JP2003504079A

JP2003504079A - 感染症および免疫系疾患の治療用組成物とその使用方法

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Publication number: JP2003504079A
Application number: JP2001509749A
Authority: JP
Inventors: アランデルケア、
Original assignee: ジェネシスリサーチアンドデベロップメントコーポレイションリミテッド
Priority date: 1999-07-12
Filing date: 2000-07-10
Publication date: 2003-02-04
Also published as: CN1378560A; MXPA01013097A; EP1200459A1; US20030054013A1; CN100379759C; EP1200459A4; BR0012740A; AU784847B2; US7041295B2; EP1200459B1; AU5719700A; CA2383496A1; WO2001004140A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、バッケー菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖａｃｃａｅ）のタンパク質の免疫原性エピトープを含むポリペプチドと、かかるポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドと、少なくとも１つのかかるポリペプチドを含む融合タンパク質を、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトとともに提供する。かかるポリペプチド、ポリヌクレオチド、融合タンパク質、および／またはＤＮＡコンストラクトを含む組成物は、感染症および免疫疾患の治療に用いるものであってもよい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、一般的には、感染症の検出、治療および予防に関する。具体的には
、本発明は、マイコバクテリウム・バッケー菌（バッケー菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｖａｃｃａｅ）から単離された免疫原性のあるエピトープを含む組
成物と、結核菌およびトリ型結核菌の感染のようなマイコバクテリウム属の細菌
感染を含む感染症に対するワクチン接種または免疫療法並びに免疫疾患および癌
のある種の治療法におけるかかる組成物の利用とに関する。

【０００２】

【従来の技術】

一般的には、本発明は、感染症の治療および予防と、ある種の免疫疾患および
癌の治療とに関する。具体的には、本発明は、結核菌またはトリ型結核菌（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ）の感染を含むマイコバクテリウム属の細
菌感染の治療および予防のための組成物および方法に関する。

【０００３】結核は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
の感染を原因とする慢性感染症である。結核は、開発途上国での主要な疾患であ
るとともに、世界の先進地域で増加中の問題でもあり、毎年約８００万人の新患
が発生し、３００万人が死亡する。この感染はかなり長期間無症状で、発熱と呼
吸の症状を起こす肺の慢性炎症として発症することが最もありふれている。未処
置のままだと非常に重い症状となり死に至ることもある。

【０００４】結核は長期の抗生物質療法を用いて管理できるのが一般的であるが、かかる治
療は本疾患の蔓延を防止するには十分ではない。感染者は一定期間無症状であっ
ても伝染する場合がある。さらに、治療方式の遵守が決定的に重要だが、患者の
行動を監視することは困難である。一部の患者は一連の治療を途中で止めるため
、治療効果がみられず、薬剤耐性のマイコバクテリウム属の細菌の発生につなが
ることがある。

【０００５】結核の蔓延を阻止するためには、有効なワクチン接種およびこの疾患の正確な
初期診断が必要である。現在のところ、生きた細菌でのワクチン予防接種が保護
免疫を誘導するために最も有効な方法である。この目的のために最も慣用される
マイコバクテリウム属の細菌は、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｂｏｖｉｓ（Ｍ．ｂｏｖｉｓ））の無毒化株のカルメット−ゲラン菌（ＢＣＧ）
である。しかし、ＢＣＧの安全性および有効性には議論があり、アメリカ合衆国
のような一部の国では、一般大衆に対してワクチン接種を実施していない。結核
菌感染の診断は、通例は、精製ツベルクリンタンパク（ツベルクリンＰＰＤ）の
皮内曝露を伴う皮膚試験を用いて行われる。抗原特異的なＴ細胞反応により、穿
刺から４８−７２時間後に測定可能な硬結部が穿刺部位に生じるので、マイコバ
クテリウム抗原に曝露されていることが示される。しかし、感度および特異性が
この試験で問題とされており、ＢＣＧではワクチン接種をした者と感染した者と
を区別することができない。

【０００６】結核およびらい病の免疫療法に用いられてきたあまり良く知られていないマイ
コバクテリウムに、ヒトでは非病原性であるマイコバクテリウム・バッケー菌（
バッケー菌、Ｍ．ｖａｃｃａｅ）がある。しかし、ＢＣＧと比較するとバッケー
菌の有効性に関する情報は少なく、一般大衆のワクチン接種に広く用いられては
こなかった。ウシ型結核菌ＢＣＧおよびバッケー菌は、結核菌感染者の免疫系に
よって認識される抗原性の化合物を含むと信じられている。

【０００７】複数の特許その他の刊行物には、バッケー菌を含むマイコバクテリウム属の細
菌か、マイコバクテリウム属の細菌の一定の分画かの投与によるさまざまな症状
の治療法が開示されている。米国特許第４，７１６，０３８号明細書は、バッケ
ー菌を含むマイコバクテリウム属の細菌を投与することによる、関節炎疾患を含
むさまざまなタイプの自己免疫疾患の診断法と、ワクチン接種法と、治療法とを
開示している。国際公開第ＷＯ９１／０２５４２号公報には、患者がＩＬ−６お
よび／またはＴＮＦの異常に高い放出を示すか、患者のＩｇＧに無ガラクトース
ＩｇＧが異常に高い割合を占めるかしている慢性炎症疾患の治療法を開示してい
る。この公報に言及された疾患の中には、乾癬、リウマトイド関節炎、マイコバ
クテリウム属の細菌による疾患、クローン病、原発性胆管性肝硬変症、サルコイ
ドーシス、潰瘍性大腸炎、全身性ループス・エリテマトーデス、多発性硬化症、
ギラン・バレー症候群、原発性真性糖尿病および移植片拒絶反応の一部の局面が
含まれる。この治療薬には、１回の注射により投与されるオートクレーブ（高圧
滅菌）したバッケー菌を含むことが好ましい。

【０００８】米国特許第４，７１６，０３８号明細書は、バッケー菌を含むマイコバクテリ
ウム属の細菌を投与することによる、関節炎疾患を含むさまざまなタイプの自己
免疫疾患の診断法と、ワクチン接種法と、治療法とを開示している。米国特許第
４，７２４，１４４号明細書は、マイコバクテリウム属の細菌性疾患、特に結核
およびらい病の治療のためおよび化学療法のアジュバントとしてのバッケー菌由
来の抗原性物質を含む免疫療法剤を開示している。国際公開第ＷＯ９１／０１７
５１号公報には、バッケー菌由来の抗原性のおよび／または免疫調節的な物質を
ＡＩＤＳの進行を遅延しおよび／または阻害するための免疫予防薬として使用す
ることが開示されている。国際公開第ＷＯ９４／０６４６６号公報には、バッケ
ー菌由来の抗原性の物質および／または免疫調節的な物質を、ＡＩＤＳを発症し
ているかまたは発症していない、かつ、結核を併発しているかまたは併発してい
ない、ＨＩＶ感染の治療に使用することが開示されている。

【０００９】伝統的なワクチンには、弱毒化あるいは死菌のいずれかの形状の病原体生物（
またはその成分）が含まれる。伝統的なワクチンに代替するアプローチとして、
ＤＮＡワクチンが、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、癌およびマラリアのように多様
な疾患について開発されてきた。ＤＮＡワクチンの臨床治験はこれらの疾患の多
くについて進行中である。典型的なＤＮＡワクチンは、不活性なプラスミド担体
にクローニングされた、抗原をエンコードするＤＮＡからなる。このワクチンＤ
ＮＡにエンコードされる抗原の発現は、通常は、ヒトβ−アクチン、ラウス肉腫
ウイルス（ＲＳＶ）またはＣＭＶのプロモーターのような、強力なプロモーター
の支配下にある（ＲａｍｓａｙＡＪら、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎｄＣｅ
ｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、７５巻、３６０−３６３頁、１９９７年）。ＤＮＡワク
チンが所望の免疫反応を誘発できるという最初の実験的な証拠は、Ｔａｎｇら（
ＴａｎｇＤ−Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻、１５２−１５４頁、１９９２年
）によって得られた。これらの実験では、ヒト成長ホルモンをエンコードする遺
伝子を含むプラスミドを接種したマウスが特異的な抗体の一次反応をした。

【００１０】結核菌由来の遺伝子を含む２つのＤＮＡワクチンに対する免疫反応が、動物モ
デルで評価された。１番目のワクチンはストレスタンパク質のＧｒｏＥＬ（６５
ｋＤａタンパク質）をコードする遺伝子を含むものであった（ＴａｓｃｏｎＲ
Ｅら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．、２巻、８８８−８９２、１９９６年）。このＤ
ＮＡワクチンを注射されたマウスは、伝統的なＢＣＧワクチンを接種されたマウ
スと同等のレベルで保護された。結核菌に対する２番目のＤＮＡワクチンは、抗
原８５複合体由来の抗原をエンコードするＤＮＡを含むものであり、Ｔａｎｇら
による研究と同様の結果が得られた（ＨｕｙｇｅｎＫら、ＮａｔｕｒｅＭｅ
ｄ．、２巻、８９３−８９８頁、１９９６年）。米国特許第５，７３６，５２４
号明細書は、操作可能に転写制御エレメントと連結された結核菌抗原８５遺伝子
を含むポリヌクレオチドの結核ワクチンを投与することによる、結核菌またはウ
シ結核菌の感染に対する飼育哺乳類あるいは家畜のワクチン接種を開示している
。

【００１１】最近、最初のヒトのＤＮＡワクチン治験が報告された（ＷａｎｇＲら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、２８２巻、４７６−８０頁、１９９８年）。この治験では、マラリ
アの病原体である熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａ
ｒｕｍ）由来の抗原が健康な志願者に注射された。細胞障害（ＣＤ８^＋）Ｔリン
パ球（ＣＴＬ）の存在により証明されるとおり、所望の免疫反応が誘発され、免
疫系が感染した患者から寄生虫を除去しうることが示唆された。ＨＩＶ−１に対
するヒトＤＮＡワクチンに安全性および免疫原性があることは、ＭｃＧｒｅｇｏ
ｒらによって行われた治験で決定された（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１７８
巻、９２−１００頁、１９９８年）。他のＤＮＡワクチンの実験からの実験デー
タも、抗体と、ＭＨＣクラス１−拘束ＣＤ８^＋ＣＴＬと、クラスＩＩ−拘束ＣＤ
４^＋ヘルパーＴ細胞とがＤＮＡワクチン注射後に産生されることが示唆された（
ＲａｍｓａｙＡＪら、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏ
ｇｙ、７５巻、３６０−３６３頁、１９９７年）。

【００１２】ＤＮＡワクチンには、より伝統的な、死菌または弱毒化菌を含むワクチンに比
べて、著しい長所がある。ＤＮＡワクチンは、長期間有効な免疫反応を誘発する
ので、１回の接種だけしか必要ない。多数の抗原をエンコードするＤＮＡを単一
のプラスミドに取り込むことができるので、多数の疾病に対する保護を与えるこ
とができる。ＤＮＡワクチン作製のための技術は比較的簡単であり、同一の技術
が全てのワクチンを作製するために利用することができ、生産コストを低廉にす
ることができる。有効な伝統的なワクチンを患者に配達するためには、製造者か
ら診療所までの「コールド・チェーン」が途切れずに維持される必要がある。液
状または乾燥状態で出荷されるＤＮＡワクチンは、保存条件に敏感ではない。

【００１３】最近、ＤＮＡワクチンを構築し適用する代替的な方法が開発された。それらの
技術の１つで、体細胞トランスジーン免疫（ＳｏｍａｔｉｃＴｒａｎｓｇｅｎ
ｅＩｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ、ＳＴＩ）という技術では、組織特異的な調節エ
レメントの制御の下にある免疫グロブリン重鎖遺伝子を有するプラスミドＤＮＡ
がマウスの脾臓に直接接種され、この抗原はその後Ｂ細胞の表面に発現した（Ｘ
ｉｏｎｇＳら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、６
３５２−６３５７頁、１９９７年）。このＢ細胞は発現された抗原に対する抗体
を産生し、免疫反応を起こすことになった。その後の研究から、ＳＴＩは２年以
上にわたる持続的な免疫学的な記憶を誘導することが示された（Ｇｅｒｌｏｎｉ
Ｍら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２−３巻、２９３−２９７頁、１９９８年）。

【００１４】発現ライブラリ免疫法（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＬｉｂｒａｒｙＩｍｍｕｎ
ｉｚａｔｉｏｎ、ＥＬＩ）はＤＮＡワクチンを用いる別の技術である（Ｂａｒｒ
ｙＭＡら、Ｎａｔｕｒｅ、３７７巻、６３２−６３５頁、１９９５年）。この
技術では、病原体の全ゲノムの断片をベクターにクローニングしてワクチンとし
て用いる。保護的な抗原、特にＣＴＬを誘発する抗原の選択は、単一クローンが
同定できるまでクローンのプールをスクリーニングし再スクリーニングすること
によってなされる。同定されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、証明さ
れた送達システムに取り込むことができる。

【００１５】ＨＩＶ感染の治療および予防のためのエピトープに基づくワクチンのＥｐｉｍ
ｍｕｎｅＩｎｃ．（ＳａｎＤｉｅｇｏ、カリフォルニア州）の科学者による
開発の進行状況が、最近発表された（ＩｓｈｉｏｋａＧＹら、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６２巻、３９１５−３９２５頁、１９９９年
）。

【００１６】ヒトおよび飼育哺乳類または家畜における結核菌その他のマイコバクテリウム
属の細菌感染のような感染症を予防し治療するためと、ある種の免疫系に関連し
た疾患の治療のためとの有効な組成物および方法の需要が、本発明の技術分野に
おいては存在する。

【００１７】発明の概要簡潔には、本発明は、マイコバクテリウム属の細菌感染のような感染症の予防
および治療のためと、免疫疾患および癌の治療のためとの組成物および方法を提
供する。

