JP2003503061A - リノール酸イソメラーゼ - Google Patents

リノール酸イソメラーゼ

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JP2003503061A JP2001506838A JP2001506838A JP2003503061A JP 2003503061 A JP2003503061 A JP 2003503061A JP 2001506838 A JP2001506838 A JP 2001506838A JP 2001506838 A JP2001506838 A JP 2001506838A JP 2003503061 A JP2003503061 A JP 2003503061A
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デン、ミン−デ
ディ． グルント、アラン
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Abstract

(57)【要約】 本発明は単離リノール酸イソメラーゼおよびその核酸ならびにアミノ酸配列を提供する。また本発明は、固定化細胞および／または単離リノール酸イソメラーゼを使用して、油から、共役リノール酸または共役リノレン酸（ＣＬＡ）もしくはその誘導体方法を生産する方法を提供する。さらに本発明は、単離リパーゼ様タンパク質およびその核酸ならびにアミノ酸配列を提供する。本発明はさらに、単離アセチルトランスフェラーゼ様酵素およびその核酸ならびにアミノ酸配列を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の属する技術分野） 本発明は、単離リノール酸イソメラーゼ酵素およびそのアミノ酸配列と、その
ようなリノール酸イソメラーゼ酵素をコードする核酸分子と、リノール酸イソメ
ラーゼ酵素を有する固定化細胞と、固定化したリノール酸イソメラーゼ酵素と、
リノール酸またはリノレン酸を単離リノール酸塩イソメラーゼ酵素、核酸分子お
よび／または固定化細胞を使用してＣＬＡまたはその誘導体に変換する方法とに
関する。
【０００２】 （本発明の背景） 本明細書では、用語「ＣＬＡ」を、共役リノール酸および共役リノレン酸の両
方について説明するための総括的な用語として使用する。（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ
）−９，１１−リノール酸および（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−リノー
ル酸というＣＬＡ化合物は、よく認められている栄養補助物質であると共に、マ
ウスの上皮の発癌および噴門洞の新生物生成ならびにラットの発癌物質誘導性乳
癌の有効な阻害剤である。ＣＬＡは、ニワトリ、マウスおよびラットの免疫刺激
によって引き起こされる悪影響を予防することも示されており、アテローム発生
食を与えたウサギにおける低密度リポタンパク質コレステロールと高密度リポタ
ンパク質コレステロールの比を減小させることが示されている。ＣＬＡはさらに
、マウス、ネズミ、ニワトリおよびブタモデルの体脂肪も減少させる。また、Ｃ
ＬＡは、食事に入れた時に、皮膚病変を治療するのに有効であることも示されて
いる。
【０００３】 ＣＬＡは、事実上すべての食物中に様々な量で生じている。ＣＬＡの基本的な
天然源は、乳製品、牛肉および反芻動物に由来する食物である。米国では、牛肉
、牛脂、子牛の肉、子羊（３−４ｍｇＣＬＡ／ｇ脂肪；８４％のｃｉｓ−９，ｔ
ｒａｎｓ−１１）および乳製品（３−７ｍｇＣＬＡ／ｇ脂肪；８０−９０％のｃ
ｉｓ−９，ｔｒａｎｓ−１１）が、最も高濃度のＣＬＡを含む。オーストラリア
の乳製品および牧草で飼育された牛肉および子羊の２−３倍高いＣＬＡ濃度が見
出される。非常に低濃度のＣＬＡ（ｃｉｓ９，ｔｒａｎｓ−１１およびｔｒａｎ
ｓ−１０，ｃｉｓ−１２の各々に対して０．１−０．７ｍｇＣＬＡ／ｇ脂肪；約
４０％）は、市販植物油に見出される。
【０００４】 ＣＬＡはリノール酸代謝の通常の中間体である。乳牛では、天然の細菌叢によ
って生産されたそれ異常代謝されない（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−ＣＬ
Ａ１つの１−ＣＬＡが、脂質に組み込まれ、次に宿主の組織および牛乳に組み込
まれる。動物は、牛乳、乳製品またはＣＬＡを含有する肉等の食事からまたはＣ
ＬＡ栄養補助物質からＣＬＡを摂取し、それを正常な組織およびミルクに組み込
んでいる。
【０００５】 ＣＬＡは、リノール酸またはリノレン酸の、もしくはリノール酸、リノレン酸
またはそれらの誘導体を含んでいる植物油の、アルカリ異性化より合成で得るこ
とが可能である。アルカリ条件下で植物油を１８０℃にて加熱すると、以下の２
つの反応に触媒作用を及ぼす。つまり、（１）トリグリセリド脂質バックボーン
に由来の脂肪酸エステル結合が加水分解して遊離脂肪酸を生じ、（２）２以上の
適切な二重結合を備えた非共役不飽和脂肪酸が共役する。現在利用可能な市販の
ＣＬＡ油は、通常はヒマワリ油で作られており、それ以上の精製を要しない状態
で得られている。そのような市販のＣＬＡ油は、他の飽和および不飽和の脂肪酸
と同様、ＣＬＡ異性体の混合物を含有している。一般に、化学合成により、約２
０−３５％（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−ＣＬＡおよび約２０−３５％（
ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−ＣＬＡと、それに釣り合う種々の他の異性
体が生産される。不活性な非天然の異性体が存在すると、（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ
）−９，１１−ＣＬＡおよび／または（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−Ｃ
ＬＡを精製する必要があるか、または安全性を実証してそのような有益でない非
天然の異性体をヒトに使用するため規則承認を求めなければならない。しかしな
がら、アルカリ異性化により生産されたＣＬＡから、単一のＣＬＡ異性体のみを
分離することは経済的に実現不可能である。
【０００６】 分別晶出法を使用すると、１０，１２−ＣＬＡに対して９，１１−ＣＬＡを豊
富にすることは可能であり、その逆もまた可能である。米２０００年１月１８日
に出願され、サボらに付与された国特許第６，０１５，８３３号は、ＣＬＡの総
含有量が５０％以上で混じったオクタデカジエン酸異性体が１％未満の種子油由
来のＣＬＡ組成物の化学的生産について説明している。ロダーズ クロクラーン
ビー ブイ（Ｌｏｄｅｒｓ Ｃｒｏｋｌａａｎ Ｂ．Ｖ．）の国際出願第９７
／１８３２０号に記載されている別のアプローチは、１０，１２−ＣＬＡを選択
的にエステル化し、９，１１−ＣＬＡ分画を豊富にするためにリパーゼを使用し
ている。しかしながら、上記の方法は、一般に高純度の単一異性体ＣＬＡの生産
を許容せず、また、単一異性体の生産が大規模レベルで達成される場合、そのよ
うな方法は高価であると予想される。
【０００７】 化学変換法の欠点を克服する１つの方法は、細胞全体の形質転換またはＣＬＡ
へのリノール酸、リノレン酸またはそれらの誘導体への酵素的変換である。 生物系が利用可能な場合、所望の化学化合物を生産するのにそのような生物系が
化学合成の有効な代わりとなり得ることはよく知られている。リノール酸をＣＬ
Ａに変換するリノール酸イソメラーゼ酵素が存在することは、３０年以上知られ
ているが、誰もその酵素の単離に成功していない。また、それがまだ単離されて
いないため、リノール酸イソメラーゼ酵素は配列決定されていない。
【０００８】 多くの微生物では、リノール酸イソメラーゼ酵素が、生体内水素化ステップに
おいて、リノール酸を中間体としてのＣＬＡに変換する。ケプラー（Ｋｅｐｌｅ
ｒ）とタヴ（Ｔｏｖｅ）は、ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅ
ｎｓ（Ｋｅｐｌｅｒ ａｎｄ Ｔｏｖｅ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１９
６６，２４１，１３５０）において該酵素を同定した。しかしながら、彼らは酵
素を可溶化することができず、つまり、任意の有意な純粋の形式で該酵素を単離
することがでてきなかった（Ｋｅｐｌｅｒ ａｎｄ Ｔｏｖｅ，Ｊ． Ｂｉｏｌ
． Ｃｈｅｍ．，１９６７，２４２，５６８６）。さらに、初期の研究によると
、遊離カルボキシル基とｃｉｓ−９、ｃｉｓ−１２二重結合部分を有する化合物
だけがリノール酸イソメラーゼによって異性化されることが示されている。Ｋｅ
ｐｌｅｒ ａｎｄ Ｔｏｖｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
１９６９，１４，１０５−１０９、およびＫｅｐｌｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，１９７０，２４５，３６１２を参照。
【０００９】 別の研究グループであるパーク（Ｐａｒｋ）とその共同研究者は、パークらが
Ｂｕｚｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓリノール酸イソメラーゼ
であると考えているタンパク質の精製について説明した、Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（Ｖｏｌ．１：２４４−２５１，１９９６）に記
事を発表した。しかしながら、ケプラーおよびタヴ（上記参照）による酵素活性
の初期のキャラクタリゼーションおよび本願発明者による３つの明らかにされた
リノール酸イソメラーゼの精製・配列決定・キャラクタリゼーションに基づくと
、本願発明者は、パークによって精製され説明されたタンパク質が実際にリノー
ル酸イソメラーゼである可能性は非常に低いと信じている。より詳細には、特定
の酵素の精製をうまく行うためにそのような酵素をまず可溶化形式に変換するこ
とが、当該技術分野ではよく確立されている。パークらは、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂ
ｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓリノール酸イソメラーゼが膜結合タンパク質
であることを実証しているが、パークらは該酵素のそのような可溶化については
説明しない。代わりに、単離タンパク質ペレットを、リン酸緩衝液に単に懸濁し
ただけであった。いかなる膜タンパク質も可溶化にせず、従ってケプラーおよび
タヴの先に説明した精製の試み（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１９６７，２
４２：５６８６−５６９２，１９６７）に特に関係して大きな疑いを投げかける
方法である。実際、上に議論したように、ケプラーとタヴは、イソメラーゼの可
溶性を試みるためによく受け入れられた可溶化方法（例えばキレート化剤、有機
溶媒、高濃度の塩、界面活性剤）を使用した、彼らの広範囲であるが成功しなか
った努力について説明した。更に、パークらによって最終的に報告された推定イ
ソメラーゼの１９ｋＤ分子量とは対照的に、主要なイソメラーゼ活性は精製の間
にカラムから非常に早い時期に溶出された。これは、見かけ分子量が１９ｋＤで
はなく数百ｋＤであることを示した。この初期の物質をフェニルセファロース４
Ｂカラムにかけると、多数の活性の広幅ピークが観察された。これは一般的でな
く、イソメラーゼ調製物が異合であり、適切に可溶化されておらず、他の膜タン
パク質と明らかに関係していることをやはり示している。その後、そのような活
性ピークのうちの１つを、セファロース６ゲルろ過カラムにかけると、ゲル電気
泳動法上で１本の１９ｋＤバンドを生じた。最後に、パークらは、この試料を、
ＨＰＬＣ（種々の位置異性体を分解しないため、ＣＬＡの検出には適切していな
い）を使用して、イソメラーゼ活性に関して分析した。標準ＣＬＡに対して示さ
れた保持時間は、１９ｋＤ推定リノール酸イソメラーゼを使用してリノール酸か
ら形成した推定ＣＬＡに対する保持時間とは大きく異なっており、パークらは、
ピークがＣＬＡではなく何か他のものであったという確固たる結論に達するに至
っている。従って、本願発明者は、パークらによって示されたデータが、リノー
ル酸イソメラーゼが精製されたという結論を支持しないと考えている。
【００１０】 従って、リノール酸イソメラーゼ酵素を精製かつ同定し、および／または該酵
素を組換え技術によって生産する必要性がある。また、異性化用に脂肪酸中の遊
離カルボン酸グループの存在を必要としないリノール酸イソメラーゼ酵素を見つ
けて同定する必要性もある。さらに、細胞全体または単離リノール酸イソメラー
ゼ酵素を利用してＣＬＡを生産する方法の必要性もある。
【００１１】 （発明の概要） 本発明は、一般に、単離リノール酸イソメラーゼ核酸、単離リノール酸イソメ
ラーゼタンパク質、リノール酸イソメラーゼの活性を増大させる遺伝子修飾を有
する固定化細菌細胞、ならびにそのような核酸分子、タンパク質および細胞をＣ
ＬＡ生産のために使用する方法に関する。
【００１２】 本発明の１実施形態は、単離リノール酸イソメラーゼに関する。本発明には、
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ由来の
リノール酸イソメラーゼ、特に、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎ
ｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ
、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ、およ
びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来のリノール酸イソメラー
ゼが含まれる。特に好ましいリノール酸イソメラーゼは、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓかＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ
由来のリノール酸イソメラーゼである。１実施形態において、本発明の単離リノ
ール酸イソメラーゼは、リノール酸およびリノレン酸を、（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ
）−１０，１２−リノール酸、（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸
をＣＬＡに変換する。１実施形態では、該タンパク質は、少なくとも約１０ｎｍ
ｏｌｅｓＣＬＡ ｍｇ-1分-1のリノール酸異性化比活性を有している。
【００１３】 本発明の１実施形態は、以下から成るグループより選択されたアミノ酸配列を
含む単離タンパク質に関する：（ａ）配列番号４２、配列番号４３および配列番
号６１から成るグループより選択されたアミノ酸配列；（ｂ）配列番号６１の少
なくとも約１７０の隣接アミノ酸にわたって配列番号６１と少なくとも約３５％
同一のアミノ酸配列（つまり配列番号６１を含むタンパク質の同族体）；および
／または（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１５の隣接アミノ
酸を含むアミノ酸配列（つまり配列番号４２，４３または６１を含むタンパク質
の同族体）。この実施形態では、タンパク質がリノール酸イソメラーゼ酵素活性
を有している。１実施形態では、該タンパク質が、低程度、中程度、または高程
度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で配列番号６０の相補的配
列とハイブリダイズする核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。別の実
施形態では、該タンパク質が、配列番号６１の少なくとも３０の隣接アミノ酸、
より好ましくは配列番号６１の少なくとも４５の隣接アミノ酸、さらにより好ま
しくは配列番号６１の少なくとも６０の隣接アミノ酸を含むアミノ酸配列を有す
る。１実施形態では、該タンパク質は、配列番号６０の少なくとも２４の隣接ヌ
クレオチドを有する核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。好ましい実
施形態では、該タンパク質が、配列番号５９および配列番号６０から成るグルー
プより選択された核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。配列番号６０
が最も好ましい。別の好ましい実施形態では、該タンパク質が、配列番号４２，
配列番号４３および配列番号６１から成るグループより選択されたアミノ酸配列
を有し、配列番号６１が最も好ましい。別の実施形態では、タンパク質が、９の
最小マッチ、１．１０のギャップペナルティおよび０．３３のギャップ長ペナル
ティにしたＭａｒｔｉｎｅｚ／Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ ＤＮＡアラ
インメント方法を使用して、配列番号７３と整列するアミノ酸配列を有する。こ
のとき、アミノ酸配列中のアミノ酸残基は、配列番号７３中の非Ｘａａ残基の少
なくとも約７０％、別の実施形態では少なくとも約８０％、別の実施形態では少
なくとも約９０％と整列する。
【００１４】 １実施形態では、該タンパク質が可溶性酵素である。別の実施形態では、タン
パク質が、該タンパク質を発現する細胞の細胞膜へのタンパク質の挿入を引き起
こすリーダー配列を含む。１実施形態では、リノール酸イソメラーゼが固相支持
体に結合される。固相支持体には、人工膜、有機支持体、生体高分子支持体、無
機支持体を含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００１５】 本発明の別の実施形態は、本発明の単離リノール酸イソメラーゼに選択的に結
合する単離抗体に関する。 本発明のさらに別の実施形態は、リノール酸、リノレン酸および／またはその
誘導体から成るグループから選択した化合物を含有する油を、該化合物の少なく
とも一部をＣＬＡまたはその誘導体に変換する（例えば基質が誘導体である場合
に）ために、本発明の単離リノール酸イソメラーゼ酵素と接触させる工程から成
る、ＣＬＡまたはその誘導体の生産方法に関する。１実施形態では、化合物がト
リグリセリドの形をしており、該方法はトリグリセリドの少なくとも一部を遊離
脂肪酸に変換するために油と加水分解酵素を接触させることをさらに含んでいる
。そのような加水分解酵素には、リパーゼ、ホスホリパーゼおよびエステラーゼ
が含まれる。本発明の方法は、さらに、ＣＬＡを回収するステップを含み得る。
ＣＬＡは、好ましくは（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−ｌ０，１２−リノール酸または
（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸である。油には、ヒマワリ油、
ベニバナ油、コーン油、亜麻仁油、パーム油、菜種油、イワシ油、ニシン油、か
らし油、落花生油、胡麻油、紫蘇油、綿実油、大豆油、脱水ひまし油およびクル
ミ油が含まれるが、それらに限定されるわけではない。 方法の１実施形態では
、リノール酸イソメラーゼ酵素が、固相支持体に結合され、該固相支持体には、
固相支持体には、人工膜、有機支持体、生体高分子支持体、無機支持体を含まれ
るが、それらに限定されるわけではない。
【００１６】 本発明の別の実施形態は、以下から成るグループより選択された核酸配列を含
む単離核酸分子に関する：（ａ）リノール酸イソメラーゼ酵素活性を有し、かつ
配列番号４２、配列番号４３および配列番号６１から成るグループより選択され
たアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列；（ｂ）リノール酸イ
ソメラーゼ酵素活性を有し、かつ配列番号６１の少なくとも約１７０の隣接アミ
ノ酸にわたって配列番号６１と少なくとも約３５％同一のアミノ酸配列を有する
（ａ）のタンパク質の同族体をコードする核酸配列；（ｃ）リノール酸イソメラ
ーゼ酵素活性を有し、（ａ）の前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１５の隣接
アミノ酸を含むアミノ酸配列を有する（ａ）のタンパク質の同族体をコードする
核酸配列；および／または、（ｄ）核ａ），（ｂ），（ｃ）のいずれかの核酸配
列に対して完全に相補的な核酸配列。１実施形態では、（ｂ）の核酸配列が、低
程度、中程度、または高程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
で配列番号６０の相補的配列とハイブリダイズする。
【００１７】 別の実施形態では、該同族体が、配列番号６１の少なくとも３０の隣接アミノ
酸、より好ましくは配列番号６１の少なくとも４５の隣接アミノ酸、さらにより
好ましくは配列番号６１の少なくとも６０の隣接アミノ酸を含むアミノ酸配列を
有する。別の実施形態の中では、（ｂ）の核酸配列は、配列番号６０の少なくと
も２４の隣接ヌクレオチドを有する。核酸分子は、配列番号５９および配列番号
６０から成るグループより選択された核酸配列を好ましくは有し、配列番号６０
が最も好ましい。好ましくは、核酸分子は、配列番号４２、配列番号４３および
配列番号６１から成るグループより選択されたアミノ酸配列をコードする核酸配
列を有し、配列番号６１が最も好ましい。
【００１８】 本発明の単離核酸分子は、ＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＣｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍを含むがそれらに限定されるわけではない微生物由来のリノー
ル酸イソメラーゼ核酸分子を包含する。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎ
ｉｃｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ
、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓが特に好ましい。最も
好ましいリノール酸イソメラーゼ核酸分子はＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ａｃｎｅｓかＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来のもので
ある。
【００１９】 さらに本発明には、本発明の単離核酸分子を含む組換え分子、組換えウイルス
および組換え細胞が包含される。１実施形態において、本発明の組換え細胞はＰ
ｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇ
ｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓが含まれるがそ
れらに限定されない微生物に由来するが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉ
ｆｏｒｍｉｓが最も好ましい。
【００２０】 本発明のさらに別の実施形態は、上に説明したようなリノール酸イソメラーゼ
をコードする単離核酸分子で形質導入した組換え細胞を培養する工程から成る、
リノール酸イソメラーゼの生産方法に関する。
【００２１】 本発明の別の実施形態は、リノール酸、リノレン酸および／またはその誘導体
から成るグループから選択した化合物を含有する油を、該化合物の少なくとも一
部をＣＬＡまたはその誘導体に変換するために、本発明の単離核酸分子によりコ
ードされた本発明の単離リノール酸イソメラーゼ酵素と接触させる工程から成る
、ＣＬＡまたはその誘導体の生産方法に関する。
【００２２】 本発明のさらに別の実施形態は、リノール酸イソメラーゼの活性を増加する遺
伝的修飾を有する固定化細胞に関する。該細胞は、固定化細菌細胞、真菌類細胞
（例えば酵母）、微小藻類細胞、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳類細胞を初め
とする任意の細胞であってよい。１実施形態では、細胞は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓまたは酵母細胞を含むがそれらに制限されない微生物である。
【００２３】 １実施形態では、遺伝的修飾により、該細胞によるリノール酸イソメラーゼの
過剰発現が起こる。遺伝的修飾により、リノール酸イソメラーゼの少なくとも１
つのアミノ酸残基の欠失、挿入、逆位、置換および誘導体化から成るグループよ
り選択された、少なくとも１つのアミノ酸修飾が生じ得る。そのような修飾によ
り、リノール酸イソメラーゼ活性が増大するか、基質阻害が減少するか、および
／または生成物阻害が減少する。別の実施形態では、遺伝的修飾が、本発明のリ
ノール酸イソメラーゼをコードする組換え核酸分子による細胞の形質導入を包含
し、その場合、組換え核酸分子は転写調節配列と機能的に連結している。組換え
核酸分子は、リノール酸イソメラーゼ同族体をコードする核酸配列を初めとする
、上述の単離核酸分子のうちのいずれかであり得る。
【００２４】 １実施形態では、組換え核酸分子が細胞のゲノムに組み込まれる。別の実施形
態では、組換え核酸分子がプラスミドにより形質導入／形質転換される。別の実
施形態では、リノール酸イソメラーゼをコードする組換え核酸分子が、リノール
酸イソメラーゼの活性を増大させる遺伝的修飾を含む。また、別の実施形態では
、遺伝的修飾により、リノール酸イソメラーゼの基質および／または生成物の阻
害を減少する。
【００２５】 別の実施形態では、本発明の固定化細胞は溶解することが可能である。細胞は
、グルタルアルデヒドを含むがそれに限定されない二機能または多機能の架橋剤
で架橋により固定化することが可能である。
【００２６】 本発明のさらに別の実施形態は、リノール酸、リノレン酸およびその誘導体か
ら成るグループから選択した脂肪酸を含有する油を、該化合物の少なくとも一部
をＣＬＡまたはその誘導体に変換するために、リノール酸イソメラーゼ活性を有
する固定化細胞と接触させる工程から成る、ＣＬＡまたはその誘導体の生産方法
に関する。そのような細胞については上述している。上述したように、該細胞は
、リノール酸イソメラーゼを有する天然細菌細胞または遺伝子修飾微生物のよう
な遺伝子組み換え細胞であり得る。好ましくは、遺伝子組み換え細胞のリノール
酸イソメラーゼ活性は増大している。脂肪酸には、トリグリセリドの少なくとも
一部を遊離脂肪酸に変換するために脂肪酸をトリグリセリドの形で含み得る。該
方法の他の特徴は、該方法の他の特徴は、ＣＬＡの生産方法において上述したと
おりである。
【００２７】 本発明の別の実施形態は、単離リパーゼ様タンパク質に関する。そのようなタ
ンパク質は、（ａ）配列番号６４；および（ｂ）配列番号６４と少なくとも約３
５％同一な配列番号６４の同族体から成るグループより選択されたアミノ酸配列
を有する。１実施形態では、該タンパク質が、中程度または高程度ストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件で配列番号６３の相補的配列とハイブリダイ
ズする核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。別の実施形態では、該タ
ンパク質が、配列番号６３の少なくとも２４の隣接ヌクレオチドを有する核酸配
列によってコードされ、より好ましくは、該タンパク質は配列番号６３によって
表わされる核酸配列を有する核酸分子によってコードされる。１実施形態では、
タンパク質が配列番号６４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、該タンパ
ク質が、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｎｏ．ＰＳ５０１８７によ
って示されたエステラーゼ／リパーゼ／チオエステラーゼ活性部位を有するアミ
ノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、該タンパク質は、Ｐｒｏｆｉｌ
ｅＳｃａｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｎｏ．ＧＣ０２６５によって示されたカルボキシ
エステラーゼタイプＢ活性部位を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、タン
パク質はリパーゼ酵素活性を有している。さらに、本発明には、上述のリパーゼ
様タンパク質のうちの任意のものをコードする核酸配列を有する単離核酸分子も
包含される。
【００２８】 本発明のさらに別の実施形態は、単離アセチルトランスフェラーゼ様タンパク
質に関する。そのようなタンパク質は、以下から成るグループより選択されたア
ミノ酸配列を含む：（ａ）配列番号６９；および（ｂ）配列番号６９の少なくと
も約６０の隣接アミノ酸にわたって配列番号６９と少なくとも約４０％同一な配
列番号６９の同族体。１実施形態では、該タンパク質が、中または高程度にスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件で配列番号６８の相補的配列とハイ
ブリダイズする核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。別の実施形態で
は、タンパク質が、ＰｒｏＳｃａｎＰｒｏｆｉｌｅ Ｎｏ．ＰＦ００５８３によ
って示されたアセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡＴ）ファミリープロファイル
を表示するアミノ酸配列を含む。好ましくは、タンパク質はアセチルトランスフ
ェラーゼ酵素活性を有している。さらに、本発明には、上述の同定されたアセチ
ルトランスフェラーゼタンパク質のうちの任意のものをコードする核酸配列を有
する単離核酸分子も包含される。
【００２９】 （発明の詳細な説明） 本発明の１実施形態は単離リノール酸イソメラーゼ酵素である。本発明によれ
ば、単離リノール酸イソメラーゼを使用して、脂肪酸、脂肪酸の誘導体および／
または関連する分子中に共役二重結合を生産することが可能である。特に、単離
リノール酸イソメラーゼを使用して、リノール酸、リノレン酸またはそれらの誘
導体から、ＣＬＡ（例えば（ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ）−６，９，１２
−オクタデカトリエン酸（１８：３）（γ−リノレン酸）；（ｃｉｓ，ｃｉｓ，
ｃｉｓ，ｃｉｓ）−６，９，１２，１５オクタデカテトラエン酸（１８：４）（
ステアリドン酸）；（ｃｉｓ，ｃｉｓ）−１１，１４エイコサジエン酸（２０：
２）；ＣＬＡのメチルエステルおよび分岐形式）を生産することが可能である。
より詳細には、単離リノール酸イソメラーゼは、リノール酸を共役へのリノール
酸へおよび／またはリノレン酸を共役リノレン酸へ変換することが可能である。
用語「共役」とは、不飽和化合物中の単結合と交互に並んだ２つ以上の二重結合
を有している分子のことを指す。リノール酸イソメラーゼは、９，１２−ジエン
部分を有するリノール酸および他の不飽和脂肪酸を９，１１−モノエン部分を含
む他の脂肪酸にさらに代謝される９，１１−共役ジエン部分に変換する、微生物
中の生体内水素化経路の一部である。例えば、大半のリノール酸イソメラーゼは
、（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１２−リノール酸を、生体内水素化経路の中間
体としての（ｃｉｓ，ｃｉｓ）９，１１−リノール酸に変換する。多くの場合で
は、ＣＬＡの形成に続いて、他のＣＬＡ異性体への代謝や、モノエン脂肪酸等の
非ＣＬＡ化合物への代謝が起こる。しかしながら、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｒｅｕｔｅｒｉはＣＬＡを生産し最終産物としてＣＬＡを蓄積する。Ｐｒｏｐ
ｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ等の他の微生物は、（ｃｉｓ，ｃｉｓ
）−９，１１−リノール酸を（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−リノール酸
に変換するリノール酸イソメラーゼを生産する。本発明によれば、用語「ＣＬＡ
」は、本明細書では共役リノール酸および共役リノレン酸の両方について説明す
る総括的な用語として使用し、用語「ＣＬＡ誘導体」は、リノール酸かリノレン
酸の誘導体から形成されるＣＬＡの誘導体について説明するために使用する。そ
のようなＣＬＡ誘導体には、ＣＬＡ脂質、ＣＬＡメチルエステル、およびＣＬＡ
の分岐型が含まれるが、それらに限定されるわけではない。例えば、リノール酸
またはリノレン酸の誘導体（例えば（ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ）−６，９，１２
−オクタデカトリエン酸（１８：３）（γ−リノレン酸）；（ｃｉｓ，ｃｉｓ，
ｃｉｓ，ｃｉｓ）−６，９，１２，１５−オクタデテトラエン酸（１８：４）（
ステアリドン酸）；（ｃｉｓ，ｃｉｓ）−１１，１４エイコサジエン酸（２０：
２））を基質として使用して、ＣＬＡ脂質誘導体を形成することが可能である。
【００３０】 用語「単離リノール酸イソメラーゼ」とは、リノール酸イソメラーゼ活性を有
する粗抽出物に対する有意な活性の増加を達成するのに十分純粋な形式をした、
自然環境の外側にあるリノール酸イソメラーゼを指す。そのようなリノール酸イ
ソメラーゼには、精製リノール酸イソメラーゼ、組換えにより生成されたリノー
ル酸イソメラーゼ、膜結合リノール酸イソメラーゼ、脂質と複合化したリノール
酸イソメラーゼ、人工膜を有するリノール酸イソメラーゼ、可溶化リノール酸イ
ソメラーゼ、および他のタンパク質を含む単離リノール酸イソメラーゼが含まれ
るが、それらに限定されるわけではない。「人工膜」とは、リノール酸イソメラ
ーゼを有する、天然の膜の一部ではないすべての膜状構造のことを指す。単離リ
ノール酸イソメラーゼについては、１９９８年１２月２３日に出願された関連の
米国特許出願番号第０９／２２１，０１４号に説明されており、その全体は引用
により本明細書に組み込まれる。
【００３１】 本発明の単離リノール酸イソメラーゼは、その比活性により特徴付けられる。
「比活性」とは、酵素によるリノール酸のＣＬＡへの変換速度のことを指す。よ
り詳しくは、比活性とは、単位時間当たりの酵素の１ｍｇ当たりのＣＬＡに変換
されたリノール酸の分子の数を指す。好ましくは、本発明の単離リノール酸イソ
メラーゼは、約１０ｎｍｏｌｅｓ ＣＬＡ ｍｇ-1分-1以上、より好ましくは約
２５ｎｍｏｌｅｓ ＣＬＡ ｍｇ-1分-1以上、好ましくは約１００ｎｍｏｌｅｓ
ＣＬＡ ｍｇ-1分-1以上、より好ましくは約２５０ｎｍｏｌｅｓ ＣＬＡ ｍ
ｇ-1分-1以上、より好ましくは約５００ｎｍｏｌｅｓ ＣＬＡ ｍｇ-1分-1以上
、好ましくは約１０００ｎｍｏｌｅｓ ＣＬＡ ｍｇ-1分-1以上、さらにより好
ましくは約１０，０００ｎｍｏｌｅｓ ＣＬＡ ｍｇ-1分-1以上の比活性を有す
る。
【００３２】 単離リノール酸イソメラーゼを特徴付ける別の方法は、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−
Ｍｅｎｔｅｎ定数（Ｋm）による。Ｋmは定常状態の条件下での酵素−リノール酸
複合体の動力学的（つまり速度）定数である。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ由来の単離リノール酸イソメラーゼは、約７．５のｐＨ値
、約２０℃の温度で、リノール酸に対して少なくとも約８．１μＭのＫmを有し
ている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来の単離リノール酸
イソメラーゼは、約７．５のｐＨ値、約２０℃の温度で、リノール酸に対して少
なくとも約１１．３μＭのＫmを有している。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ａｃｎｅｓ由来の単離リノール酸イソメラーゼは、約７．５のｐＨ値、約
２０℃の温度で、リノール酸に対して少なくとも約１７．２μＭのＫmを有して
いる。
【００３３】 リノール酸イソメラーゼを特徴付けるさらに別の方法は、オレイン酸阻害速度
定数（Ｋi）による。詳しくは、Ｋiは酵素−オレイン酸複合体の解離速度である
。例えば本発明の単離（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸イソメラ
ーゼは約７．５のｐＨ値、約２０℃の温度で、約２０μＭ〜約１００μＭのＫi
を有し、より好ましくは約５０μＭ〜約１００μＭまで、さらにより好ましくは
１００μＭより大きいＫiを有する。阻害が起こらないことが最も好ましい。
【００３４】 単離リノール酸イソメラーゼを特徴付けるまた別の方法は、その初速度（つま
り生成物形成の初速度）（ｖ0）による。初速（ｖ0）とは、酵素によるリノール
酸のＣＬＡへの初期変換速度のことを指す。詳しくは、初速とは、単位時間当た
りの酵素１ｍｇ当たりのＣＬＡに変換されたリノール酸の分子の数のことを指す
。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉまたはＣｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来の単離リノール酸イソメラーゼ等の単離９
，１１−リノール酸イソメラーゼの最大初速度は、約７．５のｐＨ値で、約１０
０ｎｍｏｌｅｓ／分／ｍｇタンパク質以上、より好ましくは約１，０００ｎｍｏ
ｌｅｓ／分／ｍｇタンパク質以上、最も好ましくは約１０，０００ｎｍｏｌｅｓ
／分／ｍｇタンパク質以上である。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃ
ｎｅｓ由来の単離リノール酸イソメラーゼ等の単離１０，１２−リノール酸イソ
メラーゼの最大の初速度は、約７．３のｐＨ値で、約１０ｎｍｏｌｅｓ／ｍｉｎ
／ｍｇタンパク質以上、より好ましくは約１，０００ｎｍｏｌｅｓ／ｍｉｎ／ｍ
ｇタンパク質以上、最も好ましくは約１０，０００ｎｍｏｌｅｓ／ｍｉｎ／ｍｇ
タンパク質以上である。
【００３５】 単離リノール酸イソメラーゼはさらにその最適ｐＨによっても特徴付けること
が可能である。最適ｐＨとは、リノール酸イソメラーゼが最大初速を有するｐＨ
値のことを指す。好ましくは、最適ｐＨは、約５〜約１０の間、より好ましくは
約６〜９の間、より好ましくは約６〜約８の間、最も好ましくは約６．８と約７
．５の間である。例えば、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉまたはＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ
由来のリノール酸イソメラーゼに対する最適ｐＨは約７．５である。Ｐ．ａｃｎ
ｅｓ由来のリノール酸イソメラーゼに対する最適ｐＨは約６．８〜約７．３まで
あり、最も好ましくは約７．３である。
【００３６】 本発明の単離リノール酸イソメラーゼのさらなる実施形態は、下に説明する任
意の核酸分子によってコードされるタンパク質である。本明細書で使用する場合
、単離リノール酸イソメラーゼとは、完全長リノール酸イソメラーゼタンパク質
、融合タンパク質またはそのようなタンパク質の任意の同族体のことを包含する
。本発明によれば、リノール酸イソメラーゼタンパク質の同族体には、少なくと
も１または数個の（ただし１または数個に限定されるわけではない）アミノ酸が
欠失（例えばペプチドかフラグメントのようにタンパク質が切断されたもの）、
挿入、逆位、置換、および／または誘導体化（例えばグリコシル化、リン酸化、
アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化、アミド化、および
／またはホスファチジルイノシトールの付加）されたリノール酸イソメラーゼタ
ンパク質が包含される。リノール酸イソメラーゼタンパク質の同族体は、配列番
号４２、配列番号４３または配列番号６１の少なくとも１５の隣接アミノ酸残基
を含む（つまり配列番号４２、配列番号４３または配列番号６１の１５の隣接ア
ミノ酸残基が１００％同一の）アミノ酸配列を有するタンパク質であり、好まし
くは配列番号４２または配列番号６１の少なくとも３０の隣接アミノ酸残基を有
している。好ましい実施形態では、リノール酸イソメラーゼアミノ酸配列の同族
体は、４５以上、より好ましくは６０以上、より好ましくは１２０以上、さらに
より好ましくは２４０以上の配列番号６１の隣接アミノ酸残基を含むアミノ酸配
列を有している。リノール酸イソメラーゼタンパク質の同族体は、２４以上、よ
り好ましくは４５以上、より好ましくは９０以上、より好ましくは１８０以上、
より好ましくは３６０以上、さらに好ましくは７２０以上の配列番号６０の隣接
ヌクレオチドを含む核酸配列によってコードされたタンパク質を有している。好
ましい実施形態では、リノール酸イソメラーゼタンパク質の同族体は、測定可能
なリノール酸イソメラーゼ酵素活性（つまり、生物活性）を有している。リノー
ル酸イソメラーゼ生物活性の検出および測定方法は、実施例の部分で詳細に説明
する。別の実施形態では、リノール酸イソメラーゼ同族体は、測定可能なリノー
ル酸イソメラーゼ酵素活性を有していても有していなくてもよいが、抗体の作製
または他のリノール酸イソメラーゼを同定するのに役立つオリゴヌクレオチドの
作製のために使用される。
【００３７】 本発明によれば、本明細書で説明している核酸またはアミノ酸配列に関する用
語「隣接する」または「連続する」とは、間断のない配列に接続されていること
を意味する。例えば、第１の配列が第２の配列の１５の連続する（または連続す
る）アミノ酸を含む場合、第１の配列は第２の配列の１５アミノ酸残基の間断の
ない配列と１００％同一の、１５アミノ酸残基の間断のない配列を含むことを意
味する。同様に、第１の配列が第２の配列に対して「１００％の同一性」を有す
るとは、第１の配列がヌクレオチド間またはアミノ酸間のギャップがない状態で
第２の配列とぴったり適合することを意味する。
【００３８】 １実施形態において、リノール酸イソメラーゼタンパク質同族体は、配列番号
６１の少なくとも約１７０の隣接アミノ酸にわたって配列番号６１と少なくとも
約３５％同一のアミノ酸配列を有する。好ましくは、リノール酸イソメラーゼタ
ンパク質同族体は、配列番号６１の約１７０以上のアミノ酸、より好ましくは配
列番号６１の約２００のアミノ酸以上、より好ましくは約２５０以上のアミノ酸
、より好ましくは約３００以上のアミノ酸、より好ましくは約３５０以上のアミ
ノ酸、さらに好ましくは約４００以上のアミノ酸にわたって、約４５％以上、よ
り好ましくは約５５％以上、より好ましくは約６５％以上、より好ましくは約７
５％以上、より好ましくは約８５％以上、さらにより好ましくは約９５％以上が
配列番号６１と同一のアミノ酸配列を有する。上に述べたように、そのようなリ
