JP2003519183A

JP2003519183A - 心臓および動脈の石灰化を抑制する低用量ビスホスホネートの使用

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Publication number: JP2003519183A
Application number: JP2001549663A
Authority: JP
Inventors: ポール、エー．プライス、
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 2000-01-04
Filing date: 2001-01-02
Publication date: 2003-06-17
Also published as: US20030027211A1; CA2396393A1; WO2001049295A9; EP1267888A4; WO2001049295A1; EP1267888A1; US6812034B2; AU2756701A

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳類で軟部組織（例えば、動脈、心臓弁、アテローム性硬化症プラーク、癌、腎臓、前立腺、皮膚、筋肉、軟骨、内臓および心筋）の石灰化を抑制する方法を提供する。本方法は、哺乳類（例えば、軟部組織の石灰化を特徴とする病態を有すると診断された哺乳類またはその危険性を有すると診断された哺乳類）で、破骨細胞による骨吸収を抑制することを包含する。該抑制は、好ましくはビスホスホネートを、骨の鉱物強化を抑制することなく骨吸収を抑制するのに十分な濃度で哺乳類に投与することによる。本発明の方法は、哺乳類のアテローム性硬化症の症状を緩和するのにも用いることができる。そのような方法は、哺乳類で破骨細胞による骨吸収を抑制することを包含する。好ましい実施態様では、該抑制は、骨の鉱物強化を抑制することなく骨吸収を抑制するのに十分な濃度でビスホスホネートを哺乳類に投与することによる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願に対するクロス・リファレンス該当なし連邦政府支援下の研究開発で為された発明の権利に関する言及該当なし

【０００２】発明の分野本発明は、軟部組織の石灰化の調節物質に関する。特に本発明は、骨吸収の抑
制は軟部組織の石灰化も抑制する、という発見に関する。

【０００３】発明の背景ビスホスホネートは1９世紀の中頃から化学者に知られており、 1８６５年に
はドイツで最初の合成が行われた（Menschutkin(1865) Ann．Chem. Pharm. 133:
317-320）。ビスホスホネートは工業的に、主に腐蝕防止剤として、または織物
、肥料および油製造工業で錯化剤として用いられた。ポリリン酸塩と同様に、炭
酸カルシウムの沈殿を防止するその能力により歯石予防に用いられた（Blomen(1
995) 111-124p., Bijvoet OLM et al., eds. Bisphosphonate on Bones, Elsevi
er, Amsterdam）。

【０００４】より最近では、ビスホスホネートは、骨、歯およびカルシウム代謝の種々の疾
患で使用する薬剤として開発されている。ビスホスホネートは、これまでに知ら
れている２つの基礎的な生物学的作用、すなわち高用量投与時の石灰化の抑制お
よび骨吸収抑制を有する。ビスホスホネートは、in vivoで異所性石灰化を効果的に抑制することが示さ
れた。従って、とりわけビスホスホネートは、非経口的および経口的に投与され
たとき実験的に誘発した多くの軟部組織の石灰化を防止する（Fleisch et al.,(
1970) Eur. J. Clin. Invest., 1:12-18; Rosenblum et al.,(1977) Calcif. Ti
ssue Res., 23:151-159）。非経口的に投与されたときにのみ作用するピロホス
フェートとは対照的に、ビスホスホネートは経口的に投与されたとき活性である
。ビスホスホネートはまた、種々のマトリックスから局所的に放出されたとき活
性を有することが示された（Levy et al.,(1985) Science, 228:190-192; Golom
b et al.,(1986) J. Cntr. Rel., 4:181-194）。さらに、局所投与は歯石形成を
減少させることができる（Briner et al.,(1971) Int. Dent. J., 21:61-73）。
この作用は、ビスホスホネートを歯磨きペーストに添加することによりヒトで歯
石形成を防止するために用いられた。さらにまた、ある種のビスホスホネートは
、全身投与したとき（Plasmans et al.,(1978) Clin. Orthop., 132:233-243）
または局所投与したとき（Ahrengart and Lindgren (1986) J. Orthop., Res. 4
:18-26）異所性骨形成を抑制する。

【０００５】ビスホスホネートのうちでエチドロネートは、異所性石灰化および骨形成の予
防にヒトで用いられてきた。石灰化に関しては残念ながら、結果は失望させるも
のであった。強皮症、皮膚筋炎、汎発性石灰沈着症のような症状でも、結果は確
定的ではないというのが精一杯のところであった（Fleisch (1988) 440-466p.,
R.F. Baker (ed), Handbook of Experimental Pharmacology, Springer-Verlag,
N.Y.）。尿石症では、有効であると考えられる用量は、正常な骨の鉱物強化(mi
neralization)が抑制される量であった（Baumann et al.,(1978) Clin. Sci. Mo
l. Med., 54:509-516）。他の報告もまた、ビスホスホネートの異所性骨形成に
対する作用、特に進行性骨化性線維形成異常（Reiner et al.,(1980) 237-241p.
, A. Caniggia (ed), Etidronate. Instituto Gentili, Pisa）、並びに脊髄損
傷、頭部外傷、総股関節部交換後の骨形成（Slooff et al.,(1974) Acta Orthop
. Belg. 40:820-828; Finerman and Stover (1981) Metab. Bone Dis. Relat. R
es., 4:337-342; Thomas and Amstutz (1985) J. Bone Joint Surg. (Am)67:400
-403）に対する作用を記載している。前記のような研究は、ビスホスホネートが
軟部組織の石灰化を抑制する量に近い用量で投与されたとき、ビスホスホネート
を用いて種々のタイプの石灰化を臨床的に抑制することができるかもしれないと
いう期待を与えたが、一方、ビスホスホネートは正常な石灰化組織（例えば骨お
よび軟骨）の鉱物強化を低下させ（King et al.,(1971) Clin. Orthop., 78:251
-270; Schenk et al., (1973) Calcif. Tissue Res., 11:196-214; Flora et al
.,(1980) Metab. Bone Dis. Rel. Res., 2:389-407）、さらにより大量で投与し
たときは象げ質（Larsson (1974) Calcif. Tiss. Res., 16:109-127）、エナメ
ル質（Ogawa (1980) Jpn. J. Oral. Biol., 22:199-226; Weile et al.,(1990)
Arch. Oral Biol., 22:199-226）、およびセメント質（Alatli and Hammarstom
(1996) Acta Odontol. Scand., 54:59-65）の鉱物強化を低下させた。

【０００６】さらに、種々のビスホスホネートの骨吸収における個々の活性はそれぞれ大い
に異なるが、鉱物強化の抑制については大きな相違はない。殆どのビスホスホネ
ートについて、1日の有効投与量は、非経口的に投与するときは１ｋｇにつき５
−２０ｍｇのオーダーのリン化合物であると考えられており、このことは、ビス
ホスホネートが高用量で通常のメカニズムを介して石灰化を抑制することを示唆
している。従って、ビスホスホネートは、ヒトまたは他の哺乳類に投与したとき骨吸収を
抑制することが判明したが、異所性石灰化を抑制するのに十分に高用量と考えら
れる量で投与したときの正常な骨の石灰化を抑制する傾向は、異所性石灰化の治
療でビスホスホネートを治療的に使用することを妨げた。

【０００７】発明の概要本発明は、異所性石灰化および種々の動脈硬化症（例えばアテローム性動脈硬
化症）の治療に新規なアプローチを提供する。本発明の方法は、骨吸収を抑制す
る薬剤は異所性石灰化および／または動脈硬化症に附随するプラーク形成および
関連する病態(pathology)も抑制するであろうという発見を一部前提としている
。特定の理論に拘束されるものではないが、骨吸収の過程で、可溶化されたカル
シウム（例えば、リン酸カルシウム／タンパク質複合体として）は血液に運ばれ
、血液により前記カルシウムは骨から遠く離れた部位へ移動し、そこで異所性石
灰化またはアテローム性硬化症プラーク形成のための核形成複合体として作用す
るか、および／または既存のカルシウム沈積物の形成に寄与すると考えられてい
る。

【０００８】様々な薬剤、特にビスホスホネートは、骨の石灰化の抑制が認められる用量よ
りもはるかに少ない用量で骨吸収をしばしば抑制することができる。骨吸収に対
する作用は生物学的／細胞性メカニズムにより仲介され、骨の石灰化に対する作
用は物理化学的メカニズム（例えば、ヒドロキシアパタイトへの直接結合）によ
り仲介されると考えられていた。同様に、ビスホスホネートは、骨の鉱物強化を
抑制するために利用される物理化学的メカニズムと同じメカニズムによって異所
性石灰化を抑制することができると考えられていた。従って、高用量のビスホス
ホネートは異所性石灰化を抑制することができるが、このアプローチは骨の鉱物
強化に対する副作用のために治療的価値を殆ど有しないと考えられていた。

【０００９】異所性石灰化は骨吸収の抑制によって抑制できるという本発明の発見は、望ま
しくない石灰化に関連する病態を低用量（例えば、骨の鉱物強化に悪影響を及ぼ
さない用量）で治療することを可能にする。従って、本明細書に記載した発見か
ら、異所性石灰化の緩和および／または動脈硬化症プラーク形成の軽減のために
新規な治療様式が提供される。従って、ある実施態様では、本発明は、哺乳類の軟部組織（例えば、動脈、心
臓弁、アテローム性硬化症プラーク、癌、腎臓、前立腺、皮膚、筋肉、軟骨、内
臓および心筋）の石灰化を抑制する方法を提供する。前記の方法は、哺乳類（例
えば、軟部組織の石灰化を特徴とする病態を有するか、またはその危険性がある
と診断された哺乳類）において、破骨細胞による(osteoclastic)骨吸収を抑制す
ることを包含する。前記抑制は、好ましくは、ビスホスホネートを骨の鉱物強化
を抑制しないで骨吸収を抑制するのに十分な濃度で哺乳類に投与することによる
。好ましい実施態様では、（好ましくは同じアッセイで同じ信頼度で）ビスホス
ホネートは、骨の鉱物強化の有意な低下をもたらす濃度より少なくとも1０倍、
より好ましくは少なくとも1００倍、最も好ましくは少なくとも1０００倍低い濃
度で骨吸収の有意な低下をもたらす。ビスホスホネートは、（好ましくは同じア
ッセイで同じ信頼度で）骨の鉱物強化の有意な低下をもたらす濃度より少なくと
も1０倍、より好ましくは少なくとも1００倍、最も好ましくは少なくとも1００
０倍の用量で投与される。特に好ましいビスホスホネートには以下が含まれるが
、ただしこれらに限定されない：アレンドロネート、イバンドロネート、ゾール
ドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５３、ネリドロネ
ート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルドロネートおよび
クロドロネート。

【００１０】別の実施態様では、本発明は、軟部組織の石灰化を特徴とする病態を有するか
、またはその危険性があると診断された哺乳類で、軟部組織（例えば動脈、心臓
弁、アテローム性硬化症プラーク、癌、腎臓、前立腺、皮膚、筋肉、軟骨、内臓
および心筋）の石灰化を抑制する方法を提供する。前記の方法は、動物に低用量
のビスホスホネートを投与することを包含し、この場合、低用量とは、石灰化を
抑制するのに十分であるが、正常な骨の鉱物強化を抑制するビスホスホネートの
用量よりは少ない用量である。好ましいビスホスホネートおよび用量は上記のも
のを含む。ある実施態様では、このビスホスホネートは、検出可能な骨吸収の抑
制を生じる最低用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの投与量範囲で投与され
るアレンドロネートである。別の実施態様では、このビスホスホネートは、５ｍ
ｇから４０ｍｇ／日の範囲の経口投与量でヒトに投与されるアレンドロネートで
ある。さらに別の実施態様では、このビスホスホネートは、検出可能な骨吸収の
抑制をもたらす最低用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの投与量範囲で、好
ましくは１ｍｇ／日の静脈内投与量で投与されるイバンドロネートである。さら
にまた別の実施態様では、このビスホスホネートは、検出可能な骨吸収の抑制を
もたらす最低用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの投与量範囲で投与される
ゾールドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５３、ネリ
ドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルドロネート
またはクロドロネートである。好ましい投与態様には、経皮パッチ、経口投与、
静脈内注射、皮下注射および筋肉内注射が含まれるが、これらに限定されない。
ビスホスホネートは、予防的処置としてまたは治療的処置として投与できる。

【００１１】本発明はまた、軟部組織（例えば動脈、心臓弁、アテローム性硬化症プラーク
、癌、腎臓、前立腺、皮膚、筋肉、軟骨、内臓および心筋）の石灰化を伴う哺乳
類の症状を軽減する方法を提供する。本方法は、骨の石灰化を抑制しないで軟部
組織の石灰化を抑制するのに十分な低用量のビスホスホネートを哺乳類に投与す
ることを包含する。そのような疾患には以下が含まれるが、ただしこれらに限定
されない：アテローム性硬化症、動脈硬化症、細動脈硬化症、高血圧性細動脈硬
化症、メンケベルク動脈硬化症、心臓弁狭窄、尿毒症、糖尿病、上皮小体機能亢
進症、血塊形成、癌の増殖、癌転移、高血圧、ビタミンＤ中毒および関節炎。好
ましいビスホスホネートおよび投与量には、上記のビスホスホネート類および投
与量が含まれるが、これらに限定されない。前記哺乳類は、軟部組織の石灰化を
特徴とする病態(pathology)を有すると診断されたか、またはその危険性がある
と診断されたものであり得る。

【００１２】さらにまた別の実施態様では、本発明は、哺乳類で移植されたプロテーゼ装具
の石灰化を緩和する方法を提供する。前記方法は、骨の石灰化を抑制することな
く、プロテーゼ装具およびプロテーゼ装具の周囲の軟部組織の石灰化を抑制する
のに十分である低用量のビスホスホネートを哺乳類に投与することを含む。前記
プロテーゼ装具には心臓弁バイオプロテーゼおよび心臓弁の機械的プロテーゼが
含まれるが、これらに限定されない。プロテーゼ装具にはまた、ポリエーテルウ
レタンウレアを含む外科的インプラント、ポリエーテルウレタンを含む外科的イ
ンプラント、シリコンを含む外科的インプラント、動脈瘤の修復のために用いら
れる外科的整復材料が含まれるが、これらに限定されない。好ましいビスホスホ
ネートおよび投与量には、上記のビスホスホネート類および投与量が含まれるが
、これらに限定されない。

【００１３】本発明の方法は、哺乳類でアテローム性硬化症の症状の緩和にも用いることが
できる。前記の方法は、前記哺乳類で破骨細胞の骨吸収を抑制することを含む。
好ましい実施態様では、前記抑制は、骨の鉱物強化を抑制することなく、骨吸収
を抑制するのに十分である濃度で哺乳類にビスホスホネートを投与することによ
る。好ましい哺乳類には、アテローム性硬化症を持つと診断されたか、またはそ
の危険性があると診断された哺乳類が含まれるが、ただしこれらに限定されない
。好ましいビスホスホネート類および投与量には上記のビスホスホネート類およ
び投与量が含まれるが、これらに限定されない。ビスホスホネートは、予防的処
置としても治療的処置としても投与される。

【００１４】また別の実施態様では、哺乳類のアテローム性硬化症の症状および進行は、石
灰化部位でのマクロファージによる鉱物の除去を阻止することによって抑制され
る。好ましい実施態様では、前記抑制は、前記マクロファージによるカルシウム
の除去を阻止するのに十分な濃度でビスホスホネートを哺乳類に投与することを
含む。前記ビスホスホネートは、好ましくは石灰化部位以外の場所でのマクロフ
ァージを抑制しない濃度で投与される。好ましいビスホスホネート類および投与
量には上記のビスホスホネート類および投与量が含まれるが、これらに限定され
ない。本方法は予防的でもおよび／または治療的でもあり得る。

【００１５】軟部組織の石灰化に関連する病態を緩和するためのキットもまた提供される。
好ましいキットは、軟部組織の石灰化を抑制するビスホスホネートを骨の石灰化
を実質的に抑制しない用量で含む容器、および軟部組織の石灰化またはプロテー
ゼの石灰化に附随する病態の治療に前記ビスホスホネートの使用を教示する指示
物を含む。好ましいビスホスホネート類および投与量には上記のビスホスホネー
ト類および投与量が含まれるが、これらに限定されない。

【００１６】本発明は、水相中のカルシウムまたはカルシウム塩のサイズおよび／または結
晶構造を安定化させる方法も提供する。前記方法は、カルシウムまたはカルシウ
ム塩をフェツインと接触させることを包含する。安定化されたカルシウムは、予め選択した部位に石灰化イニシエーターを運搬
する方法を提供する。前記方法は、標的化分子（例えば、抗体、レクチン、核酸
など）に結合させたフェツイン−鉱物複合体を提供すること（ここで、標的化分
子は予め選択した部位に特異的に結合する）、およびフェツイン−鉱物複合体
を予め選択した部位と接触させることを包含する。

