JP2003508351A

JP2003508351A - 炎症性皮膚病理を処置するためのｈｌａ−ｇの可溶性形態を含む組成物

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Publication number: JP2003508351A
Application number: JP2001504400A
Authority: JP
Inventors: セリムアラクチヌ; エドガルドデルフィノカロセッラ; ジャンドーセ; ダハーイマンハリール; フィリップモロー; パスカルポール; ナタリールア−フレイス
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 2000-06-16
Publication date: 2003-03-04
Also published as: IL147123A; DE60005952T2; EP1189627B1; ATE251911T1; WO2000078337A1; CA2377519C; IL147123A0; EP1189627A1; FR2794977B1; FR2794977A1; DK1189627T3; CA2377519A1; DE60005952D1; DE60005952T8; ES2206286T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、皮膚の炎症性病理的状態を処置するための医薬を調製するための、ＨＬＡ−Ｇの少なくとも１つの可溶性形態および少なくとも１つ許容されるの薬学的担体から本質的になる組成物に関する。本発明はまた、ＨＬＡ−Ｇの可溶性形態および該可溶性形態に指向される抗体を得るための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、皮膚病理および特に炎症性皮膚病の処置においてのＨＬＡ−Ｇの可
溶性形態を含む組成物の使用、該ＨＬＡ−Ｇの可溶性形態を得るための方法、な
らびに該可溶性形態に指向される抗体に関する。

【０００２】主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の抗原は、数個のクラスに分類される
：３つの球状ドメイン（α１、α２およびα３）を有し、このα３ドメインがβ ₂ ミクログロブリンと結合している、クラスＩ抗原（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂお
よびＨＬＡ−Ｃ）、クラスＩＩ抗原（ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ
−ＤＲ）ならびにクラスＩＩＩ抗原（補体）。

【０００３】クラスＩ抗原は、上記の抗原に加えて、非通常性クラスＩ抗原と呼ばれる他の
抗原、および特にＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＦおよびＨＬＡ−Ｇ抗原を含む：後者は
、特に、正常なヒト胎盤および胸腺上皮細胞の外絨毛トロホブラスト(extravill
ous trophoblast)によって発現される。

【０００４】ＨＬＡ−Ｇ遺伝子（ＨＬＡ−６．０遺伝子）の配列は、ＧＥＲＡＧＨＴＹら（
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 9145-9149）によって記載され；それ
は、４３９６の塩基対を含み、そしてＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ遺伝子のもの
と相同なイントロン／エキソン構成を有する。より正確には、この遺伝子は、８
つのエキソン、７つのイントロンおよび３’非翻訳末端を含み；８つのエキソン
は、それぞれ、以下に対応する：エキソン１：シグナル配列、エキソン２：
α１細胞外ドメイン、エキソン３：α２細胞外ドメイン、エキソン４：α３
細胞外ドメイン、エキソン５：貫膜領域、エキソン６：細胞質ドメインＩ、
エキソン７：細胞質ドメインＩＩ（非翻訳）、エキソン８：細胞質ドメイン
ＩＩＩ（非翻訳）および３’非翻訳領域（GERAGHTYら、上述；ELLISら、J. Immu
nol., 1990, 144, 731-735; KIRSZENBAUM M.ら、Oncogeny of hematopoiesis, A
plastic anemia Eds. E. Gluckman, L. Coulombel, Colloque INSERM/John Libb
ey Eurotext Ltd）。しかし、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子は、インフレーム翻訳終止コド
ンがエキソン６の第２コドンに配置されるという点で、他のクラスＩ遺伝子と異
なり；結果として、このＨＬＡ−６．０遺伝子によってコードされるタンパク質
の細胞質領域は、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃタンパク質の細胞質領域のものよ
りもかなり短い。

【０００５】これらＨＬＡ−Ｇ抗原は、胎盤の栄養膜細胞層の細胞によって本質的に発現さ
れ、そして胎児を保護することにおいて役割を果たすと考えられる（母親による
拒絶の欠如）。さらに、ＨＬＡ−Ｇ抗原が単形態性である限り、それはまた、胎
盤細胞の増殖または機能に関与し得る（KOVATSら、Science, 1990, 248, 220-22
3）。

【０００６】この非通常性クラスＩ抗原に関する他の研究（ISHITANIら、Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 1992, 89, 3947-3951）は、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子の一次転写物が、数
個の様式でスプライシングされ得、そして少なくとも３つの異なる成熟ｍＲＮＡ
を産生し：一次ＨＬＡ−Ｇ転写物は、完全な１２００ｂｐコピー（Ｇ１）、９０
０ｂｐフラグメント（Ｇ２）および６００ｂｐフラグメント（Ｇ３）を提供する
ことを示した。

【０００７】Ｇ１転写物は、エキソン７を含まず、そしてＥＬＬＩＳら（上述）によって記
載される配列に対応し、すなわち、それは、リーダー配列、３つの外部ドメイン
、貫膜領域および細胞質配列を含むタンパク質をコードする。Ｇ２ｍＲＮＡは
エキソン３を含まず、すなわち、それは、α１およびα３ドメインが直接連結さ
れたタンパク質をコードする。Ｇ３ｍＲＮＡはエキソン３、エキソン４を含ま
ず、すなわち、それは、α１ドメインと貫膜配列とが直接連結されたタンパク質
をコードする。

【０００８】ＨＬＡ−Ｇ２抗原を産生するために有効なスプライシングは、アデニン（Ａ）
（α１をコードするドメインから生じる）とＡＣ配列（α３をコードするドメイ
ンに由来する）との連結へ導き、これは、ＨＬＡ−Ｇ１のα３ドメインをコード
する配列の最初で遭遇するＧＡＣコドン（アスパラギン酸）の代わりに、ＡＡＣ
コドン（アスパラギン）の形成へ導く。

