JP2003513641A - プロテイン２５．１による神経内分泌細胞分化の調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 介入の標的としての新規ＩＧＦＢＰ−ｒＰ１相互作用タンパク質Ｐ２５．１の利用による、ドラッグスクリーニング検定法、診断検定法、及びがん細胞中の神経内分泌細胞分化の誘導を阻害することを含めた腫瘍抑制やがん治療のための方法が開示される。本発明はまた、Ｐ２５．１ ｃＤＮＡ配列、Ｐ２５．１ポリペプチドとその断片、抗Ｐ２５．１抗体、及び抗Ｐ２５．１アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の技術分野 本発明は、新規IGFBP-rP1相互作用タンパク質P25.1の利用による、ドラッグス
クリーニング検定法、診断検定法、及びがん細胞中の神経内分泌細胞分化の誘導
を阻害することを含めた腫瘍抑制やがん治療のための方法を提供する。本発明は
また、P25.1 cDNA配列、P25.1ポリペプチドとその断片、抗P25.1抗体、及び抗P2
5.1アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。 発明の背景 がんの進行と相関する神経内分泌細胞分化：神経内分泌(NE)細胞は小細胞肺が
ん、子宮頸がん及び前立腺がんを含む多数のがんに関係しているとみなされてき
た。前立腺がん患者ではNE細胞数の増加は進行性及び転移性腫瘍と相関するし、
またアンドロゲン不応性であり、したがって在来様式の化学療法に対して抵抗性
である進行前立腺がんを理由とする臨床的予後の不振とも相関する。

【０００２】 NE細胞の発生起源は未解明：ニューロン起源であれ皮下細胞起源であれ、前立
腺がんNE細胞の発生系統(すなわち前駆細胞の特性)は不明である。NE細胞はニュ
ーロンと形態学的に類似しており、またボンベシン、セロトニン、及び甲状腺刺
激ホルモン様、副甲状腺ホルモン様及びカルシトニン様ペプチドなどを含む多様
な神経ペプチドを分泌するものも多い。また、NE細胞はクロモグラニンA (Chr A
)やニューロン特異的エノラーゼ(NSF)を含む特異的ニューロンマーカーを含有す
る。さらに、NE細胞は腫瘍内周辺細胞の増殖に対して傍分泌刺激を与え、それに
よって隣接がん細胞の増殖を促している可能性もある。

【０００３】 がん細胞中の神経内分泌細胞分化に対するMAPキナーゼ(MAPK)の関与：前述し
た特性未解明の前駆細胞がNE細胞へと分化する正確な機構はまだ確定していない
。前立腺がん細胞中のNE分化は細胞性cAMPの増加によって促進されるかもしれな
い。たとえばcAMP類縁物質の追加は、又はcAMP依存プロテインキナーゼ(PKA)を
活性化する細胞性cDNAの増加は前立腺がん細胞系のin vitro NE分化を誘導する
。

【０００４】 したがって、PKAや、MAPキナーゼ(MAPK)などのような下流シグナル経路の活性
化が関与している可能性があるが、提唱されるこのMAPK仲介過程の下流エフェク
ターはin vivo、in vitroいずれでもまだほとんど同定されていない。 MAPKは、細胞増殖、分化、アポトーシス、及びストレスへの適応に関与するさま
ざまな転写因子の活性化につながる複数の信号伝達経路に主として関与している
。その厳密な生理学的／生物学的帰結は、特定の基底シグナル伝達経路の上流ア
クチベーターの発現とリン酸化の性格次第である。

【０００５】 たとえば、線維芽細胞、平滑筋細胞及び含脂肪細胞では、細胞性cAMPの増加は
Rasタンパク質ファミリーのメンバーを通じてMAPK経路を抑制することにより増
殖を阻害するが、PC12前ニューロン細胞(ラット副腎髄質に由来)ではPKAの活性
化はRap1/B-Raf/Mek/ MAPK経路を介した増殖停止と分化を招き、また神経成長因
子(NGF)の追加はこの形態学的過程を増進する。特にPC12細胞のニューロン分化
は、小GTP結合タンパク質上の活性部位のPKAによるリン酸化、及びその後のセリ
ン／トレオニンキナーゼ(B-Raf)とMAPKキナーゼ(Mek)の活性化に関与しそれを通
じてMAPKの活性化を招く。この後者の経路は特定の前立腺がん細胞系たとえばLN
Cap及びPC-3MのNE分化にも関係しているとされる。

【０００６】 したがって、これらの例では同じ下流MAPKメディエーターを介した2つの独立
した増殖及び分化機構が、独自のタンパク質からなり細胞の静止又は分化をプロ
グラムする複雑な特異的MAPKモジュールを必要とする。さらに、細胞はまず特定
タンパク質の誘導により代替マイトジェン経路を無効にしなければならないとい
う可能性が大きい。しかし、現時点で特性未解明の前駆細胞がNE細胞へと分化し
ていく厳密な機構は、NE分化に絡む基底シグナル伝達経路と同様に、不明である
。

【０００７】 したがって、NE細胞の前駆細胞について特性を解明することが技術上の課題と
なる。また、そうした前記細胞がNE細胞へと分化していく機構を理解することも
技術上の課題となる。さらに、これらの機構に関与しているシグナル伝達経路の
メディエーターを同定し特性を解明することも技術上の課題となる。

【０００８】 インスリン様成長因子シグナル系とIGFBPスーパーファミリー：インスリン様
成長因子(以下、IGF)シグナル系(以下、IGF軸)はリガンド(IGF-I、IGF-II及びイ
ンスリン)と膜貫通受容体ファミリー(インスリン、タイプ1及びタイプ2 IGF受容
体)からなる[Daughaday and Rotwein, Endcr. Rev. 10:68-9, 1989; Werner et
al., “Insulin-like growth factors: Molecular and Cellular Aspects,” CR
C Press, LeRoith (eds.), Boca Raton, pp. 17-47, 1991; Baxter & Martin, P
rog. Growth Factors Res. 1: 49-68 1989]。

【０００９】 さらに、IGF軸はヒトIGFBPスーパーファミリーを含み、それは6種類の高親和
性IGF結合タンパク質(以下、IGFBPs)と9種類の低親和性IGFBP関連タンパク質(以
下、IGFBP-rPs)からなる(表1にまとめて掲げる)。6種類のIGFBPsは同定、クロー
ニング、配列決定がすでに済んでいる(Baxter & Martin, Prog. Growth Factors
Res. 1: 49-68 1989; Rosenfeld et al., Recent Progress Hormones Res. 46:
99-159, 1991; Shimasaki & Ling, Prog. Growth Factor Res. 3:243- 266, 19
91)。IGFBPsは一次タンパク質構造の類似性が、特に55〜95アミノ酸残基からな
るタンパク質中央部の可変セグメントで仕切られた対応するN末端及びC末端領域
の類似性が高い(Shimasaki & Ling, Prog. Growth Factor Res. 3:243- 266, 19
91)。IGFBPsはIGF-I及びIGF-IIとの結合親和性が高いが、インスリンとの結合親
和性は高くない(Jones & Clemmons, Endocr. Rev. 16:3-34, 1995)。IGFBPsはIG
Fsの輸送、IGF半減期の延長、及びIGF受容体との相互作用への遊離IGFsの利用可
能性の調節という必須機能を果たすように見受けられる。したがって、IGFBPsは
増殖と分化に対するIGFsの効果を調節することになる[Jones & Clemmons, Endoc
r. Rev. 16:3-34, 1995; Lowe, “Insulin-like growth factors: Molecular an
d Cellular Aspects,” CRC Press, LeRoith (eds.), Boca Raton, pp. 49-85,
1991; Oh et al., Growth Regul. 3: 113-123, 1993; Kelley et al., Int. J.
Biochem. Cell Biol. 28: 619-637, 1993; Rajaram et al., Endocr. Rev. 18:
801-831, 1997]。最近のデータは、若干のIGFBPs (IGFBP-3など)が種々の細胞系
においてIGF独立的機構を介して重要な増殖抑制因子として働くという可能性の
ある生物学的機構とも符合する(Oh, Endocrine. 7:111-113, 1997; Oh, Breast
Cancer Res. Treat. 47: 283-293, 1998)。

【００１０】 IGFとの結合親和性が比較的低い「IGFBP-rPs」はそれにもかかわらずN末端領
域ではIGFBPsとの類似性がかなり高い(Hwa et al., Acta Ped. Scand. 428:37-4
5, 1999) (表1)。したがって、現在のデータは高親和性と低親和性の両メンバー
を含めた「IGFBPスーパーファミリー」という幅広い概念を支持しており、その
中の少なくとも若干のメンバーはIGF依存的手段とIGF独立的手段の両方によって
細胞増殖及び分化に影響を及ぼす(Hwa et al., Acta Ped. Scand. 428:37-45, 1
999; Baxter et al., Endocrinology 139:4036, 1998; Baxter et al., J. Clin
. Endocrinol. Metab. 83:3213, 1998)。

【００１１】 インスリン様成長因子結合タンパク質関連タンパク質1 (IGFBP- rP1)：IGFBP
-rP1は当初、髄膜がん腫化及び老化ヒト乳房上皮細胞からそれぞれ単離、クロー
ニングされた。IGFBP-rP1タンパク質のアミノ酸配列は高親和性IGF結合タンパク
質(IGFBP1-6)と類似性をもつことが証明された。組換えIGFBP-rP1ペプチドはIGF
-1及びIIと特異的に結合するが、IGFBP1-6と比べて親和性が低い。少なくともい
くつかの高親和性IGFBPsの主要な役割は前述のようにIGFsの輸送及び急速なクリ
アランス及び／又は分解からのIGFsの保護にあることがすでに自明とされるもの
の、IGFBP-rP1の生物学的機能は不明である。

【００１２】 がんで重要なIGF軸：IGFsは乳腺上皮細胞及び乳がん細胞増殖の主要な調節因
子である(Jones & Clemmons, Endocr. Rev. 16:3-34, 1995; Oh, Endocrine. 7:
111-113, 1997; Oh, Breast Cancer Res. Treat. 47: 283-293, 1998; De Leon
et al., Growth Factors 6: 327-336, 1992; Furlanetto & DiCarlo, Cancer Re
s. 44: 2122-2128, 1984; Huff et al., Cancer Res. 46: 4613-4619, 1986)。
たとえばIGF-IとIGF-IIは多数の乳がん細胞系にとってin vitroでの強力なマイ
トジェンである[De Leon et al., Growth Factors 6: 327-336, 1992; Huff et
al., Cancer Res. 46:4613-4619, 1986; Westley & May, Reviews on Endocrine
-RelatedCancer 39:29-34, 1991; Baxter et al., Insulin-like Growth Factor
s/Somatomedines, De Gruyter, Spencer (ed.), Berlin, pp. 615-618, 1983]。
さらに、大多数の乳腫瘍標本ではIGF-I及びIGF-II mRNAsが検出可能である(Cull
en et al., Cancer Res. 51:4978-4985, 1991; Paik, Breast Cancer Res. Trea
t. 22:31-38, 1992)。ほほすべての乳腫瘍標本及びそれらに由来する細胞系はタ
イプ1及びタイプ2 IGF受容体、それにインスリン受容体を発現し産生する(Culle
n et al., Cancer Res. 50:48-53, 1990; Bonneterre et al., Cancer Res. 50:
6931-6935, 1990; Peyrat & Bonneterre, Breast Cancer Res. Treat. 22:59-67
, 1992; De Leon et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 152:398-405, 1988
)。IGF-IとIGF-IIの両方のマイトジェン作用は、エストロゲン依存乳がん細胞の
使用によって確定されたように、タイプ1 IGF受容体によって仲介される(DeLeon
et al., Growth Factors 6:327-336, 1992; Papa et al., Mol. Endocrinol. 5
:709-717, 1991)。

【００１３】 その一方、IGFBPsの分子機構や生物学的機能は乳がん細胞との関連ではほとん
ど不明である。特に、乳がん細胞は種々のIGFBPsを分泌することが知られており
、これらはIGF受容体との相互作用への遊離IGFsの利用可能性を調節するように
見受けられる(Lamson et al., Growth Factors 5:19-28, 1991)。支配的な分泌I
GFBPは細胞のエストロゲン受容体の状態と相関するように見受けられる(Figuero
a et al., J. Cell. Biochem. 52:196-205,1993)。エストロゲン不応性[エスト
ロゲン受容体(ER)陰性]細胞は主に、主要種としてIGFBP-3とIGFBP-4を、微量種
としてIGFBP-6をそれぞれ分泌する。エストロゲン応答性(ER陽性)細胞は主要種
としてIGFBP-2とIGFBP-4を、微量種としてIGFBP-3とIGFBP-5をそれぞれ分泌する
。

【００１４】 求められる新たな発見：したがって、IGFBP-rPsの生物学的機能と関連の機能
付与機構を理解することが技術上の課題となる。さらに、これらの機構やタンパ
ク質を調節し、がん治療における予後、診断及び治療用途に使用しうるようにす
るための方法を確定することも技術上の課題となる。また、NE細胞の前駆細胞に
ついて特性を解明することも技術上の課題となる。最後に、これらの機構に関与
しているシグナル伝達経路のメディエーターを同定し特性を解明することも課題
となる。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【表２】

【００１７】 発明の要約 本発明は、P25.1ポリペプチドをコードしかつSEQ ID NO:1配列のコード領域又
はSEQ ID NO:1配列のコード領域と90%以上の相同性をもつ配列を含む単離DNA配
列を提供する。

【００１８】 本発明はさらに、SEQ ID NO:1に記載のcDNA配列によって発現される、又はSEQ
ID NO:1のコード領域と90%以上の相同性をもつ配列によって発現される単離タ
ンパク質又はポリペプチドを提供する。

【００１９】 本発明はさらに、進行性がんを確定するためのがん診断検定法を提供するが、
該検定法は、(a)腫瘍組織の試料を入手すること、及び(b)該試料中に存在するIG
FBP-rP1相互作用タンパク質P25.1特異的配列の量を求めるための配列同一性検定
法を実施し、もってP25.1特異的配列の量を進行性がんと相関させることを含む
ことを特徴とする。好ましくは、配列同一性検定法はPCR法、ELISA法、ハイブリ
ダイゼーション法及びそれらを組み合せた検定法からなる群より選択する。

【００２０】 本発明はさらに、がん治療活性をもつ試験化合物を同定するための方法を提供
するが、該方法は(a)試験化合物を、IGFBP-rP1ポリペプチドとIGFBP-rP1相互作
用タンパク質の両方を発現する細胞と接触させ、IGFBP-rP1か又はIGFBP-rP1相互
作用タンパク質を組み換え発現させるようにすること、及び(b)該試験化合物が
該細胞の増殖速度又は分化を変化させるかどうかを、特異的な細胞分化マーカー
の存在又は不存在によって判定し、もって該細胞の増殖速度又は分化を変化させ
る試験化合物をがん治療化合物として同定することを含むことを特徴とする。好
ましくはIGFBP-rP1相互作用タンパク質はP25.1である。