ノール酸イソメラーゼタンパク質同族体は、好ましくはリノール酸イソメラーゼ
酵素活性（例えば（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−リノール酸イソメラー
ゼ酵素活性または（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸イソメラーゼ
活性）を有している。本発明によれば、用語「（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，
１２−リノール酸イソメラーゼ活性」と「１０，１２−リノール酸イソメラーゼ
活性」は互換的に使用することが可能である。該用語は、リノール酸および／ま
たはリノレン酸を（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−リノール酸に変換する
ことが可能なリノール酸イソメラーゼの酵素活性のことを指す。同様に、用語「
（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸イソメラーゼ活性」と「９，１
１−リノール酸イソメラーゼ活性」は互換的に使用することが可能である。該用
語は、リノール酸および／またはリノレン酸を（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１
１−リノール酸に変換することが可能なリノール酸イソメラーゼの酵素活性のこ
とを指す。
【００３９】 本明細書で使用する場合、別段の定めがない限り、パーセント（％）相同性と
は、次のものを使用して実行される相同性の評価のことを指す：（１）標準のデ
フォルトパラメータを用いてアミノ酸検索に対してｂｌａｓｔｐ、核酸検索に対
してｂｌａｓｔｎを使用するＢＬＡＳＴ２．０Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴ相同性検
索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）
。ここでは、デフォルトにより領域の複雑さを下げるためにクエリ配列をフィル
タにかける。（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，Ｓｃｈ
ａａｆｅｒ、Ａ．Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｍｉｌｌｅｒ，
Ｗ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．）（１９９７）“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａ
ｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｒｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ．”Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，この全体は引用により本
明細書に組み込まれる）；（２）ＢＬＡＳＴ ２アラインメント（下に説明する
パラメータを使用）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ ｖ／ＢＬＡＳＴ ）；または（３）ＢＬＡＳＴ ２．０およびＢＬＡＳＴ ２の両
方。ＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ ２の間には標
準パラメータの差があるため、ＢＬＡＳＴ ２プログラムを使用すると２つの特
定の配列が有意な相同性を有していると認識されるのに対して、その配列のうち
の１つをクエリ配列として使用してＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳ
Ｔで実行した検索では２つ目の配列を最上位のマッチで識別しない可能性がある
ことに留意する。従って、パーセント相同性は上記プログラムの１つまたは両方
を使用して決定することが可能である。
【００４０】 特定の２つの配列は、ＴａｔｕｓｏｖａとＭａｄｄｅｎ，（１９９９），“Ｂ
ｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ −ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍ
ｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｓ”ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０（
この文献全体は引用により本明細書に組み込まれる）に説明されるように、ＢＬ
ＡＳＴ ２配列を使用して互いに整列させることが可能である。ＢＬＡＳＴ ２
配列アラインメントは、２つの配列間でＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡ
ＳＴ ２．０）を実行して生じたアラインメントにギャップ（欠失と挿入）を導
入するために、ＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムを使用してｂｌａｓｔｐまたは
ｂｌａｓｔｎにおいて実行される。ここでは明瞭にするために、ＢＬＡＳＴ ２
配列アラインメントを以下のような標準デフォルトパラメータを使用して実行す
る。
【００４１】 ｂｌａｓｔｎの場合（０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用）： マッチに対するリワード＝１ ミスマッチに対するペナルティ＝−２ 開放ギャップ（５）および延長ギャップ（２）ペナルティ ギャップｘドロップオフ（５０）ｅｘｐｅｃｔ（１０）単語サイズ（１１）フィ
ルタ（ｏｎ） ｂｌａｓｔｐの場合（０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用）： 開放ギャップ（１１）および延長ギャップ（１）ペナルティ ギャップｘドロップオフ（５０）ｅｘｐｅｃｔ（１０）単語サイズ（３）フィル
タ（ｏｎ）
【００４２】 実施形態によっては、示されるように、２つのアミノ酸配列間のパーセント相
同性を整列させて計算するために、Ｍａｒｔｉｎｅｚ／Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗ
ｕｎｓｃｈ ＤＮＡアラインメント方法を使用する。この方法はＤＮＡＳＴＡＲ
プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ社、ウィスコンシン州マディソン所在）内のモジュ
ールであるＬａｓｅｒｇｅｎｅ ＭｅｇＡｌｉｇｎによって与えられ、標準デフ
ォルトパラメータは以下のものが使用される： （１）最小マッチ＝９； （２）ギャップペナルティ＝１．１０； （３）ギャップ長ペナルティ＝０．３３。
【００４３】 別の実施形態では、リノール酸イソメラーゼ同族体を含めたリノール酸イソメ
ラーゼが、同族体をコードする核酸配列が天然リノール酸イソメラーゼをコード
する核酸分子（つまり天然リノール酸イソメラーゼアミノ酸配列をコードする核
酸鎖の相補的配列）に対して低程度、中程度、または高程度にストリンジェント
な条件でハイブリダイズする（以下に説明する）程に天然リノール酸イソメラー
ゼのアミノ酸配列に十分類似したアミノ酸配列を有するタンパク質である。好ま
しくは、リノール酸イソメラーゼタンパク質の同族体は、配列番号４２、配列番
号４３または配列番号６１によって表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質を
コードする核酸分子の相補的配列と、低程度、中程度、または高程度にストリン
ジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列を含む核酸分子によってコードさ
れる。さらにより好ましくは、リノール酸イソメラーゼタンパク質の同族体は、
配列番号６０の相補的配列と、低程度、中程度、または高程度にストリンジェン
トな条件でハイブリダイズする核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。
そのようなハイブリダイゼーション条件を以下に詳細に説明する。本発明のリノ
ール酸イソメラーゼをコードする核酸配列の相補的核酸配列とは、リノール酸イ
ソメラーゼをコードする核酸配列鎖に対して相補的な（つまり、完全な二重螺旋
を形成することが可能な）核酸鎖の核酸配列のことを指す。所与アミノ酸配列を
コードする二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡと、その一本鎖ＤＮＡと相補的な配列
を有するその相補鎖とから成ることを理解する。そのため、本発明の核酸分子は
、二本鎖でも一本鎖でもよく、かつ、配列番号４２、配列番号４３または配列番
号６１から成るグループより選択されたアミノ酸配列をコードする核酸配列と、
および／または配列番号４２、配列番号４３または配列番号６１から成るグルー
プより選択されたアミノ酸配列をコードする核酸の相補的配列と、ストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件で安定したハイブリッドを形成する核酸分子
からなる。相補的配列を導き出す方法は当業者によく知られている。アミノ酸配
列決定および核酸配列決定技術に誤差が全くないわけではないので、ここで示し
た配列がせいぜい本発明のリノール酸イソメラーゼの見かけの配列を表わすにす
ぎないことに注意すべきである。
【００４４】 リノール酸イソメラーゼ同族体は、天然対立遺伝子変化または自然突然変異の
結果生じ得る。本発明のリノール酸イソメラーゼ同族体は、タンパク質に対する
直接修飾や、ランダムまたは標的突然変異誘発を達成すべく例えば古典的または
組換えＤＮＡ技術を使用した該タンパク質をコードする遺伝子の修飾を始めとす
る、当該技術分野において周知の技術を使用しても生産することが可能であるが
、技術はそれらに限定されるわけではない。リノール酸イソメラーゼコードする
核酸の天然対立変異型は、アミノ酸配列をコードするかは配列番号４２、配列番
号４３または配列番号６１から成るグループから選択されたアミノ酸配列をコー
ドするが、例えば突然変異または組換えによって引き起こされた自然な変化によ
り、類似しているが同一でない配列を有する遺伝子として、ゲノム中の実質的に
同じ１つの座（または複数の座）で生じる遺伝子である。
【００４５】 天然対立変異型は、一般に、比較されている遺伝子によってコードされたタン
パク質の活性と同様の活性を有しているタンパク質をコードする。対立変異型の
１つのクラスは同じタンパク質をコードし得るが、遺伝子コードの縮重のため異
なる核酸配列を有する。対立変異型はさらに、その遺伝子の５’または３’非翻
訳領域（例えば調節制御領域）に変化を有し得る。対立変異型は当業者に周知で
あり、ゲノムが半数性および／または２つ以上の細菌種のグループ中に存在する
ので、所与の細菌種内で見出だされると予想される。
【００４６】 リノール酸イソメラーゼタンパク質には、融合遺伝子（例えば、組換え酵素の
可溶な活性形式を過剰発現するために使用）、突然変異遺伝子（例えば、遺伝子
の転写および翻訳を増強するためのコドン修飾部を有する遺伝子、および切断遺
伝子（例えば、膜酵素の可溶形式を生成するために膜結合ドメインを除去した遺
伝子や、特定の組換え宿主中での許容度が低いシグナル配列を除去した遺伝子）
の発現生成物が含まれる。本発明のリノール酸イソメラーゼタンパク質およびタ
ンパク質同族体には、リノール酸イソメラーゼ酵素活性を有していないタンパク
質が包含されることに注意する。そのようなタンパク質は、例えば、抗体作製や
診断検定に有用である。
【００４７】 完全長タンパク質、切断タンパク質、融合タンパク質、およびその同族体を含
めた本発明の単離リノール酸イソメラーゼは、次のような直接的な方法で同定す
ることが可能である：実施例で説明するような、リノール酸および／またはリノ
レン酸をＣＬＡに変換する該タンパク質の能力；実施例で説明するような該タン
パク質の生化学的特性；リノール酸イソメラーゼに対する抗体への選択的結合；
および／または実施例に開示したような他のリノール酸イソメラーゼアミノ酸お
よび核酸配列との相同性。詳しくは、本発明の単離リノール酸イソメラーゼは、
リノール酸および／またはリノレン酸を（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−
リノール酸または（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸に変換するこ
とが可能である。
【００４８】 本発明のタンパク質および／または同族体の最小サイズは、リノール酸イソメ
ラーゼ生物活性を有するのに十分なサイズであるか、または、該タンパク質がそ
のような酵素活性を有する必要がない場合には、本発明のリノール酸イソメラー
ゼに関連する別の目的（例えば天然リノール酸イソメラーゼに結合する抗体の生
産）に役立つのに十分なサイズである。そのため、本発明のリノール酸イソメラ
ーゼタンパク質または同族体の最小サイズは、抗体が認識可能な１以上のエピト
ープを形成するのに適切なサイズであり、典型的には、少なくとも８アミノ酸長
であり、より好ましくは１０、より好ましくは１５、より好ましくは２０、より
好ましくは２５、さらにより好ましくは３０アミノ酸長である。好ましい長さは
、そのようなタンパク質の完全長が望まれるか、多価（つまり各々が機能を有し
ている２以上のドメインを有する融合タンパク質）が望まれるか、または機能的
部分が望まれるかによって決まる。タンパク質がリノール酸イソメラーゼ（リノ
ール酸イソメラーゼ同族体を含む）の一部または完全長リノール酸イソメラーゼ
を含み得るという点で、該タンパク質の最大サイズについては、実際上の制限以
外に制限はない。
【００４９】 同様に、本発明の核酸分子の最小サイズは、リノール酸イソメラーゼ活性を有
するタンパク質をコードするのに十分なサイズか、抗体に結合する１以上のエピ
トープを含むタンパク質をコードするのに十分なサイズか、天然リノール酸イソ
メラーゼをコードする核酸分子の相補的配列と、（例えば低程度、中程度、高程
度にストリンジェントな条件で）安定なハイブリッドを形成可能なプローブまた
はオリゴヌクレオチドプライマーを形成するのに十分なサイズである。そのため
、そのようなタンパク質をコードする核酸分子のサイズは、核酸組成、核酸分子
とその相補的配列との間のパーセント相同性または同一性、ならびにハイブリダ
イゼーション条件それ自身（例えば温度、塩濃度およびホルムアミド濃度）に左
右され得る。オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブとして使用される核
酸分子の最小サイズは、核酸分子のＧＣ含量が豊富な場合には通常、約１２〜約
１５ヌクレオチド長であり、ＡＴ含量が豊富な場合には、約１５〜約１８塩基長
である。核酸分子がリノール酸イソメラーゼをコードする配列の一部、完全長リ
ノール酸イソメラーゼをコードする核酸配列（リノール酸イソメラーゼ遺伝子を
含む）または同義遺伝子、またはその一部を含み得るという点で、本発明の核酸
分子の最大サイズについては、実際上の制限以外に制限はない。
【００５０】 本発明の好ましいリノール酸イソメラーゼは、配列番号４２および／または配
列番号６１から選択されたアミノ酸配列に対して、約３５％以上、より好ましく
は約４０％以上、より好ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上、
より好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約
９０％以上同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質から成る。また、本発明の
好ましいリノール酸イソメラーゼは、配列番号４２および／または配列番号６１
、もしくは配列番号４３から選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質から成る
。本発明の好ましいリノール酸イソメラーゼはさらに、ＰＰＡＩＳＯＭ35（ＰＣ
ＬＡ35としても知られている）、および／またはＰＰＡＩＳＯＭ424またはＰＣ
ＬＡ21から選択されたタンパク質を含むタンパク質から成る。本発明のタンパク
質は、先頭に文字「Ｐ」を使用することにより、その見かけ上のサイズ（例えば
、下付文字「35」は３５のアミノ酸タンパク質である）により、その機能、基質
または生成物（例えばＣＬＡまたはＩＳＯＭは本発明のリノール酸イソメラーゼ
のことを指す）からの関連により、およびいくつかの例ではその入手源により（
例えば、ＰＰＡＩＳＯＭ424は約４２４長のアミノ酸であるＰｒｏｐｉｏｎｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ由来のリノール酸イソメラーゼタンパク質である
。）、タンパク質として識別することが可能である。上に論じたように、本明細
書で使用する場合、２つ以上のアミノ酸配列間のパーセント相同性は、ＢＬＡＳ
Ｔ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴ検索またはアラインメントを使用して、標
準デフォルトパラメータを用いて決定される。
【００５１】 本発明の１実施形態では、単離リノール酸イソメラーゼは推定ＮＡＤ／ＦＡＤ
結合ドメインを含む。好ましくは、ＮＡＤ／ＦＡＤ結合ドメインは、ｗｗｗ．ｅ ｘｐａｓｙ．ｃｈ のＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎからのＰＲＯＳＩＴＥ Ｐｒｏｆｉ
ｌｅ Ｎｏ．ＰＳ５０２０５に相当する。そのようなＮＡＤ／ＦＡＤ結合ドメイ
ンは、サイン配列Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−（Ｘａａ）2−Ｇｌｙ−（Ｘａａ）3 −Ａｌａ−（Ｘａａ）6−Ｇｌｙを有している（配列番号７３の１〜２１位置、
配列番号７３の１４−１７位置からの４つの追加Ｘａａ残基をマイナスする）。
実施例１３に述べるように、そのような配列は様々な酵素の中に存在する。例え
ば、配列番号７３と別の配列のような２以上の配列を整列させて、そのような配
列間の相同性／パーセント同一性を比較するために、ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳ
ＴＡＲ社、ウィスコンシン州マディソン）に含まれるモジュールを、好ましくは
使用する。詳しくは、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を整列かつ計算
するために、Ｍａｒｔｉｎｅｚ／Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ ＤＮＡア
ラインメント法を特に使用する。この方法は、本明細書では標準デフォルトパラ
メータとも称する以下のパラメータを用いて、ＤＮＡＳＴＡＲプログラム内のＬ
ａｓｅｒｇｅｎｅ ＭｅｇＡｌｉｇｎモジュールによって与えられる： （１）最小のマッチ＝９； （２）ギャップペナルティ＝１．１０； （３）ギャップ長ペナルティ＝０．３３。
【００５２】 これらのパラメータを用いてＭａｒｔｉｎｅｚ／Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓ
ｃｈ法を使用し、例えば図５８に示したアミノ酸配列間の整列およびパーセント
同一性の計算を実行した。好ましい実施形態では、本発明の単離リノール酸イソ
メラーゼは、上に定義したようなＭａｒｔｉｎｅｚ／Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕ
ｎｓｃｈアラインメントプログラムを使用して、配列番号７３と整列するアミノ
酸配列を有する。アミノ酸配列中のアミノ酸残基は、配列番号７３中の非Ｘａａ
残基の約５０％以上と整列し、同一である。より好ましくは、本発明の単離リノ
ール酸イソメラーゼは、このアラインメントプログラムを用いると配列番号７３
と整列するアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列中のアミノ酸残基は配列番号７
３中の非Ｘａａ残基と、約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、より好ま
しくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上整列し、同一である。さら
により好ましくは、本発明の単離リノール酸イソメラーゼは、弱いマッチを含め
るよう感度を設定した正規化マッチスコア（ＮＳｃｏｒｅ）のための標準デフォ
ルトパラメータを使用して、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ ＰＲＯＳＩＴＥ Ｐｒｏ
ｆｉｌｅ Ｎｏ．ＰＳ５０２０５とのマッチを有しているとして識別されるアミ
ノ酸配列を含む。ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎプログラムは、ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ ．ｃｈ 、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ｓ （ＳＩＢ）：パターンとプロファイル検索のＥｘＰＡＳｙ（Ｅｘｐｅｒｔ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）プロテオミクスサーバを介し
て公にアクセスすることができる。
【００５３】 本発明は、さらに１以上の融合セグメントに付着された、リノール酸イソメラ
ーゼ（リノール酸イソメラーゼ同族体を含む）含有ドメインを含む融合タンパク
質も包含する。本発明に関して使用するのに適した融合セグメントには、タンパ
ク質の安定性を増強するセグメント；他の酵素（例えば９，１２−ジエン脂肪酸
を９，１２−脂肪酸に加水分解するリパーゼ、ホスホリパーゼ、またはエステラ
ーゼ）の活性を提供するセグメント；および／または（例えばアフィニティクロ
マトグラフィーによる）リノール酸イソメラーゼの精製を支援するセグメントが
含まれるが、それらに限定されるわけではない。適当な融合セグメントは、所望
の機能（例えば、安定性の増強、溶解度の増強、作用または活性の増大の付与；
エステルの加水分解等の他の酵素活性の提供；および／または、タンパク質精製
の簡素化）を有している任意のサイズのドメインである。融合セグメントは、該
タンパク質のリノール酸イソメラーゼ含有ドメインのアミノ末端および／または
カルボキシル末端に接続することが可能であり、リノール酸イソメラーゼの直接
的回収を可能にするために分断を受けやすい。融合タンパク質は、リノール酸イ
ソメラーゼ含有ドメインのカルボキシル末端および／またはアミノ末端のいずれ
か一方に付着された融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸分子
で形質導入した組換え細胞を培養することにより好ましくは生産される。
【００５４】 リノール酸イソメラーゼは、細菌と真菌類を含めた様々な微生物より単離する
ことが可能である。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏおよび
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ等の細菌種は、リノール酸イソメラーゼ活性を有してい
る。詳しくは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃ
ｎｅｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｐｒｏｐｉｏ
ｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉおよびＥｕｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｌｅｎｔｕｍ等の細菌種は、リノール酸イソメラーゼを有している。（ｔ
ｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−リノール酸イソメラーゼ活性を有する本発明
の微生物には、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌が含まれるが、そ
れに限定されるわけではない。（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸
イソメラーゼ活性を有する本発明の微生物には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ
属の細菌が含まれるが、それらに限定されるわけではない。Ｆｕｓｏｃｉｌｌｕ
ｓ、ＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓおよびＡｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌も、リノール
酸イソメラーゼ活性を有することが示されている。本発明の特に好ましいリノー
ル酸イソメラーゼは、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍリノール酸イソメラ
ーゼおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍリノール酸イソメラーゼである。
【００５５】 本発明の更なる実施形態は、リノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子で
ある。本発明の核酸分子には、上述したようにリノール酸イソメラーゼ同族体を
含む、任意の単離リノール酸イソメラーゼタンパク質をコードする核酸配列を含
む核酸分子が包含される。１実施形態では、そのような核酸分子は、低程度にス
トリンジェントな条件で、より好ましくは中程度にストリンジェントな条件で、
さらにより好ましくは高程度にストリンジェントな条件で、天然リノール酸イソ
メラーゼ（つまりリノール酸イソメラーゼをコードする天然対立変異型を含む）
をコードする核酸配列の相補的配列とハイブリダイズする単離核酸分子を含んで
いる。好ましくは、単離核酸分子は、配列番号４２、配列番号４３または配列番
号６１によって表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列
の相補的配列と、低程度、中程度、または高程度にストリンジェントな条件でハ
イブリダイズする核酸配列を含む。１実施形態では、単離核酸分子が、高配列番
号６０によって表わされる核酸配列の相補的配列と、低程度、中程度、または高
程度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列を含む。他の実施
形態では、本発明が、配列番号４２、配列番号４３または配列番号６１から成る
グループより選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする単離核酸分
子および配列番号６０の核酸配列を有する単離核酸分子を含む。
【００５６】 本明細書に使用する場合、ハイブリダイゼーション条件とは、同様の核酸分子
を識別するために核酸分子を使用する、標準のハイブリダイゼーション条件のこ
とを指す。そのような標準条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ，１９８８に、例えば開示され
ている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）は、引用によりその全体（特に、９．３１
−９．６２ページ参照）が本明細書に組み込まれる。さらに、適切なハイブリダ
イゼーションを計算し、かつ種々の程度のヌクレオチド対合を可能にするハイブ
リダイゼーションを達成する式は、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、１９８４，Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８，２６７−２８４に例えば開示されている。Ｍｅｉｎｋ
ｏｔｈら（前掲）は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５７】 詳細には、本明細書でいう低程度にストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ンおよび洗浄条件とは、ハイブリダイゼーション反応においてプローブに使用さ
れている核酸分子と約３５％以上の核酸配列同一性を有する核酸分子を単離する
条件（つまりヌクレオチドの約６５％以下の誤対合を許容する条件）のことを指
す。本明細書でいう中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび
洗浄条件とは、ハイブリダイゼーション反応においてプローブに使用されている
核酸分子と約５５％以上の核酸配列同一性を有する核酸分子を単離する条件（つ
まりヌクレオチドの約４５％以下の誤対合を許容する条件）のことを指す。本明
細書でいう高程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件
とは、ハイブリダイゼーション反応においてプローブに使用されている核酸分子
と約７５％以上の核酸配列同一性を有する核酸分子を単離する条件（つまりヌク
レオチドの約２５％以下の誤対合を許容する条件）のことを指す。上に論じたよ
うに、当業者はＭｅｉｎｋｏｔｈら（前掲）における式を使用して、適切なハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄条件を計算し、その特定のヌクレオチド誤対合レ
ベルを達成することが可能である。そのような条件は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリ
ッドが形成されるかＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが形成されるかで変わる。ＤＮ
Ａ：ＤＮＡハイブリッドに対して計算された融解温度は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブ
リッドに対するそれより１０度低い。特定の実施形態では、ＤＮＡ：ＤＮＡハイ
ブリッドに対するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳ
Ｃ（０．９Ｍ Ｎａ+）のイオン強度、約２０℃〜約３５℃、より好ましくは約
２８℃〜約４０℃、さらにより好ましくは約３５℃〜約４５℃の温度におけるハ
イブリダイゼーションから成る。特定の実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリ
ッドに対するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ（
０．９Ｍ Ｎａ+）のイオン強度、約３０℃〜約４５℃、より好ましくは約３８
℃から約５０℃、さらにより好ましくは約４５℃〜５５℃の温度におけるハイブ
リダイゼーションから成る。これらの値は、約１００より大きいヌクレオチド、
０％のホルムアミド、および約６０％のＧ＋Ｃ含量の分子に対する融解温度の計
算に基づいている。代わりに、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）、９．３１〜９．６
２らページに述べられているようにＴmは経験的に計算することも可能である。
【００５８】 本発明の１実施形態では、本発明のリノール酸イソメラーゼをコードする核酸
分子が、配列番号６１の約１７０アミノ酸以上の隣接アミノ酸にわたって配列番
号６１と約３５％以上同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。好まし
くは、本発明のリノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子は、配列番号６１
の約１７０以上、より好ましくは配列番号６１の約２００アミノ酸以上、より好
ましくは約２５０アミノ酸以上、より好ましくは約３００アミノ酸以上、より好
ましくは約３５０アミノ酸以上、さらに好ましくは約４００アミノ酸以上のアミ
ノ酸にわたって、配列番号６１と約４５％以上、より好ましくは約５５％以上、
より好ましくは約６５％以上、より好ましくは約７５％以上、より好ましくは約
８５％以上、さらにより好ましくは約９５％以上同一であるアミノ酸配列をコー
ドする核酸配列を含む。そのような核酸配列は、リノール酸イソメラーゼタンパ
ク質同族体をコードする核酸配列を含むため、天然リノール酸イソメラーゼをコ
ードする核酸配列の同族体（つまり核酸配列同族体）と称することが可能である
。
【００５９】 本発明の好ましいリノール酸イソメラーゼ核酸分子は、配列番号４２、配列番
号４３または配列番号６１から選択されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコ
ードする核酸配列に対して、約３５％以上、より好ましくは約４５％以上、より
好ましくは約５５％以上、より好ましくは約６５％以上、より好ましくは約７５
％以上、さらに好ましくは約８５％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性
を有する核酸配列を含む核酸分子を包含する。別の実施形態では、本発明のリノ
ール酸イソメラーゼ核酸分子は、配列番号６０によって表わされる核酸配列に対
して、約３５％以上、より好ましくは約４５％以上、より好ましくは約５５％以
上、より好ましくは約６５％以上、より好ましくは約７５％以上、さらに好まし
くは約８５％以上、そして最も好ましくは以上の同一性を核酸配列を含む核酸分
子から成る。また、本発明の好ましいリノール酸イソメラーゼ核酸分子は、配列
番号４２、配列番号４３および／または配列番号６１によって表わされるアミノ
酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子、または配列番号
６０によって表わされる核酸配列を含む核酸分子を包含する。本発明の好ましい
リノール酸イソメラーゼ核酸分子はさらに、ｎＰＡＩＳＯＭ5275またはｎＰＡＩ
ＳＯＭ1275から選択された核酸分子を含む核酸分子も包含する。上に説明したよ
うに、パーセント同一性はＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴデフォ
ルトパラメータを使用して決定される。
【００６０】 本発明によれば、単離核酸分子はその自然環境から取り除かれた（つまり、そ
れは人間の操作を受けた）核酸分子であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡま
たはＲＮＡのいずれかの誘導体を含む。そのようなものとして、「単離」は、核
酸分子の精製の程度を反映しない。本発明の単離リノール酸イソメラーゼ核酸分
子は、その自然な入手源から単離してもよいし、または、組換えＤＮＡ技術（例
えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成を使
用して生産してもよい。単離リノール酸イソメラーゼ核酸分子は、例えば、リノ
ール酸イソメラーゼ遺伝子、リノール酸イソメラーゼ遺伝子の自然対立遺伝子変
異型、リノール酸イソメラーゼのコーディング領域またはその一部、本発明のリ
ノール酸イソメラーゼをコードするかまたは天然遺伝子とストリンジェントな条
件下で安定したハイブリッドを形成する核酸分子の能力に、修飾が実質的に干渉
しないようにヌクレオチド挿入、欠失、置換および／または逆位によって修飾さ
れたリノール酸イソメラーゼのコーディング領域および／または調節領域）が含
まれる。単離リノール酸イソメラーゼ核酸分子は縮重を含み得る。本明細書に使
用する場合、ヌクレオチド縮重は、１つのアミノ酸が異なるヌクレオチドコドン
によってコードし得る現象のことを指す。従って、本発明のリノール酸イソメラ
ーゼをコードする核酸分子の核酸配列は、縮重により変化し得る。本発明の単離
リノール酸イソメラーゼ核酸分子は、リノール酸イソメラーゼ活性を有するタン
パク質をコードする必要がないことに注意する。例えば、リノール酸イソメラー
ゼ核酸分子は、切断されるか、変異されるか、または不活性なタンパク質をコー
ドしてもよい。実施例に以下に説明するように、そのような核酸分子、およびそ
のような核酸分子によってコードされたタンパク質は、例えば診断検定において
、または抗体作製産生のような他の目的に、有用である。
【００６１】 本発明によれば、リノール酸イソメラーゼ遺伝子とは、コーディング領域自体
と同様に、該遺伝子によってコードされたリノール酸イソメラーゼタンパク質の
生産を調節する調節領域（転写領域、翻訳領域または翻訳調節領域、翻訳後調節
領域を含むがこれらに限定されない）を始めとする、天然の（つまり野生型の）
リノール酸イソメラーゼ遺伝子に関連する核酸配列をすべて含んでいる。
【００６２】 別の実施形態では、リノール酸イソメラーゼ遺伝子は、所与のリノール酸イソ
メラーゼをコードする核酸配列と類似しているが同一ではない天然対立変異型で
ある。対立変異型は先に説明した。句、「核酸分子」および「遺伝子」は核酸分
子が上に説明されるような遺伝子を含む場合、互換的に使用することが可能であ
る。
【００６３】 リノール酸イソメラーゼ核酸分子同族体（つまり、リノール酸イソメラーゼタ
ンパク質同族体をコードする）は、当業者に周知の多くの方法を使用して生産す
ることが可能である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋらを参照）。例えば、核酸分子は
、古典的突然変異誘発および組換えＤＮＡ技術（例えば部位特異的変異誘発、化
学処理、制限酵素分断、核酸フラグメントのライゲーションおよび／またはＰＣ
Ｒ増幅）や、オリゴヌクレオチド混合物の合成および、核酸分子の混合物よびそ
の組み合わせを「構築する」混合物グループのライゲーションを含むがそれらに
限定されない、様々な技術を使用して修飾することが可能である。核酸分子同族
対は、リノール酸イソメラーゼ遺伝子とのハイブリダイゼーションにより、また
は核酸分子によりコードされたタンパク質の機能（例えばリノール酸をＣＬＡに
変換する能力）のスクリーニングにより、選択することが可能である。さらに、
本発明の核酸分子同族体は、配列番号６０の２４以上の隣接ヌクレオチドを含む
核酸配列を有しており、より好ましくは配列番号６０の約４５以上、より好まし
くは約９０以上、より好ましくは約１３５以上、さらに好ましくは約１８０以上
、さらに好ましくは約３６０以上、さらに好ましくは約７２０以上の隣接ヌクレ
オチドを含む拡散配列を有している。同様に、本発明の核酸分子同族体は、配列
番号４２、配列番号４３および／または配列番号６１の１５以上の隣接アミノ酸
残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、好ましくは、配列番号
４２および／または配列番号６１の３０の隣接アミノ酸残基を含むアミノ酸配列
を有するタンパク質をコードする。別の実施形態では、好ましい核酸配列同族体
は、配列番号６１の４５以上、より好ましくは６０以上、より好ましくは１２０
以上、さらにより好ましくは２４０以上の隣接アミノ酸残基を含むアミノ酸配列
を有するタンパク質をコードする。
【００６４】 本発明の１実施形態は、クローニング、配列決定、ならびに／もしくは核酸の
発現および／または組換え細胞を形成するための宿主への核酸の送達等の操作に
適した任意の核酸ベクター（例えば組換えベクター）に挿入された本発明の少な
くとも１つの単離核酸分子を有する、組換え核酸分子を包含する。そのようなベ
クターは、天然では本発明の核酸分子に隣接して見出されない核酸配列である、
異種起源の核酸配列を有しているが、ベクターはさらに、天然では本発明の核酸
分子に隣接して見出される、調節核酸配列（例えばプロモーター、非翻訳領域）
も有し得る（詳細に以下に論じる）。ベクターはＲＮＡでもＤＮＡでもよく、原
核生物由来でも真核生物由来でもよく、通常はウイルスまたはプラスミドである
。ベクターは染色体外の要素（例えばプラスミド）として維持されてもよいし、
染色体に組み込まれてもよい。ベクター全体は、宿主細胞内の適所に留まっても
よいし、あるいはある一定条件下では、プラスミドＤＮＡが欠失して、本発明の
核酸分子をあとに残してもよい。組み込まれた核酸分子は、染色体プロモーター
の制御下に、天然またはプラスミドプロモーターの制御下に、またはいくつかの
プロモーターの組合せ制御下に、存在し得る。核酸分子の単一または複数のコピ
ーが染色体へ組み込まれ得る。
【００６５】 通常、組換え分子は、１または複数の転写調節配列に機能的に結合された本発
明の核酸分子を有している。本明細書で使用する場合、句「組換え分子」または
「組換え核酸分子」とは、転写調節配列に機能的に結合された核酸分子または核
酸配列を主として指すが、そのような核酸分子がここで論じるような組換え分子
である場合、句「核酸分子」と共に互換的に使用することが可能である。本発明
によれば、句「機能的に結合された」とは、宿主細胞へ形質導入した時（つまり
、形質転換、変換、形質導入、共役、または導入）に分子が発現されるように、
転写調節配列に対して核酸分子を結合させることを指す。転写調節配列は、転写
の開始、伸長または終了を調節する配列である。特に重要な転写調節配列は、プ
ロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列のような転写
開始を調節する配列である。適切な転写調節配列は、本発明のリノール酸イソメ
ラーゼを発現するのに役立つ少なくとも１つの組換え細胞において機能可能な任
意の転写調節配列である。そのような様々な転写調節配列は当業者に周知である
。好ましい転写調節配列は、細菌、真菌類（例えば酵母）、昆虫、植物細胞また
は動物細胞で機能する転写調節配列である。
【００６６】 本発明の組換え分子（ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい）は、翻訳調節
配列、複製起点、および組換え細胞と互換性のある他の調節配列のような追加の
調節配列をさらに含み得る。１実施形態では、宿主細胞染色体へ組み込まれたも
のを含めた本発明の組換え分子は、発現されたリノール酸イソメラーゼが該タン
パク質を生産する細胞から分泌されるのを可能にする分泌シグナル（つまりシグ
ナルセグメント核酸配列）をさらに含む。適切なシグナルセグメントは、本発明
のリノール酸イソメラーゼ当然関係しているシグナルセグメントまたは本発明に
従ってリノール酸イソメラーゼの分泌を指図することが可能な任意の異種起源の
シグナルセグメントを含んでいる。別の実施形態では、本発明の組換え分子が、
発現されたリノール酸イソメラーゼを細胞膜に送出しかつ宿主細胞の細胞膜に挿
入するのを可能にする、リーダー配列を含む。適切なリーダー配列は、本発明の
リノール酸イソメラーゼに当然関係しているリーダー配列またはリノール酸イソ
メラーゼの送出および挿入を指示することが可能な任意の異種起源のリーダー配
列を含んでいる。
