JP2003507710A - 神経伝達物質を変調する化合物の識別方法 - Google Patents

神経伝達物質を変調する化合物の識別方法

Info

Publication number
JP2003507710A
JP2003507710A JP2001517159A JP2001517159A JP2003507710A JP 2003507710 A JP2003507710 A JP 2003507710A JP 2001517159 A JP2001517159 A JP 2001517159A JP 2001517159 A JP2001517159 A JP 2001517159A JP 2003507710 A JP2003507710 A JP 2003507710A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
compound
tested
neurotransmitter
released
neural tissue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001517159A
Other languages
English (en)
Inventor
イスラエル モーリス
レスバツ ベルナード
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of JP2003507710A publication Critical patent/JP2003507710A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9406—Neurotransmitters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70571—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、神経伝達物質放出を変調することが可能な化合物の識別方法であって、テストする少なくとも１種の化合物を神経組織標本と接触させることおよび前記神経組織標本による神経伝達物質放出に関して場合によって起こり得る前記化合物の変調効果を測定することを特徴とする方法に関する。本発明は、この方法を実施するためのキットにも同様に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、神経伝達物質放出に作用する化合物を明らかにする、または特徴付
けるための組成物および方法に関する。これらの方法を実施するために、および
治療薬または治療薬開発の導出としてこのように識別または特徴付けられた化合
物を使用するために有用な神経組織標本にも同様に関する。
【０００２】 神経系の発作が神経変性であろうと、精神的緊張（うつ病、精神病）または心
理的外傷と結び付いていようと、我々の社会に生じる問題を意識して、製薬グル
ープおよび学術研究機関は、これらの病理学を理解し、かつ予防することを目的
とする野心的な計画を打ち上げた。このために薬剤の分泌変更細胞の移植に基づ
く新規な治療、並びに予防または前処置を保証する新規な生成物の発見は、多数
の実験室にとって優先的な目標となった。しかしながら、中枢神経伝達並びにそ
れらを調整するプロセスは複雑であり、かつ内因性または外因性神経毒性標的を
位置付けることは、しばしば困難であることを理解せねばならない。従って、多
数の組の潜在的標的に作用する多数の生成物を迅速に探求することを可能にする
技術を持つことが、大変重要である。
【０００３】 今日、製薬産業によって使用されている方法は、時間がかかり、重荷となり、
かつ困難である。例えば、これらの方法は、本質的に神経伝達物質放出後に起こ
ることの調査、すなわちシナプス後の出来事の調査に根拠を置いている。
【０００４】 本発明は、より大きな成功率で、神経系病理学の調査、予防および治療に取り
組むことを可能にする新規な方法および組成物を提案する。本発明は、そのシナ
プス前の局面による神経伝達変調の調査に特に根拠を置く。従って、本発明は、
効果または症状にではなく、病理の源および原因に直接作用する。本発明は、神
経組織標本に関する多数のテスト化合物の同時調査を可能にし、かつ高いレベル
の信頼性および再生可能性を与える。
【０００５】 この目的は、神経伝達物質放出を変調することが可能な化合物の識別方法であ
って、テストする少なくとも１種の化合物を神経組織標本と接触させること、お
よび前記神経組織標本による神経伝達物質放出に関して場合によって起こり得る
前記化合物の変調効果を測定することを特徴とする方法により、本発明によって
達成される。
【０００６】 本発明は、潅流した脳、組織切片、分離神経終末（シナプトソーム）、細胞培
養等のような生きた標本に対しリアルタイムで使用され得る、迅速、簡易、高精
度および信頼できる一連の神経伝達物質定量を提供することにおいて注目すべき
である。先行技術に記載された探求技術は、レセプタへの作用、神経伝達物質分
解酵素または再捕阻害剤のように、放出後の局面に関するが、本発明による方法
は、神経伝達物質放出、すなわち神経伝達のシナプス前の面に関心を有する。
【０００７】 好ましい実施形状によれば、本発明の方法は、テストする少なくとも１種の化
合物を神経組織標本と接触させ、次に前記標本またはその上清を、少なくとも１
種が神経組織標本によって放出された神経伝達物質と反応することが可能である
１種または数種の物質の存在下に置くこと、および神経伝達物質が放出された場
合、検出可能な前記物質の１種または数種を検出または定量して、あるいは神経
伝達物質が放出された場合、前記物質の１種の変換の結果生じた少なくとも１種
の生成物を検出または定量して、テストする化合物の場合によって起こり得る変
調効果を測定することを特徴とする。
【０００８】 神経組織標本をテストする化合物と接触させることは、前記化合物にとって、
前記標本に対して場合によって起こり得る効果を示すことが可能になるために十
分な時間にわたって行われる。
【０００９】 本発明の方法は、分離化合物、化合物混合物、生体試料、組み合わせライブラ
リ（ｂａｎｑｕｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｉｒｅ）、合成または天然分子等をテス
トすることを可能にする。その作用を特徴付けることを希望する、公知の生成物
、または未知の生成物若しくは定義されていない混合物が問題となり得る。以下
に示すように、本発明は、１匹の動物から多数の脳物質試料を扱うことを可能に
する神経組織標本を記載し、それにより大量の化合物、特に化合物ライブラリを
同時にまたは連続してテストすることが可能になる。
【００１０】 このように、本発明の方法は、連続的にせよ同時にせよ、並行してまたは並行
せずに、テストする数種の化合物を神経組織標本と接触させることにあっても良
い。
【００１１】 同時に接触させるために、テストされる化合物は、例えば検出可能な物質で溶
液にされ、次に得られた混合物は、神経組織標本と接触させられる。他の実施態
様において、テストされる化合物、および少なくとも１種が神経伝達物質と反応
することが可能な物質を含む溶液は、別々に操作され、かつ神経組織標本を含む
培地に同時に導入される。次に上清が取り入れられて、定量が行われる。
【００１２】 連続的に接触させるため、神経組織標本は、少なくとも１種が神経伝達物質と
反応することが可能な１種または数種の物質を含む溶液と第１段階で接触させら
れ得る。このことは、場合によってあり得る培地中の残留神経伝達物質の存在と
結び付いた背景音を場合によって除去することを可能にする。第２段階では、テ
ストされる化合物が加えられて、検出可能な物質が定量される。
【００１３】 本発明の方法は、数種の化合物をテストすることに加えて、数種の神経伝達物
質を並行して定量することも可能にする。例えば、同一の化合物が、１匹の動物
から調製された神経組織試料に関して、様々な神経伝達物質放出に関する特性に
対して並行してテストされ得る。
【００１４】 本発明の方法で得られ、かつ以下の実験部分で報告された結果は、この方法が
、新規な化合物または公知の化合物の新規な特性を明らかにするため、または公
知の化合物の作用メカニズムまたは作用特殊性を詳細にするために、神経組織の
多数かつ生物学的に意義深い試料に対して容易に、再生可能かつ迅速に実施され
得ることを示している。本発明の組成物および方法は、このように治療用生成物
の研究若しくは開発、または神経組織の分野におけるその他のあらゆる用途に使
用され得る。
【００１５】 本発明は、生体外で得られた上記方法の実施に有用な、かつ実験の間中、その
本質的な生理学的特性を保つことが可能な、組織標本にも同様に関する。これら
の神経組織標本は、シナプスメカニズムに作用する多数の生成物の迅速で、再生
可能かつ信頼できる定量を可能にする。先行技術は、分子毎に１匹の動物の犠牲
を必要とするか、または意義がより薄いものであるが、本発明は、１匹の動物か
ら多数の生成物をテストすることを可能にする脳物質マイクロキューブの標本に
特に関する。
【００１６】 本発明による第１のタイプの神経組織標本は、哺乳動物の脳物質マイクロキュ
ーブ、および好ましくは大脳皮質マイクロキューブを含む。
【００１７】 本発明による第２のタイプの神経組織標本は、哺乳動物の脳物質の苔状線維、
および好ましくは小脳またはタツノオトシゴの苔状繊維を含む。
【００１８】 本発明は実際に、同じ動物から信頼でき、多数かつ再生可能な定量を可能にす
る神経組織標本に関する。特に、本発明は、神経組織からの脳物質の、特に脳全
体、皮質、小脳またはその他のあらゆる神経組織のマイクロキューブ標本に関心
を有する。マイクロキューブは、局所神経連結度を保ち、かつ本発明の方法と両
立する生育力を保証するために生理学的培地で十分に酸素を含んでいるという長
所を有する。
【００１９】 １９６０年代において、中枢神経系の分割は、神経終末（シナプトソーム）の
精製へ至らせたことを想起させるべきである。この時期から神経生物学者のこれ
らの標本に対する関心は、一度も涸れたことはなかった。これらの標本がシナプ
ス要素の生化学的組成物を測定するため、または神経伝達を保証するたんぱく質
を分離するために非常に有用だったのであれば、しかしながらこの生理学的かつ
薬理学的調査が、生理学的調査には適応していない分割培地において得られたこ
れらのシナプトソームの試験管内での短い寿命に結び付いた困難にぶつかったこ
とを確認せねばならない。それならば、生理学的培地におけるシビレエイの電気