【００１７】さらに提供されるのは、マトリックス内に鉱物の核を分布させる方法である。
本方法は、フェツイン−鉱物複合体をマトリックス内に含浸すること、および鉱
物が前記フェツイン鉱物複合体から放出されるようにフェツインを変性させるこ
とを包含する。さらにフェツインは、水相中で鉱物塩のサイズまたは結晶構造を安定化させる
のに使用することができる。本方法は、前記鉱物塩をフェツインと接触させるこ
とを包含する。本発明は、フェツインとの複合体中で安定化された、実質的に単離された鉱物
塩（例えば、リン酸カルシウム）も提供する。

【００１８】本明細書に記載した方法に供される哺乳類には、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、
ネコ、ウマ、ウシ、げっ歯類、ブタおよびウサギが含まれるが、ただしこれらに
限定されない。従って、獣医学および医学への適用が意図される。特に好ましい実施態様では、本発明の方法で用いられるビスホスホネート類に
は、骨の鉱物強化を抑制する用量が骨吸収を抑制する用量に匹敵するかまたは等
しいビスホスホネートは含まれない。本発明の方法で用いられるビスホスホネー
ト類には、好ましくはエチドロネートは含まれない。

【００１９】定義ビスホスホネート（以前には誤ってジホスホネートと呼ばれていた）は、２つ
のＣ−Ｐ結合を特徴とする化合物である。前記２つの結合が同じ炭素原子に存在
する場合は、この化合物はジェミナル（geminal）ビスホスホネートと称され、
炭素原子の代わりに酸素を含むピロリン酸塩の類似体である（式Ｉ）。

【００２０】

【化１】

【００２１】文献では、これらの化合物は通常、ビスホスホネートと称されている。しかし
ながら、これは誤解を招くおそれがある。なぜならば、非ジェミナル・ビスホス
ホネートもまたビスホスホネートであるからである。従って、本明細書で用いら
れるように、ビスホスホネートはジェミナルおよび非ジェミナル・ビスホスホネ
ートの両方を含む。

【００２２】このＰ−Ｃ−Ｐ構造は、炭素上の２つの側鎖を変更するか、またはリン酸基を
エステル化するかのいずれかによって多数のバリエーションを可能にする。多く
のビスホスホネートが、それらの骨に対する作用についてヒトで調べられてきた
。骨疾患の治療のために多くのビスホスホネートが市販されている。これらには
以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：アレンドロネート（４−アミ
ノ−１−ヒドロキシブチリデン）ビス−ホスホネート）、クロドロネート（ジク
ロロメチレン）−ビス−ホスホネート、ＥＢ−１０５３（１−ヒドロキシ−３−
（１−ピロリジニル）−プロピリデン）ビス−ホスホネート、エチドロネート（
(１−ヒドロキシエチリリデン)−ビスホスホネート）、イバンドロネート（１−
ヒドロキシ−３−（メチルペンチルアミノ）プロピリデン）ビス−ホスホネート
）、インカドロネート（［（シクロヘプチルアミノ）−メチレン］ビス−ホスホ
ネート）、ネリドロネート（（６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン）ビス
−ホスホネート）、オルパドロネート（（３−ジメチルアミノ）−１−ヒドロキ
シプロピリデン）ビス−ホスホネート）、パルミドロネート（３−アミノ−１−
ヒドロキシプロピリデン）ビス−ホスホネート）、リセドロネート（１−ヒドロ
キシ−２−（３−ピリジニル）−エチリデン）ビス−ホスホネート）、チルドロ
ネート（［[（４−クロロフェニル）チオ）−メチレン］ビス−ホスホネート）
、ＹＨ５２９（［１−ヒドロキシ−２−イミダゾ−（１，２−ａ）ピリジン−３
−イルエチリデン］ビス−ホスホネート、およびゾールドロネート（１−ヒドロ
キシ−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）エチリデン）ビス−ホスホネート
）など。

【００２３】 “骨吸収”という用語は、石灰化した骨組織が、例えば破骨細胞の活性によっ
て骨から除去される過程を指す。骨吸収の増加は、骨量および／または骨密度の
低下をもたらす可能性がある（例えば、骨粗しょう症）。 “石灰化（calcification）”という用語は、組織中のカルシウムの沈積を指
す。カルシウムは、多様な形態で存在し得る（例えば、リン酸カルシウム、ヒド
ロキシアパタイト、炭酸アパタイト、非晶質リン酸カルシウムなど）。 “石灰化の抑制”または“カルシウム沈積の抑制”という語句は、軟部組織の
石灰化の速度および／または程度の減少を指す。この抑制は、完全抑制または部
分的抑制であり得る。測定可能な抑制はいずれも抑制とみなされる。好ましい抑
制は、石灰化の速度および／または程度の減少が統計的に有意なものである（例
えば、信頼度が９０％またはそれ以上、好ましくは９５％またはそれ以上、より
好ましくは９８％またはそれ以上、最も好ましくは９９％またはそれ以上）。

【００２４】 “骨の鉱物強化を抑制しないで”または“実質的な骨の鉱物強化を抑制するこ
となく”という語句は、薬剤が典型的には骨の鉱物強化に対して実質的な作用を
有しない用量で薬剤を使用することを意味する。好ましい実施態様では、それは
典型的には、骨鉱物強化の速度を１０％未満、より好ましくは１％未満、最も好
ましくは０．１％未満減少させる。より好ましくは、それは骨鉱物強化に対して
実質的に有意な作用を有しない（例えば、信頼度が９０％またはそれ以上、好ま
しくは９５％またはそれ以上、より好ましくは９８％またはそれ以上、最も好ま
しくは９９％またはそれ以上）。最も好ましい実施態様では、骨の鉱物強化に対
して検出可能な作用を有しない。

【００２５】詳細な説明Ｉ．ビスホスホネートと異所性石灰化本発明は、広く信じられてきたこととは反対に、骨の鉱物強化を抑制しない十
分に低い濃度でビスホスホネートを用いて、軟部組織の石灰化を阻止することが
できるという発見と関連がある。本発見の前には、ビスホスホネートは、同一の
物理化学的メカニズムを介して（例えば、核形成部位に結合し、結晶の成長を阻
止するなど）軟部組織の石灰化および骨の鉱物強化を抑制すると一般に考えられ
ていた。この考えが支持されたのは、部分的には、調べられた最初のビスホスホ
ネート（エチドネート）が骨の鉱物強化および軟部組織の石灰化をほぼ同じ高い
用量（約５ｍｇＰ／ｋｇ／日のエチドロネートの非経口的用量で、これは骨吸
収の抑制に必要なエチドネートの用量に匹敵する用量）で抑制するという観察に
よってであった。

【００２６】骨粗しょう症のような臨床的疾患の治療に骨吸収を特異的に抑制する物質を使
用することへの興味から、極めて多数のビスホスホネート類がその後合成され、
骨鉱物強化を抑制しない用量で骨吸収を抑制するその有効性について調べられた
。これらの研究によって、ビスホスホネートは骨吸収を抑制する濃度が非常に異
なることが明らかにされた。幾つかのビスホスホネートは、用量を規準にしてエ
チドロネートよりも１０００から１００００倍有効である。対照的に、より新し
いビスホスホネート類およびエチドロネートは、比較的高い用量で骨の鉱物強化
を抑制することが見出された（約５から２０ｍｇＰ／ｋｇ／日のビスホスホネ
ート非経口投与量）。より新しいビスホスホネートが骨吸収を抑制するために必
要な非常に低い有効用量と、同じビスホスホネートが骨鉱物強化を抑制するため
に必要な比較的高い用量との間の大きな差は、骨鉱物強化を抑制することなく骨
吸収を抑制するために用いることができるビスホスホネート用量について臨床医
に治療の大きな手段を提供した。

【００２７】本発見の前には、研究者らは全てのビスホスホネート類が骨の鉱物強化および
軟部組織の石灰化を同一の物理化学的メカニズムで抑制すると考え、結果として
両過程でより新しいビスホスホネートは比較的高用量を要求されると考えていた
（非経口的ビスホスホネート用量として約５から約２０ｍｇＰ／ｋｇ／日）と
我々は理解している。このような考えから、骨の鉱物強化を抑制することなく軟
部組織の石灰化を抑制する可能性があるか否かについて、新規なビスホスホネー
トを低用量で調べる研究者はいなかった。

【００２８】ビスホスホネートは、骨の石灰化を抑制するメカニズムとは基本的に異なるメ
カニズムによって、軟部組織の石灰化を抑制するらしいことが本発明で発見され
た。実施例１で示されるように、軟部組織の石灰化は骨吸収と共役しているらし
いことが本発明で発見された。従って、いずれのメカニズムによろうとも、骨吸
収の抑制は軟部組織の石灰化の抑制をもたらすであろう。特定の理論に拘束され
るものではないが、骨吸収過程はリン酸カルシウム複合体（例えば、リン酸カル
シウム／タンパク質複合体）を放出し、これは血中に入り、そこで核形成中心と
して作用し、骨から離れた或る部位（例えば、動脈壁、心臓弁など）で石灰化を
促進し得ると考えられる。

【００２９】上記を考慮して、骨吸収を抑制するのに十分であるビスホスホネート類（また
は他の薬剤）の用量は、軟部組織の石灰化もまた抑制するであろうということが
本発明で見出された。上記で示したように、ビスホスホネートは全てほぼ同じ用
量で骨の石灰化を抑制するが、骨吸収の抑制に必要とされる用量においてはビス
ホスホネート類で有意に異なる。骨吸収の抑制（従って、軟部組織の石灰化の抑
制）に必要とされるビスホスホネートの用量レベルが骨の石灰化の抑制に必要と
される用量レベルより低い場合、治療の手段が存在する。それは、ビスホスホネ
ートが実質的に骨の石灰化を抑制することなく軟部組織の石灰化を抑制する用量
の範囲である。

【００３０】従って、ある実施態様では、本発明は、哺乳類で軟部組織の石灰化を抑制する
方法を提供する。前記方法は、動物に低用量のビスホスホネートを投与すること
を含む。ここで、低用量とは、軟部組織の石灰化を抑制するのに十分であるが、
正常な骨の鉱物強化を抑制する前記ビスホスホネートの用量よりも低い。そのよ
うなビスホスホネートを用いると、下記で述べる異所性石灰化を特徴とする多様
な疾患を治療することができる。

【００３１】ジストロフィー性石灰化の吸収に関与するマクロファージを抑制することによ
ってアテローム性硬化症を予防および／または抑制および／または退行誘発する
ことができることが本発明で発見された。特定の理論に拘束されるものではない
が、動脈内膜の石灰化は、この場所に沈積されたカルシウムを活発に吸収するこ
とができるマクロファージを誘引すると考えられている。内膜のマクロファージ
は続いて、酸化された低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込み、泡沫細胞に
なり、それは最終的に死んで内膜にコレステロールを放出し、コレステロールに
富むアテロームを生じる。石灰化は、従って、マクロファージ補給とコレステロ
ール沈積の持続的なサイクルをもたらす。これは、石灰化部位でのマクロファー
ジを特異的に抑制することによって破壊され得るサイクルである。

【００３２】従って、ある実施態様では、本発明は、アテローム性硬化症を（予防的または
治療的に）処置する方法を提供する。本方法は、マクロファージ仲介カルシウム
吸収を抑制することを含む。好ましい実施態様では、これは、カルシウム取込み
に関与するマクロファージを特異的に抑制する抑制物質を投与することによって
達成される。特に好ましい実施態様では、これは、比較的低用量（例えば、骨吸
収を抑制する用量に匹敵する用量）のビスホスホネートを用いて達成される。

【００３３】ＩＩ．指標前述の事項に鑑みて、本発明の方法は、特に２通りの場合に適用できる：１）
生物（動物または人）が異所性石灰化の恐れがあるか、またはそれに罹患してい
る場合；および２）生物（動物または人）がアテローム性硬化症または動脈硬化
症の恐れがあるか、またはそれらに罹患している場合。Ａ）異所性石灰化ある実施態様では、本発明の方法は、軟部組織の石灰化を有するかまたはその
危険性がある生物の（治療的または予防的）処置のために用いられる。本明細書
で用いられる場合、“軟部組織”とは、正常で健康な哺乳類では石灰化されない
組織を指す。そのような異所性石灰化は、以下を含む（ただし、これらに限定さ
れない）多様な状態で発生する：１つ以上の心臓弁（例えば、大動脈弁）の石灰
化、リンパ節の石灰化、腎の石灰化（例えば、腎石灰沈着症）、筋肉および/ま
たは腱の石灰化、胆嚢の石灰化、尿毒症に附随する石灰化（例えば、末期腎疾患
に付随するもの）、ある種の癌の増殖および／または転移、血塊形成に付随する
石灰化など。

【００３４】心臓弁不全の原因としての狭窄（心臓弁疾患に附随する）の頻度は非常に高く
（７５％を超える）、本質的に全ての狭窄弁が石灰化のために機能不全となる。
狭窄および心臓弁交換の恐れがある患者の数は相当に多く、それは前記の数字に
はある程度の心臓弁石灰化をもつ全ての患者が含まれ、それは６０代の人口の約
３０％であるからである。狭窄の恐れのある事象のこの高さは、本発明方法が、
進行性弁石灰化の徴候を有する全ての被験者で心臓弁不全の危険性を減少させる
ために予防的に用いることができることを示唆している。

【００３５】他の異所性石灰化は、外傷、反復性ストレス、外科手術的および／または生物
学的インプラントに附随する。特に、生物学的インプラント（例えば、プロテー
ゼ）は望ましくない石灰化を受けやすい。石灰化が重大問題であるバイオプロテ
ーゼ装具には以下が含まれる（ただし、これらに限定されない）：ブタおよびウ
シの（即ち、外来性）大動脈弁、肺動脈弁および心臓僧帽弁バイオプロテーゼ（
Carpentier-Edwards標準物およびSupraanularブタバイオプロテーゼ弁およびHan
cockブタ異種グラフトバイオプロテーゼ弁）、ウシ、ブタまたはヒトの心膜から
作製された心臓弁および他の外科的インプラント、ヒトの弁のホモグラフト／ア
ログラフト（ヒトの死体から）および自家グラフト（患者自身の肺動脈弁、大腿
部結合組織または心膜などから作製される）。石灰化が問題となる他のプロテーゼ装具には以下が含まれる（ただし、これら
に限定されない）：機械的心臓弁、特にポリエーテルウレタンウレアおよびポリ
エーテルウレタンを用いて製造されたもの；ポリエーテルウレタンウレアおよび
ポリエーテルウレタンを用いて製造された他の外科的インプラント；シリコーン
・インプラント（乳房用インプラントを含む）；並びに動脈瘤および他の血管障
害の修復に用いられる合成材料。

【００３６】Ｂ．アテローム性硬化症および動脈硬化症上記で示したように、本発明の方法は、アテローム性硬化症に罹患しているか
またはその危険性がある哺乳類（例えば、ヒト）に適用できる。アテローム性硬
化症とは、長期間に及ぶ進行性の動脈の狭窄および硬化を指す。より一般的には
、本発明の方法は、血管内膜のカルシウム沈積を伴う動脈硬化症のいずれにも適
用できる。従って、本発明の方法は、以下を含むアテローム性硬化症に適用でき
る（ただし、これらに限定されない）：真性糖尿病、高血圧、家族性高コレステ
ロール血症、家族性合併型高脂血症、家族性異常ベータリポタンパク血症、家族
性低アルファリポタンパク血症、甲状腺機能低下症、コレステロールエステル貯
蔵病、全身性エリテマトーデス、およびホモシステイン血症に附随するアテロー
ム性硬化症。さらにまた、本発明の方法は、カルシウム沈積を伴う以下を含む非
アテローム性動脈硬化症に適用できる（ただしこれらに限定されない）：真性糖
尿病、慢性腎不全、慢性ビタミンＤ中毒、メンケベルク動脈硬化症、動脈硬化症
、高血圧性動脈硬化症、弾性線維性仮性黄色腫、幼児の特発性動脈石灰化、高齢
者の大動脈弁石灰化およびヴェルナー症候群。これらの症状および／また症状の恐れについての個々の診断は、医療従事者に
公知である。

