JP2003512030A - 血管形成の調節 - Google Patents

血管形成の調節

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Abstract

(57)【要約】 Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドによって仲介される血管形成を調節することができる物質であって、物質ｂｉｎｄｓｔｏＬｍｏ２および／または機能的に関連したポリペプチドに結合するか、あるいは細胞におけるＬｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドの発現を変える物質を提供する。このような物質を同定するための分析方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドが仲介する血管形成
を調節することができる物質を同定すためのアッセイに関する。本発明は、Ｌｍ
ｏ２に対する作用によって血管形成を調節することができる物質および血管形成
を特徴とする病気の治療におけるそれらの使用にも関する。
【０００２】発明の背景 血管供給の進展は、正常な組織の成長、成熟、および維持に不可欠である。血
管供給の進展は、創傷治癒および充実性腫瘍成長にも必要であり、様々な他の病
気にも関与する。現時の血管形成の概念では、細胞は、内皮細胞移動、増殖、お
よび毛細管形成を誘導する血管形成因子を分泌すると考えられる。
【０００３】 血管供給の主な発育は、胚の発生中、黄体形成中の排卵時、ならびに創傷およ
び骨折の治癒中に起きる。しかし、多くの病理学的疾患状態は、数ある病気の中
でも特に、腫瘍成長、糖尿病性網膜症、新生血管緑内障、乾癬、および関節リウ
マチを含む、血管形成増加を特徴とする。これらの経過中に、血管を裏打ちする
、通常は静止状態の内皮細胞が、血管に沿った部位から発芽し、細胞外マトリク
ッスバリヤーを劣化させ、増殖し、移動して新しい血管を形成する。これらの過
程は、血管新生化される組織によって分泌され、しばしば、血管形成因子と呼ば
れる因子によって誘導されると考えられる。血管形成因子は、間質コラーゲンを
分解し、指令された移動を遂げ（走化性)、増殖し、毛細管に再編成するように
内皮細胞に指令する過程の間に、周囲の組織から分泌される。
【０００４】 哺乳類胚（胚形成)の正常な成長過程では、胚がある一定のサイズに達した後
、成長するために、血管系の発育が不可欠である。胚形成中に、血管系は、２つ
の異なる過程で構築される。第１は、推定上の共通な前駆体である血管芽細胞が
、中胚葉から特異化され、一次毛細管ネットワークを形成する血管形成である。
成熟した血管構造は、既存の毛細管ネットワークを成熟血管に改造する、血管形
成と呼ばれる第２の過程で形成される。
【０００５】 内皮細胞特異化と血液細胞特異化との間の関係から、共通の前駆体が存在する
ことが示唆される。初期血液新生は、胚のＥ７．５日頃に、卵黄嚢血島で開始す
るが、最終的な血液新生は、大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ)領域で、Ｅ１０．５
日頃に開始する。さらに、血液細胞は、ヒトにおける背部大動脈、臍動脈および
卵黄動脈等の、大きい動脈の内皮細胞に由来する。これらの過程に関与する転写
因子は、内皮細胞および造血細胞の両者の運命の制御に重要である。白血病（Ｂ
ｏｅｈｍ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｂｏｅｈｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１)に
おいて、ＬＩＭ−ドメイン遺伝子Ｌｍｏ２は染色体の転位によって活性化され、
マウス胚形成における血液新生の開始において、不可欠な役割を有する（Ｗａｒ
ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９８)。
【０００６】 胚の血管形成の制御に関する研究は、腫瘍血管形成および腫瘍進行を調節する
ための戦術のデザインに役立つ重要な情報を提供することが可能である。
【０００７】発明の概要 マウスキメラにおいて、Ｌｍｏ２が血管系形成で果たす役割は、今まで、Ｌｍ
ｏ２−ヌルＥＳ細胞の運命によって評価されてきた。Ｌｍｏ２は、胚の内皮細胞
に発現し、血管形成は、Ｌｍｏ２の非存在下で、通常に進行することが確認され
ている。しかし、意外なことに、Ｌｍｏ２−ヌルＥＳ細胞は、およそＥ１１の後
の成熟血管の内皮細胞に貢献することはできない。以上の結果から、Ｌｍｏ２は
、最終的な血液新生の前提条件である、既存の毛細管ネットワークの成熟血管系
への血管形成改造に必要なことがわかる。
【０００８】 さらに、Ｌｍｏ２−／−腫瘍細胞は、成体の哺乳動物における腫瘍血管新生に
貢献できないことを、我々は示した。
【０００９】 従って、組織におけるＬｍｏ２活性を調節することによって、血管形成の調節
、たとえば、充実性腫瘍における血管形成の阻害あるいは創傷組織または虚血性
組織における血管形成の促進に有効な戦術を提供することが可能である。
【００１０】 従って、本発明は、Ｌｍｏ２またはそれに機能的に関連したポリペプチドの発
現および／または機能の調節を含む、哺乳動物における血管形成を調節する方法
を提供する。
【００１１】 Ｌｍｏ２が、Ｔａｌ１、Ｅ４７、ＧＡＴＡ１およびＬｂｄ１／ＮＬ１等の様々
なパートナーを含む、多重タンパク質ＤＮＡ結合複合体の形成に関与することは
周知である。従って、本発明は、Ｌｍｏ２活性の調節、またはＬｍｏ２機能に関
与するポリペプチドの調節に関する。「機能的に関連したポリペプチド」は、Ｌ
ｍｏ２の結合パートナーであることが好ましい。結合パートナーは、Ｔａｌ１で
あることが好ましい。
【００１２】 上記の通り、血管形成の調節は、そのアップレギュレーションまたはダウンレ
ギュレーションを含んでもよい。Ｌｍｏ２発現の阻害は、成体哺乳動物およびそ
れらの組織、特に腫瘍組織における血管形成を有効に阻害することが確認されて
いる。
【００１３】 好ましい一実施形態では、本発明は、ある細胞が、哺乳動物における血管形成
過程に貢献するのを阻害する方法であって、上記細胞でのＬｍｏ２の発現を阻害
することを含む方法を提供する。本発明に従えば、Ｌｍｏ２の発現を阻害するこ
とにより、細胞が血管形成に関与することまたは細胞またはその子孫が血管形成
過程に関与することにより血管形成に貢献することを阻害することができる。
【００１４】 従って、本発明を使用すると、薬品開発のための標的としてＬｍｏ２を使用す
ることができる。Ｌｍｏ２のレギュレーターは、血管形成の強力なモジュレータ
ーであり、Ｌｍｏ２調節アッセイを使用して同定することができる。
【００１５】 さらなる態様において、本発明は、Ｌｍｏ２が仲介する血管形成を調節するこ
とができる物質を同定する方法であって、Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリ
ペプチドを発現する細胞を候補物質と接触させることと、Ｌｍｏ２または機能的
に関連したポリペプチドの活性が変化するかどうかを判定することとを含む方法
を提供する。
【００１６】 好ましい一実施形態では、本発明は、血管形成を阻害することができる物質を
同定する方法であって、Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドを発現す
る細胞を候補物質と接触させることと、Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリペ
プチドの発現が阻害されるかどうかを判定することとを含む方法を提供する。
【００１７】 別の好ましい実施形態では、本発明は、血管形成を促進することができる物質
を同定する方法であって、Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドを発現
する細胞を候補物質と接触させることと、Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリ
ペプチドの発現がアップレギュレートされるかどうかを判定することとを含む方
法を提供する。
【００１８】 本発明は、血管形成を調節することができる物質を同定する方法であって、Ｌ
ｍｏ２ポリペプチドまたは機能的に関連したポリペプチドを候補物質と接触させ
ることと、上記物質がＬｍｏ２ポリペプチドまたは機能的に関連したポリペプチ
ドに結合するかどうかを判定することとを含む方法も提供する。
【００１９】 好ましい一実施形態では、本発明は、血管形成を阻害することができる物質を
同定する方法であって、Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドを発現す
る細胞を候補物質と接触させることと、上記物質がＬｍｏ２ポリペプチドまたは
機能的に関連したポリペプチドに結合するかどうかを判定することとを含む方法
を提供する。
【００２０】 別の好ましい実施形態では、発明は、血管形成を促進することができる物質を
同定する方法であって、Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドを発現す
る細胞を候補物質と接触させることと、上記物質がＬｍｏ２ポリペプチドまたは
機能的に関連したポリペプチドに結合するかどうかを判定することとを含む方法
を提供する。
【００２１】 本発明は、Ｌｍｏ２が仲介する血管形成を調節することができる物質を同定す
る方法であって、 （ｉ）Ｌｍｏ２ポリペプチドを提供することと、 （ｉｉ）Ｌｍｏ２結合パートナーを提供することと、 （ｉｉｉ）適当な条件で、候補物質の存在下および非存在下で、Ｌｍｏ２ポリ
ペプチドおよび結合パートナーをインキュベートすることと、 （ｉｖ）候補物質が、Ｌｍｏ２と結合パートナーとの間の相互作用に影響を及
ぼすかどうかを判定することと を含む方法も提供する。
【００２２】 本発明の上記方法は、上記方法で同定された物質を哺乳動物に投与することと
、血管形成が調節されるかどうか、たとえば阻害されるかまたは促進されるかを
、判定することとをさらに含むことが好ましい。
【００２３】 本明細書に提示する結果から、たとえばＬｍｏ２発現の変化またはＬｍｏ２生
物学的機能の妨害のいずれかによるＬｍｏ２機能の調節を使用して、たとえば血
管形成を阻害するかまたは刺激するように、血管形成をｉｎ ｖｉｖｏで調節で
きることがわかる。
【００２４】 従って、本発明は、Ｌｍｏ２またはその結合パートナーが仲介する血管形成を
調節することができる物質を提供する。上記調節は、血管形成の阻害または促進
であることが好ましい。
【００２５】 上記物質は、Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドの発現を変えるこ
とができるか、またはＬｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドの生物学的
機能を調節できることが好ましい。上記物質は、本発明の上記方法で同定される
ことがさらに好ましい。
【００２６】 本発明はさらに、血管形成の調節に使用するための本発明の物質を提供する。
本発明は、哺乳動物における血管形成を調節する方法であって、Ｌｍｏ２または
機能的に関連したポリペプチドの発現および／または機能の調節を含む方法も提
供する。
【００２７】発明の詳細な説明 概して、本明細書に記載の技術は当技術分野で周知であるが、特に、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ
.，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ（１９９９）４th Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ.