【００２１】 本発明はさらに、がん治療活性をもつ試験化合物を同定するための方法を提供
するが、該方法は(a)機能的IGFBP-rP1を、試験化合物の存在又は府存在下に、機
能的IGFBP-rP1相互作用タンパク質と接触させ、該試験化合物がIGFBP-rP1相互作
用タンパク質とIGFBP-rP1の間の相互作用を阻害するかどうかを判定すること、(
b)該相互作用を阻害する(a)の試験化合物を、IGFBP-rP1ポリペプチドとIGFBP-rP
1相互作用タンパク質の両方を発現する細胞とさらに接触させて、IGFBP-rP1か又
はIGFBP-rP1相互作用タンパク質を組み換え発現させるようにすること、及び(c)
該試験化合物が該細胞の増殖速度又は分化を変化させるかどうかを、特異的な細
胞分化マーカーの存在又は不存在によって判定し、もって該細胞の増殖速度又は
分化を変化させる試験化合物をがん治療化合物として同定することを含むことを
特徴とする。好ましくはIGFBP-rP1相互作用タンパク質はP25.1である。

【００２２】 本発明はさらに、がん治療活性をもつ試験化合物を同定するための方法を提供
するが、該方法は(a)試験化合物を、IGFBP-rP1ポリペプチドとIGFBP-rP1相互作
用タンパク質の両方を発現する細胞と接触させること、及び(b) IGFBP-rP1相互
作用タンパク質か又はIGFBP-rP1ポリペプチドの核移行の度合いを測定し、もっ
てIGFBP-rP1相互作用タンパク質か又はIGFBP-rP1ポリペプチドの核移行の度合い
を変化させる試験化合物をがん治療化合物として同定することを含むことを特徴
とする。好ましくはIGFBP-rP1相互作用タンパク質はP25.1である。

【００２３】 本発明はさらに、がん治療活性をもつ試験化合物を同定するための方法を提供
するが、該方法は(a)試験化合物を、IGFBP-rP1ポリペプチドとIGFBP-rP1相互作
用タンパク質の両方を発現する細胞と接触させること、及び(b) Ras、PKA、RAP1
、B-Raf、Mek又はMAPKのいずれかである細胞内タンパク質のリン酸化又は活性化
の状態を測定し、もって該細胞内タンパク質のリン酸化又は活性化の状態を変化
させる試験化合物をがん治療化合物として同定することを含むことを特徴とする
。好ましくはIGFBP-rP1相互作用タンパク質はP25.1である。

【００２４】 本発明はさらに、がん治療活性をもつ試験化合物を同定するための方法を提供
するが、該方法は(a)試験化合物を機能的IGFBP-rP1相互作用タンパク質と接触さ
せ、該試験化合物が機能的IGFBP-rP1相互作用タンパク質と相互作用するかどう
かを判定すること、(b)該機能的IGFBP-rP1相互作用タンパク質と相互作用する(a
)の試験化合物を、IGFBP-rP1ポリペプチドとIGFBP-rP1相互作用タンパク質の両
方を発現する細胞とさらに接触させて、IGFBP-rP1か又はIGFBP-rP1相互作用タン
パク質を組み換え発現させるようにすること、及び(c)該試験化合物が該細胞の
増殖速度又は分化を変化させるかどうかを特異的な細胞分化マーカーの存在又は
不存在によって判定し、もって該細胞の増殖速度又は分化を変化させる試験化合
物をがん治療化合物として同定することを含むことを特徴とする。好ましくはIG
FBP-rP1相互作用タンパク質はP25.1である。

【００２５】 本発明はさらに、がん治療活性をもつ試験化合物を同定するための方法を提供
するが、該方法は(a)試験化合物を、IGFBP-rP1相互作用タンパク質mRNA配列を含
む細胞又は細胞溶解物と接触させること、及び(b)IGFBP-rP1相互作用タンパク質
転写産物の翻訳阻害を検出することを含むことを特徴とする。好ましくはIGFBP-
rP1相互作用タンパク質はP25.1である。

【００２６】 本発明はさらに、IGFBP-rP1とP25.1の相互作用の阻害剤、抗P25.1抗体、P25.1
アンチセンス分子、及びリボザイム分子からなる群より選択されるP25.1生物活
性の拮抗薬を提供する。好ましくは、P25.1アンチセンス分子はP25.1 cDNA配列S
EQ ID NO:1と相補的な10塩基以上の特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドであ
る。好ましくは、このP25.1アンチセンスオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:2〜16
とそれらの組合せからなる群より選択されるオリゴヌクレオチド配列を取り込ん
だ15〜25塩基オリゴヌクレオチドである。好ましくはIGFBP-rP1相互作用タンパ
ク質はP25.1である。

【００２７】 本発明はさらに、IGFBP-rP1とP25.1の相互作用の阻害剤、抗P25.1抗体、P25.1
アンチセンス分子、及びリボザイム分子からなる群より選択される治療有効量の
P25.1拮抗薬と製薬上許容しうる担体とを含んでなる抗がん製剤組成物を提供す
る。好ましくは、P25.1アンチセンス分子はP25.1 cDNA配列SEQ ID NO:1と相補的
な10塩基以上の特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドである。好ましくは、こ
のP25.1アンチセンスオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:2〜16とそれらの組合せか
らなる群より選択されるオリゴヌクレオチド配列を取り込んだ15〜25塩基オリゴ
ヌクレオチドである。

【００２８】 本発明はさらに、処置を必要とする対象者のがんを治療又は予防するための方
法を提供するが、該方法はそうした治療又は予防が望まれる該対象者に、IGFBP-
rP1とP25.1の相互作用の阻害剤、抗P25.1抗体、P25.1アンチセンス分子、及びリ
ボザイム分子からなる群より選択される治療有効量のP25.1拮抗薬を投与するこ
とを含む。好ましくは治療又は予防するべきがんは小細胞肺がん、子宮頸がん、
乳がん又は前立腺がんである。

【００２９】 本発明はさらに、P25.1に結合する抗体又はその結合断片と製薬上許容しうる
担体とを含んでなる抗がん製剤組成物を提供する。好ましくは、該抗体はヒト化
モノクローナル抗体である。 発明の詳細な説明 用語の意味 「P25.1」はP25.1遺伝子の産物たとえば転写産物やP25.1タンパク質を意味す
る。P25.1のポリペプチド又はペプチド断片はP25.1ポリペプチド又はP25.1ペプ
チドという。P25.1、P25.1ポリペプチド又はペプチド断片の非関連タンパク質と
の融合体は本書ではP25.1融合タンパク質という。機能的P25.1はin vivo又はin
vitroでIGFBP-rP1と、又はIGFBP-rP1ペプチドと結合するタンパク質をいう。

【００３０】 「P25.1ヌクレオチド又はコード配列」はP25.1 mRNA転写産物、P25.1タンパク
質、P25.1ポリペプチド又はP25.1のペプチド断片、又はP25.1融合タンパク質を
いう。P25.1ヌクレオチド配列はゲノムDNA (P25.1遺伝子など)又はcDNAなどのDN
Aを包含する。

【００３１】 「IGFBP-rP1」はIGFBP-rP1遺伝子の産物たとえば転写産物やIGFBP-rP1タンパ
ク質を意味する。IGFBP-rP1のポリペプチド又はペプチド断片はIGFBP-rP1ポリペ
プチド又はIGFBP-rP1ペプチドという。IGFBP-rP1、IGFBP-rP1ポリペプチド又は
ペプチド断片の非関連タンパク質との融合体は本書ではIGFBP-rP1融合タンパク
質という。機能的IGFBP-rP1はin vivo又はin vitroでP25.1と、又はP25.1ペプチ
ドと結合するタンパク質をいう。

【００３２】 「NE」は神経内分泌を意味する。

【００３３】 「HA」は「エピトープタグYPYDVPDYA」を意味する。

【００３４】 「NLS」は「核局在シグナル」を意味する。 概要 IGFBP-rP1の生物学的役割をさらに解明するために、MCF-7乳がん細胞に由来す
るcDNAライブラリーを用いて酵母ツーハイブリッド法を実施した。本発明は新規
タンパク質P25.1をコードする新規cDNA (25.1)を提供するが、この新規タンパク
質P25.1はIGFBP-rP1と特異的に相互作用し、またIGFBP-rP1を過剰発現する前立
腺がん細胞系のNE分化を招く。

【００３５】 本発明は、がん治療用化合物の同定を目的としたスクリーン法(検定法など)を
包含する。本発明はさらにP25.1の作動薬と拮抗薬を包含するが、それにはP25.1
遺伝子の発現を阻害するために使用できる小分子、大分子及び抗体、さらにはア
ンチセンス及びリボザイム分子などのようなヌクレオチド配列が含まれる。本発
明はさらにそうした化合物の、がん治療及びがん等の細胞におけるNE分化の誘導
を目的とした使用を包含する。

【００３６】 特に、P25.1及び／又はIGFBP-rP1と相互作用することにより両分子間の会合に
拮抗するような、及び／又はP25.1、IGFBP-rP1又はP25.1:IGFBP-rP1複合体の活
性を調節するような化合物の同定に使用することができる細胞及び非細胞検定法
が開示される。細胞ベースの検定法は、P25.1、IGFBP-rP1又はP25.1:IGFBP-rP1
複合体に結合することにより、又は下流シグナル伝達経路に関与する細胞内因子
に作用することにより、P25.1、IGFBP-rP1又はP25.1:IGFBP- rP1複合体の活性、
核移行又は細胞区画化に影響を及ぼすような化合物又は組成物の同定に使用する
ことができる。本発明のそうした細胞ベース検定法は、P25.1及び／又はIGFBP-r
P1を発現する細胞、細胞系、又は組換え細胞又は細胞系を利用する。細胞はさら
なる遺伝子組換えにより、P25.1、IGFBP-rP1又はP25.1:IGFBP- rP1複合体によっ
て伝達されるシグナルに連結されたレポーター分子を組み込んで、P25.1仲介シ
グナル活性を調節する化合物の同定に役立てられるようにすることができる。

【００３７】 本発明はまた、P25.1遺伝子の発現を調節する化合物又は組成物のスクリーニ
ングへの細胞ベース検定法又は細胞溶解物検定法(in vitro転写又は翻訳検定法
など)の使用を包含する。たとえば、そうした検定法を用いれば、三重らせんポ
リヌクレオチドの活性を試験することができよう。あるいは、組換え細胞又は翻
訳産物の抽出物を用いて、P25.1 mRNA転写産物の翻訳を調節するような、したが
ってP25.1の発現に影響を及ぼすような(アンチセンスコンストラクト及びリボザ
イムコンストラクトなどを含む)化合物をスクリーニングすることができる。

【００３８】 本発明はまた、P25.1、IGFBP-rP1又はP25.1:IGFBP- rP1複合体と相互作用する
ような、及び／又はそれらの活性を調節するような化合物のスクリーニングを目
的とした細胞ベース又は非細胞ベース検定法用の、抗体生成用の、また診断・治
療用のP25.1タンパク質、(可溶性P25.1ポリペプチド及びペプチドを含む)ポリペ
プチド、及びP25.1融合タンパク質を提供する。P25.1タンパク質産物はP25.1拮
抗薬又は作動薬としてがん治療又はNE分化の調節に用いることができる。そうし
たP25.1タンパク質産物の例は、1以上のP25.1ドメイン(IGFBP-rP1相互作用ドメ
インなど)に対応するペプチド又はポリペプチド、1以上のP25.1ドメインを欠く(
たとえば核移行シグナル又はミリスチン化部位を欠く)不完全P25.1ポリペプチド
、及びP25.1融合タンパク質産物(GST融合体又はエピトープタグ付き融合体など)
であるが、それだけに限らない。あるいは、P25.1拮抗薬又は作動薬であるP25.1
抗体(P25.1シグナル伝達経路の下流標的に作用するようなシグナル伝達を調節す
る化合物を含む)をがん治療やNE分化の調節に使用することもできる。

【００３９】 たとえば、適切な可溶性P25.1ポリペプチド、又はP25.1融合タンパク質(P25.1 ^HA など) は有効量投与されれば、内在性IGFBP-rP1と相互作用し、それによって
内在性IGFBP-rP1を択一的に「吸い取る」、「中和する」又は「活性化する」こ
とで、P25.1、IGFBP-rP1又はP25.1:IGFBP- rP1複合体の活性を調節することにな
ろう。さらに別のアプローチでは、そうしたP25.1産物をコードするヌクレオチ
ドコンストラクトを宿主細胞の遺伝子組換えに用いれば、かかるP25.1産物をin
vivoで発現させることができる。これらの遺伝子組換え細胞は体内「バイオリア
クター」として機能し、IGFBP-rP1を択一的に「吸い取る」、「中和する」又は
「活性化する」ような適切なP25.1、P25.1ペプチド、可溶性P25.1ポリペプチド
、又はP25.1融合タンパク質を連続供給することができる。

【００４０】 がん治療におけるP25.1の発現及び／又は活性の調節、又はNE分化の調節を目
的とした「遺伝子治療」アプローチは・・・の範囲以内である。・・・

【００４１】 ・・・移行ドメイン)、不完全又は欠失型P25.1(1以上の領域又はドメインが欠失
しているP25.1など)、並びに全長P25.1、P25.1ペプチド又は不完全P25.1が非関
連タンパク質と融合した融合タンパク質もまた本発明の範囲内である。その種の
可溶性ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、又はP25.1に対応する循環天然
リガンドに結合しそれを「中和する」(抗イディオタイプ抗体を含む)抗体は本書
に記載の要領で、がん治療又はNE分化調節へと使用することができる。この目的
のためには、P25.1の個別ドメインに対応するペプチド、P25.1の可溶性欠失変異
体、又は完全P25.1を別のポリペプチド(IgFcポリペプチド、又はエピトープタグ
など)への融合に使用することができきる。

【００４２】 その種のペプチド、ポリペプチド又は融合タンパク質は組換えDNA技術で調製
することができる。たとえば、1以上のP25.1領域又はドメインをコードするヌク
レオチド配列を合成又はクローニングし、可溶性P25.1ポリペプチドをコードす
る一つの配列へと連結することができる。1以上のP25.1領域又はドメインをコー
ドするDNA配列は直接に、又はペプチドスペーサーをコードするリンカーオリゴ
ヌクレオチドを介して、一つに連結することができる。その種のリンカーはフレ
キシブルな、グリシンを多く含むアミノ酸配列をコードするため、種々のドメイ
ンがつなぎ合わせによりP25.1リガンドと結合しうるようなコンホメーションを
とれるようになろう。あるいは、個別領域又はドメインをコードするヌクレオチ
ド配列を使用してP25.1ペプチドを発現させることもできる。

