JP2003516754A - 核酸の単離精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は核酸、特にゲノムＤＮＡを有機材料から単離精製する方法に関する。本発明はさらに該方法において使用するためのキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は核酸、特に有機材料由来のゲノムＤＮＡを単離精製する方法に関する
。本発明はまた該方法に使用するためのキットに関する。

【０００２】 微生物及び植物、結果的には食品の性質にもまた影響を与える組換えＤＮＡ技
法が広まる間に、例えば大豆、とうもろこし、または小麦などの遺伝子組換え生
物体及び野菜補助食を検出することを目的として定性的及び定量的方法がこれま
で開発された。これらの検出方法のためには、核酸を対応する材料から単離しな
ければならない。同時にＤＮＡは良質で高分子量でなければならない。さらに、
単離されたＤＮＡは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）や制限酵素を用いる単離Ｄ
ＮＡの切断などの分子遺伝子学研究のために十分である純度で存在していなけれ
ばならない。

【０００３】 ＤＮＡを単離するための多くの方法が既に記載されており、最初に開発された
これらの方法は、極めて特定の基質、例えばグラム陽性またはグラム陰性細菌、
植物、血液、食品からＤＮＡを単離するための方法であった。これらの方法はし
ばしばフェノール、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ)又は塩
酸グアニジンのような健康に害のある物質を利用する。他の方法ではＤＮＡ結合
性担体物質を含む小型カラム又は遠心フィルターの形態で高価なプラスチック品
を利用し、その結果リサイクル不可なプラスチック廃棄物が蓄積される。

【０００４】 従って、例えばAusubelらの標準的研究（Current Protocols in Molecular Bi
ology, Unit 2.3 and 2.4, John Wiley & Sons, Inc., 1994)は、細菌又は植物
組織からゲノムＤＮＡを単離する技術を記載する。ゲノムＤＮＡを細菌から単離
するとき、細胞をまず溶解を目的として緩衝液中に取り出す。細胞を粉砕した後
、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を添加し、ＣＴＡＢがタ
ンパク質と多糖類を除去するように働かせる。ＣＴＡＢ−タンパク質／多糖類複
合体を次に続くクロロホルム／イソアミルアルコール抽出及び遠心分離に関連し
て分離除去する。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールでさらに抽
出をした後、ＤＮＡをイソプロパノールで沈澱させ、７０％アルコールで洗浄し
、水性緩衝液中に取り出す。

【０００５】 ゲノムＤＮＡを植物組織から単離する場合、Ausubel らはＣＴＡＢ処理を含む
方法か塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配遠心による単離のいずれかを提唱する。後
者の方法では、臭化エチジウムがＤＮＡを検出するのにさらに用いられる。

【０００６】 Foodstuff Requirement Act35条に従った分析方法に関する公認の収集による
と、特に微生物における組換え変異を検出することを目的としてソーセージから
ゲノムＤＮＡを単離する工程はフェノール抽出を含んでいる。

【０００７】 他の単離方法ではＤＮＡ結合性物質を含む小型で単回使用のカラムの形態で高
価なプラスチック製品を利用する。従って、EP 0616 639は、例えば細胞を破壊
し、核酸をまず最初にカラム内のアニオン交換基に結合させ、そして洗浄工程に
よって精製するという核酸の単離精製方法を記載する。その後、下流の無機支持
材に結合されるように核酸をアニオン交換基から遊離させる。その際、さらに水
性アルコール溶液を用いる洗浄工程、そして最後に水性溶液への溶出工程が続く
。

【０００８】 Ｒｏｃｈｅ社は、例えば制限酵素分析やＰＣＲなどの種々の分子生物学的方法
に適したＤＮＡを単離精製するためのHigh Pure^TMＰＣＲ鋳型調製キットを提供
している。他の製品の中で、そのキットは特別なガラス製ファイバーマットを含
む遠心フィルターチューブを提供する。ＤＮＡが精製される細菌を溶解し、試料
をチューブに添加し、遠心分離によってガラス製ファイバーマット内に分配する
。ＤＮＡをガラス製ファイバーマットに結合させ、種々の溶液を用いて精製する
。分離除去されるべき洗浄液及び不要な細胞残渣を遠心分離によって除去する。
その後、ＤＮＡを緩衝液中に溶出させることによってガラス製ファイバーから遊
離させる。

