JP2003512615A - 固相化学反応をモニターする方法および装置 - Google Patents

固相化学反応をモニターする方法および装置

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Abstract

(57)【要約】 固相化学反応をモニターする方法。この方法には、(a)固体担体と液体反応媒質とを含有する反応混合物を提供するステップと、(b)該反応混合物に減衰全反射エレメントを接触させるステップと、次に、(c)減衰全反射エレメントを介して固体担体上の化学反応を直接モニターするステップとが含まれる。モニターステップは、減衰全反射分光法によって行われる。本発明の利点は、反応媒質中の反応成分をモニターすることにより化学反応を間接的にモニターすることではなく、固体担体上の化学反応を直接モニターしうることである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、化学反応をモニターする方法および装置に関し、特に、固相化学反
応をモニターする方法および装置に関する。
【０００２】発明の背景 伝統的に、有機化合物を合成するためのほとんどの化学反応は、液相で行われ
てきた。しかしながら、新規な化学薬剤および薬理剤の探索における最近の動向
では、新薬候補化合物の有望な供給源として、いわゆる「化学ライブラリー」を
作製することが中心的に行われるようになってきた。そのような化学ライブラリ
ーは、生物学的活性に関してスクリーニングすることのできるさまざまな分子の
計画的に作製されたコレクションである。そのようなライブラリーを合成化学反
応によって作製する場合、ライブラリーの各メンバーは、逐次的な一連の化学反
応によって形成される。その際、反応をさまざまに組み合わせて行うことにより
、ライブラリーのそれぞれ異なるメンバーが形成される。
【０００３】 特に自動方式による化学ライブラリーの合成およびスクリーニングを促進する
ために、ライブラリー内のさまざまな化学物質は、多くの場合、粒子もしくはビ
ーズのような個別(discrete)固体担体に結合される。その結果、スクリーニング
法によって候補化合物として同定されたそのライブラリー内の特定の化合物は、
それが結合している個別固体担体を分離することによって単離することができる
。
【０００４】 これらの目的に用いられる化学合成ロボットおよびスクリーニングロボットは
公知であり、たとえば、Agrafiotisらに付与された米国特許第5,463,564号に示
されている。
【０００５】 固相コンビナトリアルライブラリーを構築する必要があるため、これまで液相
で行われてきた反応は、現在では、反応生成物が固体担体上に固定されるように
固相で行われている。固相合成反応は、反応が完結することを保証すべく典型的
には60時間までで行われる。反応中に測定を行うには、サンプルを採取して、担
体から生成物を切り離すかまたはサンプルを乾燥させる必要があるため、そのよ
うに長時間をかけて反応が行われる。前者のアプローチでは、生成物が破壊され
る傾向があるうえに時間がかかる。また、後者のアプローチでは、時間がかかる
うえにサンプルが分解する可能性がある。大きなライブラリーもしくは複雑なラ
イブラリーが望まれる場合(このことは多くの場合にあてはまる)、各反応ステッ
プの所要時間により、コンビナトリアルライブラリーの構築が著しく遅くなる。
【０００６】 以上の状況にかんがみて、固相合成反応をモニターする新しい手法が必要とさ
れている。
【０００７】発明の概要 本発明は、固相化学反応をモニターする方法を提供する。この方法には、(a)
固体担体と液体反応媒質とを含有する反応混合物を提供するステップと、(b)該
反応混合物に減衰全反射エレメントを接触させるステップと、次に、(c)該減衰
全反射エレメントを介して該固体担体上の化学反応をモニターするステップとが
含まれる。モニターするステップは、減衰全反射分光法によって行われる。有利
なことに、液体反応媒質中の反応成分をモニターすることにより化学反応を間接
的にモニターするのではなく、固体担体上の化学反応を直接モニターすることが
可能である。
【０００８】 接触させるステップは、反応媒質中に適切な試薬を添加して所望の反応の進行
を引き起こす条件下で行われる。モニターするステップは、好ましくは、吸光度
の変化が反応の進行に明確に(positively)関連づけられる条件下で(たとえば、
吸光度の増加が合成反応の進行に明確に関連づけられる条件下で、もしくは吸光
度の減少が分解反応の進行に明確に関連づけられる条件下で)反応混合物に起因
した吸光度を測定することにより行われる。
【０００９】 以上の方法は、固相担体上で化学反応を進行させながらその進行を直接モニタ
ーするのに使用することができる。プローブに結合されたビーズの吸光度(たと
えば、赤外光、近赤外光、可視光、もしくは紫外光の吸光度)を測定することに
より、サンプルを取り出したりビーズから分子を切り離したりする必要もなくビ
ーズ上の反応ステップの進行をモニターすることができる。この方法は、任意の
タイプの小規模もしくは大規模固相合成に適用しうるが、固相コンビナトリアル
ライブラリーを作製するために行われる固相合成に適用するのが特に有用であり
、この場合には、ライブラリーを作製する各ステップの所要時間を有利に削減す
ることができる。
【００１０】 したがって、本発明のさらなる態様は、好ましくは、それぞれ固相化学反応を
含む少なくとも2回の逐次反応サイクルによって、それぞれ個別固体担体上に固
定された少なくとも100種の異なる化合物を含むコンビナトリアルライブラリー
を作製する方法である。この方法では、逐次反応サイクルのそれぞれが平均で8
もしくは10時間以下となる合計時間で逐次反応サイクルのすべてを完了させる。
【００１１】 本明細書の図面および以下に記載の具体例により本発明についてさらに詳細に
説明する。
【００１２】好ましい実施形態の詳細な説明 本発明は、バッチ反応、単一反応、もしくはコンビナトリアルライブラリーを
作製するためにコンビナトリアル合成プロセスに組み入れられる反応を含めて、
すべてのタイプの固相反応に有用である。コンビナトリアルライブラリーとは、
固体担体上に固定されたさまざまな化合物のセットもしくはコレクションであり