を参照することができる。
【００２８】 Ａ． Ｌｍｏ２および機能的に関連したタンパク質Ｌｍｏ２ 本明細書で使用するＬｍｏ２は、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ Ｌｍｏ２またはその相
同体、特に、類似した生物学的機能を有する（すなわち、血管形成を促進する）
その相同体を指す。Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ Ｌｍｏ２は、Ｒｏｙｅｒ−Ｐｏｋｏｒ
ａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）によりクローニングされており、そのアミノ酸お
よびヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、寄託番号ＮＭ００５５７４（ｖｅｒ
ｓｉｏｎ ｇｉ:５０３１８７８）で入手できる。Ｌｍｏ２は、当技術分野でＴ
ＴＧ−２、ｒｂｔｎ２およびｒｈｏｍ−２とも呼ばれる。ｒｈｏｍ−２の配列は
、Ｂｏｅｈｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１にも記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋ寄
託番号Ｍ６４３５７）。Ｆｏｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２も参照されたい
。
【００２９】 本発明で使用するのに適したＬｍｏ２アミノ酸配列は、Ｒｏｙｅｒ−Ｐｏｋｏ
ｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）に示されているＨ．ｓａｐｉｅｎｓ Ｌｍｏ２
、またはそれからのタンパク質から得られる配列に限定されず、任意の起源、た
とえば関連したウイルス／細菌のタンパク質、細胞相同体および合成ペプチド、
ならびにそれらの変異形または誘導体から得られる相同の配列も含むことが理解
されるであろう。例として、幾つかの相同なマウス配列がＧｅｎｂａｎｋデータ
ベースで確認されている（たとえば、Ｍ６４３６０およびＭ６４３５９）。従っ
て、Ｌｍｏ２は、他の哺乳動物種、たとえば、マウス、および特にウシおよびヒ
ツジ等の農業的に関連がある種から供給されてもよい。哺乳類のＬｍｏ２相同体
の間には、高度の配列同一性存在する。
【００３０】 従って、本発明は、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ Ｌｍｏ２アミノ酸配列の変異形、相
同体または誘導体、ならびにそのアミノ酸配列をコードする２５ヌクレオチド配
列の変異形、相同体または誘導体を含む。
【００３１】 本発明との関連において、相同配列は、アミノ酸レベルで、少なくとも３０、
４０または５０アミノ酸に関して、好ましくは１００または１５０アミノ酸に関
して、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ Ｌｍｏ２配列（ＮＭ＿００５５７４）と少なくとも
６０、７０、８０または９０％一致する、好ましくは少なくとも９５または９８
％一致する、アミノ酸配列を含むとみなされる。特に、相同性は、一般に、連続
した非必須配列よりむしろ血管形成の仲介に不可欠であることが判明している配
列の領域に関して検討すべきである。相同性比較目的に特に好ましい領域は、Ｌ
ＩＭドメイン（およそアミノ酸２８〜８２およびアミノ酸９２〜１４９であって
、このタイプのドメインに関して一致するのは、ＣＸ2ＣＸ15-17ＨＸ2ＣＸ2ＣＸ 2 ＣＸ15-17ＣＸ2（Ｃ／Ｄ／Ｈ）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である））のいず
れかまたは両者である。相同は、類似性（すなわち、類似した化学的性質／機能
を有するアミノ酸残基）に関して検討することもできるが、本発明との関連では
、相同を配列同一性に関して表現することが好ましい。
【００３２】 相同性比較は、視覚により、またはより一般的には、容易に入手できる配列比
較プログラムを用いて、実行することができる。これらの、市販のコンピュータ
ープログラムは、２つ以上の配列間の％相同性を算出することができる。
【００３３】 連続した配列に関する％相同性を算出することができる。すなわち、１つの配
列を他の配列と並べ、一度に１個の残基について、１つの配列内の各アミノ酸と
他の配列内の対応するアミノ酸とを直接比較する。これは、「ギャップのない」
アラインメントである。一般に、このようなギャップのないアラインメントは、
比較的短い残基数（たとえば、５０未満の連続したアミノ酸）に関してのみ実施
される。
【００３４】 これは、非常に単純で且つ堅実な方法であるが、たとえば、その他の点では一
致する配列対において、１つの挿入または欠失が以下のアミノ酸残基をアライン
メントから狂わせ、その結果、広範なアラインメントを実施するとき、潜在的に
％相同性を大幅に低下させることを考慮に入れることができない。従って、ほと
んどの配列比較方法は、総体的な相同性スコアに不当にペナルティを課すことな
く、可能な挿入および欠失を考慮に入れる最適アラインメントを作成するように
、デザインされる。これは、局所的相同性の最大化を図るために、「ギャップ」
を配列アラインメントに挿入することによって達成される。
【００３５】 しかし、こうしたより複雑な方法は、アラインメントに存在する各ギャップに
「ギャップペナルティ」を割り当て、その結果、同数の同じアミノ酸の場合、可
能な限り少ないギャップを含む配列アラインメント（比較した２つの配列間で、
より高い関連性を表す）は、多くのギャップを含む配列アラインメントより高い
スコアを達成する。ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ
における後続の各残基に小さいペナルティを課する「アフィンギャップコスト」
が、一般に使用される。これは、最もよく使用されるギャップスコアリングシス
テムである。もちろん、ギャップペナルティが高いと、ギャップが少ない最適化
されたアラインメントが作成される。ほとんどのアラインメントプログラムは、
ギャップペナルティを一部変更することが可能である。しかし、このようなソフ
トウェアを配列比較に使用するとき、デフォルト値を使用することが好ましい。
たとえば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記参照
）を使用するとき、アミノ酸配列に関するデフォルトギャップペナルティは、ギ
ャップに関しては−１２であり、各伸長に関しては−４である。
【００３６】 従って、最大％相同性の算出には、先ず第一に、ギャップペナルティを考慮に
入れて、最適アラインメントを作成することが必要である。このようなアライン
メントの実行に適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓ
ｉｎ，Ｕ.Ｓ.Ａ.；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ.，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２:３８７）である。配列比較を実施する
ことができる他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕ
ｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 前掲、Ｃｈａｐｔｅｒ １８参照）、ＦＡＳ
ＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４
０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較用ツールセットなどがあるがその
限りではない。ＢＬＡＳＴもＦＡＳＴＡも、オフライン検索およびオンライン検
索に利用できる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９前掲、７〜５８乃至
７〜６０参照）。しかし、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが
好ましい。
【００３７】 同一性に関して最終的な％相同性を測定することができるが、アラインメント
法それ自体は、一般に、全か無かの対比較に基づくものではない。そうではなく
、化学的類似性または進化距離に基づいて、スコアを各ペアワイズ比較に割り当
てる、基準化類似性スコアマトリックスが一般に使用される。一般に使用される
このようなマトリックスの１例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＢＬＡＳＴ
プログラムセット用のデフォルトマトリックス）である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎ
ｓｉｎプログラムは、一般に、公的デフォルト値か、または与えられれば、カス
タム符合比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細に関しては、ユーザーマニ
ュアルを参照）。ＧＣＧパッケージには、公的デフォルト値を使用することが好
ましく、あるいは、他のソフトウェアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２等のデフォ
ルトマトリックスを使用することが好ましい。
【００３８】 いったんソフトウェアで最適アラインメントが作成されるとその後は、％相同
性、好ましくは％配列同一性を算出することが可能である。ソフトウェアは、一
般に、これを配列比較の一部として実施し、数字による成績一覧表を作成する。
【００３９】 ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ等の以下に記載のアッセイで、全長ポリペプチ
ドを使用する必要ではなく、全長配列のフラグメントを使用してもよい。このよ
うなフラグメントは、全長配列の少なくとも２０、３０、４０または５０アミノ
酸、さらに好ましくは、少なくとも１００または１５０アミノ酸を含み、第１お
よび／または第２のＬＩＭドメイン（上記参照）を含むことが好ましい。
【００４０】 本発明のアミノ酸配列に関連した用語「変異形」または「誘導体」は、配列か
らのまたは配列への、１つ（またはそれより多い）アミノ酸の置換、変化、修飾
、交換、欠失または付加を含み、結果として得られるアミノ酸配列は、血管形成
の仲介における活性等の生物学的活性、好ましくは、野生型ヒト（Ｈ．ｓａｐｉ
ｅｎｓ）Ｌｍｏ２タンパク質と少なくとも同じ活性を有する。
【００４１】 Ｌｍｏ２配列は、本発明で使用するために修飾されてもよい。一般に、配列の
活性を維持する修飾が行われる。修飾された配列が生物学的活性を維持するとい
う条件で、たとえば、１、２または３から１０、２０または３０置換までのアミ
ノ酸置換が行われる。アミノ酸置換は、たとえば、治療用に投与されたポリペプ
チドの血漿半減期を増加させるために、非天然類似体の使用を含んでもよい。
【００４２】 たとえば下表に従って、保存的置換を行ってもよい。第２列の同じブロック内
のアミノ酸、好ましくは第３列の同じ行内のアミノ酸は、互いに置換することが
可能である。
【００４３】
【表１】
【００４４】 本発明で使用するために単離されるタンパク質は、一般に、組換え法によって
作られる。しかし、これらのタンパク質は、固相合成等の熟練者に周知の技術を
使用した合成法で作ることも可能である。あるいは、これらのタンパク質は、Ｌ
ｍｏ２タンパク質を自然に発現する細胞から精製することも可能である。
【００４５】 本発明で使用するためのタンパク質は、たとえば、抽出および精製に役立つよ
うに、融合タンパク質として産生することが可能である。融合タンパク質パート
ナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈ
ｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合ドメインおよび／または転写活性化ドメイン）およ
びｐ−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。融合タンパク質配列を除去できるよ
うに、融合タンパク質パートナーと関心のあるタンパク質配列との間にタンパク
質分解切断部位を含むことも便利であろう。融合タンパク質は、関心のある配列
のタンパク質の生物学的活性を妨害しないことが好ましい。
【００４６】 本発明のある特定の態様、たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイで使用す
るためのタンパク質は、実質的に単離された形であってもよい。このタンパク質
は、タンパク質の所期の目的を妨害しない担体または希釈剤と混合してもよいと
理解され、なおかつ実質的に単離されていると見なされる。本発明のある特定の
態様、たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイで使用するためのタンパク質は
、実質的に精製された形であってもよく、その場合、このタンパク質は、一般に
、タンパク質の９０％超、たとえば９５％、９８％または９９％が本発明のタン
パク質であるタンパク質を調製物中に含む。
【００４７】 本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、上述のＬｍｏ２ポリペプチドを
コードする核酸配列を含む。遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌ
クレオチドが同じポリペプチドをコードできることが、熟練者に理解されるであ
ろう。さらに、熟練者は、ルーチンの技術を使用して、ポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行って、
本発明のポリペプチドが発現される特定の宿主生物のコドン使用を表せることを
理解すべきである。
【００４８】 本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、ＤＮＡを含んでもよく、ＲＮＡ
を含んでもよい。このポリヌクレオチドは、一本鎖であってもよく、二本鎖であ
ってもよい。また、合成ヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを中に含む
ポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なるタ
イプの修飾が当技術分野で知られている。これらの中には、メチルホスホネート
およびホスホロチオエート主鎖、分子の３’末端および／または５’末端におけ
るアクリジンまたはポリリジン鎖の付加などが含まれる。本発明のために、本明
細書に記載のポリヌクレオチドを、当技術分野で利用できる任意の方法で修飾し
てもよいことを理解すべきである。本発明のポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ
活性の寿命を増加させるために、このような修飾を実行してもよい。
【００４９】 本発明で使用するためのヌクレオチド配列に関連した用語「変異形」、「相同
体」または「誘導体」は、配列からのまたは配列への、１つ（またはそれより多
い）核酸の置換、変化、修飾、交換、欠失または付加を含み、結果として得られ
るヌクレオチド配列は、明らかにポリペプチドをコードしないアンチセンス構築
物を除き、上記ポリペプチドをコードする。
【００５０】 上述の通り、配列相同性に関して、本明細書の配列リストに示す配列に少なく
とも７５％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも
９０％相同であることが好ましい。さらに好ましくは、少なくとも９５％、さら
に好ましくは少なくとも９８％、相同である。ヌクレオチド相同性比較を上述の
通りに実施することが可能である。好ましい配列比較用プログラムは、上述のＧ
ＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトスコ
アリングマトリックスは、同一の各ヌクレオチドに対して１０という一致値を有
し、各不一致に対して−９という値を有する。各ヌクレオチドについて、デフォ
ルトギャップ発生ペナルティは−５０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルテ
ィは−３である。