器官のシナプトソーム分離は、例外であるように見える。というのもこれらは、
少なくとも４８時間、その生理学的特性（膜電位、ＡＣｈ合成および放出）を保
つことが可能だったからである。しかしながら、このような生理学的特性を保っ
ている哺乳動物の神経組織標本は、現在に至るまで記述されなかった。従って、
本発明による脳物質マイクロキューブは、大きな薬理学的利益を有している。
【００２０】 脳物質マイクロキューブは、多様な長所を提供する標本となる。例えば、皮質
から得られたマイクロキューブ試料は、各マイクロキューブ中に含まれるニュー
ロンの集合が、動物全体においてその環境と近い環境にあるという趣旨において
この皮質全体と統計的に比較し得る。各ニューロンは、その幾つかの結合を保っ
ており、かつ神経膠環境は、非常に安定したままである。これら２つの生理学的
恒常性は、疑いもなくマイクロキューブ試料の安定性および長い寿命の原因であ
る。また皮質の不均質性故に、全てのマイクロキューブが互いに同等でないとし
ても、試料を構成する各個体数は、統計的に同一である。
【００２１】 優先的には、マイクロキューブは、０．１〜５ｍｍ３の、好ましくは０．１〜
３ｍｍ３の、更により優先的には約１ｍｍ３の平均寸法を有する。マイクロキュ
ーブは、神経組織から切断によって、次に一定の直径、例えば０．０１〜２ｍｍ ２ の１個または数個の格子を通して移すことによって調製され得る。特にナイロ
ン布、金属格子、または篩分けに適応したその他のあらゆる媒体が問題となり得
る。マイクロキューブ標本の図解を、開始神経組織として大脳皮質を使用した、
添付の図１に示す。
【００２２】 本発明の方法の特殊な実施態様では、例えば円錐管または微量滴定プレート井
戸のような滴定媒体中に分配された多数の試料およびマイクロキューブの調製後
、テストする化合物を神経組織標本と接触させ、次に神経組織標本によって場合
によって放出される伝達物質の（特に化学発光による）定量を行う上清を採取す
る。
【００２３】 マイクロキューブのもう一つの長所は、凝固／解凍後でも大きな安定性にある
。従って、これらの定量を一揃いにすることは、作業日の期間によって限定され
ず、神経組織標本は、後の使用のために保存され得る。従って、同一の標本が、
並行して数種の（特に５種の）神経伝達に関して１組または数組の化合物の効果
を確実に測定することを可能にし、このことは、健康な動物の皮質構造が安定し
ているだけに一層、比較を容易にする。
【００２４】 これらのマイクロキューブはその上、現行の、製薬産業によって使用される他
の標本に関連して長所を提供する。すなわち、 − 操作の間で正しい比較を得るために２つの同一な切片を作ることは常に困難
であるので、脳の切片と比較して、マイクロキューブ試料は、統計的により均質
であり、 − シナプトソームと比較して、マイクロキューブ試料は、その生理学的環境を
保ったので、より安定し、かつより長い寿命を有し、 − 生きている動物に関する調査と比較して、マイクロキューブは、神経伝達の
数個の面および数種の化合物に同時に関する一連のテストを１匹の犠牲から作る
ことを可能にし、このことは、テストされる１匹の動物が、（範囲が推定される
行動に関して活性か否かという）１つの質問に答えることのみを可能にする、行
動調査と対照をなす。
【００２５】 従って、本発明は以上に定義したような脳物質マイクロキューブのあらゆる標
本を更に対象とする。優先的に、以上に記載したような脳物質の少なくとも１０
０個のマイクロキューブを含む組成物が問題である。本発明は、神経伝達物質放
出を変調する化合物を識別するため、このようなマイクロキューブまたは局所連
結度を保つその他のあらゆる標本の使用にも関する。
【００２６】 上記に示したように、本発明の方法の好適な応用例は、哺乳動物の脳物質苔状
線維、特に小脳またはタツノオトシゴの苔状線維を含む神経組織標本を使用する
ことにある。
【００２７】 苔状線維は、直径５〜１０μｍのグルタメート作動性神経終末を含む。これら
は、一般的に小さいシナプトソーム（０．５μｍ）を分離するために、神経組織
を均質化する時に保護されない。本発明によれば、前記神経終末を保つように調
製された、苔状線維を神経組織標本として使用する。これらの線維は、生理学的
溶液中でより穏やかに組織の分裂によって調製され得るが、このことは、これら
の大きなグルタメート作動性終末を保護することを可能にする。この状態で調製
され、かつ本発明の実施に使用できる苔状線維は、添付の図２に記載されている
。
【００２８】 神経伝達の表現型を表現する細胞系統、脳切片、脳脊髄液等のような、他の神
経組織標本が、使用可能である。しかしながら、以上に言及した理由により、マ
イクロキューブのような、局所連結度を保ち、かつ１匹の動物から多数で生成さ
れ得る標本を使用することが特に好まれる。
【００２９】 テストする化合物を神経組織標本と接触させることは、管、井戸、プレート、
媒体等のような定量反応に適したあらゆる装置で行われ得る。優先的には微量滴
定管または井戸が問題である。典型的には、定量は、滴定プレート上で実施され
る。
【００３０】 神経伝達物質が放出された場合、検出可能な１種または数種の物質、または神
経伝達物質が放出された場合、前記物質の１種の変換の結果生じた少なくとも１
種の生成物の検出または定量は、定量する物質の性質によって様々な方法で行わ
れ得る。
【００３１】 特に好ましい実施態様において、方法は、冷たい、すなわち非放射性物質を使
用する。方法は、神経伝達物質の存在下で光放射に至らせる物質の検出または定
量に特に関し、物質の定量は、その場合放射した光の定量または検出からなる。
【００３２】 従って、非常に好ましい態様において、本発明の方法は、化学発光による定量
を含むが、このことは、神経伝達物質の迅速、正確かつ多数の定量を可能にする
。神経伝達物質の存在下で光放射に至らせる物質または生成物の混合物は、神経
伝達物質により、例えばルミノールおよびペルオキシダーゼ化合物、デカアルデ
ヒドおよびルシフェラーゼ化合物または例えばＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダク
ターゼであり得る。
【００３３】 従って、本発明による方法は、少なくともその１種の基質が神経伝達物質であ
る１種または数種の酵素、およびその酵素によって前記神経伝達物質の分解に続
いて光を放射することが可能な少なくとも１種の作用物質の存在下で、テストす
る少なくとも１種の化合物を、神経組織標本と接触させることを特徴とする。
【００３４】 上記に示した通り、神経伝達物質の定量は、神経組織標本の培養上清中で、神
経伝達物質を光放射反応基質に変換するためにそれを処理した後に行われ得る。
従って、特殊な態様において、定量は神経伝達物質の変換生成物を検出すること
にある。このため、神経伝達物質は、この変換生成物を生成するため予め処理さ
れる。関係する神経伝達物質によって、様々な処理が使用され得る。
【００３５】 本発明の方法によって放出が検出または定量される神経伝達物質として、特に
グルタメート（Ｇｌｕ）、アセチルコリン（Ａｃｈ）、γ−アミノブチレート（
Ｇａｂａ）、カテコールアミン特にドーパミン（Ｄａ）、またはＡＴＰを挙げる
ことができる。
【００３６】 本発明の方法をアセチルコリンの定量または検出に応用することは、テストす
る少なくとも１種の化合物を神経組織標本と接触させ、次に前記標本またはその
上清をアセチルコリンエステラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、
およびルミノールの存在下に相次いでまたは同時に置くこと、および神経組織標
本によって放出されたアセチルコリンのアセチルコリンエステラーゼによる分解
に続く、ルミノールの分解によって放射された光を検出または定量することを特
徴とする。
【００３７】 添付の図３ａは、アセチルコリン（Ａｃｈ）の定量を示す。この定量のため、
伝達物質は、アセチルコリンエステラーゼによって加水分解され、またそこから
生じるコリンは、ルミノールおよびペルオキシダーゼの存在下でコリンオキシダ
ーゼによって酸化する。試料がコリンおよびＡＣｈを含む時でも、２種の物質を
連続的に読み取ることができる。コリンによる発光が消える時、アセチルコリン
エステラーゼを加え、かつ現れる光は、ＡＣｈの比率を示す。このタイプのテス
トは、本質的に非哺乳動物の、またはかなり広い範囲の化合物に関する調査を可
能にしない、ある種の神経試料に対して応用された［ＩｓｒａｅｌおよびＭｏｒ
ｅｌ、Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４３（１９８７）８９］。本発明は、このタイ
プのテストが、特殊な神経組織標本に対して大規模に、かつ神経伝達物質の他の
定量テストと一揃いで使用され得ることを今では示す。
【００３８】 本発明の方法をグルタメートの定量または検出に応用することは、テストする
少なくとも１種の化合物を神経組織標本と接触させ、次に前記標本またはその上
清をグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、ルシフェラーゼ、
ＮＡＤおよびデカアルデヒドの存在下に相次いでまたは同時に置くこと、および
神経組織標本によって放出されたグルタメートのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ
による分解に続く、デカアルデヒドの分解によって放射された光を検出または定
量することを特徴とする。
【００３９】 添付の図３ｂは、グルタメートの定量を示す。この定量のため、グルタメート
は、例えば酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって水素が除去される。現れ
るＮＡＤＨ２は、次に酵素ＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼによって侵食
され、このことは、フォトバクテリウムのルシフェラーゼおよびデカアルデヒド
の存在下で光放射を引き起こす。このタイプの定量は、電気器官の神経終末に対
する他の実験条件において実施された［Ｉｓｒａｅｌら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．
Ｉｎｔ．２２（１９９３）５３］。本発明は、このタイプのテストが、特殊な神
経組織標本に対して大規模に、かつ神経伝達物質の他の定量テストと一揃いで使
用され得ることを今では示す。