、以下に記載されているように、さまざまな個別固体担体上にさまざまな化合物
が固定されている。以下でも論じられているように、化合物はオリゴマーであっ
ても非オリゴマーであってもよい。
【００１３】 一般的には、以下の実施例に記載の化学合成および反応は、図1aに示される装
置を用いてモニターすることができる。装置は、紫外光/可視光分光器25に接続
された光ファイバー結合減衰全反射(ATR)プローブ20を具備する。ATRプローブ(E
quitech International, Aiken, South Carolina, USAから入手した)は、3バウ
ンス設計減衰全反射エレメント22を利用し、分光器とプローブを相互接続するケ
ーブルとして400μm光ファイバー繊維を組み込んだものであった。本研究では、
モニターされるチャンネルの数に応じて、異なる2台の分光器、すなわち、重水
素光源を用いる単一チャネル分光器(Zeiss MCS 501, Custom Sensors and Techn
ology, St. Louis, Missouri, USA)およびキセノン光源を用いる4チャネル分光
器(Equitech International, Aiken, SC)を使用した。データ解析および表示を
行うために、標準的なインターフェースボードを用いて分光器をパーソナルコン
ピューター24に接続した。本発明者らは、Zeiss, Germanyから入手可能なASPECT TM データ取得および表示ソフトウェアを使用したほか、National Instruments,
USAから入手可能なLABVIEWTMデータ取得、表示および解析ソフトウェアをも使用
した。
【００１４】 減衰全反射エレメント、モニターおよび分光法は公知であり、米国特許第5,81
4,565号、同第5,465,151号、同第5,070,243号、および同第3,752,584号に記載さ
れているような公知の方法に従って行うことができる。一般的には、全内反射は
、紫外光、近紫外光、可視光もしくは赤外光で行うことができる。減衰全反射エ
レメントは、利用する波長で実質的に光学的に透明である任意の好適な材料から
形成しうるが、一般的には、サファイア、ガラス、石英、ゲルマニウム、セレン
化亜鉛、ダイヤモンド(ダイヤモンド様炭素を含む)、およびそれらの組み合わせ
のような不活性な不溶性無機結晶材料から形成される。減衰全反射エレメントは
、公知の光学品製造法に従って複合材もしくは層から形成可能であり、被覆され
ていなくてもよいし、または減衰全反射エレメントへの固体担体の接着性を向上
させる材料で被覆されていてもよい。
【００１５】 使用時、プローブ20は、液相31と、固体担体32として好ましくはポリスチレン
ビーズである個別固体担体とを含有する固相反応媒質30に挿入される。図1bに示
されているように、固体粒子32は、ATRエレメント22に付着もしくは結合する。
その間、経路35、36に沿ってエレメントに対する光の送入および送出が行われる
。図1cに示されているように、固体担体32がATRエレメント22に付着もしくは結
合することにより、ATRエレメント22からの光37は、固体担体32に進入して透過
すると考えられる。特筆すべき点として、固体担体が粒子やビーズのような独立
した個別(separate discrete)固体担体である場合、図1bに示されているように
、減衰全反射エレメントの露出面の大部分もしくは実質的にすべてが、これらの
独立した個別固体担体の少なくとも1個の厚さを有する、これらの独立した個別
固体担体の連続層で覆われることが好ましい。
【００１６】 本発明を実施するのに使用される固体担体は、典型的には、個別固体担体であ
る。個別固体担体は、上述したように互いに分離していてもよいし、単一基材の
表面部上の個別領域であってもよい。そのような「チップ型」もしくは「ピン型
」固体担体は公知である。たとえば、Ellmanに付与された米国特許第5,288,514
号(ピンベース担体)、Fodorらに付与された米国特許第5,510,270号(チップベー
ス担体)を参照されたい(本明細書中に引用されているすべての米国特許文献の開
示内容は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)。粒
子もしくはビーズ(これらの用語は本明細書中では同義的に用いられている)、デ
ィスク、ファイバー、ニードルなどの独立した個別担体が、現在のところ好まし
い。
【００１７】 個別固体担体は、ポリスチレンのようなポリマーから形成される。一般に、固
体基材は、全体にわたり完全に緻密な、多孔性、変形可能もしくは硬質であって
もよいビーズである。ビーズの直径は、一般的には少なくとも10、20もしくは50
〜250、500、または2000μmであり、最も典型的には直径50〜250μmである。任
意の便利な組成物を粒子もしくはビーズに使用することができる。具体的には、
たとえば、セルロース、細孔ガラス、シリカゲル、ジビニルベンゼンで架橋され
たポリスチレンビーズなどのポリスチレンビーズ、ポリエチレングリコール/ポ
リスチレンなどのグラフトコポリマービーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテ
ックスビーズ、ジメチルアクリルアミドビーズ、架橋ポリスチレンのようなもし
くは線状ポリスチレンがグラフトされたフッ素化エチレンポリマーのような疎水
性ポリマーで被覆されたガラス粒子などの複合材料が挙げられる。粒子もしくは
ビーズのような独立した個別固体担体を利用する場合、それらは、一般的には、
全反応混合物の約1〜99重量パーセントを占める。
【００１８】 固体担体とは異なり、反応媒質は一般的には液体である。一般に、反応媒質は
、全反応媒質(ただし、固体担体は、粒子もしくはビーズの場合のように、反応
混合物の入っている容器から分離している)の約1〜99重量パーセントを占めるで
あろう。水性液体(水)、非水性液体(たとえば、有機溶媒)、およびそれらの組み
合わせもしくはそれらの混合物を含めて、任意の好適な液体を利用することが可
能である。液体は単相であってもまたは多相溶液であってもよい。本発明を実施
するのに使用される有機溶媒は、極性もしくは無極性、プロトン性もしくは非プ
ロトン性などであってよい。特定の溶媒もしくは溶媒混合物は、行われる特定の
反応に依存する。反応媒質に使用される好適な溶媒としては、たとえば、塩化メ