【００３７】ＩＩＩ．本発明で使用する薬剤Ａ）好ましい薬剤本発明の方法で用いられる好ましい薬剤には、ビスホスホネート、より好まし
くは骨吸収を抑制する用量が骨の石灰化を抑制する用量よりも低いビスホスホネ
ートが含まれるが、ただしこれらに限定されない。特に好ましいビスホスホネー
トでは、骨吸収を抑制する用量は骨の石灰化を抑制する用量よりも明瞭に低く、
より好ましくは、骨吸収を抑制する用量と骨の石灰化を抑制する用量との間に統
計的有意差が存在する（例えば、信頼度が９０％またはそれ以上、好ましくは９
５％またはそれ以上、より好ましくは９８％またはそれ以上、最も好ましくは９
９％またはそれ以上）。最も好ましいビスホスホネートは、骨の石灰化を抑制す
る用量よりも次数が１以上低い、好ましくは次数が２以上低い、より好ましくは
次数が３以上低い、最も好ましくは次数が４以上低い用量で骨吸収を抑制する。

【００３８】特に好ましいビスホスホネートは市販されており、以下が含まれる（ただしこ
れらに限定されない）：アレンドロネート（４−アミノ−１−ヒドロキシブチリ
デン）ビス−ホスホネート）、クロドロネート（ジクロロメチレン）−ビス−ホ
スホネート、ＥＢ−１０５３（１−ヒドロキシ−３−（１−ピロリジニル）−プ
ロピリデン）ビス−ホスホネート、イバンドロネート（１−ヒドロキシ−３−（
メチルペンチルアミノ）プロピリデン）ビス−ホスホネート）、インカドロネー
ト(（［（シクロヘプチルアミノ）−メチレン］ビス−ホスホネート）、ネリド
ロネート（（６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン）ビス−ホスホネート）
、オルパドロネート（（３−ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロピリデン）
ビス−ホスホネート）、パルミドロネート（３−アミノ−１−ヒドロキシプロピ
リデン）ビス−ホスホネート）、リセドロネート（１−ヒドロキシ−２−（３−
ピリジニル）−エチリデン）ビス−ホスホネート）、チルドロネート（［[（４
−クロロフェニル）チオ）−メチレン］ビス−ホスホネート）、ＹＨ５２９（［
１−ヒドロキシ−２−イミダゾ−（１，２−ａ）ピリジン−３−イルエチリデン
］ビス−ホスホネート、およびゾールドロネート（１−ヒドロキシ−２−（１Ｈ
−イミダゾール−１−イル）エチリデン）ビス−ホスホネート）など。

【００３９】他のビスホスホネートも当業者には公知である。従って、例えば米国特許5,31
7,015号はアザ環式ビスホスホネートの合成および使用を記載し、米国特許5,103
,036号は３−アルケニリデン−1,1−ビスホスホネートの調製を記載している。
他の多数のビスホスホネート類の合成方法も同様に当業者に公知である（例えば
米国特許5,622,973号、5,616,571号、5,616,560号、5,403,829号、5,338,731号
、5,196,409号などを参照のこと）。本発明の方法で使用する新規なビスホスホネート類をアッセイする方法は容易
である。ある実施態様では、実施例に示したように、さらに文献に記載されるよ
うに、ビスホスホネートは、骨吸収を抑制する用量および骨の石灰化を抑制する
用量について単純にアッセイされる（例えば、以下の文献を参照のこと：Muhlba
uer et al.,(1991) J. Bone and Mineral Res. 6:1003-1010; Antic et al.,(19
96) Calcif. Tissue Int. 58:443-448）。問題のビスホスホネートが骨吸収を抑
制する用量が前記ビスホスホネートが骨の石灰化を抑制する用量よりも低く、さ
らに毒性が許容できる場合は、前記ビスホスホネートは本発明の方法で使用する
ための有望な候補薬剤である。

【００４０】Ｂ．ビスホスホネートの用量広く信じられてきたこととは反対に、ビスホスホネートは高用量ではなくむし
ろ低用量で投与すると、異所性石灰化の抑制および／またはアテローム性硬化症
および関連症状の治療が可能であることが本発明で見出された。特に、適切な低
用量は、ビスホスホネートが骨の鉱物強化を抑制することなく骨吸収を抑制する
用量である。従って、好ましい用量範囲は、骨吸収および／または異所性石灰化
を抑制するのに十分な用量（治療的に有効な最低用量）から、骨の石灰化を抑制
するために用いられる用量に匹敵する用量までである。そのような用量範囲は、
骨の石灰化を抑制する用量よりもしばしば少なくとも１０倍、好ましくは少なく
とも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍、最も好ましくは少なくと
も１００００倍少ない。骨吸収を抑制する用量および骨石灰化を抑制する用量は
、製剤および投与態様に従って変動し、市販のビスホスホネートに関する製品説
明書から決定できる。他のビスホスホネートに関する適切な用量は、経験的に決
定できる。

【００４１】１つの好ましい実施態様でのアレンドロネートの場合には、該薬剤は約５ｍｇ
から４０ｍｇ／日の範囲の経口投与量でヒトに投与される。好ましい実施態様で
はイバンドロネートの場合、好ましくは１ｍｇ／日の静脈内投与量で投与される
。ゾールドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５３、ネ
リドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルドロネー
トまたはクロドロネートについては、好ましい用量は、検出可能な骨吸収抑制を
生じる最低用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲である。

【００４２】Ｃ．ビスホスホネートの製剤化および投与ビスホスホネートの急性、亜急性および慢性投与は、一般には殆ど毒性を示さ
ない。これは、一般には、それらが石灰化組織に急激に取り込まれ、従って循環
系に短時間しか存在しないことによって説明される。従って、多様な製剤および
投与ルートを用いることができる。本発明の化合物は、選択した投与経路（すなわち経口投与または非経口投与）
に適合した多様な形態で哺乳類ホストに投与できる。この場合の非経口投与には
以下のルートによる投与が含まれる（ただしこれらに限定されない）：静脈内、
筋肉内、皮下、眼内、滑液内、経上皮（経皮を含む）、眼球、舌下および頬側、
局所（眼球、皮膚、眼、直腸投与並びに通気法およびエアロゾルによる鼻吸入を
含む）、および直腸適用による全身投与。

【００４３】活性な化合物は、例えば、不活性稀釈剤または同化可能な食用担体とともに経
口的に投与するか、硬質または軟質ゼラチンカプセルにするか、錠剤に打錠する
か、または食物に直接混合してもよい。治療として経口投与する場合には、活性
化合物は賦形剤に混合し、摂取可能な錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エ
リキシル、懸濁液、シロップ、ウェハースの形態で用いることができる。そのよ
うな組成物および調合物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含むべきである
。組成物および調合物の百分率はもちろん変動してもよいが、単位剤形の約０．
１から約６重量％の間が都合よいであろう。そのような治療的に有用な組成物中
の活性化合物の量は、上記で述べたような適切な用量が得られるような量である
。本発明の好ましい組成物または調合物は、経口投与用単位剤形が約０．０１ｍ
ｇから約３００ｍｇの活性化合物を含むように製造される。

【００４４】錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどはまた以下を含み得る：結合剤、例えば
トラガカントゴム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチン；賦形剤、
例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモ
デンプン、アルギン酸など；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム。さらに
甘味剤、例えばスクロース、ラクトースまたはサッカリンを添加してもよい。ま
た、香料、例えばペパーミント、冬緑油またはサクランボ香料を添加してもよい
。単位剤形がカプセルのときは、さらに上記のタイプの材料の他に液体の担体を
含むことができる。他の種々の材料をコーティングとして、また前記剤形の物理
的形態を改変するために含むことができる。例えば、錠剤、ピル、またはカプセ
ルはシェラック、砂糖またはその両方で被覆されていてもよい。シロップまたは
エリキシルは、活性化合物、甘味剤としてのシュクロース、保存料としてのメチ
ルおよびプロピルパラベン、染料および香料（例えば、サクランボおよびオレン
ジ香料）を含むことができる。勿論、いずれの投与単位剤形に用いられるいずれ
の材料も医薬的に純粋であり、さらに用いられる量で実質的に非毒性でなければ
ならない。さらに、活性化合物は徐放性調合物または製剤に取り込まれてもよい
。

【００４５】活性化合物は、非経口的または腹腔内に投与してもよい。エステル、遊離塩基
または医薬的に許容できる塩としての活性化合物の溶液は、水または他の水性溶
液（例えば、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤）と適切に混合
した水）で調製できる。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール
およびその混合物並びに油で調製できる。通常の貯蔵および使用条件下では、こ
れらの調合物は、微生物の増殖を防止するために保存料を含む。注射用に使用するのに適した製剤形は、滅菌注射用溶液または分散液の即座の
調合用の滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末を含む。全ての事例で、前記剤
形は無菌的でなければならず、さらに注射器に容易に吸引できる程度に液体でな
ければならない。前記剤形は製造および貯蔵条件下では安定で、さらに微生物（
例えば、細菌およびカビ）の汚染作用に対して保護される必要がある。担体は、
例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリ
コールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、適切なその混合物および植物
油を含む分散媒体の溶媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンの
ようなコーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒子サイズの維持に
よって、さらに界面活性剤の使用によって維持できる。微生物作用の阻止は、種
々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール
、ソルビン酸、チマーサルなどによって達成できる。多くの場合、等張剤（例え
ば、糖または塩化ナトリウム）を混合することは好ましい。注射可能な組成物の
持続的吸収は、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラ
チン）を使用することによって達成できる。

【００４６】滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を適当な溶媒中に、必用に応じて上記に
列挙した種々の他の成分とともに混合し、典型的には続いてろ過滅菌することに
よって製造される。一般には、分散液は、滅菌した活性成分を滅菌ビヒクルに混
和することによって製造される。ビヒクルは、ベースとなる分散液媒体および上
記に列挙したものから選ばれる他の必用な成分を含む。滅菌注射溶液の調製のた
めの滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥法であり
、これによって、活性成分の粉末に任意の別の所望成分がプラスされたものが、
先にろ過滅菌されたそれらの溶液から得られる。本発明の治療用化合物は、哺乳類に、単独でまたは医薬的に許容できる上記に
記載したような担体と組み合わせて投与できる。担体の割合は、化合物の溶解性
および化学的性質、選択した投与経路および標準的な調剤慣行によって決定され
る。従って、例えば経口用製剤の生体利用性を高めるために、治療用化合物はキ
レート剤（例えば、ＥＤＴＡ）とともに製剤化してもよい。

【００４７】本明細書で教示したように、有益な低用量の予防または治療に最も適した本発
明の治療的薬剤の用量を医師は決定できる。前記用量は、選択した投与形態およ
び個々の薬剤に応じて変動し、さらにまた治療を受ける個々の患者によって変動
するであろう。一般に、医師は小さな用量から治療を開始し、さらにその状況下
で最適効果が達成されるまで少しずつ用量を増加させようとするであろう。本発明の化合物はまた１つ以上の他の活性な薬剤と併用して用いてもよい。従
って、例えば、本明細書に記載した化合物は、抗高リポタンパク血症薬（例えば
、プロブコール）とともに、および／または１つ以上の血清コレステロール低化
剤、例えばロピド（gemfibrozil）、胆汁酸シークェストラント、例えばコレス
チラミン、コレスチポール、ポリデキシド（DEAE-セファデックス）並びにクロ
フィブレート、ニコチン酸およびその誘導体、ネオマイシン、パラアミノサリチ
ル酸、ベンザフィブレートなどとともに、および／または１つ以上のＨＭＧＣ
ｏＡレダクター阻害物質、例えば、ロバスタチン、プラバスタチン、ベロスタチ
ンまたはシンバスタチンなどとともに投与してもよい。

【００４８】ＩＶ．他の石灰化抑制物質本明細書に記載した方法は、ビスホスホネートに限定されない。上記に示した
ように、実質的に骨の石灰化を抑制しない用量で破骨細胞による骨吸収を抑制す
る任意の薬剤が、本質的に異所性石灰化も抑制するであろうというのが本発明の
発見であった。従って、破骨細胞の骨吸収を抑制する他の薬剤（例えば、非ビス
ホスホネート）は、本発明の方法で使用するための有望な候補薬剤である。その
ような薬剤は、日常的なスクリーニング（例えば、実施例に示すようなもの）に
よって特定できる。同様に、鉱物のマクロファージ仲介性除去は、アテローム性硬化症の発症およ
び／または進行も抑制するであろうというのが本発明の発見であった。従って、
マクロファージの活性を抑制する薬剤（例えば、ジェニステイン）、より好まし
くはカルシウム取込みに関与するマクロファージを特異的に抑制する（例えば、
薬剤がマクロファージのこのサブセットによって内在化されるように急速にカル
シウムと会合することによって）薬剤は、本発明の方法のための有望な候補薬剤
である。

【００４９】Ｖ．キットまた別の実施態様では、本発明は異所性石灰化および／またはアテローム性硬
化症を抑制するキットを提供する。本キットは、１種以上のビスホスホネート、
好ましくは医薬として製剤化された（例えば、医薬的に許容できる賦形剤中に製
剤化された）ビスホスホネートを含む。さらに、本キットは、好ましくは、本明
細書に記載した組成物の使用について、および推奨される用量についての指示を
教示した指示物（即ち、プロトコル）を含む。前記指示物には、典型的には印刷
物が含まれるが、ただしそのようなものに限定されない。そのような指示を保存
および最終ユーザーに伝えることができる任意の媒体が本発明に包含される。そ
のような媒体には、電子記録媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッ
ジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ）などが含まれるが、ただしこ
れらに限定されない。そのような媒体には、前記指示物を提供するインターネッ
トサイトのアドレスを含むことができる。

【００５０】ＶＩ．フェツイン複合体血清タンパク質フェツインは、リン酸カルシウム鉱物相と安定な複合体を形成
し、さらにこの複合体は同じ環境下で血中で検出できることも本発明で発見され
た。特定の理論に拘束されるものではないが、フェツイン／リン酸カルシウム複
合体は、骨吸収時に除去されたカルシウムが血漿中に溶解し、新しい場所に移動
し、そこで前記カルシウムはカルシウム沈積のための核形成部位として機能し、
それによって異所性石灰化およびアテローム性硬化症プラーク形成に寄与すると
考えられている。

【００５１】フェツイン−鉱物複合体は純粋なフェツイン、カルシウム、およびリン酸塩を
用いて合成できる（実施例２を参照）。簡単に述べると、この方法によって、透
過型電子顕微鏡で見ることができる均一なサイズの小さな鉱物粒子の合成が可能
になる。フェツイン鉱物複合体のサイズは非常に小さいので、非常に高濃度のフ
ェツイン鉱物複合体を含む溶液は極めて透明で、前記複合体は沈殿しない。粒子
は安定で、観察を７日間続けても明白な変化は見られない。この複合体によって
捕捉された鉱物相は、骨および歯の石灰化で形成される最初の相であると我々は
考えている。本発明の前には、この層を安定な形態で調製する方法は存在せず、
均一な濃度でこの層を含む溶液を調製する方法も存在しなかった。

【００５２】そのような複合体の形成は、簡単に実証される。カルシウムおよびリン酸塩の
濃縮溶液を混合し、例えば４０ｍＭのカルシウムおよび４０ｍＭのリン酸塩を含
む最終混合物を作製すると、試験管の底にゆっくりと沈む密度の高い白色の沈殿
物が１分画内に形成される。フェツインが混合前に添加される場合には、前記密
度の高い白色沈殿は形成されず、溶液は数日間全く透明のままである。この溶液
を電子顕微鏡で観察すると、極めて均一なサイズおよび形状を有する多数の小さ
な鉱物の核が存在する。フェツインで被覆された前記の核は９５％以上がカルシ
ウムおよびリン酸塩の混合物である。この実験は、鉱物強化の過程を指示するフ
ェツイン分子の能力を示している。

【００５３】本発見は多数の状況で利用できる。例えば、本発見は、任意の不安定な鉱物相
を、この鉱物相と結合するタンパク質を用いて調製し、前記不安定な相を捕捉し
、さらにより安定な相に転換するのを防止する一般的な方法を提供する。フェツ
イン鉱物複合体を用いて鉱物の核を適切なマトリックス内に分布させることがで
き、その後のフェツインの不活化（例えば、熱、酸、カオトロピズム薬剤の添加
による）によって前記マトリックスの迅速で均一な石灰化が得られるであろう。
本方法は、例えば、バイオプロテーゼ装置または他の装置で使用するために石灰
化構造物を製造するのに用いることが可能であろう。

【００５４】フェツイン鉱物複合体は血中で安定であるので、該複合体は、身体の所望の部
位に石灰化イニシエーターを運搬するビヒクルとして用いることができる。例え
ば、複合体中のフェツインは、石灰化を所望する部位（例えば、歯、骨など）に
結合できるように、さらにフェツインが前記部位で不活化され鉱物強化の進行を
可能にできるように改変することが可能である。典型的には、そのような改変は
、標的化分子（例えば、抗体、抗体フラグメント、単鎖抗体、レクチン、脂質、
炭水化物、糖など）をフェツイン−鉱物複合体に結合させることを含むであろう
。標的化分子は、標的（例えば、細胞レセプター、リガンドなど）と特異的に結
合するように選択され、それによって前記鉱物複合体は所望の標的まで運搬され
る。