【００６７】 本明細書では組換えウイルスと称する、あるタイプの組換え分子は、ウイルス
コートで包まれ、細胞へのウイルスの送出後に細胞中で発現することが可能な本
発明の組換え核酸分子を含んでいる。アルファウイルス、バキュロウイルス、ポ
ックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスに基
づくウイルス粒子を始めとする多くの組換えウイルス粒子を使用することが可能
であるが、それらに限定されるわけではない。
【００６８】 本発明の１または複数の組換え分子を使用して、本発明のコードされた生成物
（つまりリノール酸イソメラーゼタンパク質）を生産することが可能である。１
実施形態では、コードされた生成物が、該タンパク質を生産するのに有効な条件
下で本明細書で説明されるように核酸分子を発現することで生産される。コード
されたタンパク質を生産するための好ましい方法は、組換え細胞を形成するため
に１または複数の組換え分子で宿主細胞を形質導入することによる。形質導入す
べき適切な宿主細胞には、形質導入可能な任意の細菌、真菌類（例えば酵母）、
昆虫、植物または動物細胞が含まれる。宿主細胞は形質導入していない細胞であ
っても、少なくとも１つの核酸分子で既に形質導入された細胞のいずれであって
もよい。本発明に使用される好ましい宿主細胞は、本発明の（ｔｒａｎｓ，ｃｉ
ｓ）−１０，１２−リノール酸イソメラーゼの発現に適したＰｒｏｐｉｏｎｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａおよびＢａｃｉｌｌｕｓ属の細菌細
胞を含むがそれらに限定されない任意の微生物細胞か、本発明の（ｃｉｓ、ｔｒ
ａｎｓ）−９，１１−リノール酸イソメラーゼの発現に適したＣｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｅｕｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａおよびＢａｃｉｌｌｕｓ属の細菌細胞を
含むがそれらに限定されない任意の微生物細胞を包含する。特に好ましい宿主細
胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ種を含むがそ
れらに限定されない（特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓを
含むがそれらに限定されない）産業上の発現宿主として適した細菌細胞である。
他の特に好ましい宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕ
ｌａ種、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、およびＰｈａｆｆｉａ
種、他の真菌類発現系を含むがそれらに限定されない産業上の発現宿主として適
した真菌細胞である。
【００６９】 本発明によれば、用語「形質導入」とは外因性核酸分子（つまり組換え核酸分
子）を細胞へ挿入することが可能な任意の方法を指すために使用される。用語「
形質転換」は、そのような用語が細菌や酵母のような微生物細胞への核酸分子の
導入のことを指すために使用される場合、用語「形質導入」と互換的に使用する
ことが可能である。微生物系では、用語「形質転換」は、微生物による外因性核
酸の獲得により引き継いだ変化のことを述べるために使用され、用語「形質導入
」と本質的に同義である。しかしながら、動物細胞では、形質転換は、細胞が癌
になった後の培養中の細胞の増殖特性の変化を指す別の意味を得ている。従って
、動物細胞への外因性核酸の導入に関する混乱を避けるために、用語「形質導入
」が好ましくは使用される。また、用語「形質導入」は、細胞への外因性核酸の
導入に該用語が関与するという程度で、動物細胞の形質導入および微生物細胞の
形質転換の両方を一般に包含するために本明細書では使用される。形質導入技術
には、形質転換、電気穿孔法、マイクロインジェクション、リポフェクション、
吸着、感染およびプロトプラスト融合が含まれるがそれらに限定されるわけでは
ない。
【００７０】 １実施形態では、本発明の単離リノール酸イソメラーゼタンパク質が、該タン
パク質を生産するのに有効な条件下で該タンパク質を発現する細胞を培養し、該
タンパク質を回収することにより生産される。培養するのに好適な細胞は、本発
明の組換え細胞である。有効な培養条件には、タンパク質生産を許容する有効な
培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれるがそれらに限定
されるわけではない。有効培地とは、細胞がその中で本発明のリノール酸イソメ
ラーゼタンパク質を生産するよう培養される、任意の培地のことを指す。そのよ
うな培地には、一般に、同化可能な炭素、窒素およびリン酸エステル源、ならび
に適切な塩類、ミネラル、金属、およびビタミン等の他の栄養素を含む水性培地
である。適切な培地および培養条件の例は、実施例の部分で詳細に論じる。本発
明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロ
タイタープレートおよびペトリ皿で培養可能である。培養は、組換え細胞に適切
な温度、ｐＨ値および酸素含量で実行することが可能である。そのような培養条
件は、当該技術分野における通常の技量を有する者の専門知識内にある。
【００７１】 生産のために使用するベクター・宿主系に依存して、本発明の得られたタンパ
ク質は、組換え細胞内に残されるか；発酵培地へ分泌されるか；Ｅ．ｃｏｌｉ中
の細胞周辺腔のような２つの細胞膜間の空間へ分泌されるか；もしくは、細胞膜
またはウイルス膜の外部表面上に保持される。句「タンパク質を回収する」とは
、タンパク質を含有する発酵培地全体を集めることを指し、分離または精製とい
う追加のステップを包含する必要はない。本発明のタンパク質は、アフィニティ
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラ
フィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび
差分可溶化を含むがそれらに限定されない様々な標準タンパク質精製技術を使用
して精製することが可能である。本発明のタンパク質は、好ましくは「本質的に
純粋な」形式で回収される。本明細書で使用する場合、「本質的に純粋な」とは
、生物触媒または他の試薬としてのタンパク質の実際的使用を可能にする純度の
ことを指す。
【００７２】 本発明の方法によって有意に高収率のＣＬＡを生産するために、微生物を遺伝
子修飾して、リノール酸イソメラーゼの活性を増加させ、そして好ましくはリノ
ール酸イソメラーゼの生産を増強してＣＬＡの生産を増強することが可能である
。本明細書に使用する場合、細菌、真菌類、微小藻類、特に本明細書に述べた任
意の好ましい細菌種等の遺伝子修飾された微生物は、所望な結果（つまりリノー
ル酸イソメラーゼの活性の増加）が達成されるようその正常な（つまり野生型ま
たは天然型）から修飾された（つまり、突然変異されるか変化させられた）ゲノ
ムを有している。微生物の遺伝的修飾は、古典的菌株発生および／または分子遺
伝学的技術を使用して遂行することが可能である。そのような技術は、例えばＳ
ａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ，に一般に開示されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）
の文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、組換え技術
による微生物の遺伝子修飾技術は、実施例の部分で詳細に説明する。
【００７３】 遺伝子修飾された微生物には、核酸分子が挿入、欠失、または修飾が微生物内
に所望の結果を供給するような方法で修飾された（すなわち例えばヌクレオチド
の挿入、欠失、置換および／または逆位によって変異された）、微生物が含まれ
得る。
【００７４】 本発明によれば、遺伝子修飾された微生物には、組換え技術を使用して修飾さ
れた微生物が含まれる。本明細書で使用する場合、遺伝子発現が減少するか、遺
伝子の機能が低下するか、または遺伝子産物（つまり遺伝子によってコードされ
たタンパク質）の機能が低下する遺伝的修飾は、遺伝子の（完全なまたは部分的
）不活性化、欠失、中断、ブロック、またはダウンレギュレーションと称され得
る。例えば、遺伝子によってコードされたタンパク質の機能が低下する遺伝子中
の遺伝的修飾は、遺伝子の完全な欠失（つまり、遺伝子は存在せず、従ってタン
パク質が存在しない）の結果であるか、タンパク質の翻訳が不完全または全く起
こらない（例えばタンパク質は発現されない）遺伝子の突然変異の結果であるか
、またはタンパク質の正常な機能が低下するか破壊される（例えば酵素活性また
は作用が減少したか欠けたタンパク質が発現される）遺伝子の変異の結果であり
得る。遺伝子の発現が増大するか遺伝子の機能が向上する遺伝的修飾は、遺伝子
の増幅、過剰生産、過剰発現、活性化、増強、付加またはアップレギュレーショ
ンと称され得る。
【００７５】 本発明の１実施形態では、微生物の遺伝的修飾が、リノール酸イソメラーゼの
活性を増大させるか減小させる。そのような遺伝的修飾には任意のタイプの修飾
が含まれるが、特に、組換え技術によって、および古典的突然変異誘発によって
生成された修飾を含んでいる。リノール酸イソメラーゼの作用（または活性）の
増大とは、酵素の機能が増大する問題の微生物における任意の遺伝子修飾を指し
、酵素活性（例えば比活性またはインビボ酵素活性）の増大、酵素の阻害または
解体の減少、および酵素の過剰発現を含むことに注意する。例えば、遺伝子コピ
ー数を増加させたり、天然プロモーターの発現レベルよりも高い発現レベルを与
えるプロモーターの使用により発現レベルを増加させたり、または、遺伝工学ま
たは古典的突然変異誘発により酵素作用を増加させるよう遺伝子を変更したりす
ることが可能である。同様に、酵素作用の減小とは、酵素の機能が減小する問題
の微生物における任意の遺伝的修飾を指し、酵素活性（例えば比活性）の減小、
酵素の阻害または解体の増大、および酵素の発現の減小または欠落を含む。例え
ば、本発明の酵素の作用は、酵素の生産のブロックまたは減少、酵素をコードす
る遺伝子の「ノックアウト」、酵素活性の減小、または酵素の活性の阻害により
減小させることが可能である。酵素の生産のブロックまたは減少は、増殖培地中
に誘発化合物の存在を必要とするプロモーターの制御下に、酵素をコードする遺
伝子を置くことをから成る。誘導物質が培地から枯渇するような条件を確立する
ことで、酵素コードする遺伝子の発現を（従って酵素合成を）オフにできる可能
性がある。酵素活性のブロックまたは減少はさらに、引用により本明細書に組み
込まれる米国特許第４，７４３，５４６号に説明されているのに似た切除（エキ
シジョン）技術アプローチの使用を含み得る。このアプローチを使用するために
、問題の酵素をコードする遺伝子は、ゲノムからの遺伝子の特定かつ制御された
切除を許容する特定の遺伝配列間で、クローニングされる。米国特許第４，７４
３，５４６号にあるような例えば培地の培養温度の変化により、または他の何ら
かの物理的シグナルまたは栄養学的シグナルにより、切除を刺激することが可能
である。
【００７６】 本発明の１実施形態では、遺伝子修飾された微生物は、ＣＬＡを合成する能力
が増強された微生物である。本発明によれば、生成物を「合成する能力の増強」
とは、同じ条件下で培養された野生型微生物と比較して微生物が増大した量の生
成物を生産するような、生成物の合成に関連する経路における生成物の任意の増
強またはアップレギュレーションのことを指す。本発明の１実施形態では、ＣＬ
Ａを合成する微生物の能力の増強が、リノール酸イソメラーゼ遺伝子の発現の増
幅によって遂行される。リノール酸イソメラーゼの発現の増幅は、細菌細胞では
、例えば、リノール酸イソメラーゼ遺伝子をコードする組換え核酸分子の導入に
よって、または天然リノール酸イソメラーゼ遺伝子に対する調節制御の修飾によ
って、遂行することが可能である。
【００７７】 従って、リノール酸イソメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子
で形質転換される細菌を提供することは、本発明の１実施形態である。そのよう
な核酸配列を含む好ましい組換え核酸分子は、配列番号４２、配列番号４３また
は配列番号６１から選択されたアミノ酸配列を含むリノール酸イソメラーゼをコ
ードする核酸配列を有する組換え核酸分子である。本発明の他の好ましい組換え
核酸分子は、配列番号６０によって表わされる核酸配列を含む核酸分子である。
上記の同定された核酸分子は、リノール酸イソメラーゼをコードする野生型（つ
まり、天然または自然の）核酸配列を含む核酸分子を表わす。（つまり、修飾さ
れるかまたは変化させられた）リノール酸イソメラーゼの同族体をコードする核
酸配列を含む遺伝子修飾核酸分子も、本発明に包含され、上記に詳細に説明して
いる。
【００７８】 基質阻害が減少するかおよび／または生成物阻害が減少したリノール酸イソメ
ラーゼを有する微生物を提供することは、本発明のさらに別の実施形態である。
基質阻害が減少するかおよび／または生成物阻害が減少したリノール酸イソメラ
ーゼは、例えば変化させられた（つまり、遺伝子修飾された）リノール酸イソメ
ラーゼ遺伝子であり、遺伝的修飾の任意の適切な方法によって生産することが可
能である。例えば、エラープローンＰＣＲなどのような、ヌクレオチドを挿入、
欠失、および／置換する任意の方法により、リノール酸イソメラーゼをコードす
る組換え核酸分子を修飾することが可能である。この方法では、リノール酸イソ
メラーゼをコードする核酸配列が、増幅のために使用されたＤＮＡポリメラーゼ
によって取込み違い誤差が頻繁に起こる条件下で増幅される。その結果、高頻度
の突然変異がＰＣＲ産物中に得られる。その後、生じたリノール酸イソメラーゼ
遺伝子突然変異体を、突然変異を受けていない組換えリノール酸イソメラーゼ核
酸分子を有する微生物と比較した、突然変異体分子が試験微生物にＣＬＡ生産増
大能力を与える能力について試験することにより、リノール酸イソメラーゼをコ
ードする組換え核酸分子を修飾する別の方法は、遺伝子の再編成（つまり分子育
種）である（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒに対する米国特許第５，６０５，７９３号
；ＭｉｎｓｈｕｌｌとＳｔｅｍｍｅｒ；１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｌ．３：２８４−２９０；Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐ．Ｎ．Ａ．
Ｓ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１を参照。それらの文献はすべて引用
によりその全体が本明細書に組み込まれる）。この技術を使用して、効率的にリ
ノール酸イソメラーゼ酵素作用の多数の同時の陽性変化を導入することが可能で
ある。リノール酸イソメラーゼの基質の減少および／または生成物阻害の減少に
より、一般に、天然リノール酸イソメラーゼ酵素に対して酵素の比活性が同じの
ままか実際に減少している時でさえ、リノール酸イソメラーゼの作用は増大する
ことに注意すべきである。従って、未修飾であるか天然リノール酸イソメラーゼ
と比較して比活性が減少した、作用が増大しおよびインビボ酵素活性が増大した
遺伝子修飾リノール酸イソメラーゼを生産することは、本発明の１実施形態であ
る。比活性が増大した遺伝子修飾リノール酸イソメラーゼも、本発明に包含され
る。
【００７９】 従って、突然変異体または同族体リノール酸イソメラーゼをコードする核酸配
列を含む遺伝子修飾組換え核酸分子で形質転換された微生物を提供することは、
本発明の１実施形態である。そのようなリノール酸イソメラーゼは本明細書では
リノール酸イソメラーゼ同族体と称されうる。タンパク質同族体は、本明細書に
詳細に説明している。
【００８０】 本発明の別の実施形態は、単離リノール酸イソメラーゼ酵素を使用して、油か
らＣＬＡまたはその誘導体を生産する方法である。該方法は、当業者に周知の攪
拌タンク、プラグフローカラムリアクターまたは他の装置を使用して、バッチ式
か連続的モードで操作することが可能である。油は、遊離脂肪酸、遊離脂肪酸の
塩（例えばセッケン）、ならびにリノール酸、リノレン酸、リノール酸またはリ
ノレン酸の誘導体を含む混合物、およびその混合物を含む混合物から成るグルー
プより選択された脂肪酸を含む。前に本明細書で論したように、リノール酸また
はリノレン酸の誘導体には、脂質誘導体、メチルエステル誘導体および分岐形式
を含むがそれらに限定されない任意の誘導体が含まれる。本発明のリノール酸イ
ソメラーゼの基質として使用可能なリノール酸およびリノレン酸の脂質誘導体と
しては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されるわけではない：（ｃｉｓ
，ｃｉｓ，ｃｉｓ）−６，９，１２−オクタデカトリエン酸（１８：３）（γ−
リノレン酸）；（ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ）−６，９，１２，１５−オ
クタデカテトラエン酸（１８：４）（ステアリドン酸）；（ｃｉｓ，ｃｉｓ）−
１１，１４−エイコサジエン酸（２０：２）。そのような誘導体は実施例２２の
表６に記されている。
【００８１】 好ましくは、油は、約５０重量％以上、より好ましくは約６０％重量以上、最
も好ましくは約８０重量％以上の脂肪酸を含有する。本発明の方法は、脂肪酸の
少なくとも一部をＣＬＡに変換する。好ましくは、約３０％以上の油がＣＬＡに
変換され、より好ましくは、約５０％以上の油がＣＬＡに変換され、より好まし
くは約７０％以上、最も好ましくは約９５％以上の油がＣＬＡに変換される。
【００８２】 本発明の上述の方法に有用な油を含む、種々の動物と植物の供給源が利用可能
である。好ましくは、油は、ヒマワリ油、ベニバナ油、コーン油、亜麻仁油、パ
ーム油、菜種油、イワシ油、ニシン油、からし油、落花生油、胡麻油、紫蘇油、
綿実油、大豆油、脱水ひまし油およびクルミ油から成るグループから選択される
。
【００８３】 脂肪酸がトリグリセリドの形をしている場合、該方法は、トリグリセリドの少
なくとも一部を遊離脂肪酸に変換するために該油を加水分解酵素と接触させる工
程を含む。加水分解酵素は、遊離脂肪酸を提供するためにトリグリセリドのエス
テル結合を分断することが可能な任意の酵素を包含する。好ましくは、加水分解
酵素は、リパーゼ、ホスホリパーゼおよびエステラーゼから成るグループから選
択される。トリグリセリドを加水分解する酵素の使用は当業者に周知である。
【００８４】 代わりに、脂肪酸のトリグリセリドを含む油を化学的に加水分解して、トリグ
リセリドの少なくとも一部を遊離脂肪酸に変換することも可能である。トリグリ
セリドの遊離脂肪酸への化学的変換は当業者に周知である。例えば、トリグリセ
リドを水酸化物、炭酸塩および重炭酸塩のような塩基を使用して塩基性条件下で
加水分解して、遊離脂肪酸を提供することが可能である。典型的な塩基としては
、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水
酸化リチウム、水酸化マグネシウム、炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、炭酸
リチウムおよび重炭酸リチウムが挙げられる。代わりに、トリグリセリドを酸を
使用して酸性条件下で加水分解して、遊離脂肪酸を提供することが可能である。
典型的な酸としては、塩酸、硫酸、リン酸、および酢酸やギ酸のようなカルボン
酸が挙げられる。
【００８５】 好ましい本発明の方法では、リノール酸イソメラーゼが、固相支持体（つまり
固定化酵素）に結合される。本明細書で使用する場合、固相支持体に結合された
リノール酸イソメラーゼ（つまり固定化リノール酸イソメラーゼ）には、固定化
単離リノール酸イソメラーゼ、リノール酸イソメラーゼ酵素を有する固定化細胞
（固定化細菌、真菌類（例えば酵母）、微小藻類、昆虫、植物または哺乳類細胞
）、安定化したインタクトな細胞および安定化した細胞／細胞膜ホモジネートが
含まれる。安定化インタクト細胞および安定化細胞／細胞膜ホモジネートは、リ
ノール酸イソメラーゼを発現する天然微生物由来の、または本明細書の別の個所
に開示した遺伝子修飾微生物、昆虫細胞または哺乳類細胞由来の、細胞およびホ
モジネートである。従って、リノール酸イソメラーゼを固定化する方法は以下に
論じるが、そのような方法が細菌や他の細胞の固定化にも等しく適用することが
でき、そのような実施形態では、細胞を溶解され得ることを理解すべきである。
【００８６】 酵素を固定化する様々な方法が、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ 第２版，Ｇｏｄｆｒｅｙ，ＴとＷｅｓｔ，Ｓ編，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６，ｐｐ．２６７−２７２；Ｉｍ
ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｃｈｉｂａｔａ，Ｉ．編．，Ｈａｌｓｔ
ｅｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９７８；Ｅｎｚｙｍｅｓ
ａｎｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｌａｓｋｉｎ，Ａ．編，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ，１９８５；およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．４，Ｃｈｉｂａｔａ，Ｉ．とＷｉｎｇ
ａｒｄ，Ｊｒ．，Ｌ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
Ｎ．Ｙ．，１９８３，この文献はその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８７】 簡単に説明すると、固相支持体とは、単離リノール酸イソメラーゼ酵素の活性
に有意な影響を与えずにリノール酸イソメラーゼと結合を形成することが可能な
、任意の固体の有機支持体、人工膜、生体高分子支持体または無機支持体ｎこと
を指す。典型的な有機固相支持体には、ポリスチレン、ナイロン、フェノールホ
ルムアルデヒド樹脂、アクリル酸共重合体（例えばポリアクリルアミド）などの
ポリマー、安定化インタクト細胞全体、および安定化粗細胞／細胞膜ホモジネー
ト全体が含まれる。典型的な生体高分子支持体には、セルロース、ポリデキスト
ラン（例えばセファデックス（登録商標））、アガロース、コラーゲンおよびキ
チンが含まれる。典型的な無機支持体には、ガラスビーズ（多孔性および非孔性
）、ステンレス鋼、金属酸化膜（例えばＺｒＯ2、ＴｉＯ2、Ａｌ2Ｏ3およびＮｉ
Ｏのような多孔性セラミック）および砂が含まれる。好ましくは固相支持体は、
安定化インタクト細胞および／または粗細胞ホモジネートから成るグループから
選択される。そのような支持体の調製には、最小の取り扱いの手間およびコスト
しか必要としない。さらに、そのような支持体は、酵素の優れた安定性を提供す
る。
【００８８】 安定化インタクト細胞および／または細胞／細胞膜ホモジネートを、例えば二
機能性の架橋剤（例えばグルタルアルデヒド）を使用して生産し、細胞および細
胞ホモジネートを安定化することが可能である。インタクト細胞および細胞膜の
両方で、細胞壁および細胞膜は、固定化支持体の役割を果たす。そのような系で
は、膜タンパク質が全体が、「最良の」脂質膜環境中にある。インタクト細胞か
ら始めてもホモジネートから始めてもよいが、この系では、細胞がもはや「生き
ていない」か「代謝しておらず」、または代わりに、「休止している」（つまり
、細胞は代謝可能性および活性リノール酸イソメラーゼを維持するが、培養条件
下で増殖していない）。いずれの場合も、固定化細胞または細胞膜は生物触媒と
しての役割を果たす。
【００８９】 吸着、架橋結合（共有結合形成を含む）および捕獲（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）
を含む様々な方法により、リノール酸イソメラーゼを固相支持体に結合すること
が可能である。吸着は、ファンデルワールス力、水素結合、イオン結合または疎
水結合によって起こり得る。吸着固定化用の典型的な固相支持体は、ポリマー吸
着材およびイオン交換樹脂を含んでいる。ビーズ形式の固相支持体は特に都合が
良い。吸着固相支持体の粒径は、着質（例えば油）が所望速度でリアクターを通
って流れることが許容される一方で固定化酵素がメッシュフィルタによってリア
クターに保持されるように、選択することが可能である。多孔性の微粒子支持体
を用いると、リノール酸イソメラーゼまたは細菌細胞を粒子の空間の中に埋め込
み、それにより許容しがたい活性の損失のない保護を提供するように、吸着プロ
セスを制御することが可能である。
【００９０】 固相支持体へのリノール酸イソメラーゼの架橋は、固相支持体とリノール酸イ
ソメラーゼとの間に化学結合を形成することに関する。架橋は中間化合物を使用
してリノール酸イソメラーゼを固相支持体に結合することに一般に関するが、中
間化合物を使用しなくても酵素と固相支持体の間の共有結合を直接形成可能であ
ることが認識される。架橋では、カルボキシル基、アミノ基、硫黄基、水酸基、
または酵素のほかの官能基を活性化し固相支持体へ付着するために、一般に二機
能または多機能の試薬を使用する。用語「活性化」とは、官能基における結合の
形成を許容する官能基の化学変化のことを指す。典型的なアミノ基活性化試薬に
は、水溶性カルボジイミド、グルタルアルデヒド、臭化シアン、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル、トリアジン、塩化シアヌル酸および、およびカルボニ
ルジイミダゾールが含まれる典型的なカルボキシル基活性化試薬には、水溶性カ
ルボジイミドおよびＮ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３−スルホン
酸が含まれる。典型的なチロシル基活性化試薬には、ジアゾニウム化合物が含ま
れる。また、典型的なスルフヒドリル基活性化試薬には、ジチオビス−５，５’
−（２−ニトロ安息香酸）およびグルタチオン−２−ピリジルジスルフィドが含
まれる。酵素を固相支持体に共有結合で直接結合するための系には、Ｒｏｈｍ
Ｐｈａｒｍａ（ダルムシュタット、ドイツ）から入手可能なポリメタクリレート
ビーズ支持体であるＥｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｏｒｇ
ａｎｉｃｓより入手可能なｋｉｅｓｅｌｇｕｈｌ（Ｍａｃｒｏｓｏｒｂｓ）、「
Ｂｉｏｆｉｘ」支持体としてＥｎｇｌｉｓｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｌａｙより入手可
能なカオリナイト、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅより入手可能なシラン化により活性化さ
れるシリカゲル、およびＵＯＰ（イリノイ州デスプレインズ）より入手可能な高
密度アルミナが含まれる。
【００９１】 捕獲を使用しても、リノール酸イソメラーゼを固定化することが可能である。
リノール酸イソメラーゼの捕獲には、とりわけ、ゲル（有機または生物ポリマー
を使用）、ベヒクル（マイクロカプセル化を含む）、半透膜または他のマトリッ
クスの形成が含まれる。酵素の捕獲のために使用される典型的な物質としては、
コラーゲン、ゼラチン、寒天、三酢酸セルロース、アルギン酸塩、ポリアクリル
アミド、ポリスチレン、ポリウレタン、エポキシ樹脂、カラギーナンおよび卵ア
ルブミンが挙げられる。ポリマーのうちの一部、特に三酢酸セルロースは、ポリ
マーが線維に紡糸されるため、酵素を捕獲するのに使用することが可能である。
ポリアクリルアミドゲルのような他の物質は、酵素を捕獲すために溶液中で重合
することが可能である。重合可能なビニル末端基で官能化されたポリエチレング
リコールオリゴマーのようなさらに他の物質は、光増感剤の存在下で、紫外線照
射によって架橋重合体を形成することで、酵素を捕獲することが可能である。
【００９２】 本発明の方法によって生産されたＣＬＡは、従来技術によって回収することが可
能である。
【００９３】 ＣＬＡは共溶媒システムで、乳化された（例えばレシチンで乳化）油を備えた
二相の水−油系において、共溶媒系において、または最も好ましくは水をほとん
ど含まない（つまり酵素活性のために必要な最小の水しか含まない）油の流れを
含む二相の水−油系において、生産することが可能である。本発明のリノール酸
イソメラーゼのさらなる特徴は、それらがより高いｌｏｇＰ溶媒によって阻害さ
れないということである。実際、不混和溶媒が使用される場合、場合によっては
本発明のリノール酸イソメラーゼがリノール酸をＣＬＡへより高く変換すること
が見出されたのは驚くべきことである。ＣＬＡは様々な溶媒系を使用して生産す
ることが可能である。例えば、ＣＬＡは、水系または水−有機系の組合せを使用
して生産することが可能である。好ましくは、リノール酸イソメラーゼを使用し
たＣＬＡ生産のための溶媒系は、水、ヘキサンデカン、ヘキサデカンおよびプロ
ピレングリコールから成るグループより選択された溶媒を含む。
【００９４】 本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に開示した本発明の微生物（または
昆虫または哺乳類細胞）、核酸分子およびタンパク質から形成された産業用発現
系を利用する、ＣＬＡの生産方法に関する。この方法では、リノール酸イソメラ
ーゼを発現している微生物から、または本明細書に述べたような本発明のリノー
ル酸イソメラーゼを安定して発現している遺伝子修飾微生物、昆虫細胞、または
哺乳類細胞（組換え微生物、昆虫細胞または哺乳類細胞を含む）から形成された
固定化インタクト細胞全体または細胞／細胞膜ホモジネートは、適切な培養系（
例えば発酵器）において増殖する。安定化細胞またはホモジネートは、本明細書
のほかの個所で特定したパラメータによれば、リノール酸および／またはリノレ
ン酸をＣＬＡに変換するための生体内変換プロセスにおける生物触媒としての役
割を果たす。１実施形態では、生物触媒が数回再使用される（つまりリサイクル
される）。好ましい実施形態では、リノール酸および／またはリノレン酸を含有
している油の流れが、最小量の水の存在下で生物触媒に加えられる。
【００９５】 本発明のさらに別の実施形態は、リパーゼ様タンパク質をコードする核酸分子
、およびそれによってコードされたリパーゼ様タンパク質に関する。１実施形態
では、本発明のリパーゼ様タンパク質をコードする核酸分子は、ｎＰＡＬＰＬ10 73 で表される。配列番号５９（この位置はセンス鎖に関して列挙した）の相補的
配列に関するヌクレオチドの１〜１０７３位置由来のｎＦＡＬＰＬ1073スパンの
核酸配列は、配列番号６３として本明細書では表わされる。配列番号６３は、不
完全なＣ末端を備えた３５８のアミノ酸残基のアミノ酸配列があるタンパク質を
コードする。この配列は本明細書ではＰＰＡＬＰＬ358（配列番号６４）と称さ
れる。ＰＰＡＬＰＬ358はリパーゼといくらか相同性を示すため（以下を参照）
、従ってＬＰＬ（リパーゼ様）と称される。
【００９６】 ２２の隣接ヌクレオチド（配列番号６３の８１５−８３６位置）の配列は、Ｂ
ｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓＲＮＡポリメラーゼシグマ８０サブユ
ニット遺伝子（サンガー５２０，Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｃｏｎｔｉｇ５４）
のセグメントと同一であることが判明した。配列ＰＰＡＬＰＬ358に関するＢＬ
ＡＳＴ ２．０検索は、タンパク質配列が低いが有意ないくつかのリパーゼとの
相同性を共有することを示した。例えば、配列番号６３の１４６−３５６位置に
またがる領域は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｌ
ｉｐＣと、２６％のアミノ酸残基同一性および４２％のアミノ酸残基類似性を共
有する。ＰＰＡＬＰＬ358はＰ．ａｃｎｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ９９２５５）
から以前にクローニングした異なるリパーゼ遺伝子とは有意な相同性を共有しな
いことに注意すべきである。しかしながら、配列番号６３の２４４−２４９位置
にある配列ＧＤＳＡＧは、多くのリパーゼで保存されており、様々なリパーゼ、
エステラーゼおよび他の加水分解酵素によって共有されている活性部位セリンモ
チーフ（ＧＸＳＸＧ）と一致する。ＰＰＡＬＰＬ358がリパーゼであるという追
加の証拠を提供するために、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ（タンパク質パターンおよ
びプロファイル検索）を、配列番号６４のタンパク質配列に関して実行した。エ
ステラーゼ／リパーゼ／チオエステラーゼ活性部位（ＰＲＯＳＩＴＥ Ｐｒｏｆ
ｉｌｅ Ｎｏ．ＰＳ５０１８７）が、配列番号６４の１６７−２６１領域で見出
された。さらに、配列番号６４の２１３−２６８位置からの領域は、カルボキシ
エステラーゼタイプ−Ｂ活性部位（ＧＣ０２６５）を含んでいた。しかしながら
、配列ＰＰＡＬＰＬ358は、Ｐ．ａｃｎｅｓリパーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ９９
２５５）中に存在する正確なリパーゼプロサイト（ＰＲＯＳＩＴＥ Ｐｒｏｆｉ
ｌｅ Ｎｏ．ＰＳ０１１７３およびＰＳ０１１７４）を含んでいない。従って、
本願発明者は、配列番号６３によってコードされ、配列番号６４のアミノ酸配列
によって表わされるタンパク質が新規なリパーゼまたはリパーゼ様酵素であると
いう結論を下した。
【００９７】 従って、本発明の１実施形態は単離リパーゼ様タンパク質に関する。そのよう
なタンパク質には、以下のグループから選択されたアミノ酸配列を含む：（ａ）
配列番号６４；および（ｂ）配列番号６４と約３５％以上同一である配列番号６
４の同族体。上に論じたように、あるアミノ酸の別のアミノ酸配列との同一性は
ＢＬＡＳＴ ２．０を使用して決定される。タンパク質の同族体の一般的な定義
は、本発明のリノール酸イソメラーゼに関して詳細に上述されており、本発明の
リパーゼ様タンパク質にも同様に当てはまる。好ましくは、本発明のリパーゼ様
タンパク質は、配列番号６４と約４５％以上、より好ましくは約５５％以上、よ
り好ましくは約６５％以上、より好ましくは約７５％以上、より好ましくは約８
５％以上、さらにより好ましくは約９５％以上同一であるアミノ酸配列を含む。
より好ましい実施形態では、本発明のリパーゼ様タンパク質は、配列番号６３に
よって表わされる核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。最も好ましく
は、本発明のリパーゼ様タンパク質は、配列番号６４のアミノ酸配列を有する。
アミノ酸配列決定および核酸配列決定技術に誤差が全くないわけではないので、
ここで示した配列がせいぜい本発明のリパーゼ用タンパク質の見かけの配列を表
わすにすぎないことに注意すべきである。
【００９８】 １実施形態では、タンパク質同族体は、該同族体をコードする核酸が天然リパ
ーゼ様タンパク質をコードする核酸分子に対して（すなわち共に）（つまり天然
リパーゼ様タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸鎖の相補的配列に対して
）、低程度、中程度、または高程度にストリンジェントな条件でハイブリダイズ
することが可能な程度に本発明の天然リパーゼ様タンパク質に十分類似している
アミノ酸配列を有する。好ましくは、リパーゼ様タンパク質の同族体は、配列番
号６４によって表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列
の相補的配列と、低程度、中程度、または高程度にストリンジェントな条件でハ
イブリダイズする核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。さらにより好
ましくは、リパーゼ様タンパク質の同族体は、配列番号６３の相補的配列と、低
程度、中程度、または高程度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核
酸配列を含む核酸分子によってコードされる。そのようなハイブリダイゼーショ
ン条件は、上記に詳細に説明している。
【００９９】 別の実施形態では、リパーゼ様タンパク質同族体が、配列番号６４の１５以上
の隣接アミノ酸残基（つまり１５の隣接アミノ酸残基と１００％の同一性がある
）、より好ましくは３０以上、より好ましくは４５以上、より好ましくは６０以
上、より好ましくは１２０以上、さらにより好ましくは２４０以上、さらに好ま
しくは３００以上の隣接アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質を
含んでいる。リパーゼ様タンパク質同族体は、２４以上、より好ましくは４５以
上、より好ましくは９０以上、より好ましくは１８０以上、より好ましくは３６
０以上、さらに好ましくは７２０以上、さらに好ましくは９００以上の配列番号
６３の隣接ヌクレオチドを含む核酸配列によってコードされたタンパク質を含ん
でいる。好ましい実施形態では、リパーゼ様タンパク質同族体が、測定可能なリ
パーゼ酵素活性を有している（つまり、生物活性を有している）。リパーゼ酵素
活性を検出および測定する方法は、Ｋｕｒｏｏｋａら、１９７７，“Ａ ｎｏｖ
ｅｌ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ
ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｌｉｐａｓｅ”，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ
）８１：３６１−３６９に記されており、その全体が引用により本明細書に組み
込まれる。別の実施形態では、リパーゼ様タンパク質同族体が、測定可能なリパ
ーゼ酵素活性を有しても有していなくてもよいが、抗体の作製（例えば、配列番
号６４を含むアミノ酸配列を有するタンパク質のような本発明の天然リパーゼ様
タンパク質に結合する抗体を生成するために使用する）、または他のリパーゼの
識別に役立つオリゴヌクレオチドの作成に使用される。
【０１００】 １実施形態では、本発明のリパーゼ様タンパク質が、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ
Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｎｏ．ＰＳ５０１８７によって表されるエステラーゼ／リパ
ーゼ／チオエステラーゼ活性部位を含むアミノ酸配列を有する。別の実施形態で
は、本発明のリパーゼ様タンパク質が、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ Ｐｒｏｆｉｌ
ｅ Ｎｏ．ＧＣ０２６５によって表されるカルボキシエステラーゼタイプ−Ｂ活
性部位を含むアミノ酸配列を有する。
【０１０１】 本発明の１実施形態は、以上に説明された本発明の任意のリパーゼ様タンパク
質をコードする核酸配列を含む単離核酸分子に関する。さらに、そのような単離
核酸分子を含む組換え核酸分子および細胞、ならびに本発明のリパーゼ様タンパ
ク質を生産するためのそのような核酸分子の使用方法も本発明に含まれる。１実
施形態では、リパーゼ様タンパク質をコードする核酸配列を含む単離核酸分子は
、上に説明された任意の方法において、本発明のリノール酸イソメラーゼタンパ
ク質をコードする単離核酸分子と共に使用される。
【０１０２】 実施例１４に以下に説明するように、本発明の１実施形態は、ｎＰＡＩＳＯＭ 5275 （配列番号５９）の配列の１６０４−２３８６にわたり、配列番号６０に上
流に位置し、配列番号６５によって表わされる、ｎＰＡＵＮＫ783で示された核
酸分子である。配列番号６５は、ＰＰＡＵＮＫ260（配列番号６６）と呼ばれる
２６０のアミノ酸残基のタンパク質をコードする読取枠である。推定リボゾーム
結合部位ＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号６７）は、第１ＡＴＧコドンの上流に位置し
、４塩基の間隔が空いている。従って、このＡＴＧコドンは、この読取枠の実際
の翻訳開始コドンである可能性が非常に高い。この読取枠は、ＧｅｎＢａｎｋ中
のまたは未完成の微生物ゲノム中のどの配列とも有意な相同性を示さない。従っ
て、ＰＰＡＵＫ260の機能はい現時点では未知である。
【０１０３】 本発明の別の実施形態は、アセチルトランスフェラーゼ様タンパク質をコード
する単離核酸分子およびそれによってコードされたアセチルトランスフェラーゼ
タンパク質に関する。アセチルトランスフェラーゼ様酵素をコードする核酸分子
は本明細書ではｎＰＡＡＴＬ582と呼ばれ、配列番号６８によって表される核酸
配列を有する。配列番号６８は配列番号５９（ｎＰＡＩＳＯＭ5275）の４１２９
−４７１０位置にまたがり、該核酸鎖に関してｎＰＡＩＳＯＭ5275上の配列番号
６０より下流に位置する。この読取枠は、１９３のアミノ酸残基（このアミノ酸
配列は配列番号６９によって表わされる）のアセチルトランスフェラーゼ様酵素
（ＡＴＬ）をコードする。配列番号６９のアミノ酸配列を有するタンパク質は、
本明細書ではＰＰＡＡＴＬ193と称される。
【０１０４】 ヌクレオチド配列ｎＰＡＡＴＬ582に関するＢＬＡＳＴ ２．０検索では、他
の配列との有意な相同性が明らかにならなかったが、タンパク質配列ＰＰＡＡＴ
Ｌ193（配列番号６９）を使用したＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎは、ＰＰＡＡＴＬ193 がアセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡＴ）ファミリープロファイル（Ｐｒｏｆ
ｉｌｅＳｃａｎ ＰＲＯＳＩＴＥ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＰＦ０
０５８３）を含むことを示した。ＢＬＡＳＴ ２．０検索でも、ＰＰＡＡＴＬ19 3 がデータベースにおいて３つの推定アセチルトランスフェラーゼ遺伝子に対し
て低い相同性を有していることを示した（実施例１４を参照）。従って、本願発
明者は、配列番号６８の核酸配列によってコードされ、配列番号６９のアミノ酸
配列によって表わされたタンパク質が、アセチルトランスフェラーゼ酵素または
アセチルトランスフェラーゼ様タンパク質であると考えている。
【０１０５】 従って、本発明の１実施形態は、単離アセチルトランスフェラーゼ様タンパク
質に関する。そのようなタンパク質には、以下から成るグループから選択された
アミノ酸配列を含む：（ａ）配列番号６９；および（ｂ）配列番号６９の６０以
上の隣接アミノ酸にわたって配列番号６９に対して約４０％以上同一である配列
番号６９の同族体。上に論じたように、あるアミノ酸の別のアミノ酸配列との同
