ES2218145T3 - Procedimiento de eliminacion de las legionella de un flujo acuoso colonizado por electropulsacion. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de tratamiento de un flujo acuoso colonizado por Legionella por aplicación de un campo eléctrico pulsado, siendo los impulsos suministrados a una frecuencia de 40 a 60 Hz.

Description

Procedimiento de eliminación de las Legionella de un flujo acuoso colonizado por electropulsación.

La presente invención se refiere a un procedimiento de tratamiento de un flujo acuoso colonizado por Legionella por la aplicación al flujo de un campo eléctrico pulsado, así como un procedimiento de tratamiento de un flujo acuoso por electropulsación y su aplicación en la eliminación de Legionella.

Las Legionella son unos bacilos Gram negativo que están en el origen de una neumopatía potencialmente grave denominada "enfermedad de los legionarios" y de un síndrome gripal benigno denominado "fiebre de Pontiac". Se estima en 3.000 el número de casos anuales de enfermedad de los legionarios en Francia, de los cuales de 400 a 500 son realmente contabilizados por el Centro Nacional de Referencia.

Estas bacterias se multiplican en unos medios hídricos y más fácilmente cuando la temperatura se sitúa entre 30 y 40ºC, resultando su supervivencia difícil por encima de 50ºC. La contaminación puede ocurrir por inhalación de las microgotas de agua que contienen estas bacterias, en particular cuando tiene lugar la utilización del agua caliente sanitaria, esencialmente la toma de ducha y por medio de una instalación de climatización. En este caso, no es tanto el aire inspirado en el interior de un inmueble climatizado el que podrá transportar la bacteria (salvo en caso de mal funcionamiento como la mala posición de la toma de aire exterior), sino la mezcla que sale de la torre aéreo refrigerante, situada en general en el tejado del inmueble.

Con un porcentaje de mortalidad que puede alcanzar el 10%, esta enfermedad plantea un difícil problema de prevención, en particular en el hospital donde se encuentran personas frágiles que podrán desarrollar más fácilmente la enfermedad, y en los establecimientos termales, en los que el agua no puede ser tratada por los medios clásicos.

Cuando se diagnostica un caso de enfermedad de los legionarios, los servicios competentes investigan la fuente contaminante. En caso de respuesta positiva, es preciso proceder a una descontaminación de la instalación que comprende, tomando el ejemplo de los sistemas de agua caliente sanitaria, varias etapas de subidas de temperatura del calentador de agua (70ºC), seguidas de "aclarado" de las conducciones y griferías, después del aislamiento del circuito en cuestión. La cloración a altos niveles residuales de cloro libre puede también realizarse individualmente o en asociación con la primera técnica. Desgraciadamente, a falta de tratamiento "continuo", en la mayoría de los casos, se asiste a una recolonización del sistema en las semanas siguientes.

Existe la necesidad de un procedimiento y unas instalaciones capaces de destruir estas bacterias de forma eficaz, sin provocar ningún efecto secundario nefasto, como el riesgo de quemadura o los efectos tóxicos del cloro y que podría funcionar permanentemente en unas condiciones económicas favorables.

Es conocido aplicar un campo eléctrico a unas células; cuando se coloca una célula en un campo eléctrico, las líneas de campo son desviadas por ésta, lo que provoca una acumulación de las cargas en la superficie de la célula. Así, resulta una diferencia de potencial transmembranaria inducida \DeltaV que se superpone a la diferencia negativa \Delta\Psi_{o} [Bernhardt J. et Pauly H. (1973):(2)].

La fórmula más completa considerada en el caso de un campo con cinética en onda cuadrada y de una célula esférica en suspensión, es la siguiente [Sale A.J.H. et Hamilton W.A. (1967):(18); Tsong T.Y. et coll (1976):(24); Kinosita K. et Tsong T.Y. (1977a):(9)]:

\Delta V_{t} = fg(\lambda ) \ r \ E_{t} \ cos \ \theta \ (1-e^{-t/\tau p})

La expresión de esta diferencia de potencial inducida en un punto M en el tiempo t es función de:

E_{t}:	la intensidad del campo eléctrico aplicado en el tiempo t,
f:	el factor forma de la célula (1,5 en el caso de una esfera)
g(\lambda):	el factor de la permeabilidad membranaria \lambda,
r:	el radio de la célula,
\theta:	el ángulo entre el vector de campo eléctrico macroscópico y la normal al plano de la membrana en el
	punto considerado M,
\tau_{p}:	es el tiempo de carga de la capacidad membranaria (del orden del microsegundo),
t:	tiempo de aplicación del campo.