【００５１】 本発明は、本発明で使用するための、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）Ｌｍｏ２配
列、またはその変異形、断片または誘導体、あるいは上記のいずれかの相補物に
選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列も含む。ヌクレオチ
ド配列は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さ、さらに好ましくは少
なくとも２０、３０、４０または５０ヌクレオチドの長さである。
【００５２】 Ｒｏｙｅｒ−Ｐｏｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９１に記載のＬｍｏ２ヌクレ
オチド配列またはそれらの相補物に選択的にハイブリダイズすることができる、
本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、一般に、少なくとも２０、好まし
くは少なくとも２５または３０、たとえば、少なくとも４０、６０または１００
またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域に関して、本明細書に記載の対応
するヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９
０％、さらに好ましくは、少なくとも９５％または９８％相同である。本発明で
使用するための好ましいポリヌクレオチドは、ヌクレオチド８６〜２４２および
／またはヌクレオチド２８３〜４４８に、好ましくは少なくとも８０または９０
％、さらに好ましくは少なくとも９５％相同な、ヌクレオチド８６〜２４８およ
び／またはヌクレオチド２７７〜４４８に相同な領域を含む。
【００５３】 用語「選択的にハイブリダイズ可能な」は、本発明の標的ポリヌクレオチドが
バックグラウンドより有意に高いレベルでプローブにハイブリダイズすることが
確認されている条件で、そのポリヌクレオチドがプローブとして使用されること
を意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、たとえば、スクリー
ニングしようとしているｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー内に、他のポ
リヌクレオチドが存在するために生じる。この場合、バックグラウンドは、標的
ＤＮＡの場合に認められる特異的相互作用の１０倍未満、好ましくは１００倍未
満の強さである、プローブとライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーとの間の相
互作用によって生じるシグナルのレベルを意味する。相互作用の強さは、たとえ
ば、プローブ、たとえば32Ｐで、放射標識することによって、測定することが可
能である。
【００５４】 ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９
８７，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １５２，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に教示されている、
核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、以下に説明する、明確に規
定された「ストリンジェンシー」を与える。
【００５５】 最大ストリンジェンシーは、一般に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃
下）で生じ、高ストリンジェンシーは、Ｔｍより約５℃〜１０℃下で；中間スト
リンジェンシーは、Ｔｍより約１０℃〜２０℃下で、低ストリンジェンシーはＴ
ｍより約２０℃〜２５℃下で生じる。当業者により理解される通り、最大ストリ
ンジェンシーハイブリダイゼーションは、一致するポリヌクレオチド配列の同定
または検出に使用することができ、中程度（または低程度）ストリンジェンシー
ハイブリダイゼーションは、類似したまたは関連したポリヌクレオチド配列の同
定または検出に使用することができる。
【００５６】 好ましい態様では、本発明は、ストリンジェントな条件（たとえば、６５℃お
よび０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ クエ
ン酸ナトリウムｐＨ７．０）で、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズす
ることができるヌクレオチド配列を含む。
【００５７】 本発明のポリヌクレオチドが二本鎖である場合、本発明で使用するために、二
重らせんの両鎖が、個別にまたは組合せて含まれる。本ポリヌクレオチドが１本
鎖である場合、そのポリヌクレオチドの相補配列も本発明の範囲内に含まれると
理解すべきである。
【００５８】 本発明で使用される配列に１００％相同ではないが、本発明の範囲内にあるポ
リヌクレオチドは、多くの方法で得ることができる。本明細書に記載の配列の他
の変異形は、たとえば、ある範囲の個体、たとえば、異なる個体群からの個体か
ら作成したＤＮＡライブラリーを精査することによって、得ることが可能である
。さらに、他のウイルス／細菌相同体、または細胞相同体、特に、哺乳類細胞（
たとえばラット、マウス、ウシおよび霊長類細胞）に見られる細胞相同体を得る
ことができ、このような相同体およびそれらのフラグメントは、一般に、本明細
書に記載の配列リストに示す配列に選択的にハイブリダイズすることができる。
このような配列は、他の動物種から作成したｃＤＮＡライブラリーまたはゲノム
ＤＮＡライブラリーを精査し、且つ中程度のストリンジェンシーから高ストリン
ジェンシー条件で、このようなライブラリーを、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）Ｌ
ｍｏ２配列の全部または一部を含むプローブで精査することによって得ることが
できる。同様の考えが、ヒトＬｍｏ２の種相同体および対立遺伝子変異形の獲得
に当てはまる。
【００５９】 本発明の配列内に保存アミノ酸配列をコードする変異形および相同体の中の配
列を標的とするようにデザインされたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを使用し
て、変異形および菌株／種相同体を得ることができる。保存配列は、たとえば、
幾つかの変異形／相同体からのアミノ酸配列を一列に並べることによって、予測
することができる。当技術分野で周知のコンピューターソフトウェアを使用して
、配列アラインメントを実施することができる。たとえば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが、広く使用されている。
【００６０】 縮重ＰＣＲで使用されるプライマーは、１つまたは複数の縮重箇所を含み、既
知の配列に対して単一の配列プライマーを用いる配列のクローニングに使用され
るものより低いストリンジェンシー条件で使用される。
【００６１】 あるいは、このようなポリヌクレオチドは、特性決定された配列の位置指定突
然変異誘発によって得ることが可能である。これは、たとえば、このポリヌクレ
オチド配列を発現させる特定の宿主細胞に合わせてコドン選択性を最適化するた
めに、配列に対するサイレントコドン変異が必要な場合、有用であろう。制限酵
素認識部位を導入したり、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの
特性または機能を変えたりするために、その他の配列変異が望ましい場合もある
。
【００６２】結合パートナー Ｌｍｏ２は、他の細胞タンパク質と多重タンパク質複合体を形成したり、他の
細胞タンパク質と相互に作用したりする。このようなタンパク質を、本明細書で
は、「機能的に関連したタンパク質」と呼ぶ。明らかに、これらのＬｍｏ２結合
パートナーの照準および／またはＬｍｏ２とその結合パートナーとの間の相互作
用を使用して、Ｌｍｏ２仲介血管形成を調節することが可能である。
【００６３】 幾つかの結合パートナーが既に同定されている。 ＴＡＬ１は、赤芽細胞内で、Ｌｍｏ２と複合体を形成することが証明されてい
る基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）タンパク質である（Ｖ
ａｌｇｅ−Ａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｗａｄｍａｎ ｅｔ ａｌ
．，１９９４）。ＴＡＬ２およびＬＹＬ１も、ｉｎ ｖｉｖｏでＬｍｏ２と複合
体を形成することが証明されているｂＨＬＨタンパク質である（Ｗａｄｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，１９９４）。Ｌｍｏ２は、ＴＡＬ１、ＴＡＬ２およびＬＹＬ１に
結合するが、その他のｂＨＬＨタンパク質、たとえば、Ｅ４７、ＩＤ１、Ｍｙｏ
Ｄ、ＭＹＣおよびＭＡＸに結合しない。しかし、Ｌｍｏ２は、１つの多重タンパ
ク質複合体の形成に関与するように、ＴＡＬ１とＥ４７等の他のｂＨＬＨタンパ
ク質との間の組立済のヘテロダイマーに結合することができる。従って、これら
は、機能的に関連している。ＴＡＬ１、ＴＡＬ２およびＬＹＬ１のｂＨＬＨドメ
インは、互いに高度に関連しているが、他のｂＨＬＨタンパク質との関連ははる
かに低い。
【００６４】 Ｌｍｏ２の結合パートナーとして同定された他のタンパク質としては、ＬＤＢ
１などがある（Ｖａｌｇｅ−Ａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。２ハイ
ブリッドスクリーニング（下記参照）および免疫沈降試験等の、当技術分野で周
知のスクリーニング方法を使用して、さらなる結合パートナーを同定することが
可能である。
【００６５】 Ｌｍｏ２に関して上に記載した通り、結合パートナーは、それらの相同体、誘
導体およびフラグメントを含む。好ましいフラグメントは、一般に、ＴＡＬ１、
ＴＡＬ２またはＬＹＬ１のｂＨＬＨドメインを含む。
【００６６】 Ｂ． Ｌｍｏ２／結合パートナー発現または機能に影響を与えることができる物
質のアッセイ 我々の結果から、Ｌｍｏ２の血管形成における役割がわかる。上記の通り、血
管形成は、疾患経過において重要な役割を果たす。従って、充実性腫瘍等の血管
形成関連の疾患を治療または予防する１つの可能な方法は、このような治療を必
要とする患者に、Ｌｍｏ２発現をダウンレギュレートするか、または関連組織に
おけるＬｍｏ２機能に影響を与える物質の有効量を投与することであろう。この
ような物質の一例は、アンチセンスＬｍｏ２構築物またはＬｍｏ２由来ペプチド
であろう。
【００６７】 本発明は、Ｌｍｏ２ポリペプチドに結合する物質、すなわちＬｍｏ２ポリペプ
チドの結合パートナー（上記の通り、相同体、変異形、誘導体およびフラグメン
トを含む）を同定するのに適した分析方法を提供する。さらに、Ｌｍｏ２が細胞
の他の成分、たとえば、他のポリペプチドに結合するのを妨害する物質を同定す
るのに適した分析方法を提供する。このような分析方法は、一般に、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏである。予備的ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで同定される候補物質の、無傷
の細胞に対する作用を、ホールセルアッセイおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでテ
ストする分析方法も提供する。
【００６８】 Ｌｍｏ２ポリペプチドとの相互作用の結果として、Ｌｍｏ２仲介血管形成を阻
害する物質は、数通りの方法でそうすることが可能である。この阻害物質は、Ｌ
ｍｏ２に結合すること、および他の成分との相互作用の部位をマスキングまたは
変化させることによって、Ｌｍｏ２が多重タンパク質複合体の成分に結合するの
を直接中断させることが可能である。この種の候補物質は、たとえば、以下に記
載のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイで便利に予備的スクリーニングが行われ、次
いで、たとえば、以下に記載のホールセルアッセイで、試験が行われる。候補物
質の例としては、Ｌｍｏ２を認識する抗体などがある。
【００６９】 Ｌｍｏ２に直接結合することができる物質は、そのサブ細胞局在性を変えるこ
とにより、従って、Ｌｍｏ２およびその結合パートナーが細胞内で接触するのを
防止することによって、血管形成における作用を阻害することも可能である。こ
れは、たとえば、以下に記載のホールセルアッセイを使用して、テストすること
ができる。Ｌｍｏ２の非機能的相同体は、他の細胞成分への結合に関してＬｍｏ
２と競合することができるが、Ｌｍｏ２の正常な機能を果たすことができないか
、またはその細胞標的を結合したＬｍｏ２の機能を妨害するため、血管形成の阻
害についてテストすることが可能である。このような非機能的相同体は、天然の
Ｌｍｏ２突然変異形および修飾Ｌｍｏ２配列またはそのフラグメントを含んでも
よい。特に、いずれか一方または両方のＬＩＭドメインを含むが、他の機能的ド
メインが欠如しているＬｍｏ２のフラグメントを使用して、多重タンパク質複合
体の成への結合に関して全長Ｌｍｏ２と競合させることが可能である。
【００７０】 あるいは、本物質は、成分の会合を直接防止する代わりに、Ｌｍｏ２の生物学
的利用可能量を抑えることが可能である。これは、たとえば、成分の発現を、転
写、転写物安定性、翻訳または翻訳後安定性のレベルで阻害することによってで
きる。このような物質の一例は、Ｌｍｏ２ ｍＲＮＡ生合成の量を抑制するアン
チセンスＲＮＡまたは二本鎖妨害ＲＮＡ配列であろう。
【００７１】 本発明のスクリーニング方法で、他の適当な物質を同定することができる。た
とえば、テストしようとする活性を有する候補物質を、候補物質の非存在下でＬ
ｍｏ２を発現する細胞に投与することが可能である。このようなスクリーニング
方法を、ｉｎ ｖｉｖｏで、哺乳動物、たとえばマウス、ラットまたはハムスタ
ー等の無傷の多細胞動物に対して、または細胞系を使用することによって、実施
することが可能である。
【００７２】 本発明は、Ｌｍｏ２ポリペプチドに結合する物質を同定するのに適した分析方
法も提供する。このような分析方法は、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。予備
的ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで同定された候補物質の、無傷の細胞に対する作用
を、ホールセルアッセイおよび／または無傷の多細胞動物で試験する分析方法も
提供する。
【００７３】候補物質 適当な候補物質としては、Ｌｍｏ２またはその結合パートナーの様々なドメイ
ンの配列、あるいは、１つ以上の残基が置換されている、このようなペプチドの
変異形に基づく、特に、約５〜３０アミノ酸または１０〜２５アミノ酸のサイズ
のペプチドが挙げられる。ランダム配列すなわち最大限に多様化したペプチドの
パネルを提供するために、常に変化した配列を含むペプチドのパネルからのペプ
チドを使用することが可能である。他の候補物質としては、抗体などが挙げられ
る。特に、細胞内に発現された抗体、たとえば、Ｌｍｏ２またはその結合パート
ナーに結合するｓｃＦｖを、たとえば、ｓｃＦｖのライブラリーが、（ｉ）レポ
ーター構築物と、（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメインに融合したＬｍｏ２を発現する構
築物と、（ｉｉｉ）転写的活性化ドメインに融合したＴＡＬ１を発現する構築物
とを含む細胞で発現される、抗体−抗原２ハイブリッドスクリーニングを使用し
て同定することが可能である。Ｌｍｏ２／ＴＡＬ１結合を阻害する抗体は、レポ
ーター構築物から生成されるシグナル（たとえば、緑色蛍光性タンパク質、β−
ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはＣＡＴ）を減少させる。２ハイブリッ
ドスクリーニングテクノロジーは、当技術分野で周知である。
【００７４】 組合せライブラリー、ペプチドおよびペプチド擬似物、明確な化学的存在物、
オリゴヌクレオチド、および天然産物ライブラリーを、Ｌｍｏ２発現および／ま
たは機能のモジュレーターとしての活性についてスクリーニングすることが可能
