ITMI20000552A1 - Markers di massa molecolare per westner blot - Google Patents
Markers di massa molecolare per westner blot Download PDFInfo
- Publication number
- ITMI20000552A1 ITMI20000552A1 IT2000MI000552A ITMI20000552A ITMI20000552A1 IT MI20000552 A1 ITMI20000552 A1 IT MI20000552A1 IT 2000MI000552 A IT2000MI000552 A IT 2000MI000552A IT MI20000552 A ITMI20000552 A IT MI20000552A IT MI20000552 A1 ITMI20000552 A1 IT MI20000552A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- peroxidase activity
- poly
- molecular mass
- cytochrome
- peptide
- Prior art date
Links
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 claims description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 31
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 claims description 23
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 claims description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 18
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 17
- 108010029942 microperoxidase Proteins 0.000 claims description 14
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 9
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 8
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 8
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 8
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 8
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 8
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 claims description 7
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 6
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 6
- 150000003278 haem Chemical group 0.000 claims description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000045576 Lactoperoxidases Human genes 0.000 claims description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 3
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 abstract 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- LNQHREYHFRFJAU-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) pentanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O LNQHREYHFRFJAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 2
- 102000008015 Hemeproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010089792 Hemeproteins Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Lubricants (AREA)
- Thermal Transfer Or Thermal Recording In General (AREA)
- Non-Silver Salt Photosensitive Materials And Non-Silver Salt Photography (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Paints Or Removers (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo:
"MARKERS DI MASSA MOLECOLARE PER WESTERN BLOT ’
La presente invenzione riguarda in generale le tecniche di separazione e visualizzazione di proteine mediante elettroforesi e western blot. Più in particolare, viene qui fornito un metodo per ottenere markers di peso molecolare (standard) impiegabili nel western blot.
STATO DELLA TECNICA
Dall’introduzione della tecnica del western blot gli anticorpi radiomarcati sono stati progressivamente sostituiti dagli anticorpi coniugati con enzimi, che risultavano di maggiore maneggevolezza e richiedevano tempi di rivelazione più brevi. Attualmente, i più comuni metodi di rivelazione di proteine in western blot sono basati sull’uso di coniugati con perossidasi (anticorpi, proteina A o G, avidina, streptavidina, e altri), la cui attività enzimatica è rivelata mediante appropriati substrati, quali cromogeni o chemioluminescenti.
Nella comune pratica di laboratorio, i markers di peso molecolare {standard) utilizzati in western blot, dopo trasferimento su membrana e colorazione, vengono segnati con una matita per avere l’esatta migrazione delle bande corrispondenti. Tale accorgimento viene adottato anche quando si utilizzano standard precolorati, dato che al termine della procedura di western blot si può avere un’alterazione dei colori o una decolorazione e conseguente scomparsa o difficoltà di individuazione di alcune bande sulla membrana. Inoltre, quando si usano metodi chemioluminescenti, la migrazione degli standard deve essere ulteriormente segnata sulla pellicola autoradiografica, introducendo un’ulteriore possibilità di imprecisione.
Esistono standard di peso molecolare direttamente rivelabili sulla membrana, ma richiedono condizioni o trattamenti particolari. Per esempio, gli standard coniugati con biotina sono rivelabili solo in sistemi biotina-(strept)avidina. E’ reperibile in commercio (Santa Cruz Biotechnology, U.S.A.) un set di standard che condividono un epitopo comune, rivelabile con un anticorpo specifico miscelato con la soluzione deH’anticorpo secondario. Questo metodo, tuttavia, comporta l’acquisto dello standard e dell’anticorpo secondario presso un unico fornitore. Non sono disponibili standard rivelabili mediante l’attività enzimatica della perossidasi direttamente sulla membrana utilizzata per il western blot.