【００５５】フェツインが糖タンパク質であることは特記すべきで、さらに分子を糖タンパ
ク質に結合させる（直接またはリンカーを介して）方法は、当業者に周知である
。結合は、好ましくはリンカーを介するものである。本明細書で用いられる場合
、“リンカー”とは、標的化分子をフェツイン−鉱物複合体に結合させるのに用
いられる分子である。リンカーは、フェツインと標的化分子との両方に対して共
有結合を形成することができる。適切なリンカーは当業者に周知であり、直鎖ま
たは分枝鎖の炭素リンカー、複素環式炭素リンカーまたはペプチドコネクターが
含まれるが、ただしこれらに限定されない。リンカーは、それらの側鎖基を介し
て構成アミノ酸と結合させるか（例えば、システインとのジスルフィド結合によ
り）、または末端アミノ酸のアルファ炭素のアミノ基およびカルボキシル基に結
合させ得る。

【００５６】種々のポリペプチドを結合させるための多くの方法およびリンカー分子が知ら
れている（例えば、以下を参照のこと：欧州特許出願188,256号；米国特許4,545
,985号；同4,894,443号；同4,671,958号；同4,659,839号；同4,414,148号；同4,
699,784号；同4,680,338号；同4,569,789号および同4,589,071号並びにBorlingh
aus et al.,(1987) Cancer Res. 47:4071-4075；Waldmann (1991) Science, 252
:1657）。フェツイン鉱物複合体は、フェツイン−鉱物特異的アッセイを開発するための
試薬として用いることもできる。このアッセイを用いると、次に、ヒト血中のフ
ェツイン鉱物複合体レベルを測定することができる。これは、骨疾患を有する患
者の管理に関連する骨代謝過程を測定する方法を提供するであろう。

【００５７】特定の理論に拘束されるものではないが、フェツイン分子の表面は標的の鉱物
相と強力かつ特異的に結合すると考えられる。この結合は、結合した他のフェツ
イン分子に対して高い親和性を有するフェツイン上の表面を露出し、結晶の成長
を阻む強力な側面会合を形成する。フェツイン中のオリゴ糖部分（これは、その
重量の約半分に達する）は、鉱物から突出して水和した殻を形成し、前記水和殻
はフェツイン鉱物複合体が凝集し溶液から沈殿するのを防ぐ。このモデルは、フ
ェツインの鉱物と相互作用する表面の工作された改変が、このタンパク質を任意
の所望の鉱物相に誘導し、それによって該タンパク質がこの鉱物相の合成を制御
するのを可能にすることを示唆する。

【００５８】実施例以下の実施例は、説明のために提供され、本発明を制限するものではない。実施例１：ビスホスホネートは骨吸収を抑制するが、骨の鉱物強化を抑制しない用量で動脈の石灰化を防止する本実験は、ビスホスホネートが、骨吸収を抑制するその能力のために動脈の石
灰化を抑制するという仮説を調べるために実施した。骨の吸収は動脈の石灰化と
連関しているという仮説は、高用量のワルファリン（マトリックスＧｌａタンパ
ク質のγ−カルボキシル化を抑制するビタミンＫ拮抗物質）で処置し、それによ
って動脈および他の軟部組織に石灰化を起こさせたラットで動脈の石灰化を増強
させる因子を知るために実施した実験に端を発した。これらの実験で、ワルファ
リン処置は、急速に成長している若いラットで最も広範囲に動脈の石灰化を誘発
し、成熟ラットは完全にワルファリン誘発動脈石灰化に耐性を示すことを見出し
た。ワルファリン誘発動脈石灰化に対する若いラットの感受性は成長と関係があ
り、年齢それ自体とは関係がない。なぜならば、ワルファリン処置は、体重維持
のために適切なカロリー内容を有するが骨の成長または体重増加を許容しない制
限飼料を与えられた若いラットの動脈石灰化を誘発しないからである。これらの
実験は、成長過程が動脈の石灰化を促進することを示し、骨代謝は、実際にワル
ファリン誘発動脈石灰化に対する感受性の重要な決定因子であろうという仮説と
一致した。第二の実験シリーズでは、高用量のビタミンＤがワルファリン処置ラ
ットの動脈石灰化を強めることが認められた。ビタミンＤは骨吸収を強力に促進
することが判明しているので、ワルファリン誘発動脈石灰化に対するビタミンＤ
処置ラットの感受性増加についての解釈の１つは、骨吸収と動脈石灰化の間の連
関であろう。

【００５９】前記実験の背景ビスホスホネートは、骨吸収、正常な骨の鉱物強化および実験的に誘発した動
脈石灰化を抑制することがこれまでに示されていた（最近の総括として以下を参
照されたい：Fleisch (1998) Endocrine Rev. 19:80-100）。徹底的に研究され
た最初のビスホスホネートであるエチドロネートは、骨吸収、正常な骨の鉱物強
化および動脈石灰化を比較的高用量で抑制する。骨粗しょう症のような臨床的疾
患を治療するために骨吸収の特異的抑制物質に関心が持たれていたので、多数の
ビスホスホネートが合成され、骨の鉱物強化を抑制しない用量で骨吸収を抑制す
る効能について調べられた。現時点で臨床的に使用されているビスホスホネート
の中で特に最も強力な２つの骨吸収抑制物質がアレンドロネートおよびイバンド
ロネートである。これらは、骨吸収抑制効果がエチドロネートよりもそれぞれ１
０００倍および１００００倍高い。全てのビスホスホネートは比較的高い用量で
骨の鉱物強化を抑制するので（Fleisch (1998) Endocrine Rev. 19:80-100; Fle
isch (1997) Ann. Med. 29:55-62）、アレンドロネートおよびイバンドロネート
がはるかに強力な骨吸収抑制物質であるという発見は、正常な鉱物強化の過程に
影響を与えないこれら薬剤の用量を用いて患者の骨吸収を抑制することを可能に
する。

【００６０】ビスホスホネートが鉱物強化の過程をin vivoで抑制するメカニズムは殆ど分
かっていない。ビスホスホネートは、骨の鉱物相であるヒドロキシアパタイトに
強力に結合し、骨の鉱物に結合するその能力のゆえに血液から迅速に除かれる（
上掲書）。In vitroでは、全てのビスホスホネートは、カルシウムおよびリン酸
塩の過飽和溶液からリン酸カルシウム鉱物相が形成されるのを強力に抑制し、さ
らにin vitroで石灰化を抑制するのに必用な種々のビスホスホネートの濃度は類
似している（上掲書）。In vivoでは、全てのビスホスホネートは、骨および他
の構造物の正常な鉱物強化を強力に抑制し、さらに正常な鉱物強化を抑制するの
に必用な種々のビスホスホネートの濃度は、類似しているかまたは相当に高い（
非経口用量のビスホスホネートは5〜２０ｍｇＰ／ｋｇ／日）（Fleisch (1998)
Endocrine Rev. 19:80-100）。全てのビスホスホネートが正常な骨の鉱物強化
をin vivoで比較的高用量で抑制し、さらに全てのビスホスホネートがin vitro
で類似する濃度で過飽和溶液からヒドロキシアパタイトの生成を抑制するので、
前記の両作用は、ヒドロキシアパタイトの結晶に結合し物理化学的メカニズムに
よって結晶の成長を抑制するこれら化合物の同じ基本的能力を反映していること
が示唆された。

【００６１】研究者らは、実験的に誘発した動脈石灰化のビスホスホネートによる抑制もま
た、ヒドロキシアパタイトの結晶に結合して結晶の成長をin vitroで抑制するこ
れら化合物の能力およびin vivoで正常な骨の鉱物強化を抑制するこれら化合物
の能力と関係があると考え、さらに実際に、正常な骨の鉱物強化の過程をも抑制
することなく、動脈および他の軟部組織の石灰化を抑制するためにそのような薬
剤を使用することは不可能であると言及した（Fleisch (1998) Endocrine Rev.
19:80-100; Fleisch (1997) Ann. Med. 29:55-62）。本発明の研究によって、我
々は、ビスホスホネートが骨の正常な鉱物強化を抑制するメカニズムとは異なる
メカニズムによって、すなわち骨の吸収を抑制することによって動脈の石灰化を
抑制することを最初に示した。従って、より新しいクラスのより強力な骨吸収抑
制物質、例えば、アレンドロネートおよびイバンドロネートを正常な鉱物強化過
程に影響を与えることなく、動脈および心臓弁の石灰化を抑制するために用いる
ことが可能である。

【００６２】実験方法材料ビタミンＫ₁（フィロキノン）、ビタミンＤ₃（コレカルシフェロール）および
ワルファリンはシグマ（Sigma, St.Louis, Mo）から購入した。エチドロネート(
ディドロネル（Didronel）, Proctor and Gamble Phamaceuticals)およびアレン
ドロネート(フォサマックス（Fosamax）, Merck and Co.,Inc.)は、University
City Pharmacy(Sandiego, Ca.,)から購入し、イバンドロネート(ボンドロナート
（Bondronat）, Boehringer Mannheim)は、Idis World Medicines(Surrey, Unit
ed Kingdom) から購入した。アレンドロネートおよびエチドロネートのストック
溶液は、０．１５ＭのＮａＣｌ（ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）で調製し、４℃
で保存した。イバンドロネートは０．１５ＭＮａＣｌで稀釈し、４℃で保存した
。全てのビスホスホネートの用量はｍｇＰで表し、薬剤のモル効果を直接比較
できるようにした。これは初期の研究で用いられた方法（Muhlbauer et al.,(19
91) J. Bone and Mineral Res. 6:1003-1010; Antic et al.,(1996) Calcif. Ti
ssue Int. 58:443-448）と同様である。ビスホスホネートの実際の測定重量から
ｍｇＰに変換するために、以下の値を各薬剤について用いた：アレンドロネー
ト（Ｎａ）（Ｈ₂Ｏ）₃＝６２ｍｇＰ／３２５ｍｇ薬剤、エチドロネート（Ｎａ
）₂＝６２ｍｇＰ／２５０ｍｇ薬剤、およびイバンドロネート（Ｎａ）（Ｈ₂Ｏ
）＝６２ｍｇＰ／３５７ｍｇ薬剤。ビタミンＫ₁のストック溶液は１０ｍｇ／ｍ
Ｌで調製し、無菌フォイルに包んだ容器で４℃で保存した。ワルファリンナトリ
ウムのストック溶液は０．１５ＭＮａＣｌで５０ｍｇ／ｍＬに調製し４℃で保存
した。最後にビタミンＤのストック溶液は、３日毎の皮下注射サイクルのたびに
７％のエマルファー（alkamuls EL-620, Rhone-Poulenc）で新しく１．６５ｍｇ
／ｍＬの濃度で調製し、続いてフォイルに包んで４℃で保存した。シモンセンア
ルビノラット（Sprague-Dawley由来）はSimonsen labs(Gilroy, Ca)から購入し
た。

【００６３】方法動脈の鉱物蓄積の測定のために、各組織を死亡から３０分以内に取り出し、直
ちに冷凍した。続いて、記載されたように組織を十分に緩衝液で洗浄し、１ｍＬ
の１０％ギ酸で２４時間室温で抽出した。血清中のカルシウムレベルは、クレゾ
ールフタレインコンプレキシオン（Sigma）を用いて比色計で測定し、血清中お
よび酸性組織抽出物中のリン酸塩レベルは記載（Zhu et al.,(1994) Cardiology
, 85:370-377）に従って比色計で測定した。組織切片作製および染色はBiomedic
al Testing Services, Inc.,(San Diego, Ca)によって実施された。雄のスプラーグ＝ドーリーラットには、げっ歯類用飼料５００１（Purina Mil
ls Inc., St Louis, Mo）が常時給餌された。前記飼料は、リン０．６７重量％
およびカルシウム０．９５重量％であり、フィロキノン５００μｇ／ｋｇを含み
、メナジオンは添加されていない。全ての実験で、動物はメトファンの麻酔下で
放血により殺し、選択した組織を直ちに取り出し、１０％緩衝ホルマリンで固定
するか、または以後の検査のために−２０℃で冷凍した。全ての動物実験はＵＣ
ＳＤ動物実験委員会で承認された。

【００６４】動脈石灰化に対するビスホスホネートの影響を、ワルファリン＋高用量ビタミ
ンＤで処置して動脈石灰化を誘発したラットで先ず最初に調べた。簡単に記せば
、４９日齢のラットにｔ＝０，２４および４８時間でビタミンＤ３０００００Ｉ
Ｕ／ｋｇを皮下注射で投与した。ｔ＝０で開始し、各動物にはまたワルファリン
を１２時間毎に、さらにビタミンＫを２４時間毎に注射した。全ての動物は９６
時間で放血によって殺した。最初の実験では（図２）、６匹のラットを最初のビ
タミンＤ注射の４日前から０．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日の用量のアレンドロネー
トで処置し、さらに６匹のラットにはアレンドロネートを投与しなかった。全て
の動物を最初のビタミンＤ投与後９６時間で放血によって殺した。用量依存実験
では、動物にはワルファリン、ビタミンＫおよびビタミンＤによる同一の処置を
所望の用量およびタイプのビスホスホネート（用量あたり４匹のラット）ととも
に最初のビタミンＤ注射の４日前から与えた。用量依存実験では（図３および４
、表III）、全ての動物は最初のビタミンＤ投与の後８４時間で放血によって殺
した。動脈石灰化に対するアレンドロネート投与のタイミングの影響に関する実
験では（図５および６）、動物には再び、ワルファリン、ビタミンＫおよびビタ
ミンＤによる同一の処置を、以下のような０．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日の用量の
アレンドロネートの処置とともに施した：Ａ群にはアレンドロネートの投与なし
（１１ラット）；Ｂ群には最初のビタミンＤ注射の４日前から始めて８日間連続
してアレンドロネートを投与（６ラット）；Ｃ群には最初のビタミンＤ注射の４
日前からアレンドロネートを６日間投与、さらにビタミンＤ処置の２日目（ｔ＝
２４時間）に最後の投与を実施して終了した（６ラット）；Ｄ群には８日間の実
験で最後の２日間にアレンドロネートのみを投与（ｔ＝４８および７２時間）（
９ラット）。アレンドロネートのタイミングに関する実験で全ての動物は最初の
ビタミンＤ注射の９６時間後に放血によって殺した。最後の実験では、４９日齢
の雄のラットはビタミンＤ３０００００ＩＵ／ｋｇをｔ＝０，２４および４８時
間に皮下注射したがワルファリンは投与しなかった。４匹のラットには、最初の
ビタミンＤの注射の４日前から日量０．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日のアレンドロネ
ートを投与し、４匹のラットには、最初のビタミンＤの注射の４日前から０．０
１ｍｇＰ／ｋｇ／日の用量でイバンドロネートを投与し、さらに４匹のラット
にはビスホスホネートを与えなかった。全ての動物は最初のビタミンＤの注射か
ら９６時間後に放血によって殺した。

【００６５】動脈石灰化に対するビスホスホネートの影響もまた、他のところで報告した方
法（Price et al.,(1998) Arterioscler. Thromb. Biol. 18:1400-1407）を用い
てワルフォリン単独で処置したラットで調べた。前記の方法は、高カルシウム血
症が存在しなくても２週間以内に動脈石灰化を誘発する。最初の実験シリーズで
は、４２日齢の雄のラットをワルフォリンで２週間、さらに最初のワルフォリン
投与の４日前から以下の用量のビスホスホネートで処理した：８ラットにはビス
ホスホネートを投与せず、４ラットにはアレンドロネート０．２５ｍｇＰ／ｋ
ｇ／日を投与し、さらに４ラットにはイバンドロネート０．０１ｍｇＰ／ｋｇ
／日を投与した。第二の実験シリーズでは、４２日齢の雄のラットをワルフォリ
ンで４週間、さらに最初のワルフォリン投与の４日前から以下の用量でビスホス
ホネートで処置した：８ラットにはビスホスホネートを投与せず、３ラットには
アレンドロネート０．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日を投与し、３ラットにはアレンド
ロネート０．０２５ｍｇＰ／ｋｇ／日を投与し、さらに４ラットにはエチドロ
ネート６．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日を投与した。