【０００９】ＨＬＡ−Ｇ３を産生するために発生されるスプライシングは、スプライシング
ゾーンにおける新しいコドンの形成へ導かない。

【００１０】その論文の著者はまた、発現される種々のタンパク質を分析する：その３つの
ｍＲＮＡは、．２２１−Ｇ細胞株においてタンパク質へ翻訳される。

【００１１】一部の発明者は、ＨＬＡ−ＧｍＲＮＡの他のスプライシングされた形態の存
在を示した：ＨＬＡ−Ｇ４転写物（これは、エキソン４を含まない）；ＨＬ
Ａ−Ｇ５転写物（これは、イントロン４をエキソン４と５との間に含み、従って
、この転写物が翻訳されると、リーディングフレームの改変、および特に、イン
トロン４のアミノ酸２１の後に終止コドンの出現を生じさせる）；ならびに、
ＨＬＡ−Ｇ６転写物（これは、イントロン４を含むが、エキソン３を失っている
）（KIRSZENBAUM M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209-4213;
欧州特許出願EP 0 677 582; KIRSZENBAUM M.ら、Human Immunol., 1995, 43, 23
7-241; MOREAU P.ら、Human Immunol. 1995, 43, 231-236）。彼らはまた、これ
ら種々の転写物が、数個のヒト胎児および成人細胞タイプにおいて、特にリンパ
球において発現されることを示した（KIRSZENBAUM M.ら、Human Immunol., 1995
, 上述；MOREAU P. ら、Human Immunol. 1995, 上述）。

【００１２】従って、ＨＬＡ−Ｇの６つのタンパク質イソ型を潜在的にコードする少なくと
も６つの異なるＨＬＡ−ＧｍＲＮＡが存在し、このうちの４つは、膜結合され
（ＨＬＡ−Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４）、そしてこのうちの２つは、可溶性で
ある（Ｇ５、Ｇ６）。

【００１３】ＨＬＡ−Ｇの該タンパク質イソ型の発現は、γ−インターフェロンによって増
大されることが示された（Yangら、J. Immunol., 1996, 156, 4224-4231）。

【００１４】これらのＨＬＡ−Ｇ分子によって働かされる免疫調節機能が記載されており、
そしてこの機能のメカニズムは、これらとＮＫ細胞上に存在してこれらの細胞の
細胞傷害性機能の阻害に導く、溶解阻害レセプター（ＫＩＲレセプター）との相
互作用を実証することによって解明され；例えば、Ｎ．ＲＯＵＡＳ−ＦＲＥＩＳ
Ｓら（Proc. Nat. Acad. Sci., 1997, 94, 5249-5254）は、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子で
トランスフェクトされたＫ５６２（ヒト赤白血病株）標的細胞が、ＮＫ細胞によ
る溶解から保護されることを示した。これらの細胞は、通常、ＮＫ細胞に対して
感受性である。

【００１５】一部の発明者は、ＮＫ細胞はいずれのＨＬＡ−Ｇ転写物をも発現しないことを
示し（Teyssierら、Nat. Immunol., 1995, 14, 262-270）、この結果は、ＨＬＡ
−Ｇ遺伝子の発現産物が、ＮＫ細胞が特に活性である（自己免疫疾患、移植）か
または対照的に阻害されている（特定の腫瘍におけるもしくはウイルス感染の間
のＨＬＡ−Ｇの異常存在）、生理学的免疫寛容（妊娠）または病理学的免疫寛容
の状態において、おそらく、役割を果たすことを確認する。

【００１６】従って、一部の発明者はまた、特定の腫瘍がＨＬＡ−Ｇ分子を発現し、それら
が免疫監視機構（immune surveillance）を回避することを可能にすることを示
した（Paulら、Proc. Nat. Acad. Sci., 1998, 95, 4510-4515）。

【００１７】乾癬は、一般的な慢性炎症性病理であり、そして白色人種母集団における２％
の個体において見られる。該疾患は、表皮のケラチノサイトの過増殖によって特
徴付けられるが、多数の生理病理学的研究によって、病巣部位に侵入しそしてイ
ンターロイキン２（ＩＬ−２）およびγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）を産
生するＴｈ１サブタイプのＴリンパ球が、この疾患の病因において主要な役割を
果たすことを示すことが可能となった（Z. Bata-Csorgoら、J. Investigative D
ermatol., 1995, 89S-94S; Schlaak ら、J. Invent. Dermatol., 1994, 102, 14
5-149; Vogelら、Eur. J. Biochem., 1995, 227, 143-149）。乾癬病巣から誘導
されたＴ細胞クローンの上清は、表皮の過増殖を誘発し得ることが示された（St
rangeら、J. Invent. Dermatol., 1993, 101, 695-700）。同様に、ＳＣＩＤマ
ウスへ移植されたヒト皮膚バイオプシーの乾癬表現型の維持は、該病巣に由来す
るＴリンパ球の共注射に依存することが示された（Gilbarら、J. Invest. Derma
tol. 1997, 109, 283-288）。

【００１８】皮膚細胞におけるＨＬＡ−Ｇの発現および関連病理におけるその潜在的役割が
、Ｕｌｂｒｅｃｈｔら（Eur. J. Immunol., 1994, 24, 176-180）によって研究
された。ＨＬＡ−Ｇの膜結合イソ型の、および特にドミナントイソ型ＨＬＡ−Ｇ
１の転写物の発現のみを分析する、その論文の著者らは、低レベルのＨＬＡ−Ｇ
転写物が乾癬病巣を示す皮膚バイオプシーにおいて検出される一方、ＨＬＡ−Ｇ
転写物は、異なる個体に由来する健康な皮膚バイオプシーにおいて、存在しない
かまたは高レベルで存在することを示す。従って、これらの著者は、ＨＬＡ−Ｇ
の発現と皮膚病理との間に明確な関連は存在しないと結論付けている。