【００４０】 本発明の方法をＧａｂａの定量または検出に応用することは、テストする少な
くとも１種の化合物を神経組織標本と接触させ、次に前記標本またはその上清を
ガバーゼ（ｇａｂａｓｅ）、オキシドレダクターゼ、ルシフェラーゼ、ＮＡＤお
よびＦＭＮの存在下に相次いでまたは同時に置くこと、および神経組織標本によ
って放出されたＧａｂａのガバーゼによる分解に続く、ＳＳＡＬの分解によって
放射された光を検出または定量することを特徴とする。
【００４１】 添付の図３ｃは、Ｇａｂａの定量を示す。この定量のため、酵素ガバーゼは、
Ｇａｂａをセミコハク酸アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｓｅｍｉ ｓｕｃｃｉ
ｎｉｑｕｅ）にＮＡＤＨ２生成物とで転換するために使用される。セミコハク酸
アルデヒドおよびＮＡＤＨは、ＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼの存在下
で光放射を引き起こす。このテストの長所は、外因性アルデヒドを加えることが
必要でないことである。このタイプの定量は、電気器官の神経終末に対する他の
実験条件において実施された［ＩｓｒａｅｌおよびＬｅｓｂａｔｓ．、Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｃｈｅｍ．６７（１９９６）２６２４］。本発明は、このタイプのテスト
が、特殊な神経組織標本に対して大規模に、かつ神経伝達物質の他の定量テスト
と一揃いで使用され得ることを今では示す。
【００４２】 本発明の方法をカテコールアミンの定量または検出に応用することは、テスト
する少なくとも１種の化合物を神経組織標本と接触させ、次に前記標本またはそ
の上清をラクトペルオキシダーゼ、Ｏ２、およびルミノールの存在下に相次いで
または同時に置くこと、および神経組織標本によって放出されたカテコールアミ
ンのラクトペルオキシダーゼによる分解に続く、ルミノールの分解によって放射
された光を検出または定量することを特徴とする。
【００４３】 添付の図３ｄおよび３ｅは、カテコールアミン、特にドーパミンの定量を表す
。ドーパミンの定量のため、本発明は、ドーパミンの変換において酵素の特性を
明らかにすることに基づく特に有効なテストに関係する。従って、本発明は、酵
素ラクトペルオキシダーゼがＯ２の存在下でＨ２Ｏ２形成に至り、次にＨ２Ｏ２ およびルミノールの存在下で、同じラクトペルオキシダーゼが光形成を引き起こ
す。従って思いがけなくも、ラクトペルオキシダーゼは、従来記述されたペルオ
キシダーゼ作用およびオキシダーゼ作用を同時に有しているように見える。
【００４４】 従って、本発明は、発光カテコールアミンに基づくテストおよびアドレナリン
作動性伝達物質の塩析を制御するためのその応用にも関係する。増加する数のオ
キシダーゼが、その特有の基質［グルコース、キサンチン、コリン等（Ｍｉｃｈ
ｅｌｓｏｎ、１９７８およびＴａｋａｙａｍａら、１９７７）］を測定するため
に使用された。伝達物質アセチルコリン（Ａｃｈ）の場合、１９８０年にＡＣｈ
の加水分解の結果生じるコリンが、過酸化水素を形成してコリンオキシダーゼに
よって酸化される方法が提案され、この過酸化水素は、化学発光反応（ルミノー
ルにペルオキシダーゼ）を使用して検出された（ＩｓｒａｅｌおよびＬｅｓｂａ
ｔｓ、１９８１、ａ、ｂ、１９８２、１９８７）。グルタメート（Ｇｌｕ）また
はγ−アミノブチレート（Ｇａｂａ）のような他の伝達物質に関して、対応する
化学発光テストが発見され、ＧｌｕおよびＧａｂａは、アルデヒドを感知できる
細菌性ルシフェラーゼの発光を引き起こすＮＡＤＨを与えるデヒドロゲナーゼの
基質である（Ｆｏｓｓｅら、１９８６；Ｉｓｒａｅｌら、１９９３；Ｉｓｒａｅ
ｌおよびＬｅｂａｔｓ、１９９６）。これらの伝達物質に、ホタルのルシフェラ
ーゼによって検出されたＡＴＰを加えるならば（Ｄｅ ＬｕｃａおよびＭｃ Ｅ
ｌｒｏｙ、１９７８；Ｍｅｕｎｉｅｒら、１９７５）、多くの伝達物質が今や化
学発光法を用いて測定されることがわかる。モノアミンの場合、モノアミンオキ
シダーゼに関するテンヌ法は、脂肪族アミンを、長鎖を有するアルデヒドを感知
できる細菌系の発光を引き起こす脂肪族アルデヒドに転換する（Ｔｅｎｎｅら、
１９８５ａ、ｂ）。
【００４５】 カテコールアミンに対するモノアミンオキシダーゼの作用は、ルミノールを用
いて検出できた、過酸化水素を生成する（ＣａｄｅｔおよびＢｒａｎｎｏｃｋ、
１９９８）。ミルクのラクトペルオキシダーゼが、混合機能オキシダーゼ−ペル
オキシダーゼを有し、それがカテコールアミンを酸化させ得たこと、およびこの
ように光放射を発生させるルミノールで形成された過酸化反応を引き起こし得た
ことが、本発明の範囲内で今や明らかになった。従って、ノルエピネフリン、エ
ピネフリンまたはドーパミンも同様に測定する感知テストが明確にされ、それは
、Ｌ−ＤＯＰＡまたはセロトニンとは非常に弱く反応する。このテストは、アド
レナリン作動性組織および細胞のカテコールアミンの塩析を制御するために応用
された。
【００４６】 従って、本発明は、試料をラクトペルオキシダーゼおよびルミノールと接触さ
せること、および放射された光の定量を含む、試料中のカテコールアミンの定量
方法も対象とする。試料は、場合によってはテスト化合物の存在下の保温および
カルシウム脱分極によるカテコールアミン放出の刺激後に、神経細胞、脳マイク
ロキューブ、またはその他のあらゆる神経組織標本のあらゆる培養上清で良い。
この定量は、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン等を定量するために
使用され得る。
【００４７】 本発明は、上記に記載された方法を実施するためのキットにも関係する。この
ようなキットは： − 分離された区画中に、１種または数種の神経組織標本と、 − １種または数種の物質で、その内少なくとも１種が、神経組織標本によって
放出された神経伝達物質と反応することが可能であり、かつ神経伝達物質が放出
された場合前記物質の少なくとも１種が検出可能であるか、または神経伝達物質
が放出された場合前記物質の１種の変換の結果生じた少なくとも１種の生成物が
検出可能である、物質と、 − 必要があれば、神経組織標本による１種または数種の神経伝達物質放出に関
する効果が知られている、１種または数種の基準化合物とを含む。
【００４８】 本発明によるキットにおいて、テストする化合物を神経組織標本と接触させる
ことは、管、井戸、プレート、媒体等のような定量反応に適したあらゆる装置で
行われ得る。優先的には微量滴定管または井戸が問題である。典型的には、定量
は、滴定プレート上で実施される。
【００４９】 本発明は最後に、本発明による方法によって識別可能な神経伝達物質のシナプ
ス前の放出を変調することが可能な化合物に関する。特に、本発明は、神経系疾
患の治療、または予防のための薬剤を製造するために、このような化合物を使用
することに関係する。
【００５０】 実際、本発明の方法により識別または特徴付けられた化合物は、伝達物質放出
を増加または抑制することができる。従って、関係する病理によって、放出され
る伝達物質量を増加または減少させるよう試みることが好適であり得る。この点
では、識別された化合物は、治療用の化合物、またはこのような治療薬開発の導
出（標的）となり得る。これらの化合物の用途は、例えば： − アセチルコリン放出を変調する化合物では、神経変性およびアルツハイマー
病、 − グルタメート放出を変調する化合物では、神経毒性および虚血、 − Ｇａｂａ放出を変調する化合物では、癲癇および不安、 − カテコールアミン（ドーパミン）放出を変調する化合物では、精神病、うつ
病、パーキンソン病、 − ＡＴＰ放出を変調する化合物では、不安、パニック、恐怖症、パーキンソン
病である。
【００５１】 本発明の他の長所および特徴は、説明として、限定的としてではなく示した、
これに続き、かつ脳物質のマイクロキューブ標本および苔状線維に関する４種の
伝達物質（ＡＣｈ、Ｇｌｕ、ＧａｂａおよびＤａ）の化学発光の定量を記載した
、実施例から現れるであろう。もちろん、種々の神経伝達表現型を表現する細胞
、興奮毒性を評価するための脳脊髄液のグルタメート測定のような、本発明の範
囲内に入る他の標本も、同様に自由に使うことができる。
【００５２】 実施例１：材料および方法。
【００５３】 牛乳のラクトペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）は、凍結乾燥粉末（
８０〜１５０単位／たんぱく質１ｍｇ）の形状でシグマから入手した。ルミノー
ル（５−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロフタラジンジオン−１，４）は
、メルクから入手した。１ｍＭの保存溶液が、１ＭのＮａＯＨ数滴中で１８ｍｇ
を希釈して、調製され、また最終量は、０．２Ｍのトリス緩衝液ｐＨ８．６の追
加によって１００ｍＭに達した。
【００５４】 哺乳動物クレブス培地は、１３６ｍＭのＮａＣｌ、５．６ｍＭのＫＣｌ、２．
２ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１．２ｍＭのリン酸ナトリウム
、２．５ｍＭの炭酸水素ナトリウム、５．５ｍＭの酸化グルコースからなる。
【００５５】 実施例２：脳物質マイクロキューブ標本および神経伝達物質定量のための使用
（図１）。
【００５６】 ラットまたはマウス（もしくはヒトを含む他の哺乳動物）の皮質は、メスの刃
で解剖され、かつ約１〜２ｍｍ３のキューブに切り分けられる。これらのキュー
ブは、大量の哺乳動物クレブス中で洗浄され（少なくとも２回、２５０ｍＬ）、
次にピペットＰ５０００を用いて吸引され、かつ一辺約１ｍｍの目を有する固い
ナイロン布を通して「噴出」を強いられる。このように直径で分けられたキュー
ブは、自然沈降によってビーカの底部に取り入れられ、このことは、より「外傷
を与える」遠心分離を減少させ、次にマイクロキューブは、徐々により減少した
体積中で取り入れられる。マイクロキューブは、円錐管の底部に沈降し、かつ１
または２ｍＬのクレブスで覆われる。入口を広げるために端部が切り取られた、
黄色い先端のギルソンピペットを用いて、２０〜５０μＬのこれらのマイクロキ
ューブのかす中で、ピペットによって移す時、統計的に比較可能な試料に対する
伝達物質放出をテストできるように、等しい数のマイクロキューブを採取する。
例えば、様々な濃度を有する１組の化合物で５０μＬのマイクロキューブの試料