【０００９】 先行技術の方法の不都合は、それらが有機溶剤であるフェノールやセチルトリ
メチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ)のような健康に害のある物質を用いる
ことであり、それらの溶剤は別個に処理しなければならないことである。他の方
法では、例えば高価で小型のＤＮＡ−結合性単回使用カラムを利用し、その結果
リサイクル不可のプラスチック廃棄物を蓄積することになる。さらに各々の方法
はＤＮＡ起源に関して非常に限られた範囲でしか利用できないという不都合もあ
る。

【００１０】 従って、本技術的課題はフェノールやセチルトリメチルアンモニウムブロミド
のような環境に害のある成分を使用することなく、またリサイクル不可のプラス
チック廃棄物の蓄積がない核酸の単離精製方法を開発することにある。さらに、
そのプロセスはコスト的に有利で、原則として非常に広範囲の有機材料からＤＮ
Ａを単離するのに適しているべきである。

【００１１】 本技術的課題は、核酸、特にゲノムＤＮＡを有機材料から単離精製する方法で
あって、以下の工程： （a）少なくとも０.２ＭのＮａＣｌ又はＫＣｌを含む溶液Ａ中に核酸を含有する
有機材料を取り出す工程； （b）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を添加する工程； （c）プロテアーゼを添加する工程； （d）５から１２０分間、５０から７５℃にてインキュベートする工程； （e）ＮａＣｌ、ＫＣｌ及び酢酸ナトリウムから成る群から選択される塩を含む
溶液Ｄを該塩が少なくとも２．３Ｍの最終濃度に達するように添加する工程； （f）不溶性物質を分離除去する工程；及び （g）核酸をアルカノールで沈澱させる工程； を含む上記方法によって解決される。

【００１２】 驚くべきことに、この方法は非常に異なる有機材料及び／又は生物体から核酸
を単離するのに用いることができることがわかった。従って、この方法は酵母、
カビ、グラム陽性及びグラム陰性細菌、光合成紅色硫黄細菌（グラム陰性）、細
胞培養物、植物、動物及びヒト組織、血液、毛根、唾液から、あるいは肉、肉製
品、及び非常に広範囲な方法で処理され、かつ非常に広範囲な成分を有する他の
食品からもまた核酸を単離するのに適している。この方法の他の利点はフェノー
ルやＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）のような環境に害のあ
る成分の使用が避けられ、例えば小型ＤＮＡ結合性カラムの形態のリサイクル不
可なプラスチック廃棄物の蓄積がないことである。さらに、本方法は、均質化工
程なしに短時間でゲノムＤＮＡを単離することを可能とする。得られる核酸の質
は際立っている。ＤＮＡは高分子量であってＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）又は
制限酵素による切断のような分子遺伝学的操作に十分な純度で得られる。さらに
収率は小型のＤＮＡ結合性カラムを用いる他の方法と比較して非常に高い。さら
に本方法は他の方法に比べてずっとコスト効率的である。

【００１３】 もうひとつの方法においては、工程（ａ）及び／又は（ｂ）の後に５０から７
５℃におけるインキュベーションをさらに行う。好ましい方法では、ドデシル硫
酸ナトリウム及び／又はプロテアーゼを溶液Ａとともに添加する。これを行うこ
とによって本方法をさらにスピードアップすることが可能となる。

【００１４】 もうひとつの好ましい方法では、プロテアーゼＫをプロテアーゼとして用いる
。好ましくはその混合物に同様にＲＮａｓｅをさらに添加する。特にＤＮＡが植
物及び肉類から調製される場合、ＲＮＡを分解することが必要である。好ましく
は、不溶性物質を工程（ｄ）の後に分離除去する。高い脂肪含有量を有する食品
を扱う場合、好ましい方法は工程（ａ）の前に最初の工程として脂肪を除去する
ためにヘキサンによる処理を含む。