【００６６】結果高用量ビタミンＤで処置されたラットの動脈石灰化に対するビスホスホネートの影響骨吸収と動脈石灰化の可能な関係を調べるために、先ず最初に、強力に骨吸収
を抑制するビスホスホネートであるアレンドロネートを、高用量のビタミンＤで
処置したラットの動脈石灰化に対する影響について調べた。これらの実験の殆ど
で、我々はまた、マトリックスＧｌａタンパク質（動脈石灰化のビタミンＫ依存
抑制物質）のγ−カルボキシル化を抑制するためにビタミンＫ拮抗物質ワルファ
リンで動物を処置し、それによって高用量のビタミンＤ単独で処置した動物で認
められる動脈石灰化と比較してその程度を高めた。以前の実験で、我々は、ビタ
ミンＤ＋ワルファリンの処置は大動脈および他の動脈で弾性層板の急速で大量の
石灰化を引き起こし、有意な石灰化は最初のビタミンＤ注射の７２時間後に明瞭
であることを示した。

【００６７】最初の実験で、我々は、４９日齢の雄のラットの皮下にアレンドロネートを０
．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日の用量で注射した。この用量は、５８日齢の雄のラッ
トでカルシウム欠乏飼料で誘発された骨吸収増加を完全に抑制することを示した
アレンドロネートの皮下投与量０．３ｍｇＰ／ｋｇ／日に匹敵する（Antic et
al.,(1996) Calcif. Tissue Int. 58:443-448）。アレンドロネートの毎日の処
置は最初のビタミンＤ注射の４日前から開始した。これは、先の実験で骨吸収の
最大抑制には約４日間のアレンドロネート処置を要することが示されたためであ
る（Antic et al.,(1996) Calcif. Tissue Int. 58:443-448の図３）。動物を最
初のビタミンＤ注射の９６時間後に調べたとき、ビタミンＤ＋アレンドロネート
で処置した６匹の動物のいずれの腹部大動脈にも鉱物に関するフォンコッサ染色
は検出されなかったが、ビタミンＤ＋ビヒクルで処置した６匹の動物全ての腹部
大動脈の弾性層板に鉱物に関するフォンコッサ染色が大量に検出された（図２）
。アレンドロネート処置は、大動脈心臓弁の弾性層板、および他の調査した全て
の動脈（腎動脈、肺動脈および頚動脈を含む）の媒体の弾性層板のフォンコッサ
染色も完全に排除した（図は示さず）。さらに、アレンドロネート処置によって
、腎臓のフォンコッサ染色は除去された。前記染色は、高用量のビタミンＤ＋ワ
ルファリン処置ラットで認められた石灰化で動脈とは無関係である。鉱物蓄積の
程度に関する定量分析によって、ビタミンＤ処置動物の胸部大動脈および頚動脈
の酸性の鉱物減少(demineralization)抽出物は、コントロールラットの対応する
組織で認められたものよりも少なくとも４０倍高いレベルのカルシウムおよびリ
ン酸塩レベルを有していることが示された。一方、ビタミンＤ＋アレンドロネー
ト処置動物の胸部大動脈および頚動脈の酸性鉱物減少抽出物は、コントロール組
織のレベルと比較して有意には増加していないカルシウムおよびリン酸塩レベル
を示した（データは示さず）。

【００６８】以前の研究で、高用量のビタミンＤ単独処理は動物に対して毒性が強いこと（
Takeo et al.,(1989) Atherosclerosis, 77:175-181; Takeo et al.,(1991) Mol
ec. Cell. Biochem. 107:169-183）、さらにワルファリンとの同時処置はビタミ
ンＤ投与の致死的性質を増大させることが示された。アレンドロネート処置と死
亡率との関係を調べるために、動物をビタミンＤ＋ワルファリンで処置し、さら
に０．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日の用量のアレンドロネートまたはビヒクルを最初
のビタミンＤ注射の４日前から与えた。ビヒクル＋ビタミンＤで処置した４匹の
動物全てが最初のビタミンＤ投与から６日以内に死亡し、一方、アレンドロネー
ト＋ビタミンＤで処置した４匹の動物全てが、観察期間の終了時の１２日目にも
生存し元気であった。高用量のビタミンＤで処置された動物の死亡はアレンドロ
ネートの処置によって防止され、さらに高用量のビタミンＤで処置された動物の
死亡原因は恐らく、未確認であるが何らかの生命にとって必須の構造物の石灰化
であろうと我々は結論する。

【００６９】次の実験シリーズでは、３種の骨吸収の抑制物質ビスホスホネート、エチドロ
ネート、アレンドロネートおよびイバンドロネートの用量に対する、ビタミンＤ
処置ラットの動脈石灰化の依存性を確立した。これらの実験では、ビタミンＤ投
与後９６時間ではなく投与後最初の８４時間で動脈石灰化の程度を調べた。これ
は、ビタミンＤ＋ワルファリン処置ラットでは９６時間で有意な死亡が観察され
たためである。３種のビスホスホネートは全て動脈石灰化を劇的に抑制し、抑制
に必用なビスホスホネートの用量は、骨吸収抑制物質としてのこれら薬剤の効力
の公知の差と相関していた。イバンドロネートおよびアレンドロネートは、イバ
ンドロネートについては０．００１８ｍｇＰ／ｋｇ／日以上の用量で、アレン
ドロネートについては０．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日の用量でフォンコッサ鉱物染
色を腹部大動脈で完全に排除した。エチドロネートは、検査した中で最高の用量
（６．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日）で腹部大動脈のフォンコッサ染色の程度を有意
に低下させた（表Ｉ）。胸部大動脈および２つの頚動脈の酸性鉱物減少抽出物中
の鉱物リン酸塩の蓄積についての定量分析によって、胸部大動脈では鉱物強化の
程度を半分まで減少させるのに必用なビスホスフェートの用量は、イバンドロネ
ートでは０．０００２ｍｇＰ／ｋｇ／日、アレンドロネートでは０．００５、
さらにエチドロネートでは２（図３）であることが判明し、さらに頸動脈では鉱
物強化の程度を半分まで減少させるために必用な用量は、イバンドロネートでは
０．０００１８ｍｇＰ／ｋｇ／日、アレンドロネートでは０．００５、さらに
エチドロネートでは２（図４）であることが明らかになった。アレンドロネート
およびイバンドロネートの２つの最高投与量での胸部大動脈および２つの頚動脈
の酸性鉱物減少抽出物中の鉱物リン酸塩レベルは、コントロール値より有意に高
くはなかった。それらは、胸部大動脈につき４４５±１０４（Ｘ±ＳＤ）nmolの
リン酸塩および頚動脈につき５１±２２nmolのリン酸塩であった。

【００７０】表Ｉ．ビタミンＤ＋ワルファリン処置ラットの胸部大動脈における石灰化フォ
ンコッサ染色の程度に対するビスホスホネートの用量の影響（図３の説明文を参
照）。７０匹の７週齢雄スプラーグ＝ドーリーラットにｔ＝０，２４および４８時間
でビタミンＤ、３０００００ＩＵ／ｋｇ体重を皮下注射した。最初のビタミンＤ
の注射から開始して、全ラットにまたビタミンＫ（２４時間毎）およびワルファ
リン（１２時間毎）の皮下注射の処置も施した。２２匹のラットにはビスホスホ
ネートを投与しなかった。残りの４８匹のラットを１２の処置群に分け、各群に
最初のビタミンＤ注射の４日前から表に示した用量のビスホスホネートを投与し
た。全ての動物を最初のビタミンＤ注射の８４時間後に殺し、直ちに各動物から
腎分枝と大腿分岐との間の腹部大動脈区域を取り出し、１０％緩衝ホルマリンで
固定した。各腹部大動脈の縦断切片をフォンコッサで鉱物染色し、７０匹の動物
の各々から得た全切片を２人の観察者が盲検を実施し、最も強い石灰化を５、石
灰化無しを０として石灰化の程度を表した。（ｎ）＝表示の処置群のラット数。

【００７１】

【表１】

【００７２】ビタミンＤ誘発動脈石灰化の抑制に必要なビスホスホネートの用量が、表ＩＩ
でアロチノイド誘発骨吸収の抑制に必要なビスホスホネートの用量と比較されて
いる。表から明らかなように、動脈石灰化の抑制物質としてのエチドロネート、
アレンドロネートおよびイバンドロネートの相対的効力は、骨吸収抑制物質とし
ての前記薬剤の相対的効力に対応する。動脈石灰化を半減させるために必要なア
レンドロネートおよびイバンドロネートの絶対的非経口投与量は、アロチノイド
誘発骨吸収を半減させるために必要な用量より実際には約２から５倍低い。これ
らを総合すれば、前記の比較は、骨吸収と動脈の石灰化に対するビスホスホネー
トの作用が連関していることを強く示唆する。最も合理的な仮説は、動脈の石灰
化と骨吸収が実際に連関しているということである。

【００７３】表ＩＩ．動脈石灰化と骨吸収に対するビスホスホネートの作用の用量依存性の
比較。ビタミンＤ誘発動脈石灰化に対するビスホスホネートの毎日の皮下投与の影響
についてのデータが図２および３から得られる。アロチノイド誘発骨吸収に対す
るアレンドロネートおよびイバンドロネートの毎日の皮下投与の影響についての
データは、文献（Muhlbauer et al.,(1991) J. Bone and Mineral Res. 6:1003-
1010）の図３のもので、ラットにおけるビスホスホネートの相対的な抗吸収効力
は、文献（Muhlbauer et al.,(1991) J. Bone and Mineral Res. 6:1003-1010）
の表Ｉに由来する。骨吸収研究は、初期には２００−２３０ｇの雄のラットで実
施され、本明細書に示したビタミンＤ誘発動脈石灰化研究は初期には２００ｇの
雄のラットで実施されたことに留意されたい。

【００７４】

【表２】

【００７５】動脈石灰化と骨吸収の抑制に必要なビスホスホネート用量間の相関性について
の可能性のある自明な説明は、高用量のビタミンＤ（骨吸収の強力な刺激物質）
によって誘発された高カルシウム血症が、ビスホスホネート処理によって軽減で
きるかもしれないというものであろう。しかしながら表IIIで明らかなように、
ここで検査したビスホスホネートのいずれもビタミンＤ処置によって惹起された
血清カルシウムレベルの増加を有意には低下させなかった。即ち、検査したビス
ホスホネートの全てで正常な血清カルシウムレベルより４０％を超える状態で維
持された。我々は、従って、ビタミンＤ処置ラットの動脈石灰化の抑制物質とし
てのビスホスホネートの有効性は、ビタミンＤによる処置で誘発された高カルシ
ウム血症の程度の単純な緩和によるものではないと結論した。ビスホスホネート
処置は血清リン酸塩レベルを有意に抑制しはしたが、減少の度合いは、アレンド
ロネートの２つの最高投与量について約１６％、イバンドロネートの２つの最高
投与量については１１％のみであった（表III）。アレンドロネート０．２５ｍ
ｇＰ／ｋｇ／日の用量を用いて繰り返した実験では、最初のビタミンＤ注射後４
８時間、６０時間および７２時間では血清カルシウムまたはリン酸塩の有意な低
下は示されず、従って、ビスホスホネート処置動物の血清リン酸塩レベルの低下
は、ビタミンＤ誘発動脈石灰化の発生過程で比較的遅く現れる。

【００７６】表III．ビタミンＤ＋ワルファリン処置ラットの血清カルシウムおよびリン酸
塩レベルに対するビスホスホネートのタイプおよび用量の影響。この実験のより詳細な説明には、表Ｉの説明文を参照されたい。血清カルシウ
ムおよびリン酸塩レベルは、実験終了時（最初のビタミンＤ注射から８４時間後
）に７０匹の動物全てから採取した血液を用いて測定した。与えられた数値は、
各ビスホスホネート処置群の動物の血清カルシウムおよびリン酸塩レベルについ
ての平均および標準偏差である。^*はＷ／Ｄコントロールと比較したときｐ＜０
．０５；^**はＷ／Ｄコントロールと比較したときｐ＜０．０２５；^***はＷ／Ｄ
コントロールと比較したときｐ＜０．００１。

【００７７】

【表３】

【００７８】我々は、ビタミンＤ単独処置動物で認められる動脈石灰化と比較してその程度
を強化するために、上記で考察した全ての実験でビタミンＫ拮抗物質であるワル
ファリンとの同時処置を用いた。動脈石灰化の抑制物質としてのビスホスホネー
トの有効性はビスホスホネートとワルファリンとの間の可能な相互作用によるも
のではないことを確定するために、我々はまた、ワルファリンと併用処置されな
いビタミンＤ処置ラットで動脈石灰化の抑制物質としてのビスホスホネートの有
効性もまた調べた。これらの実験は、０．０１ｍｇＰ／ｋｇ／日のイバンドロ
ネートおよび０．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日のアレンドロネートでは、最初のビタ
ミンＤ注射から９６時間後に調べたとき、各群の４匹の動物の大動脈および頚動
脈の鉱物フォンコッサ染色を完全に排除するが、一方、ビスホスホネートを投与
されなかった４匹の動物では全ては広範囲な動脈石灰化を有することを明らかに
した（図は示されていない）。我々は、従って、動脈石灰化抑制物質としてのビ
スホスホネートの有効性は、ビタミンＤ単独処置動物とビタミンＤ＋ワルファリ
ン処置動物とでは同等であると結論する。

【００７９】ビタミンＤ処置ラットの動脈石灰化抑制に対するアレンドロネート投与のタイミングの影響ビスホスホネートが動脈石灰化を抑制するメカニズムをさらに調べるために、
我々は、アレンドロネート投与のタイミングと動脈石灰化をアレンドロネートが
抑制する程度との関連を調べた。この実験の手法は、一方の群は動脈石灰化の前
の期間にのみアレンドロネートを投与され、別の群は動脈石灰化が実際に発生す
る期間にのみアレンドロネートを投与されることができるようにアレンドロネー
ト投与のタイミングを調節することであった。動物に同じ用量のビタミンＤおよ
びワルファリンを与え、これらを０．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日の用量のアレンド
ロネートを投与するタイミングを基準に４つの処置群に分けた：Ａ群はアレンド
ロネートを投与されず；Ｂ群は最初のビタミンＤ注射の４日前から８日間連続し
てアレンドロネートを投与され；Ｃ群は最初のビタミンＤ注射の４日前から６日
間アレンドロネートを投与され、第２回目のビタミンＤ処置の日（ｔ＝２４時間
）に最終投薬を実施して終り；Ｄ群は８日間の実験の最後の２日間（ｔ＝４８時
間および７２時間）アレンドロネートを投与された。

【００８０】フォンコッサ染色を用いた腹部大動脈の鉱物強化の組織化学的検査によって、
ビタミンＤのみで処置された１１匹の動物（Ａ群）で大量の石灰化が、８日間の
実験の最後の２日間にアレンドロネート処置を受けた９匹の動物（Ｄ群）で石灰
化レベルの減少が、さらに最初の６日間のみアレンドロネートで処置された６匹
の動物（Ｃ群）およびアレンドロネートを全８日間処置された６匹の動物（Ｂ群
）では石灰化の証拠は認められないことが明らかにされた（図５）。頚動脈の酸
性鉱物減少抽出物中のリン酸鉱物塩蓄積の定量分析は本質的に同じ結果を示した
：すなわち、ビタミンＤを投与されたがアレンドロネートは投与されなかった動
物の頚動脈には非常に高レベルの鉱物が存在し（図６）、８日間の実験の最後の
２日間にアレンドロネートで処置されたラットの頚動脈には中間レベルの鉱物が
存在し（Ｄ群）、８日間連続してアレンドロネートで処置されたラット（Ｂ群）
および最初の６日間のみアレンドロネートで処置されたラット（Ｃ群）の頚動脈
にはコントロールレベルの鉱物が存在していた。

【００８１】Ｃ群の動物で動脈石灰化が存在しないということは、ビスホスホネートが動脈
の石灰化を抑制するメカニズムを明らかにしているかもしれない。アレンドロネ
ートは血清から急速に除去され、従って、鉱物強化が生じる実際の期間にはＣ群
の動物の血中に存在するとは考えられないので、Ｃ群の結果は、石灰化過程を抑
制するためにアレンドロネートは動脈石灰化が実際に進行している間必ずしも存
在する必要がないことを示している。さらに、アレンドロネートはビタミンＤ誘
発高カルシウム血症の期間中に必ずしも存在する必要がないということもまた注
目する価値がある。なぜならば、血清カルシウムレベルはＣ群に最後のアレンド
ロネートを投与した時点（最初のビタミンＤ注射から２４時間後）では正常で、
続いて４８時間では正常よりも２１％上昇し、さらに７２時間および９６時間で
は正常より４０％上昇するからである。我々は、Ｃ群の動物で動脈石灰化が存在
しないということは、アレンドロネートが骨吸収を抑制するその能力のために動
脈の石灰化を抑制するという仮説と一致すると考える。なぜならば、Ｃ群の動物
を最初の６日間アレンドロネートで処理することによって、破骨細胞に対する薬
剤の長期間作用のために前記実験の最後の２日間の間に吸収が抑制されるはずだ
からである（（Antic et al.,(1996) Calcif. Tissue Int. 58:443-448）の図６
）。