チレン、ジメチルホルムアミド、1-メチル-2-ピロリジノン、メタノール、エタ
ノール、水、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸エチル、クロロ
ホルム、アセトン、無水酢酸、ペンタン、ヘキサン、ベンゼン、四塩化炭素、ジ
エチルエーテル、アセトニトリルなどが挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。
【００１９】 反応媒質には、所望の反応を行うのに必要な試薬、たとえば、1種以上の反応
物、所要により、特定の反応に必要な触媒および／または開始剤などが含まれる
であろう。所望の特定の反応に基づいて、当業者はすべてを慣例的に決定するこ
とができる。モニター中、反応混合物は、反応の進行を引き起こすかもしくは可
能にする条件下に保持もしくは配置される。特定の反応条件は決定的なものでは
なく、所望の特定の反応に依存し、当業者によって慣例的に決定することができ
る。大気圧、高圧、もしくは減圧の下で反応を行ってもよいし、室温、高温、も
しくは低温で反応を行ってもよいし、中性、酸性、もしくは塩基性のpHで反応を
行ってもよいし、窒素やアルゴンなどの不活性シール用ガスを用いてもしくは用
いずに反応を行ってもよい。
【００２０】 任意の好適な反応を利用して、本発明によりモニターもしくは観察される固相
合成を行うことができる。たとえば、米国特許第5,565,324号を参照されたい。
好適な反応の具体例としては、ミツノブ(Mitsunobu)反応、フリーデル・クラフ
ツ(Freidel-Crafts)反応、スズキ(Suzuki)反応、メリフィールド(Merrifield)反
応(ポリペプチド合成用)(たとえば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85,2149 (
1963); Merrifield, Science 150,178 (1965)を参照されたい)、ホフマン(Hofma
nn)反応、グリニャール(Grignard)反応、カニッツアロ(Cannizarro)反応、クレ
メンゼン(Clemmensen)反応、クネベナーゲル(Knovenagel)反応、パーキン(Perki
n)反応、ウィッティヒ(Wittig)反応、ヴォルフ・キッシュナー(Wolff-Kishner)
反応、ルッフ(Ruff)反応、ライマー・ティーマン(Reimer-Tiemann)反応、キリア
ニ・フィッシャー(Kiliani-Fisher)反応、マルコニコフ(Markonikov)反応、クル
チウス(Curtius)反応、ロッセン(Lossen)反応、シェニガー(Schoniger)反応、ウ
ィリアムソン(Williamson)反応、ボガート・クック(Bogert-Cook)反応、および
ヘル・フォルハルト・ゼリンスキー(Hell-Volhard-Zellinsky)反応などが挙げら
れるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】 従って、本発明を実施するのに利用される１種もしくは複数種の反応は、本明
細書の記載に従って合成の進行をモニターすることのできるさまざまな生成物を
生産すべく選択することが可能である。そのような生成物は、一般に、非オリゴ
マー、オリゴマー、もしくはそれらの組み合わせである。
【００２２】 非オリゴマー反応生成物としては、多種多様な有機分子、たとえば、複素環化
合物、芳香族化合物、脂環式化合物、脂肪族化合物およびそれらの組み合わせが
挙げられる。これらの化合物には、ステロイド、抗生物質、酵素阻害剤、リガン
ド、ホルモン、薬物、アルカロイド、オピオイド、テルペン、ポルフィリン、毒
素、触媒、およびそれらの組み合わせが包含される。
【００２３】 オリゴマー反応生成物としては、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリ
ゴ糖、多脂質(polylipids)、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリウ
レア、ポリエーテル、およびポリ(リン誘導体)、たとえば、ホスフェート、ホス
ホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミド、ホスフィット、ホスフィンアミド
など、ポリ(硫黄誘導体)、たとえば、スルホン、スルホネート、スルフィット、
スルホンアミド、スルフェンアミドなどが挙げられる。ここで、リンおよび硫黄
誘導体については、指定のヘテロ原子は、ほとんどがC、H、N、OもしくはS、お
よびそれらの組み合わせに結合されるであろう。
【００２４】 本発明は、間接モニター法ではなく直接モニター法を提供する。本明細書に記
載の方法を用いて反応の進行を直接モニターすることによって、反応が生じたと
きにリアルタイムで有利に反応がモニターされる。したがって、反応の進行を他
の測定から推論する必要はない。また、１種もしくは複数種の反応事象と分析と
の間に介在するサンプリングステップ、ハンドリングステップ、もしくは他の処
理ステップを有している必要もない。さらに、サンプリングステップもしくは処
理ステップによって大気、圧力、温度、濃度、体積および／または攪拌が変化す
るので、反応は、「開放系」である必要もなければ、中断する必要もない。した
がって、個々の固相反応を効率的かつ効果的にモニターすることができるので、
特定のコンビナトリアル化学および合成プログラムに対して反応材料および装置
を最適化することができ、結果として、コンビナトリアル合成に必要な時間およ
び労力を削減することができる。
【００２５】 本発明は主に合成反応の進行をモニターすることに関連して、一連の反応の目
的は化合物を合成することであってもよいが、所与の反応には、固相中のコア化
合物に対する化学単位の付加、除去(たとえば、分解)、もしくは置換が含まれて
いてもよく、そのような反応のいずれについてもその進行を本発明によってモニ
ターしうることは分かるであろう。
【００２６】 本発明の方法は、先に図1に関連して説明したように単一バッチ反応をモニタ
ーするために利用することができるか、もしくはコンビナトリアル化学ライブラ
リーの合成に利用する場合のように逐次および／または同時反応をモニターする
