JP2003508079A - 老年期体細胞からクローン化された動物中の細胞寿命のテロメア回復と延長 - Google Patents
老年期体細胞からクローン化された動物中の細胞寿命のテロメア回復と延長Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、正常な体細胞を若返らせる方法、および目的の正常な体細胞と同じ遺伝子型を有する異なる型の正常な体細胞の作成方法に関する。これらの細胞は、細胞および組織移植において特別の用途を有する。また、クローン化動物を再クローン化する方法、特に、そのクローン化された親と比較して、遺伝子が改変されるように、クローン哺乳動物の子孫（「超若い」）を設計する方法も包含される。これらの動物は、クローン化された親と比較して、より健康であり、好ましい性質を有する。また、内因性テロメラーゼ、ＥＰＣ−１活性、および／またはＡＬＴ経路の活性化方法、および／または正常な体細胞または増殖能力の細胞老化に関連する他の遺伝子の寿命を延長させる方法が含まれる。
Description
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許出願第０９／５２７，０２６号および０９／５２０，８７
９号の一部継続出願であり、仮出願６０／１５２，３４０号と６０／１５３，２
３３号の利益を主張する
９号の一部継続出願であり、仮出願６０／１５２，３４０号と６０／１５３，２
３３号の利益を主張する
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、老年期（senescence）であるか、チェックポイントで停止したか、
老年期に近いか、または好ましくない短い細胞寿命を有する正常なもしくは修飾
された体細胞または細胞性ＤＮＡを、核移行（nuclear transfer）法により若返
らせる方法に関する。この方法は、複雑な遺伝子操作後のクローン拡張により、
または組織の慢性傷害から、老年期に達したかまたは老年期に近づいている細胞
を若返らせるのに特に有用であり、従ってクローン化トランスジェニック動物の
作成のための、またはヒトでの細胞治療のためのドナーとして機能する、そのよ
うな細胞の能力を上昇させる。
老年期に近いか、または好ましくない短い細胞寿命を有する正常なもしくは修飾
された体細胞または細胞性ＤＮＡを、核移行（nuclear transfer）法により若返
らせる方法に関する。この方法は、複雑な遺伝子操作後のクローン拡張により、
または組織の慢性傷害から、老年期に達したかまたは老年期に近づいている細胞
を若返らせるのに特に有用であり、従ってクローン化トランスジェニック動物の
作成のための、またはヒトでの細胞治療のためのドナーとして機能する、そのよ
うな細胞の能力を上昇させる。
【０００３】
また本発明は、加齢の結果として、または細胞老化の悪化を引き起こす症状（
例えば、筋ジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、免疫老化、ＢＰＨ、神経
変性疾患、バレット食道硬変、ＡＭＤ骨粗鬆症、および皮膚潰瘍）のために、老
年期であるかまたは年を取った細胞の若返りに有用である。患者または動物の細
胞は、核移行法または関連技術により再プログラムまたは若返りを受けて、再生
され全能性を回復するであろう。これらの全能性細胞は、特に限定されないが、
間充織幹細胞または前間充織幹細胞、造血細胞、血管細胞などの多能性細胞を含
む型の細胞を産生するのに使用でき、これらは、患者または動物または適当なド
ナーに移植することができる。これらの細胞は、患者または動物の組織に、健康
で増殖可能な種々の型の細胞（骨、血液、筋肉、ニューロン、免疫細胞など）を
「植え付ける」であろう。
例えば、筋ジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、免疫老化、ＢＰＨ、神経
変性疾患、バレット食道硬変、ＡＭＤ骨粗鬆症、および皮膚潰瘍）のために、老
年期であるかまたは年を取った細胞の若返りに有用である。患者または動物の細
胞は、核移行法または関連技術により再プログラムまたは若返りを受けて、再生
され全能性を回復するであろう。これらの全能性細胞は、特に限定されないが、
間充織幹細胞または前間充織幹細胞、造血細胞、血管細胞などの多能性細胞を含
む型の細胞を産生するのに使用でき、これらは、患者または動物または適当なド
ナーに移植することができる。これらの細胞は、患者または動物の組織に、健康
で増殖可能な種々の型の細胞（骨、血液、筋肉、ニューロン、免疫細胞など）を
「植え付ける」であろう。
【０００４】
本発明の方法はまた、若返った細胞からの、および任意のまたは３つすべての
胚葉からの細胞を含有する奇形腫からの、分化細胞の作成を含み、目的の１次細
胞と同じ遺伝子型を有する異なる型の１次細胞を作成するのに有用である。その
ような新たに作成された１次細胞は、組織工学および臓器置換療法の分野で重要
な意義を有する。また、クローン化哺乳動物を再クローン化する方法、特にクロ
ーン化哺乳動物の子孫が、そのクローン化した親と比較して遺伝的に改変される
ように設計される方法も包含される。
胚葉からの細胞を含有する奇形腫からの、分化細胞の作成を含み、目的の１次細
胞と同じ遺伝子型を有する異なる型の１次細胞を作成するのに有用である。その
ような新たに作成された１次細胞は、組織工学および臓器置換療法の分野で重要
な意義を有する。また、クローン化哺乳動物を再クローン化する方法、特にクロ
ーン化哺乳動物の子孫が、そのクローン化した親と比較して遺伝的に改変される
ように設計される方法も包含される。
【０００５】
本発明はまた、細胞の加齢および老化を減速させる化合物、およびこれに関連
する遺伝子、特にテロメアの長さ、ＥＰＣ−１活性、ｔＰＡ、コラゲナーゼ活性
、ｇａｓ遺伝子、分裂指数、および細胞老化と増殖能力の他の指標に影響を与え
る化合物を、同定するための測定法に関する。
する遺伝子、特にテロメアの長さ、ＥＰＣ−１活性、ｔＰＡ、コラゲナーゼ活性
、ｇａｓ遺伝子、分裂指数、および細胞老化と増殖能力の他の指標に影響を与え
る化合物を、同定するための測定法に関する。
【０００６】
（発明の背景）
過去１０年間は、クローン化の科学で大きな進歩があったことが特徴であり、
「ドリイ（Dolly）」（ロスリンバイオメッド（Roslin Bio-Med））というクロ
ーン化ヒツジ、「ミラ（Mira）」と呼ぶクローン化ヤギのトリオ（ＡＣＴからの
ライセンス技術を使用したジェンザイムトランスジェニクス（Genzyme Transgen
ics））、数十匹のクローン化ウシ（ＡＣＴ）、多数の世代のクローン化マウス
、そしてつい最近は５匹のクローン化ブタ（ＰＰＬ）が誕生した。クローン化を
可能にする技術も進歩し、現在哺乳動物は、成体、分化細胞からの核を使用して
クローン化でき、これは有核卵母細胞に導入されると「再プログラミング」され
ることを、科学者は知っている。米国特許第５，９４５，５７７号を参照された
い（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。
「ドリイ（Dolly）」（ロスリンバイオメッド（Roslin Bio-Med））というクロ
ーン化ヒツジ、「ミラ（Mira）」と呼ぶクローン化ヤギのトリオ（ＡＣＴからの
ライセンス技術を使用したジェンザイムトランスジェニクス（Genzyme Transgen
ics））、数十匹のクローン化ウシ（ＡＣＴ）、多数の世代のクローン化マウス
、そしてつい最近は５匹のクローン化ブタ（ＰＰＬ）が誕生した。クローン化を
可能にする技術も進歩し、現在哺乳動物は、成体、分化細胞からの核を使用して
クローン化でき、これは有核卵母細胞に導入されると「再プログラミング」され
ることを、科学者は知っている。米国特許第５，９４５，５７７号を参照された
い（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０００７】
胚と胚幹細胞が、成体の分化細胞の核を使用して作成できるという事実は、臓
器、細胞および組織移植の分野で大きな意味を有する。例えば移植の必要な患者
から取った細胞の核から作成した胚幹細胞は、移植に必要な型の細胞に分化する
ように、作成および誘導することができる。組織工学の分野で生まれている技術
を使用して、クローン化した分化細胞から、移植に使用可能な組織や臓器を設計
することができる。移植に使用されるこれらの細胞や組織は、患者と同じ核遺伝
子型を有するため、移植拒絶の問題や免疫抑制剤の使用に固有の危険を避けたり
低下させたりすることができるであろう。さらに作成された細胞や組織は、異種
ＤＮＡで容易に修飾でき、または有害な遺伝子が不活性化されるように、移植さ
れた細胞や組織が、必要であれば遺伝的に修正または改良されるように、修飾す
ることができるであろう。米国特許出願第 号（本発明と同じ出
願人のものであり、同時に出願された）は、ドナーの核ＤＮＡと受容者のミトコ
ンドリアＤＮＡの両方を遺伝的に修飾する方法を考察している（これは参照する
ことにより本明細書に組み込まれる）。
器、細胞および組織移植の分野で大きな意味を有する。例えば移植の必要な患者
から取った細胞の核から作成した胚幹細胞は、移植に必要な型の細胞に分化する
ように、作成および誘導することができる。組織工学の分野で生まれている技術
を使用して、クローン化した分化細胞から、移植に使用可能な組織や臓器を設計
することができる。移植に使用されるこれらの細胞や組織は、患者と同じ核遺伝
子型を有するため、移植拒絶の問題や免疫抑制剤の使用に固有の危険を避けたり
低下させたりすることができるであろう。さらに作成された細胞や組織は、異種
ＤＮＡで容易に修飾でき、または有害な遺伝子が不活性化されるように、移植さ
れた細胞や組織が、必要であれば遺伝的に修正または改良されるように、修飾す
ることができるであろう。米国特許出願第 号（本発明と同じ出
願人のものであり、同時に出願された）は、ドナーの核ＤＮＡと受容者のミトコ
ンドリアＤＮＡの両方を遺伝的に修飾する方法を考察している（これは参照する
ことにより本明細書に組み込まれる）。
【０００８】
しかし最近、クローン化細胞の遺伝的年齢が問題になっている。クローン化ヒ
ツジであるドリイが関与するシールズ（Shiels）ら（Nature (1999) 399:316）
による最近の報告は、核移行はテロメアの長さを回復せず、胚、胎児および成体
の細胞からクローン化された動物中の末端制限断片（ＴＲＦ）のサイズは、移行
した核の致死性を反映することを示唆している。これらの知見の意味は、ヒト移
植のための代替細胞や組織のクローン化に特に関係がある（ランザ（Lanza）ら
（1999a） Nature Med. 5:975；ランザ（Lanza）ら（1999b） Nature Biotechno
l. 17:1171）。早期の老化を受ける移植臓器は、インビボで周りの組織に対して
破壊的となり、実際、代替細胞が治療しようとしている疾患を悪化させることが
ある。シールズ（Shiels）らはまた、核移行により作成された細胞が早期の老化
を受けるかどうか、および核移行により作成されたクローン化動物が、寿命の短
縮を示すかどうかについての問題を提示している。この報告以前は、別の世代が
繁殖する前に交配年齢に達する動物に依存する伝統的な育種法に対して、有利で
あると考えられてきた、高品質の農場動物のクローン化および再クローン化にと
って、これは重大な意味を有する。
ツジであるドリイが関与するシールズ（Shiels）ら（Nature (1999) 399:316）
による最近の報告は、核移行はテロメアの長さを回復せず、胚、胎児および成体
の細胞からクローン化された動物中の末端制限断片（ＴＲＦ）のサイズは、移行
した核の致死性を反映することを示唆している。これらの知見の意味は、ヒト移
植のための代替細胞や組織のクローン化に特に関係がある（ランザ（Lanza）ら
（1999a） Nature Med. 5:975；ランザ（Lanza）ら（1999b） Nature Biotechno
l. 17:1171）。早期の老化を受ける移植臓器は、インビボで周りの組織に対して
破壊的となり、実際、代替細胞が治療しようとしている疾患を悪化させることが
ある。シールズ（Shiels）らはまた、核移行により作成された細胞が早期の老化
を受けるかどうか、および核移行により作成されたクローン化動物が、寿命の短
縮を示すかどうかについての問題を提示している。この報告以前は、別の世代が
繁殖する前に交配年齢に達する動物に依存する伝統的な育種法に対して、有利で
あると考えられてきた、高品質の農場動物のクローン化および再クローン化にと
って、これは重大な意味を有する。
【０００９】
科学者達は、テロメアの喪失は、少なくとも２０年間の老化プロセスに関連し
ていると仮定している。ハーレイ（Harley）、「テロメアの喪失：分裂時計また
は遺伝子時限爆弾？」、Mutation Res. (1991) 256:271-282を参照されたい。元
々「マージノトミー（Marginotomy）理論」と呼ばれるこの仮説は、染色体の末
端（すなわちテロメア）が徐々に失なわれていくことにより、細胞サイクルの出
口に達し、その結果細胞の老化に至るというものである。オロブニコフ（Olovni
kov）、「マージノトミー（Marginotomy）の理論」、J. Theor. Biol. (1973) 4
1:181-190を参照されたい。この仮説は元々、ＤＮＡポリメラーゼが、ラギング
ストランド（lagging strand）の複製にＲＮＡプライマーを必要とするため、染
色体の末端を完全に複製することができないという予測から生まれた。この予測
は最終的に、ヒトの繊維芽細胞染色体の末端制限断片の平均長さが、インビトロ
で複製依存性に減少することを示した分子的研究により確認された。ハーレイ（
Harley）ら、「ヒトの繊維芽細胞の老化中にテロメアは短くなる」、Nature (19
90) 345:458-460を参照されたい。
ていると仮定している。ハーレイ（Harley）、「テロメアの喪失：分裂時計また
は遺伝子時限爆弾？」、Mutation Res. (1991) 256:271-282を参照されたい。元
々「マージノトミー（Marginotomy）理論」と呼ばれるこの仮説は、染色体の末
端（すなわちテロメア）が徐々に失なわれていくことにより、細胞サイクルの出
口に達し、その結果細胞の老化に至るというものである。オロブニコフ（Olovni
kov）、「マージノトミー（Marginotomy）の理論」、J. Theor. Biol. (1973) 4
1:181-190を参照されたい。この仮説は元々、ＤＮＡポリメラーゼが、ラギング
ストランド（lagging strand）の複製にＲＮＡプライマーを必要とするため、染
色体の末端を完全に複製することができないという予測から生まれた。この予測
は最終的に、ヒトの繊維芽細胞染色体の末端制限断片の平均長さが、インビトロ
で複製依存性に減少することを示した分子的研究により確認された。ハーレイ（
Harley）ら、「ヒトの繊維芽細胞の老化中にテロメアは短くなる」、Nature (19
90) 345:458-460を参照されたい。
【００１０】
テロメア理論を支持するさらなる証拠は、酵素テロメラーゼに関する。ヒト細
胞中のテロメラーゼ活性は、１９８９年に初めて同定された。モリン（Morin）
、「ヒトテロメア末端トランスフェラーゼは、ＴＴＡＧＧＧリピートを合成する
リボヌクレオタンパク質である」、Cell (1989) 59:521-529を参照されたい。テ
ロメラーゼは、染色体の末端で構築するように作用し、テロメアの長さを回復す
る。他の研究は、体細胞の分化中のテロメラーゼ活性は抑制されているが、生殖
細胞系の細胞の複製のいずれかの段階でテロメラーゼは活性であり、こうして世
代間の生殖細胞中のテロメアの長さを維持することを示した。さらにテロメラー
ゼはまた、形質転換細胞中で活性であることが証明されている。総説については
ハーレイ（Harley）(1991) を参照されたい。
胞中のテロメラーゼ活性は、１９８９年に初めて同定された。モリン（Morin）
、「ヒトテロメア末端トランスフェラーゼは、ＴＴＡＧＧＧリピートを合成する
リボヌクレオタンパク質である」、Cell (1989) 59:521-529を参照されたい。テ
ロメラーゼは、染色体の末端で構築するように作用し、テロメアの長さを回復す
る。他の研究は、体細胞の分化中のテロメラーゼ活性は抑制されているが、生殖
細胞系の細胞の複製のいずれかの段階でテロメラーゼは活性であり、こうして世
代間の生殖細胞中のテロメアの長さを維持することを示した。さらにテロメラー
ゼはまた、形質転換細胞中で活性であることが証明されている。総説については
ハーレイ（Harley）(1991) を参照されたい。
【００１１】
分化した細胞中のテロメラーゼの抑制は、癌のように体細胞がクローン的に無
制限に拡張する能力を制限するように機能していると考えられている。しかしあ
る腫瘍細胞系は、「ＡＬＴ」経路と呼ぶテロメラーゼ陰性の不死を示す。本発明
者らは、腫瘍形成におけるテロメラーゼ活性の獲得のように、この別の経路は生
殖細胞形質の再出現であると考えている。本発明者らは、傷害されたテロメアは
、テロメラーゼによるテロメアリピートの付加だけでなく、相同的鎖進入および
ＤＮＡポリメラーゼによる伸長によって、生殖細胞系中で修復されると考えてい
る。
制限に拡張する能力を制限するように機能していると考えられている。しかしあ
る腫瘍細胞系は、「ＡＬＴ」経路と呼ぶテロメラーゼ陰性の不死を示す。本発明
者らは、腫瘍形成におけるテロメラーゼ活性の獲得のように、この別の経路は生
殖細胞形質の再出現であると考えている。本発明者らは、傷害されたテロメアは
、テロメラーゼによるテロメアリピートの付加だけでなく、相同的鎖進入および
ＤＮＡポリメラーゼによる伸長によって、生殖細胞系中で修復されると考えてい
る。
【００１２】
【００１３】
核移行は、有性生殖をバイパスする（すなわち、核ＤＮＡの供給源として生殖
細胞ではなく体細胞を使用する）ため、クローン化に関する現在の仮説は、クロ
ーンのテロメアは決して再生されず、クローン化動物はその親と同じ「遺伝的年
齢」であるというものである。実際、核移行に使用される前の時間その技術が関
与していることが認められている。１９９９年５月２７日、木曜のＢＢＣニュー
ス、「ドリーは実際は高齢か？」を参照されたい。この理論が真実なら、クロー
ンからの細胞は、有性生殖で生まれた同年齢の動物より平均寿命がはるかに短い
ことを意味し、おそらく動物は、その親より短い寿命を有するかも知れない。
細胞ではなく体細胞を使用する）ため、クローン化に関する現在の仮説は、クロ
ーンのテロメアは決して再生されず、クローン化動物はその親と同じ「遺伝的年
齢」であるというものである。実際、核移行に使用される前の時間その技術が関
与していることが認められている。１９９９年５月２７日、木曜のＢＢＣニュー
ス、「ドリーは実際は高齢か？」を参照されたい。この理論が真実なら、クロー
ンからの細胞は、有性生殖で生まれた同年齢の動物より平均寿命がはるかに短い
ことを意味し、おそらく動物は、その親より短い寿命を有するかも知れない。
【００１４】
この理論は、臓器移植の分野で重大な意味を有するだけでなく、核移行に使用
される体細胞に行われる遺伝子操作の程度を問題としている。例えば核移行技術
の大きな利点は、体細胞が、胚幹細胞より容易に培養で維持され、トランス遺伝
子でトランスフェクトされるということである。この性質は、治療用タンパク質
を産生する動物（すなわち、例えばミルク中の治療用タンパク質の産生を可能に
する、乳腺特異的プロモーターからトランス遺伝子を発現するウシ）の作成を促
進する。同様に、核移行に使用される細胞が、老化した染色体のために一連の遺
伝子操作を受けることができないなら、複数回の遺伝子操作で動物、細胞および
組織を作成することが事実上不可能であろう。しかしそのような複雑な遺伝子操
作を行う能力は、そのような細胞が核移行および臓器移植に使用される前に、有
害な突然変異を有する患者のドナー細胞中の遺伝的異常を修正するのに必要かも
知れない。
される体細胞に行われる遺伝子操作の程度を問題としている。例えば核移行技術
の大きな利点は、体細胞が、胚幹細胞より容易に培養で維持され、トランス遺伝
子でトランスフェクトされるということである。この性質は、治療用タンパク質
を産生する動物（すなわち、例えばミルク中の治療用タンパク質の産生を可能に
する、乳腺特異的プロモーターからトランス遺伝子を発現するウシ）の作成を促
進する。同様に、核移行に使用される細胞が、老化した染色体のために一連の遺
伝子操作を受けることができないなら、複数回の遺伝子操作で動物、細胞および
組織を作成することが事実上不可能であろう。しかしそのような複雑な遺伝子操
作を行う能力は、そのような細胞が核移行および臓器移植に使用される前に、有
害な突然変異を有する患者のドナー細胞中の遺伝的異常を修正するのに必要かも
知れない。
【００１５】
一部の研究者が、核移行後にテロメアが再生されないことを観察したことを説
明する１つの仮説は、テロメア再生は、ドナーの体細胞の型の選択に依存するこ
とである。最近の研究は、テロメラーゼ活性の再構成により、テロメアが伸長さ
れ、正常なヒトの繊維芽細胞および網膜上皮細胞の不死化を引き起こした（ボド
ナー（Bodnar）ら、(1998) Science 279:349；バジリ（Vaziri）とベンチモル（
Benchimol）(1998) Curr. Biol. 8:279）が、乳腺上皮細胞を使用する同様の実
験は、テロメアの伸長を引き起こさず、複製性寿命を延長しないことを証明した
（キヨノ（Kiyono）ら(1998) Nature 396:84）。テロメラーゼがテロメアを伸長
させる能力と、培養に適用して活性化されるシグナル伝達経路とにおける細胞の
間の差が、この差を説明すると考えられている（デランゲ（De Lange）とデピン
ホ（DePinho）(1999) Science 283:947）。
明する１つの仮説は、テロメア再生は、ドナーの体細胞の型の選択に依存するこ
とである。最近の研究は、テロメラーゼ活性の再構成により、テロメアが伸長さ
れ、正常なヒトの繊維芽細胞および網膜上皮細胞の不死化を引き起こした（ボド
ナー（Bodnar）ら、(1998) Science 279:349；バジリ（Vaziri）とベンチモル（
Benchimol）(1998) Curr. Biol. 8:279）が、乳腺上皮細胞を使用する同様の実
験は、テロメアの伸長を引き起こさず、複製性寿命を延長しないことを証明した
（キヨノ（Kiyono）ら(1998) Nature 396:84）。テロメラーゼがテロメアを伸長