一性はＢＬＡＳＴ ２．０を使用して決定される。タンパク質の同族体の一般的
な定義は、本発明のリノール酸イソメラーゼに関して詳細に上述されており、本
発明のアセチルトランスフェラーゼ様タンパク質にも同様に当てはまる。好まし
くは、本発明のアセチルトランスフェラーゼ様タンパク質は、配列番号６９の約
６０以上の隣接アミノ酸、より好ましくは１００以上の隣接アミノ酸、より好ま
しくは１５０以上の隣接アミノ酸にわたって、約５０％以上、より好ましくは約
６０％以上、より好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、より
好ましくは約９０％以上、配列番号６９と同一なアミノ酸配列を有する。より好
ましい実施形態では、本発明のアセチルトランスフェラーゼ用タンパク質は、配
列番号６８によって表わされる核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。
最も好ましくは、本発明のアセチルトランスフェラーゼ様タンパク質は、配列番
号６９のアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列決定および核酸配列決定技術に誤
差が全くないわけではないので、ここで示した配列がせいぜい本発明のアセチル
トランスフェラーゼ様タンパク質の見かけの配列を表わすにすぎないことに注意
すべきである。
【０１０６】 １実施形態において、タンパク質同族体は、該同族体をコードする核酸が天然
アセチルトランスフェラーゼ様タンパク質をコードする核酸分子に対して（すな
わち共に）（つまり天然アセチルトランスフェラーゼ様タンパク質のアミノ酸配
列をコードする核酸鎖の相補的配列に対して）、低程度、中程度、または高程度
にストリンジェントな条件でハイブリダイズすることが可能な程度に本発明の天
然アセチルトランスフェラーゼ様タンパク質に十分類似しているアミノ酸配列を
有する。好ましくは、アセチルトランスフェラーゼ様タンパク質の同族体は、配
列番号６９によって表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸
配列の相補的配列と、低程度、中程度、または高程度にストリンジェントな条件
でハイブリダイズする核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。さらによ
り好ましくは、アセチルトランスフェラーゼ様タンパク質の同族体は、配列番号
６８の相補的配列と、低程度、中程度、または高程度にストリンジェントな条件
でハイブリダイズする核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。そのよう
なハイブリダイゼーション条件は、上記に詳細に説明している。
【０１０７】 別の実施形態では、アセチルトランスフェラーゼ様タンパク質同族体が、配列
番号６９の１５以上の隣接アミノ酸残基（つまり１５の隣接アミノ酸残基と１０
０％の同一性がある）、より好ましくは３０以上、より好ましくは４５以上、よ
り好ましくは６０以上、より好ましくは１２０以上、さらにより好ましくは１５
０以上の隣接アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質を含んでいる
。アセチルトランスフェラーゼ様タンパク質同族体は、２４以上、より好ましく
は４５以上、より好ましくは９０以上、より好ましくは１８０以上、より好まし
くは３６０以上、好ましくは４５０以上の配列番号６８の隣接ヌクレオチドを含
む拡散配列によってコードされたタンパク質を含んでいる。好ましい実施形態で
は、アセチルトランスフェラーゼ様タンパク質同族体が、測定可能なアセチルト
ランスフェラーゼ酵素活性を有している（つまり、生物活性を有している）。ア
セチルトランスフェラーゼ酵素活性を検出および測定する方法は、Ｆｒｅｅｍａ
ｎら，１９８３，“Ａｃｅｔｙｌ ＣｏＡ：ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｄ
ｎｉｄｅ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ｐａｒｔｉａｌ ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｉｎｔ．６：６６３−６７１に記されており、その全体が引用により本明細書
に組み込まれる。別の実施形態では、アセチルトランスフェラーゼ様タンパク質
同族体が、測定可能なアセチルトランスフェラーゼ酵素活性を有しても有してい
なくてもよいが、、抗体の作製（例えば、配列番号６９を含むアミノ酸配列を有
するタンパク質のような本発明の天然アセチルトランスフェラーゼ様タンパク質
に結合する抗体を生成するために使用する）、または他のアセチルトランスフェ
ラーゼの識別に役立つオリゴヌクレオチドの作成に使用される。
【０１０８】 １実施形態では、本発明のアセチルトランスフェラーゼ様タンパク質が、Ｐｒ
ｏｆｉｌｅ ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＰＦ００５８３により表されるアセチルトラン
スフェラーゼ（ＧＮＡＴ）ファミリープロファイルを含むアミノ酸配列を有する
。
【０１０９】 本発明の１実施形態は、以上に説明された本発明の任意のアセチルトランスフ
ェラーゼ様タンパク質をコードする核酸配列を含む単離核酸分子に関する。さら
に、そのような単離核酸分子を含む組換え核酸分子および細胞、ならびに本発明
のアセチルトランスフェラーゼ様タンパク質を生産するためにそのような分子を
使用方法も本発明に含まれる。１実施形態では、アセチルトランスフェラーゼ様
タンパク質をコードする核酸配列を含む単離核酸分子は、上に説明された任意の
方法において、本発明のリノール酸イソメラーゼタンパク質をコードする単離核
酸分子と共に使用される。
【０１１０】 （実施例） 実施例は当業者に周知と考えられている多くの分子生物学的、微生物学的、免
疫学的および生化学的技術を包含していることに注意する。そのような技術の開
示は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前傾）および関連の文献に例えば見つけることが可
能である。別段の定めがない場合、カラムクロマトグラフイーはすべて４℃で実
行した。
【０１１１】実施例１ 本実施例は、様々な微生物に関する細胞全体での生体内変換を使用した、リノ
ール酸からのＣＬＡ生産を示す。用語「細胞全体の生体内変換」とは、微生物に
よる適切な基質のＣＬＡへの変換のことを指す。
【０１１２】 様々な他の微生物を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入し、０．５％の酵母エキス、０．０００５％
のヘミン、０．００１％のビタミンＫ1、０．０５％のシステインおよび０．０
０１％のリサズリンを補給したＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｂ
ｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）により増殖させた。培養物は、３７℃で約１２〜約１６
時間、ヘッドスペースが限られた閉鎖容器中で増殖させ、採集し、新鮮な培地で
洗浄した。培養物のストックは、１０％のグリセロール中で約−８０℃に維持し
た。
【０１１３】 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８（ＡＴＣＣ登録番号
５５７３９、１９９７年１０月７日に出願されたクックらへの米国特許第５，６
７４，９０１号（その全体が引用により本明細書に組み込まれる）に関連してＡ
ＴＣＣ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓ
ｓａｓ，ＶＡ ２０１１０，ＵＳＡ所在）に１９９６年２月１５日に寄託）は、
マディソンのウィスコンシン大学のＦｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅＭｉｃｈａｅｌ Ｐａｒｉｚａ博士より供与された。生物をヘッドスペー
スが限られた閉鎖容器中で、ＭＲＳ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｂｒｏｔｈ
（ＢＢＬ）により増殖させた。大量培養物を振動させずに３７℃で約３６〜約４
０時間２Ｌの瓶で増殖させ（１−２％の接種物）、遠心により採集し、０．１Ｍ
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、０．９％ ＮａＣｌ ｐＨ６．０緩衝液で一度洗浄し、直
ちに使用するかまたは約−８０℃で保存した。
【０１１４】 上に述べたように培養物を増殖、採集した。洗浄した細胞を、新鮮な増殖培地
様々な濃度でリノール酸を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０緩衝液のいず
れかに再懸濁した。
【０１１５】 好気性の生体内変換を、室温で振とう機の上で２００ｒｐｍで振動させたバッ
フル２５０ｍＬ振とうフラスコ中で実行した。
【０１１６】 嫌気性生体内変換を、３７℃で、９５％窒素／５％二酸化炭素のヘッドスペー
ス下で、密封した１５０ｍＬ血清ボトル中で実行した。培地は、１５分間Ｎ2／
ＣＯ2雰囲気下でボトリングすることで嫌気的に調製し、波形隔膜により封止し
、オートクレーブした。ＭＲＳブロス（ＢＢＬ）はＬ．ｒｅｕｔｅｒｉに関して
使用した。補給したブレインハートインフュージョンブロスは、他の微生物に関
して嫌気性生体内変換において使用した。
【０１１７】 試料は適切な間隔を空けて採取し、実施例例２に説明するようにＣＬＡを分析
した。いくつかの実験では、様々な界面活性剤を、０．１−０．５％の最終濃度
になるように加えた。有機溶媒を用いた実験では、リノール酸をヘキサン（ｌｏ
ｇＰ＝３．６）、デカン（ｌｏｇＰ＝５．６）またはヘキサデカン（ｌｏｇＰ＝
８．６）に溶解した５％（ｖ／ｖ）ストックとして提供した。約５ｍＬの溶媒を
、室温でインインキュベートされた１２５ｍＬのバッフル振とうフラスコ中の約
２０ｍＬ水性細胞懸濁液に加えた。
【０１１８】 図１Ａおよび１Ｂは、好気（図１Ａ）および嫌気（図１Ｂ）条件下のＣｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ２５７６２による細胞全体で
の生体内変換の結果を示す。図１Ａが示すように、好気条件下では、Ｃ．ｓｐｏ
ｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ２５７６２は急速にリノール酸を（ｃｉｓ，ｔｒａｎ
ｓ）−９，１１−ＣＬＡに変換する。しかしながら、細胞全体による生体内変換
を延長すると、（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−ＣＬＡが減少し、（ｔｒａ
ｎｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−ＣＬＡおよび（ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ）−１
０，１２−ＣＬＡが増大する。Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ２５７６２
はさらに、嫌気条件下（図１Ｂ）でもリノール酸からの（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）
−９，１１−ＣＬＡを生産する。しかしながら、（ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ）−
ＣＬＡは嫌気条件下では観察されない。
【０１１９】 図２Ａおよび２Ｂは、好気（図２Ａ）および嫌気（図２Ｂ）条件下のＣ．ｂｉ
ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＡＴＣＣ６３８による細胞全体での生体内変換の結果を
示す。リノール酸はＣ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＡＴＣＣ６３８により、嫌
気条件下（図２Ｂ）よりも好気条件下（図２Ａ）で急速に（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ
）−９，１１−ＣＬＡに変換される。最も高い（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１
１−ＣＬＡ濃度は、好気条件下で約１時間〜約５時間の間に観察される。Ｃ．ｓ
ｏｒｄｅｌｌｉｉＡＴＣＣ９７１４も好気および嫌気条件の両方でリノール酸を
（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−ＣＬＡに変換する（データ非図示）。
【０１２０】 図３Ａ、３Ｂおよび４は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｎｓｅ
ｎｉｉ ＡＴＣＣ１４０７３（図３Ａ）、Ｐ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ６９１９（
図３Ｂ）、Ｐ．ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ ＡＴＣＣ２５５６２（図４）
による細胞全体での生体内変換の結果をそれぞれ示す。興味深いことに、Ｐ．ａ
ｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉはリノール酸を（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１
１−ＣＬＡに変換するが、Ｐ．ａｃｎｅｓは嫌気条件下でリノール酸を（ｔｒａ
ｎｓ，ｃｉｓ）−１０．１２−ＣＬＡに変換することがわかった。
【０１２１】 図５はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉによる細胞全体での生体
内変換を示す。他の微生物とは異なり、リノール酸からＬ．ｒｅｕｔｅｒｉによ
り形成された（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−ＣＬＡの濃度は、時間と共に
有意に減少しない。Ｔｗｅｅｎ−８０またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００のような種
々の非イオン界面活性剤を添加すると、（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−Ｃ
ＬＡ形成が大幅には増大しない。
【０１２２】実施例２ 本実施例では、ＣＬＡへのリノール酸の変換量を決定するための脂肪酸分析方
法について説明する。
【０１２３】 脂肪酸を、約１ｍＬから約２．５ｍＬの水性試料から０．５ｍＬの５Ｍ Ｎａ
Ｃｌを加えた抽出した。試料はテフロン（登録商標）裏付きキャップを備えたガ ラスねじ込みキャップ管中で、５ｍＬのクロロホルム／メタノールの２：１混合 物と振とうさせた。二相を分離し、約１〜２ｍＬのクロロホルム層を除去した。 有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させて濃縮した。濃縮脂肪酸を、Ｃｈｉｎら，Ｊ．Ｆ ｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，１９９２，５：１８５−１９２の手順により メチルエステルに変換した。６０℃に予め加熱しておいた約６ｍｌの４％ＨＣｌ メタノール溶液を、脂肪酸試料を含んでいるガラス管に加えた。管をテフロン裏 付きキャップで封止し、管ヒーターにて６０℃で２０分間インキュベートした。 その後、室温まで冷却し、２ｍＬの水と３ｍＬのヘキサンを加えた。振とう後、 有機層を分離し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、ガスクロマトグラフィーにより分析し た。４つのＣＬＡピークの順序は、（１）（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１− ＣＬＡ、（２）（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−ＣＬＡ、（３）（ｃｉｓ ，ｃｉｓ）−９，１１−ＣＬＡと（ｃｉｓ，ｃｉｓ）−ｌ０，１２−ＣＬＡ、お よび（４）（ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−ＣＬＡおよび（ｔｒａｎｓ ，ｔｒａｎｓ）−１０、１２−ＣＬＡであった。
【０１２４】実施例３ 本実施例では、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉからのリノール酸イソメラーゼの精製につ
いて説明する。界面活性剤可溶化タンパク質分画は以下のように調製した。凍結
した細胞を解凍し、氷上で切断緩衝液中に懸濁した。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ用の標
準切断緩衝液は、０．１Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｕｌｔ
ｒｏｌグレード）ｐＨ５．８（４℃）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロー
ル、２ｍＭジチオスレイトールから構成された。他の生物用には、ｐＨ７．５の
Ｔｒｉｓ緩衝液をＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液の代わりに使用した。細胞懸濁液をＳ
ＬＭ Ａｍｉｎｃｏフレンチプレスを使用して、約１．２０３３×１０8（１８
，０００ｐｓｉ）で破壊した。抽出液を１２，０００×ｇで３０分間遠心した。
上清をさらに１００，０００×ｇで９０分間遠心して、さらに細かい分画に分け
、可溶性分画および膜ペレットを精製した。膜ペレットを、再懸濁し（約５ｍｇ
／ｍＬ、界面活性剤緩衝液（０．１ＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐＨ５．８、０．２
５ＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭジチオスレイトール、０．３％オク
チルチオグルコピラノシド（ＯＴＧＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｕｌｔｒｏｌグ
レード）））で４度、４〜１８時間、磁気スターラーを用いて静かに撹拌しなが
ら抽出した。１００，０００×ｇで９０分間遠心した後、上清（つまり界面活性
剤可溶化タンパク質分画）を、方法Ａ、ＢまたはＣによってさらに以下のように
精製した。
【０１２５】 方法Ａ 界面活性剤可溶化タンパク質分画を、低塩濃度緩衝液（０．１Ｍ Ｂｉｓ−Ｔ
ｒｉｓ ｐＨ ５．８、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭジチオスレイトール、１０
％グリセロール、０．３％ＯＴＧＰ）に対して一晩透析し、低塩濃度緩衝液で予
め平衡化しておいた２．１×１５ｃｍ ＤＥＡＥ−５ＰＷ カラム（ＴｏｓｏＨ
ａａｓ）にかけた。カラムを１Ｍ ＮａＣｌ（高塩濃度緩衝液）を含んでいる同
じ緩衝液で洗浄した（４ ｍＬ／分）。このステップの結果を図６に示す。タン
パク質濃度を、２８０ｎｍで連続的にモニターした。約４ｍＬ分画を採取し、イ
ソメラーゼ活性について分析した。抽出液におけるイソメラーゼ活性は２０ｐｐ
ｍリノール酸で測定した。有意なイソメラーゼ活性を備えた分画を合一し、Ａｍ
ｉｃｏｎ限外濾過細胞を使用して濃縮した。その後、濃縮分画を、１．６×５５
ｃｍのＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲルろ過カラムにかけ
た。カラムを、０．１Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐＨ ５．８、０．２Ｍ ＮａＣ
ｌ、１０％グリセロール、２ｍＭジチオスレイトール、０．３％ＯＴＯＰを含む
緩衝液で０．５ｍＬ／分で展開した。２．０ｍＬの分画を採取し、イソメラーゼ
活性について分析した。活性分画を収集し、濃縮し、０．１Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉ
ｓ ｐＨ５．８、１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１０％グリセロール、２ｍＭジチオス
レイトール、０．３％ＯＴＯＰ、０．２Ｍ ＮａＣｌで平衡化しておいたヒドロ
キシルアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ５ｍＬ ＣＨＴ−ＩＩカートリッジ
）にかけた。カラムを、４００ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4を含んでいる同じ緩衝液を使用
してリン酸塩を増やして洗浄した（１ ｍＬ／分）。結果を図７に示す。活性分
画を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍを使用して１２．５％のア
クリルアミドゲルのＳＤＳ ＰＡＧＥに供した。イソメラーゼ活性は、４５〜７
０キロダルトン（ｋＤ）に及ぶゲル上の４本のバンドと相関した。
【０１２６】 方法Ｂ 界面活性剤可溶化タンパク質分画をアフィニティカラムにかけた。その後、ア
フィニティカラムを、０．１Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐＨ ５．８、１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．３％ＯＴＯＰ、２ｍＭジチオスレイトール、１０％グリセロール、２
０％ １，２−プロパンジオールを含む低濃度塩緩衝液（７５ｍｌ）、高濃度塩
緩衝液（５０ｍＬ）、およびリノール酸緩衝液（１００ｍｌ）で連続的に洗浄し
た。（１ｍＬ／分）。
【０１２７】 アフィニティカラムは以下のように作成した。Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＥＡＨセ
ファロース４Ｂを洗浄し、脱イオン水にスラリーとして懸濁した。５倍過剰量の
リガンド（リノール酸またはオレイン酸）を、等量の１，２−プロパンジオール
に加えた。固体Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボ
ジイミド（ＥＤＣ）を０．１Ｍまで加え、ｐＨを約５．０に調整し、また、スラ
リーを室温でゆっくり反転させて一晩混合した。ゲルはガラスフリット漏斗上に
収集し、５０％ １，２−プロパンジオール、０．１Ｍ 酢酸カリウムｐＨ ４
．０、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．２で念入りに
連続的に洗浄した。その後、樹脂を洗浄し、低塩濃度緩衝液に懸濁し、１．６×
２０ｃｍのアフィニティカラムの作成に使用した。
【０１２８】 方法Ｃ 界面活性剤可溶化タンパク質分画を、方法Ａに説明したようなＤＥＡＥ−５Ｐ
Ｗカラムを使用して、クロマトグラフィーにより精製した。イソメラーゼ活性を
有する分画を、合一し、限外濾過で濃縮、脱塩した。得られた試料を、２５ｍＭ
トリエタノールアミン、１ｍＭジチオスレイトール、０．３％ＯＴＯＰｐＨ ８
．３を含む緩衝液で予め平衡化しておいたＭｏｎｏ ＰＨＲ ５／２０カラム（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ（０．５×２０ｃｍ））にかけた。その後、カラムを、１０
％ Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ９６（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．３％ＯＴＧＰ、１
ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ６．５を含む緩衝液で溶出し、１ｍＬの分画を採
集した。図８に示されるように、タンパク質の一部は初期の分画（分画５−１５
）に存在し、イソメラーゼ活性を有する分画は分画２７〜４７の間に一般に溶出
された。イソメラーゼ活性を有する分画を合一し、方法Ａで説明したようにＳｕ
ｐｅｒｄｅｘ−２００ゲルろ過カラムを使用して、クロマトグラフィーでさらに
精製した。イソメラーゼ活性を有する分画は、約１６０ｋＤの質量を有する単一
バンドとして溶出された。この同じバンドを変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、
約７０ｋＤの単一バンドを生じた。この７０ｋＤのバンドを切り出し、当業者に
周知の技術を用いてＮ末端アミノ酸配列決定を行った。約３５のアミノ酸の部分
的Ｎ末端アミノ酸配列が導き出された。これを本明細書では配列番号１として表
す。配列番号１の配列を有するタンパク質を本明細書ではＰＣＬＡ35と称する。
アミノ酸配列決定技術に誤差が全くないわけではないので、配列番号１がせいぜ
い見かけの部分Ｎ末端アミノ酸配列を表わすにすぎないことに注意すべきである
。 Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ９，１１−リノール酸イソメラーゼの精製の様子を表１
Ａに要約する。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】実施例４ 本実施例では、分画またはタンパク質のイソメラーゼ活性の存在を決定するた
めの手順について説明する。本実施例は、動力学的検定を行う方法についても説
明する。
【０１３１】 リノール酸イソメラーゼ活性は、実施例２に説明したようなガスクロマトグラ
フィーでのＣＬＡの定量化によりまたは分光測定法により分析した。酵素検定を
、別段の定めがない場合、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液 ｐＨ７．５，１０ｍＭ
ＮａＣｌ，１ｍＭジチオスレイトール、２０ｐｐｍのリノール酸で行った。
【０１３２】 約５０〜約２５０μＬの酵素試料を、反応のため１．５ｍＬの酵素検定緩衝液
に加えた。約１〜約２ｍＬの水相を酵素反応から分離し、約３ｍｌのヘキサンで
抽出した。いくつかの実験では、および界面活性剤を含むクロマトグラフィー分
画に関して、０．５ｍＬのメタノールおよび０．５ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ溶液を
、相分離を増強するために最初に添加した。有機層は分離し、２３４ｎｍでの吸
光度をＨＰ ８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計を使用して測定した。活性
のレベルによって、クロマトグラフィー分画の検定混合物を、ヘキサンでの抽出
前に約１〜約２４時間室温でインキュベートした。
【０１３３】 動力学的検定を、室温で０．５ｍｌの石英キュベットにて直接実行し、２３４
ｎｍで連続的にモニターした。反応は、１，２−プロパンジオールに入れて調製
した濃縮ストックからのリノール酸の添加により開始した。反応緩衝液は１０％
の１，２−プロパンジオールを含む以外は、上記のものと同じであった。
【０１３４】実施例５ 本実施例は、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉリノール
酸イソメラーゼ核酸分子の核酸クローニングおよび配列決定を示す。 アミノ酸配列決定および核酸配列決定技術に誤差が全くないわけではないので
、本実施例で示した配列および以下に示す配列がせいぜい本発明のリノール酸イ
ソメラーゼの見かけの配列を表わすにすぎないことに注意すべきである。
【０１３５】 ２セットの完全縮重オリゴヌクレオチドプライマーを、配列番号１のアミノ酸
残基１−７および２３−２９の配列に対応して合成した。ＣＬＡ０１と名付けた
第１オリゴヌクレオチドプライマーは以下の配列を有していた：
【０１３６】 ５’−ｃｇｔ ｇａａ ｔｔｃ ＡＴＧ ＴＡ（Ｔ／Ｃ） ＴＡ（Ｔ／Ｃ） （
Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）Ｎ ＡＡ（Ｔ／Ｃ） ＧＧＮ ＡＡ−３’ （５’末端にＥｃｏＲＩ部位と余分な３塩基（小文字で示す）を含んでいる）（
配列番号２）。
【０１３７】 ＣＬＡ０２と名付けた第２オリゴヌクレオチドプライマーは以下の配列を有し
ていた： ５’−ａｃｔ ｇｇａ ｔＣＣ ＮＡＣ （Ｔ／Ａ／Ｇ）ＡＴ （Ａ／Ｇ）Ａ
Ｔ ＮＧＣ （Ａ／Ｇ）ＴＧ （Ｃ／Ｔ）ＴＴ−３’ （５’末端にＢａｍＨＩ部位と余分な３塩基（小文字で示す）を含んでいる）（
配列番号３）。
【０１３８】 ＰＣＲ産物を、最良のＰＣＲ条件下でＬ．ｒｅｕｔｅｒｉゲノムＤＮＡから増
幅し、ゲル精製した。予想サイズ（約１００ｂｐ）を有するＰＣＲ産物の単一バ
ンドが、３％アガロースゲル上で検出された。ＰＣＲ産物を精製し、ＳｒｆＩ部
位でベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｐ）ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎ）に挿入してクローニングした。組換プラスミドを制限消化により分析し、配
列決定した。
【０１３９】 配列決定された４つのクローンは、同じ配列を有する約８７のヌクレオチドの
挿入フラグメントを有している。その同じ配列（配列番号４）をここではＣＬＡ 87 と表わす。導き出されたアミノ酸配列（配列番号５）は、実施例３において同
定されたリノール酸イソメラーゼのＮ末端配列と一致する。配列番号５の配列を
有するタンパク質を、本明細書ではＰＣＬＡ28と称する。
【０１４０】 逆ＰＣＲ増幅のアプローチを使用して、Ｎ末端コーディング配列（ｎＣＬＡ87 ）の両側にあるＤＮＡフラグメントをクローニングした。ＣＬＡ０３およびＣＬ
Ａ０４（それぞれ配列番号６および配列番号７）と名付けた２つのオリゴヌクレ
オチドプライマーを、逆ＰＣＲのために設計した。ＣＬＡ０３は、ｎＣＬＡ87（
配列番号４）のヌクレオチド２５−４１に相当し、ＣＬＡ０４はｎＣＬＡ87（配
列番号４）のヌクレオチド４６−６７に相当した。
【０１４１】 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８由来のゲノムＤＮＡ
を、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理して分子を円形に
し、得られた分子をＰＣＲ反応の鋳型として使用した。５９２ヌクレオチドのＰ
ＣＲ産物を精製し、ＳｒｆＩ部位でベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｐ）
ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）に挿入してクローニング、配列決定した。こ
の分子の５９６ｂｐの編集バージョンを、本明細書ではｎＣＬＡ596（配列番号
８）として表す。ｎＣＬＡ596はリノール酸イソメラーゼ遺伝子の５’上流配列
と３’下流配列の両方を含んでいる。配列のＢａｍＨＩ部位は、接合箇所を示す
。しかしながらＢａｍＨＩ部位は配列中に検出されなかった。従って、ｎＣＬＡ 596 中の配列を、そのＯＲＦおよび配列ｎＣＬＡ87に関して試験的に編集した。
この試験的に編集した配列は、４７５のヌクレオチドのＯＲＦを含んでいる。こ
のＯＲＦの導き出されたアミノ酸配列は、ＰＣＬＡ158（配列番号９）と示され
る。配列番号９の配列を有するタンパク質を、ここではＰＣＬＡ158と称する。
【０１４２】 ＣＬＡ０３とＣＬＡ０４の直接両側にある配列はｎＣＬＡ87中の配列と同一で
あり、クローニングされたＰＣＲ産物の同一性が確認された。 ｎＣＬＡ596を32Ｐで標識し、様々な制限酵素で消化したＬａｃｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８ゲノムＤＮＡのサザンブロットにハイブリ
ダイズした。ｎＣＬＡ596の部分リノール酸イソメラーゼ配列は、１つのＡｇｅ
Ｉ部位と１つのＥｃｏ５８Ｉ部位を有している。予想通り、ゲノムＤＮＡをそれ
らの２つの酵素で個々に消化したとき、２本のハイブリダイゼーションバンドが
サザンブロットで観察された。
【０１４３】 ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩのような部
分イソメラーゼ配列を切断しない酵素で調製した消化物ではたった１本のハイブ
リダイゼーションバンドしか検出されなかったが、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、およ
びＳｐｈＩ消化物に関しては高分子量領域（＞１０ｋｂ）により広がったハイブ
リダイゼーションシグナルが観察された。これらのデータは、リノール酸イソメ
ラーゼ遺伝子がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉＰＹＲ８のゲノム
中の単一コピーとして存在することを示す。
【０１４４】 リノール酸イソメラーゼ遺伝子全体をクローニングするために、逆ＰＣＲのア
プローチを続けて行った。上述したように、制限酵素ＡｇｅＩ部位は配列番号８
（ｎＣＬＡ596）の中央のヌクレオチド２９５位置に存在する。サザンハイブリ
ダイゼーションによれば、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８ゲノムＤＮＡのＡｇｅ
Ｉ消化物では２本のバンドが示された：それぞれ約１．１ｋｂおよび約２．３ｋ
ｂ。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８由来のゲノムＤＮＡをＡｇｅＩで消化し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで再びライゲートして、ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。最
良の条件下では、ＣＬＡ０３およびＣＬＡ０４のプライマーセットを使用して約
１．１ｋｂのＰＣＲ産物が生成され、ＣＬＡ０５およびＣＬＡ０のプライマーセ
ットを使用して２．３ｋｂの産物が生成された（それぞれ配列番号１２および配
列番号１３）。ＣＬＡ０５はｎＣＬＡ596のヌクレオチド３２６−３４２に相当
する。また、ＣＬＡ０６はｎＣＬＡ596のヌクレオチド３９６−４１４に相当す
る。これらの結果はサザンブロットデータと一致している。
【０１４５】 両方のＰＣＲ産物を、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（ＡＭｐ）ＳＫ（＋）（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎ）に挿入してクローニングした。１．１ｋｂのフラグメントを含む
クローンをｎＣＬＡ1.1で表し、２．３ｋｂのフラグメントを含むクローンをｎ
ＣＬＡ2.3で表す。
【０１４６】 最初に、ｎＣＬＡ1.1の中のＣＬＡ０３から上流の約７００のヌクレオチドの
配列決定データと、ｎＣＬＡ2.3の中のＣＬＡ０６の下流の約７００のヌクレオ
チドの配列決定データを得た。ｎＣＬＡ596、部分ｎＣＬＡ1.1および部分ｎＣＬ
Ａ2.3の配列を編集し、ｎＣＬＡ1109（配列番号１０）としてここで表す複合配
列を生成した。配列番号１０の導き出されたアミノ酸配列を、ここでは配列番号
１１で表わす。配列番号１１の配列を有するタンパク質を、ここではＰＣＬＡ32 4 と称する。
【０１４７】 ｎＣＬＡ1709は、イソメラーゼコーディング配列の一部と同様、５’上流配列
を含む。精製されたポリペプチドの第１アミノ酸に対応するＡＴＧコドンから上
流の７３７のヌクレオチド配列はを、ＢＬＡＳＴネットワークのＢｌａｓｔｘ（
読取枠）およびＢｌａｓｔｎ（ヌクレオチド）検索を使用して、既知の配列と比
較した。いかなるエントリに対しても有意な相同性は見出されなかった。スコア
はＢｌａｓｔｘについては１７６未満であり、Ｂｌａｓｔｎについては１５３未
満であった。ＡＴＧ開始コドンから下流のコーディング配列は、６７ｋＤのミオ
シンと交差反応するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｕ０９３
５２）由来の連鎖球菌抗と相同性を示し、アミノ酸レベルで６９％の同一性およ
びヌクレオチドレベルで６６％の同一性であった。同一ヌクレオチドの中で最長
の伸張部は２３のヌクレオチドである。イソメラーゼコーディング配列は、Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｌ１９３００）由来のＯＲＦとも相
同性を示し、アミノ酸レベルもヌクレオチドレベルも共に６２％の同一性であっ
た。
【０１４８】 ｎＣＬＡ1.1とｎＣＬＡ2.3の初期配列決定に続いて、両方のクローンを完全に
配列決定した（それぞれ配列番号１４および配列番号１５）。また、これらの配
列を、ｎＣＬＡ596（配列番号８）の配列と共に組み合わせて、３５５１のヌク
レオチドの核酸配列（ｎＣＬＡ3551で表し、ここでは配列番号１６で表す）を生
成した。配列番号１４は、配列番号１６のヌクレオチド１〜１１７３にわたり、
配列番号１５は、配列番号１６のヌクレオチド１１７４〜３５５１にわたる。
【０１４９】 ｎＣＬＡ3551は３つの読取枠（図９；ＩＳＯＭ、ＤおよびＥ）を含んでおり、
第１のＯＲＦ（図９；ＩＳＯＭ）は配列番号１６のヌクレオチド位置１０００〜
２７７５にわたる約１．８ｋｂの核酸であり、ここでは配列番号１７として表す
。配列番号１７は本発明のリノール酸イソメラーゼをコードする。配列番号１７
によって表された核酸配列を有する核酸分子を、ここではｎＣＬＡ1776と称し、
該タンパク質は配列番号１８によって表されるアミノ酸配列を有する５９１のア
ミノ酸残基の約６７ｋＤ（導き出された）タンパク質をコードしている。配列番
号１８のアミノ酸配列を有するタンパク質を、ここではＰＣＬＡ591と称する。
ＰＣＬＡ591の導き出されたサイズは、ＳＤＳゲルで決定された精製イソメラー
ゼタンパク質のサイズと一致している。この第１のＯＲＦ（配列番号１７）の開
始コドンから上流の７つのヌクレオチドは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに関し
て報告されたコンセンサス（共通）リボゾーム結合部位と類似の配列である。さ
らに、この第１ＯＲＦから上流には、−１０および−３５プロモーター配列に類
似の配列がある。これらの配列特徴は、ｎＣＬＡ3551の位置１０００での開始コ
ドンが翻訳開始コドンであるという結論と一致している。代わりに、ｎＣＬＡ35 51 の配列は、第１ＯＲＦから上流の位置１０００の位置の開始コドンから上流の
３６のヌクレオチドに、インフレームで２つのＡＴＧ開始コドンを縦に一列に有
する。これらのコドンのうちの１つが翻訳開始コドンである場合、成熟イソメラ
ーゼを形成するために後に分断される、約１２アミノ酸のリーダーペプチドが生
産され得る。
【０１５０】 上述のように決定したリノール酸イソメラーゼ遺伝子用の完全なコーディング
配列（配列番号１７）をＢＬＡＳＴネットワークのＢｌａｓｔｘ（読取枠）およ
びＢｌａｓｔｎ（ヌクレオチド）検索を使用して既知の配列と比較した。配列番
号１７によってコードされたリノール酸イソメラーゼは、前に言及したＳｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｕ０９３５２）６７ｋＤミオシン交
差反応連鎖球菌抗原と６７％の核酸レベルの同一性および７０％のアミノ酸レベ
ルの同一性を示した。配列番号１７によってコードされたリノール酸イソメラー
ゼと上述のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｌ１９３００）遺伝子
との間の相同性は、それよりわずかに低く、核酸レベルで約６０％およびアミノ
酸レベルで約６２％であった。ＢＬＡＳＴ ２．０検索パラメータは、上述のよ
うな標準デフォルト値であった。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓ（Ｕ０９３５２）配列およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（
Ｌ１９３００）配列のいずれに対しても明確な機能は以前に説明されていない。
【０１５１】 ｎＣＬＡ3551の第２読取枠（図９，Ｅ）は、配列番号１６のヌクレオチド位置
２８９６〜３５５１に由来するもので、配列番号１９で表す。配列番号１９を有
する核酸分子をここではｎＵＮＫ１656と称する。ＵＮＫ１656は配列番号２０の
アミノ酸配列ｗｐ有する約２１８のアミノ酸残基のタンパク質をコードしている
。配列番号２０を有するタンパク質をここではＰＵＮＫ１218と称する。ＰＵＮ
Ｋ１218の機能は未知である。ＵＮＫ１656の配列を既知の配列と相同性を比較し
たが、有意な相同性は同定されなかった。この第２読取枠は、リノール酸イソメ
ラーゼをコードする第１読取枠（配列番号１７）から下流に位置した１２２のヌ
クレオチドである。
【０１５２】 ｎＣＬＡ3551の第３の読取枠（図９，Ｄ）は、配列番号１６に相補的なｎＣＬ
Ａ3551の鎖の側に位置し、ここでは配列番号２１として表す。配列番号２１は配
列番号１６のヌクレオチド位置１〜７２６に相補的な鎖に配置され、開始コドン
は配列番号１７の推定開始コドンの位置１０００から上流の２７５ヌクレオチド
である。配列番号２１を有する核酸分子をここではｎＣＳＮ726と称する。ｎＣ
ＳＮＡ726は配列番号２２のアミノ酸配列を有するタンパク質の少なくとも一部
をコードする。配列番号２２を含むタンパク質のＣ末端部分は単離クローン中に
は存在しなかった。配列番号２２を有する２４２のアミノ酸残基タンパク質を、
ここではＰＣＳＮ242と称する。データベース検索（ＢＬＡＳＴ２．０）は、こ
の第３のＯＲＦの核酸配列（配列番号２１）が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｑ０３１５８）由来のコンピテンス特異的ヌクレアーゼ
（ＤＮＡエントリヌクレアーゼ）と約６６％の同一性を有し、配列番号２２のア
ミノ酸配列はこのコンピテンス特異的ヌクレアーゼのアミノ酸配列と約５１−７
２％同一である。従って、配列番号１６の相補鎖上で同定された第３のＯＲＦは
、コンピテンス特異的ヌクレアーゼをコードしている可能性が考えられる。
【０１５３】実施例６ 以下の実施例では、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８ゲノム中のイソメラーゼ遺
伝子の両側に位置する配列のクローニングを示す。 逆ＰＣＲの第３ラウンドを、実施例５に説明したようなＬａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉＰＹＲ８由来の円形ゲノムＤＮＡについて実行した。
【０１５４】 この第３ラウンドを、イソメラーゼ遺伝子の両側に位置するより多くの配列を
クローニングするように設計した。ＣＬＡ０９およびＣＬＡ０１０（それぞれ配
列番号２３および配列番号２４）と名付けた２つのオリゴヌクレオチドプライマ
ーは、ＰＣＲのこのラウンドのために設計した。ＣＬＡ０９（配列番号２３）を
ｎＣＬＡ3551配列の５’末端付近に設計した（配列番号１６のヌクレオチド６３