【００１８】第１の局面では、バッケー菌のゲノム由来の単離されたポリヌクレオチドが提
供される。これらのポリヌクレオチドは、複数の免疫学的なアッセイの結果示さ
れたとおりの免疫原性に基づいて選択されるポリペプチドのエピトープをエンコ
ードする。特定の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号
８−２１に提供される配列と、（ｂ）配列番号８−２１の配列に対してコンピュ
ーターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを使用して決定される同一性が少なくとも５０
％、７５％または９０％ある残基を有する配列と、（ｃ）前記（ａ）および（ｂ
）の配列の相補体とからなるグループから選択される配列を含む。

【００１９】第２の局面では、本発明は、バッケー菌抗原の免疫原性のあるエピトープを含
む単離されたポリペプチドを提供する。特定の実施態様では、本発明のポリペプ
チドは、（ａ）配列番号６１−７７に提供される配列と、（ｂ）配列番号６１−
７７の配列に対してコンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＸを使用して決定され
る同一性が少なくとも５０％、７５％または９０％ある残基を有する配列とから
なるグループから選択される配列を含む。

【００２０】本発明のポリヌクレオチドの少なくとも１つを含むＤＮＡコンストラクトと、
かかるＤＮＡコンストラクトで形質転換またはトランスフェクションされた宿主
細胞も提供される。

【００２１】別の局面では、本発明は、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを含む融合
タンパク質を提供する。

【００２２】別の局面では、本発明は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、融合タ
ンパク質またはＤＮＡコンストラクトの少なくとも１つと、生理的に受け入れら
れる担体とを含む組成物を提供する。本発明は、上記のポリペプチド、ポリヌク
レオチド、融合タンパク質またはＤＮＡコンストラクトの少なくとも１つと、免
疫賦活剤とを含む組成物をも提供する。

【００２３】さらに別の局面では、上記の１以上の組成物の有効量を患者に投与することを
含む、患者における免疫反応を増強するための方法が提供される。１の実施態様
では、前記免疫反応はＴｈ１反応である。

【００２４】本発明の更なる局面では、患者に本発明の組成物を投与することを含む患者の
疾患の治療のための方法が提供される。ある種の実施態様では、前記疾患は、免
疫疾患、感染症および癌からなるグループから選択される。

【００２５】これらおよび他の本発明の局面は、以下の詳細な説明を参照することにより明
らかとなる。ここに開示される全ての参照文献は、引用により、その全体がそれ
ぞれが個別にとりこまれたのと同様に取り込まれている。

【００２６】発明の詳細な説明上記のとおり、本発明は、一般的には、感染症、ある種の免疫疾患および癌を
含む疾病の予防および治療のための組成物および方法を目的とする。かかる疾病
の例には、結核菌およびトリ型結核菌の感染を含むマイコバクテリウム属の細菌
感染と、感染およびアレルギー鼻炎を含む（がこれらに限定されない）Ｔｈ１免
疫反応の刺激が有益な疾病とを含むが、これらに限定されない。

【００２７】結核菌のようなある種の病原体とある種の癌とは、細胞性免疫として知られる
ＣＤ４^＋Ｔ細胞が指揮する免疫的な攻撃によって有効に封じ込めることができる
。ポリオウイルスのような他の病原体は、封じ込めにはＢ細胞によって産生され
る抗体も必要である。これらの異なるクラスの免疫的な攻撃（Ｔ細胞またはＢ細
胞）は、通例、Ｔｈ１およびＴｈ２として言及されるＣＤ４^＋Ｔ細胞の異なるサ
ブポピュレーションによって制御される。

【００２８】これらの２つのタイプのＴｈ細胞のサブセットはマウスのモデルでは良く特徴
が調べられており、これらの細胞が活性化されたときに放出するサイトカインに
よって定義づけられている。Ｔｈ１サブセットは、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γおよび
腫瘍壊死因子を分泌し、マクロファージの活性化および遅延型過敏反応に介在す
る。Ｔｈ２サブセットは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を放
出し、Ｂ細胞の活性化を刺激する。ＩＬ−４はＴｈ１タイプ反応を阻害し、ＩＦ
Ｎ−γはＴｈ２反応を阻害するというように、Ｔｈ１およびＴｈ２サブセットは
相互に阻害する。同様のＴｈ１およびＴｈ２サブセットはヒトでも見つけられて
おり、マウスモデルで観察されたのと同一のサイトカインの放出が見られる。Ｔ
ｈ１タイプの免疫反応の増幅は、結核、サルコイドーシス、喘息、アレルギー鼻
炎および肺癌のような呼吸器系疾患を含む多くの疾患の病状の進行を逆転させる
うえで中心となる。

【００２９】１の局面では、本発明の組成物には、少なくとも１つの免疫原性のあるバッケ
ー菌のエピトープを含むポリペプチドまたはその変異体が含まれる。特定の実施
態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号６１−７７に提供される配列を含
む。かかるポリペプチドは、Ｔ細胞の増殖および／または結核菌に曝露された個
体のＴ細胞からのインターフェロン・ガンマの分泌を刺激する。

【００３０】ここで使用された「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基が共有結合で
連結された、完全長を含むいかなる長さのアミノ酸鎖（例えば抗原）をも含む。
したがって、上記の抗原の１つの免疫原性のあるエピトープを含むポリペプチド
は、前記免疫原性のあるエピトープだけからなるものであってもよく、追加の配
列を含むものであってもよい。この追加の配列は、本来のバッケー菌由来であっ
ても異種由来のものであってもよく、かかる配列が免疫原性を有するものであっ
てもよい（がその必要はない）。

【００３１】ここで用いられるところの「免疫原性がある」とは、ヒトのような患者におい
て、あるいは生物学的なサンプルにおいて、免疫反応を誘発できる能力をいう。
特に、免疫原性のあるエピトープとは、マイコバクテリウム属の細菌に免疫があ
る個体由来の細胞であって、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージの
グループから選択される１以上の細胞を含む生物学的なサンプルにおいて、細胞
増殖、インターロイキン−１２産生またはインターフェロン−γ産生を刺激する
ことができるポリペプチドの部分をいう。一般に、免疫原性のあるエピトープは
、実施例１に詳細に示したアッセイ技術を用いて決定することにより、マイコバ
クテリウム属の細菌に免疫がある個体由来のＰＢＭＣの増殖を、対照実験のＰＢ
ＭＣで観察された増殖に比べて少なくとも２倍以上高いレベルで刺激する。代替
的には、あるいは追加的には、免疫原性のあるエピトープは、実施例１に詳細に
示したＥＬＩＳＡアッセイ法においてＯＤが少なくとも２倍以上増加させること
によって決定される、マイコバクテリウム属の細菌に免疫がある個体由来のＰＢ
ＭＣにおけるインターフェロン−γ産生を、コントロールの細胞で観察されたイ
ンターフェロン−γの産生に比べて少なくとも２倍以上高いレベルで刺激する。
マイコバクテリウム属の細菌に免疫がある個体とは、結核菌、環境的な非病原菌
またはＢＣＧに対して有効なＴ細胞反応を開始したために、マイコバクテリウム
属の細菌感染の発症に対して耐性があると考えられる個体をいう。かかる個体は
、結核タンパク質（ＰＰＤ）に対する皮内皮膚試験が強陽性（すなわち直径約１
０ｍｍ以上の硬化）であり、かつ、結核感染の徴候を全く示さないことに基づい
て同定できる。１以上のバッケー菌抗原の少なくとも１つの免疫原性のあるエピ
トープを含むポリペプチドは、一般に、患者における結核に対する保護免疫を誘
導するため、および／または患者における免疫反応を刺激するために用いること
ができる。

【００３２】別の局面では、本発明の組成物は、バッケー菌の免疫原性のあるエピトープを
エンコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様では、本発
明のポリヌクレオチドは、配列番号５−２１の配列を含む。本発明の単離された
ポリヌクレオチドの相補体と、かかる単離されたポリヌクレオチドの逆相補体と
、かかる単離されたポリヌクレオチドの逆配列も、かかる配列の変異体とともに
提供される。本発明は、開示された配列とは異なるが、遺伝暗号の縮重の結果、
ここに開示された本発明のポリヌクレオチドにエンコードされるポリペプチドと
同一のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドも含む。

【００３３】ここで用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチドの塩基の１本鎖または２本鎖のポリマーを意味し、
ＤＮＡ分子およびこれと対応する、ＨｎＲＮＡとｍＲＮＡ分子を含めた、センス
鎖とアンチセンス鎖の両方のＲＮＡ分子を含み、全合成または部分合成されたポ
リヌクレオチドとともに、ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡと組み換えＤＮＡとを含む。
ＨｎＲＮＡは、イントロンを含み、ＤＮＡ分子と一般的に１対１に対応する。ｍ
ＲＮＡは、イントロンが切り出されたＨｎＲＮＡおよびＤＮＡ分子に対応する。
ポリヌクレオチドは、遺伝子全体またはその部分を含む。操作可能なアンチセン
スポリヌクレオチドは、対応するポリヌクレオチドの断片を含み、それゆえに「
ポリヌクレオチド」の定義には全てのかかる操作可能なアンチセンス断片が含ま
れる。アンチセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドが関
与する技術は当業者に周知であり、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−Ｂｅｎｉｏｎら
、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（アンチセンス技術）」、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．、２５４巻、２３号、３６３−３７５頁、
１９９５年およびＫａｗａｓａｋｉら、Ａｒｔｉｆｉｃ．Ｏｒｇａｎｓ、２０巻
、８号、８３６−８４８頁、１９９６年に記載されている。

【００３４】ここで使用される「相補体」、「逆相補体」、および「逆配列」という用語の
定義は、以下の例で最も良く示されている。５’ＡＧＧＡＣＣ３’という配列に
対して、相補体、逆相補体および逆配列は以下のとおりである。相補体３’ＴＣＣＴＧＧ５’ 逆相補体３’ＧＧＴＣＣＴ５’ 逆配列５’ＣＣＡＧＧＡ３’

【００３５】ここで記載されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、全て当業者に慣用
される条件で単離精製される。

【００３６】本発明の組成物および方法には、上記のポリペプチドおよびポリヌクレオチド
の変異体も含まれる。変異体は、天然に存在する対立遺伝子の変異体でも、天然
に存在しない変異体でもよい。ここで用いられるところの「変異体」という用語
は、本発明の配列に対して、少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約
５０％、更により好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約
９０％の（ヌクレオチドまたはアミノ酸のいずれかの）残基の同一性を示すもの
をいう。残基の同一性の百分率は、比較する２つの配列のアライメントをとり（
ａｌｉｇｎ）、アライメントがとれた部分の同一残基数を決定し、該同一残基数
を本発明の、あるいはクエリーの、配列中の全残基数で除算し、その結果を１０
０倍したものをいう。

【００３７】公開され入手可能なコンピューターアルゴリズムを使用して、ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチド配列のアライメントをとることができ、特定の領域のヌク
レオチドの同一性の百分率を別のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対
して決定することができる。ポリヌクレオチド配列のアライメントおよび類似性
同定のための２つの代表的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡア
ルゴリズムである。ポリペプチド配列の類似性は、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴ
Ｘアルゴリズムを使用して調べることができる。前記ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡ
ＳＴＰの両方のプログラムは、ＮＣＢＩの匿名ＦＴＰサーバー（ｆｔｐ：／／ｎ
ｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上の／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓ
／で入手可能である。説明書に記載され、前記アルゴリズムとともに配布された
、デフォルトのパラメーター値に設定したＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン
２．０．６（１９９８年９月１６日）を、本発明による変異体の決定に用いるの
が好ましい。ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸを含むＢＬＡＳＴ
ファミリーのアルゴリズムの使用法は、ＮＣＢＩのウェッブサイトのＵＲＬ（ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｎｅｗ
ｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ）と、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、ＳｔｅｐｈｅｎＦらによる「
ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴａｎｄＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａｎｅｗｇｅ
ｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｅｓｅａｒｃｈ
ｐｒｏｇｒａｍｓ（ギャップ入りのＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世
代のタンパク質データベース検索プログラム）」、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、２５巻、３３８９−３４０２頁、１９９７年という刊行物とに記載
されている。コンピューターアルゴリズムのＦＡＳＴＡは、インターネット上の
ｆｔｐサイトｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｆａｓ
ｔａ／で入手可能である。説明書に記載され、プログラムとともに配布されたデ
フォルトのパラメーター値に設定した、ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＸアルゴリズ
ムのバージョン３．１ｔ１１（１９９８年８月）を、本発明による変異体の決定
に用いることができる。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの使用法は、例えば、Ｐｅａｒ
ｓｏｎＷＲおよびＬｉｐｍａｎＤＪ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８５巻、２４４４−２４４８頁、１９８８年と、Ｐｅａｒｓｏｎ
ＷＲ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．、１８３巻、６３−９８頁、１
９９０年とに記載されている。ＦＡＳＴＸアルゴリズムの使用法は、例えば、Ｐ
ｅａｒｓｏｎＷＲら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４６巻、２４−３６頁、１９９７年
に記載されている。