【００１９】本発明者らは、ここで、ＨＬＡ−Ｇの可溶性形態が、炎症性病理的皮膚状態に
対して治療的作用を有することを見出した。

【００２０】本発明の主題は、炎症性病理的皮膚状態を処置するための医薬品を調製するた
めの、ＨＬＡ−Ｇの少なくとも１つの可溶性形態および少なくとも１つの薬学的
に許容されるビヒクル（賦形剤）から本質的になる組成物の使用である。

【００２１】該組成物と組み合わせられる賦形剤は、所望の投与経路に好適であり；それら
は、当業者に公知の賦形剤から選択される。

【００２２】該可溶性ＨＬＡ−Ｇは、有利には、全身的に（経口的、非経口的に）または局
所的に（局所投与）投与され得る。

【００２３】後者の場合、該組成物は、クリーム、ローション、リポソームまたはゲルの形
態である。

【００２４】本発明者らは、ここで、予想外なことに、炎症性皮膚病巣において、真皮乳頭
に局在する、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を発現するマクロファージと、ＨＬＡ−Ｇに
よって認識される、細胞傷害性機能を阻害するためのレセプター（例えば、ＩＬ
Ｔ２レセプター）を発現する浸潤ＣＤ３⁺Ｔリンパ球との両方の存在を見出した
。

【００２５】本発明者らは、優性な膜結合イソ型ＨＬＡ−Ｇ１および可溶性イソ型ＨＬＡ−
Ｇ５が、炎症性皮膚病巣においてのみ発現され、一方、ＨＬＡ−Ｇタンパク質は
健康な皮膚においては検出されないことを示した。

【００２６】本発明者らはまた、ＨＬＡ−Ｇタンパク質、および特に少なくともＨＬＡ−Ｇ
のα１ドメインを含むイソ型は、Ｔリンパ球の増殖機能および細胞傷害性機能を
阻害し得ることを見出した。

【００２７】従って、本発明者らは、それゆえ、炎症性皮膚病理の処置における、ＨＬＡ−
Ｇタンパク質の、および特に少なくともＨＬＡ−Ｇのα１ドメインを含む拡散性
可溶性形態（例えば、ＨＬＡ−Ｇ５イソ型）からなる組成物の抗炎症性役割を実
証した。

【００２８】本発明に従うと、該組成物は、特に、乾癬を処置するために好適である。

【００２９】本発明の有利な実施形態に従うと、該ＨＬＡ−Ｇの可溶性形態は、少なくとも
１つの細胞外ドメイン（α１、α２またはα３）を含むＨＬＡ−Ｇの可溶性イソ
型およびＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３またはＨＬＡ−Ｇ４（膜結
合イソ型）の可溶化形態からなる群から選択される。

【００３０】該可溶性ＨＬＡ−Ｇは、少なくともα１細胞外ドメインを含む。

【００３１】該可溶性形態は、特に、バキュロウイルスにおいて産生される。

【００３２】膜結合形態に関して、それらは、有利には、国際出願PCT WO 98/37098に記載
される方法に従って真核細胞において発現され、そして次いで、膜処理（パパイ
ンのようなストリッピング剤）および例えば特異的抗体を含むイムノアフィニテ
ィーカラムにおける好適な精製によって可溶化される。

【００３３】用語「ＨＬＡ−Ｇの可溶性形態」は、可溶性ＨＬＡ−Ｇ（貫膜ドメインを含ま
ない）と、例えば上記で特定した条件下で可溶化された膜結合ＨＬＡ−Ｇとの両
方を意味することが意図される。

【００３４】好ましくは、局所的に投与される該組成物は、０．１〜５μｇ／ｍｌ、好まし
くは０．５〜２．５μｇ／ｍｌのＨＬＡ−Ｇの可溶性形態を含む。

【００３５】本発明の主題はまた、可溶性ＨＬＡ−Ｇを調製するための方法であり、該方法
が、以下の工程を含むことを特徴とする： − 昆虫細胞を、β₂ＭｃＤＮＡを含むバキュロウイルスおよびＨＬＡ−Ｇの
可溶性イソ型のα鎖を含む別のバキュロウイルスで共感染させること； − 該トランスフェクト昆虫細胞を培養すること、ならびに − 上清を採取し、そして発現されたＨＬＡ−Ｇの可溶性イソ型を精製すること
。

【００３６】該方法の有利な実施形態に従うと、該ＨＬＡ−Ｇの可溶性イソ型は、該ＨＬＡ
−Ｇの可溶性イソ型に特異的な抗体を使用して精製される。

【００３７】この実施形態の有利なアレンジメントに従うと、該抗体は、非ヒト哺乳動物（
例えば、ウサギ）を、ＫＬＨキャリアタンパク質へ結合された、可溶性ＨＬＡ−
Ｇ形態のイントロン４によってコードされるＣ末端部分に対応する、その配列が
ＳＫＥＧＤＧＧＩＭＳＶＲＥＳＲＳＬＳＥＤＬ（配列番号１）である、２１アミ
ノ酸合成ペプチドからなる免疫原性ペプチドで免疫化することによって得られる
。

【００３８】上記アレンジメントに加えて、本発明はまた、本発明の主題である方法の実行
の実施例およびまた添付の図面を参照する、以下の説明から明らかとなるであろ
う他のアレンジメントを含む。