を保温し、かつ比較対象と比べて、カリウム脱分極により誘発された、または自
然の放出に対するその効果を分析することができる。他方、４種の神経伝達物質
の定量は、これらの標本が凝固可能なので、数日に分けることができる。
【００５７】 この方法は、ＡＣｈ、Ｇａｂａ、グルタメートまたはドーパミンの場合に特に
有効に実施された（図３）。グルタメートに関しては、小脳またはタツノオトシ
ゴの苔状線維の神経終末から、この伝達物質の放出を測定することからなるより
適した標本がその上記載された。
【００５８】 実施例３：小脳またはタツノオトシゴのグルタメート作動性苔状線維の標本お
よび神経伝達物質定量のための使用（図２）。
【００５９】 苔状線維の神経終末は、５〜１０μｍの直径を有し（図２）、かつ通常精製さ
れる小さなシナプトソーム（０．５μｍ）を分離するために神経組織を均質化す
る時は、一般的に保護されない。慎重に、組織を生理学的溶液中でより穏やかに
分割するならば、これらの大きなグルタメート作動性終末を保護することが可能
である。このために約０．１ｇの組織量は、青い先端のギルソンピペットを用い
て、０．３ｍＬの体積中で吸引−吐出によって解離された。この「ホモジェネー
ト」は、次に２ｍＬのクレブスに戻され、かつ５０μｍのナイロン布上で濾過さ
れる。苔状線維の神経終末は、核分画中で自然に沈降する。このかすは、自然沈
降によってクレブス中で１または２回洗浄され、次に１ｍＬのクレブス中で再度
懸濁される。これらの神経終末は、これらをカルシウムの存在下で脱分極する時
に伝達物質を放出し、かつ長い間安定するであろう。
【００６０】 グルタメート放出に対する化合物の効果を調査するために、グルタメート定量
の反応培地に加えられる、この懸濁液３〜５μｌを一般的に使用し、放出は、カ
ルシウムの存在下でＫＣｌを付加することによって引き起こされる。得られた結
果は、この神経組織標本が、多数の試料に対して反復される定量に、上質な材料
となることを示している。
【００６１】 実施例４：種々の神経伝達表現型を表現する神経系統（図４）。
【００６２】 ３種の伝達物質ＡＣｈ、ＧｌｕまたはＧａｂａの一つにより、それを培養基に
５〜１２時間加えて、培養細胞を充填できることが示された［Ｉｓｒａｅｌら、
Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３６（１９９７）１７８９]。技術様式
は、各伝達物質に関して相違する。例えばＡＣｈの場合（図４）、コリンエステ
ラーゼ（ホスホリン５０μＭ）を予め遮断することが必要である。しかしながら
、全ての場合において、伝達物質の細胞内濃度が、使用される細胞外濃度（ここ
では１０ｍＭ）に近くなるが、これを４０ｍＭに至らせることができる。培地洗
浄後、細胞は取り込まれた伝達物質を保つ。種々の細胞系統のＡＣｈ、Ｇａｂａ
、およびＧｌｕの含有量の比較は、数μｌの懸濁液を測定培地中で溶解させ、そ
れぞれＡＣｈまたはＧｌｕを充填した細胞に関しては、０．５％または０．０５
％の三重陽子で、かつＧａｂａに関しては、予め８０℃に至らせ、次にこのよう
に放出された伝達物質を定量して行われる。ある種の神経系統は、ＡＣｈを優先
的に放出し、他のものは、Ｇａｂａまたはグルタメートを優先的に放出する（図
４）。マイクロキューブが上質な材料となるとしても、これらの系統は、神経伝
達物質放出を変調することが可能な化合物を識別または特徴付けるための本発明
の方法において同様に使用可能である。
【００６３】 実施例５：脳脊髄液中で測定されたグルタメートの興奮毒性調査（図５）。
【００６４】 局所性病変のために生じた中枢神経系の変化は、しばしば本来の意味における
病変のものより広い組織領域に及ぶ。部位のまわりに放出された興奮性アミノ酸
（グルタメート）の拡散面積は、この興奮毒性効果に対応しているように見える
。細胞外空間が脳脊髄液と釣り合う限りにおいて、脳脊髄液のグルタメート濃度
を減少させる化合物は、興奮毒性を制限し、かつ変化域の拡大を予防できるであ
ろうことを予想するできる。図５で行われた実験は、例としてグルタメート放出
を減らした生成物は、処理された動物の脳脊髄液中のグルタメート低下を引き起
こしたことを示している。
【００６５】 実験６：カテコールアミン放出調査。
【００６６】 本発明は、神経組織標本中のカテコールアミンの化学発光による定量の特に有
効なテストの説明に特に関係する。このテストは、図３ｄに示したように、光放
射に至らせる、ラクトペルオキシダーゼによるカテコールアミンの予期せぬ二重
変換に根拠を置く。このテスト実施のため、神経伝達物質を含む試料は、ラクト
ペルオキシダーゼおよびルミノールと接触させられる。好ましくは、等しい量の
これらの反応体が予め混合され（例えば各々３０μｌ）、かつ混合物は、次に試
料（約６μｌ）に加えられる。反応は、優先的には１３６ｍＭのＮａＣｌ、５．
６ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭの酸化したトリス緩衝液ｐ
Ｈ８．６からなる、食塩溶液中で行われる（溶液Ｉ）。溶液は、管中に置かれ、
かつ静かに攪拌して光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｅ）に導入される。最初の放
射が減少して基本レベルに達した時、混合物は、カテコールアミンを定量するた
めに使用され得る。標準状態の定量には、各反応体約３μｌが使用される（すな
わち混合物６μｌ）。より低い精度の定量には、１２０ｍＭのショ糖、１２０ｍ
Ｍの酸化したトリス緩衝液ｐＨ８．６からなる、非食塩溶液（溶液ＩＩ）中で、
約３μｌのルミノールおよび５μｌのラクトペルオキシダーゼを使用することが
できる。
【００６７】 カテコールアミンの定量は、解離性アドレナリン作動性細胞、カテコールアミ
ンを充填した細胞系統または脳の線条体部のマイクロキューブを含む様々な神経
組織標本から行われた。
【００６８】 解離性アドレナリン作動性細胞は、ドーパミン放出テストにおいて調製され、
かつ使用された。このために、４種のアドレナリン作動性腺は、２ｍｌの哺乳動
物クレブス培地の最終体積中で解離された。放出は、ルミノール（３μｌ）およ
びラクトペルオキシダーゼ（５μｌ）が加えられた、上記の溶液ＩまたはＩＩ中
で５〜１０μｌの体積に対してテストされた。カテコールアミン放出は、カルシ
ウム（２．５ｍＭ）の存在下でカルシウムイオノホアＡ２３１８７（１．２μｌ
）を加えることによって刺激された。得られた結果は、図６に示してあり、また
本発明のテストが小さい神経組織試料に対してカテコールアミン放出の迅速かつ
高精度な定量を可能にすることを示している。
【００６９】 脳の線条体部のマイクロキューブは、切り分けられ、かつナイロン膜（０．５
ｍｍの断面）を通して移され、次に円錐管中の最終量２ｍｌ中に入れられた、２
匹のマウスの脳から調製された。かすの試料１０μｌは、以上に記載した条件（
ルミノール３μｌおよびラクトペルオキシダーゼ３μｌを含む２ｍｌの溶液Ｉ中
）で、放出テストを行うために使用された。放出は、カルシウム（２．５ｍＭ）
の存在下でＫＣｌ（４５ｍＭ）脱分極により刺激された。カルシウムなしでの検
査が、ＥＧＴＡ（７μＭ）の存在下で行われた。得られた結果は、図７に示して
あり、また本発明の方法が高精度であり、かつカルシウムに反応して放出された
神経伝達物質を定量することを可能にすることを示している。このテストは、こ
のドーパミン放出に作用する化合物を識別または特徴付けするために、容易に使
用できる。
【００７０】 類似した実験がドーパミンを充填した神経系統（特に神経芽細胞系統）から行
われ、かつ本発明の方法の精度および再生可能性を確認することを可能にした。
【００７１】 実施例７：カテコールアミン調査。
【００７２】 実施例５よりもより詳細なこの実施例は、発光カテコールアミンに基づくテス
ト、およびアドレナリン作動性伝達物質の塩析を検査するための、その応用を記
載する。
【００７３】 １）材料および方法。
【００７４】 ａ）溶液および緩衝液。 溶液Ｉ：１３６ｍＭのＮａＣｌ、５．６ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ
２、２０ｍＭの酸化したトリス緩衝液ｐＨ８．６からなる。 溶液ＩＩ：１２０ｍＭのショ糖、１２０ｍＭの酸化したトリス緩衝液ｐＨ８．
６からなる。 哺乳動物クレブス培地：１３６ｍＭのＮａＣｌ、５．６ｍＭのＫＣｌ、２．２
ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１．２ｍＭのリン酸ナトリウム、
２．５ｍＭの炭酸水素ナトリウム、５．５ｍＭの酸化グルコースｐＨ７．４。
【００７５】 ｂ）保存溶液。 牛乳のラクトペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）は、凍結乾燥粉末（
８０〜１５０単位／たんぱく質１ｍｇ）の形状でシグマで購入し、水１ｍｌ中に
溶解し、かつ１００μｌのアリコートによって凝固したままに保たれた。
【００７６】 ルミノール（５−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロフタラジンジオン−
１，４）は、メルクで購入した。保存溶液は、１ＭのＮａＯＨ数滴中に１８ｍｇ
のルミノールを溶解して、調製され、また体積は、０．２Ｍのトリス緩衝液ｐＨ
８．６で１００ｍｌに達した。１ｍｌのアリコートは、−２０℃に保たれた。
【００７７】 ｃ）反応混合物。 発明者達は２ｍｌの溶液Ｉ中に、ルミノール３μｌおよびラクトペルオキシダ
ーゼ３μｌを加えた。等しい量（各々３０μｌ）を混合することおよび氷中に保
たれた６μｌの混合物を加えることが好ましいように思えた。管は、光度計中に
置かれ、かつ溶液は、小さな磁石で混合される。最初の閃光がゆっくりと弱まる
基線に傾いた時、混合物は、カテコールアミン（ノルエピネフリン、エピネフリ
ン、ドーパミン）を測定するために使用され得る。より感度の低いテストが必要
な場合、溶液ＩＩが使用され、これにはルミノール３μｌおよびラクトペルオキ
シダーゼ５μｌが加えられている。
【００７８】 ｄ）組織エキス。 組織５０〜１００ｍｇが、切り取られ、かつ氷中で冷却されたトリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）１ｍｌ中で２時間抽出され、変性たんぱく質が遠心分離され、かつ上
清が採取される。アリコート０．２５ｍｌは、半分だけ水中で希釈され、かつＴ
ＣＡを取り出すためにエーテルで４回洗浄された（最終ｐＨ：４）。水相中の微