−４０）。ＣＬＡ０１０を、ｎＣＬＡ3551配列の３’末端付近に設計した（配列
番号１６のヌクレオチド３５０５−３５２２）。
【０１５５】 詳細には、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８ゲノムＤＮＡをＳａｌＩで消化、再
びライゲートし、オリゴヌクレオチドプライマーＣＬＡ０９およびＣＬＡ０１０
で増幅した。約３．５〜４．０ｋｂのＰＣＲ産物をｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ａ
Ｍｐ）ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）に挿入してクローニングし、配列決定
した。この核酸分子をｎＳＡＬ3684と名付け、ここでは配列番号２５で表す。
【０１５６】 ｎＳＡＬ3684の同一性を、プライマーＣＬＡ０９およびＣＬＡ０１０の両側に
位置する配列により確認した。配列ｎＳＡＬ3684は固有のＳａｌＩ部位を有して
おり、これは逆ＰＣＲの接合箇所を示す。従って配列ｎＳＡＬ3684はＳａｌＩ部
位でスプライシングされ、ｎＣＬＡ3551（配列番号１６）３’および５’末端の
配列に付加される。この約７ｋｂの核酸分子をｎＣＬＡ7113と名付け、ここでは
配列番号２６で表す。
【０１５７】 約７ｋｂのＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８ゲノムＤＮＡ（配列番号２６）は、
図９に概略的に例証されるように、６つの読取枠を有している。イソメラーゼ遺
伝子（ＩＳＯＭ）５’上流には４つのＯＲＦ（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）が位置し、
イソメラーゼ遺伝子の３’下流には１つのｎＯＲＦが位置する。
【０１５８】 ｎＣＬＡ7113の第１の読取枠（図９，Ａ）は、配列番号２６のヌクレオチド位
置１−９４１にわたり、配列番号２７によって表わされる。配列番号２７を有す
る核酸分子を、ここではｎＢＳＰ941と称する。ｎＢＳＰ941は配列番号２８のア
ミノ酸配列を有する約３１２のアミノ酸残基のタンパク質をコードしている。配
列番号２８を有するタンパク質はここではＰＢＳＰ312と称される。データベー
ス検索（ＢＬＡＳＴ２．０）により、この第１のＯＲＦ Ａ（配列番号２７）に
よってコードされたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２８）がＢａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｐ５４４２５）のパーミアーゼと約５６％同一で７４
％類似（標準のＢＬＡＳＴ ２．０パラメータを使用）していることが示された
。従って、配列番号２６の第１ＯＲＦ Ａはパーミアーゼをコードしている可能
性が考えられる。
【０１５９】 ｎＣＬＡ7113の第２の読取枠（図９，Ｂ）は、配列番号２６のヌクレオチド位
置１１４６−１７４５にわたり、配列番号２９によって表わされる。配列番号２
９を有する核酸分子を、ここではｎＵＮＫ２600と称する。ｎＵＮＫ２600は配列
番号３０のアミノ酸配列を有する約１９９のアミノ酸残基のタンパク質をコード
している。配列番号３０を有するタンパク質はここではＰＵＮＫ２199と称され
る。ＰＵＮＫ２199の機能は未知である。ｎＵＮＫ２600の配列を既知の配列と相
同性について比較したが、有意な相同性は認められなかった。
【０１６０】 標準デフォルトを使用した最も高いＢｌａｓｔｐスコアは５１だった。 ｎＣＬＡ7113の第３の読取枠（図９，Ｃ）は、配列番号２６のヌクレオチド位
置１７４２−２５９０にわたり、配列番号３１によって表わされる。配列番号３
１を有する核酸分子を、ここではｎＵＮＫ３849と称する。ｎＵＮＫ３849は配列
番号３２のアミノ酸配列を有する約２８２のアミノ酸残基のタンパク質をコード
している。配列番号３２を有するタンパク質はここではＰＵＮＫ３282と称され
る。ＰＵＮＫ３282の機能は未知である。ｎＵＮＫ３849の配列を既知の配列と相
同性について比較したが、有意な相同性は認められなかった。
【０１６１】 標準デフォルトを使用した最も高いＢｌａｓｔｐスコアは６８だった。 ｎＣＬＡ7113の第４の読取枠（図９，Ｄ）は、配列番号２６のヌクレオチド位
置２６６２−３４０５にわたり、配列番号３３によって表わされる。配列番号３
３を有する核酸分子を、ここではｎＣＳＮ744と称する。ｎＣＳＮ744は配列番号
３４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている。配列番号３４を有す
る２４７のアミノ酸残基タンパク質を、ここではＰＣＳＮ247と称する。実施例
５（ｎＣＬＡ3551中で同定された第３のＯＲＦ）に記したように、ＰＣＳＮ242
（配列番号２２）は、ＰＣＳＮ247に含まれ、配列番号３４のアミノ酸位置１−
２４２にわたる。同様に、ｎＣＳＮ726（配列番号２１）の核酸配列は配列番号
３３のヌクレオチド１−７２６にわたる。データベース検索（ＢＬＡＳＴ２．０
）によれば配列番号３４のアミノ酸配列が上記のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅコンピテンス特異的ヌクレアーゼのアミノ酸に対して約５
７％同一で約７１％類似する（標準のパラメータを使用して）ことが示された。
【０１６２】 ｎＣＬＡ7113の第５の読取枠（図９，ＩＳＯＭ）は、実施例５に上述したよう
に、本発明のリノール酸イソメラーゼ（ＰＣＬＡ591、配列番号１８）をコード
する核酸分子（ｎＣＬＡ1776、配列番号１７）である。
【０１６３】 ｎＣＬＡ7113の第６の読取枠（図９，Ｅ）は、配列番号２６のヌクレオチド位
置５５７４−７１１３にわたり、配列番号３５によって表わされる。配列番号３
５を有する核酸分子を、ここではｎＵＮＫ１1540と称する。ｎＵＮＫｌ1540は配
列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている。配列番号３６
を有する５１３のアミノ酸残基タンパク質を、ここではＰＵＮＫ１513と称する
。実施例５（ｎＣＬＡ3551中で同定された第２のＯＲＦ）に記したように、ＰＵ
ＮＫｌ218（配列番号２０）は、ＰＵＮＫ１513に含まれ、配列番号３６のアミノ
酸位置１−２１８にわたる。同様に、ｎＵＮＫｌ656（配列番号１９）の核酸は
、配列番号３５のヌクレオチド１−６５６にわたる。ｎＵＮＫｌ1540の配列を既
知の配列と相同性について比較したが、有意な相同性は認められなかった。ＰＵ
ＮＫ１513に対する標準デフォルトを使用した最も高いＢｌａｓｔｐスコアは５
１だった。ＰＵＮＫ１513のＣ末端配列は不完全である。
【０１６４】 イソメラーゼ遺伝子は、モノシストロンとして転写される可能性が非常に高い
。この結論は２つの観察に基づく。第１に、イソメラーゼ遺伝子からすぐ上流に
位置するＯＲＦ（図９，Ｄ）は、対向する鎖上にコードされる。第２に、逆反復
ＤＮＡ配列が、イソメラーゼ遺伝子の停止コドンから下流の領域（図１０）で観
察された。停止コドンの後の６塩基目から開始するこの２８のヌクレオチド構造
（配列番号３７）は、たった１つの対合しない塩基を有している。この構造は、
イソメラーゼ遺伝子のρ依存性ステムループ転写ターミネーターとして機能し得
る。従って、イソメラーゼ遺伝子がモノシストロンとして恐らく転写され、イソ
メラーゼ遺伝子から下流の読取枠は個別の転写単位になっていることが結論され
る。
【０１６５】 Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ由来のリノール酸イソメラーゼは、その活性がほとんど細
胞タンパク質抽出物の細胞膜分画で検出され、該酵素を可溶性にするために界面
活性剤が必要であるため、の膜タンパク質である。このデータと一致して、イソ
メラーゼＯＲＦの親水性プロットは、アミノ酸残基２７から４２の、Ｎ末端配列
に近い主要な疎水性ドメインを示す。この疎水性ドメインは、膜にタンパク質を
向ける際に重要な役割を果たす、未分断シグナルペプチドの一部としても膜貫通
セグメントとしても機能するかもしれない。アミノ酸位置８９、１２４、３３６
および４３０にペプチドが４つのシステイン残基を含むことは、天然タンパク質
が１つまたは２つの内部ジスルフィド結合を有することを示唆しており、興味深
い。
【０１６６】実施例７ 以下の実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉでのＬ．ｒｅｕｔｅｒｉリノール酸イソメラ
ーゼの発現を示す。 ２つのオリゴヌクレオチドを合成し、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８ゲノムＤ
ＮＡ由来のイソメラーゼ遺伝子（プロモーター−ＯＲＦ−ターミネーター）を増
幅した（例５に記した）。正方向プライマーであるヌクレオチドＣＬＡ０７（配
列番号３８）は、配列ｎＣＬＡ7113（配列番号２６）の位置３２９６−３３１４
に相当し、５’末端にＳａｌＩ部位と余分な３塩基（小文字）を含んでいる。
【０１６７】 ５’−ｇｃａｇｔｃｇａｃＧＧＡＧＴＴＡＡＧＡＣＴＧＡＡＴＴＡＧ−３’ 逆方向プライマーであるヌクレオチドＣＬ０８Ｂ（配列番号３９）は、配列ｎ
ＣＬＡ7113（配列番号２６）に位置５５７７−５５９３に相当し、５’末端にＳ
ａｌＩ部位と余分な３塩基（小文字）を含んでいる。
【０１６８】 ５’−ｃｔａｇｔｃｇａｃＧＣＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＡＣ−３’ ２．３ｋｂのＰＣＲ産物を、平滑末端でＳｒｆｌ部位においてｐＰＣＲ−Ｓｃ
ｒｉｐｔ（Ａｍｐ）ＳＫにライゲートした。ライゲートされたＤＮＡをＥ．ｃｏ
ｌｉ細胞で形質転換した。両方の方向に挿入したフラグメントを備えたクローン
を選択し、イソメラーゼ遺伝子の発現について試験した。構築物＃１（図１１）
では、イソメラーゼ遺伝子を、ｌａｃプロモーターより下流に配置した。構築物
＃２（図１１）では、イソメラーゼ遺伝子をｌａｃプロモーターとは逆方向に配
置した。
【０１６９】 イソメラーゼ活性を検出するために、異なるイソメラーゼ構築物で形質転換し
たＥ．ｃｏｌｉ細胞を中央の対数増殖期まで生育し、ＩＰＴＧの存在下または不
在下で１〜３時間誘導し、イソメラーゼ活性検定を試験するために採集した。リ
ノール酸は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（生体内変換）とまたは粗細胞溶菌液とインキュ
ベートした。脂肪酸をヘキサンで抽出し、ガスクロマトグラフィーで分析した。
Ｅ．ｃｏｌｉのプラスミド構築物＃１およびプラスミド構築物＃２の両方に関し
て、イソメラーゼ活性は生体内変換によっても粗細胞溶菌液によっても検出され
なかった。しかしながら、ＳＤＳゲル分析によると、ＩＰＴＧが構築物＃１で形
質転換した細胞において６７ｋＤタンパク質の発現を誘導することが示された。
発現したイソメラーゼタンパク質のサイズは、イソメラーゼ遺伝子配列分析から
予測されたサイズであり、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８から生成した天然イソ
メラーゼのサイズとよい一致を見ている。触媒活性の欠如は、異種系でのイソメ
ラーゼは正しくない折り畳みおよび／または膜への挿入によるものかもしれない
。
【０１７０】 ｐＥＴベクターを使用して、イソメラーゼコーディング配列がＣ末端のＨｉｓ
タグと融合されたイソメラーゼ遺伝子構築物を作成した。Ｈｉｓタグに特異的な
市販の抗体を使用すれば、酵素が不活性だったとしても、ウェスタンブロット分
析によりＥ．ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓまたは
他の適切な発現宿主において合成されるイソメラーゼ−Ｈｉｓタグ融合タンパク
質のレベルをモニターすることが可能となり得る。構築物がＥ．ｃｏｌｉプラス
ミドより作成されるため、該方法を試験するためにＥ．ｃｏｌｉ系を使用し得る
。イソメラーゼ−Ｈｉｓタグタンパク質を、大量のイソメラーゼタンパク質を生
産するためにＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。このタンパク質をニッケルカラ
ムで変性条件下でさらに精製し、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８リノール酸イソ
メラーゼに特異的な抗体の生産に使用し得る（例１０を参照）。天然の宿主およ
び組換え系におけるイソメラーゼ発現は、そのような抗体を用いてモニターする
ことが可能である。さらに、抗体を免疫スクリーニングに用いて、リノール酸イ
ソメラーゼを生産する新規な微生物菌株を同定し、ついには追加のリノール酸イ
ソメラーゼ遺伝子のクローニングを援助することが可能である。
【０１７１】 追加実験中において、形質転換され、Ｈｉｓタグを備えたＰＹＲＳイソメラー
ゼ遺伝子を発現しているＥ．ｃｏｌｉ（図１１，＃３）を標準条件で増殖させ、
イソメラーゼタンパク質の発現について研究した。クマシーブルー染色したＳＤ
Ｓゲルにおいて、細胞溶菌液では６０〜７０ｋＤの間のバンドが顕著に現れた。
このバンドは誘発前でさえ高レベルに存在した。しかしながら、ＩＰＴＧの添加
は、該タンパク質の非常に強い過剰生産を誘導した（データ非図示）。最も高い
発現レベルはＩＰＴＧ誘導後の２時間目に達成された。このタンパク質バンドは
、ウェスタンブロットで抗Ｈｉｓタグ抗体によって強く認識され、このタンパク
質が正確なリノール酸イソメラーゼ融合タンパク質に一致することを確認してい
る（データ非図示）。
【０１７２】 リノール酸イソメラーゼ遺伝子を発現する細胞は、ＩＰＴＧ誘導後の４時間目
に採集し、イソメラーゼ−Ｈｉｓ融合タンパク質の位置を決定するために分析し
た。図１３は、異なるタンパク質分画の調製のための実験プロトコルを概説する
。簡単に説明すると、イソメラーゼ−Ｈｉｓタグ融合タンパク質を発現している
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、リゾチームを含む非変性緩衝液に溶解し、超音波処理で破
壊した。細胞溶菌液全体を低速で遠心し、封入体をペレット化した。粗封入体を
、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ２０と０．１ｍＭ ＥＧＴＡで２回洗浄した。洗浄し
たペレット中に保持されたタンパク質を、不適切に折り畳まれたペプチド（封入
体）の不溶性の高い凝集物だった。細胞溶菌液全体を低速で遠心することにより
生成された上清を超遠心工程にかけ、可溶化タンパク質から細胞膜（ペレット）
を分離した。界面活性剤を使用して膜タンパク質を可溶化し、その後膜タンパク
質を他の不溶性の膜成分から超遠心により分離した。細胞溶菌液全体および異な
る蛋白分画をＳＤＳゲルおよびウェスタンブロットで分析した。イソメラーゼ遺
伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の細胞溶菌液全体では、クマシー染色後、６０
〜７０ｋＤの間のタンパク質バンドのみが観察される。このタンパク質バンドを
封入体分画で回収し、ウェスタンブロットによりイソメラーゼ−Ｈｉｓタグ融合
タンパク質であることを確認した。上記実験において使用される条件下では、イ
ソメラーゼ遺伝子を有さないＥ．ｃｏｌｉ細胞溶菌液中の他のタンパク質と抗体
が交差反応しなかった。可溶性の膜分画中の融合タンパク質の量は、検出限界以
下であった。封入体分画中の融合タンパク質をＥＧＴＡとＴｗｅｅｎ２０で念入
りに洗浄し、他の混在タンパク質を除去した。精製ペプチドを、ＰＹＲ８リノー
ル酸イソメラーゼに特異的な抗体を生産するために使用する（実施例１０を参照
）。
【０１７３】 本発明のリノール酸イソメラーゼを発現するためのさらなる戦略は、以下のも
のを含むがそれらに限定されるわけではない：（１）配列の１つの疎水性ドメイ
ンを削除して、融合タンパク質の合成、溶解度、およびイソメラーゼ活性の決定
に使用するためにイソメラーゼを機能的可溶性タンパク質に変換すること；（２
）イソメラーゼ天然プロモーターの制御下にあるイソメラーゼ−Ｈｉｓタグ融合
遺伝子を初めとする、天然プロモーターと非天然の誘導または構造プロモーター
との両方を使用したＬ．ｒｅｕｔｅｒｉのイソメラーゼ生産用の構築物を作成す
ること；（３）Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＡＴＣＣ ２３２７２におけるイソメラー
ゼ遺伝子発現の制御用に、エリスロマイシン耐性遺伝子からプロモーターをクロ
ーニングすること；および（４）天然Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８菌株におけ
る野生型リノール酸イソメラーゼ遺伝子をノックアウトし、クローニングしたイ
ソメラーゼ遺伝子で形質転換により活性を回復すること。この第４の戦略では、
プラスミドを作成し、選択マーカーとしてのエリスロマイシン耐性遺伝子によっ
て中断された非機能イソメラーゼ遺伝子を有する野生型遺伝子をノックアウトす
る。
【０１７４】実施例８ 以下の実施例では、Ｂａｃｉｌｌｕｓでの本発明のリノール酸イソメラーゼの
発現について説明する。 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓにおいて実施例５に記したＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８リノー
ル酸イソメラーゼ遺伝子を発現するために、２つのオリゴヌクレオチドを合成し
、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉゲノムＤＮＡ由来のイソメラーゼコーディング配列を増幅
した。正方向プライマー（配列番号４０）は、ｎＣＬＡ7113（配列番号２６）の
位置３６７８〜３７０６に相当し、５’末端にＮｄｅＩ部位とＡＴＧ開始コドン
を含んでいる（小文字）。 ５’ｃａｔＡＴＧＴＡＴＴＡＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＡＴＴＡＴＧＡＡＧＣ−３
’。
【０１７５】 逆方向プライマー（配列番号４１）は、ｎＣＬＡ7113（配列番号２６）の位置
５５７９〜５６０２に相当し、５’末端にＢｃｌＩ部位を含んでいる。 ５’ｔｇａｔｃａＴＣＴＡＴＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧ−３’。
【０１７６】 １．９ｋｂのＰＣＲ産物を、平滑末端でＳｒｆＩ部位においてｐＰＣＲ−Ｓｃ
ｒｉｐｔ（Ａｍｐ）ＳＫに挿入してクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株であるＮ
ｏｖａＢｌｕｅの細胞に形質転換した。この宿主中でのｄａｍメチル化はＢｃｌ
Ｉ消化を防ぐので、組換プラスミドはＦ．ｃｏｌｉ菌株ＧＭ２１６３の細胞に形
質転換された。ＧＭ２１６３はｄａｍ-菌株である。組換プラスミドＤＮＡを制
限酵素ＮｄｅＩおよびＢｃｌＩで消化し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した
ベクターｐＢＨＡＩにライゲートした。組換プラスミドＤＮＡをＳａｃＩで消化
し、ベクターのＥ．ｃｏｌｉ部分を除去し、再び円形にし、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ２３８５６に形質転換した。
【０１７７】 この構築物において、イソメラーゼコーディング配列を、ＨｐａＩＩプロモー
ター（図１２、構築物＃１）の制御下に配置し、天然リボゾーム結合部位を、ベ
クター中のその対応部位と置き換えた。形質転換体のクローンを中央の対数増殖
期まで生育し、リノール酸の生体内変換のために採集した。脂肪酸のヘキサン抽
出物をＧＣ分析してもＣＬＡは検出されなかった。しかしながら、１時間、２時
間、３時間のインキュベーション後に、リノール酸のレベルは急激に減小し、３
時間のインキュベーション後では約４０％となった。試験した１６個のＢ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓクローンすべてについて同じ結果が観察された。リノール酸のレベ
ルが、プラスミドを有しないＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ野生型細胞および空のベクタ
ーで形質転換した細胞のインキュベーション中に一定であったので、リノール酸
の使用は、クローニングしたイソメラーゼ遺伝子の存在によって左右される。イ
ソメラーゼ構築物をＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＴ３９９に入れて形質転換
したときにも同じ結果が観察された。
【０１７８】 実験は、なぜリノール酸が使い果たされるのにＣＬＡが蓄積しないかを調べる
ために実行された。１つの可能性は、リノール酸はＣＬＡに変換されるが、それ
が急速に代謝または分解され得るということだった。これは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｍｉｓ細胞がＣＬＡを代謝させる能力を有し
ていることを示している。この架設を試験するために、ＢａｃｉｌｌｕｓＢａｃ
ｉｌｌｕｓ野生型細胞およびイソメラーゼ遺伝子構築物で形質転換した細胞を、
Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８細胞を使用して生体内変換において生産した単一
の９，１１異性体と、および、９，１１および他のＣＬＡ異性体を含む化学合成
ＣＬＡと、インキュベートした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞はＣＬＡを代謝できなか
った。同じ結論が粗細胞抽出物からも得られた。
【０１７９】 更に、イソメラーゼ遺伝子を含んでいる細胞に関する生体内変換のＧＣスペク
トルにおける未知生成物（保持時間＝２０分間）のピークが観察された。さらに
、リノール酸の変換と未知生成物の生成は、１：１の比であるように思われた。
予備のＧＣ−ＭＳ分析は、この未知生成物が、ヒドロキシル化されたリノール酸
誘導体の分子量と一致する分子量を有していることを示した。さらに、異なる方
法による構造分析は、生成物の同一性の決定を支援し得る。
【０１８０】 理論により拘束されるわけではないが、本願発明者は、この未知生成物がリノ
ール酸共役の中間体であると考えている。しかしながら、この生成物をＬ．ｒｅ
ｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８細胞または粗酵素抽出物とインキュベートした時、該生成
物をＣＬＡに変換することができない可能性がある。中間体は共役中に酵素また
は膜に結合し、一旦解離されると共役を完成できない可能性がある。
【０１８１】 さらなる実験は、ベクターｐＬＡＴ１０に基づく一連の構築物を作成し、Ｈｉ
ｓタグを含むことの利点を探索することである（図１２）。ｐＬＡＴ１０はＢ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓを直接形質転換するた
めに使用することが可能なプラスミドである。ｐＬＡＴ１０はα−アミラーゼを
コードするＬＡＴ遺伝子のプロモーター、コーディング配列およびターミネータ
ーを有している。さらには、Ｂａｃｉｌｌｕｓの細胞膜の中へ、または細胞膜を
横切って、タンパク質を移動させるシグナルペプチド配列も存在する。構築物＃
２において、イソメラーゼコーディング配列は、そのシグナルペプチドに対する
融合としてのアミラーゼプロモーター制御下に置かれた。通常、ＬＬＡＴシグナ
ル配列はタンパク質を膜の中へまたは膜を横切って方向づける。可溶化タンパク
質は典型的には培養ブロスへ分泌される。プロセス中では、シグナルペプチドが
特定のプロテアーゼによって除去される。膜タンパク質は、膜へ移動し膜に組み
込まれる。イソメラーゼペプチドの疎水性のドメインが、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉに
おける未分断シグナル配列および膜貫通セグメントの両方として機能し得るので
、タンパク質のそのようなドメインが、Ｂａｃｉｌｌｕｓの分泌機構の適切な機
能に干渉し、ＬＡＴシグナル−イソメラーゼが適切なコンホメーションに折り畳
まれないかどうかは知られていない。構築物＃３（図１２）では、イソメラーゼ
遺伝子のコーディング配列全体はＣ末端でＨｉｓタグに融合され、構築物＃４で
は、疎水性ドメインのないイソメラーゼ配列がＨｉｓタグに融合される。構築物
＃５，＃６において、分泌シグナルペプチドは除去される。これらの新しい構築
物に関して、イソメラーゼタンパク質がＢａｃｉｌｌｕｓ細胞で合成されるかど
うかおよびどの細胞分画にタンパク質が位置するかが決定され得る。
【０１８２】実施例９ 以下の実施例は、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ（菌株タイプ）ＡＴＣＣ２３２７２の天
然ＰＹＲ８プロモーターから離れたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８（ｃｉｓ，ｔ
ｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸イソメラーゼ遺伝子の発現を示す。
【０１８３】 Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８イソメラーゼ遺伝子（プロモーター−ＯＲＦ−
ターミネーター）を、プライマー対ＣＬＡ０７（配列番号３８，実施例７参照）
とＣＬＡ（配列番号３９，実施例７参照）を用いてＰＹＲ８ゲノムＤＮＡより増
幅した。ＰＣＲで増幅したイソメラーゼ遺伝子産物（２．３ｋｂ）は、完全なコ
ーディング配列およびそのすぐ上流の天然プロモーターを含む３８１ｂｐの配列
と、推定転写ターミネーター（停止コドンから１２４ｂｐまで下流）を含む下流
の配列とをを含んでいた。ＰＣＲ産物を平滑末端でｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ａ
ｍｐ）ＳＫ（＋）に入れてクローニングした。イソメラーゼ遺伝子をＳａｌＩ消
化により組換プラスミドから分離し、ＳａｌＩで前もって消化しておいたＬａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｌ／Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターｐＴＲＫＨ２でライゲ
ートした。ライゲートしたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ細胞に入れて形質転換した。形
質転換体を選択し、制限分析によりチェックした。ｌａｃプロモーターの制御下
（下流）またはｌａｃプロモーターとは逆のいずれかにイソメラーゼ遺伝子が配
置された組換プラスミドを、電気穿孔法でＬ．ｒｅｕｔｅｒｉＡＴＣＣ ２３２
７２（菌株タイプ）の細胞に入れて形質転換した。
【０１８４】 ｌａｃプロモーターの制御下にあるかまたはｌａｃプロモーターとは逆に入れ
られたイソメラーゼ遺伝子で形質転換したＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ ２３２７２の細
胞を、採集前まで３７度で２８時間生育させた。細胞タンパク質全体をＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析した。約７０ｋＤの新規なタン
パク質バンドを、両方のタイプの形質転換体の細胞のＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹ
Ｒ８イソメラーゼに特異的なウサギ抗体を用いて検出された。これは、Ｌ．ｒｅ
ｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８リノール酸イソメラーゼ遺伝子のプロモーター配列がＬ．
ｒｅｕｔｅｒｉ２３２７２において機能することを示す。
【０１８５】 かなりの量のタンパク質は生産されたにもかかわらず、形質転換Ｌ．ｒｅｕｔ
ｅｒｉ ２３２７２細胞は、測定可能な酵素活性を示さなかった。リノール酸生
体内変換検定では、ＣＬＡもヒドロキシル化リノール酸誘導体（Ｂ．ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓで生成）も、検出されなかった。タンパク質が、膜に組み込まれた膜タン
パク質として生産されたか、または（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＴ７プロモーターか
らの遺伝子の発現と同様に）封入体として生産されたかはまだ明らかではない。
タンパク質が可溶形式で生産される可能性は低い。本願発明者は、ＰＹＲＳイソ
メラーゼ遺伝子構築物の質を改良する方法（核酸の確認を含む）と、形質転換細
胞に測定可能な酵素活性を引き起こす方法とを現在調べているところである。
【０１８６】実施例１０ 以下の実施例では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中のクローン化Ｌ．ｒ
ｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸イソメ
ラーゼ遺伝子より作製したウサギ抗体の生産およびキャラクタリゼーションにつ
いて説明する。
【０１８７】 Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸イソメラ
ーゼ−Ｈｉｓタグ融合タンパク質を、実施例７に述べたような封入体としてＥ．
ｃｏｌｉ中で合成し、供給業者のプロトコルに従ってＨｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｒｅｓ
ｉｎ ａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ ｋｉｔ（ＮＯＶＡＧＥＮ，カタログ番号７０２３
９−３）を使用して、変性条件下で精製した。精製されたイソメラーゼタンパク
質を使用して、２匹のウサギを免疫した。４回目の採血から集めた血清を、ウェ
スタンブロット分析（図４２）で試験した。図４２は、タンパク質試料を載せる
ときに、低バックグラウンドレベルの交差反応は観察されたがウサギ抗体が、そ
の天然宿主Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＲＹ８で生産されたイソメラーゼに対して強
い特異性を示すと共に異種宿主で発現されたイソメラーゼに対しても強い特異性
を示すことを示している。
【０１８８】 抗体は、Ｆ．ｃｏｌｉにおいて発現されたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉイソメラーゼ−
Ｈｉｓタグ融合タンパク質（図４２，レーン１）に関して非常に強いシグナルを
示した。構築物＃１で形質転換したＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ（図１２を参照：プ
ラスミドベクターｐＢＨ１におけるＨｐａＩＩプロモーターの制御下にあるイソ
メラーゼコーディング配列）は、クマシーブルー染色したＳＤＳゲル上で観察さ
れる約７０ｋＤのタンパク質を生産した（データ非図示）。このタンパク質バン
ドは、ウサギ抗血清（図４２，レーン４）によって容易に検出された。このシグ
ナルは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの野生型細胞（図４２，レーン３
）では検出されなかった。抗体は、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８イソメラーゼ
遺伝子を含む構築物で形質転換したＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ ２３２７細胞中の約７
０ｋＤのペプチドを認識した。（図４２，レーン５：Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ２３
２７２野生型；レーン６：天然プロモーターおよびｌａｃプロモーターの両方の
制御下にあるイソメラーゼ遺伝子を含むベクターｐＴＲＫＨ２で形質転換された
Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ２３２７２；レーン７：天然プロモーターの制御下にある
イソメラーゼ遺伝子を含むベクターｐＴＲＫＨ２で形質転換されたＬ．ｒｅｕｔ
ｅｒｉ ２３２７２；実施例９参照）。
【０１８９】 ウサギ抗体は特に、天然Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８（図４２，レーン２）
において合成された７０ｋＤリノール酸イソメラーゼと反応した。本願発明者は
、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓの（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸
イソメラーゼと、Ｐ．ａｃｎｅｓ（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−リノー
ル酸イソメラーゼの抗体の交差反応を検出することを試みた。高度に精製された
Ｐ．ａｃｎｅｓイソメラーゼは、ＳＤＳゲル上に約５５ｋＤの単一のタンパク質
バンドを示した（データ非図示）。ウサギＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８抗体は
、細胞溶菌液全体で５５ｋＤのＰ．ａｃｎｅｓ（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，
１２−リノール酸イソメラーゼを認識した（図４２，レーン８）。同様に、Ｌ．
ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８抗体は、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓの４５ｋＤの（ｃ
ｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸イソメラーゼと反応した（図４２，
レーン９）。重要な非特異的抗体交差反応が、溶菌液で、および程度は低いがＰ
．ａｃｎｅｓ溶菌液で、観察された。
【０１９０】実施例１１ 以下の実施例は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓからのリ
ノール酸イソメラーゼの精製について説明する。 Ｐ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ ６９１９は、ｔｒａｎｓ１０，ｃｉｓ１２−ＣＬ
Ａをリノール酸から直接生産することが知られている唯一の微生物である。細胞
全体を使用した実施例１に記した実験により、この生物中での１０，１２−リノ
ール酸イソメラーゼの存在が確認された。酵素抽出液はフレンチプレスで調製し
た。図１４は、Ｐ．ａｃｎｅｓの細胞全体を使用したリノール酸からのｔｒａｎ
ｓ１０，ｃｉｓ１２−ＣＬＡの生成を示す。培養物は、複合ブレーンハートイン
フュージョン培地中定常期まで嫌気的に生育させ、収集し、５００ｐｐｍのリノ
ール酸を含む同じ培地に再懸濁した。細胞は、細胞を室温で振とうしながら好気
的にインキュベートした。リノール酸のレベルは、２４時間で約５０％減少した
。この失われたリノール酸のおよそ半分がｔｒａｎｓ１０，ｃｉｓ１２−ＣＬＡ
として検出された。ｃｉｓ９，ｔｒａｎｓ１１−ＣＬＡは観察されなかった。イ
ンキュベーションを延長すると、ｔｒａｎｓ１０，ｃｉｓ１２−ＣＬＡのレベル
がほんのわずかに変わったのに対し、残りのリノール酸はほぼすべて消失した。
この生物中でリノール酸がどのように代謝されるかは現在のところ不明である。
他の実験中において、ｔｒａｎｓ１０，ｃｉｓ１２−ＣＬＡの濃度は上昇したが
、リノール酸がすべてそうであったように、その後完全に消失した（結果は非図
示）。これは、ｔｒａｎｓ１０，ｃｉｓ１２−ＣＬＡが恐らく還元酵素によりさ
らなる代謝を受けた可能性があることを示唆している。リノール酸は、イソメラ
ーゼ以外の酵素に対する基質であってもよい。
【０１９１】 酵素抽出液をフレンチプレスにより調製し、図１５で概説されるように抽出液
を分画にした。分画Ａにおけるイソメラーゼ活性の合計を１００％として、可溶
化タンパク質分画（Ｂ）では９３％を超える活性が検出された。１％未満のイソ
メラーゼ活性が、洗浄されたペレット、または膜分画（Ｃ）に見つかった。約２
％の活性は、ペレットの洗浄および遠心工程後、緩衝液分画（Ｄ）に存在した。
従って、Ｐ．ａｃｎｅｓイソメラーゼは、これまでに調べたＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ
ＰＹＲ８および他の菌株中のイソメラーゼ活性と異なり、明らかに膜タンパク
質ではない。
【０１９２】 粗可溶性酵素調製物を使用したイソメラーゼ活性は、一夜の透析によってあま
り有意に影響されなかった。ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ
、ＦＭＮ、ＡＤＰ、ＡＴＰおよびグルタチオンを始めとする考えられる多くの補
因子を、イソメラーゼ活性に対するその影響に関して試験した。それらの化合物
のどれについての検定でも６０分間に有意な影響は観察されなかった。カルシウ
ムとマグネシウムも効果がなかった。イソメラーゼ活性は、キレート化剤ＥＤＴ
Ａ（５ｍＭ）または１，１０−フェナントロリン（１ｍＭ）、またはスルフヒド
リル試薬ｐ−クロロ安息香酸水銀（５μＭ）またはＮ−エチルマレイミド（１０
０μＭ）によっては阻害されなかった。
【０１９３】 粗抽出物での酵素活性に対するｐＨ値の影響を検討した。イソメラーゼ活性は
、６．８を中心として最適ｐＨを示した（図１６）。 ＣＬＡの生成は２３４ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。図１７
は酵素入手源として粗イソメラーゼ抽出液を使用した、典型的な時間経過実験を
示す。一般に、イソメラーゼは、室温で３０〜６０分間インキュベーションした
後に終了点検定を使用して分析した。図１８（異なるリノール酸レベルにおける
時間経過検定）および図１９（異なるリノール酸レベルにおける終末点検定）は
、リノール酸の生成に、基質濃度の増加が及ぼす影響を示している。これらのデ
ータは、Ｐ．ａｃｎｅｓの酵素が、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｒｅｕｔｅ
ｒｉおよびＢ．ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓのリノール酸イソメラーゼ中で観察さ
れたのと同じタイプの基質阻害を受けないことを示唆している。
【０１９４】 イソメラーゼ活性に対する温度の影響を、限られた程度で検討した。酵素は４
℃では非常にゆっくり作用し、室温ではより高い活性を示す。ＣＬＡ生成は、３
７℃では室温と事実上同じだった（データ非図示）。これらの結果は、やはり、
粒状Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉイソメラーゼで観察された結果と著しく異なる。
【０１９５】 Ｐ．ａｃｎｅｓのリノール酸イソメラーゼの精製を開始した。遠心した粗抽出
物の調製に続いて、試料をいくつかのカラムにかけ、応用性および適切な条件を
決定した。これらのパイロット実験の一部の典型的なクロマトグラムを、ＤＥＡ
Ｅおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に対してそれぞれ図２０
と図２１に示す。初期の生成試験では、ＤＥＡＥの後に非Ｃおよびゲルろ過クロ
マトグラフィーを行った。しかしながらこれらの３カラムの後、多数のバンドが
ＳＤＳ ＰＡＧＥ上に観察された。
【０１９６】 精製でのこの初期の試みにより強調されたのは、分離条件を最適化する必要性
であった。ＤＥＡＥステップを、塩濃度勾配プログラムの変更によりさらに最適
化した。０．１７５Ｍ ＮａＣｌまでの直線濃度勾配に続いて、塩レベルを７０
ｍｌに対してこのレベルに保持した。この時点でイソメラーゼを溶出し、その後
、勾配を継続し、他のタンパク質を溶出した。
【０１９７】 イソメラーゼは、フェニル基を含むＨＩＣカラムへ非常にしっかりと結合し、
エチレングリコールでのみ遊離される。しかしながら、２０％のエチレングリコ
ールに徐々に暴露させると、多くの他のタンパク質も遊離された。ＨＩＣクロマ
トグラフィーステップを、５〜３０％までのエチレングリコール勾配の使用によ
って変更した。この結果、以前に得られたよりもイソメラーゼに対する溶出プロ
ファイルが幾分鋭くなった（結果は非図示）。
【０１９８】 ＤＥＡＥおよびＨＩＣクロマトグラフィーに続いて、クロマトフォーカシング
を使用した。この方法は、等電点に基づいて分子を分離する。タンパク質を高い
ｐＨ値で弱陰イオン交換カラムにかけ、低ｐＨ「Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ」を加え
ることでｐＨを低下させながら溶出した。予備実験は、６．５〜４．０までのｐ
Ｈ勾配により、約４．４のｐＨ値でイソメラーゼが溶離されることを示した。明
らかに、イソメラーゼはかなり酸性のタンパク質である。
【０１９９】 ＨＩＣクロマトグラフィーに続いて、高イソメラーゼ活性を有する１つの分画
を、２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ ６．５）で平衡化したＰｈａｒｍａｃ
ｉａ ＭｏｎｏＰクロマトフォーカシングカラムにかけた。ｐＨ勾配は１０％
Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ７４（ｐＨ４．０）を使用して形成した。結果を図２２に
示す。イソメラーゼ活性はｐＨ４．５のあたりの鋭いピークで溶出された。活性
を有する３つの分画についてＳＤＳ ＰＡＧＥにより純度を調べた。分画３２は
、５５ｋＤの質量を有する単一のタンパク質バンドとして１２．５％ゲルおよび
２０％ゲル上に現れた。 Ｐ．ａｃｎｅｓ １０，１２−リノール酸イソメラーゼの精製の様子を表１Ｂ
に要約する。
【０２００】
【表２】
【０２０１】 この材料を、アミノ酸配列決定に供した。ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルに試料をかけ
た後、該単一バンドを移動させ、ＵＷ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ
ＷｉｓｃｏｎｓｉｎにてＮ末端配列決定を実行した。驚いたことに、いくつか
のシグナルが得られた。これは、複数のペプチドの存在を示すか、またはペプチ
ドのＮ末端部分がこの見かけ上の単一バンド中で高度に分解した（可能性は低い
）ことを示している。精製イソメラーゼを続いて分析し、タンパク質 のＮ末端
がブロックされていることをさらに突き止めた（以下に説明する）。
【０２０２】 純粋なイソメラーゼを得る精製計画をさらに改善するために、以前に使用して
いたプロトコルを精製を増強するために改訂かつ改善した。以前と同様、可溶性