【００３９】しかし、これらの実施例は、本発明の主題の例示のみによって提供され、これ
らは、いずれの様式でも本発明についての限定を構成しないことが、明らかに理
解されるべきである。

【００４０】実施例１：バキュロウイルスにおいてのＨＬＡ−Ｇのイソ型の可溶性形態の産
生 β２−ミクログロブリン（β２Ｍ）と結合している、その構造が３つの細胞外
ドメイン、α１、α２およびα３からなる、可溶性ＨＬＡ−Ｇ５イソ型は、ＨＬ
Ａ−Ｇ遺伝子のイントロン４に終止コドンを有する代替の転写物に由来する。組
換え可溶性ＨＬＡ−Ｇタンパク質の産生は、β２Ｍの相補ＤＮＡを含むバキュロ
ウイルスと、ＨＬＡ−Ｇ５のα鎖のｃＤＮＡを含むもう１つのバキュロウイルス
とを用いる、昆虫細胞の共感染を使用する。これは、実際に、生理的形態ＨＬＡ
−Ｇ５／β２Ｍを得ることを可能にする。

【００４１】１．ＢａｃＴｅｎウイルスでの組換えのためのトランスファーベクターの構築ａ− トランスファーベクターへのβ２Ｍ遺伝子の挿入： β２ＭをコードするＤＮＡ配列を、ｐＴｅｎ１２トランスファーベクター（Qu
antum）のＢｇＩＩＩ−Ｋｐｎ１部位へ挿入する。この組換えクローンを、酵素
消化によって確認し、次いで増殖させ、そして直線化ＢａｃＴｅｎバキュロウイ
ルスのＤＮＡでの共トランスフェクションのために滅菌する。

【００４２】ｂ− ＨＬＡ−Ｇ５をコードする遺伝子のトランスファーベクターへの挿入：ＨＬＡ−Ｇ５分子をコードする配列を、ｐＴｅｎ１２トランスファーベクター
のＢｇＩＩＩ−Ｋｐｎ１部位に挿入する。この組換えクローンを、酵素消化によ
って確認し、次いで増殖させ、そして直線化ＢａｃＴｅｎバキュロウイルス（Qu
antum）のＤＮＡでの共トランスフェクションのために滅菌する。

【００４３】２．組換えバキュロウイルスの構築第１工程は、第１に、ＨＬＡ−Ｇ５Ａ組換えバキュロウイルス、そして第２に
、β２Ｍ組換えバキュロウイルスを産生することを含む。β２ＭおよびＨＬＡ−
Ｇ５Ａ遺伝子を保有する２つのトランスファーベクターを、Ｓｆ９昆虫細胞を培
養液中で共トランスフェクトするために、直線ＢａｃＴｅｎと共に配置する。共
トランスフェクト上清を採取し、そして溶解プラーククローニング（lysis plaq
ue clonig）を、組換えバキュロウイルスクローンを単離するために、実施する
。構築物の質を保証するために、このウイルスクローンのＤＮＡを抽出し、そし
てこの遺伝子の正確なウイルス座への挿入を、ＰＣＲによって確認する。６つの
クローンを各構築物について得、そして各々を使用してＳｆ９細胞を再感染させ
た。培養上清および細胞を、次いで、遠心分離後に回収した。このタンパク質を
、ＰＡＧ５−６抗体（実施例４を参照のこと）を使用するイムノアフィニティー
によって精製する。タンパク質の構造を、それぞれ可溶性ＨＬＡ−Ｇ５形態およ
びβ２Ｍに特異的である、ＰＡＧ５−６抗体（抗ＨＬＡ−Ｇ５）およびＢＩＧ６
抗体（Immunotech）（抗β２Ｍ）の両方を用いるウェスタンブロットによって確
認する。１つのクローンを、ＨＬＡ−Ｇ５を産生する６つのクローンから選択し
、そして１つのクローンを、β２Ｍを産生する４つのクローンから選択した。１
つのＨＬＡ−Ｇ５αクローンおよび１つのβ２Ｍクローンを使用して、Ｓｆ９細
胞を共感染させた。ウェスタンブロット分析およびコンフォメーショナル（conf
ormational）抗体Ｗ６／３２（β２−ｍと結合したＨＬＡクラスＩα鎖に対する
、ＩｇＧ２ａ（Sigma））を用いての免疫沈降によって、この共感染由来の上清
が、β２Ｍと結合したＨＬＡ−Ｇ５タンパク質を含み；従って、それは生理学的
形態に近い形態であることを示すことが可能である。従って、これらのＳｆ９細
胞は、多量の可溶性ＨＬＡ−Ｇ５タンパク質を得ることを可能にする。

【００４４】実施例２：乾癬に関連するＴ依存性現象においてのＨＬＡ−Ｇの調節役割の実
証１．皮膚バイオプシーの起源バイオプシーの日の前の１５日間に局所的または全身的処置を受けていない患
者に由来する、慢性乾癬病巣の典型的な斑を示す皮膚バイオプシーを、分析した
。

【００４５】胸整復術を受けた患者から誘導した健康な皮膚バイオプシーを、ネガティブコ
ントロールとして使用する。

【００４６】サンプルを２つに分離し、１つの部分を、直ちにＲＴ−ＰＣＲ分析のために液
体窒素中で凍結させ、そして残りの部分を、免疫組織化学分析のために、ＯＣＴ
（Miles Inc Diagnostics Division）に埋入する。