【００３８】以下のランニングパラメーターを、ポリヌクレオチド配列の以下に説明するＥ
値（Ｅｖａｌｕｅｓ）および同一性の百分率に寄与する、ＢＬＡＳＴＮを使う
アライメントおよび類似性の決定に用いるのが好ましい。Ｕｎｉｘ（登録商標）
のランニングコマンド：ｂｌａｓｔａｌｌ −ｐｂｌａｓｔｎ −ｄｅｍｂ
ｌｄｂ −ｅ１０ −Ｇ０ −Ｅ０ −ｒ１ −ｖ３０ −ｂ３０
−ｉｑｕｅｒｙｓｅｑ −ｏｒｅｓｕｌｔｓ」で、パラメーターの初期設
定値は以下のとおりである：−ｐプログラムの名称［文字列］；−ｄデ
ータベース［文字列］；−ｅ期待値（Ｅ）［実数］；−Ｇギャップ
を空けるためのコスト（ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）［整数］；
−Ｅギャップを拡張するためのコスト（ゼロはデフォルトの行動を呼び起
こす）［整数］；−ｒヌクレオチドの適合の報酬（ｂｌａｓｔｎのみ）
［整数］；−ｖ１行説明（ｏｎｅ−ｌｉｎｅｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ
）の数（Ｖ）［整数］；−ｂ表示するアライメントの数（Ｂ）［整
数］；−ｉクェリーファイル［ＦｉｌｅＩｎ（入力ファイル）］；−ｏ
ＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル［ＦｉｌｅＯｕｔ（出力ファ
イル）］任意。ＢＬＡＳＴＰについては、以下のランニングパラメーターが好
ましい：ｂｌａｓｔａｌｌ −ｐｂｌａｓｔｐ −ｄｓｗｉｓｓｐｒｏｔｄ
ｂ −ｅ１０Ｇ０Ｅ０ −ｖ３０ −ｂ３０ −ｉｑｕｅｒｙｓｅ
ｑ −ｏｒｅｓｕｌｔｓ；−ｐプログラムの名称［文字列］；−ｄ
データベース［文字列］；−ｅ期待値（Ｅ）［実数］；−Ｇギャ
ップを空けるためのコスト（ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）［整数
］；−Ｅギャップを拡張するためのコスト（ゼロはデフォルトの行動を呼
び起こす）［整数］；−ｒヌクレオチドの適合の報酬（ｂｌａｓｔｎの
み）［整数］；−ｖ１行説明の数（Ｖ）［整数］；−ｂ表示する
アライメントの数（Ｂ）［整数］； −ｉクェリーファイル［Ｆｉｌ
ｅＩｎ］；−ｏＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル［Ｆｉｌｅ
Ｏｕｔ］任意。

【００３９】ＦＡＳＴＸを用いるアライメントおよび類似性の決定のためには、ＵＮＩＸ（
登録商標）のコマンド：ｆａｓｔｘ −Ｅ１０ −ｂ３０ −Ｈｑｕｅｒ
ｙｓｅｑ＞ｏｕｔｐｕｔが好ましい一方、ＦＡＳＴＡについては、ＵＮＩＸ
（登録商標）コマンド：ｆａｓｔａ −Ｅ２ −ｂ３０ −Ｈ −ｎｑｕ
ｅｒｙｓｅｑ＞ｏｕｔｐｕｔが好ましい。

【００４０】ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＸまたは同様のアルゴリ
ズムにより作成された、クエリー配列による１以上のデータベース配列への「ヒ
ット」は、配列の類似部分のアライメントをとって同定される。前記のヒットは
、類似性の程度と重複する配列の長さの順に並べられる。データベース配列への
ヒットは、前記クエリー配列の配列長の一部としか重複しないことを意味するの
が一般的である。

【００４１】アルゴリズムＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡは、アライメントの「Ｅ値（期待
値）」をも算出する。Ｅ値は、一定の規模のデータベースを検索したときに偶然
一定数の隣接した配列にわたって発見が「期待」できるヒットの数を示す。Ｅ値
は、好ましいＥＭＢＬデータベースのようなデータベースへのヒットが真の類似
性を表すかどうかを決定するための、有意性の閾値として用いられる。例えば、
あるヒットに付与されたＥ値が０．１であることは、ＥＭＢＬデータベースの規
模のデータベースにおいて、同様のスコアの配列のアライメントをとった部分に
わたって、偶然０．１回適合することが期待できると解釈される。この判定基準
により、前記ポリヌクレオチド配列のアライメントがとれて適合した部分は、９
０％が同一である確率を有することになる。アライメントがとれて適合した部分
にわたって０．０１以下のＥ値を有する配列については、アルゴリズムＢＬＡＳ
ＴＮまたはＦＡＳＴＡを用いてＥＭＢＬデータベースで偶然適合するものを見つ
ける確率は、１％以下である。

【００４２】１の実施態様によると、本発明のポリヌクレオチドのそれぞれに関して、「変
異体（ｖａｒｉａｎｔ）」のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの
それぞれよりも核酸の数が同じか少ない配列で、かつ、本発明のポリヌクレオチ
ドと比べて０．０１未満のＥ値となる配列を含むのが好ましい。すなわち、変異
体ポリヌクレオチドとは、デフォルトのパラメーターでＢＬＡＳＴＮまたはＦＡ
ＳＴＡアルゴリズムを用いてＥ値が０．０１以下と計測され、本発明のポリヌク
レオチドと同一である確率が少なくとも９９％である、いかなる配列をもいう。
好ましい実施態様に従うと、変異体ポリヌクレオチドとは、デフォルトのパラメ
ーターに設定されたＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いてＥ値が
０．０１以下であると評価され、本発明のポリヌクレオチドと同一である確率が
少なくとも９９％である、本発明のポリヌクレオチドのそれぞれよりも核酸の数
が同じか少ない配列をいう。

【００４３】ある種の実施態様では、変異体ポリヌクレオチド配列は、列挙されたポリヌク
レオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをす
る。ここで使用されるところの「ストリンジェントな条件」とは、６ＸＳＳＣ
および０．２％ＳＤＳの溶液で前洗浄し、６５°Ｃ、終夜（ｏｖｅｒｎｉｇｈ
ｔ）、６ＸＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳの溶液中で雑種形成させ、その後６
５°Ｃ、１ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで各３０分ずつ２回洗浄し、６５
°Ｃ、０．２ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで各３０分ずつ２回洗浄するこ
とを指す。他の実施態様では、列挙されたポリヌクレオチドおよび／またはポリ
ペプチドの変異体はマイコバクテリウム属の種の細菌から単離されるものであっ
てもよい。ある種の好ましい実施態様では、列挙されたポリペプチドの変異体は
、例えば、以下に詳細に説明するように測定される、細胞増殖および／またはヒ
トＰＢＭＣにおけるサイトカインまたはインターフェロン−γの産生を刺激する
能力によって決定される前記列挙されたポリペプチドと同様の活性を有する。

【００４４】本発明のポリペプチドは、翻訳されると同時か（ｃｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
ａｌｌｙ）または翻訳された後かにタンパク質の移送を指示するシグナル（また
はリーダー）配列にタンパク質のＮ末端で結合されていてもよい。前記ポリペプ
チドは、（例えばポリ−ヒスチジンのように）前記ポリペプチドの合成、精製ま
たは同定を容易にするために、あるいは固相支持体への前記ポリペプチドの結合
を促進するために、リンカーその他の配列と結合されることもある。例えば、ポ
リペプチドは免疫グロブリンのＦｃ領域と結合されることもある。

【００４５】ここで用いられるところの「ｘ量体」という用語は、「ｘ」の特定の値に関し
て、配列番号５−２１として同定されたポリヌクレオチドの、少なくとも特定さ
れた数（ｘ）の連続した残基を含む配列を指す。好ましい実施態様によると、ｘ
の値は、特定の配列に応じて約２０から約６００までである。

【００４６】本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５−２１として同定されたポリヌクレ
オチド配列とかかる配列の変異体とのうちのいずれかの、少なくとも特定の数の
連続した残基を含むポリヌクレオチド（ｘ量体）を含むポリヌクレオチドを含む
。好ましい実施態様によると、ｘの値は、少なくとも２０が好ましく、少なくと
も４０がより好ましく、少なくとも６０がさらに好ましく、少なくとも８０が最
も好ましい。よって、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５−２１として同
定されたポリヌクレオチドと、配列番号５−２１として同定されたポリヌクレオ
チドの１つの変異体との、２０量体、４０量体、６０量体、８０量体、１００量
体、１２０量体、１５０量体、１８０量体、２２０量体、２５０量体、３００量
体、４００量体、５００量体または６００量体を含むポリヌクレオチドを含む。

【００４７】一般に、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、さまざまな手順の
うちのどれを使って調製してもよい。例えば、ポリペプチドは、該ポリペプチド
をエンコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して、前記ポリペプチ
ドを適当な宿主で発現させることによって、組み換え法により生産してもよい。
本発明の技術分野の通常の技量を有する者に知られたさまざまな発現ベクターの
うちいずれを用いてもかまわない。組み換えポリペプチドをエンコードするＤＮ
Ａ分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされたいかな
る適当な宿主細胞においても発現は達成できる。適当な宿主細胞には、原核生物
、酵母および高等な真核細胞が含まれる。用いられる宿主細胞は、大腸菌か、昆
虫か、酵母か、ＣＯＳあるいはＣＨＯのような哺乳類株細胞かであることが好ま
しい。この方法で発現されたＤＮＡ配列は、天然に存在する抗原、天然に存在す
る抗原の部分またはこれらのその他の変異体をエンコードできる。

【００４８】本発明のポリヌクレオチドは、実施例１に説明するとおり、バッケー菌のゲノ
ムＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより、単離することができる。
代替策としては、バッケー菌のエピトープをエンコードするポリヌクレオチドは
、単離されたエピトープのアミノ酸配列に由来する縮重したオリゴヌクレオチド
に対してハイブリダイゼーションをするＤＮＡ配列について、適当なバッケー菌
のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって得
ることができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎ
ｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室
マニュアル）、ＣＳＨＬＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
、ニューヨーク州、１９８９年に記載されたとおりに、適当な縮重したオリゴヌ
クレオチドを設計し、合成し、そしてスクリーニングを行うことができる。当業
者に周知の技術を用いて、ゲノムＤＮＡか、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのライ
ブラリかから核酸プローブを単離するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
を用いることができる。

【００４９】調製方法の如何によらず、ここで記載するエピトープには、免疫原性反応を誘
発する能力がある。より具体的には、上記のとおり、エピトープには、マイコバ
クテリウム属の細菌に免疫がある個体に由来するＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞また
はマクロファージにおいて、細胞増殖および／またはサイトカインの産生（例え
ば、インターフェロン−γおよび／またはインターロイキン−１２の産生）を誘
導する能力がある。

【００５０】あるエピトープに対する免疫原性反応を評価するのに用いる細胞タイプの選択
は所望の反応に依存する。例えば、インターロイキン−１２の産生は、マイコバ
クテリウム属の細菌に免疫がある個体に由来し、当業者に周知の方法を用いて調
製された、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞および／またはマクロファージを含む調製
物を用いると、最も容易に評価される。例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の
調製物は、それ以上の構成要素の細胞を分離することなく用いることができる。
ＰＢＭＣは、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）（ＷｉｎｔｈｒｏｐＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州）による密度遠心法を用いて、調製すること
ができる。ここで説明されたアッセイ法に用いるＴ細胞は、直接ＰＢＭＣから精
製できる。代替策として、マイコバクテリウム属の細菌のタンパク質に反応する
濃縮されたＴ細胞株か、個々のマイコバクテリウム属の細菌のタンパク質に反応
するＴ細胞クローンかを用いてもよい。かかるＴ細胞クローンは、例えば、マイ
コバクテリウム属の細菌に免疫がある個体由来のＰＢＭＣをマイコバクテリウム
属の細菌のタンパク質と２−４週間培養することによって、作製することができ
る。これにより、マイコバクテリウム属の細菌のタンパク質に特異的なＴ細胞の
みを増殖することが可能となり、かかる細胞のみからなる株細胞ができる。これ
らの細胞は、その後にクローニングして、当業者に周知の方法を用いて、個々の
Ｔ細胞の特異性をより正確に定義するために、個々のタンパク質について試験す
ることもある。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージにおける細胞増
殖またはサイトカイン産生についてのアッセイ法は、例えば、以下に説明する手
順を用いて実行してもよい。

【００５１】本発明の免疫原性エピトープ、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド
のうち治療特性が優れたものは、上記のアッセイ法における反応の程度および反
応が見られた個体の百分率に基づいて、区別することができる。さらに、優れた
治療特性を有するエピトープは、マイコバクテリウム属の細菌に免疫がない個体
の約２５％以上に由来する細胞における試験管内での細胞増殖またはサイトカイ
ン産生を刺激することはないため、マイコバクテリウム属の細菌に反応する細胞
に特異的ではない反応を除くことができる。したがって、マイコバクテリウム属
の細菌に免疫がある個体由来のＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージ
の調製物において高い割合で反応を誘発する（他の個体由来の細胞調製物におい
て反応の発生率が低い）抗原は、とりわけ優れた治療特性がある。

【００５２】優れた治療特性があるエピトープは、ワクチンとして投与されたときに、実験
動物における結核菌その他のマイコバクテリウム属の細菌感染の程度を軽減する
能力に基づいて同定してもよい。実験動物において使用するための適当なワクチ
ン調製物は以下に詳細に説明する。

【００５３】本発明のポリペプチドの部分その他の変異体は、人工合成法または組み換え法
により作成してもよい。約１００個未満のアミノ酸であって、一般には約５０個
未満のアミノ酸を有する合成ポリペプチドは、本発明の技術分野の通常の技量を
有する者に周知の技術を用いて作成できる。例えば、かかるポリペプチドは、ア
ミノ酸が次々に伸長中のアミノ酸鎖に付加されていくＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相
合成法のような、商業的に利用可能ないずれかの固相技術を用いて合成すること
が可能である。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５巻
、２１４９−２１４６頁、１９６３年を参照せよ。ポリペプチド自動合成装置は
、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ
．（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、カリフォルニア州）のような供給者から商業的に
入手可能であり、製造者の指示書に従って操作することができる。天然のエピト
ープの変異体は、オリゴヌクレオチド指令型（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）部位特異的突然変異生成のような標準的な突然変異生成技
術を用いて調製される。ＤＮＡ配列のセクションは、トランケートされた（ｔｒ
ｕｎｃａｔｅｄ）ポリペプチドの調製を可能にするために、標準的な技術を用い
て切除される。