【００１５】 もうひとつの好ましい方法では、溶液Ｄを添加した後の混合物中の塩の最終濃
度が少なくとも２．５Ｍである。高い塩濃度は多糖類及びタンパク質の沈澱及び
分離除去を可能にする。本方法の他の好ましい態様では、溶液Ｄ添加後の塩の最
終濃度が少なくとも２．７５Ｍ、好ましくは少なくとも３．０Ｍ、特に好ましく
は３．５Ｍである。

【００１６】 高い塩濃度の使用は多糖類及びタンパク質を定量的に分離除去するのに特によ
く適している。これに関連して、要求に従い塩濃度は処理されるべきバイオマス
の性質に応じて特異的に調整することができる。少なくとも４Ｍ、好ましくは少
なくとも５Ｍの塩濃度でも個々の試料を処理するのに適当である。従って、５か
ら６Ｍの塩濃度が植物の部分の処理には特に適している。

【００１７】 もう１つの特に好ましい方法では、ドデシル硫酸ナトリウムの添加後の最終濃
度が０．５から２．５重量％である。他の好ましい方法では、ドデシル硫酸ナト
リウムの添加後の最終濃度が１．０から２．５重量％であり、好ましくは１．５
から２．５重量％であり、特に好ましくは２．０から２．５重量％である。２重
量％程度のドデシル硫酸ナトリウムがあらゆる種類の細胞を破壊するにも特に適
していることがわかった。

【００１８】 特に、高いＳＤＳ濃度と高い塩濃度を組み合わせるという手段によって、本発
明の方法は高品質な核酸を非常に満足のいくようにかつ非常に迅速に広範囲な起
源から精製することが可能となる。

【００１９】 もう１つの特に好ましい方法では、工程（ｄ）におけるインキュベーションを
６５℃で１５から６０分間行う。このパラメータの選択により本発明の方法でＤ
ＮＡを高収率で得ることが可能になる。

【００２０】 もう１つの特に好ましい方法では、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、二ナ
トリウム塩）及び０．４から１ＭのＮａＣｌを含み、そのｐＨが７．５から８．
５に調節されている溶液を溶液Ａとして用いる。

【００２１】 もう１つの特に好ましい方法では、ドデシル硫酸ナトリウムを添加した後の最
終濃度が０．５から２．５重量％である。

【００２２】 さらに、２．５から６ＭのＮａＣｌ溶液を溶液Ｄとして用いる。エタノール又
はイソプロパノールがアルカノールとして好ましく用いられる。

【００２３】 特に好ましい方法では、核酸を沈澱させた後、７０から８５％濃度のエタノー
ル又はイソプロパノール溶液で処理する。この工程は核酸からその塩を除去する
。

【００２４】 もう１つの好ましい方法では、冷却工程を工程（ｆ）の前に行う。この工程で
は、温度が好ましくは−１０℃未満、特に好ましくは−２０℃未満になるように
する。この冷却は好ましくは少なくとも５分間行う。この工程はタンパク質の沈
澱を促進する。

【００２５】 特に好ましい方法では、本発明の方法をフェノールの添加なしに行う。これは
十分に高い濃度のドデシル硫酸ナトリウムと高い塩濃度の組み合わせ使用が清浄
な核酸沈澱物を得るのに適していることがわかったからである。

【００２６】 もう１つの特に好ましい方法では、有機材料が原核細胞、真核細胞、植物の種
子、植物の部分、植物油、食品、ヒト及び動物組織、ヒト排出物、精液、及び唾
液から成る群から選択される。従って、本発明の方法は有益なことに、広いスペ
クトラムの材料から核酸を単離するのに例外なく使用できることがわかった。そ
れゆえ、プロトコルにいかなる変更を加えることなく、種々の材料から自動化さ
れた手法で同時に核酸を単離することもまた可能である。

【００２７】 更に、本技術的課題は核酸の単離精製のための本発明方法に使用するためのキ
ットであって、 −少なくとも０.２ＭのＮａＣｌ又はＫＣｌを含む溶液Ａ −ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム） −プロテアーゼ −少なくとも２．５ＭのＮａＣｌ、ＫＣｌ及び酢酸ナトリウムから成る群から
選択される塩を含む溶液Ｄ −アルカノール溶液 を含む上記キットの提供によって解決される。