【００４３】 種々の宿主−発現ベクター系を利用して適切なP25.1領域をコードするヌクレ
オチドを発現させて、そうしたポリペプチドを産生するようにすることができよ
う。得られるペプチド又はポリペプチドが可溶性の誘導体である場合には、その
ペプチド又はポリペプチドを培地から回収することができよう。ポリペプチド又
はペプチドが分泌されない場合には、P25.1産物は宿主細胞自体から回収するこ
とができよう。

【００４４】 宿主−発現ベクター系はまた、P25.1又は機能的同等物を発現する組換え宿主
細胞を包含する。そうした発現系からのP25.1の精製又は濃縮は技術上周知の適
切な方法を用いて行うことができる。しかし、P25.1の構造的、機能的性質を保
持することだけで、たとえばドラッグスクリーニング検定法で生物活性を評価す
ることもまた重要である場合には、そうした組換え宿主細胞自体を使用してもよ
い。

【００４５】 本発明の目的のために使用することができる宿主−発現ベクター系の例は、P2
5.1ヌクレオチド配列を納めた組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA又
はコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌(たとえばE. coliやB. subtilis
) などのような微生物; P25.1ヌクレオチド配列を納めた組換え酵母菌発現ベク
ターで形質転換した酵母菌(たとえばSaccharomycesやPichia); P25.1ヌクレオチ
ド配列を納めた組換えウィルス(たとえばバキュロウィルス)発現ベクターで形質
転換した昆虫細胞系; P25.1ヌクレオチド配列を納めた組換えウィルス(たとえば
カリフラワーモザイクウィルスCaMV、タバコモザイクウィルスTMV)発現ベクター
又は組換えプラスミド(Tiプラスミドなど)発現ベクターで感染させた又は形質転
換した植物細胞系; 又は哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター(メタルチ
オネインプロモーターなど)又は哺乳類ウィルスに由来するプロモーター(アデノ
ウィルス後期プロモーター、ワクシニアウィルス7.5Kプロモーターなど)を納め
た組換え発現コンストラクトを入れた哺乳類細胞系(COS、CHO、BHK、293、3T3な
ど)であるが、それだけに限らない。

【００４６】 細菌系では、発現されるP25.1遺伝子産物の所期用途次第で多数の発現ベクタ
ーを有利に選ぶことができよう。たとえば、P25.1タンパク質製剤組成物の生成
又はP25.1タンパク質に対する抗体の産生を目的にそうしたタンパク質を大量に
産生させるのであれば、セイセイガ容易な融合タンパク質産物のハイレベル発現
を導くようなベクターが望ましいであろう。その種のベクターの例は、P25.1コ
ード配列をlacZコード領域とインフレームでベクターに個別に連結して融合タン
パク質が産生されるようにすることができるE. coli発現ベクターpUR278 (Ruthe
r et al., EMBO J. 2:1791, 1983); pINベクター(Inouye ＆ Inouye, Nucleic A
cids Res. 13:3101-3109, 1985; van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5
503-5509, 1989)などであるが、それだけに限らない。PGEXベクターもまた、グ
ルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として異種タンパク
質を発現させるために使用することができる。一般に、この種の融合タンパク質
は可溶性であるため、溶解細胞からグルタチオン−アガロースビースーへの吸着
とそれに続く遊離グルタチオン存在下での溶離により容易に精製することができ
る。PGEXベクターはトロンビン又は因子Xaプロテアーゼ開裂部位を含むように設
計し、クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から放出されるようにする
ことができる。

【００４７】 あるいは、発現される融合タンパク質に対して特異的な抗体を使用することに
より任意の融合タンパク質を容易に精製することができる。たとえばJanknecht
et al.が記載している系はヒト細胞系中で発現される非変性融合タンパク質の敏
速な精製を可能にする(Janknecht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:897
2-8976, 1991)。この系では目的の遺伝子をワクシニア組換えプラスミドにサブ
クローニングして、該遺伝子のオープンリーディングフレームを6ヒスチジン残
基からなるアミノ末端タグと翻訳融合させるようにする。組換えワクシニアウィ
ルスを感染させた細胞からの抽出物はNi2+:ニトリロ酢酸−アガロースカラムに
添加し、ヒスチジンタグ付きタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶
離する。

【００４８】 昆虫系では、Autographa californica核多角体病ウィルス(AcNPV)を異種遺伝
子発現用ベクターとして使用する。このウィルスはSpodoptera frugiperda細胞
中で増殖する。P25.1コード配列はウィルスの非必須領域(たとえば多角体遺伝子
)中に個別にクローニングされ、AcNPVプロモーター(たとえば多角体プロモータ
ー)の調節下に置かれよう。P25.1遺伝子コード配列が首尾よく挿入されると、多
角体遺伝子の不活性化と非閉塞組換えウィルス(すなわち多角体遺伝子によって
コードされるタンパク質外被を欠くウィルス)の産生を招く結果となろう。次に
この組換えウィルスを昆虫に感染させ、そこで挿入遺伝子を発現させる(Smith e
t al., J. Virol. 46:584, 1983; Smith, U.S. Pat. No. 4,215,051)。

【００４９】 哺乳類宿主細胞では、多数のウィルス発現系を使用することができる。発現ベ
クターとしてアデノウィルスを使用する場合には、目的のP25.1ヌクレオチド配
列をアデノウィルス転写／翻訳調節複合体たとえば後期プロモーター及び3エキ
ソン構成リーダー配列へと連結することができる。このキメラ遺伝子は次にin v
itro又はin vivo組換えでアデノウィルスゲノムに挿入されよう。ウィルスゲノ
ムの非必須領域(領域E1又はE3など)への挿入は、生存能があり感染宿主内でP25.
1遺伝子産物を発現させることができる組換えウィルスをもたらす結果となろう(
Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659, 1984)。挿入P25.1
ヌクレオチド配列の効率的な翻訳には特定の開始シグナルも必要となろう。これ
らのシグナルはATG開始コドンや隣接配列などである。完全P25.1遺伝子又はcDNA
が独自の開始コドンと隣接配列を含めて適当な発現ベクターに挿入される場合に
は、追加の翻訳調節シグナルは不要であろう。しかし、P25.1コード配列の一部
分だけが挿入される場合には、外来性の翻訳調節配列を、おそらくATG開始コド
ンを含めて供給しなければならない。さらに、インサート全体が確実に翻訳され
るようにするには開始コドンは所望コード配列のリーディングフレームとインフ
レームでなければならない。これらの外来性翻訳調節シグナル及び開始コドンは
、天然、合成いずれの場合でも多様な源泉に由来しうる。発現効率は適当な転写
エンハンサー要素、ターミネーター、その他を含めることにより高めることがで
きる(Bittner et al., Methods Enzymol. 153:516-544, 1987)。

【００５０】 さらに、挿入配列の発現を調節し、又は遺伝子産物を所望のとおりに修飾しプ
ロセッシングするような宿主細胞株を選択することもできる。タンパク質産物の
そうした修飾(グルコシル化など)やプロセッシング(開裂など)はタンパク質の機
能にとっては重要かもしれない。種々の宿主細胞はタンパク質と遺伝子産物の翻
訳後プロセッシングや修飾のための特徴的な固有の機構をもつ。適切な細胞系又
は宿主系を選択することで、発現する異種タンパク質の正しい修飾とプロセッシ
ングを保証することができる。そこで、一次転写産物の適正なプロセッシング、
遺伝子産物の適正なグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構をもつ真核宿主
細胞が選択されよう。そうした哺乳類宿主細胞の例はCHO、VERO、BHK、HeLa、CO
S、MDCK、293、3T3及びW138細胞系であるが、それだけに限らない。

【００５１】 組換えタンパク質の長期高収量生産を実現するには安定発現が好ましい。たと
えば、P25.1配列を安定的に発現する細胞系が遺伝子組換えで作られよう。ウィ
ルスの複製起点を入れた発現ベクターを用いるよりもむしろ、宿主細胞を適当な
発現調節要素(プロモーター、エンハンサー配列、ターミネーター、ポリアデニ
ル化部位など)及び選択マーカーによって調節されるDNAで形質転換することがで
きる。異種DNA導入後、組換え細胞は増殖培地で1〜2日間増殖させてから選択培
地に移すことになろう。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択耐性を付与し
、細胞がその染色体中にプラスミドを安定的に組み込み、増殖してフォーカスを
形成しうるようにするが、形成されたフォーカスはクローニングして細胞系へと
発展させることができる。この方法はP25.1遺伝子産物を発現する細胞系の創出
に使用すると有利であろう。こうして創出される細胞系はP25.1遺伝子産物の固
有の活性に影響を及ぼすような化合物のスクリーニングと評価に特に有用であろ
う。

【００５２】 多数の選択系が単純ヘルペスウィルス・チミジンキナーゼ(Wigler et al., Ce
ll 11:223, 1977)、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ(Szybalska ＆ Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026,1962)及
びアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(Low et al., Cell 22:817, 19
80)を含めて使用されようが、その遺伝子はそれぞれtk、hgprt、aprt細胞に使用
することができる。また、抗代謝産物耐性も次の遺伝子の選択基準として使用で
きる:メトトレキサレート耐性を付与するdhfr (Wigler et al. Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 77:3567, 1980; O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78
:1527, 1981); ミコフェノール酸耐性を付与するgpt (Mulligan & Berg, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981); アミノグリコシドG-418耐性を付与する
neo (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1, 1981); 及びハイグロマ
イシン耐性を付与するhygro (Santerre et al., Gene 30:147, 1984)。

【００５３】 P25.1ポリペプチドに対する抗体：1以上のP25.1エピトープ、又はP25.1保存変
異体のエピトープ、又はP25.1ペプチド断片のエピトープを特異的に認識する抗
体もまた本発明に包含される。そうした抗体の例はポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体(mAbs)、ヒト化又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F
(ab’)₂フラグメント、Fab発現ライブラリーによって産生される断片、抗イディ
オタイプ(抗Id)抗体、及び前記抗体のいずれかのエピトープ結合断片であるが、
それだけに限らない。本発明の抗体は、たとえば生体試料中のP25.1の検出に用
いることができ、したがって患者又は組織試料について異常量のP25.1を検査す
る手段となる診断又は予後技術に利用することができる。そうした抗体はまた、
たとえば前述のような、P25.1遺伝子産物の発現及び／又は活性に対する試験化
合物の影響の評価を目的とした化合物スクリーニング法と併用してもよい。さら
にそうした抗体は、たとえば正常及び／又は組換えP25.1発現細胞の、患者への
導入に先立つ評価を目的とした、後述の遺伝子治療と併用してもよい。そうした
抗体はさらに、異常P25.1活性を阻害する方法として用いてもよい。したがって
、そうした抗体はがん治療法の一環として用いることもできる。

【００５４】 抗体を産生させるには、P25.1、P25.1ペプチド(たとえば核移行又はIGFBP-rP1
相互作用ドメインなどのようなP25.1の機能的ドメインに対応するペプチドなど)
、不完全P25.1ポリペプチド(1以上のドメイン、たとえば核移行又はIGFBP-rP1相
互作用ドメインをすでに欠失しているP21.1)、P25.1(又はP25.1又はその変異体)
の機能的同等物の注射で種々の宿主動物を免疫することができよう。そうした宿
主動物は、若干の例を挙げればウサギ、マウス、ハムスター、ラットなどである
が、それだけに限らない。宿主の種次第で、免疫反応を増進するために種々のア
ジュバントを使用してもよい。その例は、(完全及び不完全)フロイント、水酸化
アルミニウムなどのような鉱物性ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール
、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジ
ニトロフェノールなどのような界面活性物質、それにBCG (カルメット−ゲラン
菌)やCorynebacterium parvumなどのような潜在的に有用なヒト・アジュバント
などであるが、それだけに限らない。ポリクローナル抗体は免疫動物の血清に由
来する抗体分子の不均質個体群である。モノクローナル抗体は特定抗原に対する
抗体の均質個体群であるが、連続継代細胞系による抗体分子の産生を導くような
任意の手法で得られよう。そうした手法の一例はKohler and Milsteinのハイブ
リドーマ法(Nature 256:495-497, 1975; U.S. Pat. No. 4,376,110)、ヒトB細胞
ハイブリドーマ法(Kosbor et al., Immunology Today 4:72, 1982; Cole et al.
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030, 1983)、及びEBVハイブリドーマ
法(Cole et al., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss,
Inc., pp. 77-96, 1985)などであるが、それだけに限らない。そうした抗体はIg
G、IgM、IgE、IgA、IgDなどを含む免疫グロブリンの任意のクラス及びそのサブ
クラスに属するものでよい。本発明のmAbを産生するハイブリドーマはin vitro
又はin vivoで培養することができる。高力価mAbsのin vivo産生が可能であるた
め、これは目下の好ましい産生法となっている。

【００５５】 加えて、適切な抗原特異性を備えたマウス抗体分子に由来する遺伝子と適切な
生物活性を備えたヒト抗体分子に由来する遺伝子をつなぎ合わせることによる「
キメラ抗体」の産生を目的に開発された手法(Morrison et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature, 312:604-608,
1984; Takeda et al., Nature, 314:452-454, 1985)も使用できる。キメラ抗体
は、マウスmAb由来の可変部とヒト免疫グロブリン由来の定常部(ヒト化)などの
ように異なる動物種に由来する異なる部分からなる分子である。

【００５６】 あるいは、一本鎖抗体の産生を目的に説明されている手法(U.S. Pat. No. 4,9
46,778; Bird, Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988; Ward et al., Nature 334:544-546, 1989)を
、P25.1遺伝子産物に対する一本鎖抗体の産生へと適合させることもできる。一
本鎖抗体は、Fv領域のH鎖断片とL鎖断片をアミノ酸架橋で結合させ、一本鎖ポリ
ペプチドとすることにより形成される。

【００５７】 特異的エピトープを認識する抗体断片は周知の手法で生成させてよい。そうし
た断片の例は、抗体分子のペプシン消化により作製することができるF(ab’)₂フ
ラグメント、及びF(ab’)₂フラグメントのジスルフィド結合の還元により生成さ
せることができるFabフラグメントなどであるが、それだけに限らない。あるい
は、Fab発現ライブラリーを構築すれば(Huse et al., Science 246:1275-1281,
1989)所望の特異性を備えたモノクローナルFabフラグメントの迅速簡易な同定が
可能になる。