【００８２】鉱物強化が起こる実際の期間（実験の最後の２日間）中にアレンドロネートで
処理しても動脈石灰化を完全には抑制できなかったことは留意されるべきである
（図５および６）。この結果は、アレンドロネートは骨吸収を抑制することによ
って機能するという仮説も一致する。なぜならば、吸収は２日間のこの薬剤処置
によって一部抑制されるのみだからである（Antic et al.,(1996) Calcif. Tiss
ue Int. 58:443-448）。しかしながら、この結果は、アレンドロネートは鉱物
表面と直接相互反応し、従って直接的な物理化学的メカニズムによって結晶の成
長を抑制するその能力のために動脈石灰化を抑制するという仮設とは一致しない
。なぜならば、Ｄ群の動物は、動脈石灰化が実際に起こっている全期間（すなわ
ち最初のビタミン注射後４８時間から９６時間）を通してアレンドロネートを投
与されており、にもかかわらず有意な動脈石灰化を示したからである。

【００８３】ワルファリン処置ラットの動脈石灰化に対するビスホスホネートの影響ワルファリン処置ラットにおける骨吸収と動脈石灰化との間の関係を調べるた
めに、ビタミンＤ処置ラットで動脈石灰化抑制に有効であることが証明されてい
る用量のビスホスホネートとともに２週間ワルファリンでラットを処置した。前
記の２週間は、ワルファリン誘発動脈石灰化に必要な最短処置期間である。各事
例で、毎日のビスホスホネート処置はワルファリン処置開始より４日前に開始し
た。これは、以前の研究でビスホスホネートが骨吸収を完全に抑制するのに約４
日を要することが示されたためである（Antic et al.,(1996) Calcif. Tissue I
nt. 58:443-448）。８匹のワルファリン単独処置ラットの全てが腹部大動脈の広
範囲な石灰化を示し、これは初期の研究と一致するが（Price et al.,(1998) Ar
terioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:1400-1407）、一方、０．２５ｍｇＰ／
ｋｇ／日のアレンドロネートとともにワルファリンで処置された４匹の動物はい
ずれも腹部大動脈の石灰化は検出できなかった。０．０１ｍｇＰ／ｋｇ／日の
イバンドロネートとともにワルファリンで処置された４匹の動物のうち２匹はそ
の腹部大動脈に石灰化を示すものはなかったが、１匹は小さな単一石灰化病巣を
有し、残りの１匹は２個の小さな石灰化病巣を有していた。これらの病巣は、ワ
ルファリン単独処置ラットで見出された典型的な石灰化病巣より染色がはるかに
薄かった。各群から得られた腹部大動脈の代表的な組織学的切片は、図７に示さ
れている。０．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日のアレンドロネートの作用は２週間のワ
ルファリン処置実験で再度調査したが、石灰化は４匹のアレンドロネート処置ラ
ットのいずれにも検出することはできなかった。

【００８４】ワルファリン誘発動脈石灰化に対するアレンドロネートおよびエチドロネート
の影響は４週間ワルファリンで処置したラットでも調べた。これは、酸性鉱物減
少抽出物の定量分析によって正確に測定できる石灰化レベルを達成するためには
より長期のワルファリン処置が必要なためである（Price et al.,(1998) Arteri
oscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:1400-1407）。ラットを再びビスホスホネート
単独で４日間前処置し、続いてビスホスホネート＋ワルファリンで合計４週間の
ワルファリン処置期間で処置した。表IVおよび図８に示すように、アレンドロネ
ート処置は、骨の成長または体重増加に影響を及ぼすことなく、頚動脈の鉱物リ
ン酸塩レベルを用量依存的に低下させた。エチドロネートもまた頚動脈の石灰化
を抑制したが、前記効果に必要な用量は体重増加の抑制に及ぶ高さである（表IV
）。エチドロネート＋ワルファリンで処置された４匹の動物の頚骨の最終的な長
さ（３．５９±０．０３ｃｍ）も、ワルファリン単独処置の８匹の頚骨（３．８
０±０．０４ｃｍ、ｐ＜０．００１）より有意に短かった。

【００８５】表IV．４週間ワルファリンで処置されたラットの頚動脈の鉱物リン酸塩蓄積に
対するアレンドロネートおよびエチドロネートの影響４２日齢で開始し、１８匹の雄のラットに４週間２４時間毎にビタミンＫおよ
び１２時間毎にワルファリンを皮下注射し、１１匹のコントロールにはワルファ
リンを投与しなかった。最初のワルファリン注射の４日前から、３匹のワルファ
リン処置ラットに０．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日のアレンドロネートを与え、３匹
に０．０２５ｍｇＰ／ｋｇ／日のアレンドロネートを与え、さらに４匹に６．
２５ｍｇＰ／ｋｇ／日のエチドロネートを与えた。全ての動物を４週目で放血
し、両側の頚動脈を取り出し、酸で鉱物減少を実施した。リン酸塩レベルを全て
の酸抽出物で測定し、各処置群の両頚動脈でリン酸塩レベルの平均＋ＳＤが示さ
れている。表にはさらに、実験の最後に動物から採取した血液で測定した各群の
平均血清カルシウムおよびリン酸塩レベル、および動物の最初と最後の平均体重
が示されている。

【００８６】

【表４】

【００８７】カルシウムおよびリン酸塩レベルは、２週および４週ワルファリン処置実験の
全ての動物について放血で得られた血清で測定し、ワルファリン単独でまたはビ
スホスホネートと一緒にワルファリンで処置するのいずれによっても血清カルシ
ウムまたはリン酸塩レベルは有意な影響を受けなかった（データは示さず）。こ
の結果は、動脈のワルファリン誘発石灰化の抑制物質としてのビスホスホネート
の有効性は、カルシウムおよびリン酸塩の血清レベルに対するビスホスホネート
の作用によるものではないことを示している。

【００８８】考察本研究の主要な結論は、ビスホスホネートは、動脈、心臓弁および腎臓の石灰
化を３つの動脈石灰化モデル（ビタミンＤ処置、ビタミンＤ＋ワルファリン処置
およびワルファリン単独処置）で骨吸収を抑制するその能力によって抑制すると
いうことである。高用量エチドロネートの動脈石灰化抑制能力を説明するこれま
での仮説はおそらく誤りで、さらにアレンドロネートおよびイバンドロネート（
より強力に骨吸収を抑制するために開発されたより新しい世代のビスホスホネー
ト）は、明らかに、鉱物強化部位と直接相互作用しそれによって物理化学的メカ
ニズムで動脈石灰化を抑制するそれらの能力によって動脈石灰化を抑制するので
はない。この新しい結論は以下のいくつかの系列の証拠によって支持される。１
．動脈石灰化抑制に必要なアレンドロネートおよびイバンドロネートの毎日の実際の投与量は、この日齢の雄のラットの骨吸収抑制に必要な前記薬剤の毎日の皮
下投与量とよく一致する（表II）。対照的に、in vivoで骨の正常な鉱物強化の
抑制に必要な前記薬剤の用量（５ｍｇＰ／ｋｇ／日）は動脈石灰化の抑制に必
要な容量の１０００倍を越える。２．動脈石灰化抑制に必要なエチドロネートと
イバンドロネートの用量における１０５００倍の差は、骨吸収抑制に必要なこれ
らビスホスホネートの用量における１００００倍の差と優れて一致する（表II）
。これは、in vivoで正常な骨鉱物強化を抑制するのに必要な用量はエチドロネ
ートとイバンドロネートの本質的に同じ用量と極めて対照的である（Fleisch (1
998) Endocrine Rev. 19:80-100; Fleisc (1977) Ann. Med. 29:55-62）。３．
動脈石灰化の抑制に必要なアレンドロネート投与のタイミングについての研究（
図５および６）は、動脈に鉱物が最初に出現する前およびビタミンＤ誘発高カル
シウム血症が出現する前に投与したときでさえ、この薬剤が動脈石灰化抑制に完
全に有効であることを示している。この結果は、アレンドロネートは、in vitro
で鉱物強化を抑制するメカニズム（さらにin vivoで正常な骨の鉱物強化を抑制
すると考えられているメカニズム）と類似の物理化学的な直接的メカニズムによ
って動脈石灰化を抑制するという仮説と適合させるのは難しい。しかしながら、
アレンドロネートによる骨吸収の抑制は、この日齢の雄のラットでこの薬剤の毎
日の投与を中止した後少なくとも１０日間持続することが判明しているので((An
tic et al.,(1996) Calcif. Tissue Int. 58:443-448)の図６)、前記の結果は、
アレンドロネートは骨吸収を抑制するその能力によって動脈の石灰化を抑制する
という結論と完全に一致する。

【００８９】ビスホスホネートが、骨吸収を抑制するその能力によって動脈の石灰化を抑制
するという発見は臨床的に重要な意義を有するであろう。ビスホスホネート類が
動脈石灰化を抑制するメカニズムはそれらが骨の鉱物強化を抑制するメカニズム
と関係があるというこれまでの仮説のために、研究者らは、ビスホスホネート類
は正常な骨の鉱物強化を抑制することなく軟部組織の石灰化を抑制する物質とし
て用いることができないと結論した。1998年の概説（Fleisch (1998) Endocrine
Rev. 19:80-100）から引用すると、“しかしながら残念なことに、軟部組織の
石灰化を抑制する用量に近い用量で投与したときは、ビスホスホネートは、正常
な石灰化組織（例えば骨および軟骨）の鉱物強化を、さらにより高い用量で投与
したときはまた象げ質、エナメル質およびセメント質の鉱物強化を障害し”、さ
らに“正常な骨の石灰化を抑制するその傾向は、異所性石灰化においてビスホス
ホネートの治療的使用を妨げる”。我々のデータは、動脈石灰化および他の異所
性石灰化を抑制するエチドロネートの用量は骨の鉱物強化も抑制するという結論
を支持するが（表IV）、より新しいクラスのビスホスホネート類（例えば、アレ
ンドロネートおよびイバンドロネート）は、正常な鉱物強化を抑制する用量より
ははるかに低い用量で動脈の石灰化を抑制することを初めて示した。動脈石灰化
を抑制するこれら薬剤の用量は実際に骨吸収を抑制する用量で、従って、動脈お
よび軟部組織の石灰化の抑制は、骨吸収の抑制に臨床的に既に用いられているこ
れら薬剤の投与の予期し得ぬ有益な作用となり得るように思われる。この場合、
ヒトで骨吸収抑制に用いられるイバンドロネートの静脈内投与用量である２４時
間で１ｍｇは、５０ｋｇの人間で１０μｇＰ／ｋｇ／日のイバンドロネート用
量に換算されることは注目する価値がある。この値は、ラットで動脈の石灰化を
５０％抑制するのに必要なイバンドロネートの皮下投与用量０．２μｇＰ／ｋ
ｇ／日を十分に越えるものである（図３および４）。

【００９０】骨吸収を抑制するのに十分であるが正常な骨の鉱物強化を抑制するにははるか
に低い用量で前記のより新しいビスホスホネートを用いて患者を処置すると治療
的に有利であるという、石灰化が或る役割を果す幾つかのヒトの疾患が存在する
。ヒトの健康を考えたとき、これらのうちで最も重要なものは動脈および心臓弁
に影響を与える疾患である。これらは、我々が本明細書で石灰化の抑制に低用量
のビスホスホネートが重大な能力を示した２つの組織であるので、動脈または心
臓弁の石灰化が或る役割を果たすヒトの疾患を簡単に概説することが適切であろ
う。

【００９１】動脈の石灰化は動脈硬化症（部分的にギリシャ語で“硬い”を意味する“skle
rosis"に由来する）に附随する。動脈硬化症は動脈が堅くなることを意味し、動
脈硬化症のタイプには、アテローム性硬化症、メンケベルク動脈硬化症、高血圧
性動脈硬化症および細動脈硬化症が含まれる。アテローム性硬化症は最も多い動
脈硬化症で、石灰化は典型的にはアテローム性硬化症プラーク自体に関連してい
る。石灰化とアテローム性硬化症の進行との関係は現在のところ明確ではないが
、これまでの研究では冠状動脈疾患と冠状動脈石灰化の存在（これらは剖検、コ
ンピュータ断層写真および蛍光顕微鏡法によって特定された）との間には密接な
関連が見出されている（Bartel et al.,(1974) Circulation, 49:1247-1253; Bl
ankenhorn (1961) Am. J. Med. Sci. 242:41-49; Simons et al.,(1992) J. Am.
Coll. Cardiol. 20:1118-1126）。最近の研究では、冠状動脈の石灰化は、他の
非侵襲性手法に比べて冠状動脈のアテローム性硬化症のより感度の高いマーカー
であること（Detrano et al.,(1994) J. Am. Coll. Cardiol. 24:354-358; Puen
tes et al.,(1995) Am. J. Card. Imaging. 9(Suppl 1):5; Kaufmann et al.,(1
995) J. Am. Coll. Cardiol. 25:626-636）、および冠状動脈の石灰化の存在は
将来の冠状動脈疾患罹患率並びに無症候性および症状を有する成人の死亡率を予
測できることも示された（Detrano et al.,(1996) J. Am. Coll. Cardiol. 27:2
85-290）。

【００９２】さらに、アテローム性硬化症のウサギ（Rosenblum et al.,(1975) Atheroscle
rosis. 22:411-424）およびサル（Kramsch et al.,(1981) Science 213:1511-15
12）のモデルでは、高用量のビスホスホネート（エチドロネート）が動脈の石灰
化を抑制するだけでなく、動脈内のコレステロールの蓄積を抑制することも示さ
れた。高用量エチドロネートはまた、コレステロール飼料を与えられたニュージ
ーランド白色ウサギのモデルで予め発生させたアテローム性硬化症を退縮させる
ことが示された（Hollander et al.,(1979) Atherosclerosis 33:111-123 ; Zhu
et al.,(1994) Cardiology 85:370-377）。上記に記したように、エチドロネー
トは第一世代ビスホスホネートであり、骨吸収、動脈石灰化および正常な骨の鉱
物強化を比較的高い用量で抑制する。上記に引用したエチドロネートとアテロー
ム性硬化症の研究では、動脈の石灰化およびアテローム性硬化症の抑制に必要と
された高用量のエチドロネートは、確かに正常な骨の鉱物強化に影響を及ぼした
（Zhu et al.,(1994) Cardiology 85:370-377）。我々は、より新しいビスホス
ホネート類を用いて、骨吸収を抑制するが、正常な骨の鉱物強化を抑制する用量
より少なくとも１０００倍少ない用量で、動脈の石灰化を抑制できることを本明
細書で初めて示した。

【００９３】動脈硬化症はまたしばしば尿毒症に附随し、透析患者では、動脈石灰化の頻度
は透析の期間とともに増加し、１６年で９２％の発生率を示す（Goldsmith et a
l.,(1997) Nephron. 77:37-43）。尿毒症患者では脈管石灰化に２つのパターン
がある：身体中心部の動脈（大動脈、大腿動脈、腸骨動脈）の石灰化および抹消
動脈の石灰化である。後者の石灰化（動脈硬化症と称される）は皮膚の壊死およ
び潰瘍を生じ得、高い死亡率を示す（Coates et al.,(1998) Am. J. Kidney Dis
. 32:384-391; Hafner et al.,(1995) J. Am. Acad. Dermatol. 33:954-962）。
７０９６人の血液透析患者の最近の調査で、血清カルシウムＸリン酸塩生成物は
、相対死亡率危険因子が１．３４の独立した致死危険因子として特定された（Bl
ock et al.,(1998) Am. J. Kidney Disesses 31:607-617）。血清カルシウムＸ
リン酸塩生成物が尿毒症患者で死亡率に影響を及ぼすメカニズムは未だ確立され
ていないが、石灰化速度がカルシウムＸリン酸塩生成物に指数関数的に依存して
いることは判明している。従って、異栄養性石灰化が確かに尿毒症患者の死亡率
の増加の理由であるという推測は極めて興味深い。