【００４７】２．乾癬病巣を示す皮膚バイオプシーにおいての、全てのＨＬＡ−Ｇ転写物お
よび可溶性ＨＬＡ−Ｇ５イソ型に特異的な転写物の実証ａ）材料および方法メッセンジャーＲＮＡを、病巣化乾癬皮膚の６つの検体（Ｐｓｏ１〜Ｐｓｏ−
６、図１および３）および正常皮膚の４つの検体（健康皮膚１〜健康皮膚４、図
２および３）の凍結バイオプシーから、以下の条件下で抽出する：これらのサン
プルを、ＲＮＡＮｏｗ試薬（Biogentex, Inc.）と共に配置し、製造業者の推
奨に従って、ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘホモジナイザー（IKA Labortechnic）を使
用してホモジナイズする。抽出されたＲＮＡの質を、変性条件下で１．５％アガ
ロースゲル上における電気泳動によって、確認する。５μｇのＲＮＡを、１２〜
１８オリゴヌクレオチド長のオリゴｄＴプライマー（Gibco BRL）およびＭｏｌ
ｏｎｅｙウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素を使用して、１時間４２℃で、ｃＤ
ＮＡへ逆転写する。得られるｃＤＮＡを、次いで、第１に、種々の公知のＨＬＡ
−Ｇイソ型に対応するＨＬＡ−Ｇ転写物のＰＣＲ増幅のために使用される、全て
のＨＬＡ−Ｇ転写物を認識するプライマー［プライマーＧ．２５７（エキソン２
）および３Ｇ．Ｕ（非翻訳３’末端）］（図１および２）ならびに、第２に、可
溶性ＨＬＡ−Ｇ５配列に特異的なプライマー［すなわちプライマーＧ．５２６お
よびＧ．ｉ４ｂ］（図３）を用いて、ＰＣＲで増幅する。

【００４８】より正確には、使用される種々のプライマーおよびプローブは、結果として、
以下の通りである： − Ｇ１、Ｇ４およびＧ５イソ型について、Ｇ．５２６（エキソン３）およびＧ
３．Ｕ（３’ＵＴ）； − Ｇ５イソ型について、Ｇ．５２６（エキソン３）およびＧ．ｉ４ｂ（イント
ロン４）； − Ｇ２およびＧ６イソ型について、Ｇ．−３（部分的にエキソン２および４を
カバーする）およびＧ３．Ｕ（３’ＵＴ）； − Ｇ３イソ型について、Ｇ．３−４（部分的にエキソン２および５をカバーす
る）およびＧ３．Ｕ（３’ＵＴ）。

【００４９】ＰＣＲ条件は、以下の通りである：３５サイクルについて、９０℃で１分、６
５℃（プライマーＧ．５２６およびＧ．ｉ４ｂのペアについて６１℃）で９０秒
、そして７２℃で２分。ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲルにおける電気泳
動によって分離する。

【００５０】 βアクチン転写物を、種々のサンプル間でのＲＮＡの量を標準化するために、
特異的プライマー（Clontech）を使用して、１６サイクルについて、共増幅させ
る。

【００５１】ＰＣＲ産物を、次いで、ナイロン膜（ＨｙｂｏｎｄＮ⁺、Amersham）上に移
し、放射標識化プローブとハイブリダイズさせ、そしてハイブリダイゼーション
シグナルの強度を、デンシトメトリーによって定量化する。

【００５２】特異的ＨＬＡ−Ｇプローブは、以下の通りである： − 全てのＨＬＡ−Ｇ転写物を認識する、エキソン２に特異的なＧＲ、および − ＨＬＡ−Ｇ５転写物のみを認識する、イントロン４に特異的なＧ．Ｉ４Ｆ
。

【００５３】上記のプライマーおよびプローブは、P. MOREAUら、C. R. Acad. Sci. Paris,
Sciences de la vie / Life Sciences, 1995; 318; 837-42に記載される。

【００５４】高レベルのＨＬＡ−Ｇ転写を有する、ＪＥＧ−３絨毛癌細胞（ATCC）からのｃ
ＤＮＡを、ポジティブコントロールとして使用する。上記アッセイにおいて、Ｊ
ＥＧ−３株を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、抗生物質および２ｍＭのＬ−グ
ルタミンが補充されたＤＭＥＭ培地（Sigma）中で培養する。この細胞株は、マ
イクロプラズマを含まない。

【００５５】特異的ＨＬＡ−Ｇバンドが、エキソン２に配置されたＧＲ−特異的プローブと
のハイブリダイゼーションによって明らかとなる。同一反応の間にβアクチンプ
ライマーと共増幅されたＰＣＲ産物が、βアクチンプローブを使用して、同一膜
において検出される。

【００５６】ｂ）結果結果を、図１〜３に例示する。

【００５７】ＨＬＡ−Ｇ転写物が、乾癬病巣を示す病巣化皮膚の全てのサンプルにおいて、
および健康な皮膚の４つのサンプルのうち２つのみから検出される。１つのサン
プル（サンプル３）を除いて、ＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５イソ型に対応す
る転写物のみが、病巣化皮膚のサンプルにおいて検出される。乾癬に罹患する６
人の患者からの病巣化皮膚バイオプシーにおいて、より高いＨＬＡ−Ｇ転写レベ
ルが、特にＧ１／Ｇ５イソ型に関して存在する（ｐ＜０．０５；図１及び３）。

【００５８】これらのサンプルにおいて、可溶性ＨＬＡ−Ｇ５イソ型についてのシグナルは
、正常な皮膚の４つの検体から存在しない（図３）が、乾癬を示す６人の個体の
うち３人において見られる（図３）。

【００５９】結果のセットは、ＨＬＡ−Ｇ１および−Ｇ５転写物のレベルが、健康な皮膚の
サンプルにおいてよりも、乾癬病巣を示す皮膚バイオプシーにおいて、より高い
こと、ならびに、ＨＬＡ−Ｇ５転写物は、乾癬病巣を示す皮膚バイオプシーにお
いてのみ発現されることを示す。