ために利用することができる。ここで、反応生成物は、先に説明したようにオリ
ゴマーであっても非オリゴマーであってもよい。そのような手順は容易に自動化
される。また、本発明の方法を利用しつつ固相コンビナトリアルライブラリーを
生成する装置の概略を図12に示す。以下でより詳細に論じられているが、装置は
、複数の反応ウェルを収容するように構成された化学合成ロボット101を具備す
る。試薬容器102は、標準的な方法に従って化学合成ロボットに連動されている
。先に説明した減衰全反射エレメント(図13a〜13cに示されている)は、反応ウェ
ルの少なくとも1つ、好ましくは複数、さらには全部に挿入すべく化学合成ロボ
ットに連動されている。減衰全反射モニター103は、各減衰全反射エレメントに
接続されており、減衰全反射分光法により対応する反応ウェル中の固相合成反応
をモニターするように構成されている。合成コントローラー104は、試薬容器お
よび化学合成ロボットの両方に連動されている。合成コントローラーは、ハード
ウェア命令および／またはソフトウェア命令を実行することにより、複数の反応
ウェル中の固相コンビナトリアルライブラリーの構築を制御するように構成され
ている。したがって、合成ロボット、試薬容器およびコントローラーは、当技術
分野で公知であり、標準的な方法に従って装備することができる。たとえば、Ag
rafiotisらに付与された米国特許第5,463,564号を参照されたい(本明細書中に引
用されているすべての米国特許文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入
れられるものとする)。合成コントローラーは、適切なインターフェースを介し
て減衰全反射モニターに連動されており、合成コントローラーは、化学反応の完
了を検出すると、ハードウェア命令および／またはソフトウェア命令を介して、
特定の合成ステップもしくは反応を停止させ、全コンビナトリアル合成スキーム
を反応ステップの次のサイクルに進めることができる。
【００２７】 反応ウェルをロボットに組み入れることも可能であるが、典型的には、当技術
分野で知られているように、ロボットによる挿入もしくは搬送を行いうる別個の
構造体として提供される。マイクロタイタープレート、独立容器、カラム、ゲル
、テラスキー(Teraski)プレート、フラスコ、メリフィールド合成容器などを利
用することができる。典型的には96〜2,304もしくはそれ以上の反応ウェルを含
むマイクロタイタープレートのように複数の反応ウェルを含む構造体が好ましい
。支持構造体に嵌合する濾過プレートを用いて、公知の方法により、固体担体を
保持した状態で反応ウェルの液体内容物を排水することができる。
【００２８】 減衰全反射エレメントは、図12に示されているようにコンビナトリアル合成装
置中の反応ウェルとさまざまな方法で連動させることができる。そのうちのいく
らかの例を図13a〜cに示す。図13aでは、ウェル支持構造体120aは、複数の反応
ウェル121aを含む。各ウェルの底部は、減衰全反射エレメント123aで終端するプ
ローブ122aによって閉塞および密封されている。このように、プローブは、支持
構造体が脱着可能に取り付けられてそれぞれのウェルが反射エレメントによって
密封された状態になるように、ロボットステージに結合されている。逐次反応を
行うべく、各ウェルの内容物をピペットで取り出すことができる。
【００２９】 他の方式を図13bに示す。この場合にも、複数の反応ウェル121bを含む支持構
造体120bが配設されている。しかしながら、ここでは、全反射エレメント123bは
、支持構造体120bに固定的に密封可能に結合されており、一方、プローブエレメ
ント122bは、脱着可能に反射エレメントに接触している。したがって、支持構造
体全体が単に適切なステージを介してプローブエレメントに固定されているにす
ぎない。この場合にも、これらのエレメントは、合成ロボットに接続されている
。
【００３０】 さらに他の方式を図13cに示す。この場合にも、複数の反応ウェル121cを有す
る支持構造体120cが配設されている。また、それぞれ減衰全反射エレメント123c
を有する複数のプローブ122cが各反応ウェルへ挿入された状態で配置されている
。この構造体では、従来のマイクロタイタープレートが利用可能である。プロー
ブは、合成ロボットによって搬送される。合成ロボットは、担体、反応媒質もし
くは液体、および他の試薬を各ウェルに添加する前、添加中、または添加後に、
プローブが反応ウェル中に配置されるように構成することができる。
【００３１】 以上の装置を使用すると、以下のステップ、すなわち、 (a) 固体担体と、液体反応媒質と、反応試薬とを(典型的には、反応ウェル中
で)混合して反応混合物を生成するステップと、 (b) 該反応混合物に減衰全反射エレメントを接触させるステップと、次に、 (c) 該減衰全反射エレメントを介して該固体担体上の該化学反応を直接モニタ
ーすることにより、該反応の完了を検出するステップと、次に、 (d) 該反応の完了を検出した時点で該液体反応媒質および該反応試薬から該固
体担体を分離するステップと、次に、 (e) 先のステップ(d)で分離された固体担体を用いてステップ(a)〜(d)を繰り
返すステップと、 を用いて、固相化学合成によりコンビナトリアルライブラリーを作製する方法が
提供される。繰り返しステップは、所望の数の化合物がコンビナトリアルライブ
ラリーとして生成されるまで反復して行われる。この場合にも、こうして生成さ
れるライブラリーは、限定されるものではないが先に記載したようなタイプの固
相反応のいずれかを用いて、先に述べたようなオリゴマーもしくは非オリゴマー
から構成することが可能である。
【００３２】 コンビナトリアルケミストリーおよび本発明に関連して、反応の完了は、所与
のライブラリー成分もしくは一群の成分に対する生成物集団の妥当な均一性が得
られて有用なコンビナトリアルライブラリーの作製の所望の成果が得られる程度
に十分に反応が完結したときに、達成される。好ましくは、反応が平衡に達した
ときに、反応が完了する。
【００３３】 典型的には、上記のステップ(a)〜(d)の繰り返しは、異なる試薬もしくは基質
を用いて、または多様性のあるコンビナトリアルライブラリーを生成させるのに