【００５４】本発明は、第１および第２の本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質か、
あるいは代替策として、本発明のポリペプチドとＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＨａｎ
ｓｅｎ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５７巻、２４８１−２４８８頁、１９８
９年に記載された３８ｋＤａ抗原のような既知の結核菌の抗原とを含む融合タン
パク質かを、かかる融合タンパク質の変異体とともに提供する。関連する局面で
は、第１および第２の本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトも
提供される。本発明の複数のエピトープを含むコンストラクトの調製と、対応す
る組み換え蛋白質の発現とは、以下の実施例４に詳細に示されている。一般に、
本発明の融合タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドは、第１および第２
のポリペプチドをエンコードする別々のＤＮＡ配列を適当な発現ベクターに組み
込むために、既知の組み換えＤＮＡ技術を用いて構築される。第１のポリペプチ
ドをエンコードするＤＮＡ配列の３’末端を、ペプチドリンカーを用いて、ある
いは用いずに、第２のポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列の５’末端に連
結して、これら２つのＤＮＡ配列のｍＲＮＡの翻訳物が前記第１および第２のポ
リペプチドの両方の生物活性を保持する単一の融合タンパク質になるように、読
み枠をそろえる。

【００５５】第１および第２のポリペプチドを分離して、それぞれのポリペプチドが固有の
二次構造および三次構造をとってフォールディングすることを確保するのに十分
な間隔を空けるために、ペプチドリンカー配列を用いてもよい。かかるペプチド
リンカー配列は、当業者に周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質に取り込
まれる。適当なペプチドリンカー配列は、（１）屈曲可能な細長いコンフォメー
ションをとることができること、（２）第１および第２のポリペプチド上の機能
的なエピトープと相互作用しうる二次構造をとることができないこと、（３）こ
れらのポリペプチドの機能的なエピトープと反応しうる疎水性または荷電した残
基がないことという要因に基づいて選ぶことができる。好ましいペプチドリンカ
ー配列には、グリシン、アスパラギンおよびセリン残基が含まれる。スレオニン
およびアラニンのような他の中性に近いアミノ酸も、リンカー配列に用いること
ができる。リンカーとして有効に用いることができるアミノ酸配列には、Ｍａｒ
ａｔｅａら、Ｇｅｎｅ、４０巻、３９−４６頁、１９８５年と、Ｍｕｒｐｈｙら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３巻、８２５８−８２６
２、１９８６と、米国特許第４，９３５，２３３号明細書と、米国特許第４，７
５１，１８０号明細書とに開示されたものが含まれる。リンカー配列は、１から
約５０個までの長さのアミノ酸であってもよい。第１および第２のポリペプチド
が、機能的なドメインを隔てて立体障害を防ぐのに用いることのできる非本質的
なＮ末端アミノ酸領域を有するときには、ペプチドリンカー配列は必要でない。
融合されたタンパク質をエンコードする連結されたＤＮＡ配列は、本発明の技術
分野の通常の技量を有する者に知られた技術を用いて適当な発現システムにクロ
ーニングされる。

【００５６】別の局面では、本発明は、１以上の本発明のポリペプチドまたは融合タンパク
質（あるいはかかるポリペプチドまたは融合タンパク質をエンコードするポリヌ
クレオチド）を用いて、結核のような疾患に対する保護免疫を患者に誘導するた
めの方法を提供する。ここで用いられる「患者」とは、いかなる温血動物をも指
し、好ましくはヒトを指す。患者は、疾病に苦しんでいても、あるいは検出可能
な疾病または感染がなくてもよい。換言すると、保護免疫は疾患を予防または治
療するために誘導されるものであってもよい。

【００５７】関連する局面では、本発明のバッケー菌のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化するため、ヒトＰＢＭＣにおけるサイトカ
イン（特にＴｈ１クラスのサイトカイン）の産生を刺激するため、抗エピトープ
抗体を産生するためおよび／または長期記憶細胞を誘導するために用いられる。

【００５８】かかる方法に用いるためには、ポリペプチド、融合タンパク質またはポリヌク
レオチドは、医薬品組成物またはワクチンの中に存在しているのが一般的である
。医薬品組成物には、１以上のポリペプチドが含まれ、そのそれぞれには１以上
の上記の配列（あるいはその変異体）と、生理的に受け入れられる担体とが含ま
れる。ワクチンは、１以上の上記のポリペプチドと、その中に前記ポリペプチド
が取り込まれるアジュバントまたはリポソームのような免疫賦活剤とを含む。か
かる医薬品組成物およびワクチンは、融合タンパク質に取り込まれるか、あるい
は別個のポリペプチドの中に存在するかしている、他のマイコバクテリウム属の
細菌の抗原を含むものであってもよい。

【００５９】代替策としては、本発明のワクチンは、ポリペプチドが局部で（ｉｎｓｉｔ
ｕ）生成するように、上記の１以上のポリペプチドをエンコードするポリヌクレ
オチドを含むものであってもよい。かかるワクチンにおいては、ポリヌクレオチ
ドは、核酸発現システム、細菌およびウイルスの発現システムを含む本発明の技
術分野の通常の技量を有する者に知られたさまざまな送達システムのいずれかに
存在していてもよい。適当な核酸発現システムには、（適当なプロモーターおよ
びターミネーターのシグナルのような）患者において発現させるために必要なＤ
ＮＡ／ＲＮＡ配列が含まれる。細菌による送達システムには、その細胞表面上に
ポリペプチドの免疫原性のあるエピトープを発現する（カルメット−ゲラン菌の
ような）細菌を投与することを伴う。好ましい実施態様では、このＤＮＡおよび
／またはＲＮＡは、ウイルスの発現システム（例えば、ワクシニアその他のポッ
クスウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルス）を用いて導入してもよい
が、このウイルスによる送達システムは、非病原性または欠損のある、複製可能
なウイルスを用いることを伴うこともある。かかる発現システムにＤＮＡおよび
／またはＲＮＡを取り込むための技術は当業者に周知である。ＤＮＡは、例えば
Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９巻、１７４５−１７４９、１９９３年に
記載され、Ｃｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９巻、１６９１−１６９２頁、１
９９３年によって総説されるとおり、「裸」であってもよい。裸のＤＮＡの取り
込みは、該ＤＮＡを生分解性ビーズ上にコーティングすることにより増大するこ
ともあるが、前記生分解性ビーズは細胞内に効率的に輸送される。ＤＮＡおよび
／またはＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列の投与方法には、米国特許第５，５
８０，８５９号明細書および米国特許第５，５８９，４６６号明細書に開示され
たものが含まれる。

【００６０】上記のポリヌクレオチドワクチンは、本発明のポリペプチドか、上記の３８ｋ
Ｄａ抗原のような既知のマイコバクテリウム属の細菌の抗原かのいずれかと同時
に、あるいは連続的に（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ）、投与してもよい。例えば
、ワクチンの保護免疫効果を増強するために、本発明のポリペプチドをエンコー
ドするＤＮＡの投与の後に、抗原を投与してもよい。

【００６１】投薬の経路および頻度は、投与量と同様に、個体ごとに異なり、現行のウシ型結
核菌ＢＣＧを用いる免疫に使用されるものと平行することもある。一般に、医薬
品組成物およびワクチンは、注射により（例えば、皮内、筋注、静注または皮下
）、経鼻的に（例えば、吸入）、皮上的に（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ、皮
膚の上に局部的に適用する）または経口的に投与してもよい。１回から３回まで
の間の投与回数を１ないし３６週間の期間内に投与してもよい。３ないし４箇月
の間隔で３回投与して、その後定期的にブースターの接種を行うのが好ましい。
代替となるプロトコールが個々の患者については適切なこともある。適当な投与
量は、上記のとおり投与したときに少なくとも１ないし２年間マイコバクテリウ
ム属の細菌感染から患者を保護するのに十分な免疫反応を患者に起こしうるポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチドの量である。一回の投与に含まれる（あるいは
一回の投与のポリヌクレオチドによって局部で産生される）ポリペプチドの量は
、宿主の体重１ｋｇあたり約１ｐｇから約１００ｍｇの範囲が一般的であり、約
１０ｐｇから約１ｍｇの範囲が典型的であり、約１００ｐｇから約１μｇの範囲
が好ましい。適当な投与サイズは患者のサイズによって異なるが、約０．１ｍｌ
から約５ｍｌまでの範囲が典型的である。

【００６２】本発明の技術分野の通常の技量を有する者に知られたいかなる適当な担体でも
本発明の医薬品組成物に用いることができるが、担体のタイプは投与方法に応じ
て異なる。皮下注射のような非経口的投与には、担体は、水、生理食塩水、アル
コール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含むのが好ましい。経口投与には、上記
のいずれかの担体か、マニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネ
シウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース
および炭酸マグネシウムのような固形担体かを用いてもよい。（例えばポリ酪酸
ガラクチドのような）生分解性ミクロスフェアを本発明の医薬品組成物に用いて
もよい。適当な生分解性ミクロスフェアは、例えば米国特許第４，８９７，２６
８号明細書および米国特許第５，０７５，１０９号明細書に開示されている。

【００６３】さまざまなアジュバントのいずれかを本発明の組成物に用いて、免疫反応を増
強することができる。大抵のアジュバントには、水酸化アルミニウムか鉱物油か
のような、迅速な異化作用から抗原を保護するために設計された物質と、リピド
Ａか百日咳菌か結核菌か以下に説明するバッケー菌かのような、免疫反応の非特
異的賦活剤とが含まれる。適当なアジュバントは、例えばフロイント不完全アジ
ュバントおよびフロイント完全アジュバント（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ミシガン州）と、メルクアジュバント６５（Ｍｅｒｃ
ｋａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、ニュージャージー州）
とのように、商業的に入手可能である。他の適当なアジュバントには、ミョウバ
ン、生分解性ミクロスフェア、リピドＡモノリン酸およびＱｕｉｌＡが含まれ
る。

【００６４】以下の実施例は例示の目的で提供されるのであって、限定が目的ではない。

【００６５】

【実施例】

実施例１免疫原性のあるバッケー菌のエピトープのクローニングおよび選択バッケー菌（ＡＴＣＣ番号第１５４８３号）はメディウム９０（２．５ｇ／ｌ
酵母エキス、５ｇ／ｌトリプトン、１ｇ／ｌグルコース）培地中３７°Ｃ
で培養された。ゲノムＤＮＡはこれらの細胞から標準的なプロトコールに従って
単離し、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａで、約０．２５ｋｂのＤＮＡ断片が
生成される条件下で消化した。断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲクリーン・
アップ・システム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）を用いて精製した。

【００６６】これらのクローニングされたバッケー菌ＤＮＡを３つの異なる読み枠で発現さ
せるために、ｐｃＤＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂ
ａｄ、カリフォルニア州）を、３つの異なる３’プライマーで増幅した（組み換
えタンパク質の分泌を容易にするための）ヒト成長ホルモンのシグナルペプチド
を挿入することにより改変した。これらのプライマーにより、発現されたポリペ
プチドの読み枠をずらすために、１個または２個の余分な塩基対をＰＣＲ産物に
挿入することが可能になった。前記プライマーは、ＡＤ１０５（ヒト成長ホルモ
ン５’プライマー、配列番号１）と、３つのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）３’プ
ライマーであるＡＤ１０６、ＡＤ１０７およびＡＤ１０８（それぞれ配列番号２
−４）とであった。これらのＰＣＲ断片から、リーダー配列の切断部位の下流の
ｈＧＨ配列の大半が、制限エンドヌクレアーゼＢｓｇＩＩでの消化により除去さ
れた。このｈＧＨのＰＣＲ断片は、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＢａｍＨＩで消化した後、ｐｃＤＮＡ３発現ベクターにクローニングされた。
挿入された断片のヌクレオチド配列は配列番号５−７に与えられ、対応するアミ
ノ酸配列は配列番号６１−６３にそれぞれ提供される。３つの発現ライブラリ（
前記３つの読み枠のそれぞれについて１つずつ）は、上記のとおり調製した０．
２５ｋｂのバッケー菌のＰＣＲ断片を、ｐｃＤＮＡ３／ヒト成長ホルモンキメラ
ベクター（ｐｃＤＮＡ３−１’、ｐｃＤＮＡ３−２’およびｐｃＤＮＡ３−３’
）のＢａｍＨＩクローン化部位にクローニングすることにより構築した。レプリ
カをリフトするためのマスター・プレートは、前記ライブラリのコンストラクト
で形質転換された細菌のコロニーからなり、保存された。これらのコロニーから
調製されたプラスミドＤＮＡは、４０個ないし５０個のプラスミドからのＤＮＡ
をそれぞれ含む５００個のプールに分割された。このＤＮＡはリポフェクタミン
（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）を用いてＣＯＳ７細胞にトラン
スフェクションされ、それぞれのグループの産物の免疫原性は、熱殺菌されたバ
ッケー菌で初回抗原刺激を受けたマウスから得られた脾臓細胞の培養下でのＩＦ
Ｎ−γ産生が以下に説明するＥＬＩＳＡ法によって測定される脾臓細胞アッセイ
法によって決定された。

【００６７】（前記脾臓細胞アッセイ法においてＩＦＮ−γ産生を増加させる能力により決
定された）免疫反応を誘発する組み換えポリペプチドをエンコードするプラスミ
ドのプールは、それぞれ１０個のプラスミドを含む、より小さなプールに細分さ
れ、これらのプールを再度ＣＯＳ７細胞にトランスフェクションした。これらの
細胞の培養上清は上記の脾臓細胞アッセイ法に供された。

【００６８】３回のスクリーニングの後、熱殺菌されたバッケー菌で免疫したマウスを刺激
してＩＦＮ−γを産生させる組み換えポリペプチドをエンコードするプラスミド
は１２０個同定された。これらのプラスミドでトランスフェクションされたＣＯ
Ｓ７細胞の１２０種の上清は、２つの追加のアッセイ、すなわち、マウスの記憶
アッセイ法およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）アッセイ法によりスクリーニ
ングされた。マウスの長期記憶アッセイ法では、マウスに結核菌を半致死量の１
０^４コロニー形成単位（ＣＦＵ）注射した。４週間後から、前記マウスを結核菌
感染の治療のために４週間抗生物質で処理し、さらに４週間休ませた。２度目の
結核菌生菌注射の４日後、前記プラスミド産物の免疫原性を上記の脾臓細胞アッ
セイ法を用いて測定した。