Cuando la duración de los impulsos es muy superior al tiempo de carga de la membrana (t>>\tau_{p}), el término (1-e^{-t/\tau p}) resulta muy próximo a 1, se encuentra entonces, en el estado estacionario la formulación clásica:

\Delta V_{t} = fg(\lambda ) \ r \ E_{t} \ cos \ \theta

El término en cos \theta indica que para un valor de campo dado, la amplitud de esta diferencia de potencial no es idéntica en cualquier punto de la célula. La misma es máxima en los puntos que están frente a los electrodos (polos) y disminuye a lo largo de la superficie celular para anularse en el ecuador.

Esta diferencia de potencial generada por el campo se añade a la diferencia de potencial de reposo \Delta\Psi_{o}. Resulta de ello una diferencia de potencial resultante \DeltaVr.

\Delta Vr = \Delta \Psi _{o}+ \Delta V

Al nivel del hemisferio celular situado frente al ánodo, los valores numéricos de \Delta\Psi_{o} y de \DeltaV se suman para tener en cuenta la vectorialidad del efecto del campo, lo que provoca una hiperpolarización de la membrana. En contrapartida, al nivel del hemisferio situado frente al cátodo, los valores numéricos de \Delta\Psi_{o} y de \DeltaV disminuyen y la membrana sufre una despolarización.

Cuando esta diferencia de potencial membranario resultante resulta superior a un valor umbral estimado en 200-250 mV [Teissié et Tsong (1981):(20)], tiene lugar la inducción de un fenómeno de permeabilización [Neumann E. et Rosenheck K. (1972):(13); Kinosita K. et Tsong T.Y.:[(10)(1977b)].

La estructura membranaria responsable de esta permeabilidad membranaria es desconocida hasta el presente, y se emplea preferentemente el término de estructura transitoria de permeabilización (STP), lo que se expresa de manera usual por el término de "poros".

En las condiciones de electropulsación particulares drásticas, la electropermeabilización es un fenómeno irreversible que conduce a la muerte celular o electromortalidad en particular en el caso de microorganismos [Hamilton et Sale (1967):(5); Sale et Hamilton (1967):(18): Hülsheger et al., (1981):(6), (1983):(7); Mizuno et Hori (1988):(12); Kekez et al. (1996):(8), Grahl et Märkl (1996):(4)]. Esta propiedad ha sido utilizada o bien para lisar unas células a fin de recuperar un metabolito de interés, no excretado naturalmente por la célula, o bien para erradicar unas células en el entorno (desinfección) o en los fluidos alimenticios (esterilización no térmica) [Knorr et al. (1994):(11); Qin et al. (1996):(15); Qin et al. (1998):(16)].

La electromortalidad puede tener lugar inmediatamente después de la electropulsación (mortalidad a corto plazo) o bien a más largo plazo.

Es conocido aplicar unos campos eléctricos pulsados en cultivos celulares, en particular en lecho fijo. [Sale et Hamilton (1967):(18)].

En estas condiciones, es conocido que la sensibilidad de las células depende en particular de la naturaleza y de la geometría de los electrodos, así como de las condiciones eléctricas utilizadas (intensidad del campo, número, forma y duración de los impulsos) y de la composición del medio.

Existen dos sistemas de pulsación según el volumen tratado: un sistema de pulsación con lecho fijo denominado también batch, que sólo permite tratar pequeños volúmenes según las dimensiones de los electrodos y un sistema de pulsación en flujo que permite tratar una suspensión celular en flujo. Para el proceso en flujo, son posibles dos estrategias: el flujo continuo y el flujo secuencial. En el segundo modelo, se lleva la cámara de pulsación, se interrumpe el flujo, se aplica a continuación el campo y después se vacía la cámara.

Este modelo en flujo secuencial ha sido desarrollado para unos trabajos de electrofusión en los que el contacto está mediado por dielectroforesis [Bates et al., (1983):(1) (Zachrisson and Bomman, (1984):(25)].

La ventaja del sistema en flujo es poder tratar volúmenes importantes.

Usualmente, se utilizan unos sistemas en flujo con un campo perpendicular al flujo [Teissié et al. (1988):(22); Teissié et Rols, (1988):(21), Sixou et Teissié (1990):(19) (Teissié et al., 1992):(23), Rols et al., (1992):(17); Bruggemann et al., (1995):(3); Qin et al. (1996):(15)], unos sistemas con unos electrodos coaxiales que proporcionan un campo no uniforme pero también perpendicular al flujo [Qin et al., (1996):(15) Qin et al., (1998):(16)].