有用な任意の他の方法を用いて行われる。たとえば、図13a〜13cに示されている
装置を用いて、上記のステップ(a)〜(d)を複数の異なる反応ウェル中で同時に行
い、次に、ステップ(e)において、この場合にも典型的には複数の異なる反応ウ
ェル中で新しいセットを開始する。ステップ(a)〜(d)は、所望のコンビナトリア
ルライブラリーを生成するのに必要な回数、典型的には2、3もしくは4回から10
、20、30もしくは40回まで、またはそれ以上の回数で、別々にまたは同時反応の
セットとして、反復して行うことが可能である。
【００３４】 利用する特定の装置にもよるが、各反応サイクルは、10、20もしくは30から40
0、600もしくは800までまたはそれ以上のウェルもしくは反応容器中で同時に行
うことが可能である。現用の形式としては、96ウェルおよび384ウェルのマイク
ロタイタープレートが挙げられるが、プレート中のすべてのウェルを使用する必
要はない。
【００３５】 ライブラリーの多様性が、固相もしくは固体状態合成の任意の手段によって、
たとえば、異なる反応ウェル中で異なる一連の合成を行うことによって、あるい
は合成サイクルの後で多数の異なる反応ウェル(一部分もしくは全部)から得られ
た固体担体をプールし、さらなる反応セットに付すべくそのプールを異なる反応
ウェルに分配し、次に、公知の方法によりそのサイクルを繰り返すことによって
、達成できることが分かるであろう。たとえば、Stillらに付与された米国特許
第5,656,324号、GeysenらのPCT出願W097/37953号を参照されたい。反応、反応条
件および反応生成物としては、先に記載のものが挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。本明細書に記載のモニターステップの適用により複数の反応
サイクル(または、反応サイクルの大部分もしくはすべて)を最適化することによ
って、少なくとも100、500、1,000もしくは5,000種の異なる化合物から10,000、
20,000、50,000、100,000、106種までの異なる化合物まで、またはそれ以上の化
合物を含有するコンビナトリアルライブラリーを、従来の方法よりも迅速に作製
することができる。コンビナトリアルライブラリーの使用目的により、ライブラ
リーは比較的大きくなったり比較的小さくなったりする可能性があるが、本発明
は、比較的小さなライブラリーおよび比較的大きなライブラリーの両方をより迅
速に作製するのに有用である。
【００３６】 コンビナトリアルライブラリーの合成プロセスは、以上に記載のものとは異な
っていてもよい。一般に、コンビナトリアルライブラリーの合成を行う場合、複
数の、より好ましくは大多数の、最も好ましくはすべての反応サイクルを、その
サイクルで行われる化学反応が完了した時点で終了させる。完了は、先に記載し
たように減衰全反射分光法により決定することができる。特定のライブラリー合
成手順では、対象の化学反応サイクル中に減衰全反射分光ステップをin situで
行って、完了を直接検出してもよい。このほか、対象の化学反応サイクルの前に
モデル反応系に対して減衰全反射分光ステップをアプリオリ(a priori)に行って
、反応を最適化し、必要な反応時間を決定してもよい。次に、コンビナトリアル
ライブラリーの合成時、反応モデル(このモデルに対する反応時間はアプリオリ
に決定されている)に基づいた反応ステップを組み入れた反応サイクルは、あら
かじめ決定された反応時間が経過した時点で終了させてもよい。特定のコンビナ
トリアル合成では、上述したin situ測定もしくはアプリオリ測定のいずれかで
またはそれらを組み合わせて完了を決定して、複数の、大多数の、もしくはすべ
ての反応サイクルを完了するまで行ってもよい。また、ライブラリー合成時間が
全体として有利に低減するかぎり、特定のコンビナトリアル合成のすべての反応
を上記の方法で最適化する必要がないことも分かるであろう。さらに、完了時間
をモデル反応からアプリオリに決定する場合、モデル反応は、コンビナトリアル
ライブラリーの合成で行われる反応と同じであってもよいし、またはコンビナト
リアル合成反応の反応時間がモデル反応から補間されるこのであれば、1つ以上
のパラメーターが異なっていてもよい。完了時間を異なる反応から補間する場合
、好ましくは、複数の異なる反応から公知の方法により補間する。
【００３７】 一般的には、コンビナトリアルライブラリーの作製と組み合わせて本発明を使
用することにより、ライブラリーを合成する時間をかなり削減することができる
。一般的には、1回の反応サイクルが平均で6、8または10時間を超えない時間で
すべての反応サイクルを完了させてよい(典型的には、1回の反応サイクルあたり
少なくとも1または2時間の平均時間が利用される)。この場合、たとえば、それ
ぞれ2、4および6時間の反応時間を有する3回の逐次反応サイクルでライブラリー
を合成する場合、1サイクルあたりの平均反応時間は4時間である。注意すべき点
として、平均時間を決定する際、サイクル間の休止時間もしくは不活性時間は計
算に入れないが、混合ステップおよび洗浄ステップを含めて、各反応のすべての
局面に対する時間は組み入れる。
【００３８】 コンビナトリアル合成では、公知の手順に準拠した任意の好適な手法により後
で解読すべく、固体担体上の化合物もしくは固体担体そのものにタグづけしても
よい。タグとしては、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチドタグおよ
びオリゴペプチドタグ（たとえば、S. BrennerおよびR. Lerner, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 89, 5381 (1992); J. Kerrら, J. Am. Chem. Soc. 115, 2529 (1
993)を参照）、非連続的タグ（たとえば、Stillに付与された米国特許第5,565,3
24号を参照）または質量に基づく符号（たとえば、GeysenらのPCT出願W097/3795
3号を参照）が含まれる。タグづけ反応は、コンビナトリアルライブラリーのメ
ンバーの合成に利用される反応と同時に同一の反応媒質中で行ってもよい。
【００３９】 以下の実施例において本発明についてさらに詳細に説明するが、これらに限定