【００６９】ＰＢＭＣアッセイ法では、プラスミドでトランスフェクションされたＣＯＳ７
細胞の１２０種の上清は、マイコバクテリウム属の細菌に免疫があるヒトの供血
者由来の末梢血細胞においてＴ細胞増殖およびＩＦＮ−γ産生を誘導する能力に
ついてスクリーニングされた。これらの供血者はＰＰＤ（結核菌由来精製タンパ
ク）陽性であることが知られており、彼らのＴ細胞はＰＰＤに反応して増殖しＩ
ＦＮ−γを産生することが示された。供血者のＰＢＭＣおよびＣＯＳ７の上清は
、１０％（ｖ／ｖ）の同種血清と、ペニシリン（６０μｇ／ｍｌ）と、ストレプ
トマイシン（１００μｇ／ｍｌ）と、グルタミン（２ｍＭ）とを添加したＲＰＭ
Ｉ１６４０を含む培地中で培養された。３日後、培養液５０μｌをそれぞれのウ
ェルから上記のとおりＩＦＮ−γレベルを決定するために採取した。プレートは
さらに４日間培養し、その後ウェルあたりトリチウムチミジン１μＣｉで１８時
間パルスし、細胞を回収して、シンチレーションカウンターを用いてトリチウム
の取り込みを測定した。２つのレプリカにおいて、培地のみで培養された細胞で
見られた増殖よりも２倍以上のレベルで増殖を刺激した上清が陽性とされた。

【００７０】ＩＦＮ−γは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて以下の通り
測定された。ＥＬＩＳＡ法のプレートは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の
１μｇ／ｍｌの抗体で４時間４°Ｃでウェルをインキュベーションすることによ
り、ヒトＩＦＮ−γに対するマウスモノクローナル抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｗｏ
ｂｕｒａｌ、マサチューセッツ州）でコーティングした。ウェルは０．２％のＴ
ｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１時間室温でブロックした。プレートはＰＢＳ／０
．２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄して、このＥＬＩＳＡプレート中に培養液で
１：２に希釈されたサンプルを室温で終夜インキュベーションした。このプレー
トはさらに洗浄して、ＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌに希釈されたビオチン化されたポ
リクローナルウサギ抗ヒトＩＦＮ−γ血清（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を各ウェルに添加
した。このプレートを室温で１時間インキュベーションし、洗浄して、西洋ワサ
ビペロキシダーゼ結合アビジンＡ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、カリフォルニア州）をＰＢＳ中に１：４，０００倍に希
釈して添加した。さらに室温で１時間インキュベーションした後、プレートを洗
浄して、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質を添加した。反応は１０分後
に１０％（ｖ／ｖ）の塩酸で停止させた。吸光度（ＯＤ）は４９０ｎｍで測定し
た。２つのレプリケートの両方において、培養液のみで培養された細胞からのＯ
Ｄの平均値よりも２倍以上のＯＤを示す上清が、陽性とされた。

【００７１】これら２つのアッセイの結果から、免疫原性がある決定基またはエピトープを
含む組み換えポリペプチドをエンコードするプラスミドが５９個同定された。こ
れらのエピトープは、マウスおよびヒトで免疫反応を誘発することがわかり、長
期反応を誘導する結核菌の免疫原性のある決定基と交差反応性がある。これらの
プラスミドは、マウスの結核モデルにおいて保護免疫を誘導する能力について、
以下のとおりテストされた。それぞれのプラスミド（ＤＮＡ１００μｇ）を麻酔
マウスの前脛骨筋に３週間ごとに３回筋注した。９週間後、マウスを結核菌（５
ｘ１０^５ＣＦＵ）で攻撃した。肺および脾臓からの器官のホモジェネートを第１
２週に調製して、オレイン酸−アルブミン−デキストロース−カタラーゼ（ＯＡ
ＤＣ）を添加した７Ｈ９培地に播いて、それぞれのホモジェネートに存在するＣ
ＦＵの数を決定した。結果は２週間のインキュベーション期間の後に記録した。

【００７２】上記のプロトコールを用いて、免疫原性のあるエピトープを含むプラスミド８
つが選ばれた。これらのコンストラクトの推定オープン・リーディング・フレー
ム（ＯＲＦ）を同定した後、ＯＲＦ部分のみを含むバッケー菌の断片が前記ｐｃ
ＤＮＡ−ｈＧＨ’にサブクローニングされた。これらのプラスミドは、ＤＮＡ５
、ＤＮＡ９、ＤＮＡ２６、ＤＮＡ２７、ＤＮＡ２９、ＤＮＡ３７、ＤＮＡ４４お
よびＤＮＡ４５と呼ばれた。ＤＮＡ９には、Ａ、ＢおよびＣと呼ぶ３つのＯＲＦ
が同定された。オープン・リーディング・フレームＢおよびＣは逆方向に向いて
いたので放棄した。ＯＲＦＡは別個にクローニングされ、得られたプラスミド
をＤＮＡ９Ａと名付けた。配列が決定されたＤＮＡ５、ＤＮＡ９Ａ、ＤＮＡ２６
、ＤＮＡ２７、ＤＮＡ２９、ＤＮＡ３７、ＤＮＡ４４およびＤＮＡ４５のインサ
ートのゲノムＤＮＡは、配列番号１３−２１にそれぞれ示され、対応するＯＲＦ
の予測アミノ酸配列は配列番号６９−７７にそれぞれ提供されている。ＤＮＡ５
およびＤＮＡ２７のプラスミドのインサートには２以上のエピトープが同定され
た。これらのエピトープはクローニングによって分離されないで、全てのアッセ
イにおいて複数のエピトープとしてテストされた。ＤＮＡ５のエピトープ１、エ
ピトープ２およびエピトープ３とＤＮＡ２７のエピトープ１およびエピトープ２
との決定されたゲノムＤＮＡ配列は配列番号８−１２にそれぞれ示され、対応す
る予測アミノ酸配列は配列番号６４−６８にそれぞれ提供されている。これらの
決定されたエピトープのＤＮＡ配列を、ＥＭＢＬＤＮＡデータベース中の配列に
対してコンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＡを用いて比較した。対応する予測
タンパク質配列（６つの読み枠のそれぞれでタンパク質に翻訳されたＤＮＡ）を
、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中の配列に対してコンピューターアルゴリズ
ムＦＡＳＴＸを用いて比較した。配列番号８−２１に提供されたＤＮＡ配列のＥ
ＭＢＬＤＮＡデータベース中の配列に対する（ＦＡＳＴＡを用いる）比較と、配
列番号６４−７７に提供されたアミノ酸配列のＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース
中の配列に対する（ＦＡＳＴＸを用いる）比較とは、１９９９年３月２１日に行
われた。

【００７３】（配列番号６５、６７、７０、７３、７４、７６および７７にそれぞれ提供さ
れる）ＤＮＡ５のエピトープ２、ＤＮＡ２７のエピトープ１、ＤＮＡ９Ａ、ＤＮ
Ａ２６、ＤＮＡ２７、ＤＮＡ２９、ＤＮＡ３７、ＤＮＡ４４およびＤＮＡ４５の
予測アミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中の配列に対してＦＡＳ
ＴＸを用いて上記のとおり決定された同一性が５０％未満であった。（配列番号
６４および６６にそれぞれ提供される）ＤＮＡ５のエピトープ１およびエピトー
プ３の予測アミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中の配列に対して
ＦＡＳＴＸを用いて上記のとおり決定された同一性が７５％未満であった。（配
列番号６８および７１にそれぞれ提供される）ＤＮＡ２７のエピトープ２および
ＤＮＡ２６の予測アミノ酸配列には適合するものがなかった。以下の表１に、本
発明のアミノ酸配列とＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中の配列との上記のとお
りＦＡＳＴＸを用いた比較の結果を示すが、ここで、「同一残基数」とは、アラ
イメントがとれた部分の中の同一の残基の数を表す。

【００７４】

【表１】

【００７５】実施例２原核および真核細胞における組み換えエピトープの発現エピトープＤＮＡは細菌および真核生物の細胞でポリペプチドを発現させるた
めのベクターにサブクローニングされた。細菌での発現ベクターは改造したｐＥ
Ｔ１６ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）であっ
た。ＤＮＡ９を除く全てのプラスミドからのインサートはプライマーＡＤ１３６
およびＡＤ１３３（それぞれ配列番号２２および２３）を用いて増幅し、ブラン
トエンド・ライゲーションにより、ＥｃｏＲＩで消化してＤＮＡポリメラーゼＰ
ｆｕＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、カリフォルニア州）でエン
ドフィルしたｐＥＴ１６ベクターにクローニングされた。ＤＮＡ９Ａのインサー
トはＡＤ２５０およびＡＤ２５１（それぞれ配列番号２４および２５）で増幅さ
れ、上記のとおりｐＥＴ１６ベクターにクローニングされた。

【００７６】真核細胞においてポリペプチドを発現するためには、前記ｐｃＤＮＡ３ベクタ
ー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をクローン化部位の３’末端にヒスチジンタグを含
むように改造した。これは、２本鎖のオリゴヌクレオチドのＡＤ１８０／ＡＤ１
８１をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐｃＤＮＡ３にクローニングする
ことによりなされた。オリゴヌクレオチドＡＤ１８０およびＡＤ１８１の配列は
配列番号２６および２７にそれぞれ示されている。プラスミドのインサートは、
ｐｃＤＮＡ３−ｈＧＨ’コンストラクトをＤＮＡの鋳型として、ｈＧＨ特異的な
Ｎ末端５’プライマーのＡＤ１３４（配列番号２８）とエピトープ特異的な３’
末端プライマーとにより増幅された。エピトープ特異的な３’プライマーのＡＤ
１５１（ＤＮＡ５）、ＡＤ１５３（ＤＮＡ２６）、ＡＤ１５４（ＤＮＡ２７）、
ＡＤ１５５（ＤＮＡ２９）、ＡＤ１５８（ＤＮＡ４２）、ＡＤ１５９（ＤＮＡ４
４）、ＡＤ１６０（ＤＮＡ４５）、ＡＤ１６７（ＤＮＡ３７）およびＡＤ１８２
（ＤＮＡ９）の配列は、配列番号２９−３７にそれぞれ掲げられている。

【００７７】このベクターは、前記ｈＧＨリーダー配列と発現された配列との間の余分な配
列（４２ヌクレオチド）を除去するために更に改造され、このコンストラクトの
前記ｈＧＨ’配列がリーダー配列とｈＧＨ配列の最初の５個のＮ末端のアミノ酸
だけに削減された。このｐｃＤＮＡ３−ｈＧＨ３’コンストラクトをＤＮＡの鋳
型として用いて、短縮された融合のパートナーがＡＤ１０５（配列番号１）およ
びＡＤ２２２（配列番号３８）のプライマーを用いたＰＣＲで増幅された。ｐｃ
ＤＮＡ−ＨｉｓへのクローニングはＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位で行い
、得られたコンストラクトをｐｃＤＮＡ３−ｈＧＨｌｓ／Ｈｉｓと名付けた。ｐ
ｃＤＮＡ３−ｈＧＨｌｓ／ＨｉｓにクローニングされたｈＧＨ融合のパートナー
の決定されたＤＮＡ配列は配列番号３９に示され、対応するアミノ酸配列は配列
番号７８に示されている。ＤＮＡ９Ａ由来のインサートからなるコンストラクト
は、ＡＤ２２３およびＡＤ２２６（それぞれ配列番号４０および４１）のプライ
マーを用いてＰＣＲ増幅により調製された。

【００７８】実施例３組み換えエピトープコンストラクトの免疫原性この実施例は、８つの選択された組み換えエピトープについて、ＤＮＡか組み
換えポリペプチドかのいずれかの形状で行われた免疫原性の研究の結果を記載す
る。

【００７９】Ａ増殖およびインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の試験管内での分泌
のためのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激ｐＥＴ１６細菌発現システムにより発現された組み換えエピトープ（１および
１０μｇ）は、ヒトＰＢＭＣと３７°Ｃで培養された。４８時間後、ＩＦＮ−γ
分泌は、標準的な手順に従って、酵素結合免疫アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）法によ
り測定された。並行する培養をトリチウムチミジンでパルス標識して、ＤＮＡ合
成がＰＢＭＣ増殖を評価するために用いられた。比較のために、細胞は、結核菌
由来精製ツベルクリンタンパク（ＰＰＤ）と、陰性のコントロールとしてのＰＢ
Ｓとともに培養された。

【００８０】表２に示すとおり、全ての組み換えエピトープには、少なくとも一部のＰＢＭ
ＣのサンプルにおいてＩＦＮ−γ産生を刺激する能力がある。テストした１２人
分のＰＢＭＣのサンプルのうち、１０人分は精製ツベルクリンタンパク陽性、す
なわちこれらのサンプルからのＰＢＭＣは精製ツベルクリンタンパクとともに培
養するとＩＦＮ−γを産生したが、２人分は精製ツベルクリンタンパク陰性であ
った。ＰＢＭＣ反応は、産生されたＩＦＮ−γの量がＰＢＳのコントロールのサ
ンプルで産生されたＩＦＮ−γより少なくとも３倍多いとき陽性とされた。（Ｄ
ＮＡ５に対応する）組み換えエピトープ５と（ＤＮＡ４４に対応する）組み換え
エピトープ４４とは、前記ＰＰＤ^＋サンプルの１００％でＩＦＮ−γ産生を刺激
した。（ＤＮＡ２７に対応する）組み換えエピトープ２７は、ＰＰＤ^＋サンプル
の８０％でＩＦＮ−γ産生を刺激した。（ＤＮＡ２６およびＤＮＡ３７にそれぞ
れ対応する）組み換えエピトープ２６および３７はＰＰＤ^＋サンプルの７０％に
おいてＩＦＮ−γ産生を刺激したが、（ＤＮＡ４５に対応する）エピトープ４５
はＰＢＭＣサンプルのＰＰＤ^＋の２０％を刺激した。ＰＰＤ⁻サンプル由来のＰ
ＢＭＣは前記組み換えエピトープのいずれにも有意に反応しなかった。このこと
は、これらのエピトープがヒトにおいて免疫原性があり、マイコバクテリウム属
の細菌に以前に曝露された供血者由来のサンプルに免疫学的な記憶を想起させる
反応の引き金を引くことを証明している。