【００６０】３．乾癬病巣を示す皮膚バイオプシーにおけるＨＬＡ−Ｇタンパク質の実証ａ）材料および方法ａ₁）免疫組織化学クリオスタット切片を、凍結サンプルから調製し、そして次いで、これらの切
片を、アセトン中、−２０℃で、２０分間脱水し、そしてオープンエアーにおい
て乾燥した。

【００６１】免疫標識化を、ＤａｋｏＥｎＶｉｓｉｏｎ＋ＳｙｓｔｅｍＰｅｒｏｘｉｄ
ｅ（ＡＥＣ）キット（Dako）を使用して、製造業者の使用説明書に従って実施す
る。

【００６２】使用される抗体は、以下の通りである： − ＨＬＡ−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ１〜−Ｇ５）に特異的な８７ＧおよびＯ１Ｇ、なら
びにＨＬＡ−Ｇ５に特異的な１６Ｇ１（D. Geraghty, Fred Hutchinson Cancer
Research Center, Seattle, USA）、 − 変性形態のＨＬＡ−Ｇのイソ型に特異的な４Ｈ８４（M. McMaster, San Fra
ncisco, USA） − ＨＬＡ−Ｇへの結合に関与するＫＩＲを認識する、抗ＩＬ
Ｔ２（Navarroら、Eur. J; Immunol., 1999, 29, 277-283）、 − Ｗ６／３２：抗ＭＨＣクラスＩ抗原（Sigma） − 抗ＣＤ３（Sigma） − 抗ＣＤ１４（Sigma） − マウスＩｇＧ２ａ：コントロール抗体（Sigma）。

【００６３】ａ₂）ダブル標識化ダブル標識化を、以下の抗体のペアを用いて実施する： − ８７Ｇおよび抗ＣＤ６８ − ８７Ｇおよび抗ＣＤ１１ｃ（Dako） − 抗ＩＬＴ２および抗ＣＤ３。

【００６４】使用する条件は、以下の通りである：正常なヤギ血清とのインキュベーション
後、切片を第１抗体（８７Ｇまたは抗ＩＬＴ２）と６０分間インキュベートし、
リンスし、そして次いで、Ｔｅｘａｓｒｅｄ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とイ
ンキュベートする。次いで、切片をリンスし、そして３０分間、フルオレセイン
イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）へ結合された第２抗体［第１抗体が８７Ｇであ
る場合は抗ＣＤ６８または抗ＣＤ１１ｃ抗体、あるいは第１抗体が抗ＩＬＴ２で
ある場合は抗ＣＤ３抗体］とインキュベートする。

【００６５】コントロール切片において、第１抗体（８７Ｇまたは抗ＩＬＴ２）をコントロ
ール抗体（マウスＩｇＧ２ａ）で置換する。

【００６６】次いで、切片を、レーザー共焦顕微鏡(laser confocal microscopy)によって
分析する。

【００６７】ｂ）結果ｂ₁）皮膚バイオプシーにおいての全てのＨＬＡ−Ｇタンパク質および可溶性
ＨＬＡ−Ｇ５タンパク質の検出ＨＬＡ−Ｇタンパク質の発現は、ＨＬＡ−Ｇの全てのイソ型を認識する８７Ｇ
抗体またはＯ１Ｇ抗体を使用する場合に、健康な皮膚のサンプルおいて検出され
ない。

【００６８】一方、ＨＬＡ−Ｇ発現は、乾癬病巣を示す皮膚の９つのサンプルにおける真皮
乳頭の細胞において検出される。ＨＬＡ−Ｇ発現のレベルは、サンプルに依存し
て可変であり；それは、いくつかのサンプルにおいて高い。さらに、２つのサン
プルのみにおいて、ＨＬＡ−Ｇ発現がまた表皮において、真皮の炎症性細胞浸潤
に近い領域において、炎症性細胞の分離した座においてまたは数個のケラチノサ
イトのいずれいかにおいて、検出される。これら数個のケラチノサイトにおける
ＨＬＡ−Ｇの局在は、おそらく、該イソ型を発現する真皮の細胞からのＨＬＡ−
Ｇ５イソ型の拡散に関連する。

【００６９】真皮乳頭の細胞の特異的標識化がまた、可溶性ＨＬＡ−Ｇ５イソ型を特異的に
認識する１６Ｇ１抗体を使用する場合に、検出される。

【００７０】ｂ₂）乾癬病巣においてのＨＬＡ−Ｇを発現する細胞の局在８７Ｇ抗体および抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ１４抗体を用いるダブル標識化は
、ＨＬＡ−Ｇが、Ｃ１４Ｄを発現する細胞において共局在され；一方、Ｔリンパ
球（ＣＤ３⁺）とのＨＬＡ−Ｇの共局在は観察されないことを示す。

【００７１】ｂ₃）ＨＬＡ−Ｇを発現する細胞は、ＣＤ６８⁺、ＣＤ１１ｃ⁺マクロファージ
であるマクロファージを特異的に認識する８７Ｇ抗体および抗ＣＤ６８または抗ＣＤ
１１ｃ抗体での乾癬病巣を示す皮膚のサンプルの連続切片の標識化は、事実上、
ＨＬＡ−Ｇを発現する全ての細胞が、ＣＤ６８およびＣＤ１１ｃも発現し、そし
て従ってマクロファージであることを実証する。