【００９４】心臓弁の石灰化は、しばしば弁の機能不全に附随する。1990年にメイヨークリ
ニックで切除された２３６の心臓弁の最近の研究（Dare et al.,(1993) Human P
athology 24:1330-1338）では、石灰化関連狭窄が切除弁の６４％に見出され、
石灰化のない純粋な機能不全は２５％で見出された。前記心臓弁の１０％は狭窄
および機能不全の両方を有し、これらの弁では機能不全は典型的には変性石灰化
に対して二次性であった。大動脈心臓弁石灰化の有病率は年齢とともに増加し、
さらにこれは、最近の研究ではＣＴスキャンで検査を受けた人々の３０％で偶然
に検出された（Lippert et al.,(1995) Am. J. Roentgenology 164:73-77）。偶
然心臓弁石灰化が認められた人々の１５％は、心エコー検査で異常な大動脈弁勾
配を有することが判明し、一方、大動脈弁石灰化を認めない人々ではいずれも異
常な大動脈弁勾配はなかった。石灰化は、大動脈弁バイオプロテーゼで構造的な
弁の変性の主要な原因でもあり（Jamieson et al.,(1995) Ann. Thorac. Surg.
60:S241-S247; Schoen et al.,(1988) Cardiovasc. Clin. 18:289-317; Cohn et
al.,(1989) Ann. Surg. 210:435-443）、ビスホスホネートはそのような石灰化
を抑制し、それによってバイオプロテーゼ弁の機能不全の発生率を減少させるこ
とが可能である。

【００９５】我々は、破骨細胞による骨吸収が動脈石灰化を促進するメカニズムで最も蓋然
性の高いものは、リン酸カルシウム結晶の核が生成されることによってであると
考える。これらの核のいくつかは血液に出て、続いて動脈の弾性層板および他の
軟部組織部位に沈積する。その後これらの核は、血清がリン酸カルシウム鉱物相
（例えばヒドロキシアパタイト）に関して過飽和の状態であることによって前記
沈積部位で成長することができる。我々の仮説は、幾つかの環境下ではタンパク
質鉱物複合体は骨から放出され、血中で検出できるという証拠によって一部支持
される。

【００９６】実施例２フェツイン−鉱物複合体の合成と使用背景我々は、ラット血清の化学的組成に対する高用量エチドロネートの影響を調べ
る過程で、リン酸カルシウム鉱物相と血清タンパク質フェツインとの複合体の存
在を発見した。前記化学組成および前記複合体の性質を確認するために、我々は
、in vitroで前記複合体を生成する以下に記載する方法を開発した。好ましい実施態様では、フェツイン鉱物複合体の生成は、リン酸カルシウム鉱
物相に関して過飽和の溶液の作製を包含する。これは、生理的ｐＨ（即ち、血清
で見出されるｐＨ値）でフェツインの存在下に実施される。下記に概略する２つ
の方法で、均一な核形成プロセスによって鉱物核を生成するために、我々は、カ
ルシウムおよびリン酸塩溶液を迅速に混合することによって過飽和状態を作り出
した。フェツインは鉱物相の成長および凝集を妨げ、その結果多くの小さな結晶
が形成されるということが、本研究の発見の１つであった。これらの結晶のサイ
ズは小さいので、溶液自体は、かなり大量のフェツイン鉱物複合体の存在にもか
かわらず室温で何日も透明のままである。

【００９７】方法ウシ胎児血清、カルシウムおよびリン酸塩を用いたフェツイン鉱物複合体の調製方法フェツイン−鉱物複合体を調製する最初のアプローチではウシ胎児血清を用い
る。ウシ胎児血清を用意し、約２ｍＬを試験管に入れた。続いて１ＭのＨＥＰＥ
Ｓ（ｐＨ７．４）０．５ｍＬを前記ウシ胎児血清に添加し、ＨＥＰＥＳの最終濃
度を０．２Ｍにした（前記緩衝液は、鉱物相の形成により溶液のｐＨが急降下す
るのを防止するためにこの段階で添加される。緩衝液が存在しない場合、ｐＨは
低下し、かなり大きなブラシュ石の結晶が形成され沈殿する）。続いて、０．５
Ｍのリン酸緩衝液^*１６０μＬを１２×７５ｍｍの試験管に入れる。

【００９８】１ＭのＣａＣｌ₂約８０μＬを別の１２×７５ｍｍの試験管に添加する。続い
て上記で調製したウシ胎児血清−ＨＥＰＥＳ緩衝液溶液１ｍＬを両試験管に加え
る。カルシウム含有試験管にパラフィンで蓋をし、ピペットの先端でパラフィン
に穴を開ける。パスツールピペットおよびスポイトゴム球を用いて、ＰＯ₄試験
管の内容物を迅速にＣａ試験管の内容物に添加する。（鉱物相の均一な核形成を
促進する条件を作り出すために、この段階で可能なかぎり瞬時に混合することが
重要である。２つの溶液をゆっくりと混合すると、リン酸カルシウム鉱物の大き
な結晶が形成され、これは雲状の沈殿として明瞭で、試験管の底に沈む）。（混
合の順序は逆転させてもよく、カルシウム含有溶液をリン酸塩含有溶液に添加す
ることができる）。続いて、混合物にパラフィンで再度蓋をして室温で放置する。形成される結晶
のサイズは非常に小さいので、透過型電子顕微鏡でのみ観察できる。数分以内に
、小さな球状の結晶が形成される。これら結晶は成長し、次の３時間で構造を変
化させ、十分に均一なサイズの多数の結晶を生じる。いったん最終的なサイズが
得られたら、これは何日間も安定である。

【００９９】精製ウシフェツイン、カルシウムおよびリン酸塩を用いるフェツイン鉱物複合体の調製方法フェツイン−鉱物複合体を調製する第二のアプローチでは、精製ウシフェツイ
ン、カルシウムおよびリン酸塩胎児血清を用いる。最初に、５０ｍｇの精製ウシ
フェツインを０．２ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）２．５ｍＬに溶解する。前記
混合物を最高速度で３０分エピヒュージで遠心して溶液を透明にする（本実験で
使用したシグマのフェツインは前記緩衝液に溶解しない小量のタンパク質を含ん
でいる）。０．５Ｍのリン酸緩衝液^*１６０μＬを１２×７５の試験管に加える
。別の１２×７５の試験管には１ＭのＣａＣｌ₂８０μＬを加える。工程２で調
製したフェツイン−ＨＥＰＥＳ緩衝液溶液１ｍＬを両試験管に迅速に添加する。

【０１００】カルシウム含有試験管にパラフィンで蓋をし、ピペットの先端でパラフィンに
穴を開ける。パスツールピペットおよびスポイトゴム球を用いてＰＯ₄試験管の
内容物を迅速にＣａ試験管の内容物に添加する。（鉱物相の均一な核形成を促進
する条件を作り出すために、この段階で可能なかぎり瞬時に混合することが重要
である。２つの溶液をゆっくりと混合すると、リン酸カルシウム鉱物の大きな結
晶が形成され、これは雲状の沈殿として明瞭で、試験管の底に沈む）。（混合の
順序は逆転させてもよく、カルシウム含有溶液をリン酸塩含有溶液に添加するこ
とができる）。続いて、混合物にパラフィンで再度蓋をして室温で放置する。形成される結晶
のサイズは非常に小さいので、透過型電子顕微鏡でのみ観察できる。数分以内に
、小さな球状の結晶が形成される。これら結晶は成長し、次の３時間で構造を変
化させ、十分に均一なサイズの多数の結晶を生じる。いったん最終的なサイズが
得られたら、これは何日間も安定である。上記で使用されるリン酸緩衝液は、０．５ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄（二塩基）５０ｍ
Ｌおよび０．５ＭのＮａＨ₂ＰＯ₄（一塩基）２５ｍＬを調製することによって調
製する。前記二塩基物は前記一塩基物用液でｐＨ７．４に滴定する。続いてアジ
化ナトリウムを、保存料として最終濃度０．０２％で添加する（この工程は任意
である）。

【０１０１】方法の改変：カルシウムおよびリン酸塩の最初の濃度は大きく変更することができる。上記
の実験では、最終イオン組成は、カルシウムおよびリン酸塩で４０ｍＭよりわず
かに低い。我々は、カルシウムおよびリン酸塩がわずかに５ｍＭの最終イオン組
成を用いて複合体を形成した。主要な違いは、このような条件下では複合体は数
日間にわたってゆっくりと形成されるということである。形成される結晶は依然
として小さすぎて溶液の濁りとして眼で見ることはできない。溶液は透明のまま
で、結晶は試験管の底に沈まない。結晶は透過型電子顕微鏡によって見ることが
でき、サイズおよび構造は、上記に概略した実験で室温で３時間後に形成された
ものと類似している。我々は、最初のカルシウム：リン酸塩の比が２：１から０
．５：１の範囲のものを用いてフェツイン鉱物複合体も生成し、形成された最終
的な結晶が、１：１のモル比条件で形成されたものと特性および構造が同一であ
ることを見出した。

【０１０２】上記の方法によって形成されたフェツイン鉱物複合体は、エピフュージで最高
速度で５から３０分遠心することによって沈降することができる。形成されたペ
レットは半透明で外見はガラス様で、フェツイン、カルシウムおよびリン酸塩を
含んでいる。この複合体のカルシウムとリン酸塩のモル比は約１．２５で、この
複合体のフェツインとカルシウムの重量比は約３である。リン酸カルシウム混合物の温度は変更できる。我々はまた、７℃および３７℃
で複合体を調製した。複合体はより高い温度でより迅速に形成され、低い温度で
はゆっくりと形成されるが、形成された最終的な結晶は、室温で形成されたもの
と特性および構造は同一である。

【０１０３】精製ウシフェツインの最初の濃度は変更できる。我々は、以下を用いてフェツ
イン鉱物複合体を生成することができた：５ｍｇ／ｍＬのフェツインおよび最初
のイオン組成が１０ｍＭのカルシウムおよびリン酸塩；並びに１ｍｇ／ｍＬのフ
ェツインおよび最初のイオン組成が５ｍＭのカルシウムおよびリン酸塩。一般に
、最初のカルシウムおよびリン酸塩濃度がより低い場合、均一なサイズおよび構
造を有する安定な複合体を形成するにはより少ないフェツインが要求される。

【０１０４】フェツイン供給源の種は変更できる。我々は他の種の精製フェツインを使用す
る複合体形成については調べなかったが、最初のカルシウムおよびリン酸塩濃度
を１０ｍＭで出発して、ラットおよびヒト血清を用いてフェツイン鉱物複合体を
形成することができた（ヒトフェツインはα２−ＨＳ糖タンパク質とも称される
）。

【０１０５】均一な結晶核形成速度は最初のイオン濃度に強く依存するので、迅速に混合す
ることの重要性は、より高いリン酸カルシウム濃度で極めて高い。時間が重要で
ない場合は、最初のイオン濃度が低いものを用いて均一な核形成条件を作り出す
のに十分に迅速に混合する方がより容易であり、従って、それが、構造が最も均
一であるフェツイン鉱物複合体の形成を促進する条件である。

【０１０６】本明細書に記載した実施例および実施態様は単に説明を目的としており、それ
を基に当業者は多様な修飾または変更が可能であり、さらにそのような修飾また
は変更は本出願および添付の範囲内に包含されることが理解されよう。本明細書
に引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、本明細書中に参考として援用
されている。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、市販の多数のビスホスホネートを示す。

【図２】図２は、ビタミンＤ＋ワルファリン処置ラットの大動脈石灰化フォンコッサ染
色に対するアレンドロネート処置の影響を示す。１２匹の７週齢の雄のスプラーグ＝ドーリーラットに、ｔ＝０，２４および４
８時間でビタミンＤ３０００００ＩＵ／ｋｇ体重を皮下注射した。最初のビタミ
ンＤ注射で開始し、ラットをさらにビタミンＫ（２４時間毎）およびワルファリ
ン（１２時間毎）の皮下注射で処置した。６匹の動物に最初のビタミンＤ注射の
４日前から０．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日の用量でアレンドロネートを皮下注射し
、残りの６匹の動物にはアレンドロネートは投与しなかった。全ての動物を最初
のビタミンＤ注射から９６時間後に殺し、腎分枝と大腿分岐部との間の腹部大動
脈断片を迅速に各動物から取り出し、１０％緩衝ホルマリンで固定した。各大動
脈の縦断切片をフォンコッサにより鉱物染色した。パネルは、アレンドロネート
で処置した６ラットおよびアレンドロネートを投与されなかった６ラットの典型
的な切片を示す。

【図３】図３は、ビタミンＤ＋ワルファリンで処置したラットの胸部大動脈の鉱物リン
酸塩の蓄積の程度に対するビスホスホネートのタイプおよび用量の影響を示す。７０匹の７週齢雄スプラーグ＝ドーリーラットに、ｔ＝０，２４および４８時
間でビタミンＤ３０００００ＩＵ／ｋｇ体重を皮下注射した。最初のビタミンＤ
注射で開始し、全てのラットをさらにビタミンＫ（２４時間毎）およびワルファ
リン（１２時間毎）の皮下注射で処置した。２２匹のラットにはビスホスホネー
トを投与しなかった。残りの４８匹のラットを１２の処置群に分け、各群に図に
示した用量で最初のビタミンＤ注射の４日前から種々のビスホスホネートを皮下
注射した。全ての動物を最初のビタミンＤ注射から８４時間後に殺し、腎分枝と
心臓との間の胸大動脈断片を迅速に各動物から取り出した。各動脈の酸性の鉱物
減少(demineralization)抽出物中のリン酸塩レベルが７０匹の動物全てについて
示されている。線は、各処置群の大動脈リン酸塩の平均値を結ぶように描かれて
いる（白丸はビスホスホネートなし、白三角はイバンドロネート、黒三角はアレ
ンドロネート、黒丸はエチドロネートを示す）。この週齢の未処置コントロール
ラットの胸部大動脈のリン酸塩レベルは、４４５±１０４（Ｘ±ＳＤ）nmol／胸
部大動脈である。

【図４】図４は、ビタミンＤ＋ワルファリンで処置したラットの頸動脈のリン酸鉱物塩
の蓄積の程度に対するビスホスホネートのタイプおよび用量の影響を示す。図３の説明文に記載した実験で７０匹の動物の各々から両側の頚動脈を取り出
し、７０匹の動物の各々の２つの動脈の酸性鉱物減少抽出物中のリン酸塩レベル
を、各処置群の頸動脈リン酸塩の平均値を結ぶように引いた線で示している（白
丸はビスホスホネートなし、白三角はイバンドロネート、黒三角はアレンドロネ
ート、黒丸はエチドロネートを示す）。この週齢の未処置コントロールラットの
頸動脈のリン酸塩レベルは、５１±２２nmol／頸動脈である。

【図５】図５は、ビタミンＤ＋ワルファリン処置ラットの大動脈石灰化フォンコッサ染
色に対するアレンドロネート投与のタイミングの影響を示す。２６匹の７週齢雄スプラーグ＝ドーリーラットに、ｔ＝０，２４および４８時
間でビタミンＤ３０００００ＩＵ／ｋｇ体重を皮下注射した。最初のビタミンＤ
注射で開始し、ラットをさらにビタミンＫ（２４時間毎）およびワルファリン（
１２時間毎）の皮下注射で処置した。以下のような４つのアレンドロネート処置
群を設けた：１１匹の動物にはアレンドロネートを投与しなかった；６匹には最
初のワルファリン注射の４日前から０．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日のアレンドロネ
ートを皮下注射しｔ＝７２時間に８回目で最後の投与を実施した；６匹には最初
のワルファリン注射の４日前から０．２５ｍｇＰ／ｋｇ／日のアレンドロネー
トを投与しｔ＝２４時間に６回目の最後の投与を実施した；さらに９匹には最後
の２日間のみ（ｔ＝４８および７２時間）アレンドロネートを投与した。全ての
動物を最初のビタミンＤ注射から９６時間後に殺し、腎分枝と大腿分岐部との間
の腹部大動脈断片を迅速に各動物から取り出し、１０％緩衝ホルマリンで固定し
た。各大動脈の縦断切片をフォンコッサにより鉱物染色した。パネルは、アレン
ドロネートを投与されなかったラット（下の右）、最後の２日間のみアレンドロ
ネートを投与されたラット（上の右）、最初の６日間のみアレンドロネートを投
与されたラット（下の左）、および８日間全てアレンドロネートを投与されたラ
ット（上の左）から得た典型的な切片を示している。

【図６】図６は、ビタミンＤ＋ワルファリン処置ラットの頸動脈の鉱物リン酸塩蓄積の
程度に対するアレンドロネート投与のタイミングの影響を示す。図５の説明文に記載した実験で２６匹の動物の各々から両側の頚動脈を取り出
し、それぞれ４つの処置群の各動物の２つの動脈の酸性鉱物減少抽出物中の平均
リン酸塩レベルを示す。図中に説明文は以下を意味する：アレンドロネートなし
、アレンドロネートを投与されなかったラット；アレンドロネートを後期に、最
後の２日間のみアレンドロネートを投与されたラット；アレンドロネートを初期
に、最初の６日間のみアレンドロネートを投与されたラット；アレンドロネート
を連続的に、８日間全てアレンドロネートを投与されたラット。この週齢の未処
置コントロールラットの頸動脈のリン酸塩レベルは、５１±２２nmol／頸動脈で
ある。