量のエーテルは、蒸発した。試料は、溶液Ｉ中で１／１０〜１／１００に希釈さ
れ、かつ０．５ｍｌがクロロホルム２ｍｌ中で洗浄された。次に水相のアリコー
ト４０μｌが、１０μｌ、１％の三重陽子Ｘ１００で処理され、かつ測定は、３
〜５μｌに対して行われた。各試料は、標準物質と比較され、また、まさしく試
料のように処理されたブランクをテストすることが大変重要である。ブランクの
レベルが高い場合、三重陽子を、ブランクが試料との比較によって無視できるよ
うになるまでに希釈せねばならない（図３参照）。
【００７９】 ｅ）副腎片のカテコールアミン塩析。 ２匹のマウスは、エーテルで麻酔をかけられ、次にその副腎が取り出され、か
つ４または５個の断片に切り取られ、断片は哺乳動物クレブス４００ｍｌ中で１
時間４０分洗浄された。塩析は、ルミノールおよびラクトペルオキシダーゼがそ
れぞれ５および１０μｌまで増加した、溶液ＩまたはＩＩで行われた。カルシウ
ム２．５ｍＭの存在下で６０ｍＭのＫＣｌでの脱分極は、塩析を引き起こした。
【００８０】 ｆ）解離性アドレナリン作動性細胞のカテコールアミン塩析。 断片は、上記のように洗浄され、かつ最終量２ｍｌ中でピペット（Ｅｐｐｅｎ
ｎｄｏｒｆ、１ｍｌの円錐形）を通した数回の吸引および排出によって解離され
る。塩析は、アリコート５および１０μｌに対してテストされる。より多くの材
料が反応混合物を弱める。塩析は、ルミノール（３μｌ）およびラクトペルオキ
シダーゼ（５μｌ）が加えられた、溶液ＩまたはＩＩで測定された。塩析は、カ
ルシウム２．５ｍＭの存在下でカルシウムイオノホアＡ２３１８７（１．２μｌ
）を加えることによって引き起こされた。
【００８１】 ｇ）線条体脳微小破片のカテコールアミン塩析。 ２匹のマウスの脳の線条体部は、切り分けられ、固いナイロンのガーゼ（０．
５ｍｍ）を通して大量のクレブスにより、力ずくで移される。微小破片は、ビー
カの底部で集められ、円錐管中で最終量２ｍｌに濃縮される。かすは、沈降によ
り迅速に形成され、かつかすから試料１０μｌを採取することが可能である。試
料は、６μｌのラクトペルオキシダーゼ−ルミノール混合物（各保存溶液の等し
い量）を含む、２ｍｌの溶液Ｉに加えられる。塩析は、カルシウム２．５ｍＭの
存在下でＫＣｌ（４５ｍＭ）脱分極によって得られた。カルシウムの不存在下で
の検査が、溶液中のＥＧＴＡ０．７μＭで行われた。より多くのＥＧＴＡは、反
応を抑制するかもしれないが、この条件は、検査および試料に関しては、同程度
の精度を示す。
【００８２】 ｈ）ドーパミンを加えた細胞のカテコールアミン塩析。 細胞培養ＮＧ１０８−１５は、グルタミン２ｍＭ、ウシ胎児血清１０％、ＨＡ
Ｔ（ヒポキサンチン１００μＭ、アミノプテリン１ｍＭおよびチミジン１６μＭ
）を加えたダルベッコに修正されたイーグル培地（ＤＭＥＭ）中に保持された。
細胞は、空気が９５％およびＣＯ２が５％の湿った大気中で３７℃で培養された
。細胞にドーパミンを充填するために、発明者達は、実験の１６時間前に、ドー
パミンおよび中和されたアスコルビン酸の混合物を加え、培養容器中に各々の１
０ｍＭの最終濃度を得た。保存溶液は、ソーダによって中和されたアスコルビン
酸０．５Ｍおよびドーパミン０．５Ｍ、ｐＨ８．７で作られた。細胞は、１３６
ｍＭのＮａＣｌ、５．６ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのト
リス緩衝液ｐＨ８．６、５．５ｍＭの酸化グルコースからなる溶液中で洗浄され
た。５分間、１２００ＲＰＭで４回の洗浄が行われた。４個の容器に由来するか
すは、クレブス０．５ｍｌ中で再度懸濁された。
【００８３】 添加された細胞の塩析は、ルミノール３μｌおよびラクトペルオキシダーゼ５
μｌを含む２ｍｌの溶液ＩＩ中で行われ、ルミノールおよびラクトペルオキシダ
ーゼを２倍にし、かつ溶液ＩＩを１ｍｌ多く加えて、細胞（５μｌ）を加えた後
に反応混合物を強化することが好ましいことが発見された。線形が、許容できる
基本レベルに戻った時、塩析は、イオノホアＡ２３１８７（０．７μＭ）の存在
下でカルシウム（１．６ｍＭ）によって引き起こされた。
【００８４】 ｉ）ドーパミンの組織化学的局在 細胞は、０．５ｍｇ％のＭｇＣｌ２、ｐＨ５を含むグリオキシル酸２体積％の
溶液で、半分だけ希釈された。細胞は、ガラス薄板上に沈殿し、かつ溶液は、排
出された。細胞は、蛍光観察に適した培地中で検査される前に、室温で乾燥され
、次に３０分間８０℃で処理された。この実験法は、Ｄｅ Ｌａ Ｔｏｒｒｅ、
１９８０およびＫｎｉｇｇｅら、１９７７に従い、Ｌｉｕら、１９９２で調整さ
れた。
【００８５】 ｊ）図面 図３ｄは、発光カテコールアミンのテストの原理を示す。
【００８６】 ラクトペルオキシダーゼは、カテコールアミン（ドーパミン、ノルエピネフリ
ン、エピネフリン）の酸化およびルミノールの化学発光酸化を引き起こし、混合
機能オキシダーゼ−ペルオキシダーゼを示す。
【００８７】 図３ｅは、ドーパミンおよびノルエピネフリンの用量反応曲線を示す。
【００８８】 反応混合物、ラクトペルオキシダーゼおよびルミノールを含む溶液Ｉ（方法を
参照）は、カテコールアミンが加えられた時、化学発光反応を示す。曲線の下側
に、ピコモルの範囲の典型的な反応を示す。２つの曲線間の差は、１回分のラク
トペルオキシダーゼおよび溶液次第であり、２種のカテコールアミン間の特殊な
区別には対応しない。
【００８９】 図６は、解離性アドレナリン作動性細胞によるカテコールアミンの塩析を示す
。
【００９０】 Ａでは、塩析は食塩溶液Ｉで測定され、カルシウム２．５ｍＭの存在下でイオ
ノホアＡ２３１０７（１．２μＭ）を加えることによって誘導された（上側の線
形）。カルシウムが１０μＭまで減少した時、塩析は明らかにより弱いが、無視
はできない（中央の線形）。中央の線形に関して、細胞の自然消失は、イオノホ
アの不存在下で測定された。
【００９１】 Ｂでは、塩析は溶液ＩＩ（ショ糖−トリス）で測定され、かつカルシウム２．
５ｍＭまたはカルシウム１０μＭの存在下で、Ａのようにイオノホアを加えるこ
とによって引き起こされた（下側の線形）。この溶液中で、塩析は、少量のカル
シウムの存在下で無視できるように見え、かつ自然消失は、測定可能ではない。
【００９２】 ラクトペルオキシダーゼおよびルミノールの比率は、方法の部分に示されてい
る。
【００９３】 図７は、線条体微小破片によるカテコールアミンの塩析を示す。
【００９４】 線条断片は、固いナイロンのガーゼを通して大量のクレブスにより、力ずくで
移され、微小破片は次に、沈降することができ、かつ４匹のマウスの線条は、２
ｍｌの量に濃縮された。上側の線形に関し、カテコールアミン（恐らくドーパミ
ン）の塩析がＫＣｌ（４５ｍＭ）およびカルシウム（２．５ｍＭ）によって引き
起こされた。塩析が傾くと、２種の標準ドーパミンが注入された。下側の線形に
関し、検査脱分極が上記のように行われたが、カルシウムの不存在下（加えて０
．７μＭのＥＧＴＡ）で、いかなる塩析も測定されず、標準物質は、反応混合物
を確認するために注入された。両方の場合で、かすから採取された１０μｌの微
小破片（方法を参照）が使用された。塩析は、方法に記載したように、ラクトペ
ルオキシダーゼおよびルミノールを含む溶液Ｉで行われた。
【００９５】 図８は、生物学的エキスのカテコールアミンの含有量測定を示す。
【００９６】 ＴＣＡおよびエーテルで洗浄されたエキスは、方法に記載したように、クロロ
ホルムおよび三重陽子でも処理された。線条エキスのカテコールアミン含有量は
、標準物質（左側）、およびまさしく試料のように処理されたブランクと比較さ
れる。
【００９７】 図９は、副腎腺破片によるカテコールアミン塩析を示す。
【００９８】 マウスの各副腎線は、大量（４００ｍｌ）の哺乳動物クレブス中で洗浄された
、４個の断片に切り分けられた。断片は、溶液Ｉ（Ａ）または溶液ＩＩ（Ｂ）中
に移され、かつ塩析は、カルシウム（２．５ｍＭ）の存在下でＫＣｌ（６０ｍＭ
）による脱分極によって引き起こされた。ラクトペルオキシダーゼおよびルミノ
ールの比率は、方法の部分に示されている。下側の線形は、６０ｍＭのＮａＣｌ
を使用して、カルシウムの不存在下（Ｃ）または脱分極の不存在下（Ｄ）で行わ
れた検査である。
【００９９】 図１０は、培養中にドーパミンを加えた神経芽腫細胞によるカテコールアミン
塩析を示す。 上側：培養でドーパミン（２ｍＭ）を加えた細胞ＮＧ１０８−１５中のドーパ
ミンの存在の組織化学的証明。グリオキシル酸の方法はドーパミンにより蛍光化
合物を与えた。細胞は、ドーパミン２〜１０ｍＭを加えられている。 下側：添加された細胞によるドーパミンの塩析。細胞ＮＧ１０８−１５に、培
養で１２時間加えられたドーパミン１０ｍＭを入れた。集結した４つの容器の細
胞は、集められ、食塩溶液中で少なくとも４回洗浄され、かつ食塩溶液０．５ｍ
ｌ中で懸濁された。 左側：塩析は、方法に記載したように、ラクトペルオキシダーゼおよびルミノ
ールを含む溶液ＩＩの細胞懸濁液５μｌに対して測定された。塩析は、カルシウ
ム（１．６ｍＭ）およびＡ２３１８７（０．７μＭ）によって引き起こされた。
２種の標準ドーパミンが塩析の直径を決めるために注入された。 右側：検査、ドーパミンを加えられた細胞は、カルシウムの不存在下でそれを
塩析しなかった（ＮａＣｌの注入は、カルシウムに代わる）。標準物質は、反応
混合物が、塩析された全てのドーパミンを検出したであろうことを示している。
【０１００】 ２）結果
【０１０１】 ａ）発光カテコールアミンのテスト。 記載されたテストは、ドーパミンまたはノルエピネフリンがラクトペルオキシ
ダーゼの存在下でルミノールの化学発光酸化を引き起こすことを示す実験観察の
結果生じた。反応の最も簡単な解釈は、ラクトペルオキシダーゼが、ルミノール
と反応する過酸化水素を、カテコールアミンおよび分子酸素から形成するオキシ
ダーゼ活性を有し、ラクトペルオキシダーゼは、どのようなペルオキシダーゼで
もそれを行うように、この化学発光反応を引き起こすと考えることである。図３
ｄは、ラクトペルオキシダーゼの可能な機能オキシダーゼ−ペルオキシダーゼを
図式化している。図３ｅは、ノルエピネフリンおよびドーパミンで得られた２つ
の用量反応曲線を明示する。両方の曲線の間の差は、酵素製剤および２つの実験
で使用された混合物の特性を単に反映している。曲線の下側にドーパミンに対し
て０．５から１０ピコモルの範囲で得られた典型的な光の閃光を示す。等価値の
反応がノルエピネフリンまたはエピネフリンに関して記録された。テストは、基
本線からのゆっくりした増大を示すＬ−ＤＯＰＡを測定しない。Ｌ−ＤＯＰＡは