である。初期スクリーニングにおいて、たとえば反応当たり１０物質というバッ
チで候補物質を使用し、阻害を示すこれらのバッチの物質を個々にテストしても
よい。次いで、以下に記載するようなｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングで活性を
示す候補物質を、インヒビターに曝露し、特に、血管形成に対する作用による、
Ｌｍｏ２機能および／または発現の調節についてテストする、以下に記載するよ
うなホールセルシステムでテストすることができる。
【００７５】Ｌｍｏ２／結合パートナー結合アッセイ Ｌｍｏ２またはその結合パートナーに結合し、ｉｎ ｖｉｖｏでのその機能、
合成、流通および／または分解を妨害するかもしれない物質を同定するための１
種のアッセイは、固体支持体上に固定されるＬｍｏ２ポリペプチドまたはその結
合パートナーを、非固定化候補物質と接触させ、Ｌｍｏ２ポリペプチドまたはそ
の結合パートナーと候補物質が互いに結合するかどうかおよび／または結合の程
度を判定することを含む。あるいは、候補物質を固定化し、Ｌｍｏ２ポリペプチ
ドまたはその結合パートナーを非固定化してもよい。
【００７６】 好ましい分析方法では、Ｌｍｏ２ポリペプチドまたはその結合パートナーをア
ガロースビーズ等のビーズ上に固定する。一般に、これは、細菌、酵母または高
等真核細胞系で、成分をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、グルタチオン−
アガロースビーズを使用して、ＧＳＴ融合タンパク質を粗細胞抽出物から精製す
ることによって行われる。対照として、Ｌｍｏ２ポリペプチドまたはその結合パ
ートナーの非存在下で、ＧＳＴ融合タンパク質ではない候補物質の、グルタチオ
ン−アガロースビーズ（および／またはＧＳＴのみの対照）への結合を、決定す
る。次いで、候補物質の、固定化Ｌｍｏ２ポリペプチドまたはその結合パートナ
ーへの結合を決定する。この種のアッセイは、当技術分野でＧＳＴプルダウンア
ッセイとして知られている。また、候補物質を固定化し、Ｌｍｏ２ポリペプチド
またはその結合パートナーを非固定化してもよい。
【００７７】 成分の１つを固定化するための多様なアフィニティ精製システム、たとえばＮ
ｉ−ＮＴＡアガロースおよびヒスチジン標識成分を使用して、この種のアッセイ
を実施することも可能である。
【００７８】 Ｌｍｏ２ポリペプチドまたはその結合パートナーの、候補物質への結合は、当
技術分野で周知の様々な方法で決定することが可能である。たとえば、非固定化
成分を、（たとえば、放射性標識、エピトープタグまたは酵素−抗体結合体で）
標識することが可能である。あるいは、結合を免疫学的検出技術で決定すること
が可能である。たとえば、反応混合物をウエスタンブロッティングし、このブロ
ットを、非固定化成分を検出する抗体で精査することができる。ＥＬＩＳＡ技術
を使用してもよい。
【００７９】 候補物質は、一般に、１〜１０００ｎｍｏｌ／ｍｌ、さらに好ましくは１〜１
００ｎｍｏｌ／ｍｌの最終濃度まで加えられる。
【００８０】 Ｌｍｏ２を含む多量体タンパク質複合体の成分を含む、Ｌｍｏ２と相互に作用
するポリペプチドは、たとえば、２−ハイブリッドスクリーニングで、同定する
ことも可能である。２−ハイブリッドシステムは、酵母で開発され（Ｃｈｉｅｎ
ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
８８，９５７８−９５８２）、レポーター遺伝子を活性化する転写因子の機能的
ｉｎ ｖｉｖｏ再構成に基づく。具体的には、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化
ドメインを有する転写因子によって制御されるプロモーターの管理下にあるレポ
ーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物を用いて、適切な宿主細胞を形質転換またはト
ランスフェクトすることと、Ｌｍｏ２の一部または全部と、転写因子のＤＮＡ結
合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの第１の融合物をコードする第１
のハイブリッドＤＮＡ配列を宿主細胞で発現させることと、第１の融合物に組み
込まれない、推定上のＬｍｏ２結合タンパク質の一部または全部と、転写因子の
ＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインとの、第２の融合物をコードする第２
のハイブリッドＤＮＡ配列のライブラリーを宿主細胞で発現させることと、宿主
細胞におけるレポーター遺伝子産物の産生を検出することによって、特定の宿主
細胞における、Ｌｍｏ２相互作用性タンパク質の、Ｌｍｏ２への結合を検出する
ことと、相互作用性タンパク質をコードする第２のハイブリッドＤＮＡ配列を、
特定の宿主細胞から単離することとによって、Ｌｍｏ２と相互に作用するタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドを単離する。現在、本アッセイで使用するの
に好ましいのは、レポーター遺伝子の発現を推進するｌｅｘＡプロモーター、１
ａｃＺレポーター遺伝子、ｌｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインおよびＧＡＬ４トラン
ス活性化ドメインを含む転写因子、および酵母宿主細胞である。
【００８１】 セクションＡに記載の通り、Ｌｍｏ２の幾つかの結合パートナーが既に同定さ
れている（すなわちＴＡＬ１、ＴＡＬ２、ＬＹＬ１およびＬＤＢ１）。これらの
既知の結合パートナーおよび／または続いて同定される結合パートナーを使用し
て、Ｌｍｏ２とその結合パートナーとの間の相互作用に影響を与える物質を同定
することが可能である。Ｌｍｏ２は、ＴＡＬ１、Ｅ４７、ＧＡＴＡ−１およびＬ
ｄｂ１／ＮＬ１を含む複合体等の、ＤＮＡ結合複合体のアセンブリにおける架橋
分子であると考えられる（Ｗａｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）ため、この
ことは、特別な生理学的意義を有する。
【００８２】 Ｌｍｏ２と他のタンパク質との相互作用を調節する化合物を同定するためのア
ッセイは、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因子によって
制御されるプロモーターの管理下にあるレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物を
用いて、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることと、Ｌｍｏ
２の一部または全部と、転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインと
の第１の融合物をコードする第１のハイブリッドＤＮＡ配列を宿主細胞で発現さ
せることと、第１の融合物に組み込まれない、Ｌｍｏ２と相互に作用するタンパ
ク質の一部または全部および転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメイ
ンをコードする、第２のハイブリッドＤＮＡ配列を宿主細胞で発現させることと
、被験化合物の存在下または非存在下で、宿主細胞におけるレポーター遺伝子産
物の産生を測定することにより、特定の宿主細胞における、相互作用性タンパク
質の、Ｌｍｏ２への結合を検出することによって、被験化合物が、Ｌｍｏ２と相
互作用性タンパク質との間の相互作用に及ぼす作用を評価することと、調節化合
物の非存在下におけるレポーター遺伝子産物の産生と比較して、レポート遺伝子
産物の産生を変える被験化合物として、調節化合物を同定することとを含んでも
よい。本アッセイで使用するのに適した立体構造の１例は、レポーター遺伝子の
発現を推進するｌｅｘＡプロモーター、ｌａｃＺレポーター遺伝子、Ｌｍｏ２に
融合したｌｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン（またはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン
）、相互作用性タンパク質に融合したＧＡＬ４トランス活性化ドメイン、および
酵母宿主細胞である。
【００８３】 Ｌｍｏ２と相互作用性タンパク質との間の相互作用を調節する化合物を同定す
るための別種のアッセイは、Ｌｍｏ２または天然のＬｍｏ２相互作用性タンパク
質を固定化することと、非固定化結合パートナーを検出可能に標識することと、
結合パートナーを一緒にインキュベートして、被験化合物が、結合される標識の
量に与える影響を決定することと（被験化合物の非存在下で結合される標識の量
に比べて、被験化合物の存在下で結合される標識が減少することは、被験化合物
が、そのタンパク質とのＬｍｏ２相互作用のインヒビターであることを示す）を
含む。逆に、被験化合物の非存在下で結合される標識の量に比べて、被験化合物
の存在下で結合が増加することは、推定上のモジュレーターが、そのタンパク質
とのＬｍｏ２相互作用のアクティベーターであることを示す。
【００８４】 Ｌｍｏ２機能用のさらなるアッセイとしては、電気泳動的易動度シフトアッセ
イ（ＥＭＳＡｓ）等のＤＮＡ結合アッセイなどがある。Ｗａｄｍａｎら（１９９
７）は、Ｌｍｏ２を含む複合体は、ＣＡＧＧＴＧを含み、およそ９塩基対下流に
ＧＡＴＡ部位が続く独特の二分ＤＮＡモチーフであるＥボックスに結合すること
を示した。Ｗａｄｍａｎら（１９９７）には、適当な方法論が記載されている。
従って、本発明は、候補物質が、Ｌｍｏ２を含む多重タンパク質複合物の、同族
認識部位を含む二本鎖ＤＮＡ分子への結合を調節するかどうかを判定することに
よって、候補物質がＬｍｏ２仲介血管形成を調節するかどうかを判定する方法を
提供する。
【００８５】ホールセルアッセイ Ｌｍｏ２またはその結合パートナーの発現および／または機能に及ぼす作用に
ついて、細胞全体で、候補物質をテストすることも可能である。候補物質は、上
述のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法で同定されていることが好ましい。あるいは、Ｌｍｏ
２／結合パートナー機能を調節することができる物質用の高速スループトスクリ
ーニングを、予備的スクリーニングとして使用し、次いで、上述のｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ結合アッセイで使用して、影響がＬｍｏ２または結合パートナーに対するも
のであることを確認することが可能である。
【００８６】 候補物質、すなわち被験化合物を、幾つかの方法で細胞に投与することが可能
である。たとえば、候補物質を、細胞培地に直接加えてもよく、細胞に注入して
もよい。あるいは、ポリペプチド候補物質の場合、細胞におけるポリペプチドの
発現を指令する核酸構築物を用いて、細胞をトランスフェクトしてもよい。ポリ
ペプチドの発現は、制御可能なプロモーターの管理下にあることが好ましい。
【００８７】 阻害をテストするのに適したホールセルは、血管内皮細胞、ＭＥＬ（赤血球系
）、２１１４（マウスＴ細胞胸腺腫）またはＫＯＰＴ１（ｔ（１１；１４）（ｐ
１３；ｑ１１）活性化Ｌｍｏ２を含むヒトＴ−ＡＬＬ細胞系）等の、Ｌｍｏ２を
発現するものである。
【００８８】 一般に、候補物質は、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法で同定しておくことが可
能であり、Ｌｍｏ２またはその結合パートナーの発現および／または機能に及ぼ
す候補物質の作用を決定するためのアッセイは、候補物質を細胞に投与すること
と、その物質がＬｍｏ２またはその結合パートナーの発現および／または機能を
、阻害または低下、あるいは増強するかどうかを判定することを含む。
【００８９】 Ｌｍｏ２／結合パートナー発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロ
ッティング等の技術を使用して、ｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベ
ルを測定することによって決定することが可能である。Ｌｍｏ２発現が、未処理
の対照細胞で認められる発現の５０％未満、好ましくは４０、３０、２０または
１０％未満に減少する場合、候補物質は、一般に、Ｌｍｏ２発現のインヒビター
であると考えられる。Ｌｍｏ２発現が、未処理の対照細胞で認められる発現の５
０％未満、好ましくは、４０、３０、２０または１０％未満まで減少する場合、
候補物質は、一般に、Ｌｍｏ２発現を増強すると考えられる。
【００９０】 以下に記載の通り、Ｌｍｏ２／結合パートナー機能は、たとえば、血管形成用
のｉｎ ｖｉｖｏアッセイで測定することが可能である。
【００９１】 使用される候補物質の濃度は、一般に、細胞内の最終濃度が、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏアッセイに関して上述したものと同様になるようにする。
【００９２】 上述のホールセルで実施されるアッセイのタイプは、無傷の多細胞動物、一般
に、囓歯類、ブタまたは非ヒト霊長類等の哺乳動物に対して実施される。しかし
、一般に、無傷の多細胞動物に対して実施されるアッセイは、セクションＣに後
述するタイプのものである。
【００９３】 Ｃ．ｉｎ ｖｉｖｏ血管形成アッセイ 特に好ましいｉｎ ｖｉｖｏテストは、組織学的に検出可能なマーカー（たと
えばｌａｃＺ）等の、検出可能マーカーに融合したＬｍｏ２ポリペプチドまたは
その結合パートナーを発現する、マウス等の哺乳動物における腫瘍血管形成に及
ぼす候補物質の作用を決定することを含む。マウスは、一般に、Ｌｍｏ２−マー
カー融合に関してトランスジェニックである。
【００９４】 幾つかの方法で、動物に腫瘍を誘導することが可能である。たとえば、発癌物
質を動物に投与して、腫瘍形成を誘導することが可能である。あるいは、ネズミ
白血病ウイルス等の発癌性ウイルスをマウスに投与してもよい。ＭＬＶは、マウ
スで胸腺腫を誘導する。胸腺腫は、本発明に関して、腫瘍血管形成を測定するの
に特に適している。
【００９５】 腫瘍を誘導するための別の技術は、腫瘍に対する遺伝子的疾病素質を有する動
物を使用することである。例として、ｐ５３−ヌルマウス、および胸腺腫および
／または特に転移する可能性が高い肺腫瘍または腎腫瘍等の上皮腫瘍が一般に発
症する、機能マウスのｐ５３ゲインが挙げられる。その他の例として、胸腺腫発
症につながる機能のｃｄ２−Ｌｍｏ２ゲイン等のＴ細胞癌遺伝子を有する動物が
挙げられる。これらの遺伝学的方法を発癌物質と一緒に使用してもよい。
【００９６】 好ましい実施形態では、適当な腫瘍成長を示した上記動物からの腫瘍組織を、
腫瘍がない１つ以上の動物、特にヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスに移植して
もよい。
【００９７】 本発明のｉｎ ｖｉｖｏアッセイでは、候補物質を動物に投与し、腫瘍血管形
成等の、血管形成に対する作用を決定する。これは、一般に、たとえば、Ｌｍｏ
２−レポーター融合ポリペプチドを発現する組織の量を測定することによって、
ある一定期間中の血管新生の量を決定する。また、たとえば、腫瘍サイズの経時
的変化を測定することによって、処置動物と未処置動物における腫瘍成長に対す
る作用を測定することが可能である。
【００９８】 ｉｎ ｖｉｖｏで血管形成を誘導するための他のアッセイモデルが幾つか開発
されている。 （ｉ）角膜嚢アッセイは、ウサギ等の大型動物の角膜における、血管形成因子
含有ポリマーペレットの外科的移植を含む。 （ｉｉ）ヒヨコ漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイは、ヒヨコ胚の切除および卵殻から
杯への移行を含む。血管形成材料をカバーガラス上で乾燥させ、漿尿膜上に置き
、新しい血管の出現を観察する。 （ｉｉｉ）ウサギ耳チャンバアッセイは、ガラスまたはプラスチックの観察装
置の外科的挿入および顕微鏡による毛細管移動の測定を要する。 （ｉｖ）ラット背気嚢アッセイは、血管形成因子が入っているステンレスチー
ルチャンバのインプラントを含む。 （ｖ）アルギネートに包まれた腫瘍細胞をマウスに皮下注入することを含む、
血管形成応答を発生するアルギネートアッセイについて記載されている。注入さ
れたゲル内のヘモグロビン蓄積を使用して、血管形成応答を定量する。
【００９９】 ＣＡＭアッセイ（Ａｕｓｐｒｕｎｋ ｅｔ ａｌ.，１９７５，Ａｒｎ. Ｊ.
