JP2003526799A - ウェスタンブロット用分子量マーカー - Google Patents
ウェスタンブロット用分子量マーカーInfo
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Abstract
(57)【要約】
ペルオキシダーゼの使用に基づいた全てのウェスタンブロット技法において、抗原の検出時に直接同定できる、ペルオキシダーゼ活性を有する分子量標準物質の製造方法。
Description
【０００１】
本発明は概して電気泳動及びウェスタンブロットによりタンパク質を分離し検
出するための技法に関する。さらに詳細には、本発明はウェスタンブロットで用
いる分子量マーカー（標準物質）の製造方法に関するものである。技術的背景 ウェスタンブロットの技法が紹介されて以来、主に取り扱いがより容易であり
検出時間がより短いという理由から、酵素標識抗体がラジオアイソトープ標識抗
体に次第に取って代わってきている。現在、タンパク質をウェスタンブロット検
出するための最も一般的な方法は、ペルオキシダーゼ結合体（抗体、プロテイン
Ａ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジンなど）に基づいており、その
酵素活性は適切な基質により色素生産又は化学発光のどちらかで現される。
出するための技法に関する。さらに詳細には、本発明はウェスタンブロットで用
いる分子量マーカー（標準物質）の製造方法に関するものである。技術的背景 ウェスタンブロットの技法が紹介されて以来、主に取り扱いがより容易であり
検出時間がより短いという理由から、酵素標識抗体がラジオアイソトープ標識抗
体に次第に取って代わってきている。現在、タンパク質をウェスタンブロット検
出するための最も一般的な方法は、ペルオキシダーゼ結合体（抗体、プロテイン
Ａ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジンなど）に基づいており、その
酵素活性は適切な基質により色素生産又は化学発光のどちらかで現される。
【０００２】
一般的な実験工程では、ウェスタンブロットで用いる分子量標準物質は膜へ転
写し染色した後、対応したバンドの正確性を帰するために鉛筆で標識する。この
工程は前染色してある標準物質を用いた場合にも行われるが、これは一般的にそ
の色がウェスタンブロット工程終了時に変色又は退色し、そのためにいくつかの
バンドが消失し又は膜上での検出が困難になってしまうためである。さらに、化
学発光法を用いる場合でも、検出バンドの不正確な判定を避けるために、これら
全ての標準物質をオートラジオグラフィーフィルム上で再度標識しなくてはなら
ない。
写し染色した後、対応したバンドの正確性を帰するために鉛筆で標識する。この
工程は前染色してある標準物質を用いた場合にも行われるが、これは一般的にそ
の色がウェスタンブロット工程終了時に変色又は退色し、そのためにいくつかの
バンドが消失し又は膜上での検出が困難になってしまうためである。さらに、化
学発光法を用いる場合でも、検出バンドの不正確な判定を避けるために、これら
全ての標準物質をオートラジオグラフィーフィルム上で再度標識しなくてはなら
ない。
【０００３】
膜上で直接検出できる分子量標準物質が存在するが、それらは特別な条件又は
処理が必要である。例えば、ビオチン結合標準物質はビオチン−（ストレプト）
アビジンシステムを用いた時にのみ検出できる。二次抗体溶液に含まれる特異抗
体で検出され得る共通エピトープを共有する一組の標準物質が市販されている（
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.）。しかし、この方法はマ
ーカーと二次抗体の両方をある特定の業者から購入することを意味する。ウェス
タンブロットに用いられる膜でペルオキシダーゼ酵素活性により直接検出され得
る標準物質は、現在入手可能ではない。
処理が必要である。例えば、ビオチン結合標準物質はビオチン−（ストレプト）
アビジンシステムを用いた時にのみ検出できる。二次抗体溶液に含まれる特異抗
体で検出され得る共通エピトープを共有する一組の標準物質が市販されている（
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.）。しかし、この方法はマ
ーカーと二次抗体の両方をある特定の業者から購入することを意味する。ウェス
タンブロットに用いられる膜でペルオキシダーゼ酵素活性により直接検出され得
る標準物質は、現在入手可能ではない。
【０００４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びニトロセルロースフィルターへの転写後、色素生産性及
び化学発光性のペルオキシダーゼ基質の使用に基づいてヘムタンパク質を検出す
る方法が報告されている（Dorward D. W., 1993, Anal. Biochem. 209: 219; Va
rgas C et al., 1993, Anal. Biochem. 209: 323）。さらに、別個の組のホモポ
リマーを生ずるタンパク質の重合によって得られる電気泳動標準物質が市販され