されるものではない。
【００４０】実施例１ 固相フリーデル・クラフツ反応 一般的には、フリーデル・クラフツ反応は、求電子置換である。一般的な反応
ステップは、以下のとおりである(r. MorrisonおよびR. Boyd, Organic Chemist
ry (Allyn and Bacon, Inc., 1973))。求電子試薬は、典型的には、カルボニウ
ムイオンであり、以下のスキーム1に示されているように、酸−塩基平衡が形成
される。スキーム１ ここに記載の実施例に関連した化学を、より詳細に図2に示す。簡潔に述べる
と、例示の反応において、Biorad S-X1樹脂5.0グラムを200mLの塩化メチレンに
懸濁させ、それにN-クロロメチルフタルイミド6.85グラムを添加して攪拌する。
固体鉄0.8グラムを添加して、室温で反応液を攪拌する。
【００４１】実施例２ 固相スズキ反応 スズキカップリングには、不飽和ハロゲン化物とボロン酸もしくはエステルと
のパラジウム触媒カップリングが包含される。スズキカップリング反応は、当技
術分野で公知である。たとえば、G. Smithら, J. Org. Chem. 59, 8151 (1994)
を参照されたい。一般的なスズキカップリングを図3に示す。固相合成に適用さ
れたこのタイプの反応の例を図4に示す。簡潔に述べると、例示の反応において
、前駆体樹脂0.4グラムを6mLの塩化メチレンに懸濁させて攪拌する。これにフェ
ニルボロン酸0.24グラム、2M炭酸ナトリウム溶液0.95mL、およびテトラキス(ト
リフェニルホスフィン)パラジウム44ミリグラムを添加して還流する。
【００４２】実施例３ 固相ミツノブ反応 ミツノブ反応とは、トリフェニルホスフィンおよびアゾジカルボン酸ジエチル
の存在下におけるヒドロキシ化合物と酸(pKa≦11)との反応を指す。たとえば、M
. Varasiら, J. Org. Chem. 52, 4235 (1987)を参照されたい。このスキームは
、アルコールおよび関連化合物の官能化のために使用される。一般的なミツノブ
反応を図5に示す。特定の固相ミツノブ反応を図6に示す。簡潔に述べると、例示
の反応において、Sasrin樹脂2.16グラムを50mLのテトラヒドロフランに懸濁させ
て、窒素シール下で30分間穏やかに攪拌する。N-ヒドロキシフタルイミド1.60グ
ラムおよびトリフェニルホスフィン2.52グラムを添加し、これらの試薬が溶解す
るまで混合物を攪拌する。アゾジカルボン酸ジイソプロピル(2.0mL)を添加し、
混合物を室温で攪拌する。
【００４３】実施例４ 固相フリーデル・クラフツ反応のモニタリング 上述した図1a〜cに記載の装置により先に説明したようにフリーデル・クラフ
ツ反応のステップ1をモニターして得られたスペクトルの結果を図7に提示する。
紫外-可視データをウォーターフォールプロットおよび等高線プロットとして表
示する。時間の経過とともに吸光度が増加することに注目されたい。反応はきわ
めて迅速に終了することが判明した。さらに、反応手順を完了すべく文献で指定
された実際の洗浄回数は、ビーズを清浄化するのに真に必要とされる回数よりも
多いことを見いだした。典型的な洗浄サイクルでは15回の洗浄が必要であるとさ
れていたが、この洗浄回数まで洗浄サイクルをモニターすることによって、図8
に示されているように、より少ない洗浄回数で十分であることが明らかになった
。
【００４４】実施例５ 固相スズキ反応のモニタリング 図1a〜cに記載の装置により図4に示されるスズキカップリング反応をモニター
して得られた結果を図9に提示する。先の実施例4の場合と同様に、反応の進行中
に時間の経過とともに吸光度が増加することに注目されたい。
【００４５】実施例６ 固相ミツノブ反応のモニタリング 図1a〜cに記載の装置により上記のミツノブ反応の第1ステップをモニターして
得られた結果を図10に示す。この場合にも、反応の進行中に時間の経過とともに
吸光度が増加することに注目されたい。
【００４６】実施例７ 固相化学の直接モニタリング 図11は、本発明によりビーズ上の合成が直接モニターされることを示している
。これは、反応媒質を介して間接的に行われるものではない。この場合にも、図
1a〜cに記載の装置を利用した。「最終反応スペクトル」(中間のトレース)は、
反応中に得られるウォーターフォールトレースの典型的な例である。反応容器か
らプローブを取り出して、空気乾燥させた。サファイアプローブの先端に残留物
の薄膜が観察されたが、これはビーズであることが確認された。プローブを溶液
から取り出した後で得られたスペクトルは、乾燥に起因してわずかに変化するが
、反応スペクトルとよく一致する。(反応スキャンの場合よりも弱かったので、
実際の強度の2倍でプロットされている。)次に、プローブをKIMWIPE(商標)紙で
清浄に払拭した。払拭後のプローブのスペクトルには、スペクトル応答は観測さ
れなかった。これらのデータから分かるように、先の実施例4〜6に記載されてい
る経時にともなう吸光度の増加は、合成反応の直接モニタリングが行われたこと
を意味する。
【００４７】 以上の記載内容は、本発明を例示したものであり、これらに限定されるもので
はない。本発明は、本明細書に含まれるべき特許請求の範囲の等価物を含めて、
以下の特許請求の範囲により規定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１aは、本発明を実施するのに使用しうる装置の概略図である。 図１bは、減衰全反射エレメントへの固相合成担体ビーズの付着を示す、図1a
の装置の一部分の詳細図である。 図１cは、固体担体ビーズと減衰全反射エレメントとの光学的関係を示す、図1
bの装置の一部分の詳細図である。
【図２】 図２は、本発明を実施する際に使用しうる固相フリーデル・クラフツ・アルキ
ル化反応を示している。
【図３】 図３は、スズキ反応を示している。
【図４】 図４は、本発明を実施する際に使用しうる固相スズキ反応を示している。
【図５】 図５は、ミツノブ反応を示している。
【図６】 図６は、本発明を実施する際に使用しうる固相ミツノブ反応を示している。
【図７】 図７は、本発明のフリーデル・クラフツ反応で得られた結果を示している。こ
の図の上側の枠は、吸光度vs時間のウォーターフォールプロットであり、この図
の下側の枠は、経時に対する等高線プロットである。