【００８１】組み換えエピトープによるヒトＰＢＭＣでのＩＦＮ−γ産生の刺激

【表２】 ^＊結果はＩＦＮ−γの量をｎｇ／ｍｌの単位で表した。

【００８２】ヒトにおけるエピトープの免疫原性は、さらにＰＰＤおよび組み換えエピトー
プに対するヒトＰＢＭＣサンプルの増殖反応によって証明された。組み換えエピ
トープがＰＢＭＣの増殖を刺激する能力は刺激指数として表された。培養液のみ
のコントロールで産生されるバックグランドの増殖の平均値より５倍以上高いと
きに、増殖刺激は陽性とされる。表３に示すとおり、全ての組み換えエピトープ
はヒトＰＢＭＣサンプルのうち少なくとも一部でＰＢＭＣの増殖を刺激する能力
があることがわかった。組み換えエピトープ２６および２７はサンプルの９２％
でＰＢＭＣの増殖を刺激したが、組み換えエピトープ５、３７および４４はサン
プルの８３％で増殖を刺激した。エピトープ４５はサンプルの１７％でＰＢＭＣ
の増殖を刺激した。ＰＰＤによるＰＢＭＣの刺激は８３％であった。

【００８３】ＰＢＭＣ増殖の刺激

【表３】 ^＊ヒトＰＢＭＣ増殖の結果は増殖指数で表される。

【００８４】ＢＤＮＡエピトープでのマウスの免疫ｐｃＤＮＡ−ｈＧＨ’／ＨｉｓまたはｐｃＤＮＡ３−ｈＧＨｌｓ／Ｈｉｓのコ
ンストラクト中の組み換えエピトープの８つをエンコードするＤＮＡの注射後に
、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスにその後の結核菌感染に対する保護免疫が誘導され
た。

【００８５】保護免疫の誘導は、免疫されないコントロールのマウスからのＣＦＵの平均値
と比較した肺ホモジェネート中のＣＦＵの平均して０．５ｌｏｇの減少がその後
の結核菌感染後に観察されたとき、陽性とされた。インサートなしのプラスミド
がコントロールとして用いられた。エピトープのＤＮＡ免疫後のＣＦＵの減少は
、ウシ型結核菌のＢＣＧの既知の免疫原性とも比較された。結果は、テストした
全てのマウスにおいてＣＦＵの減少を示し、組み換えエピトープＤＮＡにより保
護免疫が誘導されたことを示唆した。グループのうち６つでは、ＣＦＵの減少は
５０％以上であり、グループのうち３つでは、減少はウシ型結核菌ＢＣＧの注射
により誘導される減少と比肩できるものであった。

【００８６】ｐｃＤＮＡ−ｈＧＨ’／ＨｉｓおよびｐｃＤＮＡ３−ｈＧＨｌｓ／Ｈｉｓのコ
ンストラクト８つを用いた遺伝子免疫により誘導されたマウスにおける保護免疫

【表４】

【００８７】ｐｃＤＮＡ−ｈＧＨ’／ＨｉｓおよびｐｃＤＮＡ３−ｈＧＨｌｓ／Ｈｉｓのコ
ンストラクト８つを用いた遺伝子免疫による、細胞障害Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と
、サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）と、増殖
および抗体反応との誘導は、以下のとおり評価した。

【００８８】ＣＴＬアッセイ：ＤＮＡ免疫されたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスの脾臓細胞における細胞溶解（Ｃ
ＴＬ）活性は、ＭＨＣハプロタイプが適合する標的細胞であるＢＡＬＢ−３Ｔ３
（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６３、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）を用いた標準的な
２段階の手順に従って測定された。標的細胞は、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞に８つの
ｐｃＤＮＡ−ｈＧＨ’／ＨｉｓまたはｐｃＤＮＡ３−ｈＧＨｌｓ／Ｈｉｓのエピ
トープＤＮＡコンストラクトをトランスフェクションすることにより調製された
。安定にトランスフェクションされた細胞株はジェネティシン選択（Ｇ４１８、
ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により作製され、単一細胞は限
界希釈法により単離された。エピトープを発現するクローンはプライマーＡＤ１
０５およびＡＤ１８１（それぞれ配列番号１および２７）を用いるＲＴ−ＰＣＲ
により選択された。ＤＮＡ免疫されたマウスの脾臓細胞は、適合するエピトープ
のＤＮＡをトランスフェクションし、マイトマイシン処理したＢＡＬＢ／３Ｔ３
細胞の存在下で、１０％ＦＣＳを添加したｃＤＭＥＭ中で培養して、試験管内で
細胞障害Ｔ細胞を再刺激した。培養は１０％ＣＯ_２の下、３７°Ｃで６日間イン
キュベーションした。細胞溶解活性は、それぞれの刺激された細胞培養の一部を
、ＤＮＡが適合する^５１Ｃｒでパルス標識した標的細胞と共存培養して、細胞培
養上清中への^５１Ｃｒの放出を測定することにより監視した。表５に示すとおり
、特異的なＣＴＬ活性は、テストしたＤＮＡコンストラクトのうち４つで免疫さ
れたマウスの脾臓において検出された。

【００８９】サイトカインおよび増殖反応：ＤＮＡ免疫されたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス由来の脾臓細胞のサイトカイン産
生および増殖反応は、組み換えエピトープで試験管内で再刺激した後評価した。
サイトカインおよび増殖反応は、それぞれ上記のＥＬＩＳＡ法およびトリチウム
（^３Ｈ）チミジンパルス標識法により測定された。表５に示すとおり、テストし
た６つのグループ由来の脾臓細胞はＴｈ１サイトカインのＩＦＮ−γを産生した
。Ｔｈ２サイトカイン（例えばＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は刺激さ
れた細胞の上清には検出されなかった。増殖反応は弱く、免疫したグループのう
ち２つに由来した脾臓細胞にだけ検出された。

【００９０】抗体反応３匹のＤＮＡ免疫されたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス由来の血液サンプルを最後
のＤＮＡ注射の２週間後に採取し、標準的な手順に従って血清を調製した。抗エ
ピトープ抗体の存在はＥＬＩＳＡ法によって決定した。マイクロタイタープレー
トのウェルを組み換えエピトープ５００ｎｇでコーティングした。抗体力価は前
記ウェルに血清の系列希釈を添加することによって測定した。結合した抗体は上
記のＥＬＩＳＡ法の手順に従って検出した。表５に示すとおり、抗エピトープ抗
体は、テストした血液サンプルの２つで検出された。ＥＬＩＳＡ法のアッセイは
、標準的なプロトコールを用いて、前記抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａのどち
らのサブクラスに属するかを決定するためにも行った。その結果、前記抗体はＩ
ｇＧ２ａサブクラスに属することが明らかとなったが、このサブクラスはＴｈ１
抗体反応に特徴的なものである。

【００９１】表５に要約されたデータは、エピトープＤＮＡでの免疫がマウスに免疫反応を
誘導することを示す。さらに、前記ＤＮＡ免疫されたマウスで検出された細胞性
および液性の反応から、Ｔｈ１反応が起こったことが証明された。

【００９２】８つのｐｃＤＮＡ−ｈＧＨ’／ＨｉｓまたはｐｃＤＮＡ３−ｈＧＨｌｓ／Ｈｉ
ｓで遺伝子的に免疫することによりマウスに誘導された細胞障害リンパ球誘導、
サイトカイン反応、増殖とおよび抗体産生

【表５】 ^＊示されたデータは、マウス３匹の脾臓細胞からの溶解の百分率の平均値である
。コントロールの細胞の非特異的な溶解は差し引いた。^＊＊示されたデータはマウス３匹からの脾臓細胞の培養のトリプリケートから得
られたＩＦＮ−γのｎｇ／ｍｌ単位の平均値である。コントロールの細胞が産生
するバックグランドのＩＦＮ−γは５−７ｎｇ／ｍｌであった。^＊＊＊ＮＴはテストしなかったことをいう。

【００９３】実施例４バッケー菌のマルチ・エピトープ・コンストラクトのためのクローニング戦略実施例４において検定された８つのエピトープは、マルチ・エピトープ・コン
ストラクトになるように組み立てられた。具体的には、ＤＮＡはＢｇｌＩＩ部位
を５’拡張配列に、ＢａｍＨＩ部位を３’拡張配列に含むプライマーで増幅され
、順次ｐｃＤＮＡ３−ｈＧＨｌｓ／ＨｉｓのＢａｍＨＩ部位にクローニングされ
た。プライマーは、ＡＤ２２３、ＡＤ２２６、ＡＤ２２９、ＡＤ２３０、ＡＤ２
３１、ＡＤ２３２、ＡＤ２３３、ＡＤ２３４、ＡＤ２３５、ＡＤ２３６、ＡＤ２
５６、ＡＤ２５８、ＡＤ２５９、ＡＤ２６０、ＡＤ２６１およびＡＤ２６２（そ
れぞれ配列番号４０−５５）であった。

【００９４】プラスミドＤＮＡ９Ａのインサートが、最初にｐｃＤＮＡ３−ｈＧＨｌｓ／Ｈ
ｉｓのＢａｍＨＩ部位にクローニングされた。前記ベクターのＢａｍＨＩ部位は
クローニングの結合部分の３’末端のみが再生され、他の全てのインサートは、
ＤＮＡ５を除いて、順次同じ部位にクローニングされた。プラスミドＤＮＡ５の
インサートは、最後に、ｐｃＤＮＡ３−ｈＧＨｌｓ／Ｈｉｓのエンドフィル（ｅ
ｎｄｆｉｌｌ）されたＢａｍＨＩ部位をブラントエンド・ライゲーションをする
ことによりクローニングされた。このプロトコールに従って、エピトープのさま
ざまな組合せがｐｃＤＮＡ３−ｈＧＨｌｓ／Ｈｉｓベクターにクローニングされ
た。８重の複数エピトープからなる３つのマルチ・エピトープ・コンストラクト
（ＭＥ／Ａ、ＭＥ／ＢおよびＭＥ／Ｄという）の決定されたＤＮＡ配列は配列番
号５６−５８にそれぞれ示され、対応する予測アミノ酸配列はそれぞれ配列番号
７９−８１に示されている。これらのマルチ・エピトープ・コンストラクトのそ
れぞれには、前記の８つのエピトープのそれぞれが、異なる順序で含まれている
。

【００９５】細菌において複数のエピトープの組み換えタンパク質を発現させるために、プ
ラスミドＭＥ／Ａ、ＭＥ／ＢおよびＭＥ／Ｄのインサートは前記改造された発現
ベクターｐＥＴ１６にサブクローニングされた。全ての８重のエピトープＤＮＡ
の組合せで、ＤＮＡ９ＡおよびＤＮＡ５がそれぞれ５’および３’末端にあった
。プラスミドインサートはプライマーＡＤ２７２およびＡＤ２７３（それぞれ配
列番号５９および６０）を用いて増幅され、増幅された断片の精製物は、ブラン
トエンド・ライゲーションにより、ＥｃｏＲＩで消化されＤＮＡポリメラーゼＰ
ｆｕＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でエンドフィルされたｐＥＴ１６ベクターにク
ローニングされた。組み換えタンパク質は大腸菌宿主細胞を用いて製造者のプロ
トコールに従って発現され、標準的なプロトコールを用いて精製された。

【００９６】実施例５バッケー菌のマルチ・エピトープ・コンストラクトによるマウスの免疫本実施例は、ＤＮＡか組み換えタンパク質かのいずれかの形状でマルチ・エピ
トープ・コンストラクトを注射した後のＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスにおける結核
菌の感染に対する保護免疫を示す。

【００９７】ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスは、異なる処置を受ける６匹ずつ３つのグループに
分けられた。第１グループのマウスは、５００μｇのウシＢＣＧまたはＰＢＳに
より腹腔内に１回の投与で免疫された。第２グループは、１００μｇのＭＥ／Ｄ
のＤＮＡまたは空のベクターのＤＮＡにより前脛骨筋に３週間の間隔を置いて３
回筋注して免疫された。第３グループのマウスは、ＩＦＡにした組み換えＭＥ／
Ｄ５０μｇまたはＩＦＡにしたコントロールのタンパク質５０μｇを１回か２回
のいずれか３週間の間隔を置いて腹腔内に免疫した。このコントロールのタンパ
ク質のＧＶ１４Ｂは、マイコバクテリウム属の細菌の伸長因子Ｇのバッケー菌で
のホモログをエンコードするＤＮＡに由来し、ｐＥＴ１６ｇ３に逆方向にクロー
ニングされた自然界に存在しないタンパク質からなる。

【００９８】最後の免疫の３週間後にマウスは結核菌の生菌（５ｘ１０^５ＣＦＵ）で攻撃さ
れた。さらに３週間後に肺および脾臓の器官のホモジェネートが調製され、オレ
イン酸−アルブミン−デキストロース−カタラーゼ（ＯＡＤＣ）を添加した７Ｈ
９培地に播いてそれぞれのホモジェネートに存在するＣＦＵ数を決定した。結果
は２週間のインキュベーション期間の後に記録された。

【００９９】保護免疫の誘導は、免疫されないコントロールのマウスからのＣＦＵの平均値
と比較して、肺および脾臓のホモジェネートのＣＦＵについて平均で０．５ｌｏ
ｇの減少が結核菌の感染後に観察されたときに、陽性とされた。ＭＥ／ＤのＤＮ
Ａまたは組み換えＭＥ／Ｄポリペプチドの免疫後のＣＦＵの減少が、ウシ型結核
菌ＢＣＧの既知の免疫原性と比較された。結果（図１）は、組み換えＭＥ／Ｄコ
ンストラクトとともにＭＥ／ＤのＤＮＡで免疫されたマウス由来の肺および脾臓
においてＣＦＵの減少を示している。肺および脾臓の両方のＣＦＵの減少によっ
て証明されたＭＥ／ＤのＤＮＡおよびｒＭＥ／Ｄポリペプチドの保護免疫は、単
一エピトープのコンストラクトで免疫後の肺のＣＦＵの減少よりも大きかった（
表４）。