ている（Sigma, U.S.A., カタログ A9392、H2757、H2507、P8906）。発明の開示 ペルオキシダーゼ活性は、ペルオキシダーゼ活性を有する２つ又はそれ以上の
タンパク質を結合させることにより又はペルオキシダーゼ活性を有するタンパク
質とペルオキシダーゼ活性を有しない他のタンパク質とを結合させることにより
、変性に対して保持され、また少なくとも一部は安定化されることが発見された
。このことは、適当なペルオキシダーゼ基質との反応により、ウェスタンブロッ
トで用いられる膜上で直接検出可能な分子量標準物質を製造することを可能にし
た。
び化学発光性のペルオキシダーゼ基質の使用に基づいてヘムタンパク質を検出す
る方法が報告されている（Dorward D. W., 1993, Anal. Biochem. 209: 219; Va
rgas C et al., 1993, Anal. Biochem. 209: 323）。さらに、別個の組のホモポ
リマーを生ずるタンパク質の重合によって得られる電気泳動標準物質が市販され
ている（Sigma, U.S.A., カタログ A9392、H2757、H2507、P8906）。発明の開示 ペルオキシダーゼ活性は、ペルオキシダーゼ活性を有する２つ又はそれ以上の
タンパク質を結合させることにより又はペルオキシダーゼ活性を有するタンパク
質とペルオキシダーゼ活性を有しない他のタンパク質とを結合させることにより
、変性に対して保持され、また少なくとも一部は安定化されることが発見された
。このことは、適当なペルオキシダーゼ基質との反応により、ウェスタンブロッ
トで用いられる膜上で直接検出可能な分子量標準物質を製造することを可能にし
た。
【０００５】
したがって、本発明は、同一又は異なっていてもよい２つあるいはそれ以上の
（ポリ）ペプチドを架橋剤により結合させることを含み、（ポリ）ペプチドのう
ちの少なくとも１つはペルオキシダーゼ活性を有し、そして任意に、所望の分子
量範囲をカバーするように結合産物を引き続き分離することを含む、ウェスタン
ブロット用分子量標準物質の製造方法に関するものである。
（ポリ）ペプチドを架橋剤により結合させることを含み、（ポリ）ペプチドのう
ちの少なくとも１つはペルオキシダーゼ活性を有し、そして任意に、所望の分子
量範囲をカバーするように結合産物を引き続き分離することを含む、ウェスタン
ブロット用分子量標準物質の製造方法に関するものである。
【０００６】
ここでいう「結合」は、２つの（ポリ）ペプチドを共有結合することのできる
適当な化合物（架橋剤）により２つ又はそれ以上の（ポリ）ペプチドを連結する
ことを意味する。
適当な化合物（架橋剤）により２つ又はそれ以上の（ポリ）ペプチドを連結する
ことを意味する。
【０００７】
該架橋剤は、全ての不可逆的二官能性架橋剤から成る群から選択することがで
きる。スベリン酸ジスクシンイミド（ＤＳＳ）又はその水溶性類似体であるグル
タル酸ジスクシンイミド（ＤＳＧ）が好適には使用される。
きる。スベリン酸ジスクシンイミド（ＤＳＳ）又はその水溶性類似体であるグル
タル酸ジスクシンイミド（ＤＳＧ）が好適には使用される。
【０００８】
ここでいう「ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質」は、好適にはヘム基
を有するタンパク質又は（ポリ）ペプチドを意味する。チトクロームＣ、ミクロ
ペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼが
本発明において使用可能なペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質の非限定的
な例である。
を有するタンパク質又は（ポリ）ペプチドを意味する。チトクロームＣ、ミクロ
ペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼが
本発明において使用可能なペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質の非限定的
な例である。
【０００９】
一方、「ペルオキシダーゼ活性を有しないタンパク質」は、電気泳動で用いら
れる異なる条件下で一定かつ再現性のある移動度を示し、また上記架橋剤と容易
にかつ安定に結合できる、分子量が既知のいずれのノンヘムタンパク質でも可能
である。ノンヘムタンパク質は好適にはリゾチーム、カルボニックアンヒドラー
ゼ、オボアルブミン及び血清アルブミンから成るグループから選択される。
れる異なる条件下で一定かつ再現性のある移動度を示し、また上記架橋剤と容易
にかつ安定に結合できる、分子量が既知のいずれのノンヘムタンパク質でも可能
である。ノンヘムタンパク質は好適にはリゾチーム、カルボニックアンヒドラー
ゼ、オボアルブミン及び血清アルブミンから成るグループから選択される。
【００１０】
結合は単一、すなわち架橋剤により２つの同一又は異なるタンパク質が結合さ
れるか、又は多重、すなわち架橋剤により２つ以上のタンパク質が様々に結合さ
れるかのどちらかであり得る。結合多重度は、架橋剤と特定のタンパク質又は異
なるタンパク質の混合物との反応条件、特に反応時間又は試薬濃度を変えること