粗抽出物を細胞破壊により調製した。この材料は、ＤＥＡＥクロマトグラフィー
を使用して細分した。何回かの試行で得られた有意なイソメラーゼ活性を有する
画分をプールし、透析し、同じカラムにふたたびかけた。活性分画をプールして
、（ＮＨ4）2ＳＯ4で１モルとし、フェニル疎水性カラムに何回かの試行でかけ
た。必要な場合、活性分画を濃縮し、ＳＤＳ ＰＡＧＥクロマトグラフィーで解
析した。高いイソメラーゼ活性を有する分画は、この段階で多くのタンパク質バ
ンドを示した。ＨＩＣカラムから選択した分画をプールし、濃縮し、透析し、ク
ロマトフォーカシングカラムにかけた。タンパク質の溶出は以前に使用したのよ
りも５．０〜４．０の低いｐＨ勾配で実行した。イソメラーゼ活性を約ｐＨ４．
２で鋭いピークとして溶出した。活性分画についてＳＤＳ ＰＡＧＥで純度を調
べた。この時点で、いくつかの分画が、サイズが約５０−５５ｋＤの単一バンド
を含むようと考えられる（データ非図示）。他の活性分画は３〜４本のさらなる
バンドを示した。一層の精製が要求される場合、これらの分画はゲルろ過カラム
をかける。Ｐ．ａｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼのＮ末端の配列決定を完了し
た（実施例１２を参照）。
【０２０３】実施例１２ 以下の実施例では、精製されたＰ．ａｃｎｅｓの可溶性（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ
）−１０，１２−リノール酸イソメラーゼのＮ末端アミノ酸配列の配列決定につ
いて示す。
【０２０４】 リノール酸イソメラーゼは、実施例１１に説明したように、Ｐ．ａｃｎｅｓ
ＡＴＣＣ ６９１９から見かけ上の均質物まで精製した；クマシーブルー染色さ
れたＳＤＳ ＰＡＧＥでは、約５５ｋＤの単一ペプチドバンドしか検出できなか
った。精製タンパク質のＮ末端ペプチド配列（３５のアミノ酸残基）を、以下の
ように決定した： ＳＩＳＫＤ ＳＲＩＡＩ ＩＧＡＧＰ ＡＧＬＡＡ ＧＭＹＬＷ ＱＡＧＦＸ
ＤＹＴＩＬ（配列番号４２）
【０２０５】 配列番号４２の配列を有するタンパク質をここではＰＰＡＩＳＯＭ35（以前に
本願の優先権主張の基礎である米国仮出願出願番号第６０／１４１，７９８号で
はＰＣＳ−ＣＬＡ35と呼んでいた）と称する。アミノ酸配列決定技術に誤差が全
くないわけではないので、配列番号４２がせいぜい見かけ上の部分Ｎ末端アミノ
酸配列を表わすにすぎないことに注意すべきである。
【０２０６】 ＰＰＡＩＳＯＭ35アミノ酸配列を、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８からクロー
ニングされたＤＮＡから導き出されたリノール酸イソメラーゼペプチド（配列番
号１８）またはＰＹＲ８イソメラーゼ（配列番号１）の直接決定されたアミノ酸
配列と最初に比較された時、有意な相同性は検出されなかった。我々は、Ｌ．ｒ
ｅｕｚｅｒｉ ＰＹＲ８およびＰ．ａｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼが異なる
質量：Ｐ．ａｃｎｅｓ由来のイソメラーゼは約５５ｋＤ、対してＬ．ｒｅｕｔｅ
ｒｉ由来のイソメラーゼは約７０ｋＤ：に注目している。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉお
よびＰ．ａｃｎｅｓ（実施例１３を参照）からのイソメラーゼ配列全体の比較は
、より意味深いことである（実施例１３を参照）。
【０２０７】 Ｐ．ａｃｎｅｓイソメラーゼのＮ末端配列は、推定ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ
ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸イ
ソメラーゼ由来のＮ末端ペプチド配列とも相同性を示さなかった（Ｐａｒｋら、
１９９６）が、（背景のセクションで）上に論じたように、本願発明者は、パー
クらによって述べられた配列が実際にリノール酸イソメラーゼである可能性は非
常に低いと考えている。標準設定でＢｌａｓｔｐプログラムを使用して、データ
ベース中の配列に対してもＮ末端ペプチド配列を解析した。最も一致した配列は
、推定Ｆ．ｃｏｌｉ酸化還元酵素であり、Ｆｅ−Ｓサブユニット（ｇｉ８８７８
２８）が２８のアミノ酸残基の領域で７１％の同一性を示す。しかしながら、Ｂ
ｌａｓｔｐ解析で複雑さの低いフィルタリングを使用した場合、データベース中
のどの配列に関しても相同性を検出することができなかった。複雑さの低い領域
は、一般に、位置ごとの有意なアラインメントではなく構成上の偏りを反映する
、擬似的な高いスコアを一般に与える。フィルタリングは、混乱を起こさせる適
合を除去するように設計されている。従って、Ｐ．ａｃｎｅｓイソメラーゼ遺伝
子と推定Ｅ．ｃｏｌｉ酸化還元酵素Ｆｅ−Ｓサブユニットとの間の相同性の本当
のレベルは、完全長Ｐ．ａｃｎｅｓイソメラーゼ遺伝子の配列が決定されたとき
にこれから決定される。
【０２０８】 当業者は、配列番号４２をコードする核酸配列を、アミノ酸配列から推定する
ことが可能である。そのような核酸配列を含む単離核酸分子は、本発明に包含さ
れる。
【０２０９】実施例１３ 以下の実施例では、本発明のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅ
ｓリノール酸イソメラーゼ核酸分子の核酸クローニングおよび配列決定について
説明する。
【０２１０】 （精製イソメラーゼのためのペプチド配列決定） 実施例１１および１２に説明したように精製された、精製Ｐ．ａｃｎｅｓリノ
ール酸イソメラーゼを、酵素エンドＬＹＳ−Ｃで消化し、ペプチドフラグメント
を生成した。生じたペプチドを、ＨＰＬＣクロマトグラフィーで分離した。
【０２１１】 ３つの異なるピークに由来するペプチドフラグメントを、個別に配列決定した
。 これらのペプチドフラグメントのいずれも、Ｎ末端配列に関して、完全にまたは
部分的に同一ではない。従って、これらのフラグメントは、Ｐ．ａｃｎｅｓリノ
ール酸イソメラーゼの内部ペプチドフラグメントを表わす。
【０２１２】 １番目のＨＰＬＣピーク中のペプチドに対して、アミノ酸の１４の配列を決定
した。それをここでは配列番号４４として表す。配列番号４４の配列を有するペ
プチドを、ここではＰＰＡＩＳＯＭ14と称する。２番目のＨＰＬＣピーク中のペ
プチドに対して、９のアミノ酸残基の配列を決定した。それをここでは配列番号
４５として表わす。配列番号４５の配列を有するペプチドを、ここではＰＰＡＩ
ＳＯＭ9と称する。３番目ＨＰＬＣピーク数中のペプチドに対して、１５のアミ
ノ酸の配列を決定した。それをここでは配列番号４６として表す。配列番号４６
の配列を有するペプチドを、ここではＰＰＡＩＳＯＭ15と称する。
【０２１３】 この配列決定実験で検出されたアミノ酸シグナルは非常に弱かったことに注意
すべきである。従って曖昧な読み取りによるある位置での代替選択が存在した。
配列番号４６中の曖昧なアミノ酸位置での第２の選択を、括弧内に小文字で示す
。
【０２１４】 （Ｎ末端ペプチド残基をコードするＤＮＡ配列のクローニング） ２セットの縮重オリゴヌクレオチドプライマーを、配列番号４２に従って合成
した。第１オリゴヌクレオチドプライマーセットは、配列番号４２のアミノ酸残
基８−１４に相当し、ＰＡ０５（配列番号４７）と称する。第２オリゴヌクレオ
チドプライマーセットは、配列番号４２のアミノ酸残基２２−２８に相当し、Ｐ
Ａ０１１（配列番号４８）と称する。ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の既知の２
つの遺伝子が、以前にＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓからク
ローニングされた。すなわち、ヒアルロニダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ１５９２
７）およびリパーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ９９２５５）である。これらの２つの
遺伝子のコドンの偏りを用いて、プライマーＰＡ０５（配列番号４７）の５’末
端における縮重を減らした。鋳型としてＰ．ａｃｎｅｓ ＤＮＡを使用したＰＣ
Ｒ反応により、大量の種々のサイズの非特異的生成物と、それより少量の予想サ
イズ（６２ｂｐ）の生成物を生成した。６２ｂｐのＰＣＲ産物を単離、精製し、
ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）Ａｍｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に入れて
クローニングした。推定組換プラスミドを制限消化により分析した。４つのクロ
ーンを選択し、配列決定した。異なるプライマー分子がＰＣＲ産物の合成に関与
していたが、４つすべてのクローンから導き出されたアミノ酸配列は、精製リノ
ール酸イソメラーゼタンパク質（配列番号４２）のＮ末端の１２〜２８残基にち
ょうど一致しており、従ってＰＣＲ産物が同一であることが確認された。クロー
ン化ＰＣＲ産物の配列（配列番号４９）を、ここではｎＰＡＩＳＯＭ62で表す。
配列番号４９の異なるクローンで見られるヌクレオチドの相違を、代替ヌクレオ
チドとして配列表（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ）に示す。導き出された
アミノ酸配列（配列番号５０）を、ここではＰＰＡＩＳＯＭ21と称する。
【０２１５】 （逆ＰＣＲによるイソメラーゼ遺伝子のより大部分のクローニング） 逆ＰＣＲ増幅アプローチを使用して、ＤＮＡ配列ｎＰＡＩＳＯＭ62の両側に位
置するＤＮＡ配列をクローニングした。ＰＡ０１６およびＰＡ０１７（それぞれ
配列番号５１および配列番号５２）と呼ばれる２つのオリゴヌクレオチドプライ
マーを合成した。ＰＡ０１６は、ｎＰＡＩＳＯＭ62のヌクレオチド７−２３に相
当し、ＰＡ０１７はｎＰＡＩＳＯＭ62のヌクレオチド３０−４７に相当した。
【０２１６】 Ｐ．ａｃｎｅｓ由来のゲノムＤＮＡを、以下の制限酵素、または匹敵する結果
を生ずる２つの酵素の組み合わせを用いて消化した：ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、
ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３Ａ、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ
、ＸｂａＩ／ＮｈｅＩ、ＸｂａＩ／ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ。各ＤＮＡ消
化物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼで円形にした。ＰＣＲ反応は、鋳型として円形にしたＤＮＡ消化物のアリコー
トを使用して、プライマー対ＰＡ０１６およびＰＡ０１７を用いて行った。約５
７０ｂｐのＰＣＲ産物が、円形にしたＢａｍＨＩ消化物により生じた。ＰＣＲ産
物を精製し、プラスミドベクターｐＣＲ２ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）に入れてクローニングし、配列決定した。ＢａｍＨＩ部位および配
列ｎＰＡＩＳＯＭ62に関して、クローニングしたＤＮＡ配列を編集し、５６９ｂ
ｐの配列を生成した。それをここではｎＰＡＩＳＯＭ596（配列番号５３）と称
する。この配列は、Ｃ末端がまだ不完全で、開始コドンが配列番号５３の位置２
５９−２６１に生じている、１０４のアミノ酸残基の読取枠（ＯＲＦ）を含んで
いた。この不完全なＯＲＦの解読アミノ酸配列を、ＰＰＡＩＳＯＭ104（配列番
号５４）と名付ける。
【０２１７】 （クローンニングされた部分的イソメラーゼ配列であるｎＰＡＩＳＯＭ569を利
用したＰ．ａｃｎｅｓＤＮＡのサザンブロット分析） Ｐ．ａｃｎｅｓ ＤＮＡを以下の制限酵素で消化した：ＢｇｌＩ、ＥｃｏＲＩ
、ＦｏｋＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕＩＩ、ＸｈｏＩ。消化物を、ビオチン化ヌ
クレオチド（ＮＥＢｌｏｔ Ｐｈｏｔｏｔｏｐｅキット，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で標識した配列ｎＰＡＩＳＯＭ569（配列番号５３）を使
用して、サザンブロットで分析した。酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐｖｕ
ＩおよびＸｈｏＩ（これらは配列ｎＰＡＩＳＯＭ569を切断しない）を用いると
、１本のハイブリダイゼーションバンドだけが観察された。これは、リノール酸
イソメラーゼ遺伝子の１つのコピーだけがＰ．ａｃｎｅｓのゲノム中に存在して
いることを示す。ＦｏｋＩとＳａｌＩ（これらは配列ｎＰＡＩＳＯＭ569に固有
な部位を有する）で消化したＤＮＡに関しては予想通りに、２本のハイブリダイ
ゼーションバンドがサザンブロットで示された。同様に、ＢｇｌＩ消化物では２
本のバンドがｎＰＡＩＳＯＭ569とハイブリダイズした状態で観察されたが、ブ
ロット上には弱いシグナル強度とより高い分子量を有するさらなるバンドが見ら
れた（これはＤＮＡ消化が不完全であるという問題によって起こった可能性があ
る）。
【０２１８】 （イソメラーゼ遺伝子およびその両側の領域をクローニングするための逆ＰＣＲ
の第２ラウンド） ＸｈｏＩ消化物は、ｎＰＡＩＳＯＭ569とハイブリダイズする１本のバンド（
約３ｋｂ）を示したが、ＢｇｌＩ消化物は、約３ｋｂの２本の主なハイブリダイ
ゼーションバンドを示した。両方のＢｇｌＩフラグメントの逆ＰＣＲ増幅および
クローニングは、合計で約５．５ｋｂの配列をカバーする。従って、２対のオリ
ゴヌクレオチドプライマーを合成した。ＰＡ０２１（配列番号５５）およびＰＡ
０２２（配列番号５６）と称する、第１対のプライマーを、上流ＢｇｌＩフラグ
メントの逆ＰＣＲ増幅用に合成した。ＰＡ０２３（配列番号５７）およびＰＡ０
２４（配列番号５８）と称する、第２対のプライマーを、下流ＢｇｌＩフラグメ
ントの逆ＰＣＲ増幅用に合成した。代替アプローチとして、Ｐ．ａｃｎｅｓゲノ
ムＤＮＡを酵素ＸｈｏＩで消化し、円形にし、プライマー対ＰＡ０２１／ＰＡ０
２４との逆ＰＣＲ反応のための鋳型として使用した。
【０２１９】 プライマー対ＰＡ０２３／ＰＡ０２４を使用してもＴ４ＤＮＡリガーゼ処理し
たＢｇｌＩ消化物に関しては期待されたサイズのＰＣＲ産物が生成されなかった
。この観察の１つの説明として、下流ＢｇｌＩフラグメントの２つの端部が適合
していないために該フラグメントを円形にできないことが挙げられる。しかしな
がら、プライマー対ＰＡ０２１／ＰＡ０２２を使用したＰ．ａｃｎｅｓＤＮＡの
円形にしたＢｇｌＩ消化物によるＰＣＲ増幅は、約２．５ｋｂのＰＣＲ産物を生
成した。約２．５ｋｂのＰＣＲ産物はさらに、プライマー対ＰＡ０２１／ＰＡ０
２４を使用して県警にしたＸｈｏＩ消化物により増幅された。両方のＰＣＲ産物
を生成し、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）に入れてクローニング
した。クローン化ＢｇｌＩフラグメントおよびクローン化ＸｈｏＩフラグメント
を共に、完全に配列決定した。ＢｇｌＩフラグメントおよびＸｈｏＩフラグメン
トの完全な配列と配列ｎＰＡＩＳＯＭ569を編集し、約５．３ｋｂの配列（配列
番号５９）を生成した。それをここではｎＰＡＩＳＯＭ5275と称する。
【０２２０】 （イソメラーゼ遺伝子とその両側に位置する配列の分析） 図５２に概略的に示したように、配列ｎＰＡＩＳＯＭ5275（配列番号５９）は
、Ｐ．ａｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼ読取枠全体（ＩＳＯＭ）と、その上流
の２つのＯＲＦ（ＡとＢ）と、その下流の１つのＯＲＦ（Ｃ）とを含んでいる。
読取枠（ＯＲＦ）Ｂ、Ｃおよびイソメラーゼ遺伝子（ＩＳＯＭ）が同じＤＮＡ鎖
によってコードされる一方で、読取枠（ＯＲＦ）Ａは反対のＤＮＡ鎖によってコ
ードされている。他の生物と共通の明らかな転写ターミネーターまたはプロモー
ターエレメントに類似の構造は、ＯＲＦ Ｂとリノール酸イソメラーゼ（ＩＳＯ
Ｍ）に対するＯＲＦとの間は見出されなかった。現時点で、３つの読取枠（Ｂ、
ＣおよびＩＳＯＭ）が単一の転写物として転写されるか多数の転写物として転写
されるかは明らかでない。この答えを決定するためにはＲＮＡプローブ技術また
はプライマー伸張実験が必要である。
【０２２１】 （リノール酸イソメラーゼの読取枠） Ｐ．ａｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼの読取枠は、配列ｎＰＡＩＳＯＭ5275 のヌクレオチド２７３５〜４００９にわたり、配列６０で表される。配列番号６
０によって表わされる核酸配列を有する核酸分子を、ここではｎＰＡＩＳＯＭ12 75 と称する。ｎＰＡＩＳＯＭ1275は、配列番号６１としてここに表わされるアミ
ノ酸配列を備えた４２４のアミノ酸残基から成るリノール酸イソメラーゼタンパ
ク質をコードしている。配列番号６１によって表されるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質を、ここではＰＰＡＩＳＯＭ424と称する。
【０２２２】 イソメラーゼタンパク質ＰＰＡＩＳＯＭ424（配列番号６１）の算出分子量は
、約４８ｋＤａであり、これは精製リノール酸イソメラーゼタンパク質の分子量
（つまりＳＤＳ−ＰＡＧＥによって以前評価したときは約５０−５５ｋＤａ）と
理論的によい一致を見ている。下に議論されるように、精製リノール酸イソメラ
ーゼ（配列番号４２）のＮ末端ペプチド配列は、位置２５および３０での２つの
残基を除いては、配列ＰＰＡＩＳＯＭ424の位置２−３６と同一である。ＯＲＦ
の開始コドンによってコードされたメチオニン残基が、翻訳後に除去されるよう
である。上流ＤＮＡ配列中の追加のインフレームＡＴＧコドンの欠如は、イソメ
ラーゼタンパク質に関連したシグナルペプチド配列がないことを示す。ＰＰＡＩ
ＳＯＭ424（配列番号６１）のアミノ酸配列の分析によれば、ＰＰＡＩＳＯＭ35
（配列番号４２）の位置３０の未解読の残基がヒスチジン（Ｈ）で、ＰＰＡＩＳ
ＯＭ35の残基２５がトリプトファン（Ｗ）の代わりにグルタミン酸（Ｅ）である
ことが示される。精製イソメラーゼのエンド−ＬＹＳ−Ｃ消化から得られた３つ
の内部ペプチドフラグメントの配列も、解読アミノ酸配列ＰＰＡＩＳＯＭ424の
内にマッピングされた。第１のＨＰＬＣピークのペプチド配列（配列番号４４）
は、ＰＰＡＩＳＯＭ424の残基１８３〜１９６と一致した。第３のピークのペプ
チド配列（配列番号４６）は、位置２８６を除いて、ＰＰＡＩＳＯＭ424の残基
２７５〜２８９と一致した。第２のピークのペプチド配列（配列番号４５）は、
ＰＰＡＩＳＯＭ424のＣ末端残基（配列番号６１の４１６〜４２４の位置）と一
致した。
【０２２３】 ここで配列番号６２と称するリボゾーム結合部位様の構造（ＡＡＧＧＡＡＧ）
は、ｎＰＡＩＳＯＭ1275のイソメラーゼ読取枠の翻訳開始コドンから上流に見出
された。この推定リボゾーム結合部位と翻訳開始コドンとの間の間隔はたった４
塩基であり、通常の６−９の間隔よりはるかに短い。まれであるが、４塩基間隔
は、配列ｎＰＡＵＮＫＡ783（以下を参照）のＯＲＦ Ｂのような他のＰ．ａｃ
ｎｅｓ遺伝子でも見つかり、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ（ＧｅｎＢａｎ
ｋ、Ｄ８５４１７）由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子中に見
出されることが以前に報告されている。
【０２２４】 （ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−リノール酸イソメラーゼ読取枠は、Ｌ
．ｒｅｕｔｅｒｉからクローニングされた（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−
リノール酸イソメラーゼ遺伝子（配列番号１７）とも、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅ
ｓより精製された（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸イソメラーゼ
のＮ末端配列（配列番号４３）とも、Ｐａｒｋらが（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９
，１１−リノール酸イソメラーゼ遺伝子と伝えていた（上述の背景のセクション
に論じている）Ｂｙｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏから精製されたタンパク質のＮ末端ペ
プチド配列とも、有意な相同性を示さない。
【０２２５】 タンパク質パターンおよびプロファイル検索（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈの
ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ）を、イソメラーゼ中の推定機能ドメインを検出するた
めに、配列ＰＰＡＩＳＯＭ424（配列番号６１）に関して実行した。その結果、
リノール酸イソメラーゼのＮ末端ドメインが推定ＮＡＤ／ＦＡＤ結合ドメイン（
ＰＲＯＳＩＴＥ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｎｏ．ＰＳ５０２０５）を含むことが示唆さ
れた。特に、このドメインは、配列番号６１のアミノ酸残基９−３８からわたる
領域に位置する。ＮＡＤ／ＦＡＤ結合ドメインは、配列番号７３の１４−１７位
置からの４つの追加Ｘａａ残基をマイナスした、サイン配列Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇ
ｌｙ−（Ｘａａ）2−Ｇｌｙ−（Ｘａａ）3−Ａｌａ−（Ｘａａ）6−Ｇｌｙ（（
配列番号７３の１〜２１位置）を有し、でヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（
図５８；配列番号７４）、トリプトファンモノオキシゲナーゼ（図５８；配列番
号７５）、グルタミン酸シンターゼ（図５８；配列番号７６）、６−ヒドロキシ
−Ｌ−ニコチンオキシダーゼ（図５８；配列番号７７）、ζ−カロチンデサチュ
ラーゼ（図５８；配列番号７８）、フィトエンデヒドロゲナーゼ（図５８；配列
番号７９）、ポリアミンオキシダーゼ（図５８；配列番号８０）のような様々な
酵素の中に存在する。共通配列は図５８の上部に示してあり（配列番号７３）、
種々の酵素における第１の残基の位置を左側に示している。酵素の名前をその起
源およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号と共に、図の下部に与えている。特
徴的なサイン残基に加えて、本願発明者は、列挙した酵素のこの推定ＮＡＤ結合
ドメインにリジン残基も保存されていることを見出した。１０，１２リノール酸
イソメラーゼの他の酵素との相同性は、わずかにＮＡＤ結合ドメインを越える範
囲に及んでいた。
【０２２６】 興味深いことに、（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９、１１−Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ（配列番号１８）由来のリノール酸イソメラーゼも、配
列番号１８の位置１９〜７９に推定ＦＡＤ／ＮＡＤ結合ドメインを含んでいた。
配列番号ｌ８中の推定ＦＡＤ／ＮＡＤ結合ドメインは、図５８に示されるような
配列番号７３の共通配列と整列し、配列番号１８の位置４１（配列番号７３の位
置１３）の共通ロイシンと配列番号１８の位置４９（配列番号７３の位置２１）
の共通グリシンとの間に４つの余分なアミノ酸残基のスペーサーがある。従って
、配列番号１８の位置４２−４５の４残基スペーサーが除外される場合、２つの
異なるリノール酸イソメラーゼ（つまり９，１１−リノール酸イソメラーゼおよ
び１０，１２−リノール酸イソメラーゼ）が、３４の残基（配列番号６１の位置
１１〜４４と、配列番号１８の位置２７〜４１と４６〜６３）にわたって４０％
同一のアミノ酸残基を共有する。さらに、推定ＦＡＤ／ＮＡＤ結合ドメインは、
９，１１−および１０，１２−リノール酸イソメラーゼタンパク質配列の両方の
Ｎ末端の付近に位置している。従って、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔ
ｅｒｉ由来の（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸イソメラーゼおよ
びＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ由来の（ｔｒａｎｓ，ｃｉ
ｓ）−１０，１２−リノール酸イソメラーゼは、配列間の全体的な配列同族性を
欠いているにもかかわらず、推定機能ドメインを共有するように思われる。Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来の（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９
，１１−リノール酸イソメラーゼも推定機能ドメインを共有する。
【０２２７】 リノール酸イソメラーゼ中のＮＡＤ／ＦＡＤ結合部位の存在の重要性は、現時
点では不明瞭である。たとえイソメラーゼがその触媒活性にＮＡＤ、ＮＡＤＰ、
ＦＡＤまたは他の補因子を必要としなくても、ＮＡＤ／ＦＡＤ結合部位は二重結
合の共役に重要な役割を果たす可能性がある。リノール酸の二重結合異性化の実
際の機構は、現在あまり理解されていない。このリノール酸イソメラーゼドメイ
ンは、イソメラーゼの構造／機能の研究のための、突然変異誘発の良好なターゲ
ットとなるかもしれない。（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１リノール酸イソメ
ラーゼがメイン疎水性ドメインと比較的疎水性の小さい他の複数の領域とを含む
膜タンパク質であることに注意することは重要である。Ｎ末端の近くにあるメイ
ン疎水性ドメインは、膜にタンパク質を向けるための未切断シグナル配列として
も機能すると推測される単一の推定膜貫通ドメインであると考えられる。さらに
、この推定膜貫通ドメインは、推定ＮＡＤ結合ドメインと重複する。他方、Ｐ．
ａｃｎｅｓ由来の（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２リノール酸イソメラーゼ
は、疎水性の小さい数個のドメインを備えた可溶化タンパク質であり、推定ＮＡ
Ｄ結合ドメインはメイン疎水性ドメインのＮ末端に位置する。（ｃｉｓ，ｔｒａ
ｎｓ）−９，１１リノール酸イソメラーゼの膜および推定ＮＡＤ結合ドメイン中
に示された４残基スペーサーとの連結は、（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２
リノール酸イソメラーゼに関する位置と幾何学的特異性位置の違いに関係する可
能性がある。
【０２２８】 ＢＬＡＳＴ２．０検索を、上に述べたような標準パラメータを使用して、配列
ＰＰＭＳＯＭ424に関して実行した。リノール酸イソメラーゼは、種々の異なる
酵素と比較的低い相同性を共有することが分かった。ほとんどの場合、相同性は
、推定ＮＡＤ結合部位の短い領域に限定されていた。イソメラーゼは、Ｚｅａ
ｍａｙｓ（ＧｅｎＢａｎｋ、０６４４１１）の１１５のアミノ酸残基の領域内（
配列番号６１の８〜１２２の位置）で、３１％の同一残基および５１％の類似残
基を共有する。イソメラーゼはさらに、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉ
ｓ（ＧｅｎＢａｎｋ、ＡＡＣ７７９０９．１）由来のトリプトファン２−モノオ
キシゲナーゼと２８％の同一残基および４２％の類似残基を共有する。Ｄｅｉｎ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＥ００１８８０
）由来のグルタミン酸シンターゼの小サブユニットとの相同性は、８８のアミノ
酸配列（配列番号６１の位置３−９０）にわたって２７％同一、４６％類似であ
った。リノール酸イソメラーゼとの相同性を示す他の酵素は、Ｃｅｒｃｏｓｐｏ
ｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ（ＧｅｎｉＢａｎｋ、Ｐ４８５３７）より得られた
ようなフィトエンデヒドロゲナーゼであり、１６３のアミノ酸残基（配列番号６
１のうちの２−１６５の位置）の重複領域のうち２９％同一、４８％類似であっ
た。Ｅ．ｃｏｌｉ（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｕ２８３７５）由来の推定オキシドレダク
ターゼのＦｅ−Ｓサブユニットは、リノール酸イソメラーゼ残基１２〜２２と１
１の隣接する同一アミノ酸残基を共有している。イソメラーゼの残基１０〜２１
は、不完全に配列決定したＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅゲノムのセグメント
から解読したアミノ酸配列と同一であった（Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏ
ｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ，Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ６６６ １７
５２）。
【０２２９】 イソメラーゼコーディング領域（ｎＰＡＩＳ０Ｍ1275，配列番号６０）のヌク
レオチド配列は、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉからクローニングされた（ｃｉｓ，ｔｒａ
ｎｓ）−９，１１−リノール酸イソメラーゼのヌクレオチド配列（配列番号１７
）と有意な相同性を示さない。ＢＬＡＳＴ ２．０検索を、詳細な説明で上に述
べたような標準パラメータを用いて、ヌクレオチド配列ｎＰＡＩＳＯＭ1275（配
列番号６０）に関して行った。イソメラーゼ遺伝子はデータベース（つまりＧｅ
ｎＢａｎｋ）中の他の遺伝子と有意な相同性を示さなかった。配列番号６０と何
らかの相同性を共有する最も近い配列は、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｎｉｃｏｔｉ
ａｎａｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０３９０３）由来のフィトンデ
ヒドロゲナーゼであった。これは配列番号６０とわずかに３０．１％の類似性（
つまり同一性ではない）を有していた。イソメラーゼは、Ｖｉｃｉａｆａｂａ
ＵＤＰ−グルコース：Ｄ−フルクトース−２−グルコシルトランスフェラーゼコ
ーディング配列（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｍ９７５５１）と同一の２２の隣接ヌクレオ
チド（配列番号６０の３９３〜４１４の位置）を有している。イソメラーゼの異
なる範囲の２１の隣接ヌクレオチド（位置６３３−６５３）が、不完全なＳｉｎ
ｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉゲノム（スタンフォード３８２、ｓｍ
ｅｌｉｌ ４２３０１７Ｅ１０．ｘ１）のセグメントに見出された。
【０２３０】実施例１４ 以下の実施例では、Ｐ．ａｃｎｅｓの核酸分子ｎＰＡＩＳＯＭ5215の他の読取
枠の配列決定およびキャラクタリゼーションについて説明する。 配列ｎＰＡＩＳＯＭ5275（配列番号５９）における読取枠Ａ（ＯＲＦＡ）は、
ヌクレオチド位置１〜１０７３（図５２，Ａ）にわたり、配列番号６３によって
表わされる。配列番号６３を有する核酸分子を、ここではｎＰＡＬＰＬ1073と称
する。不完全なＣ末端を備えた３５８のアミノ酸残基のタンパク質配列を、配列
番号６３の逆の相補的配列を使用して、ｎＰＡＬＰＬ1073から導き出した。位置
１０７３−１０７１（配列番号６３に関する位置）は開始コドンを形成する。こ
のタンパク質はリパーゼ（以下を参照）との相同性を示すため、ＬＰＬ（リパー
ゼ様）と称される。この配列はここではＰＰＡＬＰＬ358（配列番号６４）と称
される。タンパク質配列ＰＰＡＬＰＬ358は、読取枠Ｂ（ＯＲＦＢ）およびリノ
ール酸イソメラーゼ遺伝子に関して反対のＤＮＡ鎖上にコードされる。読取枠の
第１ＡＴＧコドンの上流の合理的な間隔を明らかなリボゾーム結合部位と同定で
きなかった。従って、実際の翻訳開始コドンはこの時点では決定することができ
かった。
【０２３１】 ＢＬＡＳＴ ２．０によると、核酸配列ｎＰＡＬＰＬ1073に関して有意な相同
性は見出されなかった。２２の隣接ヌクレオチド（配列番号６３の位置８１５−
８３６）の伸張部は、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ＲＮＡポリ
メラーゼΣ８０サブユニット遺伝子（Ｓａｎｇｅｒ ５２０，Ｂ．ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓ Ｃｏｎｔｉｇ５４）のセグメントと同一であった。配列ＰＰＡＬＰＬ35 8 に関するＢＬＡＳＴ ２．０検索は、該タンパク質配列が低いが有意なリパー
ゼとの相同性を共有することを示した。例えば、配列番号６３の位置１４６−３
５６にまたがる領域は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ由来のｌｉｐＣと２６％のアミノ酸残基同一性および４２％のアミノ酸残基類
似性を共有する。しかしながら、ＰＰＡＬＰＬ358は、以前にＰ．ａｃｎｅｓ（
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９９２５５）からクローニングしたリパー
ゼ遺伝子との有意な相同性を共有しない。配列ＧＤＳＡＧ（配列番号６３の２４
４−２４９の位置）は多くのリパーゼに保存されていた。また、それは、様々な
リパーゼ、エステラーゼおよび他の加水分解の酵素によって共有される活性部位
セリンモチーフ（ＧＸＳＸＧ）に適合する。
【０２３２】 ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ（タンパク質パターンとプロファイル検索）を、タン
パク質配列ＰＰＡＬＰＬ358に関して実行した。エステラーゼ／リパーゼ／チオ
エステラーゼ活性部位（ＰＲＯＳＩＴＥＰｒｏｆｉｌｅ Ｎｏ．ＰＳ５０１８７
）は、配列番号６４の領域１６７−２６１に見つかった。さらに、配列番号６４
の位置２１３〜２６８からの領域は、カルボキシエステラーゼタイプ−Ｂ活性部
位（ＧＣ０２６５）を含んでいた。配列ＰＰＡＬＰＬ358は、Ｐ．ａｃｎｅｓリ
パーゼ（Ｇｅｎｆｌａｎｋアクセッション番号Ｘ９９２５５）に存在する正確な
リパーゼプロサイト（ＰＲＯＳＩＴＥＰｒｏｆｉｌｅ Ｎｏｓ．ＰＳ０１１７３
およびＰＳ０１１７４）を含んでいない。これらのデータから、配列ｎＰＰＡＬ
ＰＬ1075中の読取枠Ａがリパーゼ様酵素をコードすることが結論された。
【０２３３】 読取枠Ｂ（ＯＲＦＢ）（図５２；Ｂ）は、Ｐ．ａｃｎｅｓイソメラーゼ遺伝子
の上流に位置し、イソメラーゼ遺伝子と同じ鎖によってコードされる。読取枠Ｂ
は配列ｎＰＡＩＳ０Ｍ5275の位置１６０４〜２３８６にまたがり、配列番号６５
によって表わされる。配列番号６５を有する核酸分子を、ここではｎＰＡＩＪＮ
Ｋ783と称する。この読取枠は、２６０アミノ酸残基の未知タンパク質をコード
し、ＰＰＡＵＮＫ260（配列番号６６）と称される。推定リボゾーム結合部位Ｇ
ＡＡＧＧＡＧ（配列番号６７）は、第１ＡＴＧコドンの上流に位置し、４塩基の
間隔を空けている。従って、このＡＴＧコドンが読取枠の実際の翻訳開始コドン
である可能性は非常に高い。
【０２３４】 この読取枠は、ＧｅｎＢａｎｋまたは未完成微生物ゲノムのどの配列とも有意
な相同性を示さない。タンパク質配列ＰＰＡＵＮＫ260に関する検索の最も高い
ＢＬＡＳＴスコアは、たった３２であり、ヌクレオチド配列ｎＰＡＵＮＫ783に
関するＢＬＡＳＴスコアは４０だった。
【０２３５】 読取枠Ｃ（ＯＲＦＣ）（図５２；Ｃ）はリノール酸イソメラーゼ遺伝子から下
流に位置し、イソメラーゼ遺伝子と同じＤＮＡ鎖にコードされる。読取枠Ｃは配
列ｎＰＡＩＳＯＭ5275の位置４１２９〜４７１０にまたがり、配列番号６８によ
って表わされる。配列番号６８を有する核酸分子をここではｎＰＡＡＴＬ582と
称する。この読取枠は、１９３のアミノ酸残基のアセチルトランスフェラーゼ様
酵素（ＡＴＬ）をコードし得（以下を参照）、配列番号６９と名付けられる。配
列番号６９のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ここではＰＰＡＡＴＬ193と
表される。
【０２３６】 読取枠配列番号６８の第１ＡＴＧコドンは、推定リボゾーム結合部位ＧＧＴＡ
ＧＧＡ（配列番号７０）から７塩基下流に位置している。ヌクレオチド配列ｎＦ
ＡＡＴＬ582に関するＢＬＡＳＴ ２．０検索では、データベース中の他の配列
との有意な相同性を見出すことはできなかった。しかしながら、該読取枠は、Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｉｎｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｆｌａｎｋ ＡＬ１
０９７３２）由来の仮説タンパク質と、５６アミノ酸残基の重複部において、３
８％のアミノ酸残基の同一性および５３％の類似性を共有している。さらに、該
読取枠は、植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＧｅｎＢａｎｋ
ＡＣ００８８８１４８）由来の推定フォスホグルコムターゼと、７８アミノ酸残
基の重複部において、３１％のアミノ酸残基の同一性および４７％の類似性とい
う限られた相同性を示す。
【０２３７】 より重要なことには、タンパク質配列ＰＰＡＡＴＬ193（配列番号６９）は、
アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡＴ）ファミリープロファイル（プロファイ
ルドキュメントＦＦ００５８３）を有している。ＢＬＡＳＴ ２．０検索によっ
ても、該配列は、データベース中の３つの推定アセチルトランスフェラーゼ遺伝
子に対して低い相同性を有することが示されている。該配列は、Ｄｅｉｎｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＥ００１８７５）由来
の遺伝子と、配列番号６９の位置２４−１５１にわたる領域に関して、２９％の
アミノ酸残基の同一性および３５％の類似性を共有する。該配列は、Ｍｅｔｈａ
ｎｏｌｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ ＡＥ０００８７２）由来のＮ−末端アセチルトランスフェラーゼ複合
サブユニットＡＲＤ１との５５アミノ酸残基重複部において、３５％のアミノ酸
残基同一性および４７％の類似性を共有する。該配列は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ
ｍａｒｉｔｉｍａ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＥ００１７７４）由来のアセチルトラ
ンスフェラーゼ関連タンパク質との４８アミノ酸残基重複部において、３０％の
アミノ酸残基同一性および５３％の類似性を共有する。従って、ＯＲＦ Ｃはア
セチルトランスフェラーゼ様タンパク質をコードし得る。
【０２３８】 要約すると、イソメラーゼ遺伝子を含むゲノム領域（ＯＲＦ Ｂ）は、未知の
タンパク質をコードする。他の２つのＯＲＦは、リパーゼ（ＯＲＦ Ａ）および
アセチルトランスフェラーゼ（ＯＲＦ Ｃ）に関連する酵素をそれぞれコードす
る。従って、これは、脂質／脂肪酸修飾と関連する遺伝子が豊富なゲノム領域で
あり得る。理論に束縛されるわけではないが、本願発明者は、それらの遺伝子の
うちの一部が、Ｐ．ａｃｎｅｓでＣＬＡの蓄積が欠如する原因となる、（ｔｒａ
ｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−ＣＬＡの急速な代謝に関与している可能性がある
と考えている。
【０２３９】実施例１５ 以下の実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉ中でクローニングしたＰ．ａｃｎｅｓリノー
ル酸イソメラーゼの発現について説明する。
【０２４０】 ２つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成して、完全なリノール酸イソメラ
ーゼ読取枠を増幅した。ＰＡ０４ｌ−ＮｄｅＩ（配列番号７１）と名付けたプラ
イマーは、配列ｎＰＡＩＳＯＭ1275（配列番号６０）の位置１−２０に相当する
。このプライマーは５’末端にＮｄｅＩ部位と余分な４塩基を含んでいる。プラ
イマーＰＡ０４２−停止−ＸｈｏＩ（配列番号７２）は、配列ｎＰＡＩＳＯＭ12 75 のより小さい鎖に特異的であり、配列番号６０の位置１２５８−１２７５にわ
たる。このプライマーは、５’末端にＸｈｏＩ部位と余分な４塩基を含んでいる
。
【０２４１】 Ｐ．ａｃｎｅｓから調製されたゲノムＤＮＡを、ＰＡ０４１−ＮｄｅＩおよび
ＰＡ０４２−停止−ＸｈｏＩプライマーによるＰＣＲ反応において鋳型として使
用した。約１．３ｋｂの予想サイズのＰＣＲ産物を生じ、それをゲル精製し、Ｎ
ｄｅＩとＸｈｏＩで消化しておいた発現ベクターｐＥＴ２４ａ（＋）とライゲー
トした。ライゲーション生成物をＥ．ｃｏｌｉ宿主であるＯｎｅ Ｓｈｏｔ と
Ｐ１０内に移送した。ｐＥＴ−ＰＡＩＳＯＭと名付けた、組換プラスミドを備え
たクローンを、ＮｄｅＩとＸｈｏＩによる制限消化により分析した。予想された
制限パターンを示すプラスミドＤＮＡを、発現宿主Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２Ｉ（ＤＥ
３）内に移送した。
【０２４２】 組換プラスミドｐＥＴ−ＰＡＩＳＯＭ（図５３）において、完全なイソメラー
ゼ読取枠は、（転写調節用の）Ｔ７プロモーターの下流に位置した。ＡＴＧコド
ンに対して最適の間隔を有するリボゾーム結合部位を、ベクターにより供給した
。余分なコドンやコドン変更はイソメラーゼコーディング配列に導入しなかった
。
【０２４３】 プラスミドｐＥＴ−ＰＡＩＳＯＭを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２ ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）細胞の新鮮な一夜の培養のアリコートを１／１００比で使用して、カナマ
イシンを３０μｇ／ｍｌの濃度で補給した５０ｍｌのＬＢ培地に接種した。３７
℃で３時間増殖させた後、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度で培地に加え、イソメラ
ーゼタンパク質の発現を誘導した。細胞をＩＰＴＧ誘導後２時間さらに増殖させ
た。
【０２４４】 ＩＰＴＧ誘導時（０）およびＩＰＴＧ誘導の２時間後（２）に細胞をサンプリ