【図８】 図８は、図7の反応で行われた洗浄ステップを示している。合計15回の洗浄ス
テップを利用した。この図の上側の枠は、吸光度vs洗浄回数のウォーターフォー
ルプロットである。このプロットから理解できるように、大きな初期吸光度が観
測され、洗浄が進行するにつれて吸光度0に近づく傾向がみられる。図の下側部
分は、等高線プロットである。洗浄液の内容物は、プロットの上部に示されてい
る。洗浄は右から左の方向に進行する。このプロットから理解できるように、最
初の5回の洗浄で実質量の過剰な試薬が除去される。
【図９】 図９は、本発明を用いてスズキカップリング反応で得られた結果を示している
。
【図１０】 図１０は、本発明を実施するのに用いたミツノブ反応の第1のステップに関す
る結果を示している。
【図１１】 図１１は、本発明に係るスズキカップリング反応における、反応溶液ではなく
ビーズ上すなわち固相上の化学のモニタリングを示している。
【図１２】 図１２は、本発明に係る減衰全反射モニターを利用するコンビナトリアルライ
ブラリー合成装置の概要を示している。
【図１３】 図１３aは、複数の反応ウェル中の反応をモニターするためのプローブおよび
支持構造体の配置を示している。 図１３bは、複数の反応ウェル中の反応をモニターするためのプローブおよび
支持構造体の配置を示している。 図１３cは、複数の反応ウェル中の反応をモニターするためのプローブおよび
支持構造体の配置を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アンダーソン，ジョアン，エリザベス アメリカ合衆国 27709 ノースカロライ ナ州， リサーチ トライアングル パー ク， ピーオー ボックス 13398， フ ァイブ ムアー ドライブ， グラクソ スミスクライン (72)発明者 タークジンスキー，フランク ジョセフ アメリカ合衆国 27709 ノースカロライ ナ州， リサーチ トライアングル パー ク， ピーオー ボックス 13398， フ ァイブ ムアー ドライブ， グラクソ スミスクライン (72)発明者 ウォーカー，ドゥワイト シェロッド アメリカ合衆国 27709 ノースカロライ ナ州， リサーチ トライアングル パー ク， ピーオー ボックス 13398， フ ァイブ ムアー ドライブ， グラクソ スミスクライン Ｆターム(参考） 2G054 AA02 AB10 BB20 GB01 2G059 AA01 AA10 BB04 BB08 CC12 DD13 EE01 EE02 FF04 GG10 HH02 HH03 JJ01 JJ17 PP04 4H006 AA05 AC90

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 固相化学反応をモニターする方法であって、 固体担体と液体反応媒質とを含有する反応混合物を提供するステップと、 前記反応混合物に減衰全反射エレメントを接触させるステップと、次に 前記減衰全反射エレメントを介して前記固体担体上の化学反応を直接モニター
    するステップと、 を含み、 前記モニターするステップが減衰全反射分光法によって行われる、上記方法。
  2. 【請求項２】 接触させるステップが、反応の進行を引き起こす条件下で行
    われ、 モニターするステップが、反応混合物に起因した吸光度を測定することにより
    行われ、そして 吸光度の変化が、反応の進行に明確に関連づけられる、請求項１に記載の方法
    。
  3. 【請求項３】 反応が合成反応であり、そして吸光度の増加が、反応の進行
    に明確に関連づけられる、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 反応が分解反応であり、そして吸光度の減少が、反応の進行
    に明確に関連づけられる、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 直接モニターするステップが連続的に直接モニターするステ
    ップである、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 反応がミツノブ反応である、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 反応がフリーデル・クラフツ反応である、請求項１に記載の
    方法。
  8. 【請求項８】 反応がスズキ反応である、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 固体担体が複数の個別固体担体を含む、請求項１に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】 固体担体が複数の独立した個別固体担体を含む、請求項１
    に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 固体担体がポリスチレンから形成されている、請求項１に
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】 個別固体担体が、減衰全反射エレメントに結合されている
    、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 減衰全反射エレメントが、サファイア、ガラス、石英、ゲ
    ルマニウム、セレン化亜鉛、ケイ素、ダイヤモンド、およびそれらの組み合わせ
    からなる群より選択された材料から形成されている、請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 固相コンビナトリアルライブラリーを作製する装置であっ
    て、 複数の反応ウェルを収容するように構成された化学合成ロボットと、 前記化学合成ロボットと連動している試薬容器と、 前記反応ウェルの少なくとも1つに挿入すべく前記化学合成ロボットと連動し
    ている減衰全反射エレメントと、 前記減衰全反射エレメントと連動しており、前記反応ウェル中の固相合成反応
    を減衰全反射分光法によりモニターするように構成された減衰全反射モニターと
    、 前記試薬容器および前記化学合成ロボットの両方と連動しており、前記複数の
    反応ウェル中の固相コンビナトリアルライブラリーの構築を制御するように構成