【００５８】 P25.1に対する抗体を利用すれば、技術上周知の手法を用いて、P25.1を「模擬
」する抗イディオタイプ抗体を生成することができる(Greenspan & Bona, FASEB
J. 7:437-444, 1993; Nissinoff, J. Immunol. 147:2429-2438, 1991)。たとえ
ば、P25.1に結合してP25.1に対するIGFBP-rP1の結合を拮抗阻害する抗体を用い
て、P25.1を「模擬」し、もってIGFBP-rP1と結合してそれを中和するような抗イ
ディオタイプ抗体を生成することができる。そうした中和作用をもつ抗イディオ
タイプ抗体又はその断片は、がん療法に用いれば天然リガンドを中和させること
ができる。

【００５９】 あるいは、P25.1活性の作動薬として作用するP25.1に対する抗体を生成させる
こともできる。そうした抗体はP25.1に結合し、P25.1及び／又はIGFBP-rP1のシ
グナル伝達活性を賦活しよう。そうした抗体は、NE分化が望ましい事象であるよ
うな特定のがん治療に特に有用であろう。さらに、P25.1活性の拮抗薬として作
用する抗体、すなわちP25.1によるシグナル伝達の活性化を阻害する抗体をがん
治療及びNE分化の調節に用いてもよい。 P25.1活性の調節とがん治療に対する遺伝子治療アプローチ P25.1の発現は、P25.1活性の調節とがん治療に対する遺伝子治療アプローチを
用いてin vivoで(たとえば転写又は翻訳レベルで)調節することができる。以下
、若干のアプローチを説明する。

【００６０】 遺伝子置換療法：正常P25.1遺伝子発現及び／又はP25.1遺伝子産物活性のレベ
ルの上昇に関してはP25.1核酸配列を小細胞肺がん、子宮頸がん、乳がん、前立
腺がんなどのがん治療に利用することができる。がんの原因が欠陥P25.1遺伝子
に関係する場合には、たとえば遺伝子置換療法の形で治療を行うことができる。
特に、正常P25.1遺伝子の、又は正常機能を示すP25.1遺伝子産物の産生を導くP2
5.1遺伝子の一部分の、1以上のコピーを患者又は対象動物体内の適切な細胞中に
、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス及びヘルペスウィルス
などのベクターを含むがそれだけに限らないベクターを用いて、DNAを細胞中に
導入するリポソームなどのような他の粒子と共に、挿入することができよう。

【００６１】 P25.1遺伝子はおそらく皮質、刺床、脳幹、脊髄及び視床下部を含む脳の中で
発現するため、かかる遺伝子置換療法は患者体内のこれらの細胞型にP25.1遺伝
子配列を送達しうる必要がある。よって、P25.1遺伝子配列を送達するための手
法は、技術上周知の血液脳関門を容易に越えるように設計する必要があるか(PCT
WO89/10134)、あるいはP25.1遺伝子配列が発現する場となる細胞部位へのP25.1
遺伝子配列の直接導入という形をとる必要がある。あるいは、標的化相同組換え
を用いて、適当な組織たとえば脳組織中の内在性P25.1遺伝子の欠陥を是正する
ことができる。動物では、標的化相同組換えを用いてES細胞の欠陥を是正し、是
正された形質を備えた子孫を生み出せるようにすることができる。

【００６２】 P25.1遺伝子発現及び／又はP25.1活性レベルを全般的に高めるために用いるこ
とができる方法としては他に、適当なP25.1発現細胞好ましくは自己細胞を患者
に、がんの進行を改善するに足る場所と数の条件を満たす形で導入する方法があ
る。そうした細胞は組換え細胞でも非組換え細胞でもよい。全般的なP25.1発現
レベルを高めるために導入することができる細胞には、P25.1遺伝子を発現する
正常細胞、すなわちたとえば視床下部細胞などがある。そうした細胞は脳内の解
剖学的部位に、又は体内の別の部位に位置する組織移植片の一部として、導入す
ることができる。こうした細胞ベースの遺伝子療法は技術上周知である(Anderso
n et al., U.S. Pat. No. 5,399,349; Mulligan & Wilson, U.S. Pat. No. 5,46
0,959)。

【００６３】 最後に、前述の検定法で同定される化合物であって、活性化又は結合P25.1に
より、たとえばP25.1シグナル伝達経路の下流シグナル伝達タンパク質を活性化
し、もって欠陥P25.1を迂回することによって、伝達シグナルを刺激又は増強す
るような化合物を、がん治療又はNE分化の調節に用いることもできる。処方と投
与様式は該化合物の物理化学的性質に左右されよう。投与は、血液脳関門を越え
られるようにする周知の手法を含むのがよい。 P25.1発現の阻害 代替実施態様では、内在性P25.1遺伝子の発現レベルを低減させるようながん
療法を考案することができる。それには、たとえばP25.1 mRNA転写産物の翻訳を
阻害又は防止するアンチセンス又はリボザイム法、P25.1遺伝子の転写を阻害す
る三重らせん法、又はP25.1遺伝子又はその内在性プロモーターを不活性化又は
「ノックアウト」する標的化相同組換え法を用いる。こうした遺伝子治療は小細
胞肺がん、子宮頸がん、乳がん、前立腺がんなどのようながんの治療に用いられ
ようが、その場合、P25.1発現の阻害はNE分化の防止が目的である。P25.1遺伝子
は他の多数の組織に加えて脳内でも発現するため、送達法は血液脳関門を越える
ように工夫するのがよい(PCT WO89/ 10134)。あるいは、本書で述べているアン
チセンス、リボザイム又はDNAコンストラクトを、標的細胞を含む部位に直接導
入することもできよう。

【００６４】 アンチセンス法はmRNAと相補的なオリゴヌクレオチド(DNAか又はRNA)の設計を
必要とする。アンチセンスオリゴヌクレオチドは相補的なmRNA転写産物へと結合
し翻訳を防止しよう。絶対相補性は好ましいとはいえ必須条件ではない。RNAの
一部分に対して「相補的」である配列とは本書では、該RNAとハイブリダイズし
安定した二本鎖を形成しうるに足る相補性を備えた配列を意味する。二本鎖アン
チセンス核酸の場合には、二本鎖DNAのうちの一本鎖について同様に検査するか
、又は三本鎖形成を評価してもよい。ハイブリダイゼーション能はアンチセンス
核酸の相補性の度合いと長さの両方に依存しよう。一般に、バイブリダイズする
核酸が長ければ長いほど、RNAとの塩基ミスマッチが多くなり、しかもなお安定
した二本鎖(又は場合により三本鎖)を形成することになろう。当業者は、ハイブ
リダイズした複合体の融点を求める標準手法の使用により、ミスマッチ許容度を
確認することができる。

【００６５】 アンチセンスヌクレオチドはコード領域配列に対して相補的であれば使用する
ことができるものの、最も好ましいのは転写・非翻訳領域に対して相補的なアン
チセンスヌクレオチドである。メッセージの5’末端、たとえばAUG開始コドンま
での5’非翻訳配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドは翻訳阻害効率が
最も高いはずである(本書中のSEQ ID NOS:2-16を参照)。しかし最近、mRNAの3’
非翻訳配列の相補配列もまたmRNAの翻訳を阻害する効果が高いことが証明された
(Wagner, Nature 372:333-335, 1994)。したがって、内在性P25.1 mRNAの翻訳を
阻害するアンチセンス法では、P25.1の5’又は3’非翻訳・非コード領域に対し
て相補的なオリゴヌクレオチドを用いるのが最も好ましいと言える。

【００６６】 mRNAの5’非翻訳領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドは好ましくはAUG開
始コドンの相補体を含むべきである。mRNAコード領域に対して相補的なアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは翻訳阻害効率が劣るが、本発明に基づく使用が可能で
ある。アンチセンス核酸はP25.1 mRNAの5’、3’またはコード領域のいずれとハ
イブリダイズするように設計されようが、長さが10ヌクレオチド以上とするのが
よいし、好ましくは長さが10〜約25ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドとする。
個別態様では、オリゴヌクレオチドは長さが15ヌクレオチド以上、17ヌクレオチ
ド以上、又は21ヌクレオチド以上である(SEQ ID NO:2-16)。

【００６７】 標的配列の選択いかんにかかわらず、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の
遺伝子発現阻害能を定量するためのin vivo調査をまず実施するのが好ましいし
、これらの調査ではアンチセンス遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的生
物学的効果を見分けるためのコントロールを使用するのが好ましい。また、これ
らの調査では標的RNA又はタンパク質のレベルと内部コントロールＲＮＡ又はタ
ンパク質のレベルを比較するのが好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレ
オチドを使用して得られる結果がコントロールオリゴヌクレオチドを使用して得
られる結果と比較されることも見込まれる。コントロールオリゴヌクレオチドは
テストオリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであるのが好ましいし、またオリゴヌ
クレオチドのヌクレオチド配列の差は標的配列との特異的ハイブリダイゼーショ
ンを阻害するうえで必要とされる範囲内にとどまるのが好ましい。

【００６８】 オリゴヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNA又はそれらのキメラ混合
体、派生体又は修飾体とすることができる。オリゴヌクレオチドはたとえば分子
の安定性、ハイブリダイゼーションなどの改善を目的に塩基部分、糖部分、又は
リン酸骨格で修飾を受けることができる。オリゴヌクレオチドは、ペプチドなど
のような他の付加基(たとえば宿主細胞受容体のin vivo標的化が目的)、又は細
胞膜横断輸送(Letsinger et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86:6553-6556, 1
989; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652, 1987; PCT W
O88/09810)、血液脳関門横断輸送(PCT WO89/10134)又は核膜横断輸送の促進又は
調節剤を含んでもよいし、ハイブリダイゼーションを引き金とする開裂剤(Krol
et al., BioTechniques 6:958-976, 1988)又は挿入剤(Zon, Pharm. Res. 5: 539
-549, 1988)を含んでもよい。この目的のためには、オリゴヌクレオチドを別の
分子たとえばペプチド、ハイブリダイゼーションを引き金とする架橋剤、輸送剤
、ハイブリダイゼーションを引き金とする開裂剤などと結合してもよい。

【００６９】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、次のものを一例として含む群から選択さ
れる1以上の修飾塩基部分を含んでもよい: 5-フルオロウラシル、5-ブロモウラ
シル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-
アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメ
チルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル
、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペン
テニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン
、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン
、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキ
シアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5’-メトキシ
カルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテ
ニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシ
ル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシ
ル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステ
ル、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシ
ル、(acp3)w及び2,6-ジアミノプリン。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた
、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、ヘキソースを含むが
それだけに限らない群から選択される1以上の修飾糖部分を含んでもよい。

【００７０】 さらに別の実施態様では、アンチセンスヌクレオチドはホスホロチオエート、
ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホス
ホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル及びホル
ムアセタール又はそれらの類縁物質からなる群より選択される1以上の修飾リン
酸骨格を含む。さらに別の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα
-アノマーオリゴヌクレオチドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは相補RN
Aと特異的二本鎖ハイブリッドを形成するが、そこでは通常のβユニットと違っ
て各鎖が互いに平行に配置する(Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15:6625-66
41, 1987)。このオリゴヌクレオチドは2’-O-メチルリボヌクレオチド(Inoue et
at., Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148, 1987)又はキメラRNA DNA類縁物質(Ino
ue et al., FEBS Lett. 215:327-330, 1987) 。

【００７１】 本発明のオリゴヌクレオチドは技術上周知の標準方法により、たとえば(Biose
arch、Applied Biosystemsなどのメーカーから市販されているような)自動DNA合
成機を用いて合成することができる。たとえば、ホスホロチオエート・オリゴヌ
クレオチドはStein et al. (Nucl. Acids Res. 16:3209, 1988)の方法により合
成することができるし、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドはコントロー
ルドポアグラスポリマー担体の使用により調製することができる(Sarin et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7448-7451, 1988)。アンチセンス分子は、P25
.1をin vivoで発現する細胞、たとえばがんなどの細胞や組織に送達する必要が
ある。アンチセンスDNA又はRNAを細胞に送達するために多数の方法が開発されて
きた。たとえば、アンチセンス分子を組織部位に直接注射することができるし、
あるいは所望細胞を標的にするよう設計された修飾アンチセンス分子(たとえば
標的細胞の表面に発現する受容体又は抗原と特異的に結合するペプチド又は抗体
へと連結されたアンチセンス)を全身投与することもできる。

【００７２】 しかし、内在性mRNAの翻訳を抑制するに足る細胞内アンチセンス濃度を実現す
るのはしばしば困難である。そこで、好ましいアプローチでは、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドを強いpolIII 又はpolIIプロモーターの支配下に置いた組換え
DNAコンストラクトを使用する。そうしたコンストラクトを患者の標的細胞に導
入すると、内在性P25.1転写産物と相補的塩基対を形成しもってP25.1 mRNAの翻
訳を阻止するに足る量の一本鎖RNAが転写される結果となろう。たとえばベクタ
ーをin vivoで導入して、それが細胞に取り込まれ、アンチセンスRNAの転写を導
くようにすることができる。そうしたベクターは、所望のアンチセンスRNAを産
生するよう転写されうる限りで、エピソームのままにとどまっても染色体中に組
み込まれてもよい。そうしたベクターは標準方法の組換えDNA技術によって構築
することができる。ベクターは哺乳類細胞中での複製と発現に使用されるプラス
ミドベクター、ウィルスベクター、又は他の技術上周知のベクターとすることが
できる。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、哺乳類細胞好ましくはヒ
ト細胞中で作用する技術上周知の任意のプロモーターによることができる。そう
したプロモーターは誘導的でも構成的でもよい。そうしたベクターの例はSV40前
記プロモーター領域(Bernoist and CHambon, Nature 290:304-31-, 1981)、ラウ
ス肉腫ウィルスの3’末端LTR (Yamamoto et al., Cell 22: 787-797, 1980)、ヘ
ルペス・チミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 78:1441-14445, 1981)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster e
t al., Nature 296:39-42, 1982)であるが、それだけに限らない。組織部位たと
えば腫瘍組織等に直接導入することができる組換えDNAコンストラクト調製には
任意のタイプのプラスミド、コスミド、YAC又はウィルスベクターを使用するこ
とができる。あるいは、所望組織に選択的に感染するようなウィルスベクターを
使用することもできる(たとえば所望組織が脳であればヘルペスウィルスベクタ
ーを使用することができる)が、その場合には別の(たとえば全身)投与経路を利
用してもよい。