させる能力と、培養に適用して活性化されるシグナル伝達経路とにおける細胞の
間の差が、この差を説明すると考えられている（デランゲ（De Lange）とデピン
ホ（DePinho）(1999) Science 283:947）。
【００１６】
一部の研究者らは、テロメラーゼ活性は、細胞サイクル依存性であると示唆し
た。例えば１９９６年にヂオンネ（Dionne）は、休止期（Ｇo 期）のテロメラー
ゼコンピタントな細胞中のテロメラーゼ活性のダウンレギュレーションを報告し
、テロメラーゼ活性は、細胞サイクル依存性かも知れないと仮説を立てた。http
://telomeres,virtualave.net/regulation.htmlを参照されたい。同様にクルク
（Kruk）らは、細胞サイクルの他の時点と比較した時、早期Ｓ期で高レベルのテ
ロメラーゼを報告した（Biochem. Biophys. Res. Commun. (1997) 233:717-722
）。しかし他の研究者らは、矛盾する結果を結果を報告しており、テロメラーゼ
活性は、細胞サイクルではなく増殖速度に相関することを示唆した（ホルト（Ho
lt）ら、(1996) Mol. Cell. Biol. 16(6):2932-2939；またウェブサイト（同上
）のHolt, 1997 とBelair, 1997を参照されたい）。さらに別の研究者らは、Ｃ
Ｄ４Ｏ抗体／抗原受容体結合およびインターロイキン−４への暴露に対応して、
インビトロでＢ細胞中のテロメラーゼがアップレギュレートされることにより証
明されるように、テロメラーゼ活性化は、他の細胞性活性化シグナルにより仲介
されると考えている（ウェブサイト（同上）のウェング（Weng）, 1997；またヒ
ヤマ（Hiyama）ら、(1995) J. Immunol. 155(8):3711-3715）。しかし老化と細
胞の形質転換のプロセスにおけるテロメラーゼとその目的とする役割についての
興味が増しているにもかかわらず、テロメラーゼ活性の制御はあまり理解されて
いない。例えば、スマグリク（Smaglik）、「テロメラーゼについて：アンチセ
ンス方策が出現する中で、基本的な問題が残っている」、The Scientist, Janua
ry 18, 1999、 13(2):8）を参照されたい。
た。例えば１９９６年にヂオンネ（Dionne）は、休止期（Ｇo 期）のテロメラー
ゼコンピタントな細胞中のテロメラーゼ活性のダウンレギュレーションを報告し
、テロメラーゼ活性は、細胞サイクル依存性かも知れないと仮説を立てた。http
://telomeres,virtualave.net/regulation.htmlを参照されたい。同様にクルク
（Kruk）らは、細胞サイクルの他の時点と比較した時、早期Ｓ期で高レベルのテ
ロメラーゼを報告した（Biochem. Biophys. Res. Commun. (1997) 233:717-722
）。しかし他の研究者らは、矛盾する結果を結果を報告しており、テロメラーゼ
活性は、細胞サイクルではなく増殖速度に相関することを示唆した（ホルト（Ho
lt）ら、(1996) Mol. Cell. Biol. 16(6):2932-2939；またウェブサイト（同上
）のHolt, 1997 とBelair, 1997を参照されたい）。さらに別の研究者らは、Ｃ
Ｄ４Ｏ抗体／抗原受容体結合およびインターロイキン−４への暴露に対応して、
インビトロでＢ細胞中のテロメラーゼがアップレギュレートされることにより証
明されるように、テロメラーゼ活性化は、他の細胞性活性化シグナルにより仲介
されると考えている（ウェブサイト（同上）のウェング（Weng）, 1997；またヒ
ヤマ（Hiyama）ら、(1995) J. Immunol. 155(8):3711-3715）。しかし老化と細
胞の形質転換のプロセスにおけるテロメラーゼとその目的とする役割についての
興味が増しているにもかかわらず、テロメラーゼ活性の制御はあまり理解されて
いない。例えば、スマグリク（Smaglik）、「テロメラーゼについて：アンチセ
ンス方策が出現する中で、基本的な問題が残っている」、The Scientist, Janua
ry 18, 1999、 13(2):8）を参照されたい。
【００１７】
テロメラーゼ活性を制御する能力は、医学界に広範な影響を与え、クローン化
動物中のテロメアの再生よりも、多くの技術に大きな影響を与える可能性がある
。テロメラーゼを制御する能力を有することは、多くの年齢関連プロセスおよび
他の型の疾患プロセスの治療を可能にするであろう。例えばテロメラーゼを制御
する能力は、癌の化学療法に関連する骨髄移植の有効性の改善にとって重要であ
り、テロメラーゼ療法は、免疫系および目の網膜中の加齢で弱った細胞の交換、
血管の裏側を治療して心臓麻痺または卒中の防止、肝硬変の治療のために肝細胞
の、または筋ジストロフィーにおける筋芽細胞の、寿命の延長を助けるのに有用
であろう。さらに、テロメラーゼを制御する能力は、癌細胞の制御を可能にする
かも知れない。最後に、テロメアおよびテロメラーゼ制御のインビトロのモデル
、特に細胞老化の逆転のためのモデルは、テロメラーゼ制御、老化および癌の分
子機序を同定するための測定法やスクリーニングの設計を可能にするであろう。
従って、テロメラーゼの制御のさらなる理解は、組織工学および移植についてク
ローン化組織の有効性を確保する以外に、広範な治療につながり、クローン化と
非クローン化動物の寿命の、その結果としてのおよびさらなる延長が可能になる
であろう。
動物中のテロメアの再生よりも、多くの技術に大きな影響を与える可能性がある
。テロメラーゼを制御する能力を有することは、多くの年齢関連プロセスおよび
他の型の疾患プロセスの治療を可能にするであろう。例えばテロメラーゼを制御
する能力は、癌の化学療法に関連する骨髄移植の有効性の改善にとって重要であ
り、テロメラーゼ療法は、免疫系および目の網膜中の加齢で弱った細胞の交換、
血管の裏側を治療して心臓麻痺または卒中の防止、肝硬変の治療のために肝細胞
の、または筋ジストロフィーにおける筋芽細胞の、寿命の延長を助けるのに有用
であろう。さらに、テロメラーゼを制御する能力は、癌細胞の制御を可能にする
かも知れない。最後に、テロメアおよびテロメラーゼ制御のインビトロのモデル
、特に細胞老化の逆転のためのモデルは、テロメラーゼ制御、老化および癌の分
子機序を同定するための測定法やスクリーニングの設計を可能にするであろう。
従って、テロメラーゼの制御のさらなる理解は、組織工学および移植についてク
ローン化組織の有効性を確保する以外に、広範な治療につながり、クローン化と
非クローン化動物の寿命の、その結果としてのおよびさらなる延長が可能になる
であろう。
【００１８】
（発明の要約）
本発明は、核移行のプロセスは、老年期または老年期に近い細胞を若返らせ、
テロメア中のように一列に繰り返されるＤＮＡ配列を修復し、ＥＰＣ−１活性を
上昇させるようにおよび／または細胞寿命または細胞増殖能力を上昇させるよう
に、遺伝子発現の若いパターンを回復することができるという、クローン化哺乳
動物の遺伝的年齢についての最近の疑問を考慮すると驚くべき発見に基づく。従
って本発明は、核移行についての最近の疑問から可能とは思われなかったことを
可能にし、すなわち、老年期または老年期に近い細胞（例えば老年期に近づくま
で培養で増殖した細胞）、または年齢に関連した欠陥または症状を有するヒトま
たは動物から得られた細胞が、年齢の一致した対照に少なくとも匹敵するかまた
はより長いテロメアを有するクローン化細胞、組織および動物を作成するのに使
用できる。またこれらの細胞は、若い細胞の遺伝子発現パターン（例えば、ドナ
ー細胞に関連するＥＰＣ−１活性の上昇）を有する。さらに本発明は、最近示唆
されていることとは対照的に、クローンのクローンの作成（すなわち、「再クロ
ーン化」）を完全に可能にし、理論的には無限に繰り返すことができ、従って「
超若い」細胞、組織、臓器および動物を得ることを可能にする。
テロメア中のように一列に繰り返されるＤＮＡ配列を修復し、ＥＰＣ−１活性を
上昇させるようにおよび／または細胞寿命または細胞増殖能力を上昇させるよう
に、遺伝子発現の若いパターンを回復することができるという、クローン化哺乳
動物の遺伝的年齢についての最近の疑問を考慮すると驚くべき発見に基づく。従
って本発明は、核移行についての最近の疑問から可能とは思われなかったことを
可能にし、すなわち、老年期または老年期に近い細胞（例えば老年期に近づくま
で培養で増殖した細胞）、または年齢に関連した欠陥または症状を有するヒトま
たは動物から得られた細胞が、年齢の一致した対照に少なくとも匹敵するかまた
はより長いテロメアを有するクローン化細胞、組織および動物を作成するのに使
用できる。またこれらの細胞は、若い細胞の遺伝子発現パターン（例えば、ドナ
ー細胞に関連するＥＰＣ−１活性の上昇）を有する。さらに本発明は、最近示唆
されていることとは対照的に、クローンのクローンの作成（すなわち、「再クロ
ーン化」）を完全に可能にし、理論的には無限に繰り返すことができ、従って「
超若い」細胞、組織、臓器および動物を得ることを可能にする。
【００１９】
現在、テロメアの短縮は、２本鎖ブレークと区別不可能な染色体の末端を引き
起こ、ＤＮＡ傷害のチェックポイントとなると考えられている（ダブリュー・イ
ー・ライト（W.E. Wright）とジェイ・エス・シェイ（J.S. Shay）2000, Nat. M
ed. 6(8) 849-851）。
起こ、ＤＮＡ傷害のチェックポイントとなると考えられている（ダブリュー・イ
ー・ライト（W.E. Wright）とジェイ・エス・シェイ（J.S. Shay）2000, Nat. M
ed. 6(8) 849-851）。
【００２０】
【００２１】
しかしテロメアは、テロメアから動原体へと進む、増加する量の縮重または非
テロメア性繰り返しＤＮＡを含有する。
テロメア性繰り返しＤＮＡを含有する。
【００２２】
【００２３】
これらの非テロメア性繰り返し配列の出現は、一時的なＤＮＡ傷害チェックポ
イントを引き起こす。例えばエキソヌクレアーゼ活性により修復後、細胞は再度
細胞サイクルに入る。以後の核移行を伴う最終老年期への致死細胞の増殖は、自
然には必ずしも現れない均一なテロメア繰り返し配列の伸長した列の合成を引き
起こす。
イントを引き起こす。例えばエキソヌクレアーゼ活性により修復後、細胞は再度
細胞サイクルに入る。以後の核移行を伴う最終老年期への致死細胞の増殖は、自
然には必ずしも現れない均一なテロメア繰り返し配列の伸長した列の合成を引き
起こす。
【００２４】
【００２５】
そのような伸長した均一なテロメア繰り返しを有する染色体を含有する細胞お
よび／または動物は若返り、どの１つの時点よりＤＮＡ傷害チェックポイント中
の細胞が少ない細胞の大量集団として、超若いというユニークな特徴を有する。
よび／または動物は若返り、どの１つの時点よりＤＮＡ傷害チェックポイント中
の細胞が少ない細胞の大量集団として、超若いというユニークな特徴を有する。
【００２６】
本発明は、核移行技術は、内因性（細胞性）テロメラーゼ活性を活性化して、
体細胞（例えば老年期もしくは老年期に近い細胞またはチェックポイントで停止
した細胞）の寿命を延長し、かつ一列に繰り返されるＤＮＡ配列傷害の修復によ
り、遺伝子発現の若いパターンを伸長するのに使用できる、という発見に基づく
。これは、クローン化哺乳動物中のテロメア短縮を解決するためにクローン化テ
ロメアの外因性発現に注目する、核移行で作成された動物で見られるテロメアの
喪失を解決するための最近提唱されたアプローチに対して、特に利点を提供する
。
体細胞（例えば老年期もしくは老年期に近い細胞またはチェックポイントで停止
した細胞）の寿命を延長し、かつ一列に繰り返されるＤＮＡ配列傷害の修復によ
り、遺伝子発現の若いパターンを伸長するのに使用できる、という発見に基づく
。これは、クローン化哺乳動物中のテロメア短縮を解決するためにクローン化テ
ロメアの外因性発現に注目する、核移行で作成された動物で見られるテロメアの
喪失を解決するための最近提唱されたアプローチに対して、特に利点を提供する
。
【００２７】
この点で、最近ゲロンコーポレーション（Geron Corporation）とロスリン研
究所（Roslin Institute）の研究者らは協力して、ゲロン（Geron）のクローン
化テロメラーゼ遺伝子（ｈＴＥＲＴ）を核移行と組合せて、クローン中のテロメ
ア短縮を解決した。例えば、Business Wire, May 26, 1999を参照されたい。核
移行によりクローン化した２匹の他のヒツジ（ドリー後）もまた、年齢の一致し
た対照より短いテロメアを示すという、ロスリン研究所（Roslin Institute）の
研究者らによる５月２７日のNatureの報告より先行する。核移行が老年期ドナー
細胞を若返らせるようであるという観察にもかかわらず、ウシのクローン化に取
り組んでいるマサチュウーセッツ大学の研究者らはまた、ドナー細胞を外因性テ
ロメラーゼ遺伝子でトランスフェクトすることは、クローン化動物の寿命に有利
であると考えている。http://abcnews.go.com/sections/science/Daily News/cl
ones980522.html (1998)を参照されたい。
究所（Roslin Institute）の研究者らは協力して、ゲロン（Geron）のクローン
化テロメラーゼ遺伝子（ｈＴＥＲＴ）を核移行と組合せて、クローン中のテロメ
ア短縮を解決した。例えば、Business Wire, May 26, 1999を参照されたい。核
移行によりクローン化した２匹の他のヒツジ（ドリー後）もまた、年齢の一致し
た対照より短いテロメアを示すという、ロスリン研究所（Roslin Institute）の
研究者らによる５月２７日のNatureの報告より先行する。核移行が老年期ドナー
細胞を若返らせるようであるという観察にもかかわらず、ウシのクローン化に取
り組んでいるマサチュウーセッツ大学の研究者らはまた、ドナー細胞を外因性テ
ロメラーゼ遺伝子でトランスフェクトすることは、クローン化動物の寿命に有利
であると考えている。http://abcnews.go.com/sections/science/Daily News/cl
ones980522.html (1998)を参照されたい。
【００２８】
本発明は、クローン化された細胞、組織および動物でテロメラーゼを活性化し
テロメアの長さを再生するのに、遺伝子操作は必要ないという点で、トランスフ
ェクトされたテロメラーゼ遺伝子からテロメラーゼを発現する提唱された方法よ
り有利である。さらに本発明で達成されたテロメラーゼ活性のアップレギュレー
ションは一過性であり、テロメアの長さを伸長するのに充分ではあるが、構成的
不死性を付与するわけではない。テロメラーゼは多くの型の癌細胞で構成的にア
ップレギュレートされており、構成的テロメラーゼ発現は、プロト癌遺伝子ｃ−
ＭＹＣのアップレギュレーションを引き起こす（ディー・ビード（D. Bead）論
文）と報告されているという観察結果を考えると、この利点は特に重要である。
従ってテロメラーゼについて余分の遺伝子を導入することはまた、細胞の形質転
換を誘導する可能性を導入し、トランスフェクトされた遺伝子からのテロメラー
ゼ発現を制御することを目的とする以後の手段が必要となるであろう。従って、
細胞自身の制御機序を使用してテロメラーゼ活性が制御される方法は、テロメラ
ーゼ遺伝子の外因性コピーを挿入するのに好ましい。
テロメアの長さを再生するのに、遺伝子操作は必要ないという点で、トランスフ
ェクトされたテロメラーゼ遺伝子からテロメラーゼを発現する提唱された方法よ
り有利である。さらに本発明で達成されたテロメラーゼ活性のアップレギュレー
ションは一過性であり、テロメアの長さを伸長するのに充分ではあるが、構成的
不死性を付与するわけではない。テロメラーゼは多くの型の癌細胞で構成的にア
ップレギュレートされており、構成的テロメラーゼ発現は、プロト癌遺伝子ｃ−
ＭＹＣのアップレギュレーションを引き起こす（ディー・ビード（D. Bead）論
文）と報告されているという観察結果を考えると、この利点は特に重要である。
従ってテロメラーゼについて余分の遺伝子を導入することはまた、細胞の形質転
換を誘導する可能性を導入し、トランスフェクトされた遺伝子からのテロメラー
ゼ発現を制御することを目的とする以後の手段が必要となるであろう。従って、
細胞自身の制御機序を使用してテロメラーゼ活性が制御される方法は、テロメラ
ーゼ遺伝子の外因性コピーを挿入するのに好ましい。
【００２９】
さらに本発明は、体細胞を培養してテロメアを短縮し次に核移行でテロメラー
ゼを延長することは、若返り細胞の集団（そのすべては、テロメアリピートのよ
り均一な区画を有する）となる点で、テロメラーゼの外因性発現より有利である
。その結果、そのような集団から単離された個々の細胞は、延長増殖能がある可
能性が高く、集団は、チェックポイントで停止した細胞が天然の細胞より少ない
（従って「超若い」）というユニークな性質を有する。
ゼを延長することは、若返り細胞の集団（そのすべては、テロメアリピートのよ
り均一な区画を有する）となる点で、テロメラーゼの外因性発現より有利である
。その結果、そのような集団から単離された個々の細胞は、延長増殖能がある可
能性が高く、集団は、チェックポイントで停止した細胞が天然の細胞より少ない
（従って「超若い」）というユニークな性質を有する。
【００３０】
すなわち、核移行を使用して、正常な体細胞を若返らせるかまたはその寿命を
延長する方法が、本発明に包含される。開示された方法の利益を受ける体細胞に
は、任意の体細胞、例えば集団倍加で自然の限界に近づくことにより、または複
雑な遺伝的改変または条件（細胞を高酸素条件、またはテロメアＤＮＡを傷害す
る他の条件に暴露）のための厳しい選択条件の結果として、老年期に近い細胞が
ある。すでに考察したように、これは特に、年齢関連の欠陥または症状（例えば
、年齢関連の黄斑変性、免疫老化神経変性傷害（例えば、パーキンソン病または
アルツハイマー病）、骨関節炎、筋ジストロフィー、皮膚老化、肺気腫、動脈瘤
、冠動脈心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、白内障、成人期発症糖尿病
）を有する患者または動物からの細胞を含む。また本発明は、加速した細胞ター
ンオーバーに関連する症状（例えば、筋ジストロフィー、帯状ヘルペス、ＡＩＤ
Ｓ、および肝硬変）に応用できる。本方法は、目的の任意の体細胞、および核移
行のためのドナーとしてのそのような細胞の使用に応用できる。
延長する方法が、本発明に包含される。開示された方法の利益を受ける体細胞に
は、任意の体細胞、例えば集団倍加で自然の限界に近づくことにより、または複
雑な遺伝的改変または条件（細胞を高酸素条件、またはテロメアＤＮＡを傷害す
る他の条件に暴露）のための厳しい選択条件の結果として、老年期に近い細胞が
ある。すでに考察したように、これは特に、年齢関連の欠陥または症状（例えば
、年齢関連の黄斑変性、免疫老化神経変性傷害（例えば、パーキンソン病または
アルツハイマー病）、骨関節炎、筋ジストロフィー、皮膚老化、肺気腫、動脈瘤
、冠動脈心疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、白内障、成人期発症糖尿病
）を有する患者または動物からの細胞を含む。また本発明は、加速した細胞ター
ンオーバーに関連する症状（例えば、筋ジストロフィー、帯状ヘルペス、ＡＩＤ
Ｓ、および肝硬変）に応用できる。本方法は、目的の任意の体細胞、および核移
行のためのドナーとしてのそのような細胞の使用に応用できる。
【００３１】
本発明の方法は、後期継代の体細胞の核を胚状態に再プログラムすることを可
能にする。胚細胞を多くの型の細胞に分化させ成長させることにより、若返らせ
たまたは「若い」状態の目的の１次細胞を再単離することができる。また本発明
の方法は、すべての異なる細胞に分化する胚幹細胞の作成を含むため、細胞の成
長に影響を与えるように改変されていない限り、目的の１次細胞を使用してすべ
ての型の細胞を作成することができる。すなわち本発明は、異なる型の細胞中の
同質遺伝子バックグランド（すなわち、遺伝子ノックアウト、または異種遺伝子
の発現）で、インビトロで同じ遺伝子改変の影響を分析するための貴重な方法を
提供する。
能にする。胚細胞を多くの型の細胞に分化させ成長させることにより、若返らせ
たまたは「若い」状態の目的の１次細胞を再単離することができる。また本発明
の方法は、すべての異なる細胞に分化する胚幹細胞の作成を含むため、細胞の成
長に影響を与えるように改変されていない限り、目的の１次細胞を使用してすべ
ての型の細胞を作成することができる。すなわち本発明は、異なる型の細胞中の
同質遺伝子バックグランド（すなわち、遺伝子ノックアウト、または異種遺伝子
の発現）で、インビトロで同じ遺伝子改変の影響を分析するための貴重な方法を
提供する。
【００３２】
例えば、患者の体細胞はＮＴ関連技術により再プログラムされ、再生され、全
能性が回復される。若返った全能性細胞から、プレ間充織細胞、間充織細胞、エ
ナンギオブラスト（enangioblast）、造血幹細胞のような多能性幹細胞が得られ
る。これらの多能性細胞またはそこから得られる細胞はドナーに移植でき、ここ
でこれらの細胞は、患者の組織に、健康で増殖可能な細胞（免疫細胞、血液細胞
、骨、筋肉、神経など）を「植え付ける」であろう。
能性が回復される。若返った全能性細胞から、プレ間充織細胞、間充織細胞、エ
ナンギオブラスト（enangioblast）、造血幹細胞のような多能性幹細胞が得られ
る。これらの多能性細胞またはそこから得られる細胞はドナーに移植でき、ここ
でこれらの細胞は、患者の組織に、健康で増殖可能な細胞（免疫細胞、血液細胞
、骨、筋肉、神経など）を「植え付ける」であろう。
【００３３】
本発明の方法はまた、例えば若返りの必要な所望の細胞（好ましくは哺乳動物
細胞、さらに好ましくはヒト細胞）の寿命を、該細胞、そこから得られる核また
は染色体を核移行ドナーとして使用して、延長する。好ましくはこのプロセスは
、生じるクローン化胚から得られる細胞、核または染色体自身が核移行ドナーと
して使用されるという意味で、繰り返される。またドナー細胞は、好ましくはト
ランスジェニックである。
細胞、さらに好ましくはヒト細胞）の寿命を、該細胞、そこから得られる核また
は染色体を核移行ドナーとして使用して、延長する。好ましくはこのプロセスは
、生じるクローン化胚から得られる細胞、核または染色体自身が核移行ドナーと
して使用されるという意味で、繰り返される。またドナー細胞は、好ましくはト
ランスジェニックである。