、次のノルエピネフリンまたはドーパミンの付加で、その精度を失った反応混合
物を不活性化した。反応は、セロトニンを検出しない。未知の生体試料のカテコ
ールアミン含有量の評価は、特に脂質、およびエキス中に存在する可能性のある
他の化合物との可能な干渉を減少させる、または最小にする試料の抽出、および
処理を必要とする。方法に記載したように、ＴＣＡおよびエーテルで洗浄された
試料もまた、クロロホルムと混合され、かつ少量の三重陽子が、水相に加えられ
た。図８は、試料のカテコールアミン含有量が標準物質と比較され、ブランクも
、まさしく生物学的エキスのように処理された溶液で実施されている、典型的な
評価を示す。下記の表１は、５つの異なる実験の結果を示し、化学発光テストで
発見されたカテコールアミン含有量は、蛍光光度法またはその他の方法を使用し
て、文献で発見された値と比較した。
【０１０２】
【表１】 化学発光法：５つの異なる実験の平均±ＳＥＭ（μｇ／新鮮組織１ｇ）＊ ：Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ（１９６２）＊＊ ：Ｃａｔｔａｂｅｎｉら（１９７２）＊＊＊ ：Ｃｏｏｐｅｒら（１９７８）
【０１０３】 ｂ）組織および細胞のカテコールアミン塩析。 化学発光法に関して上記に記載したように、カテコールアミンのテストは、組
織または細胞の切片からの塩析の後に続くように適応させ得る。このことは各実
験状況に応じて、幾つかの修正を必要とした。副腎切片の場合、例えば、難点の
１つは、反応混合物を使い尽す、高い細胞外の量の存在から生じた。細胞懸濁液
の場合、溶液の混濁度および脂質物質は、化学発光を消し、かつ精度を下げる。
発明者達は、最終的に各実験の実験法を適応させることができた。
【０１０４】 ｃ）副腎断片によるカテコールアミン塩析 各腺は、大量の哺乳動物クレブス中で２回で洗浄される、４または５片に切り
取られた（方法を参照）。１片は、方法に記載したように、ｐＨ８．６に緩衝さ
れ、かつより高い濃度のラクトペルオキシダーゼおよびルミノールを含む、溶液
Ｉまたは溶液ＩＩの反応混合物中に静かに移された。塩析は、カルシウムの存在
下で、ＫＣｌ脱分極によって引き起こされた。図９（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）は、塩析
がショ糖−トリス溶液（Ｂ）中と同じ位、食塩溶液（Ａ）中で良く得られたこと
、およびそれが明らかにカルシウムに依存していることを示している。カルシウ
ムの不存在下で、またはＫＣｌの代わりにＮａＣｌを注入した後に実施された検
査は、図９の下側に示す（ＣおよびＤ）。
【０１０５】 ｄ）線条体微小破片によるカテコールアミン塩析 この実験法もまた、マウスの脳で採取された線条体片に対してテストされた。
この場合も同様に、破片は、大量のクレブスで洗浄され、クレブス２ｍｌ中で集
める前に沈降させた。材料のアリコートは、かすから採取され、かつ反応混合物
中に注入される。この場合、最大限の精度を示す、テストに使用されるルミノー
ルおよびラクトペルオキシダーゼの比率（方法を参照）は、保たれた。塩析は、
ＫＣｌ脱分極によっても同様に引き起こされ（図７、上側の線形）、カルシウム
不存在下での検査は、ドーパミンの塩析を示さなかった（図７、下側の線形）。
両方の場合、ドーパミンを有する標準物質は、反応混合物がドーパミンを感知で
きること、および伝達物質のＣａ依存性塩析の評価を可能にすることを示した。
【０１０６】 ｅ）細胞懸濁液のカテコールアミン塩析 副腎断片をクレブス中で保温し、次に干渉物質を取り除くために副腎断片を洗
浄した後、断片は、ピペットの数回の吸引によって解離される。４つの副腎腺か
ら得られた懸濁液は、クレブス量２ｍｌ中で収集された。塩析は、溶液５〜１０
μｌを使用して実施されたが、より多くの細胞の使用は、反応混合物を弱める。
図６ＡおよびＢは、食塩溶液Ｉおよび非食塩溶液ＩＩの、異なる２種の溶液中の
副腎細胞の塩析を比較することを目的とする。Ａでは、細胞からの塩析は、食塩
溶液で測定され、かつカルシウム２．５ｍＭの存在下でカルシウムイオノホア（
Ａ２３１８７）によって引き起こされた。カルシウムが１０μＭに減らされる時
、塩析は傾くが、無視はできない（中央の線形）。一番低い線形は、イオノホア
またはカルシウム不存在下での自然消失を示す。
【０１０７】 図６Ｂは、非食塩培地（溶液ＩＩ：ショ糖トリス）で、これらの細胞の塩析が
、イオノホアＡ２３１８７およびカルシウムによってＡのように、また引き起こ
され得ることを示すが、カルシウムの低いレベルの状況では、塩析が無視し得る
ようになるので、カルシウムへの依存は、より明らかである。更に、自然消失は
、ショ糖−トリスでは、検出されなかった。細胞膨張による、カルシウムに依存
しない塩析の運動が食塩溶液中で起こることは、確からしい。
【０１０８】 ｆ）ドーパミンを加えた培養細胞のドーパミン塩析 先行する研究により、培養基中に伝達物質を加えて、培養細胞にＡＣｈ、Ｇｌ
ｕまたはＧａｂａを加えられることが示された（Ｉｓｒａｅｌら、１９９４、１
９９７）。細胞ＮＧ１０８−１５の特殊な場合、発明者達は、それらがセロトニ
ンまたはカテコールアミンを取り込めることを示す論文を発見した（Ｆｕｒｕｙ
ａら、１９８５、Ｌｉｕら、１９９２）。それらは、細胞ＮＧ１０８−１５が、
ドーパミン２〜１０ｍＭが加えられた、培養基のドーパミンを蓄積することをこ
こで示している。カテコールアミンは、特に長期の保温に関して、アスコルビン
酸を使用して、自動酸化から保護されるべきである（方法を参照）。図１０（上
側）は、細胞に実際にドーパミンが加えられたことを示す。グリオキシル酸の実
験法でドーパミンを組織化学的に特徴付けることは、細胞を蛍光にする。充填さ
れた細胞は、カルシウムの存在下でＡ２３１８７によって引き起こされたカルシ
ウム感応力に反応して神経伝達物質を塩析することが可能であった。この場合、
反応体およびイオノホアを含む溶液ＩＩ中に細胞を加えた後で、反応混合物を強
化することが必要であった。細胞外ドーパミンは、最初に測定され、かつ基本線
に達する時、ルミノール、ラクトペルオキシダーゼの追加量および１ｍｌの溶液
ＩＩ（方法を参照）が加えられた。基本線に達した時、塩析がカルシウムによっ
て引き起こされた（図１０、左側の線形）。カルシウムの代わりにＮａＣｌの注
入が実施される検査を、図１０に示す（右側の線形）。明らかにカルシウム依存
性のドーパミンの塩析が充填された細胞から得られた。
【０１０９】 ３）検討。
【０１１０】 この計画が開始した時は、発明者達は、モノアミンオキシダーゼによるカテコ
ールアミンの酸化を、ルミノールを用いた過酸化水素の検出に組み合わせること
を望んだ。偶然に、ラクトペルオキシダーゼは、カテコールアミンの酸化および
ルミノールの化学発光で生成物の検出を同時に引き起こすために、それ自体で十
分であることが発見された。カテコールアミンは電流測定実験法によって検出さ
れること、およびこれらの方法は高精度であり、特殊性はカテコールアミンの酸
化還元電位および検出電極間の関係に依存することが知られている（Ａｌｂｉｌ
ｌｏｓら、１９７７、Ｐａｎら、１９７７）。このテストで、酸化還元がラクト
ペルオキシダーゼの鉄を介して行われていることは確からしく、それは、「オキ
シダーゼ」段階において電子供与体として、かつルミノールに対するペルオキシ
ダーゼの作用において電子受容体の役目を果たし得る。あらゆる場合に、カテコ
ールアミンへのＦｅＣｌ３の親和力は、アドレナリン作動性循環中にアドレナリ
ンを発見することを可能にした「ビュルピャン反応」の根元にある。従って、ペ
ルオキシダーゼの金属イオンが、観察された反応のメカニズムを説明するために
必要不可欠であることは、確からしい。
【０１１１】 発明者達は、実験法は、ノルエピネフリン、エピネフリンまたはドーパミンを
区別しないこと、およびＬ−ＤＯＰＡは、反応混合物を不活性化するにもかかわ
らず、測定可能でないことにも気が付いた。モノアミンオキシダーゼによって酸
化したセロトニンのような、他の伝達物質は、ラクトペルオキシダーゼへのテス
トの際に反応しなかった。他の化合物、アスコルビン酸塩またはアセチルコリン
は、僅かな効果しかなかったか、効果がなかった。
【０１１２】 記載された方法は、他の方法の補足で使用され得る。この方法は迅速であり、
光の放射を測定するために同一の光度計を使用して、ＡＴＰ，ＡＣｈ、グルタメ
ートおよびＧａｂａ用に開発された他の方法を補う。
【０１１３】 発明者達は、種々のアドレナリン作動性標本のカテコールアミンの塩析を検査
することも可能であった。この方法は、塩析を連続的に検出することを可能にす
る。将来において興味深くなり得る結果の１つは、ある種の細胞は、培養の際に
ドーパミンを加えられ得るという観察である。このことは、いつかパーキンソン
病のようなドーパミン作動性欠陥を矯正する目的で、この伝達物質を蓄積し、か
つ塩析することが可能な細胞を発見することを可能にし得る（Ｂｊｏｒｋｌｕｎ
ｄおよびＳｔｅｎｅｖｉ、１９８５；Ｅｓｐｅｊｏら、１９９８）。更に、この
方法は、アドレナリン性伝達に影響を及ぼす薬理学的化合物を発見するために有
用であり得る。
【０１１４】
【参考文献】
【図面の簡単な説明】
【図１】 脳物質マイクロキューブの生成、およびその神経伝達物質定量のための使用を
示す。
【図２】 グルタメート作動性苔状線維の生成および外観、並びにその神経伝達物質定量
のための使用を示す。
【図３ａ】 アセチルコリンの定量の原理を示す。異なる定量は、数ピコモルの伝達物質の
１種を検出することを可能にする。放出された光および伝達物質比率の配分を、
各伝達物質に関して図に示す。
【図３ｂ】 グルタメートの定量の原理を示す。異なる定量は、数ピコモルの伝達物質の１
種を検出することを可能にする。放出された光および伝達物質比率の配分を、各
伝達物質に関して図に示す。
【図３ｃ】 Ｇａｂａの定量の原理を示す。異なる定量は、数ピコモルの伝達物質の１種を
検出することを可能にする。放出された光および伝達物質比率の配分を、各伝達
物質に関して図に示す。
【図３ｄ】 発光カテコールアミンのテストの原理を示す。異なる定量は、数ピコモルの伝
達物質の１種を検出することを可能にする。放出された光および伝達物質比率の
配分を、各伝達物質に関して図に示す。
【図３ｅ】 ドーパミンおよびノルエピネフリン定量を示す。異なる定量は、数ピコモルの
伝達物質の１種を検出することを可能にする。放出された光および伝達物質比率
の配分を、各伝達物質に関して図に示す。