【００２８】 該キットは使用者が核酸、特にゲノムＤＮＡを非常に広範囲な有機材料から本
発明の方法を用いて単離精製することを可能にする。このキットの利点は別個に
処分しなければならないフェノール又はＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウ
ムブロミド）のような環境に害のある成分のいずれをも含まないという事実に起
因する。さらに、該キットはいかなる高価で小型のＤＮＡ−結合性カラムをも含
まず、これは該キットを本発明の方法に用いる際にリサイクル不可のプラスチッ
ク廃棄物の蓄積がないということを意味している。

【００２９】 好ましい態様では、該キット内の溶液ＡはＥＤＴＡ及び０．４から１ＭのＮａ
Ｃｌ又はＫＣｌを含み、溶液のｐＨは７．５から８．５に調節されている。

【００３０】 もう１つの特に好ましい態様では、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が溶液
Ａ中に１から２．５重量％の濃度で存在するか、別の固体物質として存在するか
、あるいは１０から２５重量％の濃度を有する別の溶液中に存在する。ＳＤＳが
別の固体物質として該キットに存在し、既に定量してある場合は、ＤＮＡ単離を
開始する前に使用者が所定容量でキットに存在する溶液Ａに１から２．５重量％
の濃度になるようにそのＳＤＳを添加するか、ＳＤＳを水又はＴＥ緩衝液に添加
することによって１０から２５重量％の濃度を有する溶液Ｂ（実施例：材料の項
参照）を調製すればよい。

【００３１】 該キットに存在するプロテアーゼは好ましくはプロテアーゼＫである。

【００３２】 特に好ましい態様によれば、溶液Ｄ中の所定の塩濃度は５Ｍである。

【００３３】 該キットのもう１つの特に好ましい態様では、ＲＮａｓｅもまた別の固体物質
として存在する。原則的には、ＲＮａｓｅは凍結乾燥粉末として該キットに含め
られる。ＤＮＡ単離を開始する前に、使用者は既に定量してあるＲＮａｓｅを所
定容量でキットに存在する溶液Ａに特定の濃度になるよう添加するか、別のＲＮ
ａｓｅ溶液を調製すればよい。

【００３４】 もう１つの特に好ましい態様では、該キットはさらに７０から８５％濃度のエ
タノール又はイソプロパノール溶液を含む。この溶液は塩からそれを精製するた
めに沈澱したＤＮＡを処理するのに用いられる。

【００３５】 もう１つの好ましい態様では、該キットはフェノールもフェノール性溶液のい
ずれをも含まない。

【００３６】 本技術的課題はさらに核酸、特にゲノムＤＮＡを有機材料から単離精製するた
めに本発明のキットを用いることによって解決される。該キットに提供される溶
液及び化学物質は、非常に広範囲の有機材料から短い時間でゲノムＤＮＡを単離
することを可能にするような本発明方法に適合している。

【００３７】 本発明の方法を以下の実施例においてさらに詳細に説明する。

【実施例】

以下に述べる本実施例では次の溶液及び材料を用いる。材料 −溶液Ａ： ０．４Ｍ ＮａＣｌ １０ｍＭ ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８ ２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８ −溶液Ｂ： ２０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム） −溶液Ｃ： ２０ｍｇプロテナーゼＫ／ｍｌ（冷所にて保存）

【００３８】 溶液Ａ：溶液Ｂ：溶液Ｃを１：０．１：０．０２の割合で混合し、調製を行う
直前にその混合物が使用準備できているようにする。 −溶液Ｄ： ５Ｍ ＮａＣｌ溶液 −沈澱のためのイソプロパノール又は分析グレードの１００％エタノール −沈澱したＤＮＡを精製するための分析グレードの７０％エタノール −滅菌した２倍希釈のＨ₂Ｏ又は１×ＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０ （１０ｍＭ ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ） −６５℃及び３７℃を提供する水浴 −１４，０００ｇまで提供する卓上遠心機 −滅菌した、単回使用のプラスチック製品（２ｍｌのエッペンドルフ製キャップ
付きチューブ又は５０ｍｌのファルコチューブ）