【００３４】
本発明の方法はさらに、核移行中に細胞、そこから得られる核または染色体自
身を核移行ドナーとして使用して、またはそのような細胞のＤＮＡを胚の型の細
胞に暴露して、所望の細胞中で反復性ＤＮＡを回復し、所望の細胞（例えば、若
返りの必要な哺乳動物細胞、およびチェックポイントで停止した細胞）中でテロ
メラーゼを含む老化に関与する遺伝子を活性化または調節（発現を低下または上
昇）することを可能にする。後に詳述するように、本発明は、細胞の老化に関与
し、細胞の寿命を制御する具体的な分子を同定するための手段を提供するため、
すばらしい発見である。具体的には本発明は、テロメアのような反復性ＤＮＡを
回復し、細胞の老化の過程で改変された遺伝子を活性化または阻害する化合物（
例えば、テロメラーゼ、ｇａｓ、ｔＰＡなど）を同定するための測定法を提供す
る。
身を核移行ドナーとして使用して、またはそのような細胞のＤＮＡを胚の型の細
胞に暴露して、所望の細胞中で反復性ＤＮＡを回復し、所望の細胞（例えば、若
返りの必要な哺乳動物細胞、およびチェックポイントで停止した細胞）中でテロ
メラーゼを含む老化に関与する遺伝子を活性化または調節（発現を低下または上
昇）することを可能にする。後に詳述するように、本発明は、細胞の老化に関与
し、細胞の寿命を制御する具体的な分子を同定するための手段を提供するため、
すばらしい発見である。具体的には本発明は、テロメアのような反復性ＤＮＡを
回復し、細胞の老化の過程で改変された遺伝子を活性化または阻害する化合物（
例えば、テロメラーゼ、ｇａｓ、ｔＰＡなど）を同定するための測定法を提供す
る。
【００３５】
核移行は、哺乳動物細胞（例えば、老年期のまたは老年期に近い細胞）を若返
らせるかまたはその寿命を延長するのに使用されるという本発明者の知見を考え
ると、クローン化哺乳動物、胎児、奇形腫、または胚、または内部細胞マスまた
は芽球がその親の遺伝年齢であることを、もう心配する必要は無い。すなわち本
発明はまた、核移行法を使用して、クローン化哺乳動物、胎児、奇形腫、または
胚などを再クローン化する方法を包含する。そのような再クローン化法は、２つ
以上の異種遺伝子を発現するかまたは２つ以上の遺伝子がノックアウトされたト
ランスジェニック哺乳動物を作成するのに、特に有用である。それは、そのよう
な動物は、同じ遺伝的バックグランドを有するクローン化および再クローン化し
た哺乳動物を作成するためのクローン化法により作成できるためである。そのよ
うな方法は、しばしば他の遺伝的差を引き起こし、ゲノム上で密接に関連してお
り一緒に遺伝される改変遺伝子を有する２重ノックアウトまたは２重トランスジ
ェニック哺乳動物を得ることが不可能な交配または育種の、必要が無い。
らせるかまたはその寿命を延長するのに使用されるという本発明者の知見を考え
ると、クローン化哺乳動物、胎児、奇形腫、または胚、または内部細胞マスまた
は芽球がその親の遺伝年齢であることを、もう心配する必要は無い。すなわち本
発明はまた、核移行法を使用して、クローン化哺乳動物、胎児、奇形腫、または
胚などを再クローン化する方法を包含する。そのような再クローン化法は、２つ
以上の異種遺伝子を発現するかまたは２つ以上の遺伝子がノックアウトされたト
ランスジェニック哺乳動物を作成するのに、特に有用である。それは、そのよう
な動物は、同じ遺伝的バックグランドを有するクローン化および再クローン化し
た哺乳動物を作成するためのクローン化法により作成できるためである。そのよ
うな方法は、しばしば他の遺伝的差を引き起こし、ゲノム上で密接に関連してお
り一緒に遺伝される改変遺伝子を有する２重ノックアウトまたは２重トランスジ
ェニック哺乳動物を得ることが不可能な交配または育種の、必要が無い。
【００３６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、正常な体細胞を若返らせる方法を含む。「正常な体」細胞とは、体
細胞系統に運命付けられている細胞で、発癌性ではなく形質転換されておらず、
再プログラミングが可能であり、かつ該細胞またはそのような細胞の核もしくは
該細胞の染色体が有核卵母細胞に移行された時、または生殖細胞中に存在する因
子に暴露された時、胚の成長を促進することができる細胞を意味する。正常な体
細胞は、遺伝的に修飾されてもされていなくてもよい。本発明において「若返っ
た」とは、以下の少なくとも１つを意味する：該体細胞について残っている集団
倍加の可能な数が増加する、ＥＰＣ−１活性または細胞老化の他のマーカーが、
若い状態に逆転する；テロメラーゼがアップレギュレートされる、および／また
はテロメラーゼが増加する。「超若い（hyper-young）」とは、細胞集団が、正
常細胞より若い細胞加齢のマーカーを有することを意味する。「テロトーマ（te
rotoma）」とは、全能性細胞から生じる中胚葉、内胚葉、または外胚葉の誘導体
を含有する分化した細胞群を意味する。
細胞系統に運命付けられている細胞で、発癌性ではなく形質転換されておらず、
再プログラミングが可能であり、かつ該細胞またはそのような細胞の核もしくは
該細胞の染色体が有核卵母細胞に移行された時、または生殖細胞中に存在する因
子に暴露された時、胚の成長を促進することができる細胞を意味する。正常な体
細胞は、遺伝的に修飾されてもされていなくてもよい。本発明において「若返っ
た」とは、以下の少なくとも１つを意味する：該体細胞について残っている集団
倍加の可能な数が増加する、ＥＰＣ−１活性または細胞老化の他のマーカーが、
若い状態に逆転する；テロメラーゼがアップレギュレートされる、および／また
はテロメラーゼが増加する。「超若い（hyper-young）」とは、細胞集団が、正
常細胞より若い細胞加齢のマーカーを有することを意味する。「テロトーマ（te
rotoma）」とは、全能性細胞から生じる中胚葉、内胚葉、または外胚葉の誘導体
を含有する分化した細胞群を意味する。
【００３７】
本発明の好適な実施態様において、本発明で使用される正常な体細胞は、老年
期細胞、チェックポイントで停止した細胞、または老年期に近い細胞である。し
かし本方法は、任意の所望の正常な体細胞、好ましくはヒト細胞に適用し得る。
複製性老年期は、若い細胞の血清飢餓または増殖の密度依存性阻害により達成さ
れる静止期から区別される生理学的状態（ウェスト（West）ら（1989）Exp. Cel
l Res. 184:138；ウェスト（West）ら（1996）Exp. Gerontol. 31:175；および
ピグノロ（Pignolo）ら(1998) Exp. Gerontol. 33:67）であり、細胞サイクル中
のＧ1 ／Ｓ境界近くの後期Ｇ1 のブロックを含むようである（クリストファロ（
Cristofalo）とピグノロ（Pignolo）Exo. (1996) Gerontol. 31:111；ゴーマン
（Gorman）とクリストファロ（Cristofalo）Exp. Cell Res. 167:87；およびク
リストファロ（Cristofalo）ら(1992) Aging and Cellular Defense Mechanisms
, フランセシ（Franceshi）ら編（New York Academy of Sciences、ニューヨー
ク）、187-194頁）。
期細胞、チェックポイントで停止した細胞、または老年期に近い細胞である。し
かし本方法は、任意の所望の正常な体細胞、好ましくはヒト細胞に適用し得る。
複製性老年期は、若い細胞の血清飢餓または増殖の密度依存性阻害により達成さ
れる静止期から区別される生理学的状態（ウェスト（West）ら（1989）Exp. Cel
l Res. 184:138；ウェスト（West）ら（1996）Exp. Gerontol. 31:175；および
ピグノロ（Pignolo）ら(1998) Exp. Gerontol. 33:67）であり、細胞サイクル中
のＧ1 ／Ｓ境界近くの後期Ｇ1 のブロックを含むようである（クリストファロ（
Cristofalo）とピグノロ（Pignolo）Exo. (1996) Gerontol. 31:111；ゴーマン
（Gorman）とクリストファロ（Cristofalo）Exp. Cell Res. 167:87；およびク
リストファロ（Cristofalo）ら(1992) Aging and Cellular Defense Mechanisms
, フランセシ（Franceshi）ら編（New York Academy of Sciences、ニューヨー
ク）、187-194頁）。
【００３８】
老年期細胞は、当該分野で公知の種々の手段により同定される。例えば、位相
差光学顕微鏡、および電子顕微鏡による微細構造解析を使用して、繊維芽細胞反
復性老年期の特徴（若い細胞と比較して、顕著で活性なゴルジ装置、増加し陥入
したおよび葉のある核、大きなリソソーム体、および細胞質小繊維の増加）（リ
ペッツ（Lipetz）とクリストファロ（Cristofalo）(1972) J. Ultrastruct. Res
. 39:43）が証明される。さらに老年期細胞は、 3Ｈ−チミジンの取り込みで測
定すると、Ｓ期にはいる能力が低下しており、老年期関連ベータガラクトシダー
ゼの染色が有意に増加している（ジー・ピー・ジムリ（G.P. Dimri）ら(1995) P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9363）。老年期細胞はまた、早期継代細胞と比
較してＥＰＣ−１（早期集団倍加レベルｃＤＮＡ−１）（ピグノロ（Pignolo）
ら(1993) J. Biol. Chem. 268:8949）ｍＲＮＡレベルの低下と、静止期細胞（コ
ウレッド（Cowled）ら(1994) Exp. Cell Res. 211:197-202）と比較してｇａｓ
Ｉ遺伝子発現のダウンレギュレーションを示す。
差光学顕微鏡、および電子顕微鏡による微細構造解析を使用して、繊維芽細胞反
復性老年期の特徴（若い細胞と比較して、顕著で活性なゴルジ装置、増加し陥入
したおよび葉のある核、大きなリソソーム体、および細胞質小繊維の増加）（リ
ペッツ（Lipetz）とクリストファロ（Cristofalo）(1972) J. Ultrastruct. Res
. 39:43）が証明される。さらに老年期細胞は、 3Ｈ−チミジンの取り込みで測
定すると、Ｓ期にはいる能力が低下しており、老年期関連ベータガラクトシダー
ゼの染色が有意に増加している（ジー・ピー・ジムリ（G.P. Dimri）ら(1995) P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9363）。老年期細胞はまた、早期継代細胞と比
較してＥＰＣ−１（早期集団倍加レベルｃＤＮＡ−１）（ピグノロ（Pignolo）
ら(1993) J. Biol. Chem. 268:8949）ｍＲＮＡレベルの低下と、静止期細胞（コ
ウレッド（Cowled）ら(1994) Exp. Cell Res. 211:197-202）と比較してｇａｓ
Ｉ遺伝子発現のダウンレギュレーションを示す。
【００３９】
老年期細胞は、不可逆的増殖停止の状態まで細胞を増殖させることにより単離
することができる。本発明において「老年期に近い」とは、そのような細胞は、
複製性老年期から約３〜６回以下、しかし好ましくは２または３集団倍加未満の
分裂能力を有することを意味する。核移行のための老年期細胞を作成する好適な
手段は、正常な体細胞をその寿命の約９０〜９５％以上が完了するまで継代する
ことであるが、老年期および老年期様状態はまた、細胞を遺伝毒性物質およびＣ
ｄｋインヒビター（マコネル（McConnell）ら(1998) Current Biol. 8:351-354
）を含む種々の物質に暴露することによっても誘導することができる。遺伝毒性
物質は、老年期に似ており、ＤＮＡ傷害チェックポイントで停止と呼ぶ静止期と
は区別される、増殖停止を誘導する。あるいは老年期に近い細胞は、例えば老化
関連症状を有する動物またはヒトから得ることができる。
することができる。本発明において「老年期に近い」とは、そのような細胞は、
複製性老年期から約３〜６回以下、しかし好ましくは２または３集団倍加未満の
分裂能力を有することを意味する。核移行のための老年期細胞を作成する好適な
手段は、正常な体細胞をその寿命の約９０〜９５％以上が完了するまで継代する
ことであるが、老年期および老年期様状態はまた、細胞を遺伝毒性物質およびＣ
ｄｋインヒビター（マコネル（McConnell）ら(1998) Current Biol. 8:351-354
）を含む種々の物質に暴露することによっても誘導することができる。遺伝毒性
物質は、老年期に似ており、ＤＮＡ傷害チェックポイントで停止と呼ぶ静止期と
は区別される、増殖停止を誘導する。あるいは老年期に近い細胞は、例えば老化
関連症状を有する動物またはヒトから得ることができる。
【００４０】
本発明の方法は、クローン化動物を作成するために細胞若返りを使用するか、
または目的の正常な体細胞を他の目的のために若返らせるために使用する。その
ような方法には、以下を含む：
または目的の正常な体細胞を他の目的のために若返らせるために使用する。その
ような方法には、以下を含む：
【００４１】
ａ．体細胞、該体細胞からの核、または該体細胞からの染色体を、受容体であ
る卵母細胞または卵または他の適当な受容体細胞に移行させて、胚を作成する； ｂ．少なくとも１つの細胞を有する胚、該胚を使用して内部細胞マス、胚盤お
よび／または幹細胞を得る； ｃ．胚、内部細胞マス、胚盤および／または幹細胞を、所望の細胞または組織
型に分化させる； ｄ．生じる細胞または組織を単離する； ｅ．該細胞または組織を患者に移植する。
る卵母細胞または卵または他の適当な受容体細胞に移行させて、胚を作成する； ｂ．少なくとも１つの細胞を有する胚、該胚を使用して内部細胞マス、胚盤お
よび／または幹細胞を得る； ｃ．胚、内部細胞マス、胚盤および／または幹細胞を、所望の細胞または組織
型に分化させる； ｄ．生じる細胞または組織を単離する； ｅ．該細胞または組織を患者に移植する。
【００４２】
本発明に従って単離された分化した細胞奇形腫、内部細胞マス、胚盤、および
胚幹細胞は、ドナーである正常な体細胞の長さより長くはなくても、少なくとも
それと同等の長さを有し、これはまた本発明の１側面である。またこれらの分化
細胞は、若いかまたは超若い細胞老化のマーカー有するはずである。分化した細
胞または組織、奇形腫細胞、内部マス細胞、胚盤胞細胞、または胚細胞が、以後
の核ドナーとして使用される方法も、包含される。そのような方法は、複数のト
ランス遺伝子または遺伝的改変を有する正常な体細胞、奇形腫、ＥＳ細胞などを
単離するのに特に適しており、所望の数の遺伝的変化が達成されるまで無限に繰
り返すことができる。
胚幹細胞は、ドナーである正常な体細胞の長さより長くはなくても、少なくとも
それと同等の長さを有し、これはまた本発明の１側面である。またこれらの分化
細胞は、若いかまたは超若い細胞老化のマーカー有するはずである。分化した細
胞または組織、奇形腫細胞、内部マス細胞、胚盤胞細胞、または胚細胞が、以後
の核ドナーとして使用される方法も、包含される。そのような方法は、複数のト
ランス遺伝子または遺伝的改変を有する正常な体細胞、奇形腫、ＥＳ細胞などを
単離するのに特に適しており、所望の数の遺伝的変化が達成されるまで無限に繰
り返すことができる。
【００４３】
本発明の方法で使用される正常な体細胞は、任意の型の細胞である。適当な細
胞には、例えば免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞）、樹状細胞、皮膚細胞（例
えば、ケラチン細胞、上皮細胞）、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、心臓細胞、
食道細胞、皮膚繊維芽細胞、種々の臓器の細胞（肝臓、胃、小腸、肺、膵臓、角
膜、皮膚、膀胱、卵巣、睾丸、他の生殖系臓器、腎臓などを含む）がある。一般
に、最も適した細胞は、組織培養で容易に増殖でき、容易にトランスフェクショ
ンできるものである。好ましくは異種ＤＮＡをトランスフェクトし核移行を行う
ための細胞型は、繊維芽細胞である。
胞には、例えば免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞）、樹状細胞、皮膚細胞（例
えば、ケラチン細胞、上皮細胞）、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、心臓細胞、
食道細胞、皮膚繊維芽細胞、種々の臓器の細胞（肝臓、胃、小腸、肺、膵臓、角
膜、皮膚、膀胱、卵巣、睾丸、他の生殖系臓器、腎臓などを含む）がある。一般
に、最も適した細胞は、組織培養で容易に増殖でき、容易にトランスフェクショ
ンできるものである。好ましくは異種ＤＮＡをトランスフェクトし核移行を行う
ための細胞型は、繊維芽細胞である。
【００４４】
核移行を行うための方法とプロトコールは、米国特許第５，９４５，５７７号
；１９９７年７月３日に出願された米国特許出願０８／８８８，０５７号；１９
９７年７月３日に出願された米国特許出願０８／８８８，２８３号；１９９７年
９月２２日に出願された米国特許出願０８／９３５，０５２号；および１９９９
年９月１３日に出願された米国特許出願０９／３９４，９０２号（これらのすべ
ての特許と出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に
開示されている。
；１９９７年７月３日に出願された米国特許出願０８／８８８，０５７号；１９
９７年７月３日に出願された米国特許出願０８／８８８，２８３号；１９９７年
９月２２日に出願された米国特許出願０８／９３５，０５２号；および１９９９
年９月１３日に出願された米国特許出願０９／３９４，９０２号（これらのすべ
ての特許と出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に
開示されている。
【００４５】
体細胞は、任意の型の動物または哺乳動物でよく、例えばブタ、ヤギ、ネコ、
イヌ、ラット、マウス、ウシ、バファロー、ヒツジ、ウマ、ヒト、非ヒト霊長類
であるが、好ましくは有蹄動物の細胞、および最も好ましくはウシの細胞である
。核移行に使用される卵母細胞または卵は、同様の供給源からであり、ドナー細
胞またはＤＮＡと同じかまたは異なる種でもよい。
イヌ、ラット、マウス、ウシ、バファロー、ヒツジ、ウマ、ヒト、非ヒト霊長類
であるが、好ましくは有蹄動物の細胞、および最も好ましくはウシの細胞である
。核移行に使用される卵母細胞または卵は、同様の供給源からであり、ドナー細
胞またはＤＮＡと同じかまたは異なる種でもよい。
【００４６】
免疫能低下動物は、奇形腫形成を支持することができる任意の動物であり、成
長している奇形腫の拒絶が起きない程度に免疫能が低下している。例えば、免疫
能低下動物は、ＳＣＩＤマウスまたはヌードマウスでもよい。あるいは細胞は、
インビボで分化しているかまたは鳥類の卵中のものでもよい。
長している奇形腫の拒絶が起きない程度に免疫能が低下している。例えば、免疫
能低下動物は、ＳＣＩＤマウスまたはヌードマウスでもよい。あるいは細胞は、
インビボで分化しているかまたは鳥類の卵中のものでもよい。
【００４７】
本方法は、複雑なまたは複合操作を有する体細胞（すなわち、２つ以上のトラ
ンスフェクトされた異種遺伝子および／または遺伝子ノックアウトを有し、すべ
ての所望の遺伝的改変に影響を与えるのに充分な期間培養物中で体細胞を維持す
ることが困難かも知れない）を単離するのに特に有用である。まず、体細胞（好
ましくは、核移行により超若くなったもの）は、遺伝子ターゲティングの基質と
して使用される。すなわち体細胞は、まず遺伝子操作を受け、次に本発明の方法
に従って若返らせられ、次にいったん遺伝時計が「リセット」されると、第２の
遺伝子操作を受ける。従って本発明の若返った体細胞は、遺伝子操作の複雑さと
若返りプロセスを受けた回数に依存して、ゲノムに少なくとも１つの改変を有し
てもよい。本発明の方法により作成される若返らせた遺伝子改変を受けた細胞も
また包含される。
ンスフェクトされた異種遺伝子および／または遺伝子ノックアウトを有し、すべ
ての所望の遺伝的改変に影響を与えるのに充分な期間培養物中で体細胞を維持す
ることが困難かも知れない）を単離するのに特に有用である。まず、体細胞（好
ましくは、核移行により超若くなったもの）は、遺伝子ターゲティングの基質と
して使用される。すなわち体細胞は、まず遺伝子操作を受け、次に本発明の方法
に従って若返らせられ、次にいったん遺伝時計が「リセット」されると、第２の
遺伝子操作を受ける。従って本発明の若返った体細胞は、遺伝子操作の複雑さと
若返りプロセスを受けた回数に依存して、ゲノムに少なくとも１つの改変を有し
てもよい。本発明の方法により作成される若返らせた遺伝子改変を受けた細胞も
また包含される。
【００４８】
本発明はまた、異なる型の細胞である第１の細胞と同じ遺伝子型を有する体細
胞を作成する方法を含む。そのような方法は、若返りのプロセスにより可能であ
り、これは、第１の体細胞、第１の１次細胞の核、または第１の１次細胞の染色
体を、有核受容体卵母細胞または他の適当な受容体細胞に移行させるか、または
体細胞に卵母細胞中のタンパク質を接触させて、奇形腫または他の分化細胞のマ
ス（これは、外胚葉、中胚葉、内胚葉の任意の誘導体を含む）を作成することに
より行われる。受精直後の有核卵もまた使用される。すなわち事実上任意の型の
細胞が奇形腫または奇形腫の細胞から単離されて、成長して分化する。目的の特
定の細胞型にユニークな具体的な細胞マーカーは、当該分野で公知であり、クロ
ーン化した１次細胞を同定するのに使用される。
胞を作成する方法を含む。そのような方法は、若返りのプロセスにより可能であ
り、これは、第１の体細胞、第１の１次細胞の核、または第１の１次細胞の染色
体を、有核受容体卵母細胞または他の適当な受容体細胞に移行させるか、または
体細胞に卵母細胞中のタンパク質を接触させて、奇形腫または他の分化細胞のマ
ス（これは、外胚葉、中胚葉、内胚葉の任意の誘導体を含む）を作成することに
より行われる。受精直後の有核卵もまた使用される。すなわち事実上任意の型の
細胞が奇形腫または奇形腫の細胞から単離されて、成長して分化する。目的の特
定の細胞型にユニークな具体的な細胞マーカーは、当該分野で公知であり、クロ
ーン化した１次細胞を同定するのに使用される。
【００４９】
一般に、核移行に使用した細胞と異なる型の体細胞の作成法は、以下を含む：
ａ．第１の細胞、該第１細胞の核、または第１細胞の染色体を、受容体卵母細
胞または卵または他の適当な受容体細胞に移行させて、胚を作成する； ｂ．該胚を使用して、少なくとも１つの細胞、内部細胞マス、胚盤および／ま