Sono stati descritti (Dorward D.W., 1993, Anal. Biochem. 209:219; Vargas C. et al., 1993, Anal. Biochem. 209:323) metodi per la rivelazione di proteine che possiedono un gruppo eme dopo SDS-PAGE e trasferimento su filtro di nitrocellulosa, impiegando substrati della perossidasi, sia cromogeni che chemioluminescenti. Inoltre, esistono in commercio (Sigma, U.S.A., catalogo A9392, H2757, H2507, P8906) standard per elettroforesi ottenuti mediante la polimerizzazione di una proteina che genera una serie discreta di omopolimeri.
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE
Si è ora trovato che l’attività perossidasica può essere mantenuta e almeno in parte stabilizzata contro la denaturazione dopo la coniugazione di due o più proteine con attività perossidasica o di proteine aventi attività perossidasica con altre proteine prive di attività perossidasica. Ciò ha consentito la preparazione di standard di massa molecolare che possono essere direttamente rivelati sulla membrana utilizzata per il western blot mediante reazione con un opportuno substrato della perossidasi.
Pertanto, l’invenzione fornisce un metodo per la preparazione di standard di massa molecolare per uso in western blot, che comprende la coniugazione di due o più (poli)peptidi uguali o diversi, di cui almeno uno avente attività perossidasica, mediante un cross-linker, ed, eventualmente, la successiva separazione dei prodotti di coniugazione in modo da coprire l’intervallo di masse molecolari desiderato.
Con il termine coniugazione si intende l’unione di due o più (poli)peptidi per interposizione di un opportuno composto (cross-linker) in grado di legare covalentemente i due (poli)peptidi. Tali cross-linker possono essere scelti dal gruppo comprendente tutti i cross-linker bifunzionali irreversibili. Preferibilmente viene utilizzato il disuccinimidilsuberato (DSS) o il suo analogo idrosolubile disuccinimidilglutarato (DSG).
Con “proteine ad attività perossidasica” vengono preferibilmente indicate le proteine o i (poli)peptidi recanti un gruppo eme. Citocromo c, microperossidasi, lattoperossidasi e perossidasi di rafano sono esempi non limitanti di proteine ad attività perossidasica impiegabili secondo l’invenzione. Come “proteina priva di attività perossidasica” può invece essere utilizzata qualsiasi proteina non-eme di massa molecolare nota che abbia una migrazione costante e riproducibile nelle diverse condizioni adottate per l’elettroforesi, e che sia facilmente e stabilmente coniugabile con il cross-linker sopra specificato. Preferibilmente la proteina non-eme è scelta dal gruppo comprendente lisozima, anidrasi carbonica, ovalbumina e sieroalbumina.
La coniugazione può essere singola, nel senso che vengono unite due proteine uguali o diverse, o multipla, intendendo con ciò la possibilità che più di due proteine vengano variamente unite tra loro per interposizione dell’agente di cross-legame. La molteplicità della coniugazione può essere regolata variando le condizioni di reazione tra il cross-linker e la proteina o la miscela di diverse proteine, in particolare intervenendo sul tempo di reazione o sulla concentrazione dei reagenti. Al termine della reazione, si otterrà una miscela di prodotti con diversa molteplicità di coniugazione. Si è visto che i vari prodotti così ottenuti sono rappresentati in misura inversamente proporzionale alla loro massa molecolare. La miscela di prodotti può essere utilizzata come tale o separata nei suoi diversi componenti. In questo modo è possibile preparare standard che coprono vari intervalli di massa molecolare. Per una definizione più accurata della massa molecolare è possibile calibrare ogni preparazione mediante comparazione in SDS-PAGE e/o western blot o con uno standard commerciale o preparato in laboratorio con proteine di massa molecolare nota. Bisogna comunque tenere presente che la tecnica del western blot non è una tecnica analitica di determinazione della massa molecolare. Pertanto, possono essere impiegati standard la cui massa molecolare sia definita con una certa approssimazione, analogamente a quanto avviene con gli standard commerciali precolorati, in cui la coniugazione con la molecola cromofora porta ad un’alterazione della migrazione elettroforetica.