【００７２】ｂ₄）ＩＬＴ２タイプＫＩＲレセプターは、乾癬病巣に浸潤するＴリンパ球中
に存在する抗ＩＬＴ２抗体での乾癬病巣を示す皮膚バイオプシーの標識化は、表在真皮に
おける密な浸潤の存在を示す。一方、健康な皮膚のサンプルの真皮において標識
は全く検出されない。さらに、抗ＣＤ３および抗ＩＬＴ２抗体を用いてのダブル
標識化実験は、真皮乳頭における数個のダブル標識化細胞の存在を示す。

【００７３】要約すると、上記で示される結果のセットは、以下を示す： − 健康な皮膚において、ＨＬＡ−ＧＲＮＡの発現は、低いかまたは検出不可
能であり、そしてＨＬＡ−Ｇタンパク質は存在しないこと、 − 乾癬病巣において、ＨＬＡ−Ｇ１および−Ｇ５イソ型のＲＮＡおよびタンパ
ク質の増加した発現が、存在すること、 − 乾癬病巣において、ＨＬＡ−Ｇ発現は、マクロファージに局在されること、
ならびに − 乾癬病巣において、浸潤Ｔリンパ球は、ＨＬＡ−Ｇによって認識される細胞
傷害性機能を阻害するためのレセプター（ＩＬＴ２レセプター）を発現すること
。

【００７４】これらの結果は、乾癬病巣においての、ＨＬＡ−Ｇを発現する細胞（真皮乳頭
のマクロファージ）、ならびにＨＬＡ−Ｇによって認識される細胞傷害性機能を
阻害するためのレセプター（ＩＬＴ２レセプター）を発現する、乾癬病巣を担う
浸潤細胞（ＣＤ３⁺Ｔリンパ球）の両方の存在を示す。

【００７５】結論として、これらの結果は、ＨＬＡ−Ｇの、ならびに特に優性な膜結合イソ
型ＨＬＡ−Ｇ１の、および拡散性可溶性イソ型ＨＬＡ−Ｇ５の、乾癬を担うＴ依
存現象の局所制御における、直接的役割を実証する。

【００７６】実施例３：免疫機能の阻害におけるＨＬＡ−Ｇのα１細胞外ドメインの役割、
および乾癬の処置における適用１．ＮＫ細胞およびＴ細胞の細胞傷害性活性の阻害における、ＨＬＡ−Ｇのα
１細胞外ドメインの役割ａ）ＮＫ細胞末梢血に存在するイムノコンピテントナチュラルキラー細胞に対する標的細胞
としての、ＨＬＡ−Ｇ１、−Ｇ２、−Ｇ３または−Ｇ４イソ型の各々でトランス
フェクトした細胞の使用は、イソ型の各々が、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害
性活性を阻害し得ることを実証することを可能にする（図４）。これらの実験を
、１０を超える健康なボランティアドナーについて実施し、そして、各イソ型に
よって発揮される阻害の有意性を、統計学的検定を用いて確証した（図４）。

【００７７】ｂ）Ｔ細胞抗原ペプチドに特異的なＭＨＣ拘束ＣＤ８⁺Ｔ細胞に対する同一の標的細胞を
用いで実施した類似のインビトロ細胞傷害性アッセイはまた、ＨＬＡ−Ｇ１、−
Ｇ２、−Ｇ３および−Ｇ４イソ型の各々が、有意に、これらＴ細胞の細胞傷害性
活性を阻害することを実証した（図５）。

【００７８】ＨＬＡ−Ｇ３の構造に基づいて、イソ型形成(isoforming)は上述の全ての阻害
特性を有するα１細胞外ドメインのみからなり、このドメインの機能に関する結
論が導かれ得る。従って、このドメインは、ＨＬＡ−Ｇの機能的モチーフを含み
、そして従って、免疫寛容のための薬理学的薬剤として使用され得る。

【００７９】２．乾癬の処置における適用乾癬を担うＴ依存現象の局所調節における、ＨＬＡ−Ｇの、ならびに特に優性
な膜結合イソ型ＨＬＡ−Ｇ１の、および拡散性可溶性イソ型ＨＬＡ−Ｇ５の直接
的役割は、実施例２において実証された。

【００８０】Ｔ機能の阻害における、ＨＬＡ−Ｇの、および特に該イソ型のα１ドメインの
役割は、上記に実証された。

【００８１】従って、結果のセットは、該ＨＬＡ−Ｇイソ型、特に拡散性可溶性形態（例え
ば、ＨＬＡ−Ｇ５イソ型）を含有する薬学的組成物は、乾癬の処置における保護
的役割を有することを示す。

【００８２】実施例４：ウサギにおいて産生されるポリクローナル血清の形態での、ＨＬＡ
−Ｇの可溶性形態（ＨＬＡ−Ｇ５およびＨＬＡ−Ｇ６）を特異的に認識する抗体
（ＰＡＧ５−６と名付けられる）の産生ＫＬＨキャリアタンパク質へ結合された、可溶性ＨＬＡ−Ｇ形態のイントロン
４によってコードされるＣ末端部分に対応する、その配列がＳＫＥＧＤＧＧＩＭ
ＳＶＲＥＳＲＳＬＳＥＤＬ（配列番号１）である、２１アミノ酸合成ペプチドか
らなる免疫原性ペプチドでのウサギの免疫化は、免疫沈降技術、イムノプリンテ
ィング（immunoprinting）技術（ウェスタンブロット）、免疫組織化学技術およ
びＥＬＩＳＡタイプの免疫酵素技術によって、ＨＬＡ−Ｇの可溶性形態（ＨＬＡ
−Ｇ５およびＨＬＡ−Ｇ６）を特異的に認識するポリクローナル血清を産生する
ことを可能にする。血清は、アフィニティーカラム（プロテインＧ−セファロー
ス）において精製され、そして可溶性ＨＬＡ−Ｇ形態を検出、滴定および精製す
るための全てに使用され得る。