【図７】図７は、２週間ワルファリンで処置されたラットの大動脈石灰化のフォンコッ
サ染色に対するアレンドロネート処置の影響を示す。１２匹の４２日齢雄スプラーグ＝ドーリーラットをワルファリン（１２時間毎
）およびビタミンＫ（２４時間毎）で２週間処置した。最初のワルファリン注射
の４日前に開始して、４匹のラットにはアレンドロネートを０．２５ｍｇＰ／
ｋｇ／日で投与し、４匹のラットにはイバンドロネートを０．０１ｍｇＰ／ｋ
ｇ／日で投与し、さらに４匹のラットにはビスホスホネートを投与しなかった。
腎分枝と大腿分岐部との間の腹部大動脈断片をラットを殺した後迅速に取り出し
、１０％緩衝ホルマリンで固定し、各大動脈の縦断切片をフォンコッサにより鉱
物染色した。パネルは、各処置群の２匹の動物の大動脈で認められる典型的な石
灰化レベルを示している。この日齢の未処置コントロール動物では、石灰化は検
出できない。

【図８】図８は、４週間ワルファリンで処置されたラットの大動脈石灰化のフォンコッ
サ染色に対するアレンドロネート処置の影響を示す。１４匹の４２日齢雄スプラーグ＝ドーリーラットをワルファリン（１２時間毎
）およびビタミンＫ（２４時間毎）で２週間処置した。最初のワルファリン注射
の４日前に開始して、３匹のラットにはアレンドロネートを０．２５ｍｇＰ／
ｋｇ／日で投与し、３匹のラットにはアレンドロネートを０．０２５ｍｇＰ／
ｋｇ／日で投与し、さらに８匹のラットにはアレンドロネートを投与しなかった
。腎分枝と大腿分岐部との間の腹部大動脈断片を剖検で取り出し、１０％緩衝ホ
ルマリンで固定し、各大動脈の縦断切片をフォンコッサにより鉱物染色した。パ
ネルは、各処置群の動物の大動脈で認められる典型的な石灰化レベルを示してい
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/14 Ａ６１Ｐ 9/00 9/00 9/10 １０１ 9/10 １０１ 9/12 9/12 13/12 13/12 17/00 17/00 19/02 19/02 19/08 19/08 21/00 21/00 35/00 35/00 35/04 35/04 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 BA50 CA59 NA13 NA14 ZA961 ZA962 4C086 AA01 AA02 DA34 HA04 HA19 MA02 MA04 NA13 NA14 ZA36 ZA38 ZA42 ZA45 ZA81 ZA89 ZA96 ZB26 ZC21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳類で軟部組織の石灰化を抑制する方法であって、該哺乳
類で破骨細胞による骨吸収を抑制することを包含する、方法。
【請求項２】前記哺乳類が、軟部組織の石灰化を特徴とする病態を有する
か、またはその危険性があると診断された哺乳類である、請求項１に記載の方
法。
【請求項３】前記抑制が、骨の鉱物強化を抑制することなく骨吸収を抑制
するのに十分である濃度でビスホスホネートを前記哺乳類に投与することによる
、請求項３に記載の方法。
【請求項４】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を生じ
る濃度より少なくとも1０倍低い濃度で骨吸収の有意な低下をもたらす、請求項
３に記載の方法。
【請求項５】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を生じ
る濃度より少なくとも1０倍低い用量で投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を生じ
る濃度より少なくとも1０００倍低い濃度で骨吸収の有意な低下をもたらす、請
求項３に記載の方法。
【請求項７】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を生じ
る濃度より少なくとも1０００倍低い用量で投与される、請求項６に記載の方法
。
【請求項８】前記ビスホスホネートが、アレンドロネート、イバンドロネ
ート、ゾールドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５３
、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルドロ
ネートおよびクロドロネートからなる群から選択される、請求項３に記載の方法
。
【請求項９】前記軟部組織が、動脈、心臓弁、アテローム性硬化症プラー
ク、癌、腎臓、前立腺、皮膚、筋肉、軟骨、内臓および心筋からなる群から選択
される、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】軟部組織の石灰化を特徴とする病態を有するか、その危険
性を有すると診断された哺乳類で軟部組織の石灰化を抑制する方法であって、低
用量のビスホスホネートを該動物に投与することを包含し、該低用量が石灰化を
抑制するのに十分であるが正常な骨の鉱物強化を抑制するビスホスホネートの用
量よりも少ない、方法。
【請求項１１】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を
生じる濃度より少なくとも1０倍低い濃度で骨吸収の有意な低下をもたらす、請
求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を生
じる濃度より少なくとも1０倍低い用量で投与される、請求項１０に記載の方法
。
【請求項１３】前記ビスホスホネートが、アレンドロネート、イバンドロ
ネート、ゾールドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５
３、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルド
ロネートおよびクロドロネートからなる群から選択される、請求項１０に記載の
方法。
【請求項１４】前記軟部組織が、動脈、心臓弁、アテローム性硬化症プラ
ーク、癌、腎臓、前立腺、皮膚、筋肉、軟骨、内臓および心筋からなる群から選
択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をもた
らす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるアレ
ンドロネートである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】前記ビスホスホネートが、５ｍｇから４０ｍｇ／日の範囲
の経口投与量でヒトに投与されるアレンドロネートである、請求項１３に記載の
方法。
【請求項１７】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をもた
らす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるイバ
ンドロネートである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】前記ビスホスホネートが、１ｍｇ／日の静脈内投与量でヒ
トに投与されるイバンドロネートである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をも
たらす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるゾ
ールドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５３、ネリド
ロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルドロネートま
たはクロドロネートである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】前記ビスホスホネートが、経口投与、静脈内注射、皮下注
射および筋肉内注射からなる群から選択される方法により投与される、請求項１
０に記載の方法。
【請求項２１】前記ビスホスホネートが予防的処置として投与される、請
求項１０に記載の方法。
【請求項２２】前記ビスホスホネートが治療的処置として投与される、請
求項１０に記載の方法。
【請求項２３】前記哺乳類が、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、
ウシ、げっ歯類、ブタおよびウサギからなる群から選択される、請求項１０に記
載の方法。
【請求項２４】軟部組織の石灰化を伴う哺乳類の疾患の症状を緩和する方
法であって、骨の石灰化を抑制することなく軟部組織の石灰化を抑制するのに十
分である低用量のビスホスホネートを該哺乳類に投与することを包含する、方
法。
【請求項２５】前記疾患が、アテローム性硬化症、動脈硬化症、細動脈硬
化症、高血圧性動脈硬化症、メンケベルク動脈硬化症、心臓弁狭窄、尿毒症、糖
尿病、上皮小体機能亢進症、血塊形成、癌増殖、癌転移、高血圧、ビタミンＤ中
毒および関節炎からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を生
じる濃度より少なくとも1０倍低い濃度で骨吸収の有意な低下をもたらす、請求
項２４に記載の方法。
【請求項２７】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を生
じる濃度より少なくとも1０倍低い用量で投与される、請求項２４に記載の方法
。
【請求項２８】前記ビスホスホネートが、アレンドロネート、イバンドロ
ネート、ゾールドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５
３、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルド
ロネートおよびクロドロネートからなる群から選択される、請求項２４に記載の
方法。
【請求項２９】前記哺乳類が、軟部組織の石灰化を特徴とする病態を有す
るか、またはその危険性があると診断された哺乳類である、請求項２４に記載の
方法。
【請求項３０】前記軟部組織が、動脈、心臓弁、アテローム性硬化症プラ
ーク、癌、腎臓、前立腺、皮膚、筋肉、軟骨、内臓および心筋からなる群から選
択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をもた
らす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるアレ
ンドロネートである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】前記ビスホスホネートが、５ｍｇから４０ｍｇ／日の範囲
の経口投与量でヒトに投与されるアレンドロネートである、請求項２８に記載の
方法。
【請求項３３】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をもた
らす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるイバ
ンドロネートである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】前記ビスホスホネートが、１ｍｇ／日の静脈内投与量でヒ
トに投与されるイバンドロネートである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をもた
らす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるゾー
ルドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５３、ネリドロ
ネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルドロネートまた
はクロドロネートである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】前記ビスホスホネートが、経口投与、静脈内注射、皮下注
射および筋肉内注射からなる群から選択される方法により投与される、請求項２
４に記載の方法。
【請求項３７】前記哺乳類が、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ
、ウシ、げっ歯類、ブタおよびウサギからなる群から選択される、請求項２４に
記載の方法。
【請求項３８】哺乳類で、インプラントされたプロテーゼ装具の石灰化を
緩和する方法であって、骨の石灰化を抑制することなく該プロテーゼ装具または
プロテーゼ装具周囲の軟部組織の石灰化を抑制するのに十分である低用量のビス
ホスホネートを該哺乳類に投与することを包含する、方法。
【請求項３９】前記プロテーゼ装具が、心臓弁バイオプロテーゼおよび心
臓弁の機械的プロテーゼからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】前記プロテーゼ装具が、ポリエーテルウレタンウレアを含
む外科的インプラント、ポリエーテルウレタンを含む外科的インプラント、シリ
コンを含む外科的インプラント、動脈瘤の修復のために用いられる外科的整復材
料からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を生
じる濃度より少なくとも1０倍低い濃度で骨吸収の有意な低下をもたらす、請求
項３８に記載の方法。
【請求項４２】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を生
じる濃度より少なくとも1０倍低い用量で投与される、請求項３８に記載の方法
。
【請求項４３】前記ビスホスホネートが、アレンドロネート、イバンドロ
ネート、ゾールドロネート、インカドロネート、ＥＢ−１０５３、ネリドロネー
ト、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、リセドロネート、チルド
ロネートおよびクロドロネートからなる群から選択される、請求項３８に記載の
方法。
【請求項４４】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をもた
らす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるアレ
ンドロネートである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】前記ビスホスホネートが、５ｍｇから４０ｍｇ／日の範囲
の経口投与量でヒトに投与されるアレンドロネートである、請求項４３に記載の
方法。
【請求項４６】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をもた
らす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるイバ
ンドロネートである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】前記ビスホスホネートが、１ｍｇ／日の静脈内投与量でヒ
トに投与されるイバンドロネートである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をも
たらす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるゾ
ールドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５３、ネリド
ロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルドロネートま
たはクロドロネートである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】前記ビスホスホネートが、経口投与、静脈内注射、皮下注
射および筋肉内注射からなる群から選択される方法により投与される、請求項３
８に記載の方法。
【請求項５０】前記ビスホスホネートが予防的処置として投与される、請
求項３８に記載の方法。
【請求項５１】前記ビスホスホネートが治療的処置として投与される、請
求項３８に記載の方法。
【請求項５２】前記哺乳類が、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、
ウシ、げっ歯類、ブタおよびウサギからなる群から選択される、請求項３８に記
載の方法。
【請求項５３】哺乳類のアテローム性硬化症の症状を緩和する方法であっ
て、該哺乳類で破骨細胞による骨吸収を抑制することを包含する、方法。
【請求項５４】前記抑制が、骨の鉱物強化を抑制することなく骨吸収を抑
制するのに十分である濃度でビスホスホネートを該哺乳類に投与することによる
、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】前記哺乳類が、アテローム性硬化症を有するか、またはそ
の危険性があると診断された哺乳類である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を生
じる濃度より少なくとも1０倍低い濃度で骨吸収の有意な低下をもたらす、請求
項５４に記載の方法。
【請求項５７】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を生
じる濃度より少なくとも1０倍低い用量で投与される、請求項５６に記載の方法
。
【請求項５８】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を生
じる濃度より少なくとも1０００倍低い濃度で骨吸収の有意な低下をもたらす、
請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】前記ビスホスホネートが、骨の鉱物強化の有意な低下を生
じる濃度より少なくとも1０００倍低い用量で投与される、請求項５８に記載の
方法。
【請求項６０】前記ビスホスホネートが、アレンドロネート、イバンドロ
ネート、ゾールドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５
３、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルド
ロネートおよびクロドロネートからなる群から選択される、請求項５６に記載の
方法。
【請求項６１】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をもた
らす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるアレ
ンドロネートである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】前記ビスホスホネートが、５ｍｇから４０ｍｇ／日の範囲
の経口投与量でヒトに投与されるアレンドロネートである、請求項６０に記載の
方法。
【請求項６３】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をもた
らす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるイバ
ンドロネートである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】前記ビスホスホネートが、１ｍｇ／日の静脈内投与量でヒ
トに投与されるイバンドロネートである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をもた
らす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるゾー
ルドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５３、ネリドロ
ネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルドロネートまた
はクロドロネートである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】前記ビスホスホネートが予防的処置として投与される、請
求項５３に記載の方法。
【請求項６７】前記ビスホスホネートが治療的処置として投与される、請
求項５３に記載の方法。
【請求項６８】哺乳類でアテローム性硬化症の症状または進行を緩和する
方法であって、石灰化部位でのマクロファージによる鉱物の除去を抑制すること
を包含する、方法。
【請求項６９】前記抑制が、前記マクロファージによる鉱物の除去を抑制
するのに十分な濃度で前記哺乳類にビスホスホネートを投与することを包含する
、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】前記ビスホスホネートが、石灰化部位以外の場所ではマク
ロファージを抑制しない濃度で投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】前記ビスホスホネートが、アレンドロネート、イバンドロ
ネート、ゾールドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５
３、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルド
ロネートおよびクロドロネートからなる群から選択される、請求項７０に記載の
方法。
【請求項７２】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をもた
らす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるアレ
ンドロネートである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】前記ビスホスホネートが、５ｍｇから４０ｍｇ／日の範囲
の経口投与量でヒトに投与されるアレンドロネートである、請求項７０に記載の
方法。
【請求項７４】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をもた
らす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるイバ
ンドロネートである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】前記ビスホスホネートが、１ｍｇ／日の静脈内投与量でヒ
トに投与されるイバンドロネートである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】前記ビスホスホネートが、骨吸収の検出可能な抑制をもた
らす最少用量から０．５ｍｇＰ／ｋｇ／日までの範囲の用量で投与されるゾー
ルドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５３、ネリドロ
ネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルドロネートまた
はクロドロネートである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】前記ビスホスホネートが予防的処置として投与される、請
求項７０に記載の方法。
【請求項７８】前記ビスホスホネートが治療的処置として投与される、請
求項７０に記載の方法。
【請求項７９】軟部組織の石灰化に関連する病態を緩和するためのキット
であって、軟部組織の石灰化を抑制するビスホスホネートを骨の石灰化を実質的に抑制し
ない用量で含む容器、および軟部組織の石灰化またはプロテーゼ装具の石灰化に関連する病態の治療に該ビ
スホスホネートを使用することについて教示する指示物、を含む、キット。
【請求項８０】前記ビスホスホネートが、アレンドロネート、イバンドロ
ネート、ゾールドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５
３、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルド
ロネートおよびクロドロネートからなる群から選択される、請求項７９に記載の
キット。
【請求項８１】哺乳類でアテローム性硬化症の症状または進行を緩和する
ためのキットであって、石灰化部位でマクロファージによる鉱物の除去を抑制するビスホスホネートを
含む容器、および哺乳類でアテローム性硬化症の症状または進行の治療に該ビスホスホネートを
使用することについて教示する指示物、を含む、キット。
【請求項８２】前記ビスホスホネートが、アレンドロネート、イバンドロ
ネート、ゾールドロネート、インカドロネート、リセドロネート、ＥＢ−１０５
３、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ＹＨ５２９、チルド
ロネートおよびクロドロネートからなる群から選択される、請求項８１に記載の
キット。
【請求項８３】カルシウムまたはカルシウム塩をフェツインと接触させる
ことを包含する、水相中のカルシウム塩のサイズまたは結晶構造を安定化させる
方法。
【請求項８４】予め選択した部位へ石灰化イニシエーターを運搬する方法
であって、標的化分子に結合させたフェツイン−鉱物複合体を提供すること、ここで該標
的化分子は該予め選択した部位と特異的に結合する；および該フェツイン−鉱物複合体を該予め選択した部位と接触させること、を包含する、方法。
【請求項８５】マトリックス内に鉱物の核を分布させる方法であって、該マトリックスにフェツイン−鉱物複合体を含浸させること、および該フェツイン−鉱物複合体から鉱物が放出されるように該フェツインを変性さ
せること、を包含する、方法。
【請求項８６】鉱物塩をフェツインと接触させることを包含する、水相中
の鉱物塩のサイズまたは結晶構造を安定化させる方法。
【請求項８７】単離されたフェツインと接触されている、水相中で安定化
させた鉱物または鉱物塩。