たは幹細胞を有する胚を得る； ｃ．該内部細胞マス、胚盤および／または幹細胞を、免疫能低下動物の組織培
養または鳥類の卵中に注入して、奇形腫を生成する； ｄ．生じる奇形腫を単離する； ｅ．特定の細胞型を同定するために、異なる胚葉を分離する； ｆ．第１の細胞とは異なる型の細胞を単離する。
胞または卵または他の適当な受容体細胞に移行させて、胚を作成する； ｂ．該胚を使用して、少なくとも１つの細胞、内部細胞マス、胚盤および／ま
たは幹細胞を有する胚を得る； ｃ．該内部細胞マス、胚盤および／または幹細胞を、免疫能低下動物の組織培
養または鳥類の卵中に注入して、奇形腫を生成する； ｄ．生じる奇形腫を単離する； ｅ．特定の細胞型を同定するために、異なる胚葉を分離する； ｆ．第１の細胞とは異なる型の細胞を単離する。
【００５０】
ドナー細胞、核または染色体がヒトである実施態様において、１次細胞のゲノ
ムは、細胞が生存活性のある胚を産生できないように修飾される。これは、３つ
の胚葉の１つの形成に必要な１つ以上の遺伝子を不活性化またはノックアウトす
るか、または目的ではない胚葉中に含有される型の細胞で特異的に発現される成
長により制御されるプロモーターから、「自殺」遺伝子を発現することにより行
われる。あるいは、遺伝子ノックアウトまたは自殺遺伝子発現を、哺乳動物の子
宮中で付着または成長するのに具体的に必要な遺伝子にターゲティングしてもよ
い。
ムは、細胞が生存活性のある胚を産生できないように修飾される。これは、３つ
の胚葉の１つの形成に必要な１つ以上の遺伝子を不活性化またはノックアウトす
るか、または目的ではない胚葉中に含有される型の細胞で特異的に発現される成
長により制御されるプロモーターから、「自殺」遺伝子を発現することにより行
われる。あるいは、遺伝子ノックアウトまたは自殺遺伝子発現を、哺乳動物の子
宮中で付着または成長するのに具体的に必要な遺伝子にターゲティングしてもよ
い。
【００５１】
前述のように、好ましくは第１の（核ドナー）細胞は繊維芽細胞である。本方
法は、任意の種の細胞を使用して形成され、移植のためのクローン化臓器および
組織の作成において、ヒトの治療的クローン化において特に有用である。すなわ
ち本方法は、ヒト細胞を使用して行われ、単離される１次細胞を使用して組織が
作成される（移植の必要な患者への移植のために）。
法は、任意の種の細胞を使用して形成され、移植のためのクローン化臓器および
組織の作成において、ヒトの治療的クローン化において特に有用である。すなわ
ち本方法は、ヒト細胞を使用して行われ、単離される１次細胞を使用して組織が
作成される（移植の必要な患者への移植のために）。
【００５２】
開示された方法により作成される１次細胞の好適な型は、ニューロン、骨格筋
原細胞、心臓筋肉、皮膚膵臓β細胞、内皮細胞、造血細胞、皮膚細胞、毛包細胞
、腎臓細胞、および神経細胞である。本方法はさらに、奇形腫から細胞を単離し
、該細胞を増殖因子の存在下で増殖させて、さらなる分化を促進することを含む
。特に、第１の細胞のゲノムは核移行の前に改変され、そして新しい１次細胞と
作成した組織が、少なくとも１つの治療用タンパク質を発現するか、またはドナ
ー患者に有害かも知れない未変性のタンパク質を発現しないようにされる。開示
された方法により作成された細胞と組織もまた包含される。
原細胞、心臓筋肉、皮膚膵臓β細胞、内皮細胞、造血細胞、皮膚細胞、毛包細胞
、腎臓細胞、および神経細胞である。本方法はさらに、奇形腫から細胞を単離し
、該細胞を増殖因子の存在下で増殖させて、さらなる分化を促進することを含む
。特に、第１の細胞のゲノムは核移行の前に改変され、そして新しい１次細胞と
作成した組織が、少なくとも１つの治療用タンパク質を発現するか、またはドナ
ー患者に有害かも知れない未変性のタンパク質を発現しないようにされる。開示
された方法により作成された細胞と組織もまた包含される。
【００５３】
本明細書に開示の方法により作成される細胞と組織の好適な応用は、ニューロ
ン、膵島細胞、肝細胞、心筋細胞、造血細胞、および他の所望の分化細胞型およ
び組織の産生を含む。
ン、膵島細胞、肝細胞、心筋細胞、造血細胞、および他の所望の分化細胞型およ
び組織の産生を含む。
【００５４】
これらの細胞および組織（これは、随時トランスジェニックでもよい）は、細
胞、組織および臓器移植に使用してもく、例えば、バムス（bums）、毛移植、癌
、慢性疼痛、糖尿病、こびと症、てんかん、心臓疾患（例えば、心筋梗塞）、血
友病、不妊症、腎臓疾患、肝臓疾患、骨関節炎、骨粗鬆症、卒中、情動障害、ア
ルツハイマー病、酵素欠損、ハンチントン病、低コレステロール血症、副甲状腺
機能低下症、免疫不全、ルーゲーリッグ病、黄斑変性、多発性硬化症、筋ジスト
ロフィー、パーキンソン病、リウマチ様関節炎、脊髄傷害、および他の外傷の治
療に使用される。
胞、組織および臓器移植に使用してもく、例えば、バムス（bums）、毛移植、癌
、慢性疼痛、糖尿病、こびと症、てんかん、心臓疾患（例えば、心筋梗塞）、血
友病、不妊症、腎臓疾患、肝臓疾患、骨関節炎、骨粗鬆症、卒中、情動障害、ア
ルツハイマー病、酵素欠損、ハンチントン病、低コレステロール血症、副甲状腺
機能低下症、免疫不全、ルーゲーリッグ病、黄斑変性、多発性硬化症、筋ジスト
ロフィー、パーキンソン病、リウマチ様関節炎、脊髄傷害、および他の外傷の治
療に使用される。
【００５５】
核移行法は、クローン化哺乳動物の作成ならびにクローン化細胞および組織の
作成に有用であるため、本発明の方法はまた、複雑なまたは複合遺伝子改変を有
するクローン化哺乳動物の作成にも有用である。さらに本発明は、若いまたはさ
らに好ましくは超若い動物を産生するのに有用である。特に本発明は、クローン
化動物を再クローン化する方法を包含し、ここで該再クローン化動物は、クロー
ン化動物に対して遺伝子改変されている。そのような方法は、核移行が後期継代
細胞を若返らせ、テロメアの長さを回復することを明らかにするという本発明の
知見無しでは不可能であった。再クローン化哺乳動物が、クローン化遺伝子哺乳
動物（これは、第１の核ドナーの遺伝年齢と同じである）と同じ遺伝年齢である
なら、クローンの作成に依存してこの方法の現実性は低下する。本発明者らによ
り今日までに得られた結果は、これが事実ではないことを示し、実際再クローン
化は、所望の回数だけ実施でき、「超若い」動物、胚および細胞が得られること
を示唆する。超若い典型的な動物は、抗体を作成するのに有用な免疫系が増強し
ており、改善された皮膜着色を有する。
作成に有用であるため、本発明の方法はまた、複雑なまたは複合遺伝子改変を有
するクローン化哺乳動物の作成にも有用である。さらに本発明は、若いまたはさ
らに好ましくは超若い動物を産生するのに有用である。特に本発明は、クローン
化動物を再クローン化する方法を包含し、ここで該再クローン化動物は、クロー
ン化動物に対して遺伝子改変されている。そのような方法は、核移行が後期継代
細胞を若返らせ、テロメアの長さを回復することを明らかにするという本発明の
知見無しでは不可能であった。再クローン化哺乳動物が、クローン化遺伝子哺乳
動物（これは、第１の核ドナーの遺伝年齢と同じである）と同じ遺伝年齢である
なら、クローンの作成に依存してこの方法の現実性は低下する。本発明者らによ
り今日までに得られた結果は、これが事実ではないことを示し、実際再クローン
化は、所望の回数だけ実施でき、「超若い」動物、胚および細胞が得られること
を示唆する。超若い典型的な動物は、抗体を作成するのに有用な免疫系が増強し
ており、改善された皮膜着色を有する。
【００５６】
本発明の再クローン化の好適な方法は、以下の工程を含み、少なくとも２つの
遺伝子修飾を有するクローン化動物を作成するのに使用される： ａ．目的の動物から１次細胞を得る、 ｂ．異種ＤＮＡを挿入および／または未変性のＤＮＡを欠失させて、該１次細
胞に第１の遺伝子修飾を作成する、 ｃ．有核卵母細胞または卵または他の適当な受容体細胞への核移行の核ドナー
として、第１の遺伝子修飾した１次細胞を使用する、 ｄ．第１の遺伝子修飾を有するクローン化胚、胎児または動物を得る、 ｅ．クローン化胚、胎児または動物からクローン化１次細胞を得る、 ｆ．異種ＤＮＡを挿入および／または未変性のＤＮＡを欠失させて、該クロー
ン化１次細胞に第２の遺伝子修飾を作成する、 ｇ．有核卵母細胞または卵または他の適当な受容体細胞への核移行の核ドナー
として、第１と第２の遺伝子修飾を有する該クローン化１次細胞を使用する、 ｈ．第１および第２の遺伝子修飾を有するクローン化胚、胎児または動物を得
る。
遺伝子修飾を有するクローン化動物を作成するのに使用される： ａ．目的の動物から１次細胞を得る、 ｂ．異種ＤＮＡを挿入および／または未変性のＤＮＡを欠失させて、該１次細
胞に第１の遺伝子修飾を作成する、 ｃ．有核卵母細胞または卵または他の適当な受容体細胞への核移行の核ドナー
として、第１の遺伝子修飾した１次細胞を使用する、 ｄ．第１の遺伝子修飾を有するクローン化胚、胎児または動物を得る、 ｅ．クローン化胚、胎児または動物からクローン化１次細胞を得る、 ｆ．異種ＤＮＡを挿入および／または未変性のＤＮＡを欠失させて、該クロー
ン化１次細胞に第２の遺伝子修飾を作成する、 ｇ．有核卵母細胞または卵または他の適当な受容体細胞への核移行の核ドナー
として、第１と第２の遺伝子修飾を有する該クローン化１次細胞を使用する、 ｈ．第１および第２の遺伝子修飾を有するクローン化胚、胎児または動物を得
る。
【００５７】
このプロセスは、所望の回数繰り返すことができる。好ましくは少なくとも１
つの再クローン化工程は、再クローン化された細胞のテロメアが核移行により再
生または回復されるように、老年期または老年期近くまでまたはチェックポイン
ト停止するまで増殖させたドナー細胞を利用する。特に本発明の方法は、該再ク
ローン化胚、胎児、または動物が再度再クローン化される工程をさらに含み、こ
こで、さらなる再クローン化が、第１、第２、および第３の遺伝子修飾を有する
ように、第３の遺伝子修飾が行われる。従って本方法は、無数の遺伝子がノック
アウト、挿入または置換された動物を作成するのに使用でき、および置換され修
飾された全細胞系を有する動物を作成するのに使用される（すなわち、ヒトの免
疫系でウシの免疫系を置換、複雑な酵素経路（例えば、凝固因子を含むもの、ま
たは補体カスケードなど）に関与する遺伝子の置換）。
つの再クローン化工程は、再クローン化された細胞のテロメアが核移行により再
生または回復されるように、老年期または老年期近くまでまたはチェックポイン
ト停止するまで増殖させたドナー細胞を利用する。特に本発明の方法は、該再ク
ローン化胚、胎児、または動物が再度再クローン化される工程をさらに含み、こ
こで、さらなる再クローン化が、第１、第２、および第３の遺伝子修飾を有する
ように、第３の遺伝子修飾が行われる。従って本方法は、無数の遺伝子がノック
アウト、挿入または置換された動物を作成するのに使用でき、および置換され修
飾された全細胞系を有する動物を作成するのに使用される（すなわち、ヒトの免
疫系でウシの免疫系を置換、複雑な酵素経路（例えば、凝固因子を含むもの、ま
たは補体カスケードなど）に関与する遺伝子の置換）。
【００５８】
本発明の再クローン化法は、複数の遺伝子または細胞型が関与し、単一のトラ
ンス遺伝子を発現するかまたは目的の単一の遺伝子がノックアウトされている典
型的な動物モデルでは複製できない疾患の研究のための、複雑な動物モデルの作
成を可能にする。さらにそのような動物モデルは、特定の複雑な遺伝的バックグ
ランド中の治療的遺伝子の作用を研究するのに使用される。そのような動物モデ
ルはまた、異なる遺伝子の発現を制御する生成物を生成および試験するために、
免疫応答を誘発するのに関与する遺伝子をノックアウトするために、コラーゲン
遺伝子または同族の相手を有する他の構造タンパク質遺伝子を置換するために、
使用される。
ンス遺伝子を発現するかまたは目的の単一の遺伝子がノックアウトされている典
型的な動物モデルでは複製できない疾患の研究のための、複雑な動物モデルの作
成を可能にする。さらにそのような動物モデルは、特定の複雑な遺伝的バックグ
ランド中の治療的遺伝子の作用を研究するのに使用される。そのような動物モデ
ルはまた、異なる遺伝子の発現を制御する生成物を生成および試験するために、
免疫応答を誘発するのに関与する遺伝子をノックアウトするために、コラーゲン
遺伝子または同族の相手を有する他の構造タンパク質遺伝子を置換するために、
使用される。
【００５９】
本発明は、老年期細胞を若返らせられること、ＥＰＣ−１活性および老化に関
係する他の細胞マーカーが増加すること、テロメラーゼが活性化されテロメラー
ゼが伸長されること、および一列のリピートが修復され、すべて核移行のプロセ
スにより行われるという驚くべき発見を含む。すなわち本発明は、テロメアや複
製寿命を延長させることをはるかに越えた応用を有する、テロメラーゼ活性およ
び／またはＥＰＣ−１活性を活性化する新しい方法の発見を含む。また我々は、
一列に繰り返されるＤＮＡ配列への他の修復を予測する。特に本発明は、テロメ
ラーゼ活性化、ＥＰＣ−１活性化の機序、または他の老化関連遺伝子を単離する
方法、ならびにテロメラーゼまたはＥＰＣ−１、または同定された機序を使用し
て他の遺伝子を制御する手段を提供する。
係する他の細胞マーカーが増加すること、テロメラーゼが活性化されテロメラー
ゼが伸長されること、および一列のリピートが修復され、すべて核移行のプロセ
スにより行われるという驚くべき発見を含む。すなわち本発明は、テロメアや複
製寿命を延長させることをはるかに越えた応用を有する、テロメラーゼ活性およ
び／またはＥＰＣ−１活性を活性化する新しい方法の発見を含む。また我々は、
一列に繰り返されるＤＮＡ配列への他の修復を予測する。特に本発明は、テロメ
ラーゼ活性化、ＥＰＣ−１活性化の機序、または他の老化関連遺伝子を単離する
方法、ならびにテロメラーゼまたはＥＰＣ−１、または同定された機序を使用し
て他の遺伝子を制御する手段を提供する。
【００６０】
例えば、テロメラーゼ活性化、ＥＰＣ−１活性化（または、老化に関連する他
の細胞マーカー）、およびテロメア伸長を測定するために、卵母細胞の細胞質が
分画され、画分は、致死細胞、または致死細胞核、またはテロメアに連結して置
かれる。そのようなアッセイを介して、テロメラーゼ、ＥＰＣ−１活性、および
／または他の老化関連マーカーの再活性化に関与する、卵母細胞中の活性置換基
が、同定され単離される。同様に卵母細胞からＲＮＡまたはｃＤＮＡが単離でき
、テロメラーゼ活性を検出するために致死細胞に移行され、無細胞系で発現され
、テロメラーゼ活性を示すトランスフェクトされた細胞または無細胞系が同定さ
れる。そのような方法は、老年期ではなく胚形成中に発現されるＲＮＡを濃縮す
るために、サブトラクティブハイブリダイゼーション法で補足される。こうして
テロメラーゼ活性化に関与する可能性のある酵素をコードする遺伝子が同定され
る。
の細胞マーカー）、およびテロメア伸長を測定するために、卵母細胞の細胞質が
分画され、画分は、致死細胞、または致死細胞核、またはテロメアに連結して置
かれる。そのようなアッセイを介して、テロメラーゼ、ＥＰＣ−１活性、および
／または他の老化関連マーカーの再活性化に関与する、卵母細胞中の活性置換基
が、同定され単離される。同様に卵母細胞からＲＮＡまたはｃＤＮＡが単離でき
、テロメラーゼ活性を検出するために致死細胞に移行され、無細胞系で発現され
、テロメラーゼ活性を示すトランスフェクトされた細胞または無細胞系が同定さ
れる。そのような方法は、老年期ではなく胚形成中に発現されるＲＮＡを濃縮す
るために、サブトラクティブハイブリダイゼーション法で補足される。こうして
テロメラーゼ活性化に関与する可能性のある酵素をコードする遺伝子が同定され
る。
【００６１】
受精直後の期間の卵母細胞または卵は、テロメラーゼ活性化に関与する２つ以
上の遺伝子またはタンパク質を含有する。特定の理論には拘束されないが、本発
明者らは、テロメラーゼ活性の制御およびＡＬＴ経路に関与し、老年期細胞環境
のある側面に特に応答する、卵母細胞または卵母細胞の成長により生じるＥＳ細
胞もしくは生殖細胞中に、少なくとも１つの制御タンパク質またはＲＮＡが存在
すると考えている。そのようなタンパク質またはＲＮＡは、テロメラーゼまたは
テロメラーゼ遺伝子発現を直接活性化することが可能であるが、またそのような
タンパク質またはＲＮＡは、老年期のまたは老年期に近い細胞中に存在するかま
たは発現されるテロメラーゼまたはＡＬＴ経路のサプレッサーを阻害することに
より作用する。テロメラーゼの可能なアクチベーターは、Ｏｃｔ４またはＲｅｘ
である。
上の遺伝子またはタンパク質を含有する。特定の理論には拘束されないが、本発
明者らは、テロメラーゼ活性の制御およびＡＬＴ経路に関与し、老年期細胞環境
のある側面に特に応答する、卵母細胞または卵母細胞の成長により生じるＥＳ細
胞もしくは生殖細胞中に、少なくとも１つの制御タンパク質またはＲＮＡが存在
すると考えている。そのようなタンパク質またはＲＮＡは、テロメラーゼまたは
テロメラーゼ遺伝子発現を直接活性化することが可能であるが、またそのような
タンパク質またはＲＮＡは、老年期のまたは老年期に近い細胞中に存在するかま
たは発現されるテロメラーゼまたはＡＬＴ経路のサプレッサーを阻害することに
より作用する。テロメラーゼの可能なアクチベーターは、Ｏｃｔ４またはＲｅｘ
である。
【００６２】
例えば、ズー（Xu）らは、腫瘍細胞中の網膜芽細胞腫タンパク質の再発現は、
老年期を誘導しテロメラーゼ活性を阻害することを証明した（Oncogene (1997)
15:2589-2596）。最近の報告はまた、第３染色体上の遺伝子が、ｈＴＥＲＴ（テ
ロメラーゼの触媒性サブユニット）の転写抑制に関与することを示唆する。http
://claim.springer.de/EncRef/CancerResearch/samples/0001.htmを参照された
い。テロメラーゼと直接相互作用するいくつかのタンパク質も同定されており、
例えばｐ２３／ｈｓｐ９０（分子シャペロン）およびＴＥＰ１（テロメラーゼ関
連タンパク質１）がある。同上。ローレンスバークレイナショナルラボラトリー
（Lawrence Berkely National Laboratory）の研究者らは、クローン化した２つ
の追加のヒトテロメア関連タンパク質（Ｔｉｎ１とＴｉｎ２）のクローン化を目
的とした。連邦技術レポート（Federal Technology Report）、１９９９年１２
月３０日、パートナーシップダイジェスト、テクノロジーウォッチ、第９頁。す
なわち、本方法により同定される制御機序は、テロメラーゼ結合タンパク質また
はテロメラーゼレプレッサーに結合するかまたはその発現を阻害して作用し、そ
の結果テロメラーゼ活性を上昇させるが、遺伝子発現をアップレギュレートする
かまたはタンパク質安定性を増強することによってもテロメラーゼ活性を制御す
る。
老年期を誘導しテロメラーゼ活性を阻害することを証明した（Oncogene (1997)
15:2589-2596）。最近の報告はまた、第３染色体上の遺伝子が、ｈＴＥＲＴ（テ
ロメラーゼの触媒性サブユニット）の転写抑制に関与することを示唆する。http
://claim.springer.de/EncRef/CancerResearch/samples/0001.htmを参照された
い。テロメラーゼと直接相互作用するいくつかのタンパク質も同定されており、
例えばｐ２３／ｈｓｐ９０（分子シャペロン）およびＴＥＰ１（テロメラーゼ関
連タンパク質１）がある。同上。ローレンスバークレイナショナルラボラトリー
（Lawrence Berkely National Laboratory）の研究者らは、クローン化した２つ
の追加のヒトテロメア関連タンパク質（Ｔｉｎ１とＴｉｎ２）のクローン化を目
的とした。連邦技術レポート（Federal Technology Report）、１９９９年１２
月３０日、パートナーシップダイジェスト、テクノロジーウォッチ、第９頁。す
なわち、本方法により同定される制御機序は、テロメラーゼ結合タンパク質また
はテロメラーゼレプレッサーに結合するかまたはその発現を阻害して作用し、そ
の結果テロメラーゼ活性を上昇させるが、遺伝子発現をアップレギュレートする
かまたはタンパク質安定性を増強することによってもテロメラーゼ活性を制御す
る。
【００６３】
本発明は、テロメラーゼ活性またはＡＬＴ経路を直接または間接的に増強する
少なくとも１つの遺伝子の同定方法を含む。そのような方法は、老年期または老
年期に近い細胞のテロメラーゼまたはＡＬＴ活性を増強するメンバーのために、
胚または胚幹細胞から作成されるｃＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーをスクリ
ーニングすることを含む。本方法はまた、胚幹細胞中のテロメラーゼ活性を抑制
するメンバーのために、老年期または老年期に近い細胞から作成されるｃＤＮＡ
またはｍＲＮＡライブラリーをスクリーニングすることを含む、テロメラーゼま
たはＡＬＴ活性を直接または間接的に抑制する少なくとも１つの遺伝子を同定す
る方法を含む。テロメラーゼ活性は、当該分野で公知のいくつかの方法（レポー
ター遺伝子発現、例えばｈＴＲＴ遺伝子、またはタンパク質融合を含む）の任意
の１つの方法により測定される。好適なレポーター分子は、緑の蛍光性タンパク
質（ＧＦＰ）である。テロメラーゼ活性はまた、ＴＲＡＰｅｚｅアッセイを使用
して測定される。スクリーニング法は、例えばｃＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラ
リーを、老年期細胞からのｃＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーとサブトラクテ
ィブハイブリダイゼーションに付して、次に試験ライブラリーが卵母細胞または
ＥＳ細胞から作成されるかどうか、またはその逆についてスクリーニングするこ
とにより、スクリーニング法の有効性を上昇させる目的で、他の公知の方法と組
合せてもよい。
少なくとも１つの遺伝子の同定方法を含む。そのような方法は、老年期または老
年期に近い細胞のテロメラーゼまたはＡＬＴ活性を増強するメンバーのために、
胚または胚幹細胞から作成されるｃＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーをスクリ
ーニングすることを含む。本方法はまた、胚幹細胞中のテロメラーゼ活性を抑制
するメンバーのために、老年期または老年期に近い細胞から作成されるｃＤＮＡ
またはｍＲＮＡライブラリーをスクリーニングすることを含む、テロメラーゼま