Gli standard, dopo separazione elettroforetica e trasferimento su membrana per western blot, possono essere rivelati direttamente sulla membrana per reazione con un substrato croniogeno o sulla pellicola autoradiografica quando si usi un substrato chemioluminescente. Quali esempi di substrati cromogeni e chemiluminescenti comunemente utilizzati, possono essere indicati: 4-cloro-l -naftolo e diaminobenzidina (cromogeni); ECL (Amersham), Supersignal (Pierce) e DuoLux (Vector) (chemioluminescenti). E’ preferibile, prima dell’utilizzo degli standard, fare una stima del loro peso molecolare apparente mediante calibrazione con standard commerciali, dal momento che il cross-linking può impedire la completa denaturazione delle proteine nelle condizioni adottate per l’SDS-PAGE, con conseguente imprevedibilità di migrazione. Inoltre, nel caso di prodotti di coniugazione tra diverse proteine, è preferibile che la proteina ad attività perossidasica abbia basso peso molecolare, in modo da aumentare il rapporto di coniugazione (perossidasi/proteina) e consentire una migliore rivelazione degli standard. Sono dunque preferite le microperossidasi, quali la microperossidasi MP-11, un peptide di 11 amminoacidi del citocromo c, o le microperossidasi MP-9 e MP-8, rispettivamente nona- o octapeptidiche, descritte in Plattner et al., 1977, Histochemistry 53:223-242, o in Harbury et al., 1960, J. Biol. Chem., 235:3649-3655, o ancora in Kraehenbuhl et al., 1974, J. Exp. Med., 139:208-223; inoltre possono essere utilizzate la MP-6 e la MP-17, rispettivamente di 6 e 17 amminoacidi (Spee et al, 1996, Eur. J. Biochem. 241:215-220). In generale è utilizzabile qualsiasi peptide, derivato da proteine ad attività perossidasica mediante proteolisi o sintesi, che mantenga l’attività enzimatica.
In generale si è visto che le preparazioni di standard di massa molecolare secondo l’invenzione sono stabili dopo trattamento in SDS-PAGE e western blot, anche se l’attività perossidasica viene meglio mantenuta in condizioni di leggera denaturazione e a una temperatura non eccessivamente alta.
Un ulteriore aspetto dell’invenzione riguarda un kit per la preparazione di standard di massa molecolare che comprende, in contenitori separati, la proteina/peptide ad attività perossidasica, il cross-linker ed, eventualmente, la proteina priva di attività perossidasica, il tampone di incubazione e il tampone di arresto della reazione. Quest’ultimo può essere un tampone di Tris o lisina, il tampone di lisina essendo maggiormente preferito, poiché consente una migliore interazione proteina-membrana.
L’efficacia di impiego di (poli)peptidi aventi attività perossidasica nella marcatura di proteine prive di questa attività consente la loro utilizzazione in sostituzione della marcatura con la più ingombrante molecola della perossidasi. Ad esempio, possono essere coniugati, in particolare con la microperossidasi, gli anticorpi secondari, l’avidina o la streptavidina impiegati comunemente in western blot, E.L.I.S.A, immunocitochimica e immunoistochimica. Il coniugato che ne deriva potrà avere una dimensione sensibilmente ridotta e/o un maggior numero di molecole marcatrici, aumentando in generale la propria efficienza.
Pertanto, secondo un ultimo aspetto, l’invenzione riguarda l’uso di prodotti di coniugazione con (poli)peptidi di taglia ridotta aventi attività perossidasica, preferibilmente citocromo C e microperossidasi, nelle tecniche che richiedono una marcatura enzimatica.
DESCRIZIONE DELLA FIGURA
corsia 1 : (dal basso all’alto) citocromo c monomero, dimero e trimero;
corsia 2: come in corsia 1, dopo separazione e rimescolamento degli oligomeri per dare bande di intensità paragonabile;
corsia 3: lisozima coniugato con microperossidasi (dal basso verso l’alto) monomero, dimero, trimero;
corsia 4: anidrasi carbonica coniugata con microperossidasi; corsia 5: (dal basso verso l’alto) citocromo c monomero, dimero e trimero come in corsia 2; ovalbumina coniugata con citocromo c; sieralbumina bovina coniugata con citocromo-c.
