JP2003520118A - 電気パルス発振によりコロニー化された水流束からレジオネラ菌を除去する方法、電気パルス発振による水流束の処理方法、及びレジオネラ菌除去へのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、１kV/cm未満の強度をもつパルス電界を適用することによって、細胞によりコロニー化された水流束を処理するための方法に関する。本発明は同様に、レジオネラ菌除去における前記方法の使用及びレジオネラ菌駆除方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、パルス電界を流束に適用することによる、レジオネラ菌によってコ
ロニー化された水流束の処理方法、ならびに電気パルス発振による水流束の処理
方法とレジオネラ菌の除去に対するその使用に関する。

【０００２】 レジオネラ菌は「在郷軍人病」と呼ばれる潜在的に重度の肺疾患及び「ポンテ
ィアック熱」と呼ばれる良性インフルエンザ症候群の原因となるグラム陰性悍菌
である。フランスでは、在郷軍人病の年間症例数が３０００件と推定されており
、そのうち４００〜５００件は、国立基準局によって実際に計数化されている。

【０００３】 これらの細菌は、水性媒質中、そしてより容易には温度が３０℃〜４０℃の間
にある場合に増殖し、５０℃を超えるとその生存はむずかしくなる。汚染は、特
に衛生用温水の利用つまり基本的にはシャワーを浴びる際に及び空調設備を介し
てこれらの細菌を含む微小水滴を吸収することにより介入しうる。この場合、細
菌を輸送する可能性があるのは、（外気の取込み位置の不良といったような機能
不良の場合を除いて）空調された建物の内部に吹き込まれる空気ではなく、むし
ろ一般に建物の屋根の上にある空気冷却塔から出る流出物である。

【０００４】 死亡率が１０％にも達しうるこの病気は、特により容易に病気を発症し得る弱
った人々がいる病院において、及び従来の手段により水を処理できない温泉施設
において、予防上の困難な問題を提起している。

【０００５】 在郷軍人病の症例が診断された場合、管轄の公共機関は汚染源を探し求める。
結果が陽性である場合には、衛生用温水システムの例をとると、湯わかし器温度
を複数段階にわたり上昇させ（７０℃）それに続けて問題の回路を絶縁した後に
配管及び水栓類を「洗い流すこと」を含む設備の除染に着手しなければならない
。高い遊離塩素残留レベルでの塩素処理も同じく、個別に又は最初の技術と結び
つけた形で行なうことができる。残念なことに、大部分のケースにおいて、「連
続的」処理が欠如していることから、その後数週間以内でシステムは再度コロニ
ー化されることになる。

【０００６】 やけどの危険性や塩素の毒性作用といった有害な二次的効果をひき起こすこと
なく効率良くこれらの細菌を破壊する能力をもち、しかも有利な経済的条件下で
常時機能することのできる方法及び設備に対するニーズが存在している。

【０００７】 細胞に対し電界を適用することが知られている：細胞を電界の中に置いた場合
、電界線は細胞によって偏向され、このため細胞の表面には電荷の蓄積が誘発さ
れる。かくして生来の差ΔΨ₀に重ね合わされる誘導された膜内外電位差ΔＶが
結果としてもたらされる〔Bernhardt及びPauly H.（１９７３）；（２）〕。

【０００８】 方形波動特性をもつ電界及び懸濁状態の球形細胞の場合に選択される最も完全
な公式は、以下のようなものである〔Sale A.J.H.及びHamilton W.A.（１９６７
）：（１８）、Tsong T.Y.及びcoll（１９７６）：（２４）、Kinosita K.及びT
song T.Y.（１９７７ａ）（９）〕； ΔＶ_t＝ｆｇ（λ）ｒＥ_tcosθ（１−ｅ^-t/τp）

【０００９】 時間ｔにおいて点Ｍで誘導されたこの電位差の式は、以下のものの関数である
： Ｅ_t： 時間ｔで適用された電界の強度 ｆ： 細胞の形状係数（球の場合１．５） ｇ(λ)： 膜透過性λの係数 ｒ： 細胞の半径 θ： 巨視的電界ベクトルと膜の平面に対する流線の間の、考慮対象点Ｍにおけ
る角度、 τ_p： 膜容量の充電時間（マイクロセカンド規模） ｔ： 電界適用時間である。

【００１０】 パルス時間が、膜の充電時間よりもきわめて長い（ｔ≫τ_p）場合、項（１−
ｅ^-t/τp）は１にきわめて近くなるか又は、このとき静止状態で次のような古典
的公式化が再び見い出される： ΔＶ_t＝ｆｇ（λ）ｒＥ_t cosθ