により調節できる。反応終了後、異なる結合多重度を有する反応産物の混合物が
得られる。結合は様々な反応産物を供し、各々の量はその分子量と反比例する。
反応産物の混合物は、そのままで使用されるか又はその異なる成分に分離して使
用されることができる。このようにして、様々な分子量の範囲をカバーする標準
物質が調製される。分子量をさらに正確に規定するために、それぞれの調製品に
ついてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はウェスタンブロットにより、若しくは分子量
が既知のタンパク質から成る市販の標準物質又は実験室用標準物質を用いて較正
を行うことができる。しかし、ウェスタンブロットは分子量を決定するための分
析的技法ではないことを考慮すべきである。したがって、発色団分子との結合で
電気泳動の移動度に変化が生ずる市販の前染色された標準物質に共通するように
、分子量が正確に決定されていない標準物質が使用されうる。
れるか、又は多重、すなわち架橋剤により２つ以上のタンパク質が様々に結合さ
れるかのどちらかであり得る。結合多重度は、架橋剤と特定のタンパク質又は異
なるタンパク質の混合物との反応条件、特に反応時間又は試薬濃度を変えること
により調節できる。反応終了後、異なる結合多重度を有する反応産物の混合物が
得られる。結合は様々な反応産物を供し、各々の量はその分子量と反比例する。
反応産物の混合物は、そのままで使用されるか又はその異なる成分に分離して使
用されることができる。このようにして、様々な分子量の範囲をカバーする標準
物質が調製される。分子量をさらに正確に規定するために、それぞれの調製品に
ついてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はウェスタンブロットにより、若しくは分子量
が既知のタンパク質から成る市販の標準物質又は実験室用標準物質を用いて較正
を行うことができる。しかし、ウェスタンブロットは分子量を決定するための分
析的技法ではないことを考慮すべきである。したがって、発色団分子との結合で
電気泳動の移動度に変化が生ずる市販の前染色された標準物質に共通するように
、分子量が正確に決定されていない標準物質が使用されうる。
【００１１】
電気泳動による分離及びウェスタンブロット膜への転写後、標準物質は色素生
産性基質との反応により膜上で、又は化学発光性基質を用いる場合にはオートラ
ジオグラフィーフィルム上で直接検出され得る。通常使用される色素生産性及び
化学発光性基質の例は：４−クロロ−１−ナフトール及びジアミノベンジジン（
色素生産性）；ＥＣＬ（Amersham）、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（Pierce）及びＤ
ｕｏＬｕｘ（Vector）（化学発光性）である。架橋はＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で
のタンパク質の完全な変性を妨げ、予期せぬ移動度をもたらすことがあるので、
標識タンパク質の見かけの分子量は好適には市販の標準物質を用いた較正により
評価されるべきである。
産性基質との反応により膜上で、又は化学発光性基質を用いる場合にはオートラ
ジオグラフィーフィルム上で直接検出され得る。通常使用される色素生産性及び
化学発光性基質の例は：４−クロロ−１−ナフトール及びジアミノベンジジン（
色素生産性）；ＥＣＬ（Amersham）、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（Pierce）及びＤ
ｕｏＬｕｘ（Vector）（化学発光性）である。架橋はＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で
のタンパク質の完全な変性を妨げ、予期せぬ移動度をもたらすことがあるので、
標識タンパク質の見かけの分子量は好適には市販の標準物質を用いた較正により
評価されるべきである。
【００１２】
さらに、異なるタンパク質間の結合産物の場合には、結合比（ペルオキシダー
ゼ／タンパク質）を上げて標準物質がより良好に検出されるようにするために、
ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質は低分子量であることが好適である。
Plattner et al., 1977, Histochemistry 53: 223-242により、又はHarbury et
al., 1960, J. Biol. Chem., 235: 3649-3655により、又はKraehenbuhl et al.,
1974, J. Exp. Med., 139: 208-223により記載されている、１１アミノ酸を有
するチトクロームＣペプチドであるミクロペルオキシダーゼＭＰ−１１、又はそ
れぞれノナペプチド及びオクタペプチドであるミクロペルオキシダーゼＭＰ−９
及びＭＰ−８などのミクロペルオキシダーゼが好適であり、さらにそれぞれ６及
び１７アミノ酸を有するＭＰ−６及びＭＰ−１７（Spee et al., 1996, Eur. J.