Ｐａｔｈｏｌ.，７９:５９７-６１８ ａｎｄ Ｏｓｓｏｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ
.，１９８０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.，４０:２３００-２３０９）は、ヒヨコ漿
尿膜（ＣＡＭ）における血管形成を測定する。血管形成と腫瘍組織の新血管新生
の両者の測定に、ＣＡＭアッセイが使用されてきた。
【０１００】 ＣＡＭアッセイは、組織全体の新血管新生が起きており、また、実際のヒヨコ
胚血管が、ＣＡＭまたはＣＡＭ上で成長させた組織内に成長しているため、ｉｎ
ｖｉｖｏ血管形成用のアッセイモデルとして広く認められている。
【０１０１】 ＣＡＭアッセイは、血管成長の量と程度の両者に基づいて、新血管新生の阻害
を表す。さらに、ＣＡＭ上に移植された、腫瘍組織等の組織の成長をモニタリン
グすることが容易である。最終的に、本アッセイは、アッセイシステムにおける
毒性のための内部対照があるため、特に有用である。ヒヨコ胚を被験試薬に曝露
し、従って、胚の健康は、毒性の指標である。
【０１０２】 ウサギ眼で実施される角膜嚢アッセイ（Ｄ'Ａｍａｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９
９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１:４０８２−４０８５）
は、サリドマイド等の血管形成インヒビターの存在下で、血管形成と新血管新生
の両者を測定するのに使用されてきた。
【０１０３】 ウサギ眼アッセイは、角膜の縁から角膜内に成長するウサギ血管により例示さ
れる、本来透明な眼の角膜を介して新血管新生過程が容易に可視化されるため、
ｉｎ ｖｉｖｏ血管形成用のアッセイモデルとして広く認められている。さらに
、新血管新生の刺激または阻害または新血管新生の退行の程度および量の両者を
、容易に経時的にモニタリングすることができる。
【０１０４】 キメラマウスアッセイ（Ｙａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．９１:９８６−９９６）は、キメラマウス:ヒトマウスモデルにおけ
る血管形成を測定する。
【０１０５】 キメラマウスアッセイは、移植された皮膚移植片が、組織学的に正常なヒト皮
膚によく似ており、組織全体の新血管新生が起きていて、実際のヒト血管が、移
植されたヒト皮膚から、移植されたヒト皮膚の表面のヒト腫瘍組織内に成長して
いるため、ｉｎ ｖｉｖｏ血管形成に有用なアッセイモデルである。ヒト移植片
への新血管新生の起点は、ヒト特異的内皮細胞マーカーを用いた新血管系の免疫
組織化学的染色によって証明することができる。
【０１０６】 新血管成長の退行の量と程度の両者に基づいて新血管新生の退行を評価するの
に、キメラマウスアッセイを使用することが可能である。さらに、腫瘍組織等の
、移植された皮膚上に移植された組織の成長に対する作用をモニタリングするこ
とが容易である。
【０１０７】 米国特許第５，３８２，５１４号に記載のさらなるｉｎ ｖｉｖｏテストは、
宿主に注入したとき、マトリックスゲルを形成する液体マトリックス材料を提供
することと、血管形成剤を液体マトリックス材料に加えることと、血管形成剤を
含む液体マトリックス材料を宿主に注入してマトリックスゲルを形成することと
、マトリックスゲルを宿主から回収することと、回収されたマトリックスゲルの
血管形成を定量することとを含む。
【０１０８】 本発明の分析方法では、一般に、候補物質の存在下および非存在下で、米国特
許第５，３８２，５１４号に記載のｉｎ ｖｉｖｏテストを実施し、血管形成の
調節に対する候補化合物の作用、たとえば、血管形成の阻害または刺激を決定す
ることになる。
【０１０９】 Ｄ． 血管形成のモジュレーターの使用 新しい血管の成長が疾患と関連した病変の原因であるか、または一因となる場
合、血管形成の阻害によって、疾患の悪影響が減少する。例として、関節リウマ
チ、糖尿病性網膜症、炎症性疾患、再狭窄等々が挙げられる。有害な組織の成長
に新しい血管の成長が必要な場合、血管形成の阻害によって、組織への血液供給
が減少し、その結果、血液供給要求に基づく組織量の減少に役立つ。
【０１１０】 例として、腫瘍が数ミリメートル以上の厚さに成長するために、また充実性腫
瘍転移の確立のために、新血管新生が絶え間無く必要な腫瘍の成長が挙げられる
。
【０１１１】 前述の通り、血管形成は、「出芽」、血管形成、または血管拡大を含む組織の
新血管新生を含む、様々な過程を含み、血管形成過程の全てがＬｍｏ２の発現に
より仲介され、Ｌｍｏ２の発現に依存する。外傷性創傷治癒、黄体形成、月経周
期および胚形成を除き、血管形成過程の大部分は、疾患経過と関連があると考え
られる。
【０１１２】 血管形成疾患と呼ばれる、血管形成が重要と考えられる様々な疾患があり、免
疫性炎症、非免疫性炎症、慢性関節リウマチおよび乾癬等の炎症性障害、糖尿病
性網膜症、新生血管緑内障、再狭窄、アテローム硬化性プラークにおける毛細管
増殖および骨粗鬆症等の、不適当なまたは都合の悪い血管侵襲関連の障害、およ
び前新生物病変（たとえば頭部、肺または頚部）等の疾患関連の癌、充実性腫瘍
、充実性腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後方線維増殖、血管腫、カポジ肉腫およ
び腫瘍成長の維持に新血管新生を必要とする他の癌などが挙げられるが、その限
りではない。
【０１１３】 従って、罹患組織における血管形成を阻害する方法は、疾患の症状を改善し、
疾患によっては、疾患の治療に役立つ。１つの実施形態では、本発明は、組織に
おける血管形成の阻害それ自体を考える。組織における血管形成の程度、従って
本方法で達成される阻害の程度は、様々な方法で評価することができる。
【０１１４】 本明細書に記載の通り、様々な組織、または系統立てられた組織で構成される
器官のいずれも、皮膚、筋肉、腸管、結合組織、関節、骨および血管形成刺激に
際して血管が侵襲することができる他の組織を含む、疾患状態にある血管形成を
維持することができる。
【０１１５】 従って、１つの関連した実施形態では、組織は炎症組織であり、阻害すべき血
管形成は、炎症組織の新血管新生がある炎症組織血管形成である。
【０１１６】 この部類で、本方法は、慢性関節リウマチ患者等の関節炎組織、免疫性または
非免疫性の炎症組織、および乾癬組織における血管形成の阻害を考える。
【０１１７】 別の関連実施形態では、組織は、糖尿病性網膜症、黄斑変性症または新生血管
緑内障を有する患者の網膜組織であり、阻害すべき血管形成は、網膜組織の新血
管新生がある網膜組織血管形成である。
【０１１８】 さらなる関連実施形態では、血管形成を阻害すべき組織は、充実性腫瘍、転移
、皮膚癌、乳癌、血管腫または血管線維腫を有する患者の腫瘍組織であり、阻害
すべき血管形成は、腫瘍組織の新血管新生がある腫瘍組織血管形成である。本方
法で治療できる代表的な充実性腫瘍組織としては、肺、膵臓、乳房、結腸、喉頭
、卵巣等々の組織が挙げられる。
【０１１９】 新血管新生は腫瘍成長において重要な役割を果たすため、腫瘍組織血管形成の
阻害は、特に好ましい実施形態である。腫瘍組織の新血管新生がなければ、腫瘍
組織は必要な栄養を獲得せず、成長が減速し、さらなる成長が止まり、退行し、
最終的に壊死して、腫瘍が死滅する。
【０１２０】 組織における血管形成を阻害するための本方法は、血管形成が起きているか、
または血管形成が起きる危険に曝されている組織を、本発明のインヒビター、た
とえば、アンチセンスＬｍｏ２構築物か、または本発明の分析方法で同定される
インヒビターと接触させることを含む。
【０１２１】 さらなる実施形態では、たとえば、正常な治癒および再生を復活させるために
血管形成を必要とする創傷組織または虚血組織における、さらなる血管供給の誘
導を可能にするために、血管形成をＬｍｏ２仲介機構によって刺激してもよい。
【０１２２】 組織における血管形成を刺激するための本方法は、血管形成を刺激することが
望ましい組織を、本発明の刺激剤、たとえば、本発明の分析方法で同定される刺
激剤と接触させることを含む。Ｌｍｏ２タンパク質または組織におけるＬｍｏ２
の発現を指令する核酸構築物を含む組成物を投与することによって、血管形成を
刺激することも可能である。
【０１２３】 Ｅ． 投与 Ｌｍｏ２／結合パートナー発現および／または機能のインヒビター、たとえば
、本発明の分析方法で同定されるまたは同定可能な物質は、様々な成分と組合せ
て、本発明の組成物を製造できることが好ましい。本組成物を、薬学的に許容で
きる担体または希釈剤と組合せて、医用組成物（ヒト向けであっても動物向けで
あってもよい）を製造することが好ましい。適当な担体および希釈剤としては、
等張の食塩溶液、たとえばリン酸リン酸緩衝化食塩水などがある。本発明の組成
物は、直接注入によって投与することが可能である。本組成物は、非経口、筋内
、静脈内、皮下、眼内、経口または経皮的投与用に製剤化することが可能である
。
【０１２４】 一般に、各物質は、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１０
ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与すること
が可能である。
【０１２５】 アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質の第３ヘリックス
に基づくタンパク質形質導入システム等のタンパク質形質導入システムを使用し
て、抗体を含む、ポリペプチドを投与することも可能である。
【０１２６】 Ｌｍｏ２発現および／または機能を調節するのに使用するためのポリペプチド
成分（またはアンチセンス構築物）をコードするポリヌクレオチド／ベクターを
、裸の核酸構築物として直接投与してもよい。ポリヌクレオチド／ベクターは、
宿主細胞ゲノムに相同のフランキング配列をさらに含んでもよい。
【０１２７】 ポリヌクレオチド／ベクターを裸の核酸として投与するとき、投与する核酸の
量は、一般に、１μｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１００μｇ〜１ｍｇの範囲である
。
【０１２８】 哺乳類細胞による、裸の核酸構築物の取り込みは、数種の既知のトランスフェ
クション技術、たとえば、トランスフェクション剤の使用を含む技術によって増
強される。こうした薬剤の例としては、陽イオン性薬剤（たとえばリン酸カルシ
ウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン）およびリポフェクション剤（たとえば、ｌ
ｉｐｏｆｅｃｔａｍTMおよびｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍTM）などが挙げられる。一
般に、核酸構築物は、トランスフェクション剤と混合して、組成物が製造される
。
【０１２９】 本発明によるポリヌクレオチドまたはベクターを、薬学的に許容できる担体ま
たは希釈剤と組合せて、医用組成物を製造することが好ましい。適当な担体およ
び希釈剤としては、等張の食塩溶液、たとえばリン酸緩衝化食塩水などがある。
本組成物は、非経口、筋内、静脈内、皮下、経口または経皮的投与用に製剤化す
ることが可能である。
【０１３０】 本発明のモジュレーターの投与に適した個々の投与量範囲は、モジュレーター
の形態およびその力価によって異なり、血管形成が阻害されるかまたは刺激され
る、所望の効果をもたらすことができるほど十分に多い量である。投与量は、過
粘稠症候群、肺水腫、およびうっ血性心不全等の、有害な副作用を引き起こすほ
ど大量であってはならない。一般に、投与量は、患者の年齢、体調、性別および
疾患の程度によって異なり、当業者が決定することができる。何らかの合併症が
発生した場合、個々の医師が投与量を調整してもよい。
【０１３１】 有効量は、本発明のインヒビターが投与される対象である組織において、血管
形成の測定可能な調節をもたらすのに十分な、本発明のインヒビターの量である
。すなわち、血管形成調節量、血管形成の調節、たとえば、阻害または刺激は、
免疫組織化学または当技術分野で周知の他の方法によって、ｉｎ ｓｉｔｕで測
定することができる。
【０１３２】 次に、当業者が本発明を実行するのを助けるのに役立つことを意味し、決して
本発明の範囲を限定する意図がない実施例として、本発明をさらに説明する。
【０１３３】 実施例方法 相同組換え Ｌｍｏ２−ｌａｃＺターゲティングベクターの構築を図２に示す。鎖状化ベク
ターＤＮＡ ２５μｇを、エレクトロポレーションによるＣＣＢ ＥＳ細胞への
トランスフェクションに使用した。耐性の選択は、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８
（Ｇｉｂｃｏ）または３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ）を含む培地中での細胞成長によって行った。標的クローンは、ＥＳ細胞
ＤＮＡをターゲティング領域の両側からのフランキングプローブと（標準フィル
ターハイブリダイゼーション（ＬｅＦｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９８６）によ
り）逐次的にハイブリダイズさせ（図２説明を参照）、内部プローブを含むター
ゲティング断片の挿入物１個が存在することを確認することによって確認された
。