【００１１】 cosθでの項は、一定の与えられた電界値について、この電位差の振幅が細胞
のどの点においても同一でないということを表わしている。これは、電極（極）
に対面する点で最大であり、細胞表面に沿って減少して赤道で相殺される。

【００１２】 電界により生成されるこの電位差は、休止電位差ΔΨ₀に付加される。その結
果、合成電位差ΔＶ_rが得られる。 ΔＶ_r＝ΔΨ₀＋ΔＶ

【００１３】 陽極に対面して存在する細胞半球レベルで、電界効果のベクトル性を考慮に入
れるため、ΔΨ₀及びΔＶの数値は加算され、こうして膜の過分極がひき起こさ
れる。逆に、陰極に対面して存在する半球のレベルでは、ΔΨ₀とΔＶの数値は
互いに差し引き合い、膜は脱分極を受ける。

【００１４】 この合成膜電位差が、２００〜２５０mVと推定された閾値〔Teissie' 及び Ts
ong(１９８１)：（２０）〕を上回った場合、透過化現象が誘導される〔Neumann
E. 及び Rosenheck K.（１９７２）：（１３）、Kinoshita K.及びTsong T.Y.
：（１０）（１９７７ｂ）〕。

【００１５】 この膜透過性の原因である膜構造は、今のところ未知であり、好ましくは過渡
的透過化構造（ＳＴＰ）という語が用いられ、これは通常「孔」という語で表現
される。

【００１６】 徹底的で特別な電気パルス発振条件下では、電気透過化は、特に微生物の場合
において細胞の死枯つまり電気大量死を導く不可逆的現象である〔Hamilton及び
Sale（１９６７）：（５）、Sale 及び Hamilton（１９６７）：（１８）、Huls
hegerら(１９８１)：（６）、(１９８３)：（７）、Mizuno及びHori,（１９８８
）：（１２）、Kekez ら（１９９６）；（８）、Grahi及びMarkl,（１９９６）
：（４）〕。この特性は、細胞により自然に排出されない問題の代謝産物を回収
するべく細胞を溶解するためか又は、環境内（消毒）又は食物流体内（熱によら
ない滅菌）にある細胞を撲滅するため利用されてきた〔Knorr ら（１９９４）：
（１１）、Qin ら（１９９６）：（１５）、Qin ら（１９９８）：（１６）〕。

【００１７】 電気的大量死は電気パルス発振の直後（短期大量死）或いは又より長期で発生
しうる。

【００１８】 特に固定床で細胞培養にパルス電界を適用することが知られている。〔Sale及
びHamilton（１９６７）：（１８）〕。

【００１９】 これらの条件下では、細胞の感受性が特に電極の性質及び幾何形状ならびに利
用される電気的条件（電界強度、パルス数、その形状及び持続時間）及び媒質の
組成によって左右されることがわかっている。

【００２０】 処理される体積に応じて２つのパルス発振システムが存在する。すなわち電極
の寸法に応じて小体積しか処理できない、バッチとも呼ばれる固定床パルス発振
システム及びフロー状態の細胞懸濁液を処理できるようにする流束パルス発振シ
ステムである。フロープロセスについては、２つの戦略、すなわち連続的流束及
び逐次的流束が可能である。逐次的流束のモデルにおいては、パルス発振チャン
バは充てんされ、流束は停止され、その後電界が適用され、次にチャンバが空に
される。

【００２１】 この逐次的流束モデルは、接触が誘電泳動を媒介して行なわれる電気融合作業
のために開発されたものである。Bates ら（１９８３）；（１）（Zachrisson及
びBornman,（１９８４）：（２５））。

【００２２】 流束システムの利点は、大きな体積を処理できるという点にある。

【００２３】 通常、フローに対して垂直な電界を伴う流束システム〔Teissie ら（１９８８
）：（２２）、Teissie 及び Rols,（１９８８）：（２１）、Sixou 及び Teiss
ie.(１９９０)：（１９）、（Teissie ら, １９９２）：（２３）、Rois ら（１
９９２）：（１７）、 Bruggemann ら(１９９５)：（３）、Qin ら(１９９６)：
（１５）〕、不均一であるものの同じくフローに対して垂直な同軸電極を伴うシ
ステム（Qin ら（１９９６）：（１５）、Qin ら(１９９８）：（１６）〕が利
用される。