ングし、細胞タンパク質全体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。プラスミドｐ
ＥＴ−ＰＡＩＳＯＭの異なる４つのクローン（Ａ−Ｄ）を対照としてのイソメラ
ーゼ遺伝子を有さないＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２ｌ（ＤＥ３）細胞と比較した。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによると、ｐＥＴ−ＰＡＩＳＯＭを寄生させているＩＰＴＧ誘導細
胞から調製した抽出物では約５０ｋＤａのペプチドが主要なタンパク質として観
察された。これは、アミノ酸配列およびＰ．ａｃｎｅから精製した天然リノール
酸イソメラーゼのサイズから立てた予測と一致している。ＩＰＴＧ誘導をしない
場合、イソメラーゼタンパク質の発現は非常に低かった。５０ｋＤａのタンパク
質バンドは、イソメラーゼ遺伝子を含まないＢＬ２１（ＤＥ３）の細胞溶菌液で
は観察されなかった。以上のデータは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて予想サイズを有す
るクローニングしたリノール酸イソメラーゼタンパク質が非常に高レベルに発現
していることを実証している。
【０２４５】実施例１６ 以下の実施例では、クローニングしたリノール酸イソメラーゼの機能の確認に
ついて説明する。 クローニングしたイソメラーゼ遺伝子の同一性を確認するために、イソメラー
ゼタンパク質を発現しているＥ．ｃｏｌｉ細胞から調製した粗細胞抽出物を、リ
ノール酸の生体内変換によるイソメラーゼ酵素活性に関して試験した。ｐＥＴ−
ＰＡＩＳＯＭを寄生させているＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞のＩＰＴ
Ｇ誘導細胞培養物を、１０，０００ｇ、４℃で遠心により採集した。細胞ペレッ
トを、５ｍｌの細胞溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ５．８；
１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）に懸濁した。細胞をフレンチプレス
（約６．８９５×１０7Ｐａ（１０，０００ｐｓｉ））に１回通過させて破壊し
た。粗抽出物（細胞溶菌液）を、１時間または一晩、１５０ｒｐｍで振とうさせ
ながら室温で３５０ｐｐｍのリノール酸と直ちにインキュベートした。酵素反応
から得た水性試料を、１ｍｌのヘキサンで抽出した。ヘキサン層は除去し、２３
４ｎｍにおける吸光度をＨＰ８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計を使用して
測定した。一般に、２３４ｎｍにおいて実際のピークが存在することを確認する
ために、１９０−４００ｎｍ領域の全スキャン範囲を走査した。図５５は、その
ような抽出液のＵＶスペクトルを示す。共役リノール酸に典型的なものとして、
２３４ｎｍに吸収ピークが観察された。
【０２４６】 ＣＬＡ異性体のどれが組換えイソメラーゼによって生産されるかを決定するた
めに、メチルエステルを調製し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。脂肪
酸メチルエステル（ＦＡＭＥＳ）を４％ＨＣｌメタノール溶液で３０分間室温で
処理して形成した後、ヘキサンで抽出した。ＦＡＭＥＳを、水素炎イオン化検出
器に合うよう取り付けたＨＰ６８９０型クロマトグラフを使用して、ガスクロマ
トグラフィーにより分析した。検出器およびインジェクターは２５０℃に保持し
た。間断のない注入後、カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ ＳＰ−２３８０、１００ｍ、
０．２５ｍｍＩＤ）を１５５度で１５分間保持し、その後、１℃／分の割合で１
８０℃まで上昇させた。１８０℃で３０分間保持した後に、温度を１０℃／分の
割合で２２０℃まで上昇させ、２２０℃で５分間保持した。典型的な市販ＣＬＡ
混合物の分離方法を、図５６Ａに示す。化学合成ＣＬＡは、多数の構造異性体と
幾何異性体から成り、それらの大半は１００ｍカラムで分離することが可能であ
る。６２．４１４ｍｍにおけるピークは、（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−ｌ０，１２
−ＣＬＡ異性体を表わす。図５６Ｂは、クローニングしたイソメラーゼを含む粗
細胞抽出液を使用した、反応混合物の典型的な分析を示す。観察された唯一のＣ
ＬＡピークは、（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−ＣＬＡ異性体と本質的に
同じ保持時間で溶出する。
【０２４７】 クローニングしたイソメラーゼによって形成されたＣＬＡ分子の二重結合の位
置をさらに解明するために、ＤＭＯＸ（２−アルケニル−４，４−ジメトキシル
オキサゾリン）誘導体を作成し、ガスクロマトグラフィー電子質量分析により分
析した。ＤＭＯＸ誘導体は１６０℃で１８時間、窒素下で５００μｌの２−アミ
ノ−２−メチル−１−プロパノールにより脂肪酸を還流することにより形成した
。冷却後、５ｍｌの水と１ｍｌのヘキサンを加えて振とうし、分析のためヘキサ
ン層を除去した。試料を、ＨＰ５９７０ＭＳ四極質量分析計に合わせて取り付け
たＨＰ５８９０Ａガスクロマトグラフを使用して分析した。インジェクターおよ
び検出器は３００℃に保持した。間断のない注入を、Ｒｅｓｔｅｃ Ｒｔｘ−５
ＭＳカラム（１５ｍ、０．２５ｍｍＩＤ）に対して行った。オーブン温度を最初
は１５０℃とし、１０℃／分の割合で２５０℃まで上昇させ、最後の１０分を２
５０℃に保持した。図５７は、クローニングしたイソメラーゼの使用により形成
された推定（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−ＣＬＡ異性体のＤＭＯＸ誘導
体から観察された質量スペクトルを示す。切断パターンは、明らかに、位置１０
，１２で不飽和化が起こっていることを示し、これは既に示した他のデータと一
致している。
【０２４８】 ここに示された生化学的データ（つまりＵＶスペクトル、ＧＣの保持時間、お
よびリノール酸変換生成物のＤＭＯＸ誘導体のＧＣ−ＭＳスペクトル）はすべて
、Ｐ．ａｃｎｅｓ由来のクローニングイソメラーゼ遺伝子が、（ｔｒａｎｓ，ｃ
ｉｓ）−１０，１２−リノール酸イソメラーゼを確かにコードするという結論を
支持している。
【０２４９】実施例１７ 以下の実施例では、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ由来の
組換えリノール酸イソメラーゼの、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現の最適化について説明
する。
【０２５０】 本発明の組換えリノール酸イソメラーゼは、酵素反応動力学のような酵素特性
、安定性、可能な酵素活性化、およびタンパク質の三次元構造決定のためのＸ線
結晶をキャラクタライズするために使用することが可能である。これらの研究に
十分な組換えイソメラーゼタンパク質を調製するために、活性組換えＰ．ａｃｎ
ｅｓリノール酸イソメラーゼ酵素の生産レベルを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて向上さ
せた。低ＩＰＴＧ濃度および低温（３０℃未満）での組換えタンパク質発現の誘
導は、封入体中の組換えタンパク質のキレート化合物形成を低減し、より多量の
機能的酵素を生じることが示された。実験は、組換えＥ．ｃｏｌｉにおけるイソ
メラーゼ活性レベルに対して種々のＩＰＴＧ濃度および増殖温度が及ぼす影響を
試験するために実行した。
【０２５１】 １連の実験中で、イソメラーゼ遺伝子を有しているＥ．ｃｏｌｉ細胞を、３７
℃で３時間（ＯＤ600＝０．１７４）生育させ、２５℃に移し、５０μＭ ＩＰ
ＴＧで誘導した。細胞を、光学細胞濃度（０Ｄ600）決定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析、および先の実施例に説明したようなイソメラーゼ活性決定のために間隔を空
けて採集した。細胞は２５℃に移した後でも急速な増殖を示し続けた。細胞濃度
は、ＩＰＴＧ誘導の６時間後に２．７６のＯＤに達した。イソメラーゼ活性はＩ
ＰＴＧ添加３時間後まで検出できなかった。その時点から、イソメラーゼ活性は
一様に増加した。しかしながら、ＩＰＴＧ誘導６時間後に観察されたイソメラー
ゼ活性の最大レベルは、標準状態での先の実験（３７℃で２時間１ｍＭ ＩＰＴ
Ｇにより誘導）で観察されたのほぼ同じであった。
【０２５２】 別の一連の実験では、イソメラーゼ遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を３７℃
で増殖させ、細胞がＩＰＴＧ誘導を開始したときに早い増殖相にあることを確か
めるべく細胞濃度をモニターした。細胞濃度が約０．５に達した時、細胞を異な
る濃度でＩＰＴＧにて誘導し、２６℃で増殖させた。細胞は、ＩＰＴＧを培地に
添加した後、非常に速い増殖を示し続け、ＩＰＴＧ添加４．５時間後には約３．
３の０Ｄ600の濃度に達した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびイソメラーゼ活性検
定のため、ＩＰＴＧ誘導の２時間後および４．５時間後に２５ｍｌの細胞培養物
の試料をサンプリングした。
【０２５３】 ＩＰＴＧ誘導２時間後、イソメラーゼ活性のレベルは、５０〜５００のμＭ
ＩＰＴＧの範囲にわたるＩＰＴＧ濃度の関数として変化した。ＩＰＴＧ濃度の高
さは活性レベルに影響しなかった。組換えイソメラーゼタンパク質の誘導は、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥに関して見られるように、イソメラーゼ活性と同じパターンを示
した。最も高いイソメラーゼ比活性は約８．９ｐｐｍＣＬＡ ＯＤ-1ｈ-1だった
。
【０２５４】 Ｅ．ｃｏｌｉでのイソメラーゼ発現に対するＩＰＴＧ濃度の影響は、誘導時間
の長さによって影響を受けた。５０μＭという低いＩＰＴＧ濃度で誘導した細胞
では、太いイソメラーゼタンパク質バンドを生じ、これは発現レベルが高いこと
を示した。イソメラーゼタンパク質バンドは、１００μＭ ＩＰＴＧでの誘発に
より、より高いレベルに蓄積した。このレベルはさらに高いＩＰＴＧ濃度での誘
発では変化しなかった。しかしながら、イソメラーゼ活性のレベルは５０μＭ〜
５００μＭのＩＰＴＧ濃度に対してほぼ同じだった。他方、ＩＰＴＧ濃度が１，
０００μＭに達した時、イソメラーゼ活性は非常に低いレベルに降下した。２６
℃、４．５時間、４００μＭ ＩＰＴＧで誘導した組換えＥ．ｃｏｌｉは、反応
２時間後に５８％のリノール酸をｔｌ０，ｃ１２ ＣＬＡに変換した。比活性は
１３．２ｐｐｍＣＬＡ ＯＤ-1ｈ-1だった。
【０２５５】 イソメラーゼ活性を異なる濃度でリノール酸を用いて分析した。 ｔｌ０，ｃ１２ ＣＬＡの生産が基質濃度の増加と共に増加することが判った。
２，４００ｐｐｍ（約２４ｍＭ）までの濃度では基質阻害は観察されなかった。
ＣＬＡ生産と基質濃度の対数の間に線形の関係が観察された。
【０２５６】 イソメラーゼ活性を、以下に示すように異なる条件の生体内変換にて決定した
。各処理について、標準偏差が計算できるように、４つの複製を作成した。先に
説明された実験におけるように、生体内変換は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ５
．８）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロールおよび２ｍＭ ＤＴＴから
成る切断緩衝液中で行った。この緩衝液で、４℃、２５℃、３７℃の３つの温度
を試験した。最も高いイソメラーゼ活性は３７℃で検出された。２５℃と４℃で
の活性は、それぞれ３７℃の活性の約７０％および３０％にすぎなかった。Ｔｗ
ｅｅｎ８０が存在すると２５℃でのイソメラーゼ活性が約６０％増大した。組換
えイソメラーゼは、さらにｐＨ ７．５でｐＨ５．８よりも高い活性を示した。
【０２５７】 以上のデータは、ｔｌ０，ｃ１２−イソメラーゼが以下のような天然酵素と実
質的に同様の特徴を有することを示している：（ｉ） Ｅ．ｃｏｌｉで発現され
た機能的な組換えイソメラーゼは可溶化タンパク質であった；（ｉｉ）該イソメ
ラーゼは３７℃で低温（２５℃および４℃）でよりも高い活性を示した；（ｉｉ
ｉ）イソメラーゼ活性は比較的高い基質濃度で阻害されなかった。
【０２５８】実施例１８ 以下の実施例では、リノール酸イソメラーゼに対する抗体の生産用のＰｒｏｐ
ｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼＨｉｓタグ融
合タンパク質の生産について説明する。
【０２５９】 実験を、アフィニティクロマトグラフィーでＰ．ａｃｎｅｓリノール酸イソメ
ラーゼＨｉｓタグ融合タンパク質が精製できるように該タンパク質を発現するよ
うに実行した。精製タンパク質を、ウサギで抗体を作製するために使用する。
【０２６０】 イソメラーゼコーディング配列（配列番号６０）を、プライマー ＰＡ０４ｌ
−ＮｄｅｌおよびＰＡ０４４−ＸｈｏＩで増幅した。正方向プライマーであるＰ
Ａ０４１−ＮｄｅＩ（配列番号７１）は、先に説明した通りであり、ＡＴＧ開始
コドンと、５つのＮ末端残基をコードするヌクレオチド配列を有している。逆方
向プライマーであるＰＡ０４４−ＸｈｏＩ（配列番号８１）は、停止コドンが除
去され、かつ最後のアミノ酸残基がｐＥＴ２４−ａ（＋）ベクターのＨｉｓタグ
配列にインフレームで融合されるように設計した。
【０２６１】 ＰＣＲ産物をＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、該酵素で予め消化してベクターに
ライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０細胞に入れて形質
転換した。その後、確立した組換プラスミドのＤＮＡを、発現宿主Ｅ．ｃｏｌｉ
ＢＬ２ｌ（ＤＥ３）に入れて形質転換した。
【０２６２】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、予想サイズのタンパク質バンドがＩＰＴＧで誘導した細
胞の細胞タンパク質において見られた。発現レベルはＨｉｓタグのないイソメラ
ーゼとほぼ同じであった。リノール酸の生体内変換のために細胞抽出液も調製し
た。融合タンパク質の酵素活性がタグのないタンパク質とほぼ同じだったため、
Ｈｉｓタグの存在は、酵素の機能に影響しないことが判った。
【０２６３】 イソメラーゼＨｉｓタグ融合タンパク質の大部分は封入体分画で検出された。
従って、融合タンパク質を封入体から分離し、先に説明したように、Ｈｉｓタグ
アフィニティカラムを用いて精製した。精製した融合タンパク質を、２匹のウサ
ギを免疫にするために使用した。抗原注射後の採血から得られた抗血清を、特異
性および感受性に関して試験する。
【０２６４】実施例１９ 以下の実施例では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるＰｒｏｐｉ
ｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼの機能的発現に
ついて説明する。
【０２６５】 Ｐ．ａｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼコーディング配列（配列番号６０）を
、正方向プライマーＰＡ０４１（配列番号７１）および逆方向プライマーＰＡ０
４５（配列番号８２）を使用して、ＰＷＯポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応によ
って増幅した。オリゴヌクレオチドＰＡ０４ｌはＡＴＧコドンを含んでおり、上
記の実施例で説明した。ＰＡ０４５は、ＢｃｌＩ部位と停止コドンを含めた読取
枠の最後の６つのコドンを含んでいる。
【０２６６】 １．３ｋｂのＰＣＲ産物を精製し、ＮｄｅＩとＢｃｌＩにより消化し、Ｎｄｅ
ＩとＢａｍＨＩで予め消化しておいたベクターｐＨＡＩにライゲートした。ライ
ゲートしたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｏｎｅ ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０コンピテンス
細胞に入れて形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を補給したＬＢのプ
レート上で選択した。
【０２６７】 この構築物において、イソメラーゼをＨｐａＩＩプロモーターおよびそのリボ
ゾーム結合部位の制御下に置いた。プラスミドＤＮＡをＳａｃＩとＰｖｕＩで消
化し、消化物をアガロースゲルに通過させ、プラスミドのＥ．ｃｏｌｉ部分を除
去した。ＤＮＡフラグメントを再び円形にし、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ２３８５６のプロトプラストに入れて形質転換した。形質転換体を、ネオマ
イシン（１，２００μｇ／ｍｌ）を含むＤＭ３プレート上で選択した。３７℃で
のインキュベーションの２日後に、コロニーを本明細書に先に説明した方法を用
いてイソメラーゼ活性試験のために選択した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞は、生体内
変換およびタンパク質分析における陰性対照として使用される空のベクターｐＢ
Ｈｌでも形質転換した。
【０２６８】 細胞を、３７℃でネオマイシン（４０μｇ／ｍｌ）を補給したＴＳＢ培地で一
晩増殖させた。５０ｍｌの培養物から開始するために、新鮮な一夜培養物を１／
１００の接種物として使用した。培養を５時間連続して行い、５，０００ｒｐｍ
で１０分間遠心して採集した。
【０２６９】 細胞ペレットを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ５．８、１０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１０％グリセロール、および２ｍＭ ＤＴＴを含む５ｍｌの緩衝液によ
り懸濁した。細胞を、氷上で超音波処理により破壊した（最大出力で２０秒を２
回）。生体内変換を、６μｌの１０％リノール酸ストックを添加した２ｍｌの細
胞抽出液を使用して実行した。反応物を、１５０ｒｐｍで一定に振とうさせなが
ら一晩（１６−２０ｈ）室温でインキュベートした。反応物中の脂肪酸を抽出し
、メチル化し、ＧＣにより分析した。
【０２７０】 ８つの異なるクローンがｔｌ０，ｃ１２−ＣＬＡを生産した。一晩のインキュ
ベーションによる３５０ｐｐｍのリノール酸の変換は、約５０％から８５％だっ
た。比活性は約０．１０ｐｐｍＣＬＡ ＯＤ-1ｈ-1であった（下記の表１Ｂ２を
参照）。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉからクローニングした推定ｃ９，ｔ１１−リノール
酸イソメラーゼを発現しているＢａｃｉｌｌｕｓ細胞は（実施例８に論じている
）リノール酸から低レベルのヒドロキシル化生成物を生産したがＣＬＡは生産し
なかった。このヒドロキシル化誘導体を検出するためには異なるＧＣ方法が要求
される。Ｐ．ａｃｎｅ由来の組換えｔ１０，１２−イソメラーゼを使用して生産
された生体内変換生成物を、この後の方法で分析した。ヒドロキシル化生成物は
検出されなかった。
【０２７１】 細胞抽出液をクマシーブルー染色を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ２３８５６野生型細胞は、約３５ｋＤａの主な
タンパク質バンドを示した。さらに、５０ｋＤ、７０ｋＤおよび高分子量の濃い
他のバンドも存在した。同様のパターンが、空のベクターｐＢＨｌまたはｐＢＨ
ｌ／ｔ１０，ｃ１２−イソメラーゼ遺伝子で形質転換したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
より生成した抽出液でも観察された。イソメラーゼ遺伝子で形質転換した細胞で
は、イソメラーゼタンパク質のバンドを検出することができなかった。これは、
有意な量の酵素活性が検出された場合でも、１０−１２遺伝子が非常に低いレベ
ルで発現されていたことを示している。
【０２７２】 同じｐＢＨｌベクターを使用して、推定ｃ９，ｔ１１−イソメラーゼタンパク
質を、ｃ９，ｔ１１−イソメラーゼ遺伝子（コーディング配列と推定転写ターミ
ネーター）をＨｐａＩＩプロモーターの後ろに配置することにより、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓにおいて非常に高いレベルで発現させた。強力な転写ターミネーターが存
在することが高レベルの発現に重要である可能性がある。本願発明者は、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓにおけるイソメラーゼ発現の改良に関して試験するために、異なるベ
クターおよびプロモーター／ターミネーターの組合せを有する構築物を現在作成
しているところである。
【０２７３】
【表３】
【０２７４】実施例２０ 以下の実施例では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓからのリ
ノール酸イソメラーゼの精製およびキャラクタリゼーションについて説明する。
【０２７５】 本願発明者によるおよび他の者による以前の仕事より、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎ
ｅｓが有意な量のリノール酸をＣＬＡに変換できることが示されていた。Ｃ．ｓ
ｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来のリノール酸イソメラーゼは、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｐ
ＹＲ８のと最も類似した活性レベルおよび特徴を有するように思われる。以下の
実験では、実施例５にＬ．ｒｅｕｔｅｒｉに関して説明したように、該イソメラ
ーゼ遺伝子をクローニングすることを目標とした、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓか
らのリノール酸イソメラーゼの精製およびキャラクタリゼーションについて説明
する。クローニングされたＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓイソメラーゼ遺伝子を、機
能性に関して試験する。それをさらに、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉおよびＰ．ａｃｎｅ
ｓよりクローニングしたイソメラーゼ遺伝子と比較する。
【０２７６】 Ｃ． ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２を、嫌気条件下でブレー
ンハートインフュージョンスープ（ＢＨＩ）培地で増殖させた。細菌の増殖を６
００ｎｍにて分光光度計で測定した。細胞を３７℃、ｐＨ７．５で増殖させた時
、６時間のインキュベーションの後に定常期に到達した。さらにインキュベート
すると、培養物が急速に溶菌した。従って、培養物を約６時間の増殖後に採集し
た。細胞ペレットを１５ｍＭ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．０
１で洗浄した。
【０２７７】 ＣＬＡへのリノール酸の生体内変換を、２００ｐｐｍリノール酸を含む新鮮な
増殖培地中に採集した細胞を懸濁することにより実行した。インキュベーション
後、脂肪酸をヘキサンで抽出し、２１５℃で１４分間等温プログラムを使用して
、ガスクロマトグラフィーにより分析した。図２３Ａ−Ｄは、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇ
ｅｎｅｓによるリノール酸の生体内変換の時間経過を示す。再懸濁された細胞は
、室温（Ａ＆Ｂ）または３７℃（Ｃ＆Ｄ）で、好気性（図２３Ａ＆Ｃ）条件また
は嫌気性（Ｂ＆Ｄ）条件下で増殖した。ｃｉｓ９，ｔｒａｎｓ１１−ＣＬＡの急
速な生産と同時におこるリノール酸の減少とが、試験されたすべての条件下で３
０分間以内に観察された。同様量のＣＬＡが、好気性および嫌気条件下で形成さ
れた。インキュベーションを延期すると、ｃｉｓ９，ｔｒａｎｓ１１−ＣＬＡの
代わりにｔ９，ｔｒａｎｓ１１−ＣＬＡが蓄積した。インキュベーションを延期
すると（１５−２０時間）、ｃｉｓ９，ｔｒａｎｓ１１−ＣＬＡは消失した。つ
まり明らかにＣＬＡがさらに代謝された。
【０２７８】 図２４に示されるように細胞を抽出し、４つの主要な分画を生じた。表２，３
は、凍結細胞から低塩濃度（１０ｍＭ ＮａＣｌ）および新鮮な細胞から高塩濃
度（５００ｍＭ ＮａＣｌ）で調製した分画における、イソメラーゼ活性および
タンパク質濃度の分布をそれぞれ示す。酵素活性はすべての分画で検出された。
最も高い活性は４５ｋ／０．３％ＯＴＧＰ可溶性分画で見出された。
【０２７９】 膜タンパク質の有効な可溶化には、界面活性剤が高濃度の塩を必要とすること
が報告されている。抽出物緩衝液にＮａＣｌを添加すると、比活性が増大した（
表３）。これは高濃度の塩が有効であることを示している。高塩濃度の界面活性
剤可溶性分画（表３）では比活性が低塩濃度の界面活性剤可溶性分画（表２）の
５０倍以上大きかった。活性培養物を保存する条件も活性に影響を与えた。この
結果は、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラーゼがＬ．ｒｅｕｔｅｒ
ｉ ＰＹＲ８膜関連酵素と同様の特徴を有することを示唆していた。
【０２８０】
【表４】
【表５】
【０２８１】 粗抽出物におけるイソメラーゼの温度感受性を、４℃、室温（〜２５℃）およ
び３７℃で試験した。イソメラーゼ活性に関する最適温度は室温だった（図２５
）。イソメラーゼ活性は、４℃では最適温度の７３％、および３７℃では最適温
度の６３％まで減少した。最適ｐＨを、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴお
よび４０ｐｐｍリノール酸を含む０．ｌＭ Ｔｒｉｓ緩衝液を使用して、ｐＨを
５．０〜９．０に調整することでモニターした。最適ｐＨは、４℃、室温および
３７℃のそれぞれにおいて、７．５、８．０および９．０であると判った（図２
５）。
【０２８２】 リノール酸の濃度を０〜１００ｐｐｍで試験した（図２６）。リノール酸の最
適濃度は４０ｐｐｍであることが判った。時間経過の研究は、活性が２０の分間
以内では直線的に応答し、最適ｐＨ、最適温度および最適基質濃度で６０分間イ
ンキュベートするとわずかな減小を示すことを示した（図２７）。
【０２８３】 Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓイソメラーゼは、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５
、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴおよび１０％グリセロール中で超音波処
理することで代わりに抽出した。この抽出は、フレンチプレスによる抽出より効
率が高かった（約２０％）。これは、超音波処理により活性が全体的に失われた
Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉより単離したイソメラーゼとは異なっている。イソメラーゼ
活性は、Ｔｒｉｓ緩衝液，ｐＨ ７．５よりもリン酸緩衝液，ｐＨ７．５におい
て高かった（図２８）。酵素はリン酸緩衝液で最も安定だった。 界面活性剤可溶性分画を、方法Ａ、ＢまたはＤにより以下においてさらに精製
した。
【０２８４】方法Ａ ＤＥＡＥ−５ＰＷクロマトグラフィーによるイソメラーゼ精製のための実験条
件を確立した。これらの条件下では、イソメラーゼの７５％が回復した。図２９
は、ＯＴＧＰで可溶化したタンパク質からのイソメラーゼの精製の概略を与える
。３つの実験を行い同様の結果を得た。Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓイソメラーゼ
は０．５Ｍ ＮａＣｌによりカラムより溶出した。ピーク分画（＃４８〜＃５１
）は、カラムに載せたイソメラーゼの６０％を含んでおり、３２の平均比活性ま
で６倍に精製されたことになる。カラムを、１Ｍ ＮａＣｌでさらに溶出し、推
定酵素活性をＵＶ分析により検出した。（リノール酸（ＬＡ）は見かけ上ＣＬＡ
と同一のスペクトルを備えた生成物に変換された）。しかしながら、ＧＣによる
これらの分画の分析では、変換の主要生成物が１３分間の保持時間を有する一方
で、ｃｉｓ９，ｔｒａｎｓ１１−ＣＬＡの保持時間は約１０分間であることが示
された。０．５Ｍ ＮａＣｌにより溶出したピークと比較するとこのピークは小
さかったが、このデータは、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ細胞がＣＬＡの他の異性
体を生産する能力を有していることを示唆した。界面活性剤により可溶化された
タンパク質は、活性を失うか、４℃で３日を超えて保存した後に沈降する傾向が
あったため（データ非図示）、イオン交換クロマトグラフィーでイソメラーゼ活
性の高い回収を達成するには、新鮮に調製した抽出液を使用すべきであることが
観察された。
【０２８５】 ＯＤ234での吸光度を測定する（脂肪酸と他のＵＶ吸収化合物中の共役二重結
合を発見する）ＣＬＡに対する高速分光測定アッセイを使用して、カラム溶出液
分画中のＣＬＡ濃度を評価した。ＯＤ234吸収物質がさらに精製する前にＣＬＡ
であることを確認することは重要であった。この目的でガスクロマトグラフィー
を使用した。ガスクロマトグラフィーによって得られた結果をＯＤ234データと
比較すると、良い相関が示され、これは「活性な」分画が所望のイソメラーゼ酵
素活性を有することを示していた。
【０２８６】 イソメラーゼを、上に説明したような許容最小損失で、ＤＥＡＥにて部分的に
精製した。しかしながら、プールした酵素分画の活性は、４０℃で一夜貯蔵した
後で５０％減少した。いくつかの実験では、ＤＥＡＥ精製後に活性が検出されな
かった。従って、精製を続けるために酵素活性を維持することは重要である。
【０２８７】 Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラーゼが膜タンパク質であること
が実証された。界面活性剤であるオクチル−チオグルコピラノシド（ＯＴＧＰ）
を使用して、イソメラーゼを良好に可溶化した。不運にも、ＯＴＧＰ（および可
溶化酵素）は、４℃での精製の間ゆっくり沈殿した。高塩濃度での非変性界面活
性剤であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（塩の高濃度を持った）は、周辺タンパク
質と内在性膜タンパク質とを区別するために一般に使用される。１％ Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００と０．３％ ＯＴＧＰの間の可溶化の効率には、有意な差は見
出されなかった。０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−ｌ００と０．３％ ＯＴＧＰの
混合物を用いると、より少量の総タンパク量が可溶化された。１Ｍ ＮａＣｌだ
けによる可溶化の効率は非常に低かったが、これはイソメラーゼが内在性膜タン
パク質であることを示している。
【０２８８】方法Ｂ Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓイソメラーゼの活性および安定性を改良することは
明白に必要だった。２つの異なる培地であるＢＨＩおよびＭＲＳを試験した。結
果を図３０に示す。ｐＨ７．０で、ＭＲＳ培地でより高い総タンパク量は得られ
たが、より少量のイソメラーゼが生産された。どちらの培地で生産されたイソメ
ラーゼの安定性にも違いはない。プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ（０．１−
１．０ｍＭ）、ヨードアセトアミド（１ｍＭ）およびペプスタチンＡを、イソメ
ラーゼの安定性に対するそれらの影響について試験した。いずれも測定可能な利
点がなかった。
【０２８９】 リゾフォスファチジルコリン（ＬＰＣ）がある状態での可溶化が、より高濃度
の界面活性剤の使用を可能にすることが報告されている。それにより、より完全
な膜タンパク質の可溶化が許容される。ＣａＣｌ2は、いくつかのヌクレアーゼ
を始めとする酵素を活性化することが可能である。ＣａＣｌ2とＬＰＣの添加に
より、界面活性剤で可溶化したナトリウムチャンネル膜タンパク質を安定化させ
ることが実証された。リノール酸イソメラーゼに関してはそれらのいずれの肯定
的結果も観察されなかった。さらに、ＣａＣｌ2はＴｒｉｓ緩衝液システムとリ
ン酸緩衝液システムの両方での酵素活性を減少させた。３７℃より高温度では、
ＣａＣｌ2は活性に影響を与えなかったがイソメラーゼ活性が４２℃と６０℃の
温度では５０％に減小した（図３１）。
【０２９０】 図３２は、酵素活性および安定性に対して鉄キレート剤、フェナントロリンお
よびＥＤＴＡが及ぼす影響を示す。粗抽出物中の酵素がフェナントロリンによっ
て保護されたように思われる。１ｍＭ ＥＤＴＡの添加は否定的効果を有するが
、１ｍＭ フェナントロリンを１ｍＭ ＥＤＴＡと組み合わせた時、その保護は
より有効だった。対照的に、界面活性剤緩衝液に鉄キレート化合物を添加すると
、酵素調製物中の活性が喪失し、安定性がわずかな増大した（図３３）。
【０２９１】 Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来の９，１１−リノール酸イソメラーゼをさらに
精製する努力に先立って、粗抽出物中および界面活性剤可溶性分画中での酵素の
安定性を増大させるための努力を払った。
【０２９２】 抽出効率および酵素安定性に対してｐＨおよび酵素の抽出中に使用する緩衝液
の種類が及ぼす影響について検討した。粗抽出物を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液を
用いてｐＨ５．０−９．０で調製した。抽出中のｐＨ値は、抽出効率および酵素
安定性の両方に強い影響を及ぼした。イソメラーゼの抽出の最適ｐＨは７．５で
あり（図３４）、このｐＨでは、イソメラーゼの半減期がｐＨ ８．０では１日
であったのから、１週間まで延長された（図３５）。
【０２９３】 さらに、緩衝液の種類の影響も有意であった。Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸カリウ
ム緩衝液、およびＨｅｐｅｓ緩衝液を比較した。結果を図３６に示す。リン酸エ
ステル緩衝液がイソメラーゼの抽出および可溶化に最も有効であった。この緩衝
液は、得られる活性を顕著に増大させた。粗抽出物では、活性が、Ｔｒｉｓで得
られる活性の約２倍であった。また、界面活性剤可溶性分画では、４〜７倍の増
大が測定された。ＮａＣｌ（活性の２０％増大）とグリセロール（３０％の増大
）の濃度を増加させることによりさらなる改良が得られた（図３７）。
【０２９４】 酵素安定性をｐＨ７．５にて比較した。一般的に、イソメラーゼは粗抽出物で
界面活性剤可溶化分画よりも安定していた（図３８）。Ｔｒｉｓ粗抽出物、リン
酸粗抽出物およびＨｅｐｅｓ粗抽出物中で１０、１１および１３日の半減期がそ
れぞれ測定された。グリセロールと塩の濃度を増加させることで安定性の主な改
良が得られ、これにより粗抽出液で一週間、完全に近い活性が保持された。しか
しながら、界面活性剤可溶化イソメラーゼの半減期は、Ｔｒｉｓとリン酸緩衝液
ではそれぞれ３，６日にすぎなかった。
【０２９５】 上記に説明したように、０．３％ オクチル−チオグルコピラノシド（ＯＴＧ
Ｐ）で可溶化した酵素に関してＰｈａｒｍａｃｉａ ＤＥＡＥ ＭｏｎｏＱカラ
ムを使用して、小規模の精製を行った。先に使用していたＴｒｉｓをリン酸緩衝
液と替えた。約２５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出する活性の単一のピークが得られた
（図３９）。このステップ後の比活性は２．５倍増大した。この結果は再現可能
だった。このカラムから得られたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、約
７０ｋＤの分子量に対応するバンドが示された（データ非図示）。分子量は、Ｌ
．ｒｅｕｔｅｒｉの９，１１イソメラーゼの分子量と類似しており、これは２つ
のイソメラーゼが同様の特徴を有していることが示唆している。
【０２９６】 ＯＴＧＰを良好に使用して、イソメラーゼを可溶化した。しかしながら、界面
活性剤（および可溶化酵素）は、４℃でゆっくり沈殿する。この沈殿により、透
析による酵素溶液の脱塩後に、活性は５０％を超えて喪失する。しかしより重要
なことには、それはイオン交換カラムを詰まらせ、カラムを使用不可能にする。
【０２９７】 従って、イソメラーゼを効率的に可溶化できるが、沈殿の問題の回避する界面
活性剤が、調べられた。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は、イソメラーゼに対する可
溶化剤として優れた性能を有し、可溶化タンパク質の量はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００濃度の増加と共に増加する。イソメラーゼ抽出は、高い塩濃度でも（５００
ｍＭ ＮａＣｌ）増強された。しかしながら、イオン交換前に溶液を透析された
時、酵素活性が完全に失われることが判明した。低塩濃度と組み合わせてＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−ｌ００を使用すると、膜ペレットからのタンパク質の抽出がより少
なくなったが酵素活性は同様であり、また、脱塩ステップの必要性が排除される
。
【０２９８】 ５０ｍＭ リン酸緩衝液中で２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−ｌ００を用いると、Ｏ
ＴＧＰを用いて得られたのと同様の抽出効率が達成された。２つの界面活性剤系
での可溶化タンパク質および比活性の比較を、表４に示す。酵素安定性は、ＯＴ
ＧＰ対してＴｒｉｔｏｎでは低下する。これはこの新しい界面活性剤系で残って
いる欠点の１つである。しかしながら、この条件は、クロマトグラフィーの多数
のステップにより酵素を精製するための使用可能の時間枠を依然として与える。
イソメラーゼの連続精製計画はＤＥＡＥクロマトグラフィーであり、これに引き
続いて実施例５〜９に説明したイソメラーゼに対して行ったようなクロマトフォ
ーカシングを実行する。
【０２９９】
【表６】
【０３００】 第３の非イオン界面活性剤であるオクチルグルコシド（ＯＧ）を、Ｃ．ｓｐｏ
ｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラーゼを可溶化するその能力に関して試験した
。ＯＧは有効にイソメラーゼを可溶化し、可溶化した酵素の活性は安定していた
。ＯＧは、１．５％（２×臨界ミセル濃度）でＯＴＧＰ可溶化イソメラーゼより
約２０％高いイソメラーゼ比活性を生じさせた。透析後。可溶化膜タンパク質試
料中に沈殿は観察されなかった。
【０３０１】方法Ｃ リノール酸イソメラーゼを可溶化するためにＯＧが使用できる一方、この界面
活性剤は高価すぎるので、大規模のイソメラーゼ精製には使用できない。リノー
ル酸イソメラーゼを可溶化するプロトコルを改変して、最初にＯＧでイソメラー
ゼを可溶化し、次にさらなる精製中にＯＴＧＰで酵素を可溶化した状態に保った
。膜分画を、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）において１．５％
ＯＧで可溶化した。ＯＧで可溶化したタンパク質を、２０ｍＭ リン酸カリウ
ム緩衝液、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ジチオスレイトールおよ
び０．３％ ＯＴＧＰに対して透析した。４５，０００ｇ、３０分間の遠心後、
可溶化したタンパク質を、低塩濃度緩衝液（２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ
７．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．３％ ＯＴＧＰ、１ｍＭ ジチオスレイトー
ル、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１μＭペプスタチンＡ）で平衡化したＤＥＡＥ−５
ＰＷカラムにかけ、０〜０．５ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で１６℃で溶出した
。
【０３０２】 ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムクロマトグラフイーは４倍の精製を達成した。イソメ
ラーゼ活性の２つの別個のピークが明らかとなった（図４０）。より高いイオン
強度で溶出したピークＩＩは、すべての先のＤＥＡＥクロマトグラフィー実験中
に観察された。より低いイオン強度（０．１８Ｍ ＮａＣｌ）で溶出したピーク
Ｉは、初めて観察された。メチルエステル生成物のＧＣ分析で決定されるように
、両方のピークは、リノール酸のｃｉｓ９，ｔｒａｎｓ１１−ＣＬＡへの異性化
に触媒作用を及ぼした。ピークＩＩを選択してさらに精製した。
【０３０３】 ＤＥＡＥピークＩＩからの活性分画（分画４３−４７）をプールし、濃縮し、
０．３％ ＯＴＧＰを含む２５ｍＭ ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．１に対して透
析し、次にＭｏｎｏ−ｐクロマトフォーカシングゲルカラムに載せた。溶出を１
００ｍｌの１０％ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ７４を用いて行い、最終ｐＨ値を３．５
まで低下させた。イソメラーゼ活性はカラム上に保持された。ｐｏｌｙｂｕｆｆ
ｅｒ７４勾配の完了後、イソメラーゼ活性を５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ
７．１の１Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出した（図４１）。このクロマトフォーカシン
グステップにより、さらに２〜６倍の精製を達成した（表５）。イソメラーゼ活
性が高いプールしたクロマトフォーカシング分画のＳＤＳ ＰＡＧＥによる調査
により、２本の主なタンパク質バンドが明らかとなった。
【０３０４】
【表７】
【０３０５】方法Ｄ イソメラーゼ活性が高いプールしたクロマトフォーカシング分画を、ゲルろ過
を使用してさらに精製した。この方法はタンパク質をサイズにより分離する。イ
ソメラーゼの精製に関しては、１．６×５５ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カ
ラムを使用してゲルろ過を実行した。溶出緩衝液は、０．１〜０．３Ｍ ＮａＣ
ｌ、０１３％のＯＴＧＰおよび１０％ グリセロールを含む１００ｍＭ Ｋ−リ