【０１００】実施例６バッケー菌のマルチ・エピトープ・コンストラクトの免疫原性本実施例は、ＤＮＡか組み換えポリペプチドかのいずれかの形状における３つ
のマルチ・エピトープ・コンストラクトについて行われた免疫原性の研究の結果
を記載する。

【０１０１】Ａ組み換えマルチ・エピトープ・コンストラクトＭＥ／Ａ、ＭＥ／Ｂおよび
ＭＥ／Ｄは、マウスリンパ節細胞を刺激して、試験管内で増殖しＩＦＮ−γを分
泌させる。組み換えマルチ・エピトープ・コンストラクトＭＥ／Ａ、ＭＥ／ＢおよびＭＥ
／Ｄを、マウスリンパ節細胞におけるＴ細胞増殖およびＩＦＮ−γを誘導する能
力についてスクリーニングした。このアッセイでは、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス
を、等体積のＩＦＡに希釈した組み換えマルチ・エピトープ・コンストラクトの
ｒＭＥ／Ａ、ｒＭＥ／ＢおよびｒＭＥ／Ｄ１０μｇで、それぞれのフットパッド
（ｆｏｏｔｐａｄ）の皮下に免疫した。コントロールのグループのマウスにはＩ
ＦＡにしたＰＢＳを注射した。マウスは９日後に屠殺され、リンパ節を除去した
。リンパ節細胞は、１０％（ｖ／ｖ）の同種の血清と、ペニシリン（６０μｇ／
ｍｌ）と、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）と、グルタミン（２ｍＭ）
とを添加したＤＭＥＭを含む培養液中で、０μＭ、０．１２５μＭ、０．２５μ
Ｍまたは０．５μＭのｒＭＥ／Ａ、ｒＭＥ／ＢおよびｒＭＥ／Ｄとコントロール
のＧＶ１４Ｂタンパク質との存在下で培養した。３日後、培養液５０μｌを各ウ
ェルから除去して上記のとおりＩＦＮ−γレベルの測定を行った。培養プレート
はさらに４日間培養して、ウェルあたりトリチウムチミジン１μＣｉで１８時間
パルス標識した。細胞を回収してトリチウムの取り込みをシンチレーションカウ
ンターを用いて測定した。培養液だけで培養された細胞で見られる増殖よりも２
倍以上高レベルの増殖を２回の重複で刺激した上清が陽性とされた。

【０１０２】マウスの増殖実験の結果を図２ＡないしＤに示す。組み換えマルチ・エピトー
プ・コンストラクト３つ全てが免疫マウス由来のリンパ節細胞で増殖反応を誘導
した。ｒＭＥ／Ａ、ｒＭＥ／ＢおよびｒＭＥ／Ｄのこれら３つの組み換えマルチ
・エピトープ・コンストラクトによって誘導された増殖のレベル（それぞれ図２
Ａ、ＢおよびＣ）は同程度で、これらのコンストラクトは抗原としては同一であ
ることを示す。ＰＢＳで免疫したコントロールのマウスからは増殖は見られなか
った。

【０１０３】ｒＭＥ／Ａ、ｒＭＥ／ＢおよびｒＭＥ／Ｄで免疫されたマウス由来の刺激され
たリンパ節細胞によって分泌されたＩＦＮ−γのレベルをそれぞれ図３Ａないし
Ｃに示す。組み換えマルチ・エピトープ・コンストラクト３つ全てがリンパ節細
胞によるＩＦＮ−γ分泌を刺激したが、ｒＭＥ／Ｂで刺激されたもののレベルが
最も高かった（図３Ｂ）。ＰＢＳで刺激されたコントロールのマウス由来の細胞
は検出不能な量のＩＦＮ−γしか分泌しなかった（図３Ｄ）。これらの結果は、
マルチ・エピトープ・コンストラクトによる免疫がＴｈ１免疫反応をマウスに誘
導したことを示唆している。

【０１０４】Ｂ組み換えマルチ・エピトープ・コンストラクトＭＥ／Ｄと、ＭＥ／ＤのＤ
ＮＡとは、異なる経路で免疫されたマウス由来のリンパ節および脾臓細胞を刺激
して、試験管内で増殖およびＩＦＮ−γの分泌を起こす。これらの実験では、組み換えマルチ・エピトープ・コンストラクトｒＭＥ／Ｄ
かマルチ・エピトープ・コンストラクトＭＥ／ＤのＤＮＡかで、皮下、腹腔内ま
たは筋注で免疫されたマウスに由来するリンパ節または脾臓細胞が、Ｔ細胞増殖
およびＩＦＮ−γ産生を誘導するように刺激された。ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス
は、それぞれのフットパッドに１０μｇのｒＭＥ／ＤをＩＦＡにして１回皮下注
射するか、５０μｇのｒＭＥ／ＤをＩＦＡにして１回腹腔注射するか、１００μ
ｇのＭＥ／ＤのＤＮＡを３週間の間隔を置いて３回筋注するかのいずれかによっ
て免疫した。コントロールのマウスは、ＰＢＳをこれらの３つの異なる経路で免
疫した。９日後、皮下注射および腹腔内注射で免疫したマウスは屠殺され、リン
パ節（皮下注射の場合）または脾臓細胞（腹腔内注射の場合）を除去した。筋注
により免疫されたマウス由来の脾臓細胞は最後の免疫の１５日後に回収した。こ
れらの細胞の増殖およびＩＦＮ−γ産生は上記のとおり測定した。

【０１０５】これらの実験の結果を図４および図５に示す。図４Ａは、ｒＭＥ／ＤまたはＭ
Ｅ／ＤのＤＮＡで免疫されたマウス由来のリンパ節および脾臓の細胞の特異的な
増殖反応を示す。比較すると、図４Ｂは、コントロールのマウス由来の細胞の増
殖反応が弱いことを示す。同様に、ｒＭＥ／ＤかＭＥ／ＤのＤＮＡかで免疫され
たマウス由来のリンパ節および脾臓の細胞はＩＦＮ−γを分泌するように刺激さ
れるが（図５Ａ）、ＰＢＳで免疫されたコントロールのマウス由来のリンパ節お
よび脾臓の細胞が分泌するＩＦＮ−γのレベルは低い。

【０１０６】Ｃマルチ・エピトープ・コンストラクトからの単一エピトープは、組み換え
マルチ・エピトープ・コンストラクトのｒＭＥ／ＤかＭＥ／ＤのＤＮＡかで免疫
されたマウス由来のリンパ節および脾臓の細胞を異なる経路で刺激して、試験管
内で増殖させ、ＩＦＮ−γを分泌させる。これらの実験では、組み換えマルチ・エピトープ・コンストラクトのｒＭＥ／
Ｄかマルチ・エピトープ・コンストラクトＭＥ／ＤのＤＮＡ型かにより、異なる
経路で免疫されたマウス由来のリンパ節および脾臓の細胞が、ＤＮＡ５、ＤＮＡ
９、ＤＮＡ２６、ＤＮＡ２７、ＤＮＡ２９、ＤＮＡ３７、ＤＮＡ４４およびＤＮ
Ａ４５の単一エピトープの組み換え型で再度刺激された。実験の手順はこれまで
に概説したのと同じであった。これらの実験の結果を図６Ａ−Ｂおよび図７Ａ−
Ｂに示す。特異的な増殖反応およびＩＦＮ−γ分泌が、ＤＮＡ５、ＤＮＡ９Ａ、
ＤＮＡ２６、ＤＮＡ３７およびＤＮＡ４４のエピトープで再刺激された細胞で検
出された（図６Ａおよび図７Ａ）。ＤＮＡ２７、ＤＮＡ２９およびＤＮＡ４５の
エピトープによる増殖およびＩＦＮ−γ産生は少なくとも１つの免疫グループで
見られた。低いレベルの増殖およびＩＦＮ−γ産生が、ＰＢＳで免疫されたコン
トロールのマウス由来の細胞で観察された（図６Ｂおよび図７Ｂ）。このデータ
は、多成分免疫原の一部として免疫システムに提示されるときには、前記のエピ
トープが全て個別に抗原性があることを示している。

【０１０７】Ｄサイトカイン産生マルチ・エピトープ・コンストラクトのＭＥ／ＤのＤＮＡ型で免疫され、ｒＭ
Ｅ／Ａで再刺激されたマウス由来の脾臓細胞によるサイトカイン産生は、以下の
とおり測定された。ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスは、１００μｇのＭＥ／ＤのＤＮ
Ａを３週間の間隔を置いて３回筋注で免疫された。最後の注射の１５日後、マウ
スを屠殺して、脾臓細胞を除去した。この脾臓細胞をｒＭＥ／Ａ、ｒＭＥ／Ｄま
たはコントロールのＧＶ１４Ｂタンパク質で再刺激し、標準的な手順に従って、
上清をサイトカイン産生についてスクリーニングした。この脾臓細胞によるサイ
トカイン産生を表６に示す。

【０１０８】ＭＥのＤＮＡで免疫されたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス由来の脾臓細胞によって
分泌されたサイトカイン

【表６】 ^＊サイトカインの濃度はｐｇ／ｍｌ単位で測定され、標準誤差は１０％以内であ
った。

【０１０９】表６に示すとおり、ＩＬ−２およびＩＬ−６がｒＭＥ／ＡおよびｒＭＥ／Ｄで
刺激された脾臓細胞によって分泌された。ＩＬ−２は、Ｔｈ１タイプの免疫反応
の際に分泌されるサイトカインであり、マルチ・エピトープ・コンストラクトが
Ｔｈ１タイプの免疫反応を誘発することの更なる証拠を提供している。サイトカ
インのＩＬ−６は結核に対するマウスの免疫において重要な役割を果たしている
（Ｌａｄｅｌら、Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍ．、６５巻、４８４３−４８４９頁、１９
９７年）。Ｔｈ２タイプのサイトカインであるＩＬ−４の分泌は検出されなかっ
た。

【０１１０】Ｅ抗体産生ＭＥ／Ｄで免疫されたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス由来の血液サンプルは、最後
のＤＮＡ注射の２週間後に採取され、標準的な手順に従って血清が調製された。
抗ＭＥ／Ｄ抗体の存在はＥＬＩＳＡ法によって決定された。図８Ｂに示すとおり
、ｒＭＥ／ＡおよびｒＭＥ／Ｄと反応する高力価のＩｇＧ２ａ抗体は検出された
が、ＩｇＧ１抗体は検出されなかった（図８Ａ）。ＩｇＧ２ａ抗体の存在はＴｈ
１タイプの免疫反応に特徴的である。

【０１１１】Ｆ組み換えエピトープおよび組み換えマルチ・エピトープ・コンストラクト
ｒＭＥ／Ｄによるマウスの長期記憶反応の誘導結核菌に感染して、ｒＤＮＡ５、ｒＤＮＡ９Ａ、ｒＤＮＡ２６、ｒＤＮＡ２７
、ｒＤＮＡ３７、ｒＤＮＡ４４またはｒＤＮＡ４５のいずれかの組み換えエピト
ープで免疫されたマウスにおける長期記憶反応の誘導は、以下のとおり決定され
た。マウスの長期記憶のアッセイ法では、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスに結核菌を
１０^４のコロニー形成単位（ＣＦＵ）という半致死量で感染させた。４週間後か
ら、マウスは結核菌感染を治療するためにその後４週間にわたって抗生物質で処
理して、その後８週間の休養期間を置いた。結核菌の生菌（５ｘ１０^５ＣＦＵ）
での第２回目の注射の３日後、組み換えコンストラクトの免疫原性が、上記の脾
臓細胞アッセイ法を用いて測定された。脾臓細胞は２μＭの組み換えエピトープ
または１、０．３３、０．１１、０．０３または０．０１μＭのｒＭＥ／Ｄで刺
激した。脾臓アッセイ法で測定されたＩＦＮ−γ産生レベルは図９Ａ−Ｃに示さ
れている。コントロールのマウス由来の脾臓細胞は無関係なＧＶ１４Ｂタンパク
質で刺激した（図９Ｂ）。この実験の他のコントロールには、培養液のみと、２
μｇ／ｍｌのＣｏｎＡと、１０μｇ／ｍｌのＰＰＤと、１０μｇ／ｍｌのバッケ
ー菌とによる刺激が含まれる（図９Ａ）。組み換えＭＥ／Ｄは、結核菌に感染し
たマウス由来の記憶Ｔ細胞を刺激して、大量のＩＦＮ−γを投与量依存的に産生
させた（図９Ｂ）。このアッセイ法でのＩＦＮ−γ産生は、長期記憶反応を誘導
する結核菌抗原とＭＥ／Ｄとの交差反応性を示すものである。結核菌抗原と交差
反応性がある抗原決定基は、ＤＮＡ５、ＤＮＡ９Ａ、ＤＮＡ２６、ＤＮＡ２７お
よびＤＮＡ４４のエピトープに位置するようである（図９Ｂ）。

【０１１２】実施例７組み換え単一エピトープおよび組み換えマルチ・エピトープ・コンストラクトによるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激の効果Ａ試験管内で増殖させインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を分泌させ
るためのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激ｐＥＴ１６細菌発現システムによって発現された組み換えエピトープおよび組
み換えマルチ・エピトープ・コンストラクトを、ヒトＰＢＭＣと３７°Ｃで培養
した。４８時間後、ＩＦＮ−γの分泌を酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法
で測定した。並行した培養をトリチウムチミジンでパルス標識して、ＤＮＡ合成
をＰＢＭＣの増殖を評価するために用いた。これらの実験の結果は図１０Ａ−Ｂ
および図１１Ａ−Ｂに示される。組み換えマルチ・エピトープ・コンストラクト
はヒトＰＢＭＣを刺激して、ＩＦＮ−γを分泌させ、増殖させた（それぞれ図１
０ＡおよびＢ）。これらの反応は、投与量依存性があり、個別の組み換えエピト
ープによって誘導された反応よりも大きかった（図１１ＡおよびＢ）。