【００２４】 フロー状態で処理される流束については、パルスは方形波又は指数関数減衰（
容量性放電）パルスであり得る〔Qin ら（１９９４）：１４〕。

【００２５】 発明者は今回、処理すべき水性媒質の体積が大量である場合でさえ、上述の欠
点（塩素処理、再コロニー化、やけどの危険性、経済的制約）を補正する、コロ
ニー化された媒質流束に対しパルス電界を適用することによるコロニー化された
媒質の処理方法を完成させた。

【００２６】 かくして、本発明の第１の目的に従うと、本発明は、１kV/cm未満の振幅（強
度とも呼ばれる）をもつパルス電界を適用することにより細胞によってコロニー
化された水流束を処理する方法に関する。細胞に適用されるパルス発振の数はお
よそ１〜２００であってよい。好ましくは、適用されるパルス発振数は約４０〜
２００である。

【００２７】 本発明は同様に、レジオネラ菌除去に対する該方法の使用にも関する。

【００２８】 本発明のもう１つの目的に従うと、本発明は、レジオネラ菌によりコロニー化
された水流束を１kV/cm未満の強度のパルス電界に付すことを特徴とする、レジ
オネラ菌駆除方法にも関する。細胞に適用されるパルス発振数は、およそ１〜２
００である。

【００２９】 かくして、電気パルス発振によりレジオネラ菌の完全撲滅を達成することがで
きる。結果は、適用される電界の低い強度を利用して得られる。

【００３０】 本発明は、添付図面及び以下に詳述する説明を見ることでより良く理解できる
だろう。

【００３１】 本発明によるコロニー化された流束というのは、特に冷却回路、給水２次回路
特に空調システム回路といったようなレジオネラ菌を含みうるか又は含んでいる
あらゆる家庭、天然又は工業用の水性媒質、そして一般的には、レジオネラ菌が
生育、生存又は増殖する可能性のあるあらゆる媒質を意味している。

【００３２】 本発明の方法は、図１に概略化されている設備に従った連続的流束式設備の中
で使用される。コロニー化された水性媒質流束は、タンク１から例えばぜん動ポ
ンプ２を用いて、それにパルス電界が加えられる電気パルス発振チャンバ３に向
かって導かれ、次に処理の後、出口４に向かって導かれ、この出口は、閉回路の
場合には脱コロニー化された流束を再循環させ、又消費可能な流束（衛生用高温
水）の場合には脱コロニー化された流束を廃棄し、かつ／又は分析の終りで脱コ
ロニー化された流束を収集する。図１にある図式上の回路の要素を結ぶ管を表わ
している。

【００３３】 本発明に従って利用可能な電気パルス発振チャンバ及び発生装置は既知のもの
であり、処理すべき流束の体積に適合させられている。同様に、各々付随する発
生装置を伴う並列に設置された電気パルス発振チャンバを考慮することもできる
。本発明の方法を実施するためには、約４０〜６０Hz、特に約５０Hzの周波数を
利用することができる。

【００３４】 連続的流束の変形形態としては、逐次的流束を考慮することができるが、それ
でも連続的流束への適用が好ましい。なお、フローに対しほぼ垂直な電界の適用
を利用することができるものの、特にフローに対しほぼ平行といったその他の向
きを考慮することも可能である。本発明の方法は、均一な又は不均一な電界で利
用することができる。

【００３５】 パルス形状の点から見ると、方形波を利用できるが、特に三角波、台形、指数
関数減衰又は正弦状といったその他のプロフィールも考慮できる。プロフィール
の選択は、特に電界強度、パルス持続時間及びパルスの数といったその他の変数
によって左右される可能性がある。好ましくは方形波が利用される。

【００３６】 本発明に従ったパルスは１〜２０ms好ましくは約１０msの持続時間をもち得る
。

【００３７】 例 細菌 実験の際に利用される細菌懸濁液は、ペトリ皿上のコロニーから直接調製され
る。懸濁液は、ＯＤ _(650nm)≒０．１（≒細菌２×１０⁸個／mlに対応する）を
得るような形で調製される。実験は、環境から単離されたか又は医療施設内で採
取されたL.pneumophila について実施される。

【００３８】 発生装置 この研究で利用された発生装置（Jouan, France)は、負の極性の方形波状動特
性をもつパルスを発生する。パルスの持続時間は０．５μs〜２４msの間で変動
でき、利用周波数は内部パイロット式制御で０．１〜１０Hzであり、外部パイロ
ット式制御では制限されている。装置により送り出される電圧は、最大１５００
ボルト（８アンペア）である。交流電流を再現する目的で、電圧発生器の出力端
には極性転換器を接続することができる。