【００７３】 P25.1 mRNA転写産物を触媒的に開裂させるよう設計されたリボザイム分子使用
してP25.1 mRNAの翻訳とP25.1の発現を防止することもできる(PCT WO90/11364;
Sarver et al., Science 247:1222 -1225, 1990)。P25.1 mRNAの破壊にはmRNAを
部位特異的認識配列で開裂させるリボザイムを使用することができるが、ハンマ
ーヘッド型リボザイムを使用するのが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは
標的mRNAと相補的塩基対を形成するフランキング領域により指定される部位でmR
NAを開裂させる。その唯一の要求条件は標的mRNAが5’-UG-3’という2塩基配列
をもつことである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築と産生は技術上周知であ
り、またHaseloff and Gerlach, Nature, 334:585-591, 1988にもっと詳しく記
載されている。ヒトP25.1 cDNAのヌクレオチド配列内には多数の潜在的ハンマー
ヘッド型リボザイム開裂部位が存在する(図1BとSEQ ID NO:]を参照)。好ましく
は、リボザイムの作製に際しては開裂認識部位がP25.1 mRNAの5’末端近傍に位
置するようにする(すなわち、効率を高め、非機能的mRNA転写産物の細胞内集積
を最小限に抑えるのが目的)。

【００７４】 本発明のリボザイムはまた、Tetrahymena thermophila中に天然に存在しThoma
s Cechとその共同研究者たちによって説明されてきた(Zaug et al., Science 22
4:574-578, 1984; Zaug and Cech, Science 231:470-475, 1986; Zaug et al.,
Nature 324:429-433, 1986; WO 88/04300; Been and Cech, Cell 47:207-216, 1
986)ようなRNAエンドリボヌクレアーゼ(以下、Cech型リボザイム)を含む。Cech
型リボザイムは標的RNA配列とハイブリダイズする8塩基対の活性部位をもつが、
標的RNAの開裂はハイブリダイゼーション後に起こる。本発明は、P25.1中に存在
する8塩基対活性部位を標的とするそれらのCech型リボザイムを包含する。

【００７５】 アンチセンス法の場合と同様に、リボザイムは(安定性や標的化などの改善を
目的とする)修飾オリゴヌクレオチドからなることができし、P25.1をin vivoで
発現する細胞たとえば前立腺、脳、肝臓などに送達するのがよい。好ましい送達
法では、強い構成的porIII 又はporIIの支配下にあるリボザイムを「コードする
」DNAコンストラクトを使用して、コンストラクトを導入された細胞が内在性P25
.1メッセージを破壊し翻訳を阻害するに足る量のリボザイムを産生するようにす
る。リボザイムはアンチセンスオリゴヌクレオチドと違って触媒的であるため、
効率の実現にはより低い細胞内濃度で足りる。内在性P25.1遺伝子の発現はまた
、標的化相同組換えを用いてP25.1遺伝子又はそのプロモーターを不活性化又は
「ノックアウト」することにより低減させることもできる(Smithies et al., Na
ture 317:230-234, 1985; Thomas & Capecchi, Cell 51:503-512, 1987; Thomps
on et al., Cell 5:312-321, 1989)。

【００７６】 たとえば、内在性P25.1遺伝子と相同のDNAを近傍に配置した変異体の非機能的
P25.1 (又は完全に非関連のDNA配列)を、選択マーカー及び／又はネガティブ選
択マーカーを付けて、又は付けずに、P25.1をin vivoで発現する細胞中に導入す
ることができる。そうしたアプローチは農業分野に特に適しており、そこではES
(胚性幹)細胞への変更を用いて不活性P25.1を備えた動物の子孫を生み出すこと
ができる。しかし、このアプローチは人間への使用に合わせることができる。た
だし、その場合には組換えDNAコンストラクトが適切なベクター、たとえば視床
下部や脈絡叢への送達を目的としたヘルペスウィルスベクターを用いて所要部位
にin vivoで直接導入又は誘導されなければならない。

【００７７】 あるいは、内在性P25.1遺伝子の発現は、P25.1遺伝子の調節領域と相補的なデ
オキシリボヌクレオチド配列を標的として、体内標的細胞中でのP25.1遺伝子の
転写を阻むような三重らせん構造を形成させることによっても低減することがで
きる(Helen, Anticancer Drug Des. 6:569-84, 1991; Helene et al., Ann. N.Y
. Acad. Sci., 660: 27-36, 1992; Maher, Bioassays 14: 807-15, 1992)。 がん治療に有用な薬物のスクリーニング検定法 P25.1活性又はP25.1遺伝子発現を調節し、もってNE分化及び／又はがんを調節
するような化合物又は組成物の同定には、少なくとも3種類の検定システムを設
計し使用することができる。以下説明するシステムはキット化することができる
。その場合、P25.1又はP25.1を発現する細胞はバイアル、チューブ、マイクロタ
イターウェルプレート、ボトルなどのようなさまざまな容器に包装することがで
きる。他の試薬、たとえばポジティブコントロール試料、ネガティブコントロー
ル試料、P25.1ペプチド、緩衝液、細胞培養培地などは別個の容器に含め、キッ
トと併せて提供することができる。

【００７８】 細胞ベースの検定法：本発明では、がん治療のためのがんの特定を目的に、P2
5.1活性を調節する化合物を細胞ベース検定法でスクリーニングすることができ
る。化合物のスクリーニングには、P25.1及び／又はIGFBP-rP1を内在的に発現す
る細胞を用いることができる。あるいは、P25.1及び／又はIGFBP-rP1を発現する
よう遺伝子組換えをした細胞系たとえば293細胞、COS細胞、CHO細胞、線維芽細
胞などをスクリーニングに使用してもよい。好ましくは、P25.1ペプチドによる
活性化に応答する機能的IGFBP-rP1を発現するよう遺伝子組換えした宿主細胞を
検定法の終点として用い、それを対象に化学的、生理学的、生物学的又は形質的
変化、宿主細胞遺伝子又はレポーター遺伝子の誘導、cMAPレベルの変化、アデニ
リルシクラーゼ活性、宿主細胞Gタンパク質活性、細胞外酸性化速度、宿主細胞
キナーゼ活性、増殖、分化などを測定できるようにする。

【００７９】 機能的P25.1及び／又はIGFBP-rP1を発現する宿主細胞は、スクリーニング検定
法に有用であるためには、P25.1に対して有意の応答を、好ましくはバックグラ
ウンドに比して5倍超の誘導を示す必要がある。宿主細胞は好ましくは、誘導応
答をP25.1により極大化するための多数の性質を、読出し情報次第で、もつ必要
がある。

【００８０】 たとえばCREレポーター遺伝子の強い誘導を検出するためのCREレポーター遺伝
子系では、(a)低天然レベルのcAMP、(b)高レベルのアデニリルシクラーゼ、(c)
高レベルのプロテインキナーゼA、(d)低レベルのホスホジエステラーゼ、及び(e
)高レベルのcAMP応答エレメント結合タンパク質が好都合であろう。こうした系
に結合されたP25.1ペプチドなどへの応答を強めるには、宿主細胞を遺伝子組換
えして有利な因子の発現量を増す、又は不利な因子の発現量を減らすようにする
ことができよう。さらに、CREレポーター誘導のための代替経路を除去して、塩
基性度を低下させることもできよう。

【００８１】 こうした細胞ベース検定システムを使用する場合には、P25.1及び／又はIGFBP
-rP1を発現する細胞を試験化合物又はコントロールと接触させる。接触後に、NE
細胞分化の測定を目的に細胞を検定することができるし、あるいはP25.1及び／
又はIGFBP-rP1のシグナル伝達経路成分の発現及び／又は活性を、もしくはシグ
ナル伝達経路自体の活性を検定することができる。たとえば接触後に、細胞溶解
物を検定してcAMPの誘導、もしくはRas、KPA、RAP1、B-Raf、Mek又はMAPKの調節
を調べることができる。P25.1の拮抗薬として作用する可能性のある化合物のス
クリーニングでは、IGFBP-rP1を過剰発現させてコントロールと比較した場合の
試験化合物によるシグナル伝達阻害を調べるのが好都合であろう。P25.1は核移
行シグナル(図1B)を含み、また本書で示したとおり細胞内核輸送をこうむる。本
発明の別の実施態様では、試験化合物がP25.1及び／又はIGFBP-rP1の核移行調節
能を基準に選択される。

【００８２】 非細胞ベース検定法：P25.1と相互作用する、たとえば結合する化合物のスク
リーニングには細胞ベース検定法に加えて非細胞ベース検定法を用いてもよい。
そうした化合物はP25.1活性の拮抗薬又は作動薬として作用することがあろうし
、またがん治療に使用されることもあろう。可溶性P25.1を遺伝子組換えで発現
させ、P25.1に結合する化合物の同定を目的とした非細胞ベース検定法に用いて
もよい。非細胞ベースのスクリーニング検定法には、遺伝子組換えで発現させた
P25.1ポリペプチド又は融合タンパク質を用いることができる。あるいは、1以上
のP25.1ドメインに対応するペプチド、又は1以上のP25.1ドメインを含む融合タ
ンパク質を非細胞ベース検定システムに用いて、P25.1に結合する化合物を同定
することもできるが、そうした化合物はP25.1のシグナル伝達経路を調節するう
えで有用であろう。非細胞ベース検定法では、遺伝子組換えで発現させたP25.1
を試験管、マイクロタイターウェル又はカラムなどのような固体担体に、技術上
周知の手段により、付着させてもよい。そのうえで試験化合物のP25.1に対する
結合能を検定する。

【００８３】 本発明の一態様では、P25.1とP25.1リガンドたとえばIGFBP-rP1の間の相互作
用を拮抗阻害する化合物を同定するためのスクリーンを設計する。そうしたスク
リーンでは、P25.1リガンド(すなわちIGFBP-rP1)を標識し、P25.1に対する標識
リガンドの結合を拮抗阻害する試験化合物の能力を検定することができる。

【００８４】 P25.1の発現を調節する化合物又は組成物の検定法：P25.1発現を転写レベルか
翻訳レベルで調節する化合物のスクリーニングには、in vitro細胞ベース検定法
をデザインしてもよい。P25.1翻訳を調節する化合物を同定するには、P25.1転写
産物を含む細胞又はin vitro細胞溶解物を試験してP25.1 mRNA翻訳の調節を調べ
ることができる。P25.1翻訳の阻害物質を検定するには、in vitro翻訳抽出物中
でP25.1 mRNAの翻訳を調節する試験化合物の能力を検定する。P25.1発現レベル
を転写レベルか翻訳レベルで低下させる化合物は、ある種のがんの治療に有効で
あろう。他方、P25.1の発現を増進させる化合物は他種のがんの治療に有効であ
ろう。 本発明に基づくスクリーニングが可能な化合物 前述の各種検定法ではP25.1活性に影響を及ぼす化合物の同定が可能である。P
25.1活性に影響を及ぼす化合物の例はP25.1に結合し、その天然リガンド(IGFBP-
rP1)の結合を阻害し、またシグナル伝達経路を活性化する (作動薬) か又は活性
を遮断する(拮抗薬)ような化合物、及びP25.1の天然リガンドに結合しリガンド
の活性を中和するような化合物であるが、それだけに限らない。P25.1遺伝子活
性に (P25.1遺伝子の発現に影響に影響を及ぼすことにより) 影響を及ぼす化合
物(転写に影響を及ぼすか又はスプライシング事象を妨げることにより、全長型
又は不完全型P25.1の発現の調節を可能にする分子、たとえばタンパク質又は低
分子量有機化学分子を含む)もまた本発明のスクリーニングによる同定が可能で
ある。しかし、前述の各種検定法ではP25.1シグナル伝達を調節する化合物(たと
えば下流シグナル伝達事象に影響を及ぼす化合物。P25.1に結合するIGFBP-rP1に
よって活性化されるシグナルの伝達に関与するGタンパク質活性の、又はRas、KP
A、RAP1、B-Raf、Mek又はMAPKの、阻害又は増進物質など)の同定も可能であるこ
とに注目する必要がある。P25.1の下流のシグナル伝達事象に影響を及ぼし、も
ってがんの進行に対するP25.1の効果を調節するような、こうした化合物の同定
と使用は本発明の範囲内である。

【００８５】 本発明に基づくスクリーニングが可能な化合物の例は、ペプチド、抗体及びそ
の断片及びその他の有機化合物(たとえばペプチドミメティクス)であってP25.1
に結合し、IGFBP-rP1によって誘発される活性を模擬するもの(すなわち作動薬)
か又は阻害するもの(すなわち拮抗薬); 並びに変異体又は不完全型P25.1分子(又
はその部分)を含みかつIGFBP-rP1に結合しそれを「中和」するペプチド、抗体及
びその断片及びその他の有機化合物であるが、それだけに限らない。化合物の例
はペプチド、たとえばランダムペプチドライブラリーのメンバーを含むがそれだ
けに限らない可溶性ペプチド(Lam et al., Nature 354:82-84, 1991; Houghten
et al., Nature 354:84-86, 1991); 及びコンビナトリアルケミストリー由来分
子ライブラリーのD型及び／又はL型アミノ酸、ホスホペプチド(ランダム又は部
分縮退指定ホスホペプチドライブラリーのメンバーを含むがそれだけに限らない
。Songyang et al., Cell 72:67-778, 1993などを参照)、抗体(ポリクローナル
、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ又は一本鎖抗体; FAB、F
(ab’)2及びFAB発現ライブラリー断片及びそのエピトープ結合断片を含むがそれ
だけに限らない)、及び低分子量の有機又は無機化学分子などである。本発明に
基づくスクリーニングが可能な他の化合物の例は、血液能関門を越え、適切な細
胞中に進入し、P25.1遺伝子又はP25.1シグナル伝達経路に関与する他遺伝子の発
現に(たとえば、遺伝子発現に関与する調節領域又は転写因子との相互作用を通
じて)影響を及ぼすような小有機化学分子、又はP25.1活性あるいはP25.1シグナ
ル伝達経路に関与する他の分子内因子たとえばIGFBP-rP1、Ras、PKA、RAP1、B-R
af、Mek又はMAPKなどの活性に影響を及ぼすようなその種の分子であるが、それ
だけに限らない。

