が異なる種のものである、請求項37に記載の方法。
【請求項４２】表現型が異なる分化状態のものである、請求項37に記載の
方法。
【請求項４３】幾何学的パラメーターが増加長軸である、請求項42に記載
の方法。
【請求項４４】表現型が所定の細胞分裂サイクル段階のものである、請求
項37に記載の方法。
【請求項４５】一段階サイクルがSである、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】幾何学的パラメーターが増加長軸である、請求項45に記載
の方法。
【請求項４７】一つの段階サイクルがG₀、G₁、G₂およびMからなる群から
選択される、請求項44に記載の方法。
【請求項４８】表現型がアポトーシス状態のものである、請求項37に記載
の方法。
【請求項４９】表現型が疾病状態のものである、請求項37に記載の方法。
【請求項５０】疾病状態が遺伝子疾患である、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】疾病状態が鎌状赤血球貧血である、請求項50に記載の方法
。
【請求項５２】疾病状態がダウン症候群である、請求項50に記載の方法。
【請求項５３】疾病状態が自己免疫疾患である、請求項49に記載の方法。
【請求項５４】表現型が異数性である、請求項37に記載の方法。
【請求項５５】表現型が腫瘍性のものである、請求項37に記載の方法。
【請求項５６】幾何学的パラメーターが増加長軸である、請求項55に記載
の方法。
【請求項５７】異なる細胞の種類の指標が悪性細胞を示す、請求項37に記
載の方法。
【請求項５８】幾何学的パラメーターが勾配線の減少した傾きである、請
求項57に記載の方法。
【請求項５９】異なる細胞の種類の指標が転移細胞を示す、請求項55に記
載の方法。
【請求項６０】幾何学的パラメーターが広げた短軸である、請求項59に記
載の方法。
【請求項６１】細胞が胸部組織に由来する、請求項54に記載の方法。
【請求項６２】細胞が管組織に由来する、請求項54に記載の方法。
【請求項６３】細胞が肺組織に由来する、請求項54に記載の方法。
【請求項６４】細胞が結腸、胃、リンパ、腸および前立腺からなる群から
選択される組織に由来する、請求項54に記載の方法。
【請求項６５】細胞が脳、卵巣、精巣、骨および剥落した循環組織からな
る群から選択される組織に由来する、請求項54に記載の方法。
【請求項６６】細胞のNPEを決定する装置であって、少なくとも1個の細胞の核の生化学成分(BC)を測定する第一の手段、少なくとも1個の細胞の核の空間的変位(SDN)を測定する第二の手段、および BCおよびSDNの値を相関させることによって核パッキング効率(NPE)を決定する
手段を含んでなる、上記装置。