【図４】 細胞を神経伝達物質で満たすこと、およびその神経伝達物質定量のための使用
を示す。神経伝達物質を培養基（１０ｍＭ）に加えて、細胞は、神経伝達物質で
充填される。細胞は、５〜６回洗浄され、次に約５μｌ中、神経伝達物質の濃度
１ナノモルに達するために大量の培地中に入れられる。様々な表現型の神経伝達
物質が細胞系統によってこのように表現される。
【図５】 脳脊髄液中のグルタメート定量を示す。
【図６】 食塩溶液（Ａ）または非食塩溶液（Ｂ）の解離性アドレナリン作動性細胞標本
に対するカテコールアミン定量を示す。
【図７ａ】 カルシウムの存在下でＫＣｌによって刺激された脳マイクロキューブ標本に対
するカテコールアミン定量を示す。
【図７ｂ】 ＥＧＴＡの存在下でＫＣｌによって刺激された脳マイクロキューブ標本に対す
るカテコールアミン定量を示す。
【図８】 生物学的エキスのカテコールアミン含有量測定を示す。
【図９】 副腎腺破片によるカテコールアミン塩析を示す。
【図１０】 培養中にドーパミンを加えた神経芽腫細胞によるカテコールアミン塩析を示す
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/527 Ｃ１２Ｑ 1/527 1/66 1/66 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ // Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 9/10 25/08 25/08 25/16 25/16 25/18 25/18 25/22 25/22 25/28 25/28 43/00 １１１ 43/00 １１１ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 モーリス イスラエル フランス国、ブレス−スル−イベッテ エ フ−91440、ルー アリスタイド ブライ アンド、２ (72)発明者 ベルナード レスバツ フランス国、プレッシス ペイト エフ− 91220、ルー デス カプシネス、12 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 FB12 FB13 4B063 QA01 QA05 QQ20 QQ61 QQ63 QQ80 QR02 QR03 QR04 QR12 QR72 QS28 QS36 QX02 4C084 AA17 ZA032 ZA052 ZA062 ZA122 ZA162 ZA182 ZA362 ZC022 ZC782

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 神経伝達物質放出を変調することが可能な化合物の識別方法
    であって、テストする少なくとも１種の化合物を、哺乳動物の脳物質マイクロキ
    ューブを含む神経組織標本と接触させること、および哺乳動物の脳物質マイクロ
    キューブを含む前記神経組織標本による神経伝達物質放出に関して場合によって
    起こり得る前記化合物の変調効果を測定することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 前記マイクロキューブは、０．１〜５ｍｍ３の平均寸法を有
    することを特徴とする請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記マイクロキューブは、１ｍｍ３の平均寸法を有すること
    を特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の方法。
  4. 【請求項４】 テストする少なくとも１種の化合物を、哺乳動物の脳物質マ
    イクロキューブを含む神経組織標本と接触させ、次に前記標本またはその上清を
    、少なくとも１種が哺乳動物の脳物質マイクロキューブを含む神経組織標本によ
    って放出された神経伝達物質と反応することが可能である１種または数種の物質
    の存在下に置くこと、および神経伝達物質が放出された場合、検出可能な前記物
    質の１種または数種を検出または定量して、あるいは神経伝達物質が放出された
    場合、前記物質の１種の変換の結果生じた少なくとも１種の生成物を検出または
    定量して、テストする化合物の場合によって起こり得る変調効果を測定すること
    を特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 テストする化合物は、分離化合物、化合物混合物、生体試料
    、組み合わせライブラリ、合成または天然分子であることを特徴とする請求項１
    から４のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記マイクロキューブは、大脳皮質マイクロキューブである
    ことを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 テストする化合物を、哺乳動物の脳物質マイクロキューブを
    含む神経組織標本と接触させた後、神経伝達物質が放出された場合、検出可能な
    前記物質１種または数種を検出または定量して、あるいは神経伝達物質が放出さ
    れた場合、前記物質の１種の変換の結果生じた少なくとも１種の生成物を検出ま
    たは定量して、テストする化合物の場合によって起こり得る変調効果を測定する
    上清を採取することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 放射された光の検出または定量によってテストする化合物の
    、場合によって起こり得る変調効果を測定することを特徴とする請求項１から７
    のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 グルタメート（Ｇｌｕ）、アセチルコリン（Ａｃｈ）、γ−
    アミノブチレート（Ｇａｂａ）、カテコールアミン特にドーパミン（ＤＡ）、ま
    たはＡＴＰから選択された１種または数種の神経伝達物質放出に関してテストす
    る化合物の、場合によって起こり得る変調効果を測定することを特徴とする請求
    項１から８のいずれかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 テストする少なくとも１種の化合物を、哺乳動物の脳物質
    マイクロキューブを含む神経組織標本と接触させ、次に前記標本またはその上清
    を、少なくともその１種の基質が神経伝達物質である１種または数種の酵素、お
    よびその酵素によって前記神経伝達物質の分解に続いて光を放射することが可能
    な少なくとも１種の作用物質の存在下に置くことを特徴とする請求項９に記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】 テストする少なくとも１種の化合物を、哺乳動物の脳物質
    マイクロキューブを含む神経組織標本と接触させ、次に前記標本またはその上清
    をアセチルコリンエステラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およ
    びルミノールの存在下に相次いでまたは同時に置くこと、および哺乳動物の脳物
    質マイクロキューブを含む神経組織標本によって放出されたアセチルコリンのア
    セチルコリンエステラーゼによる分解に続く、ルミノールの分解によって放射さ
    れた光を検出または定量することを特徴とする請求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 テストする少なくとも１種の化合物を、哺乳動物の脳物質
    マイクロキューブを含む神経組織標本と接触させ、次に前記標本またはその上清
    をグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、ルシフェラーゼ、Ｎ
    ＡＤおよびデカアルデヒドの存在下に相次いでまたは同時に置くこと、および哺
    乳動物の脳物質マイクロキューブを含む神経組織標本によって放出されたグルタ
    メートのグルタミン酸デヒドロゲナーゼによる分解に続く、デカアルデヒドの分
    解によって放射された光を検出または定量することを特徴とする請求項９に記載
    の方法。
  13. 【請求項１３】 テストする少なくとも１種の化合物を、哺乳動物の脳物質
    マイクロキューブを含む神経組織標本と接触させ、次に前記標本またはその上清
    をガバーゼ、オキシドレダクターゼ、ルシフェラーゼ、ＮＡＤおよびＦＭＮの存
    在下に相次いでまたは同時に置くこと、および哺乳動物の脳物質マイクロキュー
    ブを含む神経組織標本によって放出されたＧａｂａのガバーゼによる分解に続く
    、ＳＳＡＬの分解によって放射された光を検出または定量することを特徴とする
    請求項９に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 テストする少なくとも１種の化合物を、哺乳動物の脳物質
    マイクロキューブを含む神経組織標本と接触させ、次に前記標本またはその上清
    をラクトペルオキシダーゼ、Ｏ２、およびルミノールの存在下に相次いでまたは
    同時に置くこと、および哺乳動物の脳物質マイクロキューブを含む神経組織標本
    によって放出されたカテコールアミンのラクトペルオキシダーゼによる分解に続
    く、ルミノールの分解によって放射された光を検出または定量することを特徴と
    する請求項１０に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１から１４のいずれかに記載の方法を実施するため
    のキットであって： − 分離された区画中に、哺乳動物の脳物質マイクロキューブを含む１種または
    数種の神経組織標本と、 − １種または数種の物質で、その内少なくとも１種が、哺乳動物の脳物質マイ
    クロキューブを含む神経組織標本によって放出された神経伝達物質と反応するこ
    とが可能であり、かつ神経伝達物質が放出された場合前記物質の少なくとも１種
    が検出可能であるか、または神経伝達物質が放出された場合前記物質の１種の変
    換の結果生じた少なくとも１種の生成物が検出可能である、物質と、 − 必要があれば、哺乳動物の脳物質マイクロキューブを含む神経組織標本によ
    る１種または数種の神経伝達物質放出に関する効果が知られている、１種または