たはＡＬＴ活性を直接または間接的に抑制する少なくとも１つの遺伝子を同定す
る方法を含む。テロメラーゼ活性は、当該分野で公知のいくつかの方法（レポー
ター遺伝子発現、例えばｈＴＲＴ遺伝子、またはタンパク質融合を含む）の任意
の１つの方法により測定される。好適なレポーター分子は、緑の蛍光性タンパク
質（ＧＦＰ）である。テロメラーゼ活性はまた、ＴＲＡＰｅｚｅアッセイを使用
して測定される。スクリーニング法は、例えばｃＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラ
リーを、老年期細胞からのｃＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーとサブトラクテ
ィブハイブリダイゼーションに付して、次に試験ライブラリーが卵母細胞または
ＥＳ細胞から作成されるかどうか、またはその逆についてスクリーニングするこ
とにより、スクリーニング法の有効性を上昇させる目的で、他の公知の方法と組
合せてもよい。
【００６４】
本発明はまた、（ａ）卵母細胞、胚、胚幹細胞の細胞質から画分を集めて、（
ｂ）これらを、老年期または老年期に近い細胞から設計された無細胞系に加えて
、そして（ｃ）特定の卵母細胞またはＥＳ細胞細胞質画分への暴露により生じる
、テロメラーゼ、若い遺伝子発現またはＡＬＴ活性の変化を測定することを含ん
でなる、テロメラーゼ、若い遺伝子発現またはＡＬＴ活性のパターンを増強する
タンパク質の同定方法を包含する。テロメラーゼまたは若い遺伝子発現を阻害す
る化合物のスクリーニング法も含まれ、これは、老年期または老年期に近いドナ
ー細胞を使用して核移行法により作成された胚幹細胞を、化合物に暴露して、該
化合物が、テロメラーゼ、若い遺伝子発現またはＡＬＴ活性を阻害するかどうか
を測定することを含む。
ｂ）これらを、老年期または老年期に近い細胞から設計された無細胞系に加えて
、そして（ｃ）特定の卵母細胞またはＥＳ細胞細胞質画分への暴露により生じる
、テロメラーゼ、若い遺伝子発現またはＡＬＴ活性の変化を測定することを含ん
でなる、テロメラーゼ、若い遺伝子発現またはＡＬＴ活性のパターンを増強する
タンパク質の同定方法を包含する。テロメラーゼまたは若い遺伝子発現を阻害す
る化合物のスクリーニング法も含まれ、これは、老年期または老年期に近いドナ
ー細胞を使用して核移行法により作成された胚幹細胞を、化合物に暴露して、該
化合物が、テロメラーゼ、若い遺伝子発現またはＡＬＴ活性を阻害するかどうか
を測定することを含む。
【００６５】
また本発明は、好ましくは適当なマーカーに連結した若い遺伝子または制御性
配列でトランスフェクトされた細胞を産生すること、およびそのような細胞を使
用して、若い遺伝子発現をアップレギュレートする化合物を同定する方法を含む
。これらのスクリーニングにより、細胞増殖または老化を調節する化合物が同定
される。いくつかの遺伝子が、細胞増殖とサイクリングにある役割を果たしてい
るという仮説が立てられている、例えば、細胞増殖とサイクリングにおいて、Ｅ
ＰＣ−１、ｇａｓ遺伝子（シッカレッリ（Ciccareli）ら、Mci. Cell. Bid. 10(
4):1525-1529 (1990)、例えば、ｇａｓ−２、−３、−５、−７、ＰＩ−３キナ
ーゼ（トレシニ（Tresini）ら、Cancer Res. 58(i):1-4(1998)、コラゲナーゼ、
ｔＰＡがある。
配列でトランスフェクトされた細胞を産生すること、およびそのような細胞を使
用して、若い遺伝子発現をアップレギュレートする化合物を同定する方法を含む
。これらのスクリーニングにより、細胞増殖または老化を調節する化合物が同定
される。いくつかの遺伝子が、細胞増殖とサイクリングにある役割を果たしてい
るという仮説が立てられている、例えば、細胞増殖とサイクリングにおいて、Ｅ
ＰＣ−１、ｇａｓ遺伝子（シッカレッリ（Ciccareli）ら、Mci. Cell. Bid. 10(
4):1525-1529 (1990)、例えば、ｇａｓ−２、−３、−５、−７、ＰＩ−３キナ
ーゼ（トレシニ（Tresini）ら、Cancer Res. 58(i):1-4(1998)、コラゲナーゼ、
ｔＰＡがある。
【００６６】
別のスクリーニング法は、体細胞、さらに好ましくは老年期体細胞の、マーカ
ー遺伝子（すなわちＧＦＰ）による修飾であり、ここでマーカー遺伝子は、その
発現が細胞の老化とともに変化する遺伝子（すなわちテロメラーゼ）に融合また
は結合している。テロメラーゼ遺伝子および／またはプロモーターは、一連の端
を切り取った型でマーカー遺伝子に融合し、マーカー構築体は、次に老年期また
は老年期に近い細胞中にトランスフェクトされる。次に、核移行は、核移行によ
りテロメラーゼ発現の活性化に関与する、テロメラーゼ遺伝子の領域または遺伝
子プロモーターまたは上流領域を同定するのに使用される。
ー遺伝子（すなわちＧＦＰ）による修飾であり、ここでマーカー遺伝子は、その
発現が細胞の老化とともに変化する遺伝子（すなわちテロメラーゼ）に融合また
は結合している。テロメラーゼ遺伝子および／またはプロモーターは、一連の端
を切り取った型でマーカー遺伝子に融合し、マーカー構築体は、次に老年期また
は老年期に近い細胞中にトランスフェクトされる。次に、核移行は、核移行によ
りテロメラーゼ発現の活性化に関与する、テロメラーゼ遺伝子の領域または遺伝
子プロモーターまたは上流領域を同定するのに使用される。
【００６７】
さらに本発明は、ＥＰＣ−１および他の若い遺伝子を、異種の、例えば制御可
能な好ましくは強いプロモーターの制御下に置き、テロメラーゼ活性とテロメア
に及ぼす発現の上昇または低下の影響を評価することを含む。
能な好ましくは強いプロモーターの制御下に置き、テロメラーゼ活性とテロメア
に及ぼす発現の上昇または低下の影響を評価することを含む。
【００６８】
本発明はまた、テロメア制御とＡＬＴ経路中の遺伝子の役割を同定するための
遺伝子修飾された体細胞のケースを含む。ＡＬＴ機能に決定的に重要な遺伝子は
、例えばＡＬＴの前に体細胞中でこれらの遺伝子がノックアウトされた時、ＡＬ
Ｔ機能の喪失により同定することができる。
遺伝子修飾された体細胞のケースを含む。ＡＬＴ機能に決定的に重要な遺伝子は
、例えばＡＬＴの前に体細胞中でこれらの遺伝子がノックアウトされた時、ＡＬ
Ｔ機能の喪失により同定することができる。
【００６９】
本発明はまた、上記方法により同定される制御化合物、タンパク質および核酸
を含み、これらを含んでなり、本明細書に記載の方法と目的（すなわち、年齢関
連疾患の治療、老化組織（例えば、網膜組織）の治療、癌の治療、および骨髄移
植の有効性の改善）に従って、外因性テロメラーゼ活性化剤として単離され使用
される医薬組成物を含む。
を含み、これらを含んでなり、本明細書に記載の方法と目的（すなわち、年齢関
連疾患の治療、老化組織（例えば、網膜組織）の治療、癌の治療、および骨髄移
植の有効性の改善）に従って、外因性テロメラーゼ活性化剤として単離され使用
される医薬組成物を含む。
【００７０】
本発明の範囲と精神は、開示された例により例示される。
【００７１】
例１−胎児ドナー細胞
予備実験は、体細胞核移行が、初代培養細胞の寿命を回復するのに使用できる
ことを示唆した。６週齢の胎児からの繊維芽細胞を老年期まで培養すると、これ
は３０回の集団倍加を受け、平均細胞サイクルの長さは２８〜３０時間であった
。これらの細胞が、核移行により老年期からレスキューされるかどうかを試験す
るために、老年期から０．８集団倍加以内の細胞を使用して、４０日齢の胎児を
作成した。この胎児から得られた繊維芽細胞は、正常に妊娠した同年齢の胎児か
らの繊維芽細胞の３３回の倍加と比較して、３１回の集団倍加を受けた。このデ
ータは、核移行が老年期細胞を若返らせることができることを示唆した。
ことを示唆した。６週齢の胎児からの繊維芽細胞を老年期まで培養すると、これ
は３０回の集団倍加を受け、平均細胞サイクルの長さは２８〜３０時間であった
。これらの細胞が、核移行により老年期からレスキューされるかどうかを試験す
るために、老年期から０．８集団倍加以内の細胞を使用して、４０日齢の胎児を
作成した。この胎児から得られた繊維芽細胞は、正常に妊娠した同年齢の胎児か
らの繊維芽細胞の３３回の倍加と比較して、３１回の集団倍加を受けた。このデ
ータは、核移行が老年期細胞を若返らせることができることを示唆した。
【００７２】
例２
老年期ドナー体細胞から得られたクローン化子ウシ
４５日齢の雌のウシ胎児（ＢＦＦ）から体細胞株を得て、ＰＧＫ指令選択カセ
ットでトランスフェクトした。Ｇ４１８で１０日間細胞を選択し、５つのネオマ
イシン耐性コロニーを単離し、完全長ｃＤＮＡプローブを使用してサザンブロッ
ティングにより安定なトランスフェクションについて分析した。１つの細胞株（
ＣＬ５３）が、ＦＩＳＨ分析によりトランス遺伝子について６３％［核の総数］
陽性として同定され、本研究に記載する核移行試験のために選択した。
ットでトランスフェクトした。Ｇ４１８で１０日間細胞を選択し、５つのネオマ
イシン耐性コロニーを単離し、完全長ｃＤＮＡプローブを使用してサザンブロッ
ティングにより安定なトランスフェクションについて分析した。１つの細胞株（
ＣＬ５３）が、ＦＩＳＨ分析によりトランス遺伝子について６３％［核の総数］
陽性として同定され、本研究に記載する核移行試験のために選択した。
【００７３】
サイトケラチンについて陰性でビメンチンについて陽性として解析されたＣＬ
５３繊維芽細胞を、その寿命の９５％を越えるまで継代した。細胞の形態は、光
学顕微鏡による細胞の位相差写真により示されるように、その寿命の最後に近い
細胞に一致した（図１Ａ）。電子顕微鏡のより詳細な超微細構造解析は、これら
の細胞が、複製性老年期の追加の特徴（若い細胞と比較して、顕著で活性のゴル
ジ装置、陥入したおよび葉のある核の増加、大きなリソソーム体、および細胞質
小繊維の増加）を示すことを証明した（図１Ｂ）（２７）。さらにこれらの後期
継代細胞は、 3Ｈ−チミジンの取り込みの低下（図１Ｃ）により測定されるよう
に、Ｓ期に入る能力の低下と、老年期関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇ
ａｌ；データは示していない）の染色の顕著な増加を示す老年期表現型を示した
（２８）。さらにこれらの細胞は、早期継代ウシＢＥＦ細胞と比較して、ＷＩ−
３８細胞の老化中に観察された変化と似た方法で、ＥＰＣ−１（早期集団倍加レ
ベルｃＤＮＡ−１）（２９）ｍＲＮＡレベルの低下を示す（図１Ｄ）。
５３繊維芽細胞を、その寿命の９５％を越えるまで継代した。細胞の形態は、光
学顕微鏡による細胞の位相差写真により示されるように、その寿命の最後に近い
細胞に一致した（図１Ａ）。電子顕微鏡のより詳細な超微細構造解析は、これら
の細胞が、複製性老年期の追加の特徴（若い細胞と比較して、顕著で活性のゴル
ジ装置、陥入したおよび葉のある核の増加、大きなリソソーム体、および細胞質
小繊維の増加）を示すことを証明した（図１Ｂ）（２７）。さらにこれらの後期
継代細胞は、 3Ｈ−チミジンの取り込みの低下（図１Ｃ）により測定されるよう
に、Ｓ期に入る能力の低下と、老年期関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇ
ａｌ；データは示していない）の染色の顕著な増加を示す老年期表現型を示した
（２８）。さらにこれらの細胞は、早期継代ウシＢＥＦ細胞と比較して、ＷＩ−
３８細胞の老化中に観察された変化と似た方法で、ＥＰＣ−１（早期集団倍加レ
ベルｃＤＮＡ−１）（２９）ｍＲＮＡレベルの低下を示す（図１Ｄ）。
【００７４】
既に記載されている（１３）ように老年期ＣＬ５３細胞を使用する核移行によ
り、全部で１８９６個のウシ卵母細胞を再構築した。１週間培養後、８７個の胚
盤胞（５％）が同定された。胚の大部分（ｎ＝７９）は、プロゲスチン同期受容
体に移行され、３２受容体のうち１７個（５３％）は、移行後４０日目に超音波
で妊娠していることが検出された。１つの胎児は、妊娠７週目に選択して取り出
され（ＡＣＴ９９−００２）、残りの受容体の９つ（２９％）は、妊娠１２週ま
で妊娠していた。これらのウシの３つは、妊娠２５２日（双子）、２５３日、お
よび２７８日に流産した。残りの６つの受容体は、満期まで成長した。老年期Ｃ
Ｌ５３細胞を使用する胚盤胞形成（５％）、早期（５３％）および満期（１９％
）妊娠の比率は、早期継代ＢＦＦ細胞から得られた非老年期ドナー（ＣＬ５７）
細胞を使用して作成した対照胚に匹敵した（それぞれ、５％、４５％、および１
３％）。
り、全部で１８９６個のウシ卵母細胞を再構築した。１週間培養後、８７個の胚
盤胞（５％）が同定された。胚の大部分（ｎ＝７９）は、プロゲスチン同期受容
体に移行され、３２受容体のうち１７個（５３％）は、移行後４０日目に超音波
で妊娠していることが検出された。１つの胎児は、妊娠７週目に選択して取り出
され（ＡＣＴ９９−００２）、残りの受容体の９つ（２９％）は、妊娠１２週ま
で妊娠していた。これらのウシの３つは、妊娠２５２日（双子）、２５３日、お
よび２７８日に流産した。残りの６つの受容体は、満期まで成長した。老年期Ｃ
Ｌ５３細胞を使用する胚盤胞形成（５％）、早期（５３％）および満期（１９％
）妊娠の比率は、早期継代ＢＦＦ細胞から得られた非老年期ドナー（ＣＬ５７）
細胞を使用して作成した対照胚に匹敵した（それぞれ、５％、４５％、および１
３％）。
【００７５】
子ウシＣＬ５３−１、ＣＬ５３−８、ＣＬ５３−９、ＣＬＳ３−１０、ＣＬ５
３−１１、およびＣＬ５３−１２は、それぞれ妊娠２８０、２７３、２７３、２
７３、２６６、および２６６日に選択的帝王切開により出産した（図２）。ゲノ
ム解析は、２匹の動物（ＣＬ５３−１とＣＬ５３−１２）ならびに妊娠４９日に
選択的に取り出した胎児中で、トランス遺伝子の存在が確認された。出産時に、
クローン化子ウシの提示は、すでに発表されている報告（１３、１５、３０、３
１）と一致した。一般に生誕時の体重（５１．６±３．６kg）は増加し、子ウシ
のいくつかは、出産時に肺高血圧と呼吸困難を示し、４月目にワクチン接種後に
発熱した。最初の２４時間後、子ウシは、健康上の問題もなく元気である。しか
し、我々は、最初の２ヶ月間に、 軽い多尿症／多渇症と乾燥物質摂取の低下を
認めた。これらの合併症の発症は、ドナー細胞集団（分離体５３または５７）に
もトランス遺伝子組み込みの有無にも関係なかった。約２ヶ月後、すべての子ウ
シは元気であり、インビトロ受精とインビボの胚移行から作成された健康な対照
子ウシに似ている。すべての６匹のクローン化動物は、出産後５〜１０ヶ月まで
元気で正常である。
３−１１、およびＣＬ５３−１２は、それぞれ妊娠２８０、２７３、２７３、２
７３、２６６、および２６６日に選択的帝王切開により出産した（図２）。ゲノ
ム解析は、２匹の動物（ＣＬ５３−１とＣＬ５３−１２）ならびに妊娠４９日に
選択的に取り出した胎児中で、トランス遺伝子の存在が確認された。出産時に、
クローン化子ウシの提示は、すでに発表されている報告（１３、１５、３０、３
１）と一致した。一般に生誕時の体重（５１．６±３．６kg）は増加し、子ウシ
のいくつかは、出産時に肺高血圧と呼吸困難を示し、４月目にワクチン接種後に
発熱した。最初の２４時間後、子ウシは、健康上の問題もなく元気である。しか
し、我々は、最初の２ヶ月間に、 軽い多尿症／多渇症と乾燥物質摂取の低下を
認めた。これらの合併症の発症は、ドナー細胞集団（分離体５３または５７）に
もトランス遺伝子組み込みの有無にも関係なかった。約２ヶ月後、すべての子ウ
シは元気であり、インビトロ受精とインビボの胚移行から作成された健康な対照
子ウシに似ている。すべての６匹のクローン化動物は、出産後５〜１０ヶ月まで
元気で正常である。
【００７６】
皮膚繊維芽細胞をクローン化子ウシから単離し、図１Ｄに記載したようにｍＲ
ＮＡを調製した。細胞は、早期継代胎児細胞に匹敵するかまたはそれより高いＥ
ＰＣ−１ ｍＲＮＡレベルを発現した。クローン化動物を生むわずかな割合の非
老年期細胞があった可能性を排除するために、ＣＬ５３ドナー細胞を、正常およ
びクローン密度で接種した。図３Ｂに示すように、細胞は、複製性老年期から２
．０１±０．１１（ＳＥＭ）集団倍加であった。クローン密度で接種した細胞の
１２％未満（１１／９７）および３％未満（２／９７）は、それぞれ１または２
回の集団倍加を受け、いずれの細胞も３回を越えて分裂することはなかった（図
３Ｃ）。これに対して、早期継代（プレトランスフェクション）ＢＦＦ細胞は、
４７．８±０．９の集団倍加を受け、対数増殖期中の平均細胞サイクル長さは１
７．８±０．７時間であった（図３Ａ）。
ＮＡを調製した。細胞は、早期継代胎児細胞に匹敵するかまたはそれより高いＥ
ＰＣ−１ ｍＲＮＡレベルを発現した。クローン化動物を生むわずかな割合の非
老年期細胞があった可能性を排除するために、ＣＬ５３ドナー細胞を、正常およ
びクローン密度で接種した。図３Ｂに示すように、細胞は、複製性老年期から２
．０１±０．１１（ＳＥＭ）集団倍加であった。クローン密度で接種した細胞の
１２％未満（１１／９７）および３％未満（２／９７）は、それぞれ１または２
回の集団倍加を受け、いずれの細胞も３回を越えて分裂することはなかった（図
３Ｃ）。これに対して、早期継代（プレトランスフェクション）ＢＦＦ細胞は、
４７．８±０．９の集団倍加を受け、対数増殖期中の平均細胞サイクル長さは１
７．８±０．７時間であった（図３Ａ）。
【００７７】
体細胞ＮＴ法が老年期ドナー細胞の増殖性寿命を回復するかどうかを試験する
ために、我々は、選択的に取り出した７週齢の胎児（ＡＣＴ９９−００２）から
の繊維芽細胞を培養した。ここからの細胞株は８５．３±５．６回の集団倍加を
受け、対数増殖期中の平均細胞サイクル長さは１７．７±０．８時間であった（
図３Ａ）。１つの細胞クローン（ｎ＝５）を、クローン化（ＡＣＴ９９−００２
）および元々の（ＢＦＦ）年齢の一致した胎児から作成し、免疫組織化学染色に
より繊維芽細胞として解析された培養物を単離した。これらの１細胞クローンは
、クローン化胎児と元々の胎児からそれぞれ３１．２±３．４と２５．９±２．
９回の集団倍加を受けた（図３Ｄ）。これらのデータは、クローン化が老年期細
胞の寿命をリセットし、胎児の細胞年齢は、ＮＴ前の培養物中でドナー細胞が倍
加した回数を反映しないことを示唆する。
ために、我々は、選択的に取り出した７週齢の胎児（ＡＣＴ９９−００２）から
の繊維芽細胞を培養した。ここからの細胞株は８５．３±５．６回の集団倍加を
受け、対数増殖期中の平均細胞サイクル長さは１７．７±０．８時間であった（
図３Ａ）。１つの細胞クローン（ｎ＝５）を、クローン化（ＡＣＴ９９−００２
）および元々の（ＢＦＦ）年齢の一致した胎児から作成し、免疫組織化学染色に
より繊維芽細胞として解析された培養物を単離した。これらの１細胞クローンは
、クローン化胎児と元々の胎児からそれぞれ３１．２±３．４と２５．９±２．
９回の集団倍加を受けた（図３Ｄ）。これらのデータは、クローン化が老年期細
胞の寿命をリセットし、胎児の細胞年齢は、ＮＴ前の培養物中でドナー細胞が倍
加した回数を反映しないことを示唆する。
【００７８】
老年期細胞をレスキューするＮＴの能力をさらに調べるために、クローン化動
物の有核血液細胞中のテロメアの長さを、直接ＦＩＴＣ標識した（ＣＣＣＴＡＡ
）ペプチド核酸プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション後にフ
ローサイトメトリー分析（フローＦＩＳＨ）を使用して、年齢の一致した対照動
物、新生子ウシ（＜２週齢）および高齢のウシ（１０〜１９才）と比較した（３
２、３３）。２つの別々の実験結果（図４Ａ）は、年齢の一致した対照に対して
クローン化動物で、テロメアの長さの完全な回復を示す（６３．４±１．７対５
１．０±３．１ｋＭＥＳＦ［平均±ｓ．ｄ．、Ｐ＜０．０００１、実験１］、お
よび７５．７±１．７対６１．４±３．２ｋＭＥＳＦ［Ｐ＜０．０００１、実験
２］。確かにクローン化動物のテロメアは、４匹の新生子ウシより統計的に長か
った（実験２）（７５．３±１．２対６６．９±１．４、Ｐ＜０．０００２）。
高齢ウシの平均テロメアの長さは、実験１と２についてそれぞれ４７．７±０．
７ｋＭＥＳＦと５２．０±３．６ｋＭＥＳＦであった。
物の有核血液細胞中のテロメアの長さを、直接ＦＩＴＣ標識した（ＣＣＣＴＡＡ
）ペプチド核酸プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション後にフ
ローサイトメトリー分析（フローＦＩＳＨ）を使用して、年齢の一致した対照動
物、新生子ウシ（＜２週齢）および高齢のウシ（１０〜１９才）と比較した（３
２、３３）。２つの別々の実験結果（図４Ａ）は、年齢の一致した対照に対して
クローン化動物で、テロメアの長さの完全な回復を示す（６３．４±１．７対５
１．０±３．１ｋＭＥＳＦ［平均±ｓ．ｄ．、Ｐ＜０．０００１、実験１］、お
よび７５．７±１．７対６１．４±３．２ｋＭＥＳＦ［Ｐ＜０．０００１、実験
２］。確かにクローン化動物のテロメアは、４匹の新生子ウシより統計的に長か
った（実験２）（７５．３±１．２対６６．９±１．４、Ｐ＜０．０００２）。
高齢ウシの平均テロメアの長さは、実験１と２についてそれぞれ４７．７±０．
７ｋＭＥＳＦと５２．０±３．６ｋＭＥＳＦであった。
【００７９】
テロメアの長さの動力学を、末端制限断片のサザン解析を使用して、老年期細
胞（ＣＬ５３）、対照細胞（プレトランスフェクション、ＢＦＦ）、およびクロ
ーン化細胞（ＡＣＴ９９−００２）でも研究した（３４）。結果（図４Ｂ〜Ｄ）
は、有核血液細胞のフローＦＩＳＨ解析と一致した。クローン化胚から得られた
細胞のテロメア（１９．３kb）は、早期継代ドナー細胞（それぞれ１６．２と１
７．９kb）中より長かった（レーン４、５、および６を比較されたい、図４Ｂ）
。これらの結果は、同じ細胞のテロメアの長さのフローサイトメトリー（フロー
ＦＩＳＨ、文献３２）により確認された（図４Ｄ）。ＴＲＡＰアッセイで試験し
た再構築した７日目の胚でも、高レベルのテロメア活性が検出され（図５、レー
ン５〜８）、一方核移行実験のドナー細胞として使用したウシ繊維芽細胞は陰性
であった（図５、レーン９）。
胞（ＣＬ５３）、対照細胞（プレトランスフェクション、ＢＦＦ）、およびクロ
ーン化細胞（ＡＣＴ９９−００２）でも研究した（３４）。結果（図４Ｂ〜Ｄ）
は、有核血液細胞のフローＦＩＳＨ解析と一致した。クローン化胚から得られた
細胞のテロメア（１９．３kb）は、早期継代ドナー細胞（それぞれ１６．２と１
７．９kb）中より長かった（レーン４、５、および６を比較されたい、図４Ｂ）
。これらの結果は、同じ細胞のテロメアの長さのフローサイトメトリー（フロー
ＦＩＳＨ、文献３２）により確認された（図４Ｄ）。ＴＲＡＰアッセイで試験し