【００８６】 本書で開示したような検定法で同定された化合物は、たとえばP25.1遺伝子産
物の生物学的機能を工夫するうえで、またがん治療に、有用であろう。細胞ベー
ス検定法で同定された化合物の有効性を試験するための検定法は細胞ベース又は
動物モデル系で試験することができる。そうした動物モデルはそうした疾患の治
療に有効であるかもしれない薬物、医薬品、療法及び介入法を同定するための検
体として使用することができよう。たとえば、がん治療効果を示すと期待される
化合物に動物モデルを接触させるが、接触させる量と時間は動物に対しそうした
治療効果を示すに足る量、時間とする。この接触に対する動物の応答はがんの逆
転を評価することによりモニターすることができる。 可溶性P25.1ポリペプチドの送達 可溶性のP25.1ドメイン又は融合タンパク質たとえば融合Ig分子又はP25.1HAを
発現する遺伝子組換え細胞をin vivo導入すれば、そうした細胞は該可溶性分子
を供給する「バイオリアクター」として機能するであろう。そうした可溶性P25.
1ポリペプチド及び融合タンパク質は、適正濃度で発現するとき、P25.1に対応す
る天然リガンド(すなわちIGFBP-rP1)を適宜、中和し、「吸収」し、又は潜在的
に活性化し、もってがん治療用のP25.1活性調節剤として作用するはずである。 製剤組成物とがん治療法 本発明はがん治療とNE分化調節のための方法及び組成物を包含する。P25.1遺
伝子産物の機能の増進はP25.1の(たとえば下流)経路及びNE分化を活性化する結
果となるので、P25.1活性の阻害は小細胞肺がん、子宮頸がん、乳がん、前立腺
がんなどのようながんの治療を促進する可能性がある。あるいは、ある種のがん
の治療は、正常レベルを下回るP25.1遺伝子発現及び／又はP25.1遺伝子活性及び
／又はP25.1経路活性の(たとえば下流シグナル伝達事象を標的とした)下方調節
によって促進される可能性がある。種々のアプローチが論じられている。小細胞
肺がん、子宮頸がん、乳がん及び前立腺がんなどのようながんではP25.1の作動
薬をNE分化の誘導に使用することができる。これらの同じがんタイプでは、P25.
1活性の拮抗薬をNE分化の阻害に使用することができる。化合物がP25.1に対する
絶対的な特異性を示す必要はない。たとえば、P25.1を、他の未知IGFBP-rP1相互
作用分子もろとも作動させるような化合物を使用してもよい。そうした化合物は
、前立腺等への送達が最適化されてがん治療が実現すると同時に潜在的副作用が
許容限度内に収まるように、投与することができよう。P25.1に対する特異性を
示さない化合物は他の療法又は薬物との併用で投与し、他分子(IGFBP-rP1など)
の調節に由来する副作用の抑制に役立てることができる。しかし、P25.1に対す
る選好又は特異性を示す化合物のほうが好ましい。

【００８７】 用量の決定：こうした化合物の毒性と治療有効性は、たとえば細胞培養又は実
験動物でLD₅₀ (半数致死量)やED₅₀ (半数治療有効量)を決定するための標準製薬
及び毒性評価法により求めることができる。用量の毒性効果と治療効果の間の比
は治療指数であり、LD₅₀/ ED₅₀で表わすことができる。紅治療指数を示す化合物
が好ましい。有害な副作用を示す化合物を使用してもよいが、そうした化合物を
標的の患部組織へと誘導するような送達システムを考案して、非患部細胞への潜
在的損傷を最小限に抑え、もって副作用を少なくするよう配慮する必要がある。

【００８８】 細胞培養検定や動物実験から得られたデータは人間に用いる用量範囲の決定に
使用することができる。かかる化合物の用量は、ED₅₀を含み副作用がほとんど又
はまったくない循環濃度範囲の中に収まるのが好ましい。用量はこの範囲内で、
使用する剤型や投与法に応じて変動しよう。本発明の方法に使用される任意の化
合物は、まず細胞培養検定で治療有効量が決定される。動物モデルでは、細胞培
養で決定されたIC₅₀ (半数最大徴候阻止を実現する試験化合物濃度)を含む循環
血漿中濃度範囲を実現する用量が決定されよう。そうした情報を用いれば、人間
での有効容量をもっと正確に決定することができる。血漿中濃度はたとえば高性
能液体クロマトグラフィーで測定することになろう。

【００８９】 製剤と使用：本発明の製剤組成物は慣用の方法で生理的に許容可能な1以上の
担体又は賦形剤を用いて調合されよう。こうして、本発明の化合物とその生理的
に許容可能な塩及び溶媒化合物は(口又は鼻からの)吸入投与用に、あるいは経口
、舌下、腸管外又は経直腸投与用に製剤されよう。

【００９０】 経口投与の場合、製剤組成物はたとえば錠剤又はカプセル剤の形をとるが、そ
れは慣用の手段により製薬上許容しうる賦形剤たとえば結合剤(ゲル化前のトウ
モロコシでんぷん、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロ
ースなど); 増量剤(ラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウムな
ど); 潤滑剤(ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカなど); 崩壊剤(ジャ
ガイモでんぷん又はグリコール酸ナトリウムでんぷんなど); 又は湿潤剤(ラウリ
ル硫酸ナトリウムなど)を用いて調製される。錠剤は技術上周知の方法で被覆処
理してもよい。経口投与用の液剤はたとえば溶液、シロップ又は懸濁液の形をと
ってもよいし、又は乾燥品として調製し、使用前に水又は他の好適な賦形剤で還
元するようにしてもよい。こうした液剤は慣用の手段で、製薬上許容しうる添加
剤たとえば懸濁化剤(ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は硬化食用油
脂など); 乳化剤(レシチン又はアカシアなど); 非水性賦形剤(アーモンド油、油
性エステル、エチルアルコール又は分留植物油など); 及び保存料(メチル又はプ
ロピル-p-ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸など)を用いて調製することが
できる。製剤には緩衝塩、香味料、着色料、甘味料などを適宜添加してもよい。
経口投与製剤は適宜徐放剤として調製してもよい。

【００９１】 舌下投与剤は慣用の方法で調製される錠剤又はトローチ剤の形にすることがで
きる。

【００９２】 吸入投与の場合、本発明の化合物はエアゾール噴霧剤の形で加圧容器又はネブ
ライザーから、安定した推進剤たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロ
フルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適なガ
スを用いて、投与するのが便利である。加圧エアゾールの場合、定量噴霧弁を設
けて単位用量が噴霧されるようにする。吸入器用には、化合物と好適な粉末基剤
たとえばラクトース又はでんぷんのパウダーミックスを入れたゼラチンカプセル
及びカートリッジを調製することができる。

【００９３】 化合物は静脈内ボーラス又は連続輸液などの注入による腸管外投与用に調製し
てもよい。注入用製剤は単位用量剤型で、たとえばアンプル入り又は追加保存料
を加えた複数分量容器入りとして提供してもよい。組成物は油性又は水性賦形剤
を使用した懸濁液、溶液又は乳濁液の形にしてもよく、また懸濁化剤、安定剤及
び／又は分散剤などの調合助剤を含んでもよい。あるいは、有効成分を粉末化し
、使用前に好適な賦形剤たとえば発熱物質を含まない滅菌水で還元するようにし
てもよい。化合物はまた、慣用の座薬用基剤たとえばココアバター又は他のグリ
セリドを加えた座薬や停留浣腸剤などのような直腸用製剤として調製してもよい
。

【００９４】 化合物は前述の製剤とは別に、貯留製剤として調製してもよい。そうした持続
性の製剤は(たとえば皮下又は筋肉内)埋め込みにより、又は筋内注射により投与
することができる。したがって、化合物はたとえば好適な高分子又は疎水性物質
と混ぜて(許容しうる油と混ぜた乳濁液として)、又はイオン交換樹脂と混ぜて、
又はやや溶けにくい誘導体として、たとえばやや溶けにくい塩として調製しても
よい。

【００９５】 本発明の組成物は、もしも望むなら、有効成分を含む1以上の単位用量剤型を
収納したパック又はディスペンサー入りとして提供してもよい。パックの素材は
たとえばブリスターパックなどのように金属又はプラスチックのホイルでもよい
。パック又はディスペンサーには製剤の使用説明書を添えてもよい。

【００９６】 実施例1 新規IGFBP-rP1相互作用タンパク質に対応するcDNA、P25.1のクローニング 以下の実施例では新規IGFBP-rP1相互作用タンパク質をコードするcDNAすなわ
ちP25.1のクローニングと単離について説明する。それらの結果は、核局在シグ
ナルと予想されるミリスチン化部位を備えた新規222アミノ酸タンパク質をコー
ドする長さ913bpの新規cDNAの発見を示す。

【００９７】 酵母ツーハイブリッド法の使用による新規cDNAクローンの単離: IGFBP-rP1相互作用タンパク質P25.1の単離に用いた酵母ツーハイブリッド法の
説明図を図1に示す。簡単に言えば、 “Match Maker” Yeast-Two-Hybrid cDNA
構築キット(Clontech) を用いて、MCF-7乳がん細胞に由来する5μgの全RNAからc
DNAライブラリーを作製した。このライブラリーを、GAI4 DNA結合ドメインへと
融合させた全長IGFBP-rP1 cDNAと共に、Match Maker Yeast-Two-Hybridスクリー
ニングキットに用いて選択培地上の88個の陽性コロニーを単離した。βガラクト
シダーゼ活性のあるものを再スクリーニングすると、65個のコロニーがなお陽性
のままであった。塩基配列を解析してみると、65コロニーはどれも、長さ約650b
pの同じ新規cDNA (25.1と呼ぶ)を含んでいた。次いで、“5’ RACE rapid ampli
fication of 5’ kit” (Life Technologies)と25.1に対応する遺伝子特異的プ
ライマーとを用いて全長cDNAクローンを単離した(すなわち全長cDNAのbona fide
5’末端とわれわれが今日呼んでいるものの下流350bpの位置からプライミング)
。全長cDNAの単離には標準的な制限酵素消化及びサブクローニング技術を用いた
。

【００９８】 新規cDNAの発見：このcDNAクローンの塩基配列解析から、推定核局在シグナル
と予想される単一ミリスチン化部位を備えた222アミノ酸をコードするオープン
リーディングフレームをもつ913bpのcDNAが明らかになった(図2及びSEQ ID NO:1
)。National Center for Biotechnology Institute (NCBI)を通じての既知デー
タベースの“BLAST”サーチから、この配列は新規であり(GenBankに登録されて
いない)、かつその機能は(本発明の時点まで)不明であることが判明した。

【００９９】 実施例2 ヒト組織における多種のP25.1 mRNAの発現パターン 以下の実施例では多様なヒト組織試料中のP25.1 mRNAの発現パターンについて
説明する。それらの結果は、種々の組織内及び組織間で調節の受け方が異なる3
つの新種P25.1 mRNAの発見を示し、またP25.1 mRNAの発現レベルががん進行の有
用な診断マーカーであるかもしれないことを示唆する。

【０１００】 ヒト多組織ノーザンブロット：ヒト多組織ノーザンブロット(mRNAブロット)を
Clontechから購入した。それは、各表示組織(脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣
、小腸、結腸、抹消血白血球、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓
)に由来するmRNAを試料レーン当たり2μg含んでいた。25.1 cDNAを用いてノーザ
ンブロットをプローブし、 “Prime It” (Stratagene) ランダムDNAプライミン
グキットを用いて25.1 cDNAに[³²P]-α-dCTPで放射性標識した。2000万cpm/10ml
-Rapid Hybridization Solution (Amersham-Pharmacia Biotech, Inc.)を用いて
65℃で一晩、ブロットのハイブリダイゼーションを行った。技術上周知の標準方
法で、またメーカーの勧めに沿って、ブロットを洗浄した。

【０１０１】 調節の受け方が異なる3種のP25.1転写産物の発見：ヒト多組織ノーザンブロッ
トと放射性標識25.1 cDNAプローブとのハイブリダイゼーションから、調節の受
け方が異なる3種の転写産物(サイズは1.3、3.4及び8.5kb)の普遍的発現が明らか
になった(図3)。3種のmRNAの発現レベルはヒト組織試料内部でも、ヒト組織試料
間でも異なる。この発見が示唆するように、これら3種のP25.1 mRNAは正常ヒト
組織中で普遍的に発現するものの調節の受け方は異なる。

【０１０２】 さらに、(データは示していないが)これら3種の転写産物のがん細胞中のmRNA
レベルは一般に正常組織中のそれより低いことも判明したが、それはP25.1 mRNA
ががんの進行を評価するための有用な診断マーカーとなりうることを示唆する。

【０１０３】 実施例3 IGFBP-rP1とP25.1の相互作用の確認 以下の実施例では、P25.1の、細菌タンパク質GSTとの、またHAエピトープタグ
とのインフレーム融合タンパク質の作製と産生について説明する。また、P25.1
と特異的結合を形成することができる抗体分子の産生について説明し、さらにP2
5.1タンパク質の内在性発現を示す乳がん及び前立腺がん細胞系の、アフィニテ
ィー精製抗体を使用したウェスタン免疫ブロット法について説明する。最後に、
本実施例の結果はP25.1とIGFBP-rP1の間の結合の発見を示し、また当初の酵母ツ
ーハイブリッド法クローニング戦略の正しさを確認する。

【０１０４】 P25.1^HA融合タンパク質に対する抗体の産生：抗体産生プロセスの図解は図5の
とおりである。簡単に言えば、PCRによりP25.1のcDNAに(P25.1のC末端、cDNAの
ヌクレオチド714の後に)9アミノ酸HAエピトープ(Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
Tyr Ala)でエピトープタグし、P25.1^HAと命名した。次にこのP25.1^HAを、GST細
菌タンパク質のオープンリーディングフレームをコードするDNAと5’末端でイン
フレームに融合して(融合部分にはトロンビンプロテアーゼ部位を含む)、P25.1^{H A} 融合タンパク質(タグ付き融合タンパク質)をコードするcDNAを作製した。BL21
E. coli細胞中での増殖、誘導後に細胞溶解物をSTE緩衝液中での超音波処理によ
り調製し、タンパク質を非イオン系洗剤で可溶化し、還元剤DTTを加えた。次に
タグ付き融合タンパク質をグルタチオンSepharoseへと結合させ、STE緩衝液で洗
い、P25.1^HA融合ペプチドをトロンビンプロテアーゼによる消化で放出させた。
メスのNew Zealand Whiteウサギ3匹に、予め等容量の完全フロイントアジュバン
トを混合した精製タンパク質100μg/匹を皮下注射した(免疫5日前に免疫前血清
を回収した)。同濃度のタンパク質とフロイトアジュバントによる2回の追加注射
を1ヶ月間隔で実施した。ウサギから全血を採取し、全血から血清を回収した。P
25.1^HAを一過性発現するCOS-7哺乳類細胞に由来する抗原とならし培地に対する
抗体の力価を試験した。次に最高力価のポリクローナル抗体を、E. coli精製P25
.1^HAタンパク質で作製したアフィニティーカラムで精製した。本実施例と明細書
で以下に示すとおり、この精製抗体はウェスタン免疫ブロット法、免疫沈法及び
免疫細胞化学に上首尾に使用された。