Biochem. 241: 215-220）も使用可能である。概して、タンパク質分解又は合成
で生ずるペルオキシダーゼタンパク質由来のどのようなペプチドでもそれが酵素
活性を保持している限りにおいて使用可能である。
ゼ／タンパク質）を上げて標準物質がより良好に検出されるようにするために、
ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質は低分子量であることが好適である。
Plattner et al., 1977, Histochemistry 53: 223-242により、又はHarbury et
al., 1960, J. Biol. Chem., 235: 3649-3655により、又はKraehenbuhl et al.,
1974, J. Exp. Med., 139: 208-223により記載されている、１１アミノ酸を有
するチトクロームＣペプチドであるミクロペルオキシダーゼＭＰ−１１、又はそ
れぞれノナペプチド及びオクタペプチドであるミクロペルオキシダーゼＭＰ−９
及びＭＰ−８などのミクロペルオキシダーゼが好適であり、さらにそれぞれ６及
び１７アミノ酸を有するＭＰ−６及びＭＰ−１７（Spee et al., 1996, Eur. J.
Biochem. 241: 215-220）も使用可能である。概して、タンパク質分解又は合成
で生ずるペルオキシダーゼタンパク質由来のどのようなペプチドでもそれが酵素
活性を保持している限りにおいて使用可能である。
【００１３】
原則として、ペルオキシダーゼ活性は高温を避けた温和な変性条件下でより良
く保持されるが、本発明の分子量標準物質はＳＤＳ−ＰＡＧＥやウェスタンブロ
ットでの処理後も安定であることが証明されている。
く保持されるが、本発明の分子量標準物質はＳＤＳ−ＰＡＧＥやウェスタンブロ
ットでの処理後も安定であることが証明されている。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、個別の容器中に、ペルオキシダーゼ活性を有するタ
ンパク質／ペプチド、架橋剤、並びに任意にペルオキシダーゼ活性を有しないタ
ンパク質、インキュベーション用緩衝液及び反応停止用緩衝液を含む分子量標準
物質の製造用キットに関するものである。緩衝液はトリス又はリジン緩衝液が可
能であるが、タンパク質−膜相互作用がより良好であるという点においてリジン
緩衝液が好適である。
ンパク質／ペプチド、架橋剤、並びに任意にペルオキシダーゼ活性を有しないタ
ンパク質、インキュベーション用緩衝液及び反応停止用緩衝液を含む分子量標準
物質の製造用キットに関するものである。緩衝液はトリス又はリジン緩衝液が可
能であるが、タンパク質−膜相互作用がより良好であるという点においてリジン
緩衝液が好適である。
【００１５】
ペルオキシダーゼ活性を有する小さな（ポリ）ペプチドがタンパク質マーカー
として効果的であることから、より障害的なペルオキシダーゼタンパク質の代わ
りにそれらを用いることができる。ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞
化学及び免疫組織化学で通常採用される二次抗体、アビジン又はストレプトアビ
ジンは、ミクロペルオキシダーゼと好適に結合し得る分子の例である。得られる
結合体は極めてサイズが小さく、また１分子当りのマーカー数がより高いために
、その効率が増大している。
として効果的であることから、より障害的なペルオキシダーゼタンパク質の代わ
りにそれらを用いることができる。ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞
化学及び免疫組織化学で通常採用される二次抗体、アビジン又はストレプトアビ
ジンは、ミクロペルオキシダーゼと好適に結合し得る分子の例である。得られる
結合体は極めてサイズが小さく、また１分子当りのマーカー数がより高いために
、その効率が増大している。
【００１６】
したがって、さらなる態様によれば、本発明は、酵素標識が必要な技法におい
て、ペルオキシダーゼ活性を有する小サイズの（ポリ）ペプチド、好適にはチト
クロームＣやミクロペルオキシダーゼを用いて製造される結合産物の使用に関す