た再構築した７日目の胚でも、高レベルのテロメア活性が検出され（図５、レー
ン５〜８）、一方核移行実験のドナー細胞として使用したウシ繊維芽細胞は陰性
であった（図５、レーン９）。
【００８０】
考察
テロメア回復は、クローン化動物では以前は記載されていない。我々の結果は
、シールズ（Shiels）らの研究（２０）（ヒツジで核移行後に、テロメアの侵食
は修復されないようであった）と顕著に異なる。３匹のクローン化動物６ＬＬ３
（ドリー、胎児ドナー細胞から得られる）、６ＬＬ６（胚ドナー細胞から得られ
る）および６ＬＬ７（胎児ドナー細胞から得られる）のテロメアの長さは、年齢
の一致した対照動物と比較して、低下していた。著者らは、これらの動物は生殖
細胞系の関与無しで作成されたため、テロメアの長さの完全な回復は起きないこ
とを示唆した。さらにこれらは、ドリーのより短いＴＲＦは、ドナー細胞が核移
行の前に培養中で費やした時間と一致することを示唆した。生存活性のある子孫
が老年期体細胞から作成されるためだけではなく、核移行法は、新生児と年齢の
一致した対照動物のテロメアを越えて、動物のテロメアを延長するようであるた
めに、この知見は重要である。これらの動物の寿命が、テロメア測定により反映
されているかどうかは不明であるが、クローン化胎児から得られた細胞は、元々
の同じ年齢の非操作胎児から得られた増殖寿命より長い増殖寿命を有することが
観察された。実際、後者の細胞で観察された平均ＴＲＦサイズは、これらの知見
と一致した。
、シールズ（Shiels）らの研究（２０）（ヒツジで核移行後に、テロメアの侵食
は修復されないようであった）と顕著に異なる。３匹のクローン化動物６ＬＬ３
（ドリー、胎児ドナー細胞から得られる）、６ＬＬ６（胚ドナー細胞から得られ
る）および６ＬＬ７（胎児ドナー細胞から得られる）のテロメアの長さは、年齢
の一致した対照動物と比較して、低下していた。著者らは、これらの動物は生殖
細胞系の関与無しで作成されたため、テロメアの長さの完全な回復は起きないこ
とを示唆した。さらにこれらは、ドリーのより短いＴＲＦは、ドナー細胞が核移
行の前に培養中で費やした時間と一致することを示唆した。生存活性のある子孫
が老年期体細胞から作成されるためだけではなく、核移行法は、新生児と年齢の
一致した対照動物のテロメアを越えて、動物のテロメアを延長するようであるた
めに、この知見は重要である。これらの動物の寿命が、テロメア測定により反映
されているかどうかは不明であるが、クローン化胎児から得られた細胞は、元々
の同じ年齢の非操作胎児から得られた増殖寿命より長い増殖寿命を有することが
観察された。実際、後者の細胞で観察された平均ＴＲＦサイズは、これらの知見
と一致した。
【００８１】
クローン化についての考察において、核移行により作成される動物が、培養中
の大部分の細胞より、一部のまれな細胞の使用の結果であるかどうかについてい
つも疑問とされている。大量培養は、種々の最大可能な細胞寿命を有する多数の
系統を有する（４３）。実際本研究で使用した後期継代細胞は、元々最も大きい
寿命を有すた細胞である。もし２０またはそれ以上の集団倍加を有する若い細胞
のサブセットが後期継代培養物中に残っているなら、これらは、自発的不死化が
一般的なマウス細胞培養中で見られる培養物より増殖したであろう。この反論を
予測して我々は、ドナー細胞をクローン密度で蒔き、すべての細胞の増殖性寿命
のスコアをつけた。３４７細胞中の３３９（９８％）は、３ ＰＤ未満であり、
３４７／３４７（１００％）は４回またはそれ以下のＰＤであった。さらに高血
清濃度（１５％）で細胞を増殖させ、若い細胞は迅速に増殖し、プレート中で容
易に観察されたであろう。従って１つの試料中の若い細胞の確率は、＜１／３４
７である。それでも７匹の動物（６匹の満期の動物と１匹の胎児）を、老年期胎
児細胞の集団からクローン化した。従って、検出されない若い細胞から、偶然動
物をクローン化した可能性は非常に低い（Ｐ＜０．００１、χ自乗）。
の大部分の細胞より、一部のまれな細胞の使用の結果であるかどうかについてい
つも疑問とされている。大量培養は、種々の最大可能な細胞寿命を有する多数の
系統を有する（４３）。実際本研究で使用した後期継代細胞は、元々最も大きい
寿命を有すた細胞である。もし２０またはそれ以上の集団倍加を有する若い細胞
のサブセットが後期継代培養物中に残っているなら、これらは、自発的不死化が
一般的なマウス細胞培養中で見られる培養物より増殖したであろう。この反論を
予測して我々は、ドナー細胞をクローン密度で蒔き、すべての細胞の増殖性寿命
のスコアをつけた。３４７細胞中の３３９（９８％）は、３ ＰＤ未満であり、
３４７／３４７（１００％）は４回またはそれ以下のＰＤであった。さらに高血
清濃度（１５％）で細胞を増殖させ、若い細胞は迅速に増殖し、プレート中で容
易に観察されたであろう。従って１つの試料中の若い細胞の確率は、＜１／３４
７である。それでも７匹の動物（６匹の満期の動物と１匹の胎児）を、老年期胎
児細胞の集団からクローン化した。従って、検出されない若い細胞から、偶然動
物をクローン化した可能性は非常に低い（Ｐ＜０．００１、χ自乗）。
【００８２】
この研究とシールズ（Shiels）ら（２０）が報告したものとの差は、ドナー体
細胞型の選択の差が原因かも知れない。例えばウィルムト（Wilmut）ら（１２）
は、静止期（Ｇ0）のドナー乳腺上皮細胞を使用してドリーを作成し、一方本実
験では老年期（Ｇ1）繊維芽細胞を使用した。実際最近の研究は、テロメラーゼ
活性の再構築により、テロメアが伸長され、正常ヒト繊維芽細胞が不死化される
ことを示し（３５、３６）、乳腺上皮細胞を使用する同様の実験は、テロメアの
伸長と複製性寿命の延長を起こさないことを示している（３７）。テロメラーゼ
がテロメアを伸長する能力、および培養に適用することで活性化されるシグナル
伝達経路の細胞間の差が、この差を説明すると提唱された（３８）。しかし他の
研究者らは、ｈＴＥＲＴの外因性発現は、テロメアを伸長させ、ヒト乳腺上皮細
胞を不死化させることを報告している（ジェイ・シェイ（J. Shay）、私信）。
細胞型の選択の差が原因かも知れない。例えばウィルムト（Wilmut）ら（１２）
は、静止期（Ｇ0）のドナー乳腺上皮細胞を使用してドリーを作成し、一方本実
験では老年期（Ｇ1）繊維芽細胞を使用した。実際最近の研究は、テロメラーゼ
活性の再構築により、テロメアが伸長され、正常ヒト繊維芽細胞が不死化される
ことを示し（３５、３６）、乳腺上皮細胞を使用する同様の実験は、テロメアの
伸長と複製性寿命の延長を起こさないことを示している（３７）。テロメラーゼ
がテロメアを伸長する能力、および培養に適用することで活性化されるシグナル
伝達経路の細胞間の差が、この差を説明すると提唱された（３８）。しかし他の
研究者らは、ｈＴＥＲＴの外因性発現は、テロメアを伸長させ、ヒト乳腺上皮細
胞を不死化させることを報告している（ジェイ・シェイ（J. Shay）、私信）。
【００８３】
従来の研究は、早期ウシ胚形成中のテロメラーゼ活性の有意なアップレギュレ
ーションを記載している（３９）。本研究におけるテロメアの伸長は、核移行に
より再構築されるウシ胚が、テロメアの長さの再生と維持のための機序を含有し
、付着前および後の成長のイベントの間染色体安定性を与えることを示唆する。
ーションを記載している（３９）。本研究におけるテロメアの伸長は、核移行に
より再構築されるウシ胚が、テロメアの長さの再生と維持のための機序を含有し
、付着前および後の成長のイベントの間染色体安定性を与えることを示唆する。
【００８４】
例３
成体ドナー細胞を使用する核移行
胎児繊維芽細胞ドナーで得られた上記データは、成体動物から得られた老年期
細胞を使用して行われた実験と一致する。皮膚繊維芽細胞を、３匹のホルスタイ
ンウシから増殖させた。単一の細胞クローンを単離し、老年期まで集団倍加を数
えた。老年期または老年期に近いこれらの繊維芽細胞を使用して、核移行を行っ
た。妊娠６週目に子宮から胎児を取り出し、そこから繊維芽細胞を単離し、老年
期まで培養した。免疫組織化学により細胞を分析し、繊維芽細胞であることを証
明した。核移行の時点で成体の動物（老年期前のＰＤの数として数えた）とそこ
から作成した６週齢の胎児からの元々の細胞の集団倍加の回数を、表１に示す。
クローン化胎児から単離した細胞株は、平均８９．４±０．９ＰＤであり、これ
と比較して、正常な年齢の一致した対照（６週齢）から作成した細胞株では６０
．５±１．７ＰＤであった（Ｐ＜０．０００１）。これらのデータは、クローン
化が、体細胞の寿命をリセット（および、実際延長）することができ、胎児の細
胞年齢は、ＮＴ前の培養でドナー細胞が倍加した回数を反映しないことを示唆す
る。
細胞を使用して行われた実験と一致する。皮膚繊維芽細胞を、３匹のホルスタイ
ンウシから増殖させた。単一の細胞クローンを単離し、老年期まで集団倍加を数
えた。老年期または老年期に近いこれらの繊維芽細胞を使用して、核移行を行っ
た。妊娠６週目に子宮から胎児を取り出し、そこから繊維芽細胞を単離し、老年
期まで培養した。免疫組織化学により細胞を分析し、繊維芽細胞であることを証
明した。核移行の時点で成体の動物（老年期前のＰＤの数として数えた）とそこ
から作成した６週齢の胎児からの元々の細胞の集団倍加の回数を、表１に示す。
クローン化胎児から単離した細胞株は、平均８９．４±０．９ＰＤであり、これ
と比較して、正常な年齢の一致した対照（６週齢）から作成した細胞株では６０
．５±１．７ＰＤであった（Ｐ＜０．０００１）。これらのデータは、クローン
化が、体細胞の寿命をリセット（および、実際延長）することができ、胎児の細
胞年齢は、ＮＴ前の培養でドナー細胞が倍加した回数を反映しないことを示唆す
る。
【００８５】
【００８６】
例４
成体ドナー細胞型の解析
成体のウシ（屠殺の時に得られた）の３つの胚葉から組織生検が得られる。特
に少なくとも以下の細胞が集められるであろう： 外胚葉−ケラチン細胞 中胚葉−皮膚繊維芽細胞 内胚葉−腸管上皮
に少なくとも以下の細胞が集められるであろう： 外胚葉−ケラチン細胞 中胚葉−皮膚繊維芽細胞 内胚葉−腸管上皮
【００８７】
上記の３つの細胞型の一部を直ちに評価してテロメアの長さを決定する。これ
は、種々の方法により行うことができる。すべての３つの細胞型の残りの部分は
、老年期まで培養される。培養中、各集団の一部を保持し凍結する。異なる凍結
細胞試料を、その特定の集団倍加に基づき印を付ける。 次に種々の細胞試料についてテロメアの長さ（特に老年期に得られた細胞を含
む）を評価する。
は、種々の方法により行うことができる。すべての３つの細胞型の残りの部分は
、老年期まで培養される。培養中、各集団の一部を保持し凍結する。異なる凍結
細胞試料を、その特定の集団倍加に基づき印を付ける。 次に種々の細胞試料についてテロメアの長さ（特に老年期に得られた細胞を含
む）を評価する。
【００８８】
例５
成体老年期ドナー体細胞から作成したクローン化子ウシ
例４で得られる細胞を使用して、クローン化ウシ胎児を得る。特にすべての３
つの細胞型を使用して、および異なる集団倍加（すなわち、老年期から０．８集
団倍加離れている）からの細胞を使用して、ウシのクローンを作成する。クロー
ン化ウシ胎児は、実質的に米国特許第５，９４５，５７７号（参照することによ
り本明細書に組み込まれる）に記載の方法に従って作成されるであろう。クロー
ン化胎児は、４０日目に取り出し、そこからすべての３つの型の細胞（例えば、
ケラチン細胞、皮膚繊維芽細胞、および腸管上皮細胞）を単離する。
つの細胞型を使用して、および異なる集団倍加（すなわち、老年期から０．８集
団倍加離れている）からの細胞を使用して、ウシのクローンを作成する。クロー
ン化ウシ胎児は、実質的に米国特許第５，９４５，５７７号（参照することによ
り本明細書に組み込まれる）に記載の方法に従って作成されるであろう。クロー
ン化胎児は、４０日目に取り出し、そこからすべての３つの型の細胞（例えば、
ケラチン細胞、皮膚繊維芽細胞、および腸管上皮細胞）を単離する。
【００８９】
さらに対照として、２つの同じ年齢（４０日）の野生型胎児を使用して、同じ
３つの型の細胞を回収する。これらの細胞ならびにクローン化胎児から単離した
細胞を、老年期まで培養する。
３つの型の細胞を回収する。これらの細胞ならびにクローン化胎児から単離した
細胞を、老年期まで培養する。
【００９０】
再度これらの異なる型の培養細胞のテロメアの長さは、動物から単離した直後
に、または単離後凍結される細胞から、決定される。さらに再度細胞を取り出し
老年期まで異なる細胞集団まで凍結する。次に、クローン化胚と野生型の胚から
得られた培養細胞について、異なる細胞集団倍加で得られた異なる細胞型につい
て、テロメアの長さを計算する。
に、または単離後凍結される細胞から、決定される。さらに再度細胞を取り出し
老年期まで異なる細胞集団まで凍結する。次に、クローン化胚と野生型の胚から
得られた培養細胞について、異なる細胞集団倍加で得られた異なる細胞型につい
て、テロメアの長さを計算する。
【００９１】
結果を例４の結果と比較する。これらの実験は現在進行中である。
【００９２】
例６
若い細胞対高齢の細胞のＥＰＣ−１発現
若いまたは高齢のヒト、ウシの細胞、クローン化動物、および対照で、ＥＰＣ
−１発現を比較した。これらの結果を以下に示す。 これらの結果は、クローン化動物からの若い細胞は、ＥＰＣ−１発現で測定す
ると、正常の動物から得られた若い細胞より若かった。マーカーとしてのテロメ
アの長さは、これらの細胞中でより若いレベルまで回復した。この説明は、テロ
メアは不完全な性質を有し、不死化のある系統で長い長さで維持されると、テロ
メラーゼは、内部配列に頻繁にはアクセスしないことかも知れない。従って、（
Ｔ2ＡＧ3）n リピートは、動原体に向かうテロメアからの配列を読むと忠実に分
解する。これは、以下に模式的に示す。
−１発現を比較した。これらの結果を以下に示す。 これらの結果は、クローン化動物からの若い細胞は、ＥＰＣ−１発現で測定す
ると、正常の動物から得られた若い細胞より若かった。マーカーとしてのテロメ
アの長さは、これらの細胞中でより若いレベルまで回復した。この説明は、テロ
メアは不完全な性質を有し、不死化のある系統で長い長さで維持されると、テロ
メラーゼは、内部配列に頻繁にはアクセスしないことかも知れない。従って、（
Ｔ2ＡＧ3）n リピートは、動原体に向かうテロメアからの配列を読むと忠実に分
解する。これは、以下に模式的に示す。
【００９３】
老年期の小さい問題は、３’ ５’エキソヌクレアーゼにより修復され、これ
は次に再度Ｔ2ＡＧ3を露出し、これはＴＲＦ−２への結合を回復する。しかしあ
る時点で、傷害が大きくなり、これが終末細胞老年期として知られているものを
開始させる。
は次に再度Ｔ2ＡＧ3を露出し、これはＴＲＦ−２への結合を回復する。しかしあ
る時点で、傷害が大きくなり、これが終末細胞老年期として知られているものを
開始させる。
【００９４】
ウィルムト（Wilmut）は、テロメアの長さは、体細胞ドナーの核の短縮したテ
ロメアを反映するため、老年期細胞のクローン化は、動物で問題を引き起こすか
も知れないと主張した。しかし我々の結果は、反対のことを示唆している。むし
ろ、細胞を老年期または老年期近くまで増殖させるか、またはチェックポイント
で停止させ、細胞からＴ2ＡＧ3を喪失させ、３’ ５’エキソヌクレアーゼによ
り小さい傷害を除くと、次に遺伝子を有核卵母細胞または他の胚細胞に移行させ
る機会が与えられ、次にテロメア活性が突然現れて、純粋なＴ2ＡＧ3の区画が再
構成される（通常存在するものより長い）。これらの細胞は、より長い寿命を有
するが、Ｔ2ＡＧ3の純度のために、一時的に細胞サイクルが停止した細胞はまれ
である。これは、正常より高い分裂細胞指数を与え、全体に遺伝子発現の「若い
ものより若い」パターンを与える。
ロメアを反映するため、老年期細胞のクローン化は、動物で問題を引き起こすか
も知れないと主張した。しかし我々の結果は、反対のことを示唆している。むし
ろ、細胞を老年期または老年期近くまで増殖させるか、またはチェックポイント
で停止させ、細胞からＴ2ＡＧ3を喪失させ、３’ ５’エキソヌクレアーゼによ
り小さい傷害を除くと、次に遺伝子を有核卵母細胞または他の胚細胞に移行させ
る機会が与えられ、次にテロメア活性が突然現れて、純粋なＴ2ＡＧ3の区画が再
構成される（通常存在するものより長い）。これらの細胞は、より長い寿命を有
するが、Ｔ2ＡＧ3の純度のために、一時的に細胞サイクルが停止した細胞はまれ
である。これは、正常より高い分裂細胞指数を与え、全体に遺伝子発現の「若い
ものより若い」パターンを与える。
【００９５】
これをより完全に調べるために、年齢の一致した哺乳動物からの培養物、およ
び若い細胞と老年期細胞からクローン化したクローン化試料、および短縮したテ
ロメアを有するものと有さないものを使用して、実験を実施中である。これらの
細胞を老年期まで増殖させ、１５ｐｄごとに凍結して戻す。これらの細胞を、細
胞老年期のマーカーについて比較する。公知の方法（例えば、ノーザンブロット
）または適当なプローブを使用して標識して、これらの細胞で遺伝子発現を比較
する。
び若い細胞と老年期細胞からクローン化したクローン化試料、および短縮したテ
ロメアを有するものと有さないものを使用して、実験を実施中である。これらの
細胞を老年期まで増殖させ、１５ｐｄごとに凍結して戻す。これらの細胞を、細
胞老年期のマーカーについて比較する。公知の方法（例えば、ノーザンブロット
）または適当なプローブを使用して標識して、これらの細胞で遺伝子発現を比較
する。
【００９６】
例７
核移行から得られる胚中のテロメラーゼレベルの上昇
テロメア伸長の機序を調べるために、核移行（ＮＴ）後の早期胚の成長中のテ
ロメラーゼ活性レベルを、ウシの系で調べた。正常（ＩＶＦ）のウシの胚につい
て公表された結果（ベッツ（Betts）とキング（King）、1999, Dev. Genetics 2
5:397-403）と同様に、分析した早期成長のすべての段階でテロメラーゼが検出
された。テロメラーゼ活性のレベルは、８〜１６の細胞段階で低下し、次にＮＴ
とＩＶＦ対照胚の両方について桑実胚と胚盤胞段階で上昇した（データは示して
いない）。しかしＮＴ胚盤胞中のテロメラーゼのレベルは、対応するＩＶＦ胚盤
胞より２倍高かった。
ロメラーゼ活性レベルを、ウシの系で調べた。正常（ＩＶＦ）のウシの胚につい
て公表された結果（ベッツ（Betts）とキング（King）、1999, Dev. Genetics 2
5:397-403）と同様に、分析した早期成長のすべての段階でテロメラーゼが検出
された。テロメラーゼ活性のレベルは、８〜１６の細胞段階で低下し、次にＮＴ
とＩＶＦ対照胚の両方について桑実胚と胚盤胞段階で上昇した（データは示して
いない）。しかしＮＴ胚盤胞中のテロメラーゼのレベルは、対応するＩＶＦ胚盤
胞より２倍高かった。
【００９７】
例８
クローン化動物対年齢の一致した対照中の超若い免疫機能
核移行により免疫老年期が逆転する程度を調べるために、かつクローン化動物
が、年齢の一致した対照と比較して免疫機能の上昇を示すかどうかを調べるため
に、種々の分裂促進因子にインビトロ暴露した後のクローン化ウシ対対照ウシの
細胞の免疫応答を調べた。ＴＳＳＴ（毒性ショック症候群毒素、Ｔ細胞増殖を誘
導する細菌スーパー抗原）に応答して、およびＴ細胞とＢ細胞の増殖を誘導する
アメリカヤマゴボウマイトゲン（ＰＷＭ）に応答して、クローン化動物と対照動
物の間に有意な差があった。差は、２日目と３日目の培養物の両方で観察された
。またＰＨＡ（別のＴ細胞分裂促進因子）に応答して、しかしより大きな変動で
差が観察された。ＰＨＡ応答で観察された差の有意性を、より多くの被験体を試
験して測定した。ＣｏｎＡ（Ｔ細胞分裂促進因子）に応答した差は小さく、統計
的に有意ではなかった。ＴＳＳＴとＰＷＭについては、差は約２倍であり、７２
時間のＴＳＳＴ系は２．６×の作用を示す。結果を以下の表に示す。
が、年齢の一致した対照と比較して免疫機能の上昇を示すかどうかを調べるため
に、種々の分裂促進因子にインビトロ暴露した後のクローン化ウシ対対照ウシの
細胞の免疫応答を調べた。ＴＳＳＴ（毒性ショック症候群毒素、Ｔ細胞増殖を誘
導する細菌スーパー抗原）に応答して、およびＴ細胞とＢ細胞の増殖を誘導する
アメリカヤマゴボウマイトゲン（ＰＷＭ）に応答して、クローン化動物と対照動
物の間に有意な差があった。差は、２日目と３日目の培養物の両方で観察された
。またＰＨＡ（別のＴ細胞分裂促進因子）に応答して、しかしより大きな変動で
差が観察された。ＰＨＡ応答で観察された差の有意性を、より多くの被験体を試
験して測定した。ＣｏｎＡ（Ｔ細胞分裂促進因子）に応答した差は小さく、統計
的に有意ではなかった。ＴＳＳＴとＰＷＭについては、差は約２倍であり、７２
時間のＴＳＳＴ系は２．６×の作用を示す。結果を以下の表に示す。
【００９８】
ワクチン接種後にクローン化動物の感受性の上昇が観察されたため、分裂促進
因子に対するインビボの応答は試験しなかった。しかし記憶抗原に対する皮膚の
遅延型過敏性応答のインビボ試験はリスクが小さく、実施でき、インビボの免疫
応答を分析することができた。
因子に対するインビボの応答は試験しなかった。しかし記憶抗原に対する皮膚の
遅延型過敏性応答のインビボ試験はリスクが小さく、実施でき、インビボの免疫
応答を分析することができた。
【００９９】
特定の細胞型を分離するのに有用な試薬を使用して、特定の細胞型（すなわち
、Ｔ細胞サブセット、Ｂ細胞、マクロファージなど）の応答を調べるためのイン
ビトロ試験も行う。特定のサイトカインの産生レベルも、ルーチン法を使用して
調べる。
、Ｔ細胞サブセット、Ｂ細胞、マクロファージなど）の応答を調べるためのイン
ビトロ試験も行う。特定のサイトカインの産生レベルも、ルーチン法を使用して
調べる。
【０１００】
【０１０１】
結論と本発明の広い応用
我々が本明細書に開示するように、ＮＴによる体細胞中のテロメアの伸長は、
ウィルムト（Wilmut）からは明らかではなかった。しかし老年期細胞から出発す
ると、より良好な結果（より長いテロメア、長い寿命の細胞）が得られることは
、前者の結果からは明らかではない。
ウィルムト（Wilmut）からは明らかではなかった。しかし老年期細胞から出発す
ると、より良好な結果（より長いテロメア、長い寿命の細胞）が得られることは
、前者の結果からは明らかではない。
【０１０２】
現在でも、テロメアの短縮が、細胞老年期の表現型または細胞サイクルの中間
の減速を招く機序については、合意が無い。初期の論文は、テロメアリピートが
徐々に喪失することが、テロメア遺伝子の喪失につながり、決定的に重要な細胞
機能の喪失につながると提唱した。ウッドリング・イー・ライト（Woodring E.