Gli esempi che seguono illustrano l’invenzione in maggior dettaglio.
ESEMPI ESEMPIO 1 : intervallo tra ~ 13 e 40 kDa (oligomeri di citocromo c) Materiale: 20 mg citocromo c
tampone A: 10 mM NaP; pH 7,4, 150 mM NaCl
tampone B: 1M DL-lisina in tampone A
tampone C: 40 mM Tris-Cl pH 7,4, 300 mM NaCl
soluzione D: 20 mM DSS in dimetilsulfossido (preparare estemporaneamente).
1. Disciogliere il citocromo c in 0,18 ML di tampone A.
2. Aggiungere 0,02 mi della soluzione D.
3. Lasciare in agitazione per Ih a temperatura ambiente.
4. Aggiungere 0,02 mi di tampone B.
Se si desidera ottenere un set con bande aventi la stessa intensità, proseguire con i punti successivi, altrimenti saltare direttamente al punto 7. 5. Caricare su colonna Superdex 75 (10 x 300 mm) o una colonna delle stesse caratteristiche, equilibrata e eluita in tampone C al flusso di 0,5 ml/min, raccogliendo separatamente i picchi eluiti.
6. Rimescolare ciascun picco in misura inversamente proporzionale all’area del picco cromatografico.
7. Aliquotare e congelare a temperatura inferiore a -20°C.
ESEMPIO 2: intervallo tra ~ 60 e 130 kDa (coniugati con citocromo c)
Materiale: 1 mg citocromo c
3,3 mg ovalbumina
10 mg sieralbumina bovina
tampone A: 10 mM NaPj pH 7,4, 150 mM NaCl
tampone B: 1M DL-lisina in tampone A
soluzione D: 20 mM DSS in dimetilsulfossido (preparare
estemporaneamente).
1) Disciogliere il citocromo c in 1 mi di tampone A.
2) Disciogliere l’ovalbumina in 0,8 mi di tampone A e aggiungere 0,1 mi della soluzione di cui al punto 1.
3) Disciogliere la sieralbumina bovina in 0,8 mi di tampone A e aggiungere 0,1 mi della soluzione di cui al punto 1.
4) Aggiungere 0,1 mi della soluzione D alle soluzioni preparate ai punti 2 e 3.
5) Lasciare le soluzioni di cui al punto 4 in agitazione per 1 h a temperatura ambiente.
6) Aggiungere 0,1 mi di tampone B.
7) Aliquotare e congelare a temperatura inferiore a -20° C.
ESEMPIO 3: intervallo tra ~ 15 e 45 kDa (coniugati con microperossidasi MP-11)
Materiale: 1 mg microperossidasi MP-1 1
10 mg lisozima
5 mg anidrasi carbonica
tampone A: 10 mM NaP; pH 7,4 , 150 mM NaCl
tampone B: 1M DL-lisina in tampone A
soluzione D: 20 mM DSS in dimetilsulfossido (preparare estemporaneamente) .