るものである。実施例１ 〜１３から４０ｋＤａの範囲（チトクロームＣオリゴマー） 材料：２０mg チトクロームC 緩衝液Ａ：１０ｍＭ ＮａＰｉ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ中の１Ｍ ＤＬ−リジン 緩衝液Ｃ：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ 溶液Ｄ：ジメチルスルホキシド中の２０ｍＭ ＤＳＳ（用時調製）。 １． チトクロームＣを０．１８ｍｌの緩衝液Ａ中に溶解する。 ２． ０．０２ｍｌの溶液Ｄを加える。 ３． 室温で１時間撹拌する。 ４． ０．０２ｍｌの緩衝液Ｂを加える。
て、ペルオキシダーゼ活性を有する小サイズの（ポリ）ペプチド、好適にはチト
クロームＣやミクロペルオキシダーゼを用いて製造される結合産物の使用に関す
るものである。実施例１ 〜１３から４０ｋＤａの範囲（チトクロームＣオリゴマー） 材料：２０mg チトクロームC 緩衝液Ａ：１０ｍＭ ＮａＰｉ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ中の１Ｍ ＤＬ−リジン 緩衝液Ｃ：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ 溶液Ｄ：ジメチルスルホキシド中の２０ｍＭ ＤＳＳ（用時調製）。 １． チトクロームＣを０．１８ｍｌの緩衝液Ａ中に溶解する。 ２． ０．０２ｍｌの溶液Ｄを加える。 ３． 室温で１時間撹拌する。 ４． ０．０２ｍｌの緩衝液Ｂを加える。
【００１７】
同じ強度を持つバンドのセットが所望の場合は引き続き以下の工程を継続し、
そうでなければ直接工程７へスキップする。 ５． 平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（１０×３００ｍｍ）又は同様な
特性を持ったカラムにロードし、０．５ｍｌ／分の流速で緩衝液Ｃで溶出し、溶
出ピークを個別に回収する。 ６． 各々のピークをクロマトグラフィーのピーク面積と反比例する量で混合す
る。 ７． 等分し、−２０℃以下の温度で凍結する。実施例２ 〜６０から１３０ｋＤａの範囲（チトクロームＣ結合体） 材料：１ｍｇ チトクロームＣ ３．３ｍｇ オボアルブミン １０ｍｇ 牛血清アルブミン 緩衝液Ａ：１０ｍＭ ＮａＰｉ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ中の１Ｍ ＤＬ−リジン 溶液Ｄ：ジメチルスルホキシド中の２０ｍＭ ＤＳＳ（用時調製）。 １） チトクロームＣを１ｍｌの緩衝液Ａに溶解する。 ２） オボアルブミンを０．８ｍｌの緩衝液Ａに溶解し、工程１の溶液を０．１
ｍｌ加える。 ３） 牛血清アルブミンを０．８ｍｌの緩衝液Ａに溶解し、工程１の溶液を０．
１ｍｌ加える。 ４） 工程２及び３で調製した溶液に０．１ｍｌの溶液Ｄを加える。 ５） 工程４の溶液を室温で１時間撹拌する。 ６） ０．１ｍｌの緩衝液Ｂを加える。 ７） 等分し、−２０℃以下の温度で凍結する。実施例３ 〜１５から４５ｋＤａの範囲（ミクロペルオキシダーゼＭＰ−１１結合体） 材料：１ｍｇ ミクロペルオキシダーゼＭＰ−１１ １０ｍｇ リゾチーム ５ｍｇ カルボニックアンヒドラーゼ 緩衝液Ａ：１０ｍＭ ＮａＰｉ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ中の１Ｍ ＤＬ−リジン 溶液Ｄ：ジメチルスルホキシド中の２０ｍＭ ＤＳＳ（用時調製）。 １． ミクロペルオキシダーゼを１ｍｌの緩衝液Ａに溶解する。 ２． リゾチームを０．８ｍｌの緩衝液Ａに溶解し、工程１の溶液を０．１ｍｌ
加える。 ３． カルボニックアンヒドラーゼを０．８ｍｌの緩衝液Ａに溶解し、工程１の
溶液を０．１ｍｌ加える。 ４． 工程２及び３で調製した溶液に０．１ｍｌの溶液Ｄを加える。 ５． 工程４の溶液を室温で１時間撹拌する。 ６． ０．１ｍｌの緩衝液Ｂを加える。 ７． 等分し、−２０℃以下の温度で凍結する。実施例４ ウェスタンブロット 未結合のチトクロームＣ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダ
ーゼ及び（チトクロームＣ及びＭＰ−１１と）結合したタンパク質の重複試料を
還元Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液と混合した。第１の重複試料は９５℃で、第２の
重複試料は４０℃で、５分間加熱した後、標準的な工程に従って１５％のミニＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥでブロード分子量マーカー（Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.）
と並行して泳動した。泳動後、ゲルを０．４５μｍのニトロセルロースシート上