【００３９】 実験用設定 この設定は、必要とされる安全条件下で作業するべく積層流束フードの内部に
配置される。流量調節は、ぜん動ポンプによって行なわれ、０〜２４ml／分の間
で流束を調整することが可能となる。

【００４０】 電気パルス発振チャンバ（１×ｈ×Ｌ＝０．２×０．２×２cm）は８０μlの
容積をもつ。電極の長さは２cmであることから、流量は、細胞がその通過中にｎ
回のパルスに付されるような形で調整される。

【００４１】 バッチで 流束での結果は、バッチでの予備作業の後で得られた。得られたデータにより
、細菌の完全死亡率及び商業的利用と相容性ある必要出力を得るべく電気パラメ
ータを最適化することが可能になった。パルス間の短かい遅延について観察され
たより致死的な効果から、配電網のもの（５０Hz）とおよそ同じ周波数を優れた
効率で利用することを考慮することができる。

【００４２】 流束での細胞死亡率は、より大きいパルスの数で適用されるより低い振幅を選
択することによって最適化される。

【００４３】 流束で 結果は、流束にて電気パルス発振されたレジオネラ菌の感受性が、予め「バッ
チ」で決定されたものとほぼ同じであることを示している。

【００４４】 パルスの数の倍増は、図２を見ればわかるように、適用された電界の振幅に応
じて２〜１０倍の細胞死亡率増加をひき起こす。

【００４５】 第２段階では、電気パルス発振は全て５０Hzの周波数で実施される。利用され
る振幅の範囲（１００〜５００v/cm）は、先行する実験に比べ著しく減少した。
その結果、適用されるパルスの数は増加した（最高連続２００パルスまで）。

【００４６】 実験は、１００％の細胞死亡率を与える電気条件を決定する目的で行なわれた
。

【００４７】

【表１】

【００４８】 上表１は、さまざまな振幅の方形波パルスを可変的回数で適用した後に得られ
る生存百分率を示している。各欄は、一定の与えられた電界振幅及び増大するパ
ルスの数についての生存状態の推移を示している。行を読取ると、増大する振幅
で適用された一定の与えられた回数のパルスについての細胞の生存状態が得られ
る。

【００４９】 テスト対象の条件範囲内には、低い振幅の多数のパルスか又はより強いがより
少ない回数のパルスという、完全死亡率をひき起こすさまざまな対（振幅／持続
時間）を見い出すことができる。最高の実験条件を決定するために、これらのさ
まざまな電気パルス発振の際に介入させられるエネルギーを計算した。

【００５０】 実験的体積（８０μl）内に介入させられるエネルギーは、以下の式に従って
計算された： Ｗ＝Ｖ・Ｃ・Ｅ²・Ｔｐ（ジュール単位） なお式中、Ｖ＝標本体積（８×１０^-8m³） Ｃ＝標本のコンダクタンス（０．０２ジーメンス／m） Ｅ＝電界の振幅（ボルト／m単位） Ｔｐ＝ｎを変数、ｔ＝１０msとした、電気パルス発振の持続時間（ｎ×ｔ）
（秒単位）

【００５１】 必要な電気出力は以下の式から計算される： Ｐ＝Ｗ／Ｔｔ（ワット単位）。なおＴｔ＝標本の合計処理時間（秒単位）で
ある。

【００５２】 Ｔｐ（パルス発振持続時間）とＴｔ（処理持続時間）の間の差は、電流の振幅
が０に等しい遅延により分離されたパルス利用に起因するものである。

【００５３】 パルス持続時間 ｔ＝１０ms（０．０１ｓ）について５０Hzで、１回のパルス
数に関してＴｐ＝ｎ×０．０１ｓ及びＴｔ＝ｎ×０．０２秒となる。

【００５４】

【表２】

【００５５】

【表３】

【００５６】 表２ａ及び２ｂは、細菌懸濁液の電気処理のために介入させられるエネルギー
と出力を示す。１欄〜４欄は、電界値及び適用パルス数の値ならびに計算中間値
Ｔｐ及びＥ²を示す。５欄及び６欄は、８０μlの細菌溶液を処理するのに必要な
エネルギー（Ｗ）及び出力（Ｐ）に対応する。７欄は、各実験条件について、１
立法メートルの懸濁液の処理に必要なエネルギーを示している。