1. Disciogliere la microperossidasi in 1 mi di tampone A.
2. Disciogliere il lisozima in 0,8 mi di tampone A e aggiungere 0,1 mi della soluzione di cui al punto 1 .
3. Disciogliere l’anidrasi carbonica in 0,8 mi di tampone A e aggiungere 0,1 mi della soluzione di cui al punto 1.
4. Aggiungere 0,1 mi della soluzione D alle soluzioni preparate ai punti 2 e 3.
5. Lasciare le soluzioni di cui al punto 4 in agitazione per 1 h a temperatura ambiente.
6. Aggiungere 0,1 mi di tampone B.
7. Aliquotare e congelare a temperatura inferiore a - 20°C.
ESEMPIO 4- Western Blot
Campioni in duplicato di citocromo c non coniugato, perossidasi di rafano, lattoperossidasi, e di proteine coniugate (sia con citocromo c che con MP-11) sono stati miscelati con tampone riducente di Laemmli: il primo duplicato è stato scaldato per 5 min a 95°C, il secondo a 40°C, poi i campioni sono stati fatti correre in parallelo con Broad Molecular Weight Markers (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.) in 15% mini-SDS-PAGE secondo procedura standard. Dopo la corsa, il gel è stato trasferito su fogli di nitrocellulosa di 0,45 pm in cella “semi-dry”. Le membrane sono state lavate con 20 mM Tris-HC1 pH 7,4, 150 mM NaCl (TBS), bloccate 1 h in 3% (w/v) albumina di siero bovino in TBS (BT), poi incubate in BT contenente 0,05% (v/v) Tween-20 per 2 ore oppure per una notte per simulare le diverse procedure di Western Blot. Dopo lavaggio in TBS contenente 0,25% Tween-20 e ulteriori lavaggi in TBS, l attività perossidasica è stata rivelata.
Il citocromo c è stato inoltre trattato con DSS senza aggiunta di proteine, sottoposto a gel-filtrazione su colonna Superdex 75 (1x30 cm) (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Svezia), equilibrata ed eluita in 40 mM Tris-HCl pH 7,4, 300 mM NaCl, con un flusso di 0,5 ml/min: i picchi eluiti sono stati raccolti separatamente.
Si è visto che i coniugati di citocromo c e MP- 11 conservano attività perossidasica al termine della procedura di western blot , come riassunto in Tabella 1A-B. Si è visto anche che le proteine ad attività perossidasica, non sottoposte a coniugazione, risultavano più sensibili al trattamento ad alta temperatura, che riduceva drasticamente la loro attività enzimatica; infatti, è da ritenersi che il trattamento con il cross-linker stabilizzi la struttura della proteina contro la denaturazione.
TABELLA 1
A. Coniugati di citocromo C
B. coniugati di microperossidosi MP-11
Quando il citocromo c veniva trattato con il cross-linker, si producevano tre oligomeri (Figura, corsie I e 2) che venivano facilmente separati per gel filtrazione. La mobilità elettroforetica suggerisce la loro identificazione come monomeri, dimeri e trimeri (Tabella 2).
La quantità di ciascun coniugato e degli oligomeri di citocromo c è stata regolata in modo da rendere il più possibile omogenea l’intensità di segnale di ciascuna banda. Dalla miscelazione delle tre specie citocromo c, ovalbumina- e sieroalbumina-citocromo c, si è ottenuta una valida serie di marcatori di massa molecolare (Figura, corsia 5). La coniugazione di MP-11 a lisozima generava tre specie di oligomeri di lisozima, tutti coniugati di MP-11 (Tabella 1B e Figura, corsia 3), monomeri, dimeri e trimeri (Tabella 2). La coniugazione di MP-1 1 alla anidrasi carbonica generava una singola banda (corsia 4).
TABELLA 2
Claims (12)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la preparazione di markers di massa molecolare per western blot che comprende la coniugazione di due o più (poli)peptidi uguali o diversi, di cui almeno uno avente attività perossidasica, mediante un cross-linker.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, comprendente inoltre la separazione dei prodotti di coniugazione in base alle loro masse molecolari.
- 3. Metodo secondo le rivendicazioni 1-2, in cui il (poli)peptide con attività perossidasica è scelto dal gruppo delle proteine/peptidi contenenti un gruppo eme.
- 4. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui detto (poli)peptide con attività perossidasica è scelto tra citocromo c, microperossidasi, lattoperossidasi e perossidasi di rafano.
- 5. Metodo secondo le rivendicazioni 1-2, in cui la proteina non avente attività perossidasica è scelta tra lisozima, anidrasi carbonica, ovalbumina e sieralbumina.
- 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il cross linker è scelto tra quelli bifunzionali irreversibili.
- 7. Markers di massa molecolare per western blot ottenibili con il metodo delie rivendicazioni 1-6.