にセミドライセルを用いてブロットした。膜を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ
７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）で洗浄し、ＴＢＳに溶解した３％（ｗ
／ｖ）牛血清アルブミン（ＢＴ）で１時間ブロッキングした後、異なるウェスタ
ンブロット工程をシミュレートするために０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２
０を含むＢＴ中で２時間又は一晩インキュベートした。０．２５％Ｔｗｅｅｎ−
２０を含むＴＢＳで洗浄し、さらにＴＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼ活性
を検出した。
そうでなければ直接工程７へスキップする。 ５． 平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（１０×３００ｍｍ）又は同様な
特性を持ったカラムにロードし、０．５ｍｌ／分の流速で緩衝液Ｃで溶出し、溶
出ピークを個別に回収する。 ６． 各々のピークをクロマトグラフィーのピーク面積と反比例する量で混合す
る。 ７． 等分し、−２０℃以下の温度で凍結する。実施例２ 〜６０から１３０ｋＤａの範囲（チトクロームＣ結合体） 材料：１ｍｇ チトクロームＣ ３．３ｍｇ オボアルブミン １０ｍｇ 牛血清アルブミン 緩衝液Ａ：１０ｍＭ ＮａＰｉ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ中の１Ｍ ＤＬ−リジン 溶液Ｄ：ジメチルスルホキシド中の２０ｍＭ ＤＳＳ（用時調製）。 １） チトクロームＣを１ｍｌの緩衝液Ａに溶解する。 ２） オボアルブミンを０．８ｍｌの緩衝液Ａに溶解し、工程１の溶液を０．１
ｍｌ加える。 ３） 牛血清アルブミンを０．８ｍｌの緩衝液Ａに溶解し、工程１の溶液を０．
１ｍｌ加える。 ４） 工程２及び３で調製した溶液に０．１ｍｌの溶液Ｄを加える。 ５） 工程４の溶液を室温で１時間撹拌する。 ６） ０．１ｍｌの緩衝液Ｂを加える。 ７） 等分し、−２０℃以下の温度で凍結する。実施例３ 〜１５から４５ｋＤａの範囲（ミクロペルオキシダーゼＭＰ−１１結合体） 材料：１ｍｇ ミクロペルオキシダーゼＭＰ−１１ １０ｍｇ リゾチーム ５ｍｇ カルボニックアンヒドラーゼ 緩衝液Ａ：１０ｍＭ ＮａＰｉ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ中の１Ｍ ＤＬ−リジン 溶液Ｄ：ジメチルスルホキシド中の２０ｍＭ ＤＳＳ（用時調製）。 １． ミクロペルオキシダーゼを１ｍｌの緩衝液Ａに溶解する。 ２． リゾチームを０．８ｍｌの緩衝液Ａに溶解し、工程１の溶液を０．１ｍｌ
加える。 ３． カルボニックアンヒドラーゼを０．８ｍｌの緩衝液Ａに溶解し、工程１の
溶液を０．１ｍｌ加える。 ４． 工程２及び３で調製した溶液に０．１ｍｌの溶液Ｄを加える。 ５． 工程４の溶液を室温で１時間撹拌する。 ６． ０．１ｍｌの緩衝液Ｂを加える。 ７． 等分し、−２０℃以下の温度で凍結する。実施例４ ウェスタンブロット 未結合のチトクロームＣ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダ
ーゼ及び（チトクロームＣ及びＭＰ−１１と）結合したタンパク質の重複試料を
還元Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液と混合した。第１の重複試料は９５℃で、第２の
重複試料は４０℃で、５分間加熱した後、標準的な工程に従って１５％のミニＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥでブロード分子量マーカー（Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.）
と並行して泳動した。泳動後、ゲルを０．４５μｍのニトロセルロースシート上
にセミドライセルを用いてブロットした。膜を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ
７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）で洗浄し、ＴＢＳに溶解した３％（ｗ
／ｖ）牛血清アルブミン（ＢＴ）で１時間ブロッキングした後、異なるウェスタ