Para unos flujos tratados en flujo, los impulsos pueden ser en ondas cuadradas o en declive exponencial (descarga capacitiva) Qin et al. (1994):14.

Los solicitantes han puesto a punto ahora un procedimiento de tratamiento de un medio colonizado, por aplicación de un campo eléctrico pulsado a un flujo de medio colonizado, que evita los inconvenientes anteriores (cloración, recolonización, riesgos de quemadura, esfuerzos económicos), incluso para grandes volúmenes de medio acuoso a tratar.

Así, según un primer objeto de la invención, ésta se refiere a un procedimiento de tratamiento de un flujo acuoso colonizado por unas células por aplicación de un campo eléctrico pulsado de amplitud, también denominada intensidad, inferior a 1kV/cm, siendo los impulsos suministrados a una frecuencia de 40 a 60 Hz. El número de pulsaciones aplicadas a la célula puede ser del orden de 1 a 200. Preferentemente, el número de pulsaciones aplicadas es del orden de 40 a 200.

La invención se refiere también a la aplicación del procedimiento para la eliminación de Legionella.

Según otro objeto de la invención, ésta se refiere a un procedimiento de destrucción de Legionella, caracterizado porque se somete un flujo acuoso colonizado por Legionella a un campo eléctrico pulsado de intensidad inferior a 1kV/cm, siendo los impulsos suministrados a una frecuencia de 40 a 60 Hz. El número de pulsaciones aplicadas a las células puede ser del orden de 1 a 200.

Así, se puede llegar a una erradicación total de la bacteria Legionella por electropulsación. Los resultados se obtienen utilizando pequeñas intensidades del campo aplicado.

La invención se pondrá más claramente de manifiesto a partir de las figuras anexas y la descripción detallada siguiente.

La figura 1 representa el esquema de una instalación de realización del procedimiento.

La figura 2 representa los resultados de un estudio del efecto de la intensidad del campo eléctrico cuando se dobla el número de impulsos.

Por flujo colonizado según la invención, se entiende cualquier medio acuoso doméstico, natural o industrial que puede comprender o que comprende Legionella en particular, como unos circuitos de refrigeración, unos circuitos secundarios de distribución de agua, en particular los circuitos de los sistemas de climatización y de manera general cualquier medio en el que Legionella es susceptible de vivir, sobrevivir o multiplicarse.

El procedimiento de la invención se realiza en unas instalaciones en flujo continuo de acuerdo con la instalación esquematizada en la figura 1. El flujo de medio acuoso colonizado es conducido a partir de un depósito 1, por ejemplo con la ayuda de una bomba peristáltica 2, hacia una cámara de electropulsación 3 donde le es aplicado el campo pulsado, y a continuación es conducido, después del tratamiento, hacia una salida 4 que recicla el flujo descolonizado, en el caso de un circuito cerrado, o que expulsa el flujo descolonizado, en el caso de un flujo consumible (agua caliente sanitaria), y/o que recoge el flujo descolonizado con fines de análisis. Los trazos continuos que unen los elementos del circuito en el esquema de la figura 1 representan unos tubos.

Las cámaras de electropulsación utilizables según la invención y los generadores son conocidos y están adaptados al volumen de los flujos a tratar. También se pueden prever unas cámaras de electropulsación instaladas en paralelo cada una con su generador asociado. Para realizar el procedimiento de la invención, se utilizan unas frecuencias del orden de 40 a 60 Hz, en particular de aproximadamente 50 Hz.

Como variante de los flujos continuos, se pueden prever unos flujos secuenciales, siendo preferida sin embargo la aplicación a unos flujos continuos. Por otra parte, se puede utilizar la aplicación de un campo sensiblemente perpendicular al flujo, pero se pueden prever otras orientaciones, en particular sensiblemente paralelo al flujo; el procedimiento de la presente invención puede ser realizado con un campo uniforme o no.

Desde el punto de vista de la forma de los impulsos, se pueden utilizar unas ondas cuadradas, pero se pueden prever otros perfiles, en particular unas ondas triangulares, en trapecio, en declive exponencial o de formas sinusoidales. La elección del perfil puede depender en particular de las otras modalidades que son la intensidad del campo, la duración de los impulsos y el número de impulsos. Preferentemente, se utilizan unas ondas cuadradas.

Los impulsos según la invención pueden tener una duración de 1 a 20 ms, preferentemente del orden de 10 ms.