【００３９】 １．方法の一般的原理 核酸を含む有機材料を０．４ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８
）、２ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含む過剰量の溶液Ａ中に取り出す。これに関し
、その溶液の量は材料の約２倍容量に相当するべきである。１容量の溶液Ａに対
してまず１／１０容量の溶液Ｂ（２０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）及び
２／１００容量の溶液Ｃ（プロテアーゼＫ、２０ｍｇ／ｍｌ）を材料に添加し、
混合物を６５℃にて１５から６０分間インキュベートする。続く単離処理は室温
で行う。材料の量が少ないとき、例えば０．５ｇ未満のとき、完全な可溶化物上
清をさらなる処理に供する。基質量がより多いときは、液状の可溶化物の１ｍｌ
だけをさらなる処理に供する。もし可溶化物が材料とは別にピペットオフできな
い場合は、その溶液を卓上遠心分離機で２０００ｇにて５分間遠心分離する。混
合物の容量を測定し、０．７５容量の溶液Ｄ（５Ｍ ＮａＣｌ）を混合物に添加
し、全体を激しく混合する。続いて１４，０００ｇで１０分間遠心分離を行い、
細胞残渣、タンパク質及び多糖類を分離除去する。液状の上清を取り除き、その
中に存在するＤＮＡを除去された上清の容量に基づき１容量のイソプロパノール
にて室温で５分間沈殿させる。沈澱したＤＮＡを１４，０００ｇにて１０分間遠
心にかけた後、上清をピペットオフし、沈澱したＤＮＡを７０％強度のエタノー
ルを用いて塩から精製する。エタノールをペピットオフし、ペレットを３７℃に
て１５分間乾燥し、水又はＴＥ緩衝液に取り出す（ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ溶液）。
可溶化に要する時間によるが、全プロセスに約６０分から９０分要する。

【００４０】 ２．特別調製 ａ）植物からの調製 植物の部分、例えば０．１ｇの花粉を２００μｌの溶液Ａに取り出し、一方、
２個の大豆を１ｍｌの該溶液及び２個の大麦種子を１０ｍｌの該溶液に取り出す
。その後、適当量の溶液Ｂ及び溶液Ｃを加え、その混合物を６５℃にて６０分間
溶解させる。高含量の油を含んでいる植物をヘキサンで前処理することは不要で
ある。溶解後、不溶性物質を分離除去する。非常にタンパク質豊富な植物の場合
は、塩処理工程の後、例えば５Ｍ ＮａＣｌ溶液(溶液Ｄ）を添加後にクロロホ
ルム抽出を行い、あるいはＲＮａｓｅをＲＮＡを除去するために添加してもよい
。不溶性物質を分離除去した後、核酸を沈澱させる。沈澱したＤＮＡを、もはや
塩がＤＮＡペレットから溶液中に出なくなるまで７０％エタノールにて１回又は
２回精製する。小さなＤＮＡペレットを５０μｌの水又はＴＥ緩衝液に取り出し
、一方、大きなＤＮＡペレットを４００μｌの水又はＴＥ緩衝液に取り出す。

【００４１】 ｂ）組織及び肉からの調製 組織（新鮮な、冷凍された、又は調理された）を約１ｃｍ²の大きさで、約０
．２ｇに相当する切片にカットし、４００μｌの溶液Ａ、４０μｌの溶液Ｂ及び
８μｌの溶液Ｃ（プロテナーゼＫ２０ｍｇ／ｍｌ）に取り出し、６５℃にて６０
分間溶解させる。不溶性物質を分離除去し、適当量の溶液Ｄを加える。その後、
不溶性物質をもう一度分離除去する。核酸を先の混合物の全容量に対して２容量
の１００％エタノールにて沈殿させる。沈殿前に必要に応じてＲＮＡをＲＮａｓ
ｅ（１／１００容量、ＲＮａｓｅ１００μｇ／ｍｌ）を用いて３７℃にて１５分
間消化する。ＤＮＡペレットを最終的に１００μｌの水かＴＥ緩衝液に取り出す
。