ンブロット工程をシミュレートするために０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２
０を含むＢＴ中で２時間又は一晩インキュベートした。０．２５％Ｔｗｅｅｎ−
２０を含むＴＢＳで洗浄し、さらにＴＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼ活性
を検出した。
【００１８】
他のいかなるタンパク質も加えずにチトクロームＣをＤＳＳで処理し、平衡化
したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（１×３０ｃｍ）カラム（Amersham Pharmacia Biote
ch, Uppsala, Sweden）でゲルろ過にかけ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．
４、３００ｍＭ ＮａＣｌで０．５ｍｌ／分の流速で溶出した。各々の溶出ピー
クは個別に回収した。
したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（１×３０ｃｍ）カラム（Amersham Pharmacia Biote
ch, Uppsala, Sweden）でゲルろ過にかけ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．
４、３００ｍＭ ＮａＣｌで０．５ｍｌ／分の流速で溶出した。各々の溶出ピー
クは個別に回収した。
【００１９】
表１Ａ−Ｂに要約したように、チトクロームＣ結合体及びＭＰ−１１結合体は
ウェスタンブロット工程の終了時にペルオキシダーゼ活性を保持していることが
判明した。未結合のペルオキシダーゼタンパク質は酵素活性を大幅に減少させる
高温処理に対してより感受性を示すことが判明した：架橋剤処理は実際に変性に
対してタンパク質構造を安定化するようである。
ウェスタンブロット工程の終了時にペルオキシダーゼ活性を保持していることが
判明した。未結合のペルオキシダーゼタンパク質は酵素活性を大幅に減少させる
高温処理に対してより感受性を示すことが判明した：架橋剤処理は実際に変性に
対してタンパク質構造を安定化するようである。
【００２０】
【表１】
【００２１】
チトクロームＣを架橋剤で処理すると、ゲルろ過で容易に分離される３種のオ
リゴマーが生成した（図１、レーン１及び２）。電気泳動の移動度はこれらが単
量体、二量体及び三量体であることを示している（表２）。
リゴマーが生成した（図１、レーン１及び２）。電気泳動の移動度はこれらが単
量体、二量体及び三量体であることを示している（表２）。
【００２２】
各々の結合体の量及びチトクロームＣオリゴマーの量は、各々のバンドのシグ
ナル強度ができるだけ均一になるように調整した。３種のチトクロームＣ、オボ
アルブミン−及び血清アルブミン−チトクロームＣを混合することで有用な一組
の分子量標準物質が供された（図１、レーン５）。ＭＰ−１１とリゾチームの結
合は、その全てがＭＰ−１１結合体である３種のリゾチームオリゴマー（表１Ｂ
及び図１、レーン３）、単量体、二量体及び三量体（表２）を生じた。ＭＰ−１
１とカルボニックアンヒドラーゼとの結合は単一バンドを生じた（レーン４）。
ナル強度ができるだけ均一になるように調整した。３種のチトクロームＣ、オボ
アルブミン−及び血清アルブミン−チトクロームＣを混合することで有用な一組
の分子量標準物質が供された（図１、レーン５）。ＭＰ−１１とリゾチームの結
合は、その全てがＭＰ−１１結合体である３種のリゾチームオリゴマー（表１Ｂ
及び図１、レーン３）、単量体、二量体及び三量体（表２）を生じた。ＭＰ−１
１とカルボニックアンヒドラーゼとの結合は単一バンドを生じた（レーン４）。
【００２３】
【表２】
【図１】 レーン１は、（下から上へ）チトクロームＣ単量体、二量体及び
三量体を示す。レーン２は、レーン１と同様であるが、同等な強度のバンドにな
るようにオリゴマーを分離し混合した後のものを示す。レーン３は、ミクロペル
オキシダーゼと結合したリゾチームで、（下から上へ）単量体、二量体、三量体
を示す。レーン４は、ミクロペルオキシダーゼと結合したカルボニックアンヒド
ラーゼを示す。レーン５は、レーン２と同様に、（下から上へ）チトクロームＣ
単量体、二量体、三量体；チトクロームＣと結合したオボアルブミン；チトクロ
ームＣと結合した牛血清アルブミンを示す。
三量体を示す。レーン２は、レーン１と同様であるが、同等な強度のバンドにな
るようにオリゴマーを分離し混合した後のものを示す。レーン３は、ミクロペル