- 8. Markers di massa molecolare secondo la rivendicazione 7, scelti dal gruppo comprendente: coniugato di citocromo c, coniugato di microperossidasi e lisozima, coniugato di anidrasi carbonica e microperossidasi, coniugato di citocromo c e ovalbumina, coniugato di citocromo c e sieralbumina.
- 9. Kit per la preparazione dei markers di massa molecolare delle rivendicazioni 7 e 8, che comprende, in contenitori separati, il (poli)peptide ad attività perossidasica e il cross-linker, ed eventualmente la proteina priva di attività perossidasica e il tampone di incubazione.
- 10. Uso di un (poli)peptide ad attività perossidasica per la preparazione di un marker di massa molecolare per western blot.
- 11. Uso secondo la rivendicazione 10, dove detto (poli)peptide ad attività perossidasica è scelto tra i (poli)peptidi contenenti un gruppo eme.
- 12. Uso di prodotti di coniugazione di (poli)peptidi di taglia ridotta aventi attività perossidasica nelle tecniche che richiedono una marcatura enzimatica.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT2000MI000552A IT1318400B1 (it) | 2000-03-17 | 2000-03-17 | Markers di massa molecolare per westner blot. |
| US10/221,854 US20050064537A1 (en) | 2000-03-17 | 2001-03-15 | Molecular weight markers for western blot |
| AU2001252202A AU2001252202A1 (en) | 2000-03-17 | 2001-03-15 | Molecular weight markers for western blot |
| CA002399112A CA2399112A1 (en) | 2000-03-17 | 2001-03-15 | Molecular weight markers for western blot |
| EP01925453A EP1264184B1 (en) | 2000-03-17 | 2001-03-15 | Molecular weight markers for western blot |
| DE60116481T DE60116481D1 (de) | 2000-03-17 | 2001-03-15 | Molekulargewichtsmarker für western blot |
| PCT/EP2001/002890 WO2001068899A2 (en) | 2000-03-17 | 2001-03-15 | Molecular weight markers for western blot |
| JP2001567380A JP2003526799A (ja) | 2000-03-17 | 2001-03-15 | ウェスタンブロット用分子量マーカー |
| AT01925453T ATE315232T1 (de) | 2000-03-17 | 2001-03-15 | Molekulargewichtsmarker für western blot |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT2000MI000552A IT1318400B1 (it) | 2000-03-17 | 2000-03-17 | Markers di massa molecolare per westner blot. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITMI20000552A0 ITMI20000552A0 (it) | 2000-03-17 |
| ITMI20000552A1 true ITMI20000552A1 (it) | 2001-09-17 |
| IT1318400B1 IT1318400B1 (it) | 2003-08-25 |
Family
ID=11444498
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT2000MI000552A IT1318400B1 (it) | 2000-03-17 | 2000-03-17 | Markers di massa molecolare per westner blot. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050064537A1 (it) |
| EP (1) | EP1264184B1 (it) |
| JP (1) | JP2003526799A (it) |
| AT (1) | ATE315232T1 (it) |
| AU (1) | AU2001252202A1 (it) |
| CA (1) | CA2399112A1 (it) |
| DE (1) | DE60116481D1 (it) |
| IT (1) | IT1318400B1 (it) |
| WO (1) | WO2001068899A2 (it) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITGE20060047A1 (it) * | 2006-04-21 | 2007-10-22 | Ccmi Cashmere & Camel Hair Man | Metodo per la determinazione della composizione di fibre tessili. |
| CA2959427A1 (en) * | 2014-09-19 | 2016-03-24 | Li-Cor, Inc. | Multifunctional protein molecular weight ladders |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL51668A (en) * | 1977-03-16 | 1981-12-31 | Israel State | Analytical method for the quantitative determination of immunogens and antibodies and a kit therefor |
| US4328312A (en) * | 1979-04-11 | 1982-05-04 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Process for production of peroxidase |
| DE19729248C1 (de) * | 1997-07-09 | 1998-07-09 | Jochen Uhlenkueken | Standardprotein |