    数種の基準化合物とを含むことを特徴とするキット。
  16. 【請求項１６】 カテコールアミンおよび特にドーパミン（ＤＡ）の放出を
    変調することが可能な化合物の識別方法であって、テストする少なくとも１種の
    化合物を神経組織標本と接触させ、次に前記標本またはその上清をラクトペルオ
    キシダーゼ、Ｏ２、およびルミノールの存在下に相次いでまたは同時に置くこと
    、および神経組織標本によって放出された少なくとも１種のカテコールアミンの
    ラクトペルオキシダーゼによる分解に続く、ルミノールの分解によって放射され
    た光を検出または定量することを特徴とする方法。
JP2001517159A 1999-08-11 2000-08-10 神経伝達物質を変調する化合物の識別方法 Pending JP2003507710A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9910410A FR2797453B1 (fr) 1999-08-11 1999-08-11 Procede d'identification de composes capables de moduler la liberation de neuromediateur et les kits pour sa mise en oeuvre
FR99/10410 1999-08-11
PCT/FR2000/002294 WO2001013108A1 (fr) 1999-08-11 2000-08-10 Procede d'identification de composes modulateurs des neuromediateurs

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003507710A true JP2003507710A (ja) 2003-02-25

Family

ID=9549085

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001517159A Pending JP2003507710A (ja) 1999-08-11 2000-08-10 神経伝達物質を変調する化合物の識別方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US7279330B1 (ja)
EP (2) EP1335202B9 (ja)
JP (1) JP2003507710A (ja)
AT (2) ATE288080T1 (ja)
AU (1) AU776373B2 (ja)
CA (1) CA2381700A1 (ja)
DE (2) DE60017754T2 (ja)
FR (1) FR2797453B1 (ja)
WO (1) WO2001013108A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006280201A (ja) * 2005-03-31 2006-10-19 Toyama Univ 生体アミンの分析方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992019717A1 (en) * 1991-04-02 1992-11-12 Baylor College Of Medicine A high-affinity human glutamate/aspartate uptake system

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006280201A (ja) * 2005-03-31 2006-10-19 Toyama Univ 生体アミンの分析方法
JP4665165B2 (ja) * 2005-03-31 2011-04-06 国立大学法人富山大学 生体アミンの分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE60017754T2 (de) 2006-01-05
DE60025405T2 (de) 2006-09-07
AU7011100A (en) 2001-03-13
EP1335202B1 (fr) 2006-01-04
DE60017754D1 (de) 2005-03-03
EP1203233B1 (fr) 2005-01-26
WO2001013108A1 (fr) 2001-02-22
DE60025405D1 (de) 2006-03-30
US7279330B1 (en) 2007-10-09
CA2381700A1 (fr) 2001-02-22
EP1203233A1 (fr) 2002-05-08
FR2797453B1 (fr) 2003-10-17
AU776373B2 (en) 2004-09-09
ATE288080T1 (de) 2005-02-15
EP1335202B9 (fr) 2006-06-28
EP1335202A1 (fr) 2003-08-13
ATE315227T1 (de) 2006-02-15
FR2797453A1 (fr) 2001-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Thompson et al. Fluorescence microscopy of stimulated Zn (II) release from organotypic cultures of mammalian hippocampus using a carbonic anhydrase-based biosensor system
US20070141652A1 (en) Isolation of the mitotic spindle matrix and its methods of use
JP2021523700A (ja) 早期発症型孤発性パーキンソン病の分子シグネチャの診断及び薬物スクリーニング
Guo et al. Expression of two forms of glutamic acid decarboxylase (GAD67 and GAD65) during postnatal development of cat visual cortex
WO2019195800A1 (en) Novel differentiation technique to generate dopaminergic neurons from induced pluripotent stem cells
Fatima et al. Monoallelic and bi-allelic variants in NCDN cause neurodevelopmental delay, intellectual disability, and epilepsy
Nomura et al. Three-dimensional ultra-structures of myelin and the axons in the spinal cord: application of SEM with the osmium maceration method to the central nervous system in two mouse models
Zhou et al. Non-invasive optical biomarkers distinguish and track the metabolic status of single hematopoietic stem cells
Vancamp et al. Developmental thyroid disruption permanently affects the neuroglial output in the murine subventricular zone
CN107109462B (zh) 涉及测试溶酶体贮积紊乱的方法
KR100951656B1 (ko) 프로베네시드를 포함하는 ｔｒｐｖ２ 활성제
EP4100541A1 (en) Disease detection and treatment based on phenylacetyl glutamine levels
US7309579B2 (en) Method for screening for activators of soluble guanylate cyclase having oxidized heme iron
Merlo-Pich et al. Methods to detect mitochondrial function
JP2003507710A (ja) 神経伝達物質を変調する化合物の識別方法
Israël et al. A chemiluminescent catecholamine assay: its application for monitoring adrenergic transmitter release
Odinokova et al. Isolation of pancreatic mitochondria and measurement of their functional parameters
DE10029210A1 (de) Testsystem sowie dessen Verwendung
US6368815B1 (en) Screening of molecules that inhibit human phosphodiesterase 4A produced by non-recombinant cell lines
JP2006214731A (ja) スフィンゴミエリンの検出方法
KR100289673B1 (ko) 넙치의효소분석으로얻어진생화학지표에의한해양오염진단법
Delaney et al. Local inhibition of PRC2 activity by H3. 3K27M drives DNA replication defects through misregulation of the JNK pathway
Xu et al. Different histone deacetylases target Runx transcription factors through their co-activators
Jakobsson Molecular mechanisms in synaptic vesicle recycling
Vancamp et al. and Sylvie Remaud