【００４２】 ｃ）食品からの調製 食品が高脂肪含量を有する場合は、溶解工程の前にヘキサンでそれらを処理す
ることが適当である、たとえば食品をヘキサンの層で覆い、混合物を室温にて約
１５分間振とうする。ヘキサンをピペットオフし、実施例１に記載されたように
溶解を行う。固形の食品、例えば、１００ｍｇのコーンフレークを４００μ１の
溶液Ａに取り出し、一方、２ｇのミューズリーを１０ｍｌの溶液Ａに取り出す。
これらの固形の食品をモーター内で挽くことによって細かく砕くことは必要では
ないが、この工程はＤＮＡの収率を増加させる。液状の食品は１．５から２容量
の溶液Ａ中に１容量の材料の割合で取り出す。適当量の溶液Ｂ及び溶液Ｃを加え
る。有機材料を溶解させるために、その混合物を６５℃にて６０分間インキュベ
ートし、場合により振とうする。液体の上清をピペットオフすることができない
場合は、固体成分を２０００ｇで５分間遠心する。食品があまりに大きな程度に
膨張する場合は、続いて溶液Ａをさらに添加することもまた可能である。溶液Ｄ
による塩処理及び遠心分離後、追加の固層が液層の上に形成される可能性もある
。液層をこの固層から注意深く取り去ることもできる。その後エタノールによる
沈殿を行う。原則としてＤＮＡペレットを１００μｌの水又はＴＥ緩衝液に取り
出す。

【００４３】 ｄ）グラム陽性及びグラム陰性細菌、酵母及びカビからのＤＮＡ調製 微生物はその液体から採取し、そして最初の容量に応じて３０００ｇでの遠心
分離又は真空ろ過装置と少なくとも４５μｍの孔径のフィルターを用いるろ過に
よって採取する。微生物をろ過物から洗浄し、さらなる遠心分離によって濃縮す
る。平均的なサイズのコロニーに相当する多数の微生物の場合、その微生物を２
００μｌの溶液Ａに取り出す。最初の量がより多い場合、５００μｌの溶液Ａを
用いる。相当する量の溶液Ｂ及びＣを添加する。６５℃で１５分間のインキュベ
ーションは細菌を溶菌するのに十分であり、一方、酵母やカビの場合は６５℃で
６０分のインキュベーションで十分である。その後相当する量の溶液Ｄを添加し
、不溶性物質を分離除去する。微生物由来のＤＮＡを上清の容量に基づいて２容
量のエタノールを用い、−２５℃で少なくとも１５分間沈殿させる。ペレットを
７０％エタノールにて精製し、乾燥し、１０から１００μｌの水に取り出す。

【００４４】 ｅ）細胞培養物からの調製 細胞培養物の細胞はトリプシン化せず、調製前にフラスコ外に遊離させてもよ
いが、代わりにフラスコ内で直接に溶解させてもよい。細胞をまず１×ＰＢＳで
洗浄する。予め混合しておいた溶液Ａ，Ｂ，及びＣをその培養フラスコに注ぐ。
フラスコ全体をときどきかき混ぜながら６５℃にて６０分間インキュベートする
。溶解物を５０ｍｌの遠心チューブ内にあけ、不溶性物質を分離除去する。塩処
理をその後行う。その後、遠心分離をたいていの遠心分離機において５０００ｇ
で、好ましくは８０００ｇで１０分間行う。イソプロパノールを用いて沈殿させ
た後、ＤＮＡを２００から４００μｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、より小さいチュ
ーブに移す。

【００４５】 本発明の方法は非常に広範囲の有機材料からゲノムＤＮＡを単離するために行
われた。ＤＮＡは次のリストに挙げた材料からうまく単離され、それによって本
発明の方法の普遍的な応用性が実証された。

【００４６】 培養プレート及びビールから得られる細菌： シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、大腸菌(Escherichia coli)、ラクトバ
チルス属(Lactobacillus sp.)、メガスファエラ（Megasphaera)、ペクチナツス
（Pectinatus)及びアロクロマチウム ヴィノサム（Allochromatinum vinosum)