【０１１３】Ｂ組み換え単一エピトープおよび組み換えマルチ・エピトープ・コンストラ
クトｒＭＥ／ＡおよびｒＭＥ／Ｄによる、試験管内でサイトカインを分泌させる
ためのヒトＰＢＭＣの刺激ヒトＰＢＭＣのサイトカイン産生は、組み換え単一エピトープまたは組み換え
ｒＭＥ／ＡまたはｒＭＥ／Ｄによる試験管内での再刺激の後に、以下のとおり評
価された。細胞は、ｒＤＮＡ５、ｒＤＮＡ９Ａ、ｒＤＮＡ２６、ｒＤＮＡ２７、
ｒＤＮＡ２９、ｒＤＮＡ３７、ｒＤＮＡ４４またはｒＤＮＡ４５の組み換え単一
エピトープ２μＭか、ｒＭＥ／ＡまたはｒＭＥ／Ｄ０．５μＭかで刺激された。
コントロールのグループの細胞はＧＶ１４Ｂ２μＭまたは１０μｇ／ｍｌのＰＰ
Ｄで刺激された。サイトカイン反応は、標準的な手順に従ってＥＬＩＳＡ法によ
って測定された。表７に示すとおり、組み換え単一エピトープか、ｒＭＥ／Ａま
たはｒＭＥ／Ｄで刺激されたヒトＰＢＭＣは、Ｔｈ１サイトカインのＩＦＮ−γ
およびＴＮＦ−αを産生した。これらの組み換えエピトープは、ＩＬ−１０の分
泌も誘導した。Ｔｈ２サイトカインのＩＬ−５は、刺激された細胞の上清中に検
出されなかった。低レベルのサイトカインがコントロールの抗原での刺激に対し
て分泌され、テストした全てのサイトカインが、ＰＰＤによる刺激の後ヒトＰＢ
ＭＣによって分泌された。

【０１１４】組み換え単一エピトープおよびｒＭＥで試験管内で刺激後にヒトＰＢＭＣにより分泌されたサイトカイン

【表７】

【０１１５】実施例８組み換えｒＭＥ／Ｄによる免疫後のカニクイザルにおけるリンパ球増殖の刺激組み換えマルチ・エピトープ・コンストラクトｒＭＥ／Ｄの免疫原性をテスト
するために、４匹ずつのカニクイザルからなる３つのグループを免疫した。リン
パ球の増殖はＰＢＭＣ増殖アッセイ法で測定した。グループＩのサルにはＰＢＳ
を不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）にして全量０．１ｍｌを皮内に免疫
した。グループＩＩのサルには３３μｇのｒＭＥ／ＤをＩＦＡにして（全量０．
１ｍｌ）皮内に免疫し、グループＩＩＩのサルには１０μｇのｒＭＥ／ＤをＩＦ
Ａにして（全量０．１ｍｌ）皮内に免疫した。０週と６週の２回免疫した。血液
サンプルはそれぞれのサルから免疫して１２週間後に採取した。

【０１１６】それぞれのサル由来の全血液は、１：５に希釈して、陽性のコントロールのフ
ィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、１０μｇ／ｍｌ）、ＰＰＤ（１０μｇ／ｍｌ）、
バッケー菌１０μｇ／ｍｌ、ｒＭＥ／Ｄ１μｇ／ｍｌまたはコントロールの組
み換えタンパク質ＧＶ−１４Ｂ１μｇ／ｍｌのいずれかを含む、コントロール
の培養液（１０％（ｖ／ｖ）の同種血清と、ペニシリン（６０μｇ／ｍｌ）と、
ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）と、グルタミン（２ｍＭ）とを添加し
たＲＰＭＩ１６４０）を全培養液量１ｍｌで刺激した。プレートは７２時間培養
して、トリチウムチミジンをウェルあたり１μＣｉで１８時間パルス標識して、
回収して、トリチウムの取り込みをシンチレーション・カウンターを用いて測定
した。リンパ球増殖の結果は表８に示した。

【０１１７】ＰＨＡ、ＰＰＤ、バッケー菌、ｒＭＥ／ＤまたはｒＧＶ−１４で刺激されたカニクイザルの血液サンプル中のリンパ球の増殖

【表８】 ^＊ＰＢＭＣの増殖の結果は刺激指数で表す。

【０１１８】表８に示すとおり、組み換えマルチ・エピトープ・コンストラクトｒＭＥ／Ｄ
は、グループＩＩおよびＩＩＩの免疫されたサル由来のＰＢＭＣ細胞において、
陽性のコントロール（ＰＨＡ）と比肩できる増殖反応を誘導した。ＰＰＤ、バッ
ケー菌またはｒＧＶ−１４での刺激後には増殖は記録されなかった。

【０１１９】本発明は、明瞭な理解を目的として例示のためにある程度詳細に説明されてい
るが、特許請求の範囲によってのみ限定されることを意図する本発明の範囲から
逸脱することなく、変更および改変を行うことができる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスの肺および脾臓のホモジェネートにおける結核菌Ｃ
ＦＵの減少として測定された、ウシ型結核菌（それぞれ図１ＡおよびＤ）と、Ｍ
Ｅ／ＤのＤＮＡ（それぞれ図１ＢおよびＥ）と、ｒＭＥ／Ｄ（それぞれ図１Ｃお
よびＦ）とを接種することによる保護免疫の誘導を示す。

【図２】ｒＭＥ／Ａ（図２Ａ）か、ｒＭＥ／Ｂ（図２Ｂ）か、ｒＭＥ／Ｄ（図２Ｃ）か
で皮下に免疫されたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス由来のリンパ節細胞の増殖反応を
示す。コントロールのマウスはＰＢＳで免疫された（図２Ｄ）。

【図３】組み換えマルチ・エピトープ・コンストラクトのｒＭＥ／Ａ（図３Ａ）か、ｒ
ＭＥ／Ｂ（図３Ｂ）か、ｒＭＥ／Ｄ（図３Ｃ）かで皮下に免疫されたＢＡＬＢ／
ｃＢｙＪマウス由来のリンパ節細胞によるＩＦＮ−γの分泌を示す。コントロー
ルのマウスはＰＢＳで免疫された（図３Ｄ）。

【図４】ｒＭＥ／Ａか、ｒＭＥ／Ｄか、ＭＥ／ＤのＤＮＡかを３つの異なる経路で免疫
したＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス由来のリンパ節細胞の増殖反応を示す（図４Ａ）
。ＰＢＳで免疫したコントロールのマウス由来のリンパ節細胞の増殖反応は図４
Ｂに示す。

【図５】ｒＭＥ／Ａか、ｒＭＥ／Ｄか、ＭＥ／ＤのＤＮＡかを３つの異なる経路で免疫
したＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス由来のリンパ節細胞によるＩＦＮ−γ分泌レベル
を示す（図５Ａ）。ＰＢＳで免疫したコントロールのマウス由来のリンパ節細胞
によるＩＦＮ−γ分泌のレベルは図５Ｂに示す。

【図６】ｒＭＥ／Ａか、ｒＭＥ／Ｄか、ＭＥ／ＤのＤＮＡかを３つの異なる経路で免疫
したＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス由来のリンパ節細胞の増殖反応に対する単独のエ
ピトープの寄与を示す（図６Ａ）。ＰＢＳで免疫したコントロールのマウス由来
のリンパ節細胞の増殖反応は図６Ｂに示す。

【図７】ｒＭＥ／Ａか、ｒＭＥ／Ｄか、ＭＥ／ＤのＤＮＡかを３つの異なる経路で免疫
したＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス由来のリンパ節細胞によるＩＦＮ−γ分泌のレベ
ルに対する単独のエピトープの寄与を示す（図７Ａ）。ＰＢＳで免疫したコント
ロールのマウス由来のリンパ節細胞によるＩＦＮ−γ分泌のレベルは図７Ｂに示
す。

【図８】試験管内でｒＭＥ／ＡおよびｒＭＥ／Ｄと反応したＭＥ／ＤのＤＮＡで免疫さ
れたマウスの血清中の抗ＭＥ抗体の力価およびサブクラスを示す。ＩｇＧ１抗体
の力価は図８Ａに示し、ＩｇＧ２ａ抗体の力価は図８Ｂに示す。

【図９】組み換え単一エピトープ（図９Ｂ）またはｒＭＥ／Ｄ（図９Ｃ）で免疫された
ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス由来の記憶脾臓細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示す。コ
ントロールで刺激された脾臓細胞によるＩＦＮ−γ分泌は図９Ａに示す。

【図１０】試験管内でｒＭＥ／Ａ、ｒＭＥ／ＢおよびｒＭＥ／Ｄで刺激された後のヒトＰ
ＢＭＣによるＩＦＮ−γ分泌（図１０Ａ）および増殖反応（図１０Ｂ）を示す。

【図１１】試験管内で８つの組み換え単一エピトープで刺激した後のヒトＰＢＭＣによる
ＩＦＮ−γ分泌（図１１Ａ）および増殖反応（図１１Ｂ）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 37/00 37/00 37/04 37/04 Ｃ０７Ｋ 14/35 Ｃ０７Ｋ 14/35 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA13 BA31 CA03 CA07 CA20 DA02 DA06 EA04 GA13 GA25 GA27 HA17 4B065 AA26X AA36Y AA58X AA72X AA90X AB01 AC14 BA02 BA05 BA16 BA24 CA24 CA45 CA46 4C084 AA13 MA52 MA66 NA14 ZA592 ZB092 ZB132 ZB262 ZB352 4C085 AA03 BA09 BB11 CC07 DD62 EE01 EE06 FF03 FF20 GG02 GG03 GG04 GG05 GG08 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA11 DA86 EA22 EA52 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号６１−７７に提供された配列からなるグループから
選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】（ａ）配列番号６１−６３、６５および６７−７７のいずれ
かに列挙される配列に対してコンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＸによって決
定される同一性が少なくとも約３０％ある残基を有する配列と、（ｂ）配列番号
６１−６３、６５および６７−７７のいずれかに列挙される配列に対してコンピ
ューターアルゴリズムＦＡＳＴＸによって決定される同一性が少なくとも約５０
％ある残基を有する配列と、（ｃ）配列番号６１−７７に列挙される配列に対し
てコンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＸによって決定される同一性が少なくと
も約７５％ある残基を有する配列と、（ｄ）配列番号６１−７７に列挙される配
列に対してコンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＸによって決定される同一性が
少なくとも約９０％ある残基を有する配列とからなるグループから選択されるア
ミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３】請求項１および２のいずれかに記載のポリペプチドをエンコ
ードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】配列番号８−２１に列挙された配列とその相補体とからなる
グループから選択される配列を含む、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオ
チド。
【請求項５】（ａ）配列番号８−２１のいずれかに列挙される配列に対し
てコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮによって決定される同一性が少なく
とも約３０％ある残基を有する配列と、（ｂ）配列番号８−２１のいずれかに列
挙される配列に対してコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮによって決定さ
れる同一性が少なくとも約５０％ある残基を有する配列と、（ｃ）配列番号８−
２１に列挙される配列に対してコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮによっ
て決定される同一性が少なくとも約７５％ある残基を有する配列と、（ｄ）配列
番号８−２１に列挙される配列に対してコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴ
Ｎによって決定される同一性が少なくとも約９０％ある残基を有する配列と、（
ｅ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の配列の相補体とからなるグルー
プから選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】請求項３ないし５のいずれかに記載の少なくとも１つのポリ
ヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクト。
【請求項７】配列番号５６−５８からなるグループから選択される配列を
含む、請求項６に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項８】請求項６および７のいずれかに記載のＤＮＡコンストラクト
で形質転換された宿主細胞。
【請求項９】請求項１および２のいずれかに記載の少なくとも１つのポリ
ペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項１０】配列番号７９−８１からなるグループから選択される配列
を含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】請求項１および２のいずれかに記載の少なくとも１つのポ
リペプチドと生理的に受け入れ可能な担体とを含む組成物。
【請求項１２】請求項３ないし５のいずれかに記載の少なくとも１つのポ
リヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１３】請求項９に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と生理
的に受け入れ可能な担体とを含む組成物。
【請求項１４】請求項６に記載の少なくとも１つのＤＮＡコンストラクト
と生理的に受け入れ可能な担体とを含む組成物。
【請求項１５】請求項１および２のいずれかに記載の少なくとも１つのポ
リペプチドと免疫賦活剤とを含む組成物。
【請求項１６】請求項３ないし５のいずれかに記載の少なくとも１つのポ
リペプチドと免疫賦活剤とを含む組成物。
【請求項１７】請求項９に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と免疫
賦活剤とを含む組成物。
【請求項１８】請求項６に記載の少なくとも１つのＤＮＡコンストラクト
と免疫賦活剤とを含む組成物。
【請求項１９】請求項１１ないし１８のいずれかに記載の組成物を患者に
投与することを含む、患者の免疫反応を増強するための方法。
【請求項２０】前記免疫反応はＴｈ１反応である、請求項１９に記載の方
法。
【請求項２１】前記組成物はＴ細胞とＮＫ細胞とからなるグループから選
択される少なくとも１つの細胞を活性化する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】前記組成物はサイトカインの産生を刺激する、請求項１９
に記載の方法。
【請求項２３】前記組成物は長期記憶細胞を誘導する、請求項１９に記載
の方法。
【請求項２４】患者の免疫疾患、感染症および癌からなるグループから選
択される疾病の治療のための方法であって、請求項１１ないし１８のいずれかに
記載の組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項２５】前記疾病は結核である、請求項２９に記載の方法。