Wright）は数年前、テロメアの短縮は、テロメアに関連するヘテロクロマチンを
シフトさせて、テロメア遺伝子を沈黙させ、これが次に老年期を招くと提唱した
。ブライアント・ビレポントー（Bryant Villeponteau）は、ほとんど反対、す
なわちテロメアの短縮とともに短くなったテロメアに関連するヘテロクロマチン
の円錐があり、これがテロメアの近くの遺伝子を活性化したと公表した。チチア
・デ・ランゲ（Titia de Lange）は、ＴＲＦ２とＴループについての最近の論文
で、老年期細胞はもうＴＲＦ２に結合することができず、Ｔループを形成できな
いことを提唱した。しかし、テロメア中に「ばらまかれている」のは、非テロメ
ア配列であり、そこではテロメア自身により多くの純粋なＴＴＡＧＧＧの区画が
あり、内部は少ないという別の可能性がある。体細胞中でテロメアが短縮すると
、細胞は、テロメアでＴＲＦ２に結合できない非テロメア配列と遭遇する確率が
増加し、最終的にこれが、活性化ｐ５３のレベルそして次にｐ２１のレベルを上
げて、細胞サイクルの減速そして最終的に停止を引き起こす。要点は、増殖して
おり突然老年期になる若い細胞についての、すべてまたは全く無しの減少ではな
いことである。これは、徐々にｐ２１を上げる、傷害されたテロメアの増加する
量の勾配かも知れない。
の減速を招く機序については、合意が無い。初期の論文は、テロメアリピートが
徐々に喪失することが、テロメア遺伝子の喪失につながり、決定的に重要な細胞
機能の喪失につながると提唱した。ウッドリング・イー・ライト（Woodring E.
Wright）は数年前、テロメアの短縮は、テロメアに関連するヘテロクロマチンを
シフトさせて、テロメア遺伝子を沈黙させ、これが次に老年期を招くと提唱した
。ブライアント・ビレポントー（Bryant Villeponteau）は、ほとんど反対、す
なわちテロメアの短縮とともに短くなったテロメアに関連するヘテロクロマチン
の円錐があり、これがテロメアの近くの遺伝子を活性化したと公表した。チチア
・デ・ランゲ（Titia de Lange）は、ＴＲＦ２とＴループについての最近の論文
で、老年期細胞はもうＴＲＦ２に結合することができず、Ｔループを形成できな
いことを提唱した。しかし、テロメア中に「ばらまかれている」のは、非テロメ
ア配列であり、そこではテロメア自身により多くの純粋なＴＴＡＧＧＧの区画が
あり、内部は少ないという別の可能性がある。体細胞中でテロメアが短縮すると
、細胞は、テロメアでＴＲＦ２に結合できない非テロメア配列と遭遇する確率が
増加し、最終的にこれが、活性化ｐ５３のレベルそして次にｐ２１のレベルを上
げて、細胞サイクルの減速そして最終的に停止を引き起こす。要点は、増殖して
おり突然老年期になる若い細胞についての、すべてまたは全く無しの減少ではな
いことである。これは、徐々にｐ２１を上げる、傷害されたテロメアの増加する
量の勾配かも知れない。
【０１０３】
我々の結果は、老年期を介してそして次にＮＴ後に正確なＴＴＡＧＧＧの迅速
な再合成を介してのテロメアの人工的除去は、正常細胞より若い状態で増殖する
能力を示す細胞や動物を与え得る。再生産するのに必要な時間以上に生きる細胞
または動物を、進化が選択する理由はない。従って、生殖細胞系が、体細胞に、
必要以上のより均一なＴＴＡＧＧＧを与える理由は無い。細胞を増殖させて老年
期にする技術は、良いテロメア配列と悪いテロメア配列を有効に除去し、次にＮ
Ｔは、細胞が通常有するよりも長い寿命の可能性を与える。細胞が、正常細胞と
匹敵するテロメアの長さを有するなら、これが真実であろう。これは、より長期
間高い分裂促進指数を有する細胞を与え、従って高齢の良好なおよびより長生き
の動物を与えるであろう。
な再合成を介してのテロメアの人工的除去は、正常細胞より若い状態で増殖する
能力を示す細胞や動物を与え得る。再生産するのに必要な時間以上に生きる細胞
または動物を、進化が選択する理由はない。従って、生殖細胞系が、体細胞に、
必要以上のより均一なＴＴＡＧＧＧを与える理由は無い。細胞を増殖させて老年
期にする技術は、良いテロメア配列と悪いテロメア配列を有効に除去し、次にＮ
Ｔは、細胞が通常有するよりも長い寿命の可能性を与える。細胞が、正常細胞と
匹敵するテロメアの長さを有するなら、これが真実であろう。これは、より長期
間高い分裂促進指数を有する細胞を与え、従って高齢の良好なおよびより長生き
の動物を与えるであろう。
【０１０４】
従って、テロメア伸長を伴うかまたはテロメア伸長の無い対象ＮＴ法の使用は
、テロメア中で新しい均一なＴＴＡＧＧＧの再合成を引き起こす。これらの仮説
に拘束されないが、本発明者らはこれは、テロメラーゼ、ＥＰＣ−１のアップレ
ギュレーションを介して、単独または他の遺伝子（例えば、増殖停止配列（ｇａ
ｓ遺伝子）、コラゲナーゼ、ｔＰＡなど）とともに、起きると考えている。これ
は、より長寿命で健康な動物を与え、「超若い」ヒトの治療のための細胞を与え
るはずである。これは、超若い細胞の最初の証明（すなわち正常な若い細胞より
さらに若い遺伝子発現パターンと分裂指数）、すなわち細胞や組織の集団である
。テロメラーゼの使用は、テロメアと細胞の寿命を単に延長したのみである。し
かし本発明者らの知見では、すべての公表された報告は、細胞の全体の表現型が
若いかまたは超若い細胞が得られたことの証拠は示していない。実際多くの研究
者らは、テロメラーゼでゆっくりではあるが無限に分裂する減速した高齢の（し
かし老年期ではない）細胞を報告している。
、テロメア中で新しい均一なＴＴＡＧＧＧの再合成を引き起こす。これらの仮説
に拘束されないが、本発明者らはこれは、テロメラーゼ、ＥＰＣ−１のアップレ
ギュレーションを介して、単独または他の遺伝子（例えば、増殖停止配列（ｇａ
ｓ遺伝子）、コラゲナーゼ、ｔＰＡなど）とともに、起きると考えている。これ
は、より長寿命で健康な動物を与え、「超若い」ヒトの治療のための細胞を与え
るはずである。これは、超若い細胞の最初の証明（すなわち正常な若い細胞より
さらに若い遺伝子発現パターンと分裂指数）、すなわち細胞や組織の集団である
。テロメラーゼの使用は、テロメアと細胞の寿命を単に延長したのみである。し
かし本発明者らの知見では、すべての公表された報告は、細胞の全体の表現型が
若いかまたは超若い細胞が得られたことの証拠は示していない。実際多くの研究
者らは、テロメラーゼでゆっくりではあるが無限に分裂する減速した高齢の（し
かし老年期ではない）細胞を報告している。
【０１０５】
本発明の好適な応用は、テロメアを、所望の寿命を可能にするようにできるだ
け短く維持し、しかしＴＴＡＧＧＧの均一性を最大にすることである。これは、
寿命対癌のリスクの微妙なバランスを最適化し、すなわち細胞は構成的に不死的
ではなく、異常な細胞のクローン拡大を制限するように、必要以上に長いテロメ
アを持たないであろう。
け短く維持し、しかしＴＴＡＧＧＧの均一性を最大にすることである。これは、
寿命対癌のリスクの微妙なバランスを最適化し、すなわち細胞は構成的に不死的
ではなく、異常な細胞のクローン拡大を制限するように、必要以上に長いテロメ
アを持たないであろう。
【０１０６】
この技術を使用して老年期細胞からクローン化された動物は、ユニークな性質
を有することが予測される。例えばその外皮について飼育した動物は、より均一
な外皮色を有すると予測され、免疫応答が上昇しており、より疾患耐性であり、
かつ他の利点を有するであろう。
を有することが予測される。例えばその外皮について飼育した動物は、より均一
な外皮色を有すると予測され、免疫応答が上昇しており、より疾患耐性であり、
かつ他の利点を有するであろう。
【０１０７】
具体的な医学的応用は、我々が述べたように、年齢関連疾患について、例えば
年齢関連黄斑変性、パーキンソン病、アルツハイマー病、骨関節炎、骨粗鬆症、
免疫老化、皮膚老化、肺気腫、動脈瘤、冠動脈心疾患、高血圧、白内障、成人期
発症糖尿病などであろう。さらに、加速した細胞ターンオーバーに関連する症状
、例えば、筋ジストロフィー、帯状ヘルペス、ＡＩＤＳ、および肝硬変が、再生
細胞を投与することにより治療されるであろう。
年齢関連黄斑変性、パーキンソン病、アルツハイマー病、骨関節炎、骨粗鬆症、
免疫老化、皮膚老化、肺気腫、動脈瘤、冠動脈心疾患、高血圧、白内障、成人期
発症糖尿病などであろう。さらに、加速した細胞ターンオーバーに関連する症状
、例えば、筋ジストロフィー、帯状ヘルペス、ＡＩＤＳ、および肝硬変が、再生
細胞を投与することにより治療されるであろう。
【０１０８】
【図１】
ＮＴドナー細胞中の細胞老年期の性状解析。（Ａ）細胞が、位相差顕微鏡によ
り観察される。ドナー細胞は、早期継代ＢＦＦ細胞（ａ）と比較して細胞サイズ
の増大と細胞質顆粒性（ｂ）を示した。（Ｂ）ＢＥＦ細胞（ａ）とドナーＣＬ５
３細胞（ｂ）の代表的電子顕微鏡写真である。ＣＬ５３細胞の渦巻き状の核（ｎ
）に注目されたい。ＣＬ５３細胞はＢＦＦ細胞より大きく、その細胞質は、豊富
なリソソーム（矢印）と厚い小繊維を含有する。両方の写真は同じ倍率である。
棒は、２ミクロンを示す。ミトコンドリア（ｉｎ）。（Ｃ）３０時間のインキュ
ベーション中に 3Ｈ−チミジン取り込みにより測定した早期継代（ａ、ＢＦＦ）
と後期継代（ｂ、ＣＬ５３）細胞のＤＮＡ合成へのエントリー（ブイ・ジェイ・
クリストファロ（V.J. Cristofalo）とビー・ビー・シャーフ（B.B. Sharf）、(
1973) Exp. Cell Res. 76:419）。細胞をオートラジオグラフィー用に処理し、
次に顕微鏡で観察し、標識された核についてスコアをつけた。確立されたプロト
コール（クリストファロ（Cristofalo）とシャーフ（Sharf）(1973)）に従って
、少なくとも４００個の核を数えて、標識された核のパーセントを測定した。（
Ｄ）ドナーＣＬ５３細胞は、ノーザン解析で測定すると、ＥＰＣ−１ ｍＲＮＡ
レベルの低下を示す。早期継代（Ｙ）と後期継代（０）のヒト繊維芽細胞（ＷＩ
−３８）、早期継代（Ｙ：ＢＦＦ）と後期継代（０：ドナーＣＬ５３）のウシ繊
維芽細胞、およびクローン化ウシ皮膚繊維芽細胞株から単離したＲＮＡを示して
ある。細胞をコンフルエンスになるまで増殖させ、無血清培地中で３日間増殖を
停止させた後、細胞からＲＮＡを抽出した（ピー・チョムクジンスキー（P. Cho
mczynski）とエヌ・サッチ（N. Sacchi）(1987) Anal. Biochem 162:156）。等
量のＲＮＡをグリオキサルで処理し、アガロースゲル上で電気泳動により分離し
、ニトロセルロースフィルターに電気泳動的に移し、標準的条件（ディー・ジー
・フィネイ（D.G. Phinney）、シー・エル・ケイパー（C.L. Keiper）、エム・
ケー・フランシス（M.K. Francis）、ケー・ライダー（K. Ryder）、(1994) Onc
ogene 9:2353）を使用して完全長ＥＰＣ−１ ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた
。
り観察される。ドナー細胞は、早期継代ＢＦＦ細胞（ａ）と比較して細胞サイズ
の増大と細胞質顆粒性（ｂ）を示した。（Ｂ）ＢＥＦ細胞（ａ）とドナーＣＬ５
３細胞（ｂ）の代表的電子顕微鏡写真である。ＣＬ５３細胞の渦巻き状の核（ｎ
）に注目されたい。ＣＬ５３細胞はＢＦＦ細胞より大きく、その細胞質は、豊富
なリソソーム（矢印）と厚い小繊維を含有する。両方の写真は同じ倍率である。
棒は、２ミクロンを示す。ミトコンドリア（ｉｎ）。（Ｃ）３０時間のインキュ
ベーション中に 3Ｈ−チミジン取り込みにより測定した早期継代（ａ、ＢＦＦ）
と後期継代（ｂ、ＣＬ５３）細胞のＤＮＡ合成へのエントリー（ブイ・ジェイ・
クリストファロ（V.J. Cristofalo）とビー・ビー・シャーフ（B.B. Sharf）、(
1973) Exp. Cell Res. 76:419）。細胞をオートラジオグラフィー用に処理し、
次に顕微鏡で観察し、標識された核についてスコアをつけた。確立されたプロト
コール（クリストファロ（Cristofalo）とシャーフ（Sharf）(1973)）に従って
、少なくとも４００個の核を数えて、標識された核のパーセントを測定した。（
Ｄ）ドナーＣＬ５３細胞は、ノーザン解析で測定すると、ＥＰＣ−１ ｍＲＮＡ
レベルの低下を示す。早期継代（Ｙ）と後期継代（０）のヒト繊維芽細胞（ＷＩ
−３８）、早期継代（Ｙ：ＢＦＦ）と後期継代（０：ドナーＣＬ５３）のウシ繊
維芽細胞、およびクローン化ウシ皮膚繊維芽細胞株から単離したＲＮＡを示して
ある。細胞をコンフルエンスになるまで増殖させ、無血清培地中で３日間増殖を
停止させた後、細胞からＲＮＡを抽出した（ピー・チョムクジンスキー（P. Cho
mczynski）とエヌ・サッチ（N. Sacchi）(1987) Anal. Biochem 162:156）。等
量のＲＮＡをグリオキサルで処理し、アガロースゲル上で電気泳動により分離し
、ニトロセルロースフィルターに電気泳動的に移し、標準的条件（ディー・ジー
・フィネイ（D.G. Phinney）、シー・エル・ケイパー（C.L. Keiper）、エム・
ケー・フランシス（M.K. Francis）、ケー・ライダー（K. Ryder）、(1994) Onc
ogene 9:2353）を使用して完全長ＥＰＣ−１ ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた
。
【図２】
老年期体細胞からクローン化した正常なウシ。（Ａ）５月齢のＣＬＳ３−８、
ＣＬ５３−２０９、ＣＬ５３−１０、ＣＬ５３−１１およびＣＬ５３−１２（そ
れぞれ、リリー（Lily）、ダフォディル（Daffodil）、クロッカス（Crocus）、
フォルシチア（Forsythia）、およびローズ（Rose）というあだ名をつけた）；
および（Ｂ）１０月齢のＣＬ５３−１（ペルセポネー（Persephone）、挿入図）
。
ＣＬ５３−２０９、ＣＬ５３−１０、ＣＬ５３−１１およびＣＬ５３−１２（そ
れぞれ、リリー（Lily）、ダフォディル（Daffodil）、クロッカス（Crocus）、
フォルシチア（Forsythia）、およびローズ（Rose）というあだ名をつけた）；
および（Ｂ）１０月齢のＣＬ５３−１（ペルセポネー（Persephone）、挿入図）
。
【図３】
老年期ドナー細胞の増殖性寿命を回復する核移行の能力。（Ａ）元々のＢＦＦ
細胞株（＊）の増殖曲線を、後期継代ＢＦＦ細胞（ＣＬ５３細胞）からクローン
化した胎児（ＡＣＴ９９−００２）（ｏ）から得られる細胞の増殖曲線と比較す
る。（Ｂ）培養物が約２集団倍加が残っていることを示すＣＬ５３ドナー細胞の
増殖曲線。（Ｃ）後期継代ＣＬ５３細胞（ｎ＝９７）を、クローン密度で接種し
、１月後の増殖能力を比較した。（Ｄ）後期継代細胞から得られたクローンと比
較して、早期継代ＢＦＦ培養物（元々）と早期継代ＡＣＴ９９−００２（クロー
ン）からの単一細胞クローンは、増殖延長の能力を示した。
細胞株（＊）の増殖曲線を、後期継代ＢＦＦ細胞（ＣＬ５３細胞）からクローン
化した胎児（ＡＣＴ９９−００２）（ｏ）から得られる細胞の増殖曲線と比較す
る。（Ｂ）培養物が約２集団倍加が残っていることを示すＣＬ５３ドナー細胞の
増殖曲線。（Ｃ）後期継代ＣＬ５３細胞（ｎ＝９７）を、クローン密度で接種し
、１月後の増殖能力を比較した。（Ｄ）後期継代細胞から得られたクローンと比
較して、早期継代ＢＦＦ培養物（元々）と早期継代ＡＣＴ９９−００２（クロー
ン）からの単一細胞クローンは、増殖延長の能力を示した。
【図４】
テロメアの長さの解析。（Ａ）有核血液細胞。クローン化動物および対照動物
からの末梢血試料を、フローＦＩＳＨ（エヌ・ルファー（N. Rufer）、ダブリュ
ー・ドラゴウスカ（W. Dragowska）、ジー・ソーンブリー（G. Thornbury）、イ
ー・ルースネク（E. Roosnek）、ピー・エム・ランスドープ（P.M. Lansdorp）(
1998) Nature Biotechnol. 16:743）により、２つの別々のブラインド実験で解
析した。塩化アンモニウムを使用して赤血球の浸透圧溶解後に得られた有核細胞
（プールした顆粒球とリンパ球）の二重測定の試料を、既に記載されている（エ
ヌ・ルファー（N. Rufer）ら、J. Exp. Med. 190:157）ようにフローＦＩＳＨに
より解析した。ＦＩＴＣ−標識テロメアプローブで得られた平均蛍光から、平均
バックグランド蛍光を引いて、ゲーティッド（ゲートされた）単核細胞の平均テ
ロメア蛍光を計算した。正常なウシではテロメア蛍光の年齢に応じた低下があり
、クローン化動物では比較的長いテロメアがあることに注目されたい。（Ｂ）末
端制限断片の解析。対照細胞から単離したゲノムＤＮＡ（プレトランスフェクシ
ョンＢＦＦウシ繊維芽細胞）、老年期ＣＬ５３細胞、および老年期ＣＬ５３細胞
を用いるＮＴにより得られた７週齢のクローン化した胎児からの繊維芽細胞（Ａ
ＣＴ９９−００２）。Ｈｉｎｆｌ／ＲｓａＩによる消化後に得られたＤＮＡ断片
のＴＲＦ解析を、０．５％アガロースゲルで１２時間、既に記載されているよう
に行った（テロメア長さ測定キット（Telomere Length Assay Kit）、ファーミ
ンゲン（Pharmingen）、サンジエゴ、カリホルニア州）。レーン１：ＣＥＰＨリ
ンパ芽球ヒト細胞株１３４１０５からの対照ＤＮＡ；レーン２：ビオチン化マー
カー（ファーミンゲン（Pharmingen））；レーン３：テロロウ（TeloLow）対照
ＤＮＡ（ファーミンゲン（Pharmingen）、ＴＲＦの平均長さ３．３kb）；レーン
４：老年期ＣＬ５３細胞；レーン５：ＢＦＦ繊維芽細胞プレトランスフェクショ
ン；レーン６：ＡＣＴ９９−００２（クローン化）細胞。（Ｃ）０．５％アガロ
ースゲル上で２４時間電気泳動後のＢと同様のＴＲＥ解析。レーン１：ＡＣＴ９
９−００２細胞（ＴＲＦの平均長さ１９．３kb）；レーン２：ＢＦＦ０５６Ｈ繊
維芽細胞プレトランスフェクション（ＴＲＦの平均長さ１７．９kb）；レーン３
：老年期ＣＬ５３細胞（ＴＲＦの平均長さ１６．２kb）；レーン４：テロハイ（
TeloHigh）対照ＤＮＡ（ファーミンゲン（Pharmingen）、ＴＲＦの平均長さ１１
．３kb）；レーン５：ＣＥＰＨリンパ芽球ヒト細胞株１３４１０５からの対照Ｄ
ＮＡ；レーン６：ＨｉｎｄIIIで切断したビオチン化ラムダＤＮＡ（分子量マー
カー）。（Ｄ）プレトランスフェクションＢＩＴウシ繊維芽細胞、老年期ＣＬ５
３細胞およびＡＣＴ９９−００２繊維芽細胞のフローＦＩＳＨ解析。ＦＩＴＣ−
© ３ＴＡ２）３ペプチド核酸プローブ有りまたは無しでハイブリダイズし
た後の細胞を分析した（それぞれ灰色と黒のヒストグラム）。単一の細胞を光散
乱性に基づいてゲーティッド（ゲート）した。核ドナーとして使用した老年期Ｃ
ＬＳ３細胞中の高い自己蛍光に注目されたい。蛍光は、線形のスケールで測定し
た。バックグランド蛍光を引いた後、ＡＣＴ９９−００２（クローン化）細胞が
最も高い蛍光を有し、次はＢＦＦ（元々）細胞である。老年期ＣＬ５３細胞は、
最も低い特異的蛍光を有するようである。
からの末梢血試料を、フローＦＩＳＨ（エヌ・ルファー（N. Rufer）、ダブリュ
ー・ドラゴウスカ（W. Dragowska）、ジー・ソーンブリー（G. Thornbury）、イ
ー・ルースネク（E. Roosnek）、ピー・エム・ランスドープ（P.M. Lansdorp）(
1998) Nature Biotechnol. 16:743）により、２つの別々のブラインド実験で解
析した。塩化アンモニウムを使用して赤血球の浸透圧溶解後に得られた有核細胞
（プールした顆粒球とリンパ球）の二重測定の試料を、既に記載されている（エ
ヌ・ルファー（N. Rufer）ら、J. Exp. Med. 190:157）ようにフローＦＩＳＨに
より解析した。ＦＩＴＣ−標識テロメアプローブで得られた平均蛍光から、平均
バックグランド蛍光を引いて、ゲーティッド（ゲートされた）単核細胞の平均テ
ロメア蛍光を計算した。正常なウシではテロメア蛍光の年齢に応じた低下があり
、クローン化動物では比較的長いテロメアがあることに注目されたい。（Ｂ）末
端制限断片の解析。対照細胞から単離したゲノムＤＮＡ（プレトランスフェクシ
ョンＢＦＦウシ繊維芽細胞）、老年期ＣＬ５３細胞、および老年期ＣＬ５３細胞
を用いるＮＴにより得られた７週齢のクローン化した胎児からの繊維芽細胞（Ａ
ＣＴ９９−００２）。Ｈｉｎｆｌ／ＲｓａＩによる消化後に得られたＤＮＡ断片
のＴＲＦ解析を、０．５％アガロースゲルで１２時間、既に記載されているよう
に行った（テロメア長さ測定キット（Telomere Length Assay Kit）、ファーミ
ンゲン（Pharmingen）、サンジエゴ、カリホルニア州）。レーン１：ＣＥＰＨリ
ンパ芽球ヒト細胞株１３４１０５からの対照ＤＮＡ；レーン２：ビオチン化マー
カー（ファーミンゲン（Pharmingen））；レーン３：テロロウ（TeloLow）対照
ＤＮＡ（ファーミンゲン（Pharmingen）、ＴＲＦの平均長さ３．３kb）；レーン
４：老年期ＣＬ５３細胞；レーン５：ＢＦＦ繊維芽細胞プレトランスフェクショ
ン；レーン６：ＡＣＴ９９−００２（クローン化）細胞。（Ｃ）０．５％アガロ
ースゲル上で２４時間電気泳動後のＢと同様のＴＲＥ解析。レーン１：ＡＣＴ９
９−００２細胞（ＴＲＦの平均長さ１９．３kb）；レーン２：ＢＦＦ０５６Ｈ繊
維芽細胞プレトランスフェクション（ＴＲＦの平均長さ１７．９kb）；レーン３
：老年期ＣＬ５３細胞（ＴＲＦの平均長さ１６．２kb）；レーン４：テロハイ（
TeloHigh）対照ＤＮＡ（ファーミンゲン（Pharmingen）、ＴＲＦの平均長さ１１
．３kb）；レーン５：ＣＥＰＨリンパ芽球ヒト細胞株１３４１０５からの対照Ｄ
ＮＡ；レーン６：ＨｉｎｄIIIで切断したビオチン化ラムダＤＮＡ（分子量マー
カー）。（Ｄ）プレトランスフェクションＢＩＴウシ繊維芽細胞、老年期ＣＬ５
３細胞およびＡＣＴ９９−００２繊維芽細胞のフローＦＩＳＨ解析。ＦＩＴＣ−
© ３ＴＡ２）３ペプチド核酸プローブ有りまたは無しでハイブリダイズし
た後の細胞を分析した（それぞれ灰色と黒のヒストグラム）。単一の細胞を光散
乱性に基づいてゲーティッド（ゲート）した。核ドナーとして使用した老年期Ｃ
ＬＳ３細胞中の高い自己蛍光に注目されたい。蛍光は、線形のスケールで測定し
た。バックグランド蛍光を引いた後、ＡＣＴ９９−００２（クローン化）細胞が
最も高い蛍光を有し、次はＢＦＦ（元々）細胞である。老年期ＣＬ５３細胞は、
最も低い特異的蛍光を有するようである。
【図５】
テロメラーゼは、再構築した胚中で発現されるがドナーウシの繊維芽細胞では
発現されない。テロメア活性は、テロメリックリピート増幅プロトコール（Tele
meric Repeat Amplification Protocol）（ＴＲＡＰ）アッセイキット（ファー
ミンゲン（Pharmingen）、サンジエゴ、カリホルニア州）を使用して測定した。
成体ドナー老年期（ＣＬ５３）繊維芽細胞と７日目の再構築したウシ胚（ｎ＝１
５）から溶解物を得て、ＴＲＡＰアッセイで使用した。レーン１：４０００ Ｋ
５６２ヒト赤白血病細胞株細胞の抽出物；レーン２：２０bpラダー；レーン３：
細胞抽出物無し；レーン４：熱処理胚（ｎ−１）抽出物；レーン５、ｎ＝１０；
レーン６，ｎ＝１；レーン７、ｎ＝０．１；レーン８、ｎ＝０．０１）；レーン