【００４７】 培養プレート、液体培養物及び乾燥材料及びビールから得られる酵母： サッカロミセス属(Saccharomyces sp.)、及び壁紙、培養プレート及び果物か
らのカビ

【００４８】 下記の種の動物、新鮮肉（冷凍、調理、又は焼かれた；例えば筋肉、皮膚、脂肪
、肝臓、腎臓、尾、及び耳を含む）： ブタ、ウシ、ノロジカ、マウス、トリ、七面鳥、キジ、ならびにヘビ、カブト
ムシ、ハエ、及びハチからの材料

【００４９】 細胞培養物： 培養された線維芽細胞

【００５０】 下記の種の植物（生の、調理及び冷凍された；葉、茎、根、花弁、花粉、及び果
実）： とうもろこし、大豆、ルピナス、セイヨウアブラナ、さとうきび、ポテト、ト
マト、小麦、大麦、ライ麦、ホップ、モミ、スパイダープラント（Chlorophytum
comosum)、ゴムプラント（Ficus benjamini)及び室内用シュロ

【００５１】 食品： 大豆タンパク単離物、レシチン、冷抽出大豆油、マーガリン、醤油、ケーキ及
び練り粉菓子、大豆製エスカローペ、大豆製ソーセージ、ベビーフード、スポー
ツ選手用食品、食餌飲料、ベーキングミクスチャー、ベジタリアンスプレッド(v
egetarian spread)、コーンスターチ、マルトデキストリン、小麦粉、コーンフ
レーク、ミューズリー、ミューズリーバー、ポップコーン、トルティーラチップ
、セモリーナ、ワッフル、ポレンタ、ポップライス、牛乳、クリーム、ヨーグル
ト、ココア、チョコレート、詰め物をしたチョコレート、Tween 80、はちみつ
、サラミ、コンビーフ及びほか多数

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ミュッヒェル ガブリエール ドイツ連邦共和国 53859 ニーデルカッ セル エーレンシュトラーセ １ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA03 HA03