【０１３４】 キメラマウスの製造および生殖細胞系伝達 ＥＳ細胞をＣ５７／ＢＬ６胚盤胞に微量注入し、ＣＢＡ／Ｃ５７／ＢＬ６レシピ
エントに移入した。胚の研究に関して、注入日をＥ２．５として表す。テールＤ
ＮＡを用いたサザンフィルターハイブリダイゼーションで、標的対立遺伝子の生
殖細胞系伝達を確認した。ヘテロ接合＋／−キャリヤーマウスのインターブリー
ディングおよび結果として得られた胚の試験で、ホモ接合Ｌｍｏ２ヌル−／−胚
の胚性致死表現型のＫＺ２６生殖細胞系伝達対立遺伝子が確認された。このこと
から、ＫＺ２６ Ｌｍｏ２−ｌａｃＺヌル突然変異は、前述のＬｍｏ２突然変異
（Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）と同じ挙動を示すことが分かった。
【０１３５】 ホールマウントＸ−ｇａｌ染色 各ステージの胚を子宮から切除し、母親の脱落膜組織を除去した。Ａｌｌｅｎ
ｅｔ ａｌ．，１９８８に記載の手順に従って、全胚を、β−ガラクトシダー
ゼ活性（Ｌｍｏ２−ｌａｃＺ遺伝子発現により生じる）のＸ−ｇａｌ染色につい
て検査した。組織学的研究用に、胚を、Ｘ−ｇａｌ染色後、１０％緩衝化ホルマ
リンで固定し、パラフィンに包埋した。薄切をスライドグラスに載せ、エオシン
で対比染色した。
【０１３６】 腫瘍成長 Ｌｍｏ２＋／−；ｐ５３−／−マウス内で交配させ、続いて互いに交配させて
、Ｌｍｏ２＋／−；ｐ５３−／−マウス遺伝子型を有する実験群マウスを得た。
【０１３７】 ルイス肺癌腫（ＬＬＣ）細胞を、１０％ウシ胎仔血清を加えたＤＭＥＭ培地で
培養し、トリプシン処理し、２．５×１０5細胞／１００μｌの濃度で、ＰＢＳ
中に再懸濁した。細胞懸濁液１００μ１を、Ｃ５７Ｂ１６ Ｌｍｏ２＋／−ヘテ
ロ接合マウスの背部近位正中線に皮下に注入した。発生した腫瘍は、概して、３
日に初めて認められ、１４日に最大腫瘍サイズ１．７ｃｍに達した。
【０１３８】 ヌードマウスに移植されたＥＳ細胞から奇形癌腫が生じた。トリプシン処理前
に、ＥＳ細胞を、ＬＩＦの存在下、ネオマイシン耐性フィーダーで増殖させた。
洗浄した細胞を、２×１０6細胞／１００μｌの濃度で、ＰＢＳ中に再懸濁した
。細胞懸濁液１００μｌを、ＭＦＩ成体メスヌードマウスの両側腹に皮下注入し
た。Ｌｍｏ２＋／−およびＬｍｏ２−／−ＥＳ細胞のそれぞれに、マウス５０匹
のコホートを使用した。腫瘍を４日毎にダイアルカリパスで測定し、式、幅2×
長さ×０．５２を使用して、体積を決定した。
【０１３９】実施例１ マウスにおけるＬｍｏ２遺伝子のヌル突然変異は、卵黄嚢赤血球新生が欠如し
ているため、結果的に、胚ステージＥ９〜１０頃に胚性致死表現型に終わる。し
かし、Ｌｍｏ２は、発育赤血球で発現するほかにも、様々な他の位置で発現し、
成体の造血システムの発達においても重要である。この突然変異は致死性である
ため、これらの発現部位におけるＬｍｏ２機能の重要性を、ホモ接合Ｌｍｏ２ヌ
ルマウスで評価することはできない。Ｅ１０後に、Ｌｍｏ２の潜在的役割を評価
するための補助として、我々は、相同組換えにより、ＥＳ細胞内のＬｍｏ２遺伝
子にｌａｃＺ遺伝子を導入した。図２Ａは、Ｌｍｏ２のエキソン２にｌａｃＺが
組み込まれた、Ｌｍｏ２−ｌａｃＺ融合遺伝子の構造を示す。Ｌｍｏ２対立遺伝
子１個のｌａｃＺ遺伝子ノックインによってＥＳクローンを選択し（図２Ａ、Ｋ
Ｚ２６＋／−ＥＳ細胞）、Ｌｍｏ２−ハイグロマイシンベクターでこのクローン
を再トランスフェクトし、第２の標的Ｌｍｏ２対立遺伝子を有するＥＳ細胞を作
った（ＫＺ２６−／−；３種の独立したクローンを研究した、クローン１、１６
および６４）。ＥＳ細胞を胚盤胞に注入し、胚が発生した後、これらのＥＳ細胞
内のＬｍｏ２遺伝子またはそれらの誘導物によって、β−ガラクトシダーゼの発
現を、ｉｎ ｖｉｖｏで調節する。さらに、標的対立遺伝子の生殖細胞系伝達を
得るためにＬｍｏ２＋／−ＥＳ細胞（ＫＺ２６）を使用して、ＫＺ２６ヘテロ接
合マウスを得た。
【０１４０】 我々は、β−ガラクトシダーゼを使用して、発生中の胚におけるＬｍｏ２発現
ＥＳ細胞の運命を追跡した。最初に、我々は、ＫＺ２６ヘテロ接合マウスを使用
して、Ｅ８．５〜Ｅ１４のβ−ガラクトシダーゼ発現パターンを研究した。これ
らの胚ステージの間に、主として、全身血管系の内皮細胞内に、Ｘ−ｇａｌ染色
が認められた。Ｅ１１．５から、間充織組織と呼ばれる発育帯域である肢芽の外
胚葉性頂堤の真下に、Ｘ−ｇａｌ染色が認められた。これは、血管部位であり、
出芽性血管形成の領域である。さらなる部位は、尾芽および海馬である（図３Ａ
および３Ｂは、それぞれ、Ｅ１０．５およびＥ１２．５ Ｌｍｏ２＋／−胚を示
す。肢芽におけるβ−ガラクトシダーゼの発現を、組織学的薄切で見ることがで
きる、図３Ｄ；血管内皮のＸ−ｇａｌ染色を、組織薄切に示す（図３Ｃ））。こ
れらのβ−ガラクトシダーゼ発現データは、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダ
イゼーションで確認されたＬｍｏ２発現パターンと一致し、内皮細胞におけるβ
−ガラクトシダーゼの発現も、胚形成におけるＬｍｏ２プロモーター活性を事実
通りに反映することがわかる。
【０１４１】 Ｌｍｏ２−ｌａｃＺ融合遺伝子を含むＥＳ細胞の運命を追跡し、ホモ接合ヌル
突然変異の結果を研究する方法として、我々は、胚盤胞へのＫＺ２６＋／−およ
び−／−ＥＳ細胞注入によって誘導されたキメラ胚のβ−ガラクトシダーゼ染色
パターンを比較した（図４）。この研究から、多数の結果が明らかになった。Ｅ
９．５では、＋／−と−／−キメラマウスとの間に明白な差はなかった（データ
示さず）が、ＫＺ２６＋／−または−／−注入のいずれかで、比較可能なサイズ
のＥ１１．５胚がＸ−ｇａｌで染色されたとき（それぞれ、図４ＡおよびＢ）、
内皮細胞染色に関して、β−ガラクトシダーゼパターンは、著しく異なっていた
。ＫＺ２６＋／−Ｅ１１．５キメラ胚は、ヘテロ接合胚の染色パターンとよく似
た染色パターンを示す（図３）。これに反して、Ｅ１１．５−／−キメラ胚は、
ＥＳ由来細胞の血管系への寄与をほとんど示さなかった（図３Ｂ）が、肢芽およ
び海馬へのＥＳ細胞寄与は維持された。末梢の散在性内皮細胞がＸｇａｌ染色で
確認されたが、Ｌｍｏ２−／−ＥＳ細胞の主要血管内皮細胞への寄与はなかった
。Ｅ１２．５におけるＫＺ２６＋／−および−／−胚の試験によって、この観察
結果の一貫性が証明された。図４Ｃは、内皮細胞の広範な染色パターンおよび、
肢芽および海馬の染色を示す、ＫＺ２６＋／−キメラ胚を示す。対照的に、クロ
ーン１（３Ｄ）、クローン１６（３Ｅ）またはクローン６４（３Ｆ）からのＥ１
２．５ ＫＺ２６−／−胚は、内皮細胞染色を示さなかったが、それぞれ、比較
可能な肢芽、テールおよび海馬染色を示した。この、Ｅ１２．５内皮細胞染色の
欠如は、Ｅ１１．５キメラ胚と一致する（図４Ｂ）。
【０１４２】 血管内皮の改造は、マウスでは、Ｅ１０．５頃に開始する。この極めて重大な
ステージにおける、ヌルＬｍｏ２突然変異の作用を研究した。ＫＺ２６−／−ク
ローン１を胚盤胞に注入することにより、Ｅ１０．５に、同腹子から胚を得て、
Ｘ−ｇａｌでホールマウント染色した。７つの胚を、それらの染色パターン（図
５、パネルＢ〜Ｈ）で、Ｅ１０．５ ＫＺ２６＋／−キメラ（図５、パネルＡ）
と比較した。−／−キメラでは、著明なサイズ変動があり、内皮細胞へのＥＳ細
胞寄与の程度（Ｘ−ｇａｌ染色で判断）と反比例していた。強いＸ−ｇａｌ染色
を示す（すなわち、Ｌｍｏ２−／−ＥＳ由来細胞の寄与が高い）マウスは、同じ
同腹子で寄与が低いものより小さかった（図５）。正常サイズのＬｍｏ２−／−
胚には、染色された内皮細胞が本質的になかったが、肢芽およびテール染色は存
続している。これらの、強いＸ−ｇａｌ染色を示す小さいマウスでは、十分に系
統立てられた血管系がなく（図５、パネルＪ、Ｋ）、−／−ＥＳ細胞のキメラ現
象が高いとき、Ｌｍｏ２がないため内皮改造ができず、これらの胚は結果的に死
滅する定めにあることが示唆される（下記参照、表２）。キメラ現象が胚におけ
る比較的低い場合、改造過程で、胚盤胞由来細胞がＥＳ由来細胞に取って代わる
ことができるため、胚は生き残る。
【０１４３】 これらのデータから、Ｌｍｏ２−ヌルＥＳ細胞は、およそＥ１０．５〜Ｅ１１
．５の後に、内皮細胞に選択的に寄与できないことがわかる。ＫＺ２６−／−ク
ローンを胚盤胞に注入することによって作られた同腹子からの多数の胚を分析す
ることによって、これらの観察結果の一貫性が確認された。これらのデータを、
表２にまとめる。ヘテロ接合ＥＳ細胞ＫＺ２６を用いて作られたキメラ胚は、Ｅ
９．５〜Ｅ１２．５の全ステージで一様に生存した（表２）が、ＫＺ２６−／−
キメラの生存率は、Ｅ９．５で１００％であったにすぎない。その後、生存能力
は次第に低下し、付随して、ｌａｃＺ−陽性キメラの比率が低下した。一斉に、
１８８の−／−キメラ胚を分析すると、Ｅ１０．５とＥ１１．５との間に、生存
率およびＸ−ｇａｌ陽性比に大きいギャップが存在した。＋／−キメラマウスに
は、このような関係はなかった。胚におけるＬｍｏ２−／−ＥＳ細胞誘導体の比
率が高い場合、成熟した血管系を形成することができないため、内皮の改造およ
び生存は起こらない。Ｌｍｏ２−／−内皮細胞は、Ｅ１０．５より後に、選択的
にプログラム死する可能性がある。
【０１４４】 およそＥ１０．５〜Ｅ１ｌ．５より後に、Ｌｍｏ２−ヌルＥＳ細胞は、血管内
皮細胞に選択的に寄与できないことが、我々のデータからわかる。従って、血管
形成の初期過程は、Ｌｍｏ２を必要としないと考えられるが、マウス発生中の血
管形成にはＬｍｏ２が必要である。以前の試験で、Ｌｍｏ２は、最終的な血液新
生の開始に必要なことが明らかにされた。これらのデータを合わせると、Ｌｍｏ
２の少なくとも２種の異なる機能、すなわち、血管形成および造血の両者におけ
る機能を考えなければならないことが示唆される。Ｔａｌ１／Ｓｃｌ遺伝子が、
卵黄嚢血管形成、初期造血および最終的造血において類似した役割を有すること
は、かなり興味深い。こうした、Ｌｍｏ２の作用とＴａｌ１の作用の類似点は、
Ｔａｌ１が、Ｅ４７と一緒にＤＮＡ結合性エレメントを形成し、Ｌｍｏ２が、そ
のＬＩＭドメインを介して、タンパク質−タンパク質架橋分子の役割を果たす、
これらの２種のタンパク質の間の相互作用に起因すると考えられる。異なる発生
学的機能におけるＬｍｏ２−Ｔａｌ１一致に対するもっともらしい説明は、Ｌｍ
ｏ２分子が、異なる組のタンパク質を、異なる発生上の細胞型のＴａｌ１−Ｅ４
７と結び付けるということあでる。これによって、機能の（たとえば造血および
血管形成における）異なる部位で異なるタンパク質複合体が作られるが、それで
も、共通して、Ｌｍｏ２およびＴａｌ１タンパク質を有する。こうした推定上の
複合体の組成の変異は、これらの異なる複合体の標的遺伝子（正にまたは負に制
御された）と同様、研究に値する。さらに、数種のチロシンキナーゼ型細胞表面
受容体が内皮細胞上で特異的に発現され、それらは、脈管形成または血管形成の
いずれかにおいて重要な役割を有する。
【０１４５】実施例２ 実施例１の結果から、マウス発生における血管内皮の改造にはＬｍｏ２が必要
なことがわかる。この結論は、成体の血管形成もＬｍｏ２に依存するということ
である。腫瘍成長は、血液供給の拡張による酸素化に左右される（Ｈａｎａｈａ
ｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６） Ｃｅｌｌ ８６:３５３）ため、血管形成に
Ｌｍｏ２が必要なことは、タンパク質は腫瘍新血管形成において不可欠な因子で
あるという意味を含む。Ｌｍｏ２ヌルＥＳ細胞を使用して、またＬｍｏ２＋／−
マウスを使用して、この可能性を試験した。
【０１４６】 我々は、ヘテロ接合Ｌｍｏ２マウス（Ｌｍｏ２＋／−）を用いて、血管内皮内
のβ−ガラクトシダーゼにより、Ｌｍｏ２発現を研究した。唾液腺等の高い内因
性β−ガラクトシダーゼ活性を有する組織を除き、Ｘ−ｇａｌ染色により、Ｌｍ
ｏ２発現をｉｎ ｓｉｔｕで確認した。１２週齢のＬｍｏ２＋／−マウスおよび
野生型の一腹子から、胸腺、脳、肝臓および腎臓を切除し、切片をホールマウン
トＸ−ｇａｌ染色に使用した。野生型マウスのこれらの器官の内皮細胞で無視で
きる内因性β−ガラクトシダーゼ活性が確認され、Ｌｍｏ２＋／−マウスにおけ
る青色染色は、Ｌｍｏ２遺伝子発現に起因するとされた。Ｌｍｏ２＋／−マウス
で、低レベルの血管系染色が確認された。図６は、脳血管（図６Ａ）、腎皮質の
糸球体および髄質の血管（図６Ｂ）および肝血管系（図６Ｃ）におけるβ−ガラ
クトシダーゼの発現および局在化を示す。
【０１４７】実施例３ 正常な組織内皮および腫瘍内皮におけるβ−ガラクトシダーゼレベルの比較に
よって、後者におけるＬｍｏ２発現の著明なアップレギュレーションが明らかに
された。１２週齢のＬｍｏ２＋／−マウスまたは野生型対照の皮下に移植したル
イス肺癌腫（ＬＬＣ）細胞で発生させた充実性腫瘍で、腫瘍血管におけるＬｍｏ
２発現について研究した。ホールマウントＸ−ｇａｌ染色用に、移植の２週間後
に腫瘍を切除した。Ｌｍｏ２＋／−マウスのＬＬＣ腫瘍血管のみで、強いβ−ガ
ラクトシダーゼ活性が見られた（図６Ｄ；野生型マウスの腫瘍で、活性は認めら
れなかった）。第２に、Ｌｍｏ２ヘテロ接合マウスを、腫瘍易罹患性ｐ５３ノッ
クアウトマウス（ｐ５３−／−；Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．，（１９９８））
と交配させて、Ｌｍｏ２制御β−ガラクトシダーゼ発現を示す自発性腫瘍を得た
（しばしば胸腺腫）。この結果として、腫瘍血管系のＬｍｏ２発現は著しく増加
した。１例（図６ＥおよびＦに示す）は、出血性リンパ腫ホールマウント（図６