【００８３】上記から明らかとなるように、本発明は、いずれの様式でも、たった今より明
示的に記載した実行、調製および適用のその方法に限定されず；逆に、それは、
本発明の文脈または範囲から逸脱することなしに、当業者に予想され得る全ての
その変形を網羅する。

【００８４】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１および２は、健康な皮膚と比較した、乾癬病巣おけるＨＬＡ−Ｇの種々の
イソ型のＲＮＡの存在を例示する。

【図２】図１および２は、健康な皮膚と比較した、乾癬病巣おけるＨＬＡ−Ｇの種々の
イソ型のＲＮＡの存在を例示する。

【図３】図３は、健康な皮膚と比較した、乾癬病巣におけるＨＬＡ−Ｇ５イソ型に特異
的なＲＮＡの存在を例示する。

【図４】末梢血に存在するナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）に対するＨＬＡ−Ｇイソ
型の阻害活性を例示する；この図は、ｘ軸に研究されるイソ型を、そしてｙ軸に
パーセンテージ特異的溶解を含む。ベクターのみ（Ｍ８−ｐＣＤＮＡ）（Invitr
ogen）か、あるいはＨＬＡ−Ｇ１をコードするｃＤＮＡ（Ｍ８−ＨＬＡ−Ｇ１）
、ＨＬＡ−Ｇ２をコードするｃＤＮＡ（Ｍ８−ＨＬＡ−Ｇ２）、ＨＬＡ−Ｇ３を
コードするｃＤＮＡ（Ｍ８−ＨＬＡ−Ｇ３）またはＨＬＡ−Ｇ４をコードするｃ
ＤＮＡ（Ｍ８−ＨＬＡ−Ｇ４）を含むベクターのいずれかをトランスフェクトさ
せたＭ８細胞（ＨＬＡクラスＩ⁺、クラスＩＩ^-黒色腫細胞株）が、標的（Ｔ）と
して使用される。末梢血単核細胞、ＰＢＭＣが、エフェクター細胞（Ｅ）として
使用される。結果は、クロム５１（⁵¹Ｃｒ）−放出アッセイにおいて４時間記録
された、パーセンテージ溶解として表現される。

【図５】インフルエンザウイルスのマトリクスから発生する、位置５８から６６のウイ
ルスペプチドを提示するＨＬＡ−Ａ２に限られたＣＤ８＋Ｔリンパ球株に対する
、ＨＬＡ−Ｇイソ型の阻害活性を例示する；この図は、ｘ軸に研究されるイソ型
を、そしてｙ軸にパーセンテージ特異的溶解を含み；エフェクター細胞／標的細
胞比は１５：１である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:93 Ｃ１２Ｒ 1:93） (72)発明者ハリールダハーイマンフランス国エフ−94150 ルンギアベニューデアンテ 25 (72)発明者モローフィリップフランス国エフ−91170 ヴィリー−シャティヨンリュブーガンビル８ (72)発明者ポールパスカルフランス国エフ−75010 パリリュデラグランジェオーベル 29 (72)発明者ルア−フレイスナタリーフランス国エフ−75013 パリブルーバードアラゴ 44 Ｆターム(参考） 4B064 AG31 CA10 CA12 CA19 CC24 DA01 4C085 AA02 BA99 BB11 CC05 CC27 DD23 DD31 DD88 DD90 EE01 4H045 AA11 AA20 AA30 CA40 DA75 EA28

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】炎症性病理的皮膚状態を処置するための医薬品を調製するた
めの、ＨＬＡ−Ｇの少なくとも１つの可溶性形態および少なくとも１つの薬学的
に許容されるビヒクルから本質的になる組成物の使用。
【請求項２】前記ＨＬＡ−Ｇの可溶性形態が、少なくともα１細胞外ドメ
インを含むＨＬＡ−Ｇの可溶性イソ型およびＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬ
Ａ−Ｇ３またはＨＬＡ−Ｇ４の可溶化形態からなる群から選択されることを特徴
とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】前記組成物が、０．１〜５μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜
２．５μｇ／ｍｌのＨＬＡ−Ｇの可溶性形態を含むことを特徴とする、請求項１
または請求項２に記載の使用。
【請求項４】可溶性ＨＬＡ−Ｇを調製するための方法であって、該方法が
、以下の工程を含むことを特徴とする： − 昆虫細胞を、β₂ＭｃＤＮＡを含むバキュロウイルスおよびＨＬＡ−Ｇの
可溶性イソ型のα鎖を含む別のバキュロウイルスで共感染させること； − トランスフェクトされた昆虫細胞を培養すること、ならびに − 上澄みを採取し、そして発現されたＨＬＡ−Ｇの可溶性イソ型を精製するこ
と。
【請求項５】前記ＨＬＡ−Ｇの可溶性イソ型が、該ＨＬＡ−Ｇの可溶性イ
ソ型に特異的な抗体を使用して精製されることを特徴とする、請求項４に記載の
方法。
【請求項６】前記抗体が、非ヒト哺乳動物（特に、ウサギ）をＫＬＨキャ
リアタンパク質へ結合された配列番号１の免疫原性ペプチドで免疫化することに
よって得られることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】非ヒト哺乳動物（特に、ウサギ）を、ＫＬＨキャリアタンパ
ク質へ結合された配列番号１の２１アミノ酸合成ペプチドからなる免疫原性ペプ
チドで免疫化することによって得られることを特徴とする、可溶性抗ＨＬＡ−Ｇ
抗体。