    された合成コントローラーと、 を備え、 前記合成コントローラーが前記減衰全反射モニターと連動している、上記装置
    。
  15. 【請求項１５】 合成ロボットにより搬送される支持構造体をさらに備え、
    前記支持構造体が前記複数の反応ウェルを含む、請求項１４に記載の装置。
  16. 【請求項１６】 支持構造体がマイクロタイタープレートである、請求項１
    ５に記載の装置。
  17. 【請求項１７】 固体担体が複数の個別固体担体を含む、請求項１４に記載
    の装置。
  18. 【請求項１８】 固体担体が複数の独立した個別固体担体を含む、請求項１
    ４に記載の装置。
  19. 【請求項１９】 固体担体がポリスチレンから形成されている、請求項１４
    に記載の装置。
  20. 【請求項２０】 個別固体担体が、減衰全反射エレメントに結合されている
    、請求項１４に記載の装置。
  21. 【請求項２１】 減衰全反射エレメントが、サファイア、ガラス、石英、ゲ
    ルマニウム、セレン化亜鉛、ケイ素、ダイヤモンド、およびそれらの組み合わせ
    からなる群より選択された材料から形成されている、請求項１４に記載の装置。
  22. 【請求項２２】 固相化学合成によってコンビナトリアルライブラリーを作
    製する方法であって、 (a) 固体担体と、液体反応媒質と、反応試薬とを反応ウェル中で混合して反応
    混合物を生成するステップと、 (b) 前記反応混合物に減衰全反射エレメントを接触させるステップと、次に、 (c) 前記減衰全反射エレメントを介して前記固体担体上の化学反応を直接モニ
    ターするステップと、ここで、このモニターするステップは、反応の完了を検出
    すべく減衰全反射分光法によって行われる、次に、 (d) 反応の完了を検出した時点で前記液体反応媒質および前記反応試薬から前
    記固体担体を分離するステップと、次に、 (e) 先のステップ(d)で分離された固体担体を用いてステップ(a)〜(c)を繰り
    返すステップと、 を含んでなる、上記方法。
  23. 【請求項２３】 ステップ(a)〜(e)が、複数の別個の反応ウェル中で同時に
    繰り返される、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 直接モニターするステップが連続的に直接モニターするス
    テップである、請求項２２に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 反応がミツノブ反応である、請求項２２に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 反応がフリーデル・クラフツ反応である、請求項２２に記
    載の方法。
  27. 【請求項２７】 反応がスズキ反応である、請求項２２に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 固体担体が複数の個別固体担体を含む、請求項２２に記載
    の方法。
  29. 【請求項２９】 固体担体が複数の独立した個別固体担体を含む、請求項２
    ２に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 固体担体がポリスチレンから形成されている、請求項２２
    に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 個別固体担体が、減衰全反射エレメントに結合されている
    、請求項２２に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 減衰全反射エレメントが、サファイア、ガラス、石英、ゲ
    ルマニウム、セレン化亜鉛、ケイ素、ダイヤモンド、およびそれらの組み合わせ
    からなる群より選択された材料から形成されている、請求項２２に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 それぞれ固相化学反応を含む少なくとも2回の逐次反応サ
    イクルによって、それぞれ個別固体担体上に固定された少なくとも100種の異な
    る化合物を含むコンビナトリアルライブラリーを作製する方法であって、 逐次反応サイクルのそれぞれが平均で1〜8時間となる合計時間で逐次反応サイ
    クルのすべてを完了させることが改良点に含まれる、上記方法。
  34. 【請求項３４】 複数の逐次反応サイクルが、対応する固相化学反応の完了
    した時点で終了する、請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 複数の逐次反応サイクルの完了が、減衰全反射分光法によ
    って決定される、請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 減衰全反射分光法が、 (a) 固体担体と、液体反応媒質と、反応試薬とを混合して反応混合物を生成す
    ることと、 (b) 前記反応混合物に減衰全反射エレメントを接触させることと、次に、 (c) 前記減衰全反射エレメントを介して前記固体担体上の化学反応を直接モニ
    ターすることと、ここで、このモニターするステップは、反応の完了を検出すべ
    く減衰全反射分光法によって行われる、 によって行われる、請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 減衰全反射分光法が、複数の逐次化学反応サイクルの各サ
    イクル中にin situで行われる、請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 減衰全反射分光法が、複数の化学反応サイクルの各サイク
    ルの前にモデル反応に対してアプリオリに行われる、請求項３６に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 反応サイクルのそれぞれが、少なくとも10個の別個の反応
    ウェル中で同時に繰り返される、請求項３３に記載の方法。
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