オキシダーゼと結合したリゾチームで、（下から上へ）単量体、二量体、三量体
を示す。レーン４は、ミクロペルオキシダーゼと結合したカルボニックアンヒド
ラーゼを示す。レーン５は、レーン２と同様に、（下から上へ）チトクロームＣ
単量体、二量体、三量体；チトクロームＣと結合したオボアルブミン；チトクロ
ームＣと結合した牛血清アルブミンを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ
，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，
ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ
Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ
，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，
ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ
Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ
，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，
ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 チアビーニ，アンニバーレ
イタリア国イー−67100 ラクイラ，ヴィ
ア・カムポ・ディ・ピレ，ドムペ・ソチエ
タ・ペル・アツィオーニ
(72)発明者 ディ・チョッチョ，ヴィトー
イタリア国イー−67100 ラクイラ，ヴィ
ア・カムポ・ディ・ピレ，ドムペ・ソチエ
タ・ペル・アツィオーニ
Ｆターム(参考） 2G045 BB01 BB05 BB14 BB46 BB50
BB51 FB01 FB03 FB05
4B063 QA01 QQ22 QR64 QS02
Claims (12)
- 【請求項１】 同一又は異なっていてもよい２つあるいはそれ以上の（ポリ
）ペプチドの架橋剤による結合を含み、（ポリ）ペプチドのうちの少なくとも１
つはペルオキシダーゼ活性を有する、ウェスタンブロット用分子量標準物質の製
造方法。 - 【請求項２】 分子量に応じた結合産物の分離をさらに含む、請求項１に記
載の製造方法。 - 【請求項３】 ペルオキシダーゼ活性を有する（ポリ）ペプチドが、ヘムタ
ンパク質／ペプチドから成る群から選択される請求項１〜２に記載の製造方法。 - 【請求項４】 ペルオキシダーゼ活性を有する該（ポリ）ペプチドが、チト
クロームＣ、ミクロペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ及び西洋ワサビ
ペルオキシダーゼの群から選択される請求項３に記載の製造方法。 - 【請求項５】 ペルオキシダーゼ活性を有しないタンパク質が、リゾチーム
、カルボニックアンヒドラーゼ、オボアルブミン及び血清アルブミンの群から選
択される請求項１〜２に記載の製造方法。 - 【請求項６】 架橋剤が不可逆的二官能性架橋剤から選択される請求項１〜
５のいずれか１項に記載の製造方法。 - 【請求項７】 請求項１〜６の方法により得ることのできるウェスタンブロ
ット用分子量標準物質。 - 【請求項８】 チトクロームＣ結合体、ミクロペルオキシダーゼ及びリゾチ
ームの結合体、カルボニックアンヒドラーゼ及びミクロペルオキシダーゼの結合
体、チトクロームＣ及びオボアルブミンの結合体、チトクロームＣ及び血清アル
ブミンの結合体から成る群から選択される請求項７に記載の分子量標準物質。 - 【請求項９】 個別の容器中に、ペルオキシダーゼ活性を有する（ポリ）ペ
プチド及び架橋剤、並びに任意にペルオキシダーゼ活性を有しないタンパク質及
びインキュベーション用緩衝液を含む、請求項７及び８に記載の分子量標準物質
の製造用キット。 - 【請求項１０】 ウェスタンブロット用分子量標準物質を製造するためのペ
ルオキシダーゼ活性を有する（ポリ）ペプチドの使用。 - 【請求項１１】 ペルオキシダーゼ活性を有する該（ポリ）ペプチドがヘム
（ポリ）ペプチドから選択される請求項１０に記載の使用。 - 【請求項１２】 酵素標識が必要な技法における、ペルオキシダーゼ活性を
有する小サイズ（ポリ）ペプチドのタンパク質マーカーとしての使用。
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