【０１０５】 乳がん及び前立腺がん細胞系に由来する細胞溶解物のウェスタン免疫ブロット
法による分析：RIPA (150mM NaCl、20mM Hepes pH 7.5、1% Triton-100、1%デオ
キシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、+プロテアーゼ阻害剤カクテル)で調製した
細胞溶解物の等タンパク質量を還元条件下でSDS-PAGEにかけ、Towbin Transfer
Buffer中でニトロセルロース膜に転写した。得られたニトロセルロースブロット
を次にTBS-T(Tris緩衝生理食塩水+Tween 20)に溶かした5%粉乳でブロッキングし
た。ブロットの一次抗体インキュベーションを同じ緩衝液中で、指定の希釈度に
より、4℃で一晩実施した。ブロットをTBS-Tで3回すすぎ、適当な二次抗体を指
定の希釈度でTBS-Tに添加し、室温で1to時間インキュベートした。

【０１０６】 IGFBP-rP1^FLAGとP25.1^HA融合ペプチドの架橋：Hs578T乳がん細胞に由来するな
らし培地100μl、COS-7細胞中で一過性発現したIGFBP-rP1^FLAGに由来するならし
培地100μl又はバキュロウィルス組換え体から精製したIGFBP-rP1^FLAG 300μgを
、100μlのPBSと、又はGST融合体由来の精製P25.1^HA1μg/100μl-PBSと混合して
、室温で3時間、又は4℃で一晩、インキュベートさせた。相互作用タンパク質に
、10mM DSSを用いて4℃で15分間、化学的架橋反応を起こさせた。40mM Trsi-Cl
pH 7.5と4mM EDTAで反応を止め、非還元性SDS-PAGE泳動緩衝液に再懸濁させ、12
% SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写してから、IGFBP-rP1に対する
ポリクローナル抗体でブロットした。免疫反応性タンパク質を、HRP(西洋わさび
ペルオキシダーゼ)を結合させた抗ウサギ二次抗体を用いて検出し、次いで化学
ルミネッセンスで検出した。

【０１０７】 IGFBP-rP1^FLAGとP25.1^HAの免疫共沈：空無、IGFBP-rP1^FLAG、P25.1^HAを入れた
pcDNA3プラスミド、又はIGFBP-rP1^FLAGとP25.1^HAを入れた両プラスミドを、Fuge
ne 6試薬(Roche Laboratories)と共に用いてCOS-7細胞への一過性トランスフェ
クションを行った。すべてのプラスミド濃度はpcDNA3と等しくした。トランスフ
ェクションの3日後、細胞を回収し、PBSで1回洗い、PBSに再懸濁させ、超音波処
理で溶解した。不溶性物質を遠心で除去してから、細胞溶解物をまず、プロテイ
ンA Sepharose (Amersham-Pharmacia)と予めインキュベートさせておいたα-P25
.1又はα-IGFBP-rP1とインキュベートさせた。免疫沈降した複合体を遠心でペレ
ット化し、PBSで3回洗った。次に、このタンパク質複合体を、還元性SDS-PAGEサ
ンプル緩衝液中で煮沸して溶離(溶解)させ、12% SDS-PAGEにかけ、Towbin Trans
fer Bufferを用いてニトロセルロース膜に転写した。TBS-Tに溶かした5%粉乳に
よるブロッキング後、対応する免疫共沈タンパク質のエピトープタグに対応する
二次モノクローナル抗体を免疫ブロット法に用い、最後にHRP結合抗マウス「二
次」抗体及び化学ルミネッセンスで検出した。

【０１０８】 混合と免疫共沈： Hs578T又はMCF-7乳がん細胞に由来する3日ならし培地とP.2
51^HA、IGFBP-rP1^FLAG又は空無をコードする一過性発現ベクターを用いて、混合
実験により二タンパク質間の相互作用を検証した。等容量の表示ならし培地を4
℃で一晩インキュベートした。タンパク質複合体を前述の要領による免疫共沈法
とウェスタン免疫ブロット法で調べた。

【０１０９】 内在性P25.1及びIGFBP-rP1の免疫細胞化学的調査：内在性発現P25.1及びIGFBP
-rP1タンパク質を、前立腺上皮がん細胞系M12中のα-II25.1 Ab又はα-IGFBP-rP
1 Abによる免疫蛍光法で調べた。

【０１１０】 がん細胞中の内在性P25.1の発現低下の発見：アフィニティー精製α-P25.1抗
体(図5)を用いて、次の乳がん及び前立腺がん細胞系に由来する細胞溶解物試料
を含むウェスタン免疫ブロットをプローブした: HMEC (一次乳腺上皮細胞)、MCF
-7、Hs578T乳がん細胞、M12-pcDNA、及びM12-rP1安定前立腺がん細胞系(図6)。
その結果は、乳がん及び前立腺がん細胞系でのP25.1の発現レベルが一次乳腺上
皮細胞での発現レベルを下回ることを示したが、それはP25.1の発現ががん細胞
内では下方調節を受けることを示唆する。

【０１１１】 IGFBP-rP1とP25.1の相互作用を確認する調査：化学的架橋、免疫共沈及び混合
の各実験を用いて、種々の系における組換え及び内在性両IGFBP-rP1の一過性発
現又は組換えP25.1HAとの相互作用を証明した。乳がん細胞に由来する内在性IGF
BP-rP1は一過性型及び組換え型と共に、さまざまな由来のP25.1と相互作用する
ことができた。この相互作用はin vitroでは二ペプチドの溶液結合により、また
複合体の化学的架橋(図7)か免疫沈降(図8) のいずれかとその後のウェスタン免
疫ブロット法(図2C及び2D)による検証により、証明された。さらに、二タンパク
質は、一過性発現のP25.1と内在性又は一過性発現のIGFBP-rP1の免疫共沈によっ
て示されたようにin vivoでも細胞内で結合した(図2E)。

【０１１２】 内在性P25.1及びIGFBP-rP1の核移行の発見：同期化させてから自己複製するに
任せた細胞上での内在性P25.1及びIGFBP-rP1を対象とする免疫蛍光法により、サ
イトゾルと核の間の、細胞周期依存的な移行と同時局在が証明された。

【０１１３】 実施例4 IGFBP-rP1との関連で見たP25.1の生物学的役割の研究 以下の実施例では、IGFBP-rP1を安定的、構成的に発現するM12-IGFBP-rP1細胞
におけるP25.1の一過性発現の結果について説明する。免疫細胞化学的な特性解
明により、P25.1の一過性発現はNE文化を誘導することが判明した。

【０１１４】 一過性トランスフェクション：表示のcDNAを備えたpdDNA3系プラスミドを、Fu
gene 6試薬を用いてメーカーの勧めに従って、種々の哺乳類細胞に一過性トラン
スフェクションした。簡単に言えば細胞密度60〜70%の100mmディッシュに、20μ
lのFugene 6試薬を用いて (室温、15分で) 予め沈殿させた表示のプラスミド10
μgをトランスフェクトした。プラスミド濃度は、シングル又はデュアルトラン
スフェクションの場合、コントロールベクターpcDNA3で標準化した。NE分化実験
では、6穴ディッシュを用いてプラスミドDNA 8μg/ウェルを6〜18時間かけてト
ランスフェクションし、次いでトリプシン処理してから新ディッシュにまいて後
続の実験に備えた。

【０１１５】 免疫蛍光法：24穴ディッシュで細胞培養を表示時間にわたり、±トランスフェ
クション及び／又は±処理で、実施した。4%パラホルムアルデヒドを用いて室温
、10分間で細胞をウェルに固定させ、次いで50%メタノール／50%アセトンを用い
て室温、1〜2分間で透過性にした。PBSに溶かした0.25%正常ヤギ血清+0.1% Trit
on-X 100で細胞をブロッキングした。一次抗体インキュベーションを表示の希釈
度の同じ緩衝液中で、室温で1〜2時間又は必要ならば4℃で一晩実施した。各ウ
ェルをPBSで3回すすぎ、蛍光標識二次抗体をHoechst染料(1μg/ml)と共に加えて
室温で1〜2時間おいた。各ウェルをPBSで3回、十分に洗い、次いでアナログカメ
ラ付きNikon反転位相傾向顕微鏡で観察した。

【０１１６】 P25.1^HAの一過性発現はM12-IGFBP-rP1細胞のNE分化を促進するという発見：IG
FBP-rP1との関連で見たP25.1の生物学的役割を調べるために、前立腺上皮がん細
胞系M12を使用した。このM12はIGFBP-rP1を安定的に発現するので、ここではM12
-IGFBP-rP1細胞系と呼ぶ。野生型M12と比べて、安定トランスフェクションしたM
12-IGFBP-rP1細胞は多数の突起をもつ細長の形態を獲得している。規定培地で増
殖させると、親細胞系(コントロール)と比べて抑制された増殖速度を示す。M12-
IGFBP-rP1細胞系の形態学的、生物学的変化は内在性IGFBP-rP1の内在性P25.1と
の相互作用に起因させることができるかもしれない。この可能性を調べるために
、P25.1^HAをM12-IGFBP-rP1細胞中で一過性発現させた。

【０１１７】 M12-IGFBP-rP1細胞にNE分化の増進が起こり、P25.1^HAを一過性発現する細胞中
に長いシナプス様樹状突起が出現した(図9)。さらに、これらの細胞は神経炎の
ような外観を呈し、またIGFBP-rP1相互作用タンパク質のP25.1を過剰発現してい
る他細胞と擬似シナプス結合を形成するように見受けられる。P25.1タンパク質
は十分に分化した神経細胞中に、さらには樹状突起のアームの分泌顆粒とされる
ものの中にさえ、くまなく存在する。NEマーカーのChr A (クロモグラニンA)及
びNSE (ニューロン特異的エノラーゼ)に対するモノクローナル抗体を使用して、
これらの分化細胞が実際に神経内分泌細胞(NE)であることを検証した (図10) 。

【０１１８】 実施例5 NE分化におけるcAMPとP25.1の関係の特性解明 8-ブロモ-cAMP/Forskolin処理：細胞を0.1〜1mM 8br-cAMPで処理した。これは
100mMストックから希釈し、ストック自体は増殖培地で表示のとおりに希釈した
。増殖培地中の10mMストックから希釈した10μM Forskolinを表示のとおりに使
用した。

【０１１９】 cAMP誘導型P25.1調節の発見：cAMP類縁物質の8-ブロモ-cAMP (8br-cAMP)又は
作動薬フォルスコリンでM12-IGFBP-rP1細胞を処理すると、P.25.1の一過性発現
がない場合には、NE分化と類似する形態学的変化を引き起こした。内在性P25.1
の蛍光免疫分析から、非処理M12-IGFBP-rP1細胞ではこのタンパク質がサイトゾ
ルからNE細胞中で支配的な分泌顆粒へと移行することが明らかになった。 P25.1を一過性発現するM12-IGFBP-rP1細胞に8br-cAMPを使用して、cAMP誘導型の
細胞分化がP25.1の発現と関連するかどうかを調べた。8br-cAMPとのインキュベ
ーションはP25.1を一過性発現する細胞の数を増やし、NE特異的抗体で陽性着色
するNE分化細胞のいっそうの増加を招く結果となった(図10)。トランスフェクシ
ョンした細胞に由来する全細胞溶解物をウェスタン免疫ブロット法で調べると、
P25.1の発現レベルは8br-cAMPによる処理で大幅に増進されることが判明したが
、これはcAMP誘導型のP25.1調節が行われたことを示唆する(図10)。

【０１２０】 まとめ 線維芽細胞、平滑筋細胞及び含脂肪細胞では、細胞性cAMPの増加はRasタンパ
ク質ファミリーのメンバーを通じてMAPキナーゼ経路の抑制により増殖を阻害す
る(「発明の背景」を参照)。ラットの副腎髄質に由来するPC12などのような前ニ
ューロン細胞では、PKAの活性化はRap1/B-Raf/Mek/MAPK経路による増殖の停止と
分化を招き、神経成長因子(NGF)の追加はこの形態学的過程を増進する(同上)。
以上の実験では、M12-IGFBP-rP1細胞は規定培地では増殖速度の抑制を示したが
、これはRas>MAPK経路がIGFBP-rP1分泌タンパク質の過剰発現によって妨げられ
る可能性のあることを示唆する。これは、増殖の抑制と分化経路の部分的活性化
を招く結果となるIGFBP-rP1と限定量の内在性P25.1の間の相互作用によって説明
がつくであろう。これはcAMP類縁物質又は作動薬の追加によってさらに増進され
、それが低分子量Gタンパク質Rap1を活性化し、ひいてはMAPK経路を通じてのB-R
afの活性化といっそうの分化を招く。この分化経路で固有の役割を果たすP25.1
の一過性発現はがん細胞中の最終的なNE分化をさらに増進する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 酵母ツーハイブリッド法を使用してIGFBP-rP1相互作用タンパク質を単離する
ための単離法の説明図である。新規cDNAクローンのP25.1は全長ヒトIGFBP-rP1と
MCF-7乳がん細胞に由来するcDNAライブラリーとを使用して単離した。該cDNAは
、推定核局在シグナルと予想されるミリスチン化部位とを備えた222アミノ酸の
新規タンパク質をコードする。

【図２】 新規P25.1 cDNAの配列を示す。該cDNAは、推定核局在シグナルと予想されるミ
リスチン化部位(図ではどちらも、対応するヌクレオチド配列の上に印をつけて
ある)とを備えた222アミノ酸の新規タンパク質をコードする。

【図３】 3種のP25.1 mRNAの発現差を示す正常ヒト組織のノーザンブロットである。レ
ーン当たり2μgのmRNAを含む正常ヒト組織のノーザンブロットを[³²P]-α-dCTP
標識25.1 cDNAプローブとハイブリダイズさせた。各レーンで示される組織は次
のとおり: レーン1脾臓、レーン2胸腺、レーン3前立腺、レーン4精巣、レーン5
卵巣、レーン6小腸、レーン7結腸、レーン8抹消血白血球、レーン9心臓、レーン
10脳、レーン11胎盤、レーン12肺、レーン13肝臓、レーン14骨格筋、レーン15腎
臓、レーン16膵臓。

【図４】 乳がん及び前立腺がん細胞に由来する細胞溶解物を対象としたウェスタン免疫
ブロット法による内在性P25.1タンパク質の検出を示す。P25.1タンパク質の検出
量はがん細胞のほうが正常細胞よりも少ない。細胞溶解物は密集培養ディッシュ
のHMEC (一次ヒト乳腺上皮細胞)、MCF-7及びHs587T乳がん細胞、それにM12-pcDN
A及びM12-rP1安定前立腺がん細胞系からRIPA緩衝液(150mM NaCl、20mM Hepes pH
7.5、1% Triton-100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDSにプロテアーゼ
阻害剤カクテルを添加)を用いて調製した。等量のタンパク質をSDS-PAGE上に分
離し、アフィニティー精製抗P25.1ポリクローナル抗体によるウェスタン免疫ブ
ロット法でP25.1タンパク質を検出した。