-
2000
- 2000-03-17 IT IT2000MI000552A patent/IT1318400B1/it active
-
2001
- 2001-03-15 AU AU2001252202A patent/AU2001252202A1/en not_active Abandoned
- 2001-03-15 EP EP01925453A patent/EP1264184B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-15 CA CA002399112A patent/CA2399112A1/en not_active Abandoned
- 2001-03-15 AT AT01925453T patent/ATE315232T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-03-15 JP JP2001567380A patent/JP2003526799A/ja active Pending
- 2001-03-15 DE DE60116481T patent/DE60116481D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-15 WO PCT/EP2001/002890 patent/WO2001068899A2/en active IP Right Grant
- 2001-03-15 US US10/221,854 patent/US20050064537A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60116481D1 (de) | 2006-03-30 |
| ITMI20000552A0 (it) | 2000-03-17 |
| CA2399112A1 (en) | 2001-09-20 |
| EP1264184B1 (en) | 2006-01-04 |
| ATE315232T1 (de) | 2006-02-15 |
| AU2001252202A1 (en) | 2001-09-24 |
| JP2003526799A (ja) | 2003-09-09 |
| WO2001068899A2 (en) | 2001-09-20 |
| IT1318400B1 (it) | 2003-08-25 |
| WO2001068899A3 (en) | 2002-02-21 |
| EP1264184A2 (en) | 2002-12-11 |
| US20050064537A1 (en) | 2005-03-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wilson et al. | Beef‐Liver 5‐Aminolevulinic Acid Dehydratase: Purification and Properties | |
| Murphy et al. | Clathrin assembly protein AP-3: The identity of the 155K protein, AP 180, and NP185 and demonstration of a clathrin binding domain | |
| Mekalanos et al. | Enzymic activity of cholera toxin. I. New method of assay and the mechanism of ADP-ribosyl transfer. | |
| Sakurai et al. | Mammalian α-Keto Acid Dehydrogenase Complexes: VI. NATURE OF THE MULTIPLE FORMS OF PIG HEART LIPOAMIDE DEHYDROGENASE | |
| Kurstak | Enzyme immunodiagnosis | |
| DK261386A (da) | Monoklonale antistoffer | |
| Bayer et al. | Selective labeling of sulfhydryls and disulfides on blot transfers using avidin-biotin technology: studies on purified proteins and erythrocyte membranes | |
| EP0076695A1 (en) | Fluorescent conjugates for analysis of molecules and cells | |
| CA2328805A1 (en) | Enzyme-protein complex | |
| Klugerman | Chemical and physical variables affecting the properties of fluorescein isothiocyanate and its protein conjugates | |
| JP2002542820A5 (it) | ||
| ITMI20000552A1 (it) | Markers di massa molecolare per westner blot | |
| Burkin et al. | Hapten modification approach for switching immunoassay specificity from selective to generic | |
| JPH03175360A (ja) | 薬剤スクリーニングアッセイ | |
| Retzios et al. | Effects of chemical modifications on the surface-and protein-binding properties of the light chain of human high molecular weight kininogen. | |
| Palmer et al. | Cysteine-specific radioiodination of proteins with fluorescein maleimide | |
| JPH03255959A (ja) | ポリマー | |
| Lin et al. | Purification and partial characterization of a preneoplastic antigen in liver carcinogenesis | |
| SUGIYAMA et al. | Multiplicity of sulfobromophthalein-binding proteins in Y-fraction from rat liver | |
| JPH01101900A (ja) | ハイブリダイゼーシヨン反応を行うための方法および試薬 | |
| Elliott Jr et al. | Free sulfhydryl groups of rabbit secretory IgA. | |
| Wofsy et al. | Affinity labeling of equine anti-β-lactoside antibodies | |
| Bayer et al. | Avidin–Biotin Technology: Preparation of Biotinylated Probes | |
| Winkelhake et al. | Complement C1q binding affects spin-labeled heterosaccharides of rabbit antibodies in immune but not artificial immunoglobulin G aggregates. | |
| AU601674B2 (en) | A method for determining a ligand |