９：４０００ドナーＣＬ５３繊維芽細胞の抽出物；レーン１０〜１１：繊維芽細
胞抽出物の対照（それぞれ、ＴＳ鋳型無しと熱不活性化抽出物）；レーン１２：
２０bpラダー。すべてのレーンは、内部対照ＴＲＡＰ反応物（３６bp）を含む。
発現されない。テロメア活性は、テロメリックリピート増幅プロトコール（Tele
meric Repeat Amplification Protocol）（ＴＲＡＰ）アッセイキット（ファー
ミンゲン（Pharmingen）、サンジエゴ、カリホルニア州）を使用して測定した。
成体ドナー老年期（ＣＬ５３）繊維芽細胞と７日目の再構築したウシ胚（ｎ＝１
５）から溶解物を得て、ＴＲＡＰアッセイで使用した。レーン１：４０００ Ｋ
５６２ヒト赤白血病細胞株細胞の抽出物；レーン２：２０bpラダー；レーン３：
細胞抽出物無し；レーン４：熱処理胚（ｎ−１）抽出物；レーン５、ｎ＝１０；
レーン６，ｎ＝１；レーン７、ｎ＝０．１；レーン８、ｎ＝０．０１）；レーン
９：４０００ドナーＣＬ５３繊維芽細胞の抽出物；レーン１０〜１１：繊維芽細
胞抽出物の対照（それぞれ、ＴＳ鋳型無しと熱不活性化抽出物）；レーン１２：
２０bpラダー。すべてのレーンは、内部対照ＴＲＡＰ反応物（３６bp）を含む。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｈ０４５
Ａ６１Ｐ 1/16 5/14
3/10 9/00
5/14 9/10
9/00 9/12
9/10 13/12
9/12 15/08
13/12 17/00
15/08 19/02
17/00 19/10
19/02 21/04
19/10 25/08
21/04 25/14
25/08 25/16
25/14 25/28
25/16 29/00
25/28 １０１
29/00 31/18
１０１ 35/00
31/18 37/02
35/00 43/00 １０５
37/02 Ｃ０７Ｋ 14/47
43/00 １０５ Ｃ１２Ｑ 1/02
Ｃ０７Ｋ 14/47 1/25
Ｃ１２Ｎ 5/10 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
1/25 5/00 Ｂ
1/68 Ａ６１Ｋ 37/02
(31)優先権主張番号 ０９／５２７，０２６
(32)優先日 平成12年３月16日(2000．3．16)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ０９／５２０，８７９
(32)優先日 平成12年４月５日(2000．4．5)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，
ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ
Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ
，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，
ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ
Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ
，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，
ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ
Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ
，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 シベリ、ホセ
アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ホー
ルデン、 タムロック サークル 21
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA04 CA06 DA02
EA04 FA02 FA11 GA11 HA20
4B063 QA08 QA13 QQ21 QQ43 QR32
QR55 QS34
4B065 AA91X AA91Y AB01 AC20
BA30 CA44 CA60
4C084 AA02 AA06 AA13 AA17 BA03
DC50 NA14 ZA022 ZA062
ZA082 ZA152 ZA162 ZA362
ZA402 ZA422 ZA752 ZA812
ZA892 ZA942 ZA962 ZA972
ZB072 ZB152 ZB262 ZC022
ZC062 ZC352 ZC552
4C087 AA01 AA03 BB65 CA12 NA14
ZA02 ZA06 ZA08 ZA15 ZA16
ZA36 ZA40 ZA42 ZA75 ZA81
ZA89 ZA94 ZA96 ZA97 ZB07
ZB15 ZB26 ZC02 ZC06 ZC35
ZC55
4H045 AA10 CA40 EA22 EA28 FA74
Claims (86)
- 【請求項１】 １次細胞を若返らせる方法であって、 ａ．第１の細胞、該第１細胞の核、または第１細胞の染色体を、受容体である
卵母細胞または卵に移行させて、胚を作成する； ｂ．該胚を使用して、内部細胞マス、胚盤および／または幹細胞を得る； ｃ．該内部細胞マス、胚盤および／または幹細胞を、免疫能低下動物に注入し
て、奇形腫を生成する； ｄ．該生じる奇形腫を単離する； ｅ．特定の細胞型を同定するために、異なる胚葉を分離する； ｆ．第１の細胞と同じ型の細胞を単離する、 ことを含んでなる上記方法。 - 【請求項２】 １次細胞は、老年期細胞または老年期に近い細胞である、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 核移行奇形腫から単離された細胞は、核移行法によっては作
成されない同年齢の対照奇形腫からの細胞と、平均して少なくとも同じ長さであ
るテロメアを有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 テロメアは、核移行法によっては作成されない同年齢の対照
奇形腫からの細胞のものより平均して長い、請求項４に記載の方法。 - 【請求項５】 １次細胞は繊維芽細胞である、請求項２に記載の方法。
- 【請求項６】 免疫能低下動物は、ＳＣＩＤマウスまたはヌードマウスであ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 １次細胞は、ゲノムに少なくとも１つの変化を有する、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項８】 異なる細胞型である第１の細胞と同じ遺伝子型を有する１次
細胞の作成方法であって、 ａ．第１の細胞の核を、受容体卵母細胞に移行させて、胚を作成する； ｂ．該胚を使用して、内部細胞マス、胚盤および／または幹細胞を得る； ｃ．該内部細胞マス、胚盤および／または幹細胞を、免疫能低下動物に注入し
て、奇形腫を生成する； ｄ．該生じる奇形腫を単離する； ｅ．特定の細胞型を同定するために、異なる胚葉を分離する； ｆ．第１の細胞と異なる型の細胞を単離する、 ことを含んでなり、新しい１次細胞のテロメアは、核移行法によっては作成され
ない奇形腫中の同年齢の対照細胞のテロメアと少なくとも同じ長さである、上記
方法。 - 【請求項９】 １次細胞は、老年期細胞または老年期に近い細胞である、請
求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 １次細胞は繊維芽細胞である、請求項９に記載の方法。
- 【請求項１１】 １次細胞は、平滑筋、骨格筋、心筋、皮膚、および腎臓よ
りなる群から選択される型である、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１２】 増殖因子の存在下で異なる型の細胞を増殖させて、さらに
分化を促進することをさらに含む、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１３】 １次細胞は、（移植の必要な患者への移植のための）組織
を作成するのに使用される、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】 第１の細胞のゲノムは、核移行の前に改変される、請求項
８に記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項８に記載の方法により単離される細胞。
- 【請求項１６】 請求項１３に記載の方法により単離される組織。
- 【請求項１７】 遺伝子改変は、少なくとも１つの異種遺伝子のトランスフ
ェクションを含む、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１８】 遺伝子改変は、少なくとも１つの未変性の遺伝子の破壊を
含む、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１９】 遺伝子改変は、少なくとも１つの未変性の遺伝子のトラン
スフェクションを含む、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項２０】 遺伝子改変は、少なくとも１つの未変性の遺伝子の破壊を
含む、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項２１】 受容体卵母細胞への核移行を使用して遺伝子操作の間で１
次細胞を若返らせることを含む、１次細胞中の複合遺伝子操作の実施方法であっ
て、該細胞は、核移行の前に老年期または老年期に近い状態まで継代される上記
方法。 - 【請求項２２】 受容体卵母細胞への核移行を使用して遺伝子操作の間で１
次細胞を若返らせることを含む、１次細胞中の複合遺伝子操作の実施方法であっ
て、該細胞は、核移行の前に老年期または老年期様の状態まで誘導される上記方
法。 - 【請求項２３】 若返りにより、平均して同年齢の対照胚細胞と少なくとも
同じ長さのテロメアを有する胚細胞が得られる、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２４】 請求項２１に記載の方法に従って遺伝子改変を受けた１次
細胞。 - 【請求項２５】 請求項２４に記載の細胞と同じ遺伝子型を有する遺伝子改
変動物の作成方法であって、 ａ．受容体卵母細胞に該細胞の核を移行させる、 ｂ．該有核卵母細胞から胚または胚幹細胞を作成する、 ｃ．受容体である雌に該胚または胚幹細胞を導入する、そして ｄ．雌が、該１次細胞と同じ遺伝子型を有する新生児動物を出産するように、
該胚または胚幹細胞を完全に成長させる、ことを含む上記方法。 - 【請求項２６】 動物は、同年齢の対照動物と平均して少なくとも同じ長さ
のテロメアを有する、請求項２５に記載の方法により作成される遺伝子改変動物
。 - 【請求項２７】 再クローン化の核を提供するために使用されるドナー細胞
は、老年期または老年期に近い細胞である、核移行法を使用してクローン化動物
を再クローン化する方法。 - 【請求項２８】 再クローン化動物は、クローン化動物に対して遺伝子が改
変されている、請求項２５に記載の方法。 - 【請求項２９】 少なくとも２つの遺伝子修飾を有する再クローン化内部細
胞マス、胚盤胞、奇形腫、胚、胎児、または動物の作成方法であって： ａ．目的の動物から１次細胞を得る、 ｂ．異種ＤＮＡを挿入および／または未変性のＤＮＡを欠失させて、該１次細
胞に第１の遺伝子修飾を作成する、 ｃ．該遺伝子修飾した１次細胞を複製させて、老年期または老年期に近い状態
にする、 ｄ．有核卵母細胞または有核受精卵への核移行のための核ドナーとして、第１
の遺伝子修飾した老年期または老年期に近い細胞を使用する、 ｅ．該第１の遺伝子修飾を有する、クローン化内部細胞マス、胚盤胞、奇形腫
、胚、胎児、または動物を得る、 ｆ．該クローン化内部細胞マス、胚盤胞、奇形腫、胚、胎児、または動物から
クローン化１次細胞を得る、 ｇ．異種ＤＮＡを挿入および／または未変性のＤＮＡを欠失させて、該クロー
ン化１次細胞に第２の遺伝子修飾を作成する、 ｈ．該第２のクローン化１次細胞を老年期または老年期に近い状態まで複製さ
せる、 ｉ．有核卵母細胞または有核受精卵への核移行のための核ドナーとして、該第
１および第２の遺伝子修飾を有する、老年期または老年期に近いクローン化１次
細胞を使用する、そして ｊ．該第１および第２の遺伝子修飾を有する、再クローン化内部細胞マス、胚
盤胞、奇形腫、胚、胎児、または動物を得る、ことを含む上記方法。 - 【請求項３０】 再クローン化内部細胞マス、胚盤胞、奇形腫、胚、胎児、
または動物が再クローン化され、さらなる再クローン化が、第１、第２、および
第３の遺伝子修飾を有するように、第３の遺伝子修飾が作成されることをさらに
含む請求項２９に記載の方法。 - 【請求項３１】 さらなる再クローン化は、老年期または老年期に近いドナ
ー細胞を使用する核移行法により作成される、請求項３０に記載の方法。 - 【請求項３２】 再クローン化物は、核移行法を使用しては作成されない同
年齢の対照動物と、平均して少なくとも同じ長さのテロメアを有する、請求項２
９に記載の方法。 - 【請求項３３】 さらなる再クローン化物は、核移行法を使用しては作成さ
れない同年齢の対照動物と、平均して少なくとも同じ長さのテロメアを有する、
請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３４】 遺伝子修飾は、免疫機能に関与する遺伝子を含む、請求項
２９に記載の方法。 - 【請求項３５】 目的の動物は、有蹄動物である、請求項２９に記載の方法
。 - 【請求項３６】 目的の動物は、ウシである、請求項３５に記載の方法。
- 【請求項３７】 細胞の核を受容体卵母細胞に移行させることを含む、老年
期細胞、チェックポイント停止細胞、または老年期に近い細胞の寿命をリセット
する方法。 - 【請求項３８】 受容体卵母細胞は、該老年期または老年期に近い細胞とは
異なる種である、請求項３７に記載の方法。 - 【請求項３９】 有核卵母細胞から胚または胚幹細胞を作成することをさら
に含む、請求項３７に記載の方法。 - 【請求項４０】 老年期または老年期に近い細胞中のテロメラーゼ活性を増
強するメンバーについて、胚または胚幹細胞から作成されたｃＤＮＡまたはｍＲ
ＮＡライブラリーをスクリーニングすることを含む、テロメラーゼ活性を直接ま
たは間接に増強する少なくとも１つの遺伝子の同定方法。 - 【請求項４１】 テロメラーゼ活性の増強は、テロメラーゼレポーター遺伝
子の発現増強を測定することにより測定される、請求項４０に記載の方法。 - 【請求項４２】 テロメラーゼレポーター遺伝子は、レポーター遺伝子に融
合したｈＴＲＴ遺伝子を含む構築体である、請求項４１に記載の方法。 - 【請求項４３】 構築体は、遺伝子融合を含む、請求項４２に記載の方法。
- 【請求項４４】 構築体は、タンパク質融合を含む、請求項４２に記載の方
法。 - 【請求項４５】 増強されたテロメラーゼ活性は、ＴＲＡＰｅｚｅアッセイ
により測定される、請求項４０に記載の方法。 - 【請求項４６】 ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーは、ライブラリース
クリーニングの前に、老年期細胞からのｃＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーと
のサブトラクティブハイブリダイゼーションに付される、請求項４０に記載の方
法。 - 【請求項４７】 胚幹細胞中のテロメラーゼ活性を抑制するメンバーについ
て、老年期または老年期に近い細胞から作成されたｃＤＮＡまたはｍＲＮＡライ
ブラリーをスクリーニングすることを含む、テロメラーゼ活性を直接または間接
に抑制する少なくとも１つの遺伝子の同定方法。 - 【請求項４８】 テロメラーゼ活性の低下は、テロメラーゼレポーター遺伝
子の発現低下を測定することにより測定される、請求項４７に記載の方法。 - 【請求項４９】 テロメラーゼレポーター遺伝子は、レポーター遺伝子に融
合したｈＴＲＴ遺伝子を含む構築体である、請求項４７に記載の方法。 - 【請求項５０】 構築体は、遺伝子融合を含む、請求項４９に記載の方法。
- 【請求項５１】 構築体は、タンパク質融合を含む、請求項４９に記載の方
法。 - 【請求項５２】 テロメラーゼ活性はタンパク質相互作用により低下し、テ
ロメラーゼ活性の低下は、ＴＲＡＰｅｚｅアッセイにより測定される、請求項４
７に記載の方法。 - 【請求項５３】 ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーは、ライブラリース
クリーニングの前に、胚幹細胞からのｃＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーとの
サブトラクティブハイブリダイゼーションに付される、請求項４７に記載の方法
。 - 【請求項５４】 ＥＰＣ−１および／またはテロメラーゼ活性を増強するタ
ンパク質の同定方法であって、 ａ．卵母細胞の細胞質から画分を集める、 ｂ．これらを、老年期または老年期に近い細胞から設計された無細胞系に加え
る、そして ｃ．特定の卵母細胞の細胞質画分への暴露により生じる、テロメラーゼおよび
／またはＥＰＣ−１活性の変化を測定する、ことを含む上記方法。 - 【請求項５５】 請求項４０に記載の方法により同定される遺伝子。
- 【請求項５６】 請求項４７に記載の方法により同定される遺伝子。
- 【請求項５７】 請求項５４に記載の方法により同定されるタンパク質。
- 【請求項５８】 老年期または老年期に近いドナー細胞を使用する核移行に
より作成される胚幹細胞を化合物に暴露して、該化合物がテロメラーゼおよび／
またはＥＰＣ−１活性を阻害するかどうかを測定することを含む、テロメラーゼ
および／またはＥＰＣ−１活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。 - 【請求項５９】 請求項５８に記載の方法により同定される化合物。
- 【請求項６０】 活性の増強が必要な被験体中のテロメラーゼ活性を増強す
ることを目的とする、請求項５５に記載の遺伝子、またはその部分もしくは転写
生成物を含む医薬組成物。 - 【請求項６１】 活性の増強が必要な被験体中のテロメラーゼ活性を増強す
ることを目的とする、請求項５５に記載の遺伝子によりコードされる遺伝子産物
を含む医薬組成物。 - 【請求項６２】 活性の抑制が必要な被験体中のテロメラーゼ活性を抑制す
ることを目的とする、請求項５６に記載の遺伝子、またはその部分もしくは転写
生成物を含む医薬組成物。 - 【請求項６３】 活性の抑制が必要な被験体中のテロメラーゼ活性を抑制す
ることを目的とする、請求項５６に記載の遺伝子にコードされる遺伝子産物を含
む医薬組成物。 - 【請求項６４】 活性の増強が必要な被験体中のテロメラーゼ活性を増強す
ることを目的とする、請求項５８に記載のタンパク質を含む医薬組成物。 - 【請求項６５】 請求項５８に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 【請求項６６】 活性の増強が必要な被験体中のテロメラーゼ活性を増強す
ることを目的とする、請求項６５に記載の遺伝子を含む医薬組成物。 - 【請求項６７】 活性の低下が必要な患者中のテロメラーゼ活性を阻害する
ことを目的とする、請求項５９に記載の化合物を含む医薬組成物。 - 【請求項６８】 １次細胞の寿命を延長することを目的とする、内因性テロ
メラーゼおよび／またはＥＰＣ−１の活性化方法。 - 【請求項６９】 体細胞の寿命に運命付けられている細胞またはそのＤＮＡ
を発現させて、胚または胚細胞またはその分画された化合物にすることにより作
成される、若返った増殖能力を有する細胞。 - 【請求項７０】 同じ型および種の年齢の一致した体細胞と比較して、ＥＰ
Ｃ−１活性が上昇しおよび／またはテロメアが長くなっている、請求項６９に記
載の細胞。 - 【請求項７１】 ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、マウス、ラット、
ヤギ、ヒツジ、モルモット、クマ、ウサギよりなる群から選択される、請求項６
９に記載の細胞。 - 【請求項７２】 ヒト細胞である、請求項６９に記載の細胞。
- 【請求項７３】 請求項６０に記載の細胞から得られる、伸長したテロメア
を有するＤＮＡ。 - 【請求項７４】 ヒトの細胞から得られる、請求項７３に記載のＤＮＡ。
- 【請求項７５】 体細胞系統に運命付けられている細胞またはそのＤＮＡを
、卵、卵母細胞、胚細胞、またはそこから単離される分画された成分に暴露する
ことによる、若返った増殖能力を有する細胞の産生方法。 - 【請求項７６】 体細胞は、老年期、老年期に近い、またはチェックポイン
トで停止したものである、請求項７５に記載の方法。 - 【請求項７７】 体細胞はヒト細胞である、請求項７５に記載の方法。
- 【請求項７８】 体細胞は、老化関連症状または細胞ターンオーバーの上昇
に関連する症状を有するヒトから得られる、請求項７７に記載の方法。 - 【請求項７９】 症状は、ＡＩＤＳ、筋ジストロフィー、神経変性障害、高
血圧、免疫不全、骨関節炎、および糖尿病よりなる群から選択される、請求項７
８に記載の方法。 - 【請求項８０】 ドナー細胞または核は、老年期細胞またはチェックポイン
トで停止した細胞である、核移行により産生されるクローン化非ヒト胚、動物細
胞、または非ヒト動物。 - 【請求項８１】 年齢の一致した対照と比較して、伸長したテロメラーゼ、
および／または上昇したＥＰＣ−１活性、および／または上昇したテロメラーゼ
活性、および／または上昇した増殖能力または寿命を有する、非ヒト胚または動
物またはヒトまたは非ヒト細胞を産生させる核移行の改良法であって、該改良は
、ドナー細胞またはＤＮＡとして、老年期の、老年期に近い、チェックポイント
で停止したドナー細胞またはＤＮＡを使用することを含む上記方法。 - 【請求項８２】 細胞の老化または老年期に影響を与える化合物の同定方法
であって、 （ｉ）ＥＰＣ−１遺伝子またはＥＰＣ−１制御配列でトランスフェクトした細
胞を産生する；そして （ii）該制御配列を「スイッチオン」にする化合物を同定する、ことを含む上
記方法。 - 【請求項８３】 ＥＰＣ−１制御配列または遺伝子は、ＤＮＡ発現が検出可
能なＤＮＡに機能的に連結している、請求項８２に記載の方法。 - 【請求項８４】 マーカーＤＮＡに機能的に連結した、ＥＰＣ−１遺伝子ま
たはそれに関連した制御配列でトランスフェクトされている真核細胞。 - 【請求項８５】 構成性または強い制御性プロモーターに機能的に連結した
ＥＰＣ−１遺伝子でトランスフェクトされている真核細胞。 - 【請求項８６】 ＥＰＣ−１遺伝子は、ＣＭＶ、ＰＧＫ、または他の非ＥＰ
Ｃ−１制御配列に機能的に連結している、請求項８５に記載の細胞。
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