Ejemplo Las bacterias

Las suspensiones bacterianas utilizadas cuando tienen lugar las experiencias se preparan directamente a partir de colonias en caja. La suspensión se realiza de manera que se obtenga un DO(_{650 \ nm}) \approx 0,1 (correspondiente a \approx 2x10^{8} bacterias/ml). Las experiencias se realizan en unas L. pneumophila aisladas del entorno o extraídas en medio hospitalario.

Los generadores

Los generadores utilizados en este estudio (Jouan, Francia) generan unos impulsos con cinética en onda cuadrada de polaridad negativa. La duración de los impulsos puede variar entre 0,5 \mus y 24 ms y la frecuencia de aplicación de 0,1 a 10 Hz en mando interno e ilimitada en mando externo. El voltaje suministrado por el aparato es de 1500 voltios máximo (8 amperios). Con el fin de reproducir una corriente alterna, se puede conectar un inversor de polaridad a la salida del generador de tensión.

El montaje experimental

Se ha colocado en el interior de una campana con flujo laminar a fin de trabajar en las condiciones de seguridad requeridas. La regulación del caudal se realiza por la bomba peristáltica y permite ajustar el flujo entre 0 y 24 ml/min.

La cámara de electropulsación (I x h x L = 0,2 x 0,2 x 2 cm) presenta un volumen de 80 \mul. Siendo la longitud de los electrodos de 2 cm, el caudal está ajustado de manera que las células sean sometidas a un número n de impulsos durante su paso.

En batch

Los resultados en flujo han sido obtenidos después de unos trabajos preliminares en batch. Los datos obtenidos han permitido prever la optimización de los parámetros eléctricos a fin de obtener una mortalidad total de las bacterias y una potencia necesaria compatible con una utilización comercial. El efecto más letal observado para unos plazos cortos entre los impulsos permite prever utilizar unas frecuencias del orden de la de la red (50 Hz) con una buena eficacia.

La mortalidad celular en flujo está optimizada por la elección de amplitudes más pequeñas aplicadas con un número de impulsos mayor.

En flujo

Los resultados muestran que la sensibilidad de las Legionella electropulsadas en flujo es del mismo orden que la determinada previamente en "batch".

El duplicar el número de impulsos provoca un aumento de la mortalidad celular en un factor de 2 a 10 según la amplitud de campo aplicada, como aparece en la figura 2.

En un segundo tiempo, todas las electropulsaciones son realizadas a una frecuencia de 50 Hz. La gama de amplitud utilizada (entre 100 y 500 V/cm) ha sido muy disminuida con respecto a las experiencias anteriores. En consecuencia, el número de impulsos aplicados ha sido aumentado (hasta 200 impulsos sucesivos).

Las experiencias han sido realizadas con el fin de determinar las condiciones eléctricas que proporcionan el 100% de mortalidad celular.

1

La tabla I anterior presenta el porcentaje de supervivencia obtenido después de la aplicación de un número variable de impulsos en ondas cuadradas en diversas amplitudes. Las columnas indican la evolución de la supervivencia para una amplitud de campo determinada y un número creciente de impulsos. La lectura en línea indica la supervivencia de las células para un número determinado de impulsos aplicados con unas amplitudes crecientes.

En la gama de las condiciones ensayadas, se pueden encontrar diferentes pares (amplitud/duración) que provocan una mortalidad total: o bien un gran número de impulsos de pequeña amplitud, o bien un número más pequeño de impulsos más intensos. A fin de determinar las mejores condiciones experimentales, se ha calculado la energía puesta en juego cuando tienen lugar estas diferentes electropulsaciones.

La energía utilizada en el volumen experimental (80 \mul) ha sido calculada según la fórmula siguiente:

W = V. C. E^{2} . \ TP (en Joules)

con

V = volumen de la muestra (8.10-8 m^{3})

C = conductancia de la muestra (0,02 Siemens/m)

E = amplitud del campo (en Voltios/m)

Tp = duración de la electropulsación (n x t) (en s) con n variable y t = 10 ms

La potencia eléctrica necesaria se calcula según la fórmula:

P = W/Tt \ (en \ vatios), con \ Tt = Tiempo de tratamiento total de la muestra (en s).

La diferencia entre Tp (la duración de pulsación) y Tt (la duración del tratamiento) se debe a la utilización de impulsos separados por unos plazos en los que la amplitud de la corriente es igual a 0.

A 50 Hz para una duración de impulso t = 10 ms (0,01 s), para un número de impulsos, se tiene Tp = n x 0,01 s y Tt = n x 0,02 s.