Ｅ）および組織学的薄切の特異的内皮染色（図６Ｆ）において、腫瘍血管系で高
レベルのｌａｃＺ活性を示す、Ｌｍｏ２＋／−；ｐ５３−／−マウスの腹部Ｔ細
胞リンパ腫である。このリンパ腫様塊における悪性Ｔ細胞は、β−ガラクトシダ
ーゼを発現していないことに注目されたい（図６Ｆ）。
【０１４８】 ２つの自発性胸腺腫発生モデルを使用して、胸腺腫進行中のＬｍｏ２発現の変
化について研究した。上記の遺伝子型Ｌｍｏ２＋／−；ｐ５３−／−を作るため
にマウスを繁殖させ、胸腺におけるＬｍｏ２発現を指定し、リンパ腫を伴うクロ
ーンＴ細胞白血病を引き起こす（Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）；
Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）；Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（
１９９６））、Ｌｍｏ２導入遺伝子（ＣＤ２−ｒｂｔｎ２:Ｆｉｓｃｈ ｅｔ
ａｌ．，１９９２）と組合せたヘテロ接合Ｌｍｏ２を有する第２の系のマウスを
作った。両セットのマウスで、長い潜伏期を伴う胸腺腫が発生した（Ｌｍｏ２＋
／−；ｐ５３−／−マウスで計９例およびＣＤ２−ｒｂｔｎ２導入遺伝子を有す
るＬｍｏ２＋／−の２例）。病気−健康の兆候が、十分なサイズのリンパ腫様沈
着物を示したとき、マウスを屠殺して胸腺腫をホールマウント染色に付した。こ
れらを、１２週齢のＬｍｏ２＋／−マウスからの正常な胸腺染色と比較した。肉
眼で試験したとき、Ｌｍｏ２＋／−胸腺の血管で若干の染色が認められ（図７Ａ
）、この弱い染色は、内皮細胞内に存在することが組織学的に示された（図７Ｄ
）。Ｌｍｏ２＋／−；ｐ５３−／−およびＬｍｏ２＋／−；ＣＤ２−ｒｂｔｎ２
胸腺腫の両者における血管染色は、肉眼レベル（それぞれ、図７ＢおよびＣ）で
はるかに著明であり、血管密度の上昇を伴う。Ｌｍｏ２発現のレベル増大は、内
皮細胞ｌａｃＺ発現の組織学的検査で確認される（図７ＥおよびＦ）。
【０１４９】 以上のデータは、腫瘍新血管新生の過程でＬｍｏ２転写が活性化されることを
示唆し、充実性腫瘍成長において必要な血管形成過程における役割を意味する。
免疫不全ヌードマウスに皮下移植された後、ＥＳ細胞が奇形癌腫を引き起こす、
充実性腫瘍発生モデルを使用して、Ｌｍｏ２に関する後者の機能をさらに分析し
た。Ｌｍｏ２＋／−またはＬｍｏ２−／−ＥＳ細胞のいずれかを、ヌードマウス
のコホートの両側腹に皮下移植することによって奇形癌腫を作り、ホールマウン
トＸ−ｇａｌ染色のために、移植の２、３、３．５、４および８週後に、腫瘍を
切除した（表２に、分析した腫瘍数を示す）。進行中の腫瘍への血液供給は、ヌ
ードマウス血管系を通して提供することができるため、Ｌｍｏ２＋／−腫瘍とＬ
ｍｏ２−／−腫瘍との間で、腫瘍成長速度に有意差は認められなかった。約２週
間後、ＥＳ細胞起源の内皮細胞内のＬｍｏ２−ｌａｃＺ融合タンパク質のため、
内在性のＥＳ細胞由来の管系が発生しはじめ、宿主（ヌードマウス）血管と識別
することが可能である。早期腫瘍（移植の３週後より前）の表面上のほとんどの
腫瘍血管は、Ｘ−ｇａｌ染色陰性であった。移植の２週間後、Ｌｍｏ２＋／−（
図８Ａ）およびＬｍｏ２−／−腫瘍（図、８Ｂ）のいずれにも、明白なＥＳ細胞
由来の血管樹発生の兆候はなかった。しかし、推定上の血管芽細胞（出芽性内皮
の前駆体）であるｌａｃＺ陽性細胞のクラスター（図８Ａおよび８Ｂにおける青
色）が、両セットの腫瘍に存在していた。移植の３週後頃に、Ｌｍｏ２＋／−腫
瘍におけるｌａｃＺ陽性細胞クラスターから、出芽性新血管系を示す血管樹が発
生する（図８Ｃ）が、Ｌｍｏ２−／−腫瘍では、血管樹発生の兆候はなかった（
図８Ｄ）。Ｌｍｏ２＋／腫瘍に出現した血管樹は、３．５週（図８Ｅ）および４
週（図８Ｇ）に、より成熟した血管系を腫瘍内に形成するまで、成長を続けた。
しかし、３．５週（図８Ｆ）または４週（図８Ｈ）のＬｍｏ２−／−腫瘍には、
２週に見られたｌａｃＺ陽性細胞のクラスター以外の、ＥＳ由来の血管樹発生は
、依然としてなかった（表２参照）。しかし、Ｌｍｏ２＋／−腫瘍とＬｍｏ２−
／−腫瘍との間の、血管発生の差は、移植の８週後にあまり明白ではなくなった
（データ示さず）が、これは、この進行したステージに、ヌードマウスとＥＳ細
胞油体由来の血管系とが融合してキメラ血管を形成したためであろう。以上のデ
ータから、マウス胚血管形成でみられる、腫瘍成長における中胚葉成分からの内
皮前駆体（血管芽細胞）の新規特異化にも、既存の血管系の維持にも、Ｌｍｏ２
は必要ではないことがわかる（Ｌｍｏ２−ヌル内皮細胞の選択的アポトーシスの
兆候がなかったため）。しかし、Ｌｍｏ２は、血管形成の出芽ステップで必須で
あることが、データからわかる。
【０１５０】 テトラサイクリン誘導性Ｌｍｏ２システムを使用して構築したＬｍｏ２−／−
マウスで、血管形成におけるＬｍｏ２の本質的性質を確認した。Ｔｅｔ誘導性Ｌ
ｍｏ２／＋マウスを、上記Ｌｍｏ２＋／−マウスと交配し、子をテトラサイクリ
ン投与でレスキューした。Ｔｅｔ誘導性Ｌｍｏ２／−マウスを同定し、成熟時に
テトラサイクリンを退薬することにより、Ｌｍｏ２−／−に転換させた。対照Ｌ
ｍｏ２ ＋マウスにおけるＭＬＶ感染は、１００５例で、胸腺腫の発生につなが
る。しかし、Ｌｍｏ２−/−マウスで、胸腺腫発生は認められなかった。
【０１５１】 Ｌｍｏ２は、特異的染色体の転位によって活性化されるＴ細胞癌遺伝子として
同定された（Ｒａｂｂｉｔｔｓ ｅｔ ａｌ，１９９８）。本遺伝子は、血管形
成（内皮細胞改造）に本遺伝子を必要とするマウス胚の内皮細胞で正常に発現さ
れる。最新のデータは、成体マウス組織におけるＬｍｏ２発現および腫瘍新血管
系での発現レベルの増大を示す。さらに、Ｌｍｏ２の非存在下で、充実性腫瘍に
おける成熟した血管系の発生が防止される。新血管新生は、癌および糖尿病性網
膜症等の、多くのヒト疾患の進行における極めて重大なステップであり、従って
、この過程を制御すれば、これらの進行性疾患を管理することができるであろう
。血管形成に重要な成長因子およびそれらの細胞表面受容体（たとえば、血管内
皮成長因子、アンギオポエチン、線維芽細胞成長因子およびそれらの細胞表面受
容体）ならびにそれらの臨床応用について広範に研究されているが、血管形成の
転写調節の分子メカニズは不確かなままである。特に、Ｌｍｏ２は新血管新生に
おいて明確な役割を有するが、既存の内皮細胞はこのタンパク質を必要としない
と思われるため、腫瘍新血管新生の核レギュレーターであるＬＩＭオンリータン
パク質Ｌｍｏ２に関する我々の研究は、癌治療に重要な治療的応用を強調する。
Ｌｍｏ２のＬＩＭ−ドメインタンパク質−タンパク質相互作用を修飾することに
より、我々は、新血管新生の非常に重要な特異的なステップを管理することがで
きるかも知れない。最後に、新血管新生の転写機構を阻害することによって、血
管形成関連の下流遺伝子を同時に制御することができるはずであり、これは、新
血管新生を制御し、且つ結局は腫瘍成長および転移を管理するためのさらに強力
な方法かもしれない。
【０１５２】
【表２】
【０１５３】 ＥＳ細胞の胚盤胞に、（Ａ）Ｌｍｏ２の１つの対立遺伝子へのｌａｃＺのノッ
クイン（ＫＺ２６＋／−）または（Ｂ）Ｌｍｏ２の１つの対立遺伝子（ＫＺ２６
＋／−）へのｌａｃＺのノックインおよびハイグロマイシンの挿入による第２の
対立遺伝子のノックアウト（ＫＺ２６＋−／−）を注入することにより、キメラ
マウスを作った。これらの胚盤胞をレシピエントに移植し、指定された胚の時点
に、子宮嚢を数え、胚を切除し、β−ガラクトシダーゼ活性についてＸｇａｌで
染色した。データを、子宮嚢総数（印のある変性した胚は含めなかった）当たり
の生きている胚（Ａ／Ｂ）の％および％β−ガラクトシダーゼ陽性胚（Ｃ／Ｂ）
として表す。ＫＺ２６−／−ＥＳクローンの場合、各クローンについて試験した
胚の数を示す（注:Ｅ９．５、Ｅ１１．５またはＥ１４．５に、クローン６４胚
は試験しなかった）。
【０１５４】 表３：奇形癌腫進行中のＥＳ由来の出芽性血管形成
【表３】
【０１５５】 Ｌｍｏ２＋／−またはＬｍｏ２−／−ＥＳ細胞をヌードマウスに皮下注入する
ことにより、ＥＳ細胞由来の奇形癌腫を誘導した。各移植から合計１９の腫瘍を
検査し、その時点の数を示す。各時点の腫瘍数を括弧内に示し、総計と共にパー
センテージを示す。
【０１５６】 参照文献
【表４】
【０１５７】
【表５】
【０１５８】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 キメラマウスを作製するために使用したＥＳ細胞におけるＬｍｏ２標的対立遺伝
子の構造。 ｌｍｏ２＋／−（ＫＺ２６＋／−）およびｌｍｏ２−／−（ＫＺ２６−／−）
を得るために、ＥＳ細胞で、ヘテロ接合およびホモ接合ヌル突然変異を生じさせ
た。 Ａ．ネオマイシン選択を使用して、ｌｍｏ２−／−でヌル対立遺伝子を作製し
、細菌のｌａｃＺ遺伝子をＬｍｏ２の第２エキソンと融合させた。この結果とし
て、Ｌｍｏ２をコードしているアミノ酸の短い伸長および全ガラクトシダーゼタ
ンパク質を含むβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質が生じた。 Ｂ．ハイグロマイシン耐性マーカーの挿入によって、第２のＬｍｏ２対立遺伝
子を標的にするために、Ｌｍｏ２＋／−ＥＳ細胞（クローンＫＺ２６＋／−）を
使用した。こうすることによって、Ｌｍｏ２−／−細胞（ＫＺ２６−／−）が生
じた。
【図２】 相同組換えによるＬｍｏ２−ｌａｃＺ融合遺伝子ノックイン。 ２つの構築物を使用して、本研究で使用するＬｍｏ２標的ＥＳ細胞を作製した
。ｐＫＯ５−ｌａｃＺ−ｎｅｏ（Ａ）を用いてＣＣＢ ＥＳ細胞をトランスフェ
クトし、フィルターハイブリダイゼーションで、標的事象を検出した。幾つかの
標的クローンを最初に分析し、胚盤胞に注入した後、マウスで常に高レベルのキ
メラ現象を生じさせる能力に基づいて、１個（ＫＺ２６と呼ぶ）を選択した。ｐ
ＫＯ５ｈｙｇｒｏ（ｔｋ）による第２のトランスフェクションにＫＺ２６クロー
ン＋／−を使用し、３つのクローン（１、１６および６４）について研究し、Ｌ
ｍｏ２の第２の対立遺伝子を標的にして、ＫＺ２６−／−（Ｌｍｏ２−／−）Ｅ
Ｓ細胞を得た。 ＳｆｉＩ−ｌａｃＺ−ＭＣｌｎｅｏｐＡ（Ｄｅａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５
）の４．５ｋｂの平滑末端化ＳｆｉＩフラグメントを、遺伝子ターゲティングベ
クターｐＫＯ５（ｔｋ）（Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）の平滑末端
化ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより、Ｌｍｏ２−ｌａｃＺ融合遺伝
子ターゲティングベクターの構築を行った。このようにして得られたクローンに
おいて、ＫＯ５−ｌａｃＺ−ｎｅｏ（Ｌｍｏ２の２４番目のコドン（エキソン２
））を、１２ｂｐのリンカー配列で、ｌａｃＺの２番目のコドンに連結した。ハ
イグロマイシンターゲティングベクター（ｐＫＯ５ｈｙｇｒｏ（ｔｋ））につい
て、記載されている（Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。遺伝子ターゲ
ティングの評価に使用されるプローブの位置は、ｐＫＯ５−ｌａｃＺ−ｎｅｏの
地図上に表示されており、また、以前に記載されている（Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９４）。ｐＫＯ５−ｌａｃＺ−ｎｅｏをＬｍｏ２内に向けて送ると
、プローブＡで（９Ｋｂ生殖細胞系バンドと比較して）６ＫｂのＳａｃＩフラグ
メントが得られ、プローブＢで（１２Ｋｂ生殖細胞系バンドと比較して）９．５
ＫｂのＢａｍＨＩバンドが得られる（Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）
。プローブＣはターゲティングベクター１個の挿入を確認するために使用される
ネオプローブである。ｐＫＯ５ｈｙｇｒｏ（ｔｋ）をＬｍｏ２内に向けて送ると
、プローブＡで１０．８ＫｂのＳａｃＩバンドが得られ、プローブＢで１３．８
ＫｂＢａｍＨＩバンドが得られる。 Ｓ＝ＳａｃＩ；Ｂ＝ＢａｍＨＩ プローブＡ（３’フランキング）、プローブＢ（５’フランキング）およびプ
ローブＣ（内部）を用いた、サザンフィルターハイブリダイゼーションによる、
ＥＳクローンＤＮＡにおける相同組換えの検出 代表的な＋／＋（野生型）および＋／−（ネオ標的）クローンのハイブリダイ
ゼーションを示す。 Ｗｔ＝野生型ハイブリダイゼーションバンド Ｃ．プローブＡを用いた、３つの独立した二重標的Ｌｍｏ２−／−クローン（ク
ローン１、クローンｌ６およびクローン６４）のフィルターハイブリダイゼーシ
ョンによる同定。プローブＢおよび内部ハイグロマイシンプローブを使用して、
これらの第２の標的対立遺伝子の完全性を検証した（データ示さず）。
【図３】 Ｌｍｏ２＋／−ヘテロ接合胚のホールマウントβ−ガラクトシダーゼ染色 標的ＥＳクローンＫＺ２６（ヌルＬｍｏ２対立遺伝子１個を含む）を胚盤胞に
注入し、キメラマウスを得て、Ｌｍｏ２ヌル対立遺伝子の生殖細胞系伝達を得た
。ヘテロ接合ＫＺ２６マウスをＣ５７／Ｂ１６マウスと交配し、Ｅ１０．５およ
びＥ１２．５に胚を得た。β−ガラクトシダーゼ活性の基質として、これらの胚
をＸ−ｇａｌで染色した。青色染色は、Ｌｍｏ２−ｌａｃＺ遺伝子発現によるβ
−ガラクトシダーゼの領域を示す。 Ａ．Ｅ１０．５胚。全身の主要血管壁および毛細管でＸ−ｇａｌ染色が見られ