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸、特にゲノムＤＮＡを有機材料から単離精製する方法で
   あって、以下の工程： （a）少なくとも０.２ＭのＮａＣｌ又はＫＣｌを含む溶液Ａ中に核酸を含有する
   有機材料を取り出す工程； （b）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を添加する工程； （c）プロテアーゼを添加する工程； （d）５から１２０分間、５０から７５℃にてインキュベートする工程； （e）ＮａＣｌ、ＫＣｌ及び酢酸ナトリウムから成る群から選択される塩を含む
   溶液Ｄを該塩が少なくとも２．３Ｍの最終濃度に達するように添加する工程； （f）不溶性物質を分離除去する工程；及び （g）核酸をアルカノールで沈澱させる工程； を含む上記方法。
2. 【請求項２】 工程（ａ）及び／又は（ｂ）の後に５０から７５℃における
   インキュベーションをさらに行う請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ドデシル硫酸ナトリウム及び／又はプロテアーゼを溶液Ａと
   ともに添加する請求項１又は２に記載の方法。
4. 【請求項４】 プロテアーゼＫをプロテアーゼとして用いる請求項１から３
   のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】 ＲＮａｓｅをさらに添加する請求項１から４のいずれかに記
   載の方法。
6. 【請求項６】 不溶性物質を工程（ｄ）の後に分離除去する請求項１から５
   のいずれか記載の方法。
7. 【請求項７】 ヘキサンによる処理を工程（ａ）の前に最初の工程として行
   う請求項１から６のいずれかに記載の方法。
8. 【請求項８】 溶液Ｄ添加後の塩の最終濃度が少なくとも２．５Ｍである請
   求項１から７のいずれかに記載の方法。
9. 【請求項９】 溶液Ｄ添加後の塩の最終濃度が少なくとも２．７５Ｍである
   請求項１から８のいずれかに記載の方法。
10. 【請求項１０】 溶液Ｄ添加後の塩の最終濃度が少なくとも３．０Ｍである
    請求項１から９のいずれかに記載の方法。
11. 【請求項１１】 溶液Ｄ添加後の塩の最終濃度が少なくとも３．５Ｍである
    請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
12. 【請求項１２】 ドデシル硫酸ナトリウムの添加後の最終濃度が０．５から
    ２．５重量％である請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
13. 【請求項１３】 ドデシル硫酸ナトリウムの添加後の最終濃度が１．０から
    ２．５重量％である請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
14. 【請求項１４】 ドデシル硫酸ナトリウムの添加後の最終濃度が１．５から
    ２．５重量％である請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
15. 【請求項１５】 ドデシル硫酸ナトリウムの添加後の最終濃度が２．０から
    ２．５重量％である請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
16. 【請求項１６】 工程（ｄ）におけるインキュベーションを６５℃にて１５
    から６０分間行う請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
17. 【請求項１７】 ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩）及
    び０．４から１．０ＭのＮａＣｌ又はＫＣｌを含み、そのｐＨが７．５から８．
    ５に調節されている溶液を溶液Ａとして用いる請求項１から１６のいずれかに記
    載の方法。
18. 【請求項１８】 ２．５から６ＭのＮａＣｌ溶液を溶液Ｄとして用いる請求
    項１から１７のいずれかに記載の方法。
19. 【請求項１９】 エタノール又はイソプロパノールをアルカノールとして用
    いる請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
20. 【請求項２０】 沈澱させた後、濃度が７０から８５％であるエタノール又
    はイソプロパノール溶液で核酸を処理する請求項１から１９のいずれかに記載の
    方法。
21. 【請求項２１】 冷却工程を工程（ｆ）の前に行って温度を−１０℃未満、
    好ましくは−２０℃未満にする、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
22. 【請求項２２】 フェノールを用いない請求項１から２１のいずれかに記載
    の方法。
23. 【請求項２３】 有機材料が原核細胞、真核細胞、植物の種子、植物の部分
    、植物油、食品、ヒト及び動物組織、ヒト排出物、精液、及び唾液から成る群か
    ら選択される請求項１から２２のいずれかに記載の方法。
24. 【請求項２４】 請求項１から１４のいずれかに記載の核酸の単離精製方法
    に用いるためのキットであって、 −少なくとも０.２ＭのＮａＣｌ又はＫＣｌを含む溶液Ａ −ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム） −プロテアーゼ −少なくとも２．５ＭのＮａＣｌ、ＫＣｌ及び酢酸ナトリウムから成る群から
    選択される塩を含む溶液Ｄ −アルカノール溶液 を含む上記キット。
25. 【請求項２５】 溶液ＡがＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウ
    ム塩）及び０．４から１．０ＭのＮａＣｌ又はＫＣｌを含み、そのｐＨが７．５
    から８．５に調節されている請求項２４に記載のキット。
26. 【請求項２６】 ドデシル硫酸ナトリウムが溶液Ａ中に１から２．５重量％
    の濃度で存在するか、１０から２５重量％の濃度を有する別の溶液中に存在する
    か、あるいは別の固体物質として存在する、請求項２４又は２５に記載のキット
    。
27. 【請求項２７】 プロテアーゼがプロテアーゼＫである請求項２４から２６
    のいずれかに記載のキット。
28. 【請求項２８】 溶液Ｄ中の所定の塩濃度が５Ｍである請求項２４から２７
    のいずれかに記載のキット。
29. 【請求項２９】 濃度が７０から８５％のエタノール又はイソプロパノール
    溶液がさらに存在する請求項２４から２８のいずれかに記載のキット。
30. 【請求項３０】 フェノール又はフェノール性溶液が存在しない請求項２４
    から２９のいずれかに記載の方法。
31. 【請求項３１】 ＲＮａｓｅがさらに存在する請求項２４から３０のいずれ
    かに記載の方法。
32. 【請求項３２】 請求項１から２３のいずれかに記載される、核酸、特にゲ
    ノムＤＮＡを有機材料から単離精製するための請求項２４から３１のいずれかに
    記載のキットの使用。