TABLA 2a

Condiciones que provocan del 90% al 99% de mortalidad
E(V/cm)	n	E^{2}(v/m)^{2}	n x T (s)	W(J)	P(Vatios)	W(kJ/m^{3})
100	120	1E+08	1,20	0,19	0,08	2400
100	160	1E+08	1,60	0,26	0,08	3200
100	200	1E+08	2,00	0,32	0,08	4000
200	40	4E+08	0,40	0,26	0,32	3200
200	120	4E+08	1,20	0,77	0,32	9600
200	160	4E+08	1,60	1,02	0,32	12800
300	40	9E+08	0,40	0,58	0,72	7200
400	20	1,6E+09	0,20	0,51	1,28	6400
400	40	1,6E+09	0,40	1,02	1,28	12800
500	10	2,5E+09	0,10	0,40	2,00	5000
500	20	2,5E+09	0,20	0,80	2,00	10000

TABLA 2b

Condiciones que provocan el 100% de mortalidad
E(V/cm)	n	E^{2}(v/m)^{2}	n x T (s)	W(J)	P(Vatios)	W(kJ/m^{3})
200	200	4E+08	2,00	1,28	0,32	16000
300	120	9E+08	1,20	1,73	0,72	21600
300	160	9E+08	1,60	2,30	0,72	28800
200	200	9E+08	2,00	2,88	0,72	36000
400	80	1,6E+08	0,80	2,05	1,28	25600
500	40	2,5E+08	0,40	1,60	2,00	20000

Las tablas 2a y 2b presentan la energía y la potencia utilizadas para el tratamiento eléctrico de una suspensión bacteriana. Las columnas 1 a 4 indican los valores de campo y del número de impulsos aplicados así como los intermedios de cálculo Tp y E^{2}. Las columnas 5 y 6 corresponden a la energía (W) y a la potencia (P) necesarias para tratar 80 \mul de solución bacteriana. La columna 7 indica, para cada condición experimental, la energía necesaria para el tratamiento de un metro cúbico de suspensión.

En estas dos tablas, el análisis para un volumen pulsado de 80 \mul permite observar un límite en términos de energía a aplicar para provocar el 100% de mortalidad celular. Esta energía mínima necesaria es de 1,28 J para 80 \mul o sea 16000 kJ/m^{3}. La energía máxima, que no provoca una mortalidad total, es de 12800 kJ/m^{3} en las condiciones ensayadas.

A fin de determinar la posibilidad de aplicación de este procedimiento en una utilización comercial, se ha realizado una estimación del coste de energía según los cálculos de energía obtenidos en la última tabla.

El cálculo utilizado es:

la potencia P está determinada por P = (W x m^{3} a tratar)/ tiempo de tratamiento

en segundos y la energía = P x tiempo de tratamiento en h.

En el estado actual de los trabajos, la previsión de coste en energía para la erradicación total de las Legionella es de 16000 kJ/m^{3} o sea 1,33 kWh para un calentador de 300 litros. Si el tratamiento se realiza en 5 horas, la potencia necesaria será de 270 Vatios.

Así, se puede prever una mortalidad del 90 al 99% (Tabla 2a), respectivamente 100% (Tabla 2b) en las condiciones presentadas en estas tablas.

Referencias

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Claims (16)

1. Procedimiento de tratamiento de un flujo acuoso colonizado por Legionella por aplicación de un campo eléctrico pulsado, siendo los impulsos suministrados a una frecuencia de 40 a 60 Hz.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la intensidad del campo eléctrico aplicado es inferior a aproximadamente 1 kV/cm.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el número de impulsos aplicados a la célula es del orden de 1 a 200.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el flujo acuoso es natural, doméstico o industrial.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el flujo es continuo o secuencial.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el flujo es continuo.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el campo es sensiblemente perpendicular al flujo.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el campo es sensiblemente paralelo al flujo.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los impulsos tienen una duración de 1 a 20 ms, preferentemente del orden de 10 ms.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque los impulsos son unas ondas cuadradas, unas ondas triangulares, en trapecio, en declive exponencial, o de formas sinusoidales.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque los impulsos son ondas cuadradas.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el campo eléctrico pulsado es uniforme.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el campo aplicado tiene un valor superior a 100 V/cm.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque los impulsos son unipolares o bipolares.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque los impulsos son unipolares.

16. Procedimiento de destrucción de Legionella en un flujo acuoso colonizado, en el cual se somete el flujo acuoso colonizado por Legionella a un campo eléctrico pulsado según el procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 15.