【００５７】 これら２つの表の中で、パルス発振された体積８０μlを分析することにより
、１００％の細胞死亡率をひき起こすために適用すべきエネルギーの形での限界
を観察することかできる。この所要最小エネルギーは、８０μlについて１．２
８Ｊつまり１６０００kJ/m³である。完全死亡率をひき起こさない最大エネルギ
ーは、テストされた条件において１２８００kJ/m³である。

【００５８】 商業的利用に対するこの方法の応用の可能性を見極めるべく、最後の表中で得
られたエネルギー計算に従って、エネルギーコストの見積りが実施された。

【００５９】 利用された計算は以下の通りである： すなわち、出力Ｐは、Ｐ＝（ｗ×処理すべきm³）／秒単位の処理時間で求めら
れ、エネルギー＝Ｐ×時単位の処理時間（時間単位）である。

【００６０】 現在の研究作業状態では、レジオネラ菌の完全撲滅のためのエネルギーコスト
予測は、１６０００kJ/m³つまり３００リットルの湯沸しについて１．３３kWhで
ある。処理が５時間で行なわれる場合、必要な出力は２７０ワットとなる。

【００６１】 かくして、これらの表中に示された条件でそれぞれ９０〜９９％（表２ａ）及
び１００％（表２ｂ）の細胞死亡率を予測することができる。

【００６２】

【表４】

【００６３】

【表５】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の方法を実施するための設備の図式を表わす。

【図２】 パルス数を倍増した場合の電界強度の効果の研究結果を表わす。

【符号の説明】

１ タンク ２ ぜん動ポンプ ３ 電気パルス発振チャンバ ４ 出口

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カバン，ピエール−アンドレ・ルネ フランス国、エフ−75018 パリ、リュ・ オルドネ 63 (72)発明者 テシィ，ジュスタン フランス国、エフ−31520 ラモンヴィ ル・サンターニュ、リュ・シニョレ ５ Ｆターム(参考） 4B063 QA06 QQ06 QR90 QX04 4D061 DA01 DA05 DB01 EA13 EB01 EB02 EB07 EB39 GC02

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 パルス電界を適用することによる、レジオネラ菌によりコロ
   ニー化された水流束の処理方法。
2. 【請求項２】 適用された電界の強度が約１kV/cmであることを特徴とする
   請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 細胞に適用されるパルスの数がおよそ１〜２００であること
   を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. 【請求項４】 水流束が天然、家庭又は工業用の水流束であることを特徴と
   する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 流束が連続的又は逐次的であることを特徴とする請求項１〜
   ４のいずれか１項に記載の方法。
6. 【請求項６】 流束が連続的であることを特徴とする請求項１〜５のいずれ
   か１項に記載の方法。
7. 【請求項７】 電界が流束に対してほぼ垂直であることを特徴とする請求項
   １〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 【請求項８】 電界が流束に対してほぼ平行であることを特徴とする請求項
   １〜６のいずれか１項に記載の方法。
9. 【請求項９】 パルスが４０〜６０Hzの周波数により送り出されることを特
   徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 【請求項１０】 パルスが１〜２０ms、好ましくは約１０msの持続時間をも
    つことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 【請求項１１】 パルスが方形波、三角波、台形パルス、指数関数減衰パル
    ス又は正弦形パルスの形態であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１
    項に記載の方法。
12. 【請求項１２】 パルスが方形波パルスであることを特徴とする請求項１〜
    １１のいずれか１項に記載の方法。
13. 【請求項１３】 パルス電界が均一であることを特徴とする請求項１〜１２
    のいずれか１項に記載の方法。
14. 【請求項１４】 適用された電界が１００v/cmを上回る値を有することを特
    徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 【請求項１５】 パルスが単極性又は両極性パルスであることを特徴とする
    請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 【請求項１６】 パルスが単極性であることを特徴とする請求項１〜１５の
    いずれか１項に記載の方法。
17. 【請求項１７】 コロニー化された水流束中のレジオネラ菌を駆除する方法
    において、レジオネラ菌によりコロニー化された水流束をパルス電界に付すこと
    を特徴とする方法。
18. 【請求項１８】 適用された電界の強度が約１kV/cm未満であることを特徴
    とする請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 パルスの数がおよそ１〜２００であることを特徴とする請
    求項１７又は１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 水流束が天然、家庭又は工業用の水流束であることを特徴
    とする請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 【請求項２１】 水流束が連続的又は逐次的であることを特徴とする請求項
    １７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 【請求項２２】 レジオネラ菌を除去するための、請求項１〜１６のいずれ
    か１項に記載の方法。