【図５】 P25.1タンパク質の発現と精製、及びポリクローナル抗体の産生に関する説明
図である。簡単に言えば、P25.1 cDNAとGSTの融合タンパク質を生成させ、GST:P
25.1融合体をE. coliに導入した。菌を対数期まで増殖させ、IPTGで誘導し、次
いでPBS中で超音波処理により溶解させた。融合タンパク質をグルタチオンSepha
roseに結合させ、トロンビンによる消化でP25.1タンパク質を放出させた。融合
タンパク質をフロインドアジュバントと混和して、メスのNew Zealand Whiteウ
サギに皮下注射し、その後2回ブースター投与した。ウサギから全血を採取し、
血清を回収した。

【図６】 IGFBP-rP1とP25.1の相互作用の確認を示す。精製P.25.1 E. coliと種々のIGFB
P-rP1源を、両タンパク質間の物理的会合を立証するアフィニティー架橋に使用
した。精製P25.1(E. coli中に発現)と種々のIGFBP-rP1源を使用しアフィニティ
ー架橋を起こさせた。架橋産物を12% SDS-PAGEの使用により分離し、ニトロセル
ロース膜に転写し、抗IGFBP-rP1で免疫ブロットした。Hs587T乳がん細胞由来の
ならし培地(CM)(内在源)、COS-7細胞中に一次発現させたIGGBP-rP1 ^FLAG由来のC
M、及び組換え感染昆虫細胞に由来するアフィニティー精製IGFBP-rP1 ^FLAGからI
GFBP-rP1を得て、E. coli由来精製P.25.1の存在下(右図)又は不存在下(左図)でD
SSと化学架橋させた。

【図７】 トランスフェクションしたCOS-7細胞に由来するP25.1^HAとIGFBP-rP1^FLAGの免
疫共沈(IPed)を示す。COS-7細胞へのトランスフェクションにはpcDNA3、pcDNA3:
25.1^HA、pcDNA3.1:IGFBP- rP1 ^FLAG、又はpcDNA3:25.1^HAとpcDNA3.1:IGFBP-rP1^{F LAG} の両方を用いた。トランスフェクションの48時間後に、細胞を収穫しプロテ
アーゼ阻害剤入りPBS中で超音波処理により溶解した。抽出物を、それぞれプロ
テインA-Sepharose 4 Fast Flowに予め吸着させておいた抗IGFBP-rP1(右の2レー
ン)又は抗P25.1(左の4レーン)と共に免疫沈降させた。

【図８】 トランスフェクションしたMCF-7(M)又はHs578T(H)細胞に由来するP25.1^HA及び
IGFBP-rP1^FLAGのin vivo混和と免疫共沈を示す。MCF-7(M)又はHs578T(H)細胞へ
のトランスフェクションにはpcDNA3(コントロール)、pcDNA3:25.1^HA（25.1^HA）
、pcDNA 3.1:IGFBP-rP1 ^FLAG (rP1 ^FLAG)又はpcDNA3:25.1^HA + pcDNA3.1: IGFBP
-rP1 ^FLAG を用いた。独立トランスフェクション体に由来する等量のCMを、プロ
テインA-Sepharose 4 Fast Flowに予め吸着させておいた抗IGFBP-rP1と混和し免
疫沈降(IPed)させた。免疫沈降産物を12% SDS-PAGEを用いて分離し、ニトロセル
ロース膜に転写して、ラット抗HAモノクローナル抗体で免疫ブロットした。

【図９】 P25.1^HAを一過性発現するM12:rP1安定トランスフェクション細胞のNE様分化を
示す。P25.1タンパク質を過剰発現するM12:rP1細胞はNE分化の増進を示した。pc
DNA3:25.1^HAはFugene 6トランスフェクション試薬を用いてM12:pcDNA3又はM12:I
GFBP- rP1安定トランスフェクション細胞系に一過性トランスフェクションした
。一過性トランスフェクション細胞をトリプシン処理し、12穴ディッシュに再プ
レートした。内在性の一過性発現25.1タンパク質を、抗P25.1 Ab又は抗HA mAb (
HAエピトープに対するモノクローナル抗体)により免疫細胞化学を用いて調べた
。25.1タンパク質を過剰発現するM12:rP1細胞はNE分化の著増を示した。こうし
て、IGFBP-rP1を安定的に過剰発現する前立腺がん細胞系内の一過性発現性P25.1 ^HA はNE分化を促進することになる。

【図１０】 NEマーカー染色が陽性となるM12:rP1を安定的に過剰発現するP25.1タンパク質
を示す。一過性P25.1の発現は8br-cAMPの存在下で増大する。pcDNA3又はpcDNA3:
25.1HAによるM12:pcDNA又はM12:rP1の一過性トランスフェクション体を6穴又は2
4穴ディッシュにまき、付着後に-/+ 0.5μM 8br-cAMPでインキュベートした。6
穴ディッシュから全細胞溶解物を0.25ml RIPA緩衝液中で調製し、等量のタンパ
ク質を12% SDS-PAGE上で分離し、ニトロセルロース膜に転写し、アフィニティー
精製抗P25.1ポリクローナル抗体及び抗NSEモノクローナル抗体でブロットした。
細胞は一次抗体としての抗P25.1 Abと抗クロモグラニンA mAbで同時染色した。F
ITCで標識した抗ウサギIgG (緑色)とAlexaで標識した抗マウス(赤色)を用いて、
P25.1又はクロモグラニンAをそれぞれ免疫蛍光法で検出した。同一場の独立画像
をオーバーレイして、同時発現を黄色で表現した。P25.1を一時的に過剰発現す
るM12:rP1安定細胞はNEマーカーのクロモグラニンA染色で陽性を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 11/00 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 11/00 13/08 ４Ｈ０４５ 13/08 15/00 15/00 15/08 15/08 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ローゼンフェルド，ロン ジー． アメリカ合衆国，オレゴン 97062，トゥ アラティン，サウスウエスト メリディア ン ウェイ 5791 (72)発明者 オー，ヤングマン アメリカ合衆国，オレゴン 97006，ビー バートン，ノースウエスト パシフィック グローブ ドライブ 545 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB14 BB29 BB50 CB01 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB05 FB08 FB12 4B024 AA01 AA12 CA04 HA11 HA12 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ43 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4C084 AA13 AA17 NA14 ZA591 ZA811 ZB261 ZC022 4C085 AA13 AA14 CC21 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA59 ZA81 ZB26 ZC02 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA28 EA51 FA74

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 P25.1ポリペプチドをコードしかつSEQ ID NO:1配列のコード
   領域又はSEQ ID NO:1配列のコード領域と90%以上の相同性をもつ配列を含む単離
   DNA配列。
2. 【請求項２】 SEQ ID NO:1に記載のcDNA配列によって発現される、又はSEQ
   ID NO:1のコード領域と90%以上の相同性をもつ配列によって発現される単離タ
   ンパク質又はポリペプチド。
3. 【請求項３】 進行性がんを確定するがん診断検定法であって、 (a)腫瘍組織の試料を入手すること、及び (b)該試料中に存在するIGFBP-rP1相互作用タンパク質P25.1特異的配列の量を
   求めるための配列同一性検定法を実施し、もってP25.1特異的配列の量を進行性
   がんと相関させること を含むがん診断検定法。
4. 【請求項４】 配列同一性検定法がPCR法、ELISA法、ハイブリダイゼーショ
   ン法及びそれらを組み合せた検定法からなる群より選択される請求項4のがん診
   断検定法。
5. 【請求項５】 がん治療活性をもつ試験化合物を同定するための方法であっ
   て、 (a)試験化合物を、IGFBP-rP1ポリペプチドとIGFBP-rP1相互作用タンパク質の
   両方を発現する細胞と接触させ、IGFBP-rP1か又はIGFBP-rP1相互作用タンパク質
   を組み換え発現させるようにすること、及び (b)該試験化合物が該細胞の増殖速度又は分化を変化させるかどうかを、特異
   的な細胞分化マーカーの存在又は不存在によって判定し、もって該細胞の増殖速
   度又は分化を変化させる試験化合物をがん治療化合物として同定すること を含む試験化合物の同定法。
6. 【請求項６】 IGFBP-rP1相互作用タンパク質がP25.1である請求項5の方法
   。
7. 【請求項７】 がん治療活性をもつ試験化合物を同定するための方法であっ
   て、 (a)機能的IGFBP-rP1を、試験化合物の存在又は府存在下に、機能的IGFBP-rP1
   相互作用タンパク質と接触させ、該試験化合物がIGFBP-rP1相互作用タンパク質
   とIGFBP-rP1の間の相互作用を阻害するかどうかを判定すること、 (b)該相互作用を阻害する(a)の試験化合物を、IGFBP-rP1ポリペプチドとIGFBP
   -rP1相互作用タンパク質の両方を発現する細胞とさらに接触させて、IGFBP-rP1
   か又はIGFBP-rP1相互作用タンパク質を組み換え発現させるようにすること、及
   び (c)該試験化合物が該細胞の増殖速度又は分化を変化させるかどうかを、特異
   的な細胞分化マーカーの存在又は不存在によって判定し、もって該細胞の増殖速
   度又は分化を変化させる試験化合物をがん治療化合物として同定すること を含む試験化合物の同定法。
8. 【請求項８】 IGFBP-rP1相互作用タンパク質がP25.1である請求項7の方法
   。
9. 【請求項９】 がん治療活性をもつ試験化合物を同定するための方法を提供
   であって、 (a)試験化合物を、IGFBP-rP1ポリペプチドとIGFBP-rP1相互作用タンパク質の
   両方を発現する細胞と接触させること、及び (b) IGFBP-rP1相互作用タンパク質か又はIGFBP-rP1ポリペプチドの核移行の度
   合いを測定し、もってIGFBP-rP1相互作用タンパク質か又はIGFBP-rP1ポリペプチ
   ドの核移行の度合いを変化させる試験化合物をがん治療化合物として同定するこ
   と を含む試験化合物の同定法。
10. 【請求項１０】 IGFBP-rP1相互作用タンパク質がP25.1である請求項9の方
    法。
11. 【請求項１１】 がん治療活性をもつ試験化合物を同定するための方法であ
    って、 (a)試験化合物を、IGFBP-rP1ポリペプチドとIGFBP-rP1相互作用タンパク質の
    両方を発現する細胞と接触させること、及び (b) Ras、PKA、RAP1、B-Raf、Mek又はMAPKのいずれかである細胞内タンパク質
    のリン酸化又は活性化の状態を測定し、もって該細胞内タンパク質のリン酸化又
    は活性化の状態を変化させる試験化合物をがん治療化合物として同定すること を含む試験化合物の同定法。
12. 【請求項１２】 IGFBP-rP1相互作用タンパク質がP25.1である請求項11の方
    法。
13. 【請求項１３】 がん治療活性をもつ試験化合物を同定するための方法であ
    って、 (a)試験化合物を機能的IGFBP-rP1相互作用タンパク質と接触させ、該試験化合
    物が機能的IGFBP-rP1相互作用タンパク質と相互作用するかどうかを判定するこ
    と、 (b)該機能的IGFBP-rP1相互作用タンパク質と相互作用する(a)の試験化合物を
    、IGFBP-rP1ポリペプチドとIGFBP-rP1相互作用タンパク質の両方を発現する細胞
    とさらに接触させて、IGFBP-rP1か又はIGFBP-rP1相互作用タンパク質を組み換え
    発現させるようにすること、及び (c)該試験化合物が該細胞の増殖速度又は分化を変化させるかどうかを特異的
    な細胞分化マーカーの存在又は不存在によって判定し、もって該細胞の増殖速度
    又は分化を変化させる試験化合物をがん治療化合物として同定すること を含む試験化合物の同定法。
14. 【請求項１４】 IGFBP-rP1相互作用タンパク質がP25.1である請求項13の方
    法。
15. 【請求項１５】 がん治療活性をもつ試験化合物を同定するための方法であ
    って、 (a)試験化合物を、IGFBP-rP1相互作用タンパク質mRNA配列を含む細胞又は細胞
    溶解物と接触させること、及び (b)IGFBP-rP1相互作用タンパク質転写産物の翻訳阻害を検出すること を含む試験化合物の同定法。
16. 【請求項１６】 IGFBP-rP1とP25.1の相互作用の阻害剤、抗P25.1抗体、P25
    .1アンチセンス分子、及びリボザイム分子からなる群より選択されるP25.1生物
    活性の拮抗薬。
17. 【請求項１７】 P25.1アンチセンス分子がP25.1 cDNA配列SEQ ID NO:1と相
    補的な10塩基以上の特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項16の拮
    抗薬。
18. 【請求項１８】 P25.1アンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO:2〜16
    とそれらの組合せからなる群より選択されるオリゴヌクレオチド配列を取り込ん
    だ15〜25塩基オリゴヌクレオチドである請求項17の化合物。
19. 【請求項１９】 IGFBP-rP1とP25.1の相互作用の阻害剤、抗P25.1抗体、P25
    .1アンチセンス分子、及びリボザイム分子からなる群より選択される治療有効量
    のP25.1拮抗薬と製薬上許容しうる担体とを含んでなる抗がん製剤組成物。
20. 【請求項２０】 P25.1アンチセンス分子がP25.1 cDNA配列SEQ ID NO:1と相
    補的な10塩基以上の特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項19の抗
    がん製剤組成物。
21. 【請求項２１】 P25.1アンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO:2〜16
    とそれらの組合せからなる群より選択されるオリゴヌクレオチド配列を取り込ん
    だ15〜25塩基オリゴヌクレオチドである請求項19の抗がん製剤組成物。
22. 【請求項２２】 処置を必要とする対象者のがんを治療又は予防するための
    方法であって、そうした治療又は予防が望まれる該対象者に、IGFBP-rP1とP25.1
    の相互作用の阻害剤、抗P25.1抗体、P25.1アンチセンス分子、及びリボザイム分
    子からなる群より選択される治療有効量のP25.1拮抗薬を投与することを含む方
    法。
23. 【請求項２３】 治療又は予防するべきがんが小細胞肺がん、子宮頸がん、
    乳がん又は前立腺がんである請求項22の方法。
24. 【請求項２４】 P25.1に結合する抗体又はその結合断片と製薬上許容しう
    る担体とを含んでなる抗がん製剤組成物。
25. 【請求項２５】 抗体がヒト化モノクローナル抗体である請求項26の抗がん
    製剤組成物。