た。 Ｂ．Ｅ１２．５胚。血管系のβ−ガラクトシダーゼ染色に加えて、肢芽および
テール先端で、顕著な染色が確認された。 Ｃ．β−ガラクトシダーゼに関して染色し、エオシンで対比染色した、Ｅ１２
．５胚の組織学的薄切。エオシン染色組織のバックグラウンドで、血管内皮細胞
が確認された。 Ｄ．β−ガラクトシダーゼに関して染色し、エオシンで対比染色した、Ｅ１２
．５胚の肢芽の組織学的薄切。肢芽の外胚葉性頂堤の下の領域は、β−ガラクト
シダーゼ陽性である。
【図４】 ＫＺ２６＋／−およびＫＺ２６キメラ胚のホールマウントＸ−ｇａｌ染色の比較
。 １個（ＫＺ２６＋／−）または２個（ＫＺ２６−／−）のＬｍｏ２ヌル対立遺
伝子を含むＥＳ細胞を、Ｃ５７／Ｂ１６胚盤胞に注入して、レシピエント雌に移
入する。指示された胚の日に胚を切除し、Ｌｍｏ２−ｌａｃＺ遺伝子発現による
β−ガラクトシダーゼ活性に関して、Ｘ−ｇａｌでホールマウント染色した。 Ａ．ヘテロ接合ＫＺ２６マウスでみられるものに類似した染色パターンを有す
るＥ１１．５ＫＺ２６＋／−キメラ胚 Ｂ．ＫＺ２６−／−クローン１由来のＥ１１．５ ＫＺ２６−／−キメラ胚。
この胚では、ＥＳ細胞寄与（青色）が海馬および肢芽で見られ、青色に染色され
る内皮細胞（すなわちＥＳ細胞起源のもの）は非常に少ない。 Ｅ１２．５ ＫＺ２６＋／−キメラ胚。Ｅ１１．５ ＫＺ２６＋／−胚に似て、
染色パターンはヘテロ接合ＫＺ２６マウスで見られるものに類似していた。 ＥおよびＦ．３つの独立した−／−クローンのＥ１２．５ ＫＺ２６−／−キメ
ラ胚。 Ｄ．ＫＺ２６−／−クローン１の注入により誘導される胚、Ｅ．クローン１６
からの胚。Ｆ．クローン６４からの胚。−Ｅ１１．５後のＫＺ２６−／−キメラ
胚の場合、主要血管の内皮細胞における−／−ＥＳ細胞の寄与はなかったが、海
馬、肢芽およびテールで発現が維持された。この、血管内皮におけるＥＳ寄与の
選択的喪失から、血管ネットワークの成熟（血管形成）におけるＬｍｏ２タンパ
ク質の本質的な役割が示唆される。
【図５】 Ｅ１０．５ Ｌｍｏ２−／−キメラ胚における成長遅滞および血管系の組織破壊 ＫＺ２６＋／−ＥＳ細胞（Ａ）またはＫＺ２６−／−ＥＳ細胞クローン１（Ｂ
〜Ｊ）を胚盤胞に注入し、Ｅ１０．５の胚を得て、ホールマウントＸ−ｇａｌ染
色することにより、キメラ胚を作製した。 Ｂ〜Ｊに示す胚は、一腹子である。高キメラ（すなわちβ−ガラクトシダーゼ染
色のレベルが高いもの）は成長が遅れたため、サイズおよびＸ−ｇａｌ染色の差
は、サイズとＥＳ細胞寄与レベルとの間の反比例関係を示す。 Ａ．Ｅ１０．５ ＫＺ２６＋／−キメラ胚。この写真は、胚を示すものであり
、一腹子の間に著しいサイズ差はなかった。 Ｂ〜Ｊ．ＫＺ２６−／−キメラ胚の一連のホールマウントＸ−ｇａｌ染色。 Ａ〜Ｈ、拡大率は同じである。 胚Ｄの拡大図（およそ１．７Ｘ）は、この高キメラ−／−胚の血管系における重
大な組織破壊を示す。ＫＺ２６＋／−（Ａ）と比較して、成熟した血管は認めら
れなかった。 Ｋ．Ｘ−ｇａｌで染色し、エオシンで対比染色した、−／−キメラ胚Ｄの組織
学的薄切。
【図６】 正常な成体の血管系およびＬｍｏ２ＩａｃＺ遺伝子融合ノックインマウスの腫瘍
血管におけるＬｍｏ２発現。 ホールマウントＸ−ｇａｌ染色用に、正常なまたは腫瘍を担持する、Ｌｍｏ２
−ｌａｃＺ遺伝子融合ノックインマウス（ＫＺ２６；Ｌｍｏ２＋／−）（９週〜
１５週齢）から組織を切除した。野生型マウスからの器官を同じ方法で染色して
、β−ガラクトシダーゼの内因性活性を除いた（データ示さず）。Ａ．Ｌｍｏ２
＋／−マウス脳のホールマウント；Ｂ．マウス腎のホールマウント（糸球体皮質
におけるＸｇａｌ染色に注目）；Ｃ．Ｌｍｏ２マウス肝のホールマウント；Ｄ．
Ｌｍｏ２＋／−遺伝子型を有するＣ５７Ｂ１６マウスへのルイス肺細胞癌腫細胞
移植によって作られた皮下腫瘍のホールマウント；Ｅ．Ｌｍｏ２ ＋１／；Ｐ５
３−／−マウスで発生させた腹部リンパ節腫瘍（Ｔ細胞リンパ腫）のホールマウ
ント；Ｆ．核ファストレッドで対比染色した、パネルＥに示す腹部リンパ節から
のＸ−ｇａｌ染色腫瘍サンプルの組織学的薄切。腫瘍血管内皮は青く染色された
。 ｃ＝皮質；ｍ＝髄質；ｅｎ＝内皮
【図７】 胸腺腫血管内皮におけるＬｍｏ２発現増大。 Ｌｍｏ２＋／−マウスから胸腺を採取し（Ａ、Ｄ）、ｐ５３ノックアウトマウ
スと交配したＬｍｏ２＋／−（Ｂ、Ｅ）（遺伝子型Ｌｍｏ２＋／−；ｐ５３−／
−）およびＣＤ２−ｒｂｔｎ２／ｌｍｏ２導入遺伝子（Ｃ、Ｆ）（遺伝子型Ｌｍ
ｏ２＋／−；ＣＤ２−ｒｂｔｎ２＋）から胸腺腫を採取した。組織をＸｇａｌで
ホールマウント染色する（Ａ〜Ｃ）か、または組織学的に薄切して核ファストレ
ッドで対比染色した（Ｄ−Ｆ）。Ｌｍｏ２＋／＋；ｐ５３−／−遺伝子型および
Ｌｍｏ２＋／＋；ＣＤ２ｒｂｔｎ２導入遺伝子陽性遺伝子型を有する対照マウス
で発生した全ての腫瘍を、内因性ｌａｃＺ活性について検査したが、染色を示す
ものはなかった。
【図８】 皮下奇形癌腫におけるＥＳ−細胞由来の血管樹の発生 ヘテロ接合Ｌｍｏ２＋／−またはホモ接合ヌルＬｍｏ２−／−ＥＳ細胞の移植
によって、ヌードマウスで皮下奇形癌腫を作った。Ｌｍｏ２＋／−ＥＳ細胞また
はＬｍｏ２−／−ＥＳ細胞のいずれか２×１０6細胞を、ヌードマウスのコホー
トの両側腹に移植した。 移植の２、３、３．５、４および８週後にレシピエントマウスから皮下腫瘍を切
除し、続いてホールマウントＸ−ｇａｌ染色し、写真撮影した。ＥＳ−細胞起源
の（すなわちＬｍｏ２標的）血管は、Ｘ−ｇａｌ染色後、ｌａｃＺのＬｍｏ２遺
伝子3へのノックイン融合による青色によって、宿主（ヌードマウス）起源の血
管と識別できる。腫瘍ホールマウント染色は、２週（２Ｗ）、３週（３Ｗ）、３
．５週（３．５Ｗ）および４週（４Ｗ）に採取される生検により示される。移植
の２週後に、Ｌｍｏ２＋／−ＥＳ細胞腫瘍（Ａ）またはＬｍｏ２−／−ＥＳ細胞
腫瘍（Ｂ）に、明白なＥＳ由来血管発生はなく、青色細胞（Ｌｍｏ２発現細胞）
のクラスターのみが認められた。しかし、３週に、Ｌｍｏ２＋／−で血管樹発生
の開始が認められたが（Ｃ）−／−では認められなかった（Ｄ）；これは、３．
５週のＬｍｏ２＋／−腫瘍で非常に明らかであったが（Ｅ）、Ｌｍｏ２−／−腫
瘍に、証拠は全くなかった（Ｆ）。４週に、十分に発達した血管樹がＬｍｏ２＋
／−腫瘍で見られたが（Ｇ）、４週に、Ｌｍｏ２−／−ＥＳ由来内皮からの血管
発生の兆候は見られなかった（Ｈ）。合計で、各ＥＳ細胞遺伝子型から誘導され
た１９の腫瘍を分析した（表２参照）。ｖｔ＝血管内皮
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/10 Ａ６１Ｐ 19/10 27/02 27/02 29/00 29/00 １０１ １０１ 35/00 35/00 37/00 37/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ ＺＮＡ Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 4B024 AA01 AA11 BA80 CA02 DA02 EA04 GA14 HA11 4B063 QA05 QA18 QQ08 QQ13 QQ20 QQ53 QQ79 QR77 QR80 QS24 4C084 AA02 AA13 AA17 BA01 CA62 MA52 MA55 MA63 MA66 NA14 ZA331 ZA361 ZA451 ZA961 ZA971 ZB071 ZB111 ZB151 ZB261

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物における血管形成を調節する方法であって、Ｌｍｏ
    ２または機能的に関連したポリペプチドの発現および／または機能の調節を含む
    方法。
  2. 【請求項２】 哺乳動物における血管形成を阻害する方法であって、Ｌｍｏ
    ２または機能的に関連したポリペプチドの発現および／または機能の阻害を含む
    方法。
  3. 【請求項３】 哺乳動物における血管形成を促進する方法であって、Ｌｍｏ
    ２または機能的に関連したポリペプチドの発現および／または機能の増強を含む
    方法。
  4. 【請求項４】 前記哺乳動物の特定の組織で血管形成が調節される請求項１
    〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 哺乳動物における血管形成過程への細胞の寄与を阻害する方
    法であって、前記細胞におけるＬｍｏ２の発現を阻害することを含む方法。
  6. 【請求項６】 Ｌｍｏ２により仲介される血管形成を調節することができる
    物質を同定する方法であって、Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドを
    発現する細胞を候補物質と接触させるステップと、Ｌｍｏ２または機能的に関連
    したポリペプチドの血管形成仲介活性が変化しているかどうかを判定するステッ
    プとを含む方法。
  7. 【請求項７】 前記物質が血管形成を阻害することができ、Ｌｍｏ２または
    機能的に関連したポリペプチドの発現を減少させることを特徴とする請求項６に
    記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記物質が血管形成を促進することができ、Ｌｍｏ２または
    機能的に関連したポリペプチドの発現を増加させることを特徴とする請求項７に
    記載の方法。
  9. 【請求項９】 Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドにより仲介さ
    れる血管形成を調節することができる物質を同定する方法であって、Ｌｍｏ２ポ
    リペプチドまたはその結合パートナーを候補物質と接触させるステップと、前記
    物質がＬｍｏ２ポリペプチドまたは機能的に関連したポリペプチドに結合するか
    どうかを判定するステップとを含む方法。
  10. 【請求項１０】 前記物質が血管形成を阻害することができる請求項９に記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記物質が血管形成を促進することができる請求項９に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】 Ｌｍｏ２によって仲介される血管形成を調節することがで
    きる物質を同定する方法であって、 （ｉ）Ｌｍｏ２ポリペプチドを提供するステップと、 （ｉｉ）Ｌｍｏ２結合パートナーを提供するステップと、 （ｉｉｉ）候補物質の存在下および非存在下で、前記Ｌｍｏ２ポリペプチドお
    よび前記結合パートナーを適切な条件でインキュベートするステップと、 （ｉｖ）前記候補物質が、Ｌｍｏ２と結合パートナーとの間の相互作用に影響
    を及ぼすかどうかを判定するステップと を含む方法。
  13. 【請求項１３】 前記物質が血管形成を阻害することができる請求項１２に
    記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記物質が血管形成を促進することができる請求項１２に
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】 Ｌｍｏ２によって仲介される血管形成を調節することがで
    きる物質を同定する方法であって、候補物質をＬｍｏ２ポリペプチドまたは機能
    的に関連したポリペプチドと接触させるステップと、前記候補物質が結合するか
    どうかを判定するステップとを含む方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法で同定される
    物質を哺乳動物に投与するステップと、血管形成が調節されるかどうかを判定す
    るステップとをさらに含む請求項６〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 血管形成が阻害される請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 血管形成が促進される請求項１６に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドによって仲
    介される血管形成を調節することができる物質であって、Ｌｍｏ２および／また
    は機能的に関連したポリペプチドに結合するか、または細胞におけるＬｍｏ２ま
    たは機能的に関連したポリペプチドの発現を変える物質。
  20. 【請求項２０】 Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドの発現をダ
    ウンレギュレートするか、あるいはＬｍｏ２または機能的に関連したポリペプチ
    ドの機能を阻害することができる、請求項１９に記載の物質。
  21. 【請求項２１】 Ｌｍｏ２または機能的に関連したポリペプチドの発現をア
    ップレギュレートするか、あるいはＬｍｏ２または機能的に関連したポリペプチ
    ドの機能を増強することができる、請求項１９に記載の物質。
  22. 【請求項２２】 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法で同定される
    、請求項１９に記載の物質。
  23. 【請求項２３】 血管形成を調節する際に使用するための、請求項１９〜２
    ２のいずれか１項に記載の物質。
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