ン酸エステル、ｐＨ７．５より構成した。種々の分画でのイソメラーゼ活性の測
定により、イソメラーゼ活性の単一のピークが明らかとなった。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析では、クマシーブルーによる染色後に約４５ｋＤの単一のタンパク質バン
ドが示された。
【０３０６】
【表８】
【０３０７】実施例２１ 以下の実施例では、精製Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ内在性膜タンパク質である
（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸イソメラーゼのＮ末端アミノ酸
配列の配列決定について説明する。
【０３０８】 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍイソメラーゼを多重ステップのクロマトグラフィー法
（例２０）を用いて精製した。この精製タンパク質は、ＳＤＳゲルで質量約４５
ｋＤの単一バンドを示したが、これをＮ末端配列決定のために使用した。Ｎ末端
アミノ酸配列を得る最初の試みによると、該タンパク質がＮ−末端でブロックさ
れていることが示唆された。タンパク質抽出および精製中に、細胞の天然形式と
して、または人工的事象の結果として、タンパク質全体の４０〜７０％のＮ−末
端がブロックされていると概算された。人工的なＮ末端ブロックの可能性を制限
するために、ゲルろ過の最終ステップを受けないタンパク質試料を使用した。こ
のタンパク質試料は非常に高いイソメラーゼ活性を持っており、ＳＤＳ ＰＡＧ
Ｅ分析によって４５のｋＤタンパク質を主に含んでいた。ＰＶＤＦ（ポリビニリ
デンジフロリド）膜上にブロットした後、４５ｋＤバンドを切り出し、配列決定
のために使用した。２１のアミノ酸残基の配列を以下のように決定した： ＭＦＮＬＫ ＮＲＮＦＬ ＴＬＭＤＦ ＴＰＸＥＩ Ｑ（配列番号４３）
【０３０９】 配列番号４３の配列を有するタンパク質をここではＰＣＬＡ21と称する。 アミノ酸配列決定技術に誤差が全くないわけではないので、配列番号４３がせい
ぜい見かけの部分Ｎ末端アミノ酸配列を表わすにすぎないことに注意すべきであ
る。
【０３１０】 該配列はＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８よりクローニングしたリノール酸イソ
メラーゼ（配列番号１８）と有意な相同性を示さず、Ｐ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ
６９１９由来の５５ｋＤイソメラーゼのＮ末端配列（配列番号４２）とも、Ｂ
ｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓより精製した推定１９ｋＤ
イソメラーゼペプチド（Ｐａｒｋら、１９９６；背景のセクションのＰａｒｋら
に関する先のコメントを参照のこと）とも有意な相同性を示さない。Ｃ．ｓｐｏ
ｒｏｇｅｎｅｓイソメラーゼのＮ末端配列は、標準設定のＢｌａｓｔｐプログラ
ムを使用して、データベース中の配列に対して分析した。配列は、Ｃ．ｐｅｒｆ
ｒｉｎｇｅｎｓ（ｇｉ１３２１７８７）を含む６つの異なる生物から単離したオ
ルニチンカルバモイルトランスフェラーゼと５７〜７５％同一のアミノ酸配列を
共有することが判った。しかしながら、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍオルニチンカル
バモイルトランスフェラーゼはＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｐ．ａｃｎｅｓまた
はＬ．ｒｅｕｔｅｒｉリノール酸イソメラーゼよりはるかに小さな３７ｋＤのタ
ンパク質である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍオルニチンカルバモイルトランスフェ
ラーゼは、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８からクローニングしたＤＮＡ配列から
導き出すかまたはＰＹＲ８イソメラーゼのアミノ酸配列から直接決定したリノー
ル酸イソメラーゼペプチドや、Ｃ．ａｃｎｅｓイソメラーゼのＮ末端配列と、有
意な配列相同性を共有しない。従って、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍリノール酸イソ
メラーゼとアルギニン代謝に関与する酵素との間の相同性の優位性は明らかでな
い。Ｐ．ａｃｎｅｓイソメラーゼに関して上に論じたように、完全なイソメラー
ゼ配列との比較が必要である。しかしながら、実施例１３において上述したよう
に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍリノール酸イソメラーゼは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓおよびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のリノール酸イソメラー
ゼと、推定ＮＡＤ／ＦＡＤ結合ドメインを共有すると予想される。
【０３１１】 Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラーゼ核酸およびアミノ酸配列全
体は、当該技術分野における標準分析法を使用して、かつ実施例に説明したまた
Ｐ．ａｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼに述べたように、現在解読しているとこ
ろである。当業者は、配列番号４３をコードする核酸配列をアミノ酸配列から推
定することが可能である。そのような核酸配列を含む単離核酸分子は、本発明に
包含される。
【０３１２】実施例２２ 以下の実施例では、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラーゼの酵素
活性を実証する。 同様の動力学データをＬ．ｒｅｕｔｅｒｉに対して作成した（実施例４）。こ
の実験では、すべての動力学実験を、ＨＰ８４５２Ａダイオード配列分光光度計
を使用して、室温で、石英キュベット（１ｃｍ光路長、磁気スターラー付き）に
て実行した。キュベットに、５０μｇタンパク質、０．１Ｍ リン酸カリウム、
ｐＨ７．５、ｌ０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０％ １，２−プロパンジオールを含
むインキュベーション緩衝液の１ｍｌを充填した。異性化は、１，２−プロパン
ジオールに新たに希釈した基質ストック（〜２０μＭリノール酸）の小アリコー
ト（ｌ〜２μｌ）を５０秒目に添加することにより開始した。２３４ｎｍにおけ
る吸光度の増加をモニターし、記録した。図４３は、リノール酸のＣＬＡへの酵
素触媒による変換率対時間の典型的な累進曲線を示す。形成された生成物の量を
、２４，０００のモル吸光係数に基づいて計算した。
【０３１３】 部分的に精製した酵素（ＤＥＡＥ活性分画の混合物）を使用して、以下のＣ．
ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラーゼ動力学的パラメータをキャラクタ
ライズした：基質特異性、酵素活性の阻害、ｐＨ、補因子および種々の脂肪酸お
よびその誘導体が触媒作用に及ぼす影響。
【０３１４】異性化のｐＨ依存性 イソメラーゼ活性に対するｐＨ値の影響を、異なるｐＨ値で一連のリン酸カリ
ウム緩衝液（０．ｌＭ）を使用して決定した。異性化対Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅ
ｓリノール酸イソメラーゼに対するｐＨ値のプロットを、図４４に示す。異性化
のための最適ｐＨは約ｐＨ７．５であり、それはさらにＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｐ
ＹＲ８イソメラーゼに対しても最適だった。従って、ｐＨ７．５緩衝液をすべて
の動力学的分析に使用した。
【０３１５】
【表９】 基質特異性 Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラーゼの基質特異性を、基質とし
て多くの不飽和脂肪酸、それらのエステル化誘導体またはアルコール変換誘導体
を使用して研究した。基質特異性の傾向を表３に要約する。該イソメラーゼは、
Ｃ１８脂肪酸の９，１２位置に「Ｚ」二重結合を有する基質に対して明確な嗜好
を示す。追加の二重結合を有する化合物も良好な基質である。しかし、ターンオ
ーバー率は二重結合の増加とともに減少した。試験した他のジエン酸（Ｃ１８−
Ｃ２２）のうちでは、（ｃｉｓ，ｃｉｓ）−１１，１４−エイコサジエン酸のみ
が異性化された。これは、イソメラーゼが第１二重結合位置の後に９つの炭素原
子を有するＣ１８とＣ２０の不飽和脂肪酸を利用することを示唆している。
【０３１６】 イソメラーゼをリノレイルアルコールおよびリノール酸メチルともインキュベ
ートした。表６に示すように、アルコール変換リノール酸およびエステル化リノ
ール酸は基質として作用しない。明らかに、イソメラーゼは遊離カルボキシル基
を含む化合物のみを利用している。これは、Ｋｅｐｌｅｒと彼の共同研究者によ
って得られたＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓイソメラー
ゼに関する結果およびＬ．ｒｅｕｔｅｒｉＰＬＲ８およびＰ．ａｃｎｅｓ６９１
９イソメラーゼに関する我々の研究に一致している。基質への親和性
【０３１７】 Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラーゼが１８の炭素鎖長を備えた
「Ｚ」二重結合化合物に対して高い特異性を示したので、同様の化合物（リノー
ル酸、リノレン酸、ｒ−リノレン酸および（ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ）
−６，９，１２，１５オクタデカテトラエン酸）に対する該酵素の親和性を調べ
た。
【０３１８】 異性化の基質濃度依存性の動力学的分析（図４５）によれば、以下の証拠が提
供された。 １．反応速度は基質濃度に強く依存する。 ２．基質は、リノール酸、リノレン酸、ｒ−リノレン酸および（ｃｉｓ，ｃｉ
ｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ）−６，９，１２，１５オクタデカテトラエン酸のそれぞれ
２０、４０、１５および１２０μＭを超える濃度で阻害効果を有する。
【０３１９】 図４６は、１／ｖ対ｌ／［Ｓ］のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロット
を示す。このプロットから計算して、リノール酸に対して１１．３μＭのＫmと
３５０μｍｏｌ ＣＬＡ／ｍｉｎ／μｇタンパク質の最大速度（Ｖmax）を得た
。他のＣl8不飽和脂肪酸を使用して決定したＫmおよびＶmaxの値を、表７Ａに示
す。試験された基質はすべて、試験濃度の全範囲にわたって通常のＭｉｃｈａｃ
ｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ挙動を示した。Ｋm値は基質中の二重結合の増加とともに
増加した。酵素は、３つの二重結合を有する異性体であるリノレン酸およびｒ−
リノレン酸に対しても同様のＫm値を有していた。Ｋmの比較から、リノール酸は
明らかにＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラーゼの最良の基質である
。
【０３２０】 表７Ａは、本願発明者がすべて単離したＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８および
Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ２３２７２由来のリノール酸イソメラーゼと、Ｂ．ｆ
ｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ Ａ−３８リノール酸イソメラーゼ（Ｋｅｐｌｅｒ ａ
ｎｄ Ｔｏｖｅ，１９６７，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：５６８６−５６９２
）の重要な動力学的パラメータを比較したものである。
【０３２１】
【表１０】 表７Ａに見られるように、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラーゼ
の動力学的データは他のリノール酸イソメラーゼと質的に類似している。しかし
ながら、異性化速度は非精製Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅ
ｎｓイソメラーゼ（Ｋｅｐｌｅｒ ａｎｄ Ｔｏｖｅ，１９６７、前掲を参照）
についてケプラーにより報告されたそれよりはるかに高い。
【０３２２】 表７Ｂは、本願発明者がすべて単離したＰ．ａｃｎｅｓ（実施例１１における
ようなクロマトフォーカシングステップで精製した酵素を使用してＶmaxを決定
した以外は、実施例１１と同様のＤＥＡＥ精製前の粗抽出物）、Ｌ．ｒｅｕｔｅ
ｒｉ（実施例３におけるようなゲルろ過ステップで精製した酵素）、およびＣ．
ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ（実施例２０におけるようなゲルろ過ステップで精製した
酵素）からのリノール酸イソメラーゼ、ならびに、Ｂ．ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎ
ｓ Ａ−３８リノール酸イソメラーゼ（粗抽出物；Ｋｅｐｌｅｒ ａｎｄ Ｔｏ
ｖｅ，１９６７，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：５６８６−５６９２）の動力学
的データおよびキャラクタライゼーションの要約である。これらの実験における
基質はリノール酸とした。
【０３２３】
【表１１】 イソメラーゼ活性に対する補因子の影響 ２つの基質、リノール酸（ＬＡ）および（ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ）
−６，９，１２，１５オクタデカテトラエン酸（テトラＬＡ）を使用して、補因
子の影響を試験した。反応混合物は、１０ＰＰＭ（ＬＡ）または２０ＰＰＭ（テ
トラＬＡ）の基質と、以下の１または複数の補因子もしくは添加物を含有してい
た：１ｍＭ ＤＴＴ、５０μＭ ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ
ＰＨおよびＣｏＡ。表８および表９に見られるように、いずれの補因子または添
加物も、イソメラーゼ活性に強い影響を及ぼさなかった。これは異性化が外部補
因子またはエネルギーの添加を必要しないことを示唆している。
【０３２４】
【表１２】
【表１３】
【０３２５】脂肪酸およびその誘導体がリノール酸異性化に及ぼす影響 脂肪酸およびその誘導体の影響を調べた。脂肪酸の濃度は３５μＭに固定した
。表１０はデータの要約を示す。結果は以下のことを実証した。 １．試験した飽和脂肪酸は見かけ上、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イ
ソメラーゼの活性に影響を及ぼさない。 ２．イソメラーゼ活性は、研究したすべての不飽和脂肪酸により強く阻害され
る。 ３．リノール酸カルボキシル基のエステル誘導体、リノール酸メチルおよびリ
ノレイルアルコールも、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラーゼの阻
害剤である。
【０３２６】
【表１４】
【０３２７】オレイン酸とパルミトレイン酸の阻害作用 オレイン酸とパルミトレイン酸の阻害作用をさらにキャラクタライズした。 １．（カルボキシル末端から数えて）９位の炭素にｃｉｓ二重結合を含んでい
るＣ18およびＣ16不飽和脂肪酸はともに、リノール酸の異性化を阻害した。 ２．イソメラーゼ活性は、オレイン酸濃度の増加と共に、劇的に低下した（図
４７）。７０μＭオレイン酸（２０ＰＰＭ）がある状態ではイソメラーゼ活性は
ほぼ完全に失われた。 ３．二次プロット（１／ｖ対［Ｓ］）から計算したオレイン酸とパルミトレイ
ン酸に対する阻害定数（Ｋi）は、それぞれ２３．８および３３．１μＭであっ
た（図４８，４９）。
【０３２８】 ケプラーおよびタヴならびにその共同研究者は、オレイン酸がＣＬＡへのリノ
ール酸の異性化を競合阻害すると報告した（Ｋｅｐｌｅｒ ａｎｄ Ｔｏｖｅ，
１９６７、前掲）。オレイン酸がＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラ
ーゼの競合阻害剤かどうかを決定するために、オレイン酸の阻害作用をＬｉｎｅ
ｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅ（１／Ｖ対ｌ／［Ｓ］）およびＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌ
ｆ（［Ｓ］／Ｖ対［Ｓ］）プロットを使用してさらに調べた。動力学的分析を、
０、２４および４８μＭのオレイン酸の存在下でリノール酸の濃度を変えて実行
した。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロット（図５０）の平行線およびＨ
ａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロット（図５１）の共通切片が得られた。これらのデー
タは、オレイン酸がＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラーゼの非競合
阻害剤であることと一致している。同様の結果がＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８
（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸イソメラーゼに関しても得られ
た。以上の結果は、Ｂ．ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９
，１１−リノール酸イソメラーゼに関して報告されたオレイン酸による競合的阻
害と対照をなしている。
【０３２９】実施例２３ 以下の実施例では、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８のための増殖条件の最適化
について説明する。
【０３３０】 発酵作業で重点を置いたのは、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８の増殖条件の最
適化であった。発酵培地は、細胞増殖とイソメラーゼ生産を一貫して良好に支援
可能であり、従って、以前に観察された可変性の排除を追求した。
【０３３１】 ＭＲＳ培地を用いて作業すると、主として細胞増殖にいくらか影響を及ぼす培
養液組成および殺菌手順のせいで、リノール酸イソメラーゼ活性が変化しうるこ
とが判明した。接種物ステージの数および接種物サイズは最終細胞濃度に影響し
なかった。培地中のガス収支に影響すると疑われる混合増殖と静止増殖は、有意
に変化するとは思われなかった。培地に豊富に与えられるので、いくつかの化合
物の有毒濃度が可変性の考えられる理由として疑われた。しかしながら、種々の
希釈度のＭＲＳは、それに比例する低い細胞濃度を招来した（データ非図示）。
これは培地における栄養的制限を示す。さらに、同じ培地の２つのバッチを使用
すると、高い可変性が観察された。
【０３３２】 １および１０リットルの発酵容器で実行した実験によれば、ＭＲＳに類似の組
成を有するが酵母エキス、ペプトンおよび酢酸エステル濃度が高くビーフエキス
を含まない異なる培地（ＡＶ）が、細胞増殖およびイソメラーゼ活性の両方に関
してＭＲＳより発酵容器においてより一貫して良好な結果を与えることが示され
た。我々はさらなる仕事のために、この培地をベース培地として採用した。その
組成を表１１に示す。
【０３３３】
【表１５】 ビタミン混合物はリボフラビン、パントテン酸、ピリドキサール、ニコチン酸
、葉酸、塩化コリン、ビオチンおよびチアミンを含んでいた。
【０３３４】 全要因分析を、２つのボトルで実行した。該培地を、７つのカテゴリー（酵母
エキス、ペプトン、酢酸エステル、グルコース、Ｔｗｅｅｎ８０、塩類およびビ
タミン）に分類し、かつ、各カテゴリーの成分の以下のような２つの濃度が及ぼ
す影響を検討した：２．５対１０ｇ／ｌの酵母エキス、１０対２０ｇ／ｌｌのペ
プトン、１０対２０ｇ／ｌのグルコース、５対１０ｇ／ｌの酢酸エステル、０．
５対１ｍｌ／ｌのＴｗｅｅｎ８０、０．５×対１×の塩濃度、ビタミン無添加対
添加。この研究により、酵母エキス濃度が増殖に最も影響を及ぼし、それに続い
てグルコース、およびグルコースと酵母エキスの併用作用が影響を及ぼすことを
明らかに示された。ペプトンの影響は限界ぎりぎりであり、他の成分は増殖に影
響しなかった。
【０３３５】 ＣＬＡへのリノール酸の変換によって測定されるように、Ｔｗｅｅｎ８０の濃度
はイソメラーゼ活性に影響するように思われた。Ｄｉｆｃｏ酵母エキスを、ＫＡ
Ｔ酵母エキスとうまく取り替えて、いくつかの産業型窒素源を、ペプトン＃３の
代用物として試験した。それらを表１２に要約する。
【０３３６】
【表１６】 ほとんどのこれらの窒素源は、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８の増殖を支援し
たが、イソメラーゼ活性が必ずしも検出されるとは限らなかった。最も有望な窒
素源であるＮ−Ｚ−アミンＡ、Ａｍｂｅｒｆｅｒｍ ２２３４、Ａｍｂｅｒｆｅ
ｒｍ ４０１５、ＡｍｉｓｏｙおよびＨｙ−Ｓｏｙを、発酵容器中でさらに試験
した。Ｈｙ−Ｓｏｙはペプトンの良好な代用物にすぎないわけではなくペプトン
に優り増殖を改善することが判った。
【０３３７】 ラクトース、フルクトースおよびガラクトースを考えられる炭素源としてグル
コースと比較した。生物はフルクトースとラクトースでは増殖しなかった。また
、ガラクトースは、グルコースより優れた長所を有していなかった。
【０３３８】 ペプトンを使用し、２０ｇ／ｌまで酵母エキスのレベルを増加させで行った発
酵により、１０ｇ／ｌを超える酵母エキス濃度がまだ有益であることが示された
。発酵容器での全要因分析に関して、２つのレベルの酵母エキス（２０および３
０ｇ／ｌ）、Ｈｙ−Ｓｏｙ（１０および２０ｇ／ｌ）およびグルコース（２０お
よび３０ｇ／ｌ）を比較する、一層の最適化を継続した。高いグルコース濃度か
ら多くの酸が生産されるによる低ｐＨの阻害を回避するために、４．８でのｐＨ
調整を採用した。それらの発酵により起こった増殖では、条件間に統計的に有意
な差がなかったが、高い酵母エキスの発酵容器でわずかに高い光学濃度が得られ
ることが示された（データ非図示）。高レベルの３つの成分を備えた培地中の培
養物は、より速く増殖し、より高い細胞濃度に達した。
【０３３９】 ３０ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのＨｙ−Ｓｏｙおよび３０ｇ／ｌのグル
コースを含む培地を、さらなる最適化ステップのために選択した。 増殖温度およびＴｗｅｅｎ８０濃度の影響を研究した。発酵を、１１および１
．５ｍｌ／ｌ Ｔｗｅｅｎ８０および３７℃，４０℃および４３℃で実行した。
２０ｇ／ｌのＨｙ−Ｓｏｙを含む培地も３７℃と４３℃で比較された。増殖と変
換の結果は、高い温度が増殖およびイソメラーゼ活性には有益であることを明ら
かに示した（データ非図示）。高いＴｗｅｅｎ８０濃度で４３℃にて高い変換率
が観察されたが、Ｔｗｅｅｎ８０濃度の増加はリノール酸に変換に有意に影響を
与えるようには思われなかった。
【０３４０】 好ましい増殖温度として４０℃の温度を採用し、３０ｇ／ｌ 酵母エキス、１
０ｇ／ｌ Ｎｙ−Ｓｏｙ、３０ｇ／ｌ グルコースおよび１．５ｍｌ／ｌ Ｔｗ
ｅｅｎを含む培地を新しいベース培地として採用した。発酵の別のセットにおい
て、３部構成発酵容器で、手順の再現性を試験した。より高濃度の酵母エキス、
Ｈｙ−Ｓｏｙおよびグルコースも、４０℃にて比較した。結果は、この培地と増
殖条件では、最終細胞濃度とイソメラーゼ活性に関して、よい再現性を得ること
が可能であることを示した（データ非図示）。主成分の濃度のさらなる増加は、
細胞増殖に優勢に作用した。１０単位を超える光学濃度が４０ｇ／ｌ 酵母エキ
ス、２０ｇ／ｌ Ｎｙ−Ｓｏｙおよび４０ｇ／ｌ グルコースに関して得られた
。酵素比活性および細胞１つ当たりの活性はこれらのすべての異なる条件下で類
似した。従って、細胞濃度の増加により、イソメラーゼ活性は増加した。
【０３４１】 上に説明した３０ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ Ｎｙ−Ｓｏｙ、および３
０ｇ／ｌ グルコースとそれにプラスしてＡＶ培地の追加成分を含む培地では、
ＭＲＳに関して得られるよりも２倍高い細胞濃度（ＯＤとＤＣＷで測定）が得ら
れ作業も信頼できるものであった。これらの条件では、静止ボトルよりも発酵容
器において発酵は一貫して良好に実行された。培養物を２４時間および３０時間
目に採集し、培養物の年齢の関数としてイソメラーゼ活性を決定した。任意の試
験培地に関する異なる年齢の細胞間で、ＣＬＡへのリノール酸の変換速度に差は
見出されなかった。発酵時間が短くて済むのは、この培地でのおよび高温での増
殖が速いためである。２４時間目で、培養物は既に定常期に達していた。
【０３４２】 ９，１１リノール酸イソメラーゼの誘導物質候補として、いくつかの物質を試
験した。試験した物質には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミ
トレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸ステアリルエス
テル、リノレイルアルコール、リノール酸メチルエステル、リノール酸エチルエ
ステル、ステアリン酸およびリノール酸メチルエステルが含まれる。それらを１
００ｍｇ／ｌレベルで増殖培地に加えた。いずれの化合物でも肯定的作用は見出
されなかった。また、それらのうちの一部はイソメラーゼの発現および／または
活性に有害だった。肯定的作用の存在の決定は、それ自体が誘導物質であるが増
殖のために必要になるため除去できないＴｗｅｅｎ８０が必須に存在するために
、不明瞭になっている可能性がある。
【０３４３】実施例２４ 以下の実施例では、酵素安定性と性能を改善する条件と、生体内変換プロセス
の限定要因の試験について説明する。 Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８の細胞全体を以下に説明するすべての生体内変換
実験において使用した。
【０３４４】 酵素活性の保存の１態様は、採集直後の細胞の取扱と、適切な保存条件の決定
である。異なる緩衝液に維持した細胞の活性の保存について調べたところ、２０
ｍＭ システインまたは２０ｍＭＤＴＴを含むＴＫＭ／ＥＤＴＡ／ＮａＣｌ（５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１．２５
ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）のような還元緩衝液が他
の緩衝液または培地よりはるかに良好にイソメラーゼ活性を保存することが判っ
た。１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロールおよび２ｍＭＤＴＴを含む１０
０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐＨ ５．８（切断緩衝液）に維持した細胞は、４
８時間内に活性を失わなかった。この緩衝液中で測定した生体内変換速度が、反
応を実行するために好ましい培地として使用した培地（ＭＲＳ）で測定し生体内
変換速度に非常に類似していることがさらに判明した。
【０３４５】 細胞ペーストの凍結によっても、イソメラーゼ活性を保存することができた。
細胞ペーストを、ＭＲＳか切断緩衝液のいずれかで洗浄するかまたはしないで採
集した直後に凍結した。差は観察されなかった。細胞を、採集するかまたはせず
に培養液中に直接保存した時も、いくつかの興味深い結果が得られた。採集直後
の細胞と、採集してから２４時間４℃で細胞ペーストとして（洗浄せずに）維持
した細胞と、採集せずに２４時間４℃で培養液中に維持した細胞と、室温で２４
時間維持した培養液からの細胞とを比較した。ＣＬＡへのリノール酸の変換は、
一日間室温で維持した細胞でわずかな減小が観察されただけで、すべての場合に
おいて非常に類似していた。
【０３４６】 別の実験において、採集後に異なる方法で取り扱った細胞におけるイソメラー
ゼ活性を検討した。細胞を、ＭＲＳ、切断緩衝液または培養上清（ｐＨ５．８に
調整）に再懸濁した。採集直後、４℃で２４時間保持した後、および２２℃で４
時間保持してから４℃で２０時間保持後、１０００ｐｐｍのリノール酸の変換率
として比較したイソメラーゼ活性を測定した。それらの異なる実験から得られた
結果により、細胞が厳しい非増殖条件下で維持される場合には、酵素活性がより
良好に保存されることが示された（データ非図示）。
【０３４７】 何回かの反復実験において、ＭＲＳに再懸濁した細胞は、切断緩衝液に再懸濁し
た細胞よりも変化しやすい結果を与えた。ＭＲＳ中の細胞を室温に維持した時、
劣化は一層顕著となった。切断緩衝液では酵素安定性がより優れていたため、生
体内変換を実行するための好ましい培地として切断緩衝液を選択した。細胞は、
採集前に、発酵終了時に達した低ｐＨ値にて培養液中に保存することも可能であ
る。
【０３４８】 調べた生体内変換の別の態様は、油、水相、および膜結合酵素間の物質移動制
限の存在可能性であった。異なるリノール酸の添加方法を使用し、異なる振動速
度での撹拌ジャーにおける異性反応を実行して、実験を行った。
【０３４９】 リノール酸を、９９％ＬＡとして、プロピレングリコール（１００μｇ／ｍｌ
溶液）に溶解して、または０．５、５または３０％のレシチンで乳化して、添加
した。エマルションは、細胞の添加前にリノール酸およびレシチンを反応培地と
混ぜ合わせることにより調製した。リノール酸を１０００および２０００ｐｐｍ
で添加した。結果は、純粋な酸の添加またはプロピレングリコール溶液の添加の
間に有意な差はなく、いずれの反応も酸をレシチンで乳化した時よりもわずかに
速いことを示した（データ非図示）。高レベルのレシチンは、最終変換に否定的
に影響するように思われた。
【０３５０】 ２つの生体内変換反応を、３００ｍｌの反応培地を入れた撹拌ジャーで実行し
た。細胞をオリジナルの培養濃度に対して１０倍濃縮した。反応をＭＲＳ中で６
℃〜８℃の間で実行し、リノール酸をプロピレングリコールに加えて溶解させた
。０時間目に１０００ｐｐｍを加え、２時間目にさらに１０００ｐｐｍを加えた
。振動を一方の他方中で１つの反応器では２００ｒｐｍに保ち、他方では１００
０ｒｐｍに保った。結果、２つの条件間に有意な差が示されなかった。これらの
実験は、この酵素を用いて作業する場合に、物質移動制限は主要な問題ではない
ことを示した。
【０３５１】 酵素の性能に対して基質および生成物が及ぼす影響も、細胞の再利用可能性と
共に調べた。反応に対するＣＬＡの影響は、種々の濃度の異性体の混合物（Ｓｉ
ｇｍａの材料、約４１％の９，１１異性体と４８％の１０，１２ＣＬＡ）または
９，１１ＣＬＡのみ（Ｍａｔｒｅｙａの材料、約７７％の９，１１ＣＬＡ）のい
ずれかを加えることにより研究した。５００〜３０００ｐｐｍの濃度について試
験した。さらに、いくつかの実験を、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８に関する先
の生体内変換反応からブロスを再利用して実行した。初期ＣＬＡ濃度は約７００
ｐｐｍであった。どの場合でも、１０００ｐｐｍリノール酸を加えた。Ｓｉｇｍ
ａおよびＭａｔｒｅｙａ ＣＬＡの両方で、反応は、最低試験濃度でも完全に阻
害され、リノール酸とＣＬＡは反応が続く４時間の期間にわたって一定のままで
あった。同じ期間において、外因性ＣＬＡがない対照ではリノール酸がほぼ完全
に変換された。しかしながら、存在するＣＬＡが再利用反応ブロスから得たもの
場合には、その影響は検出されなかった。この場合、ＣＬＡがない場合と７００
ｐｐｍとの間の変換速度に違いはなかった。結果は、化学生産したＣＬＡ中にあ
る不純物のうちの一部が、生成物自体よりも９，１１イソメラーゼのより強い共
同阻害剤であり得ることを示している可能性がある。
【０３５２】 細胞が最初の生体内変換ステップ後に再利用する、別個の３つの実験を実行し
た。第１の実験では、１０００ｐｐｍのリノール酸を用いた生体内変換ステップ
を、ＭＲＳおよび切断緩衝液の両方において３時間で完了させた。９８〜９９％
のリノール酸が９，１１ＣＬＡに異性化された。細胞を遠心により回収し、同じ
培地に再懸濁し、１０００ｐｐｍリノール酸を添加し、反応をさらに３時間進行
させた。すべての場合で非常に良好な変換が得られた（データ非図示）。
【０３５３】 第２の実験では、細胞の再利用を、異なるレベルのリノール酸を用いて生体内
変換を実行した細胞に関して研究した。細胞を採集し、切断緩衝液に１０倍濃度
で再懸濁し、１０００、１５００、２０００、２５００および３０００ｐｐｍレ
ベルのリノール酸を加えた。より高いリノール酸濃度を与え、反応を６時間進行
させた。その時、細胞を遠心で回収し、緩衝液ｄ洗浄して（少なくとも一部の）
反応していないリノール酸とＣＬＡを除去し、細胞をすべて比較可能な条件下に
置いた。１０００ｐｐｍのリノール酸を加えて、反応を４時間続けた。第１段階
に得られた変換とＣＬＡの濃度により、活性の良好な細胞では、３０００ｐｐｍ
までのリノール酸で基質阻害が検出されないことが示された。より高いリノール
酸の反応は７時間では完了しなかったが、ＣＬＡの形成速度は種々の基質濃度で
非常に類似していた。しかしながら、細胞を再利用し、第２段階でリノール酸を
供給した場合、細胞が曝されたリノール酸レベルとは関係なく、いずれの細胞で
も反応は起こらずイソメラーゼ活性は検出されなかった。リノール酸に曝されな
かった同じロットの細胞は、２４時間後に十分な活性を維持していた。
【０３５４】 これらの結果から、観察された活性の喪失に関連して反応混合物への暴露の長
さを調べる必要性が生じた。反応を行っていない細胞で活性が失われていないこ
とは明らかなので、基質またはより高い可能性として生成物が、酵素と相互作用
してその活性に影響したのかもしれない。第３の再利用実験では、通常のように
細胞は濃縮し、反応を２０００ｐｐｍで開始した。反応が進行している間、２時
間ごとに８時間までアリコートを採取し、最終試料を２５時間目とした。各アリ
コートからの細胞を遠心により回収し、緩衝液に再懸濁した。１０００ｐｐｍの
リノール酸を添加した。その後、反応を３時間行った。結果は、細胞中で活性が
ゆっくり失われていることを明らかに示した。反応は第１段階で経時的に遅くな
り、細胞を新鮮な反応培地に置いた時に活性は回復しなかった。２時間後に再利
用した細胞が非常に良好な活性を有し１０００ｐｐｍのリノール酸をＣＬＡへ急
速に変換できた一方、８時間後に再利用した細胞は活性を有しなかった。再び述
べるが、２５時間後の対照では活性全体が保存されていた（反応なし）。
【０３５５】 上記実験は、酵素が反応中に不活性化されるか、基質にとって接近しにくくな
るという、明瞭な証拠を提供した。その理由は明らかではないが、生成物が蓄積
するとともに活性が失われるように見えるため、生成物との相互作用が示唆され
る。この相互作用の性質や、それが酵素または細胞の健康状態と直接関係がある
かどうかということは、現時点では明らかでない。この結果を理解するためには
、固定化酵素に関する研究がさらに必要である。
【０３５６】実施例２５ 以下の実施例では好ましい生体内変換プロトコルについて説明する。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ（またはリノール酸イソメラー
ゼ遺伝子を有する別の物）の細胞を、４０ｇ／ｌ 酵母エキス、２０ｇ／ｌ Ｈ
ｙ−ｓｏｙおよび４０ｇ／ｌ グルコースを含む変形ＡＶ培地（または他の生物
に対する他の適切な培地）で、約３〜４ｇ／ｌの乾燥菌体重量の細胞濃度まで増
殖させる。細胞が定常期に達した時に、細胞を採集し、１リットル当たり５〜２
０ｇの乾燥菌体重量間の濃度で切断緩衝液中に再懸濁した。生体内変換反応は、
酵素活性を維持するために４℃〜８℃の間の温度で好ましくは行うべきである。
リノール酸は、９９％の油として、別の油の１成分として、油相として、または
プロピレングリコールのような共溶媒に溶解させて添加可能である。リノール酸
は、０．５〜４ｇ／ｌの間の濃度で添加することが可能である。添加は、少量の
数回のステップで好ましくは行うべきである。より高いＣＬＡ濃度を得るために
、反応が進行している間に細胞を連続ステップで加えることも可能である。これ
らの条件下で、およびこれらのリノール酸濃度では、８０％〜１００％の間のＣ
ＬＡへのリノール酸の変換が２〜８時間以内に期待される。
【０３５７】実施例２６ 以下の実施例では、Ｐ．ａｃｎｅｓ細胞全体によるリノール酸の１０，１２Ｃ
ＬＡへの生体内変換について説明する。 そのような研究の目的は、１０，１２のリノール酸イソメラーゼの挙動のキャ
ラクタリゼーションを始めることおよび該酵素の性能を高める条件を決定するこ
とであった。
【０３５８】 Ｐ．ａｃｎｅｓは現在使用されている培地での増殖が非常に芳しくない偏性嫌
気性生物である。いくつかの以前の実験において、Ｐ．ａｃｎｅｓは１０，１２
ＣＬＡをさらに代謝できることが示唆された。新たな実験も、これがその通りで
あることを示したが、しかし、それは、反応の条件に依存する遅いプロセスであ
るように思われる。培養中に達成されている現在の細胞濃度と、９，１１ＣＬＡ
異性体生産に使用したのと同じ生物変換プロトコル（１０倍濃度の細胞、緩衝液
への再懸濁、プロピレングリコールに溶解させたリノール酸の添加）を使用する
と、反応は９，１１イソメラーゼの反応よりもずっと低い速度で進み、より少な
い変換が達成されることに注意すべきである。
【０３５９】 その反応を、培地対切断緩衝液で、異なる温度において、空気の存在下および
不在下で比較した。温度は反応速度に強い影響を及ぼした。反応は４℃では非常
にゆっくり進行し、反応速度は室温から３７℃まででは温度と共に増加した。成
長培地の使用と緩衝液の使用の間、もしくは反応が進行する時間枠（３０時間）
の間に酸素が存在するか不在であるかの間には、変換に有意な差は見出されなか
った（データ非図示）。反応を４８時間を超えてさらに進行させたとき、種々の
細胞および基質濃度に関するさらなる実験でＣＬＡ濃度の明らかな減少が示され
たが、リノール酸からのＣＬＡの形成がその時間では停止しているように思われ
た。
【０３６０】 当業者は、本発明の好ましい実施形態に多数の変更および改変を行うことがで
き、そのような変更および改変は本発明の精神から逸脱せずに行なわれ得る。従
って、特許請求の範囲は、そのようなすべての均等な変更が本発明の精神および
範囲内に入れるものとして、そのような変更を包含する。
【０３６１】 なお、本文中、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．らの文献中のＳｃｈａａｆｅｒ、
Ａ．Ａ．は元の英文では
【表１７】 であったが、ウムラウトを使用できないためａａを使用した。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２
５７６２による好気条件下でのリノール酸からのＣＬＡの細胞全体での生体内変
換を示す折れ線グラフである。
【図１Ｂ】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２
５７６２による嫌気条件下でのリノール酸からのＣＬＡの細胞全体での生体内変
換を示す折れ線グラフである。
【図２Ａ】Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＡＴＣＣ ６３８による好気条
件下でのリノール酸からのＣＬＡの細胞全体での生体内変換を示す折れ線グラフ
である。
【図２Ｂ】Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＡＴＣＣ ６３８による嫌気条
件下でのリノール酸からのＣＬＡの細胞全体での生体内変換を示す折れ線グラフ
である。
【図３Ａ】Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｎｓｅｎｉｉ ＡＴ
ＣＣ １４０７３によるリノール酸からのＣＬＡの細胞全体での生体内変換を示
す折れ線グラフである。
【図３Ｂ】Ｐ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ ６９１９によるリノール酸からのＣ
ＬＡの細胞全体での生体内変換を示す折れ線グラフである。
【図４】Ｐ．ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ ＡＴＣＣ ２５５６２によ
るリノール酸からのＣＬＡの細胞全体での生体内変換を実証する折れ線グラフで
ある。
【図５】Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８によるリノール酸からのＣＬＡの細
胞全体での生体内変換を示す折れ線グラフである。
【図６】Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉによる界面活性剤に可溶化したイソメラーゼの
ＤＥＡＥクロマトグラフィーを示す折れ線グラフである。
【図７】Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８によるイソメラーゼ活性のハイドロ
キシアパタイトクロマトグラフィーを実証する折れ線グラフである。
【図８】Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８によるリノール酸イソメラーゼ活性
のクロマトフォーカシングを示す折れ線グラフである。
【図９】Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８におけるリノール酸イソメラーゼ遺
伝子とその隣接読取枠の略図である。
【図１０】リノール酸イソメラーゼ遺伝子中の推定転写ターミネーターの略
図である。
【図１１】Ｅ．ｃｏｌｉにおけるリノール酸イソメラーゼ発現のためのいく
つかの構築物の略図。
【図１２】Ｂａｃｉｌｌｕｓにおけるリノール酸イソメラーゼ発現のための
いくつかの構築物の略図。
【図１３】組換えリノール酸イソメラーゼを発現したＥ．ｃｏｌｉの種々の
蛋白分画の調製用の実験プロトコルのフロー図である。
【図１４】Ｐ．ａｃｎｅｓの細胞全体を使用した、リノール酸からのｔｒａ
ｎｓ１０，ｃｉｓ１２−ＣＬＡの形成を示す折れ線グラフである。
【図１５】Ｐ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ ６９１９に対する細胞分画法プロト
コルを示すフロー図である。
【図１６】Ｐ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ ６９１９粗抽出物でのリノール酸イ
ソメラーゼ活性に対するｐＨ値の影響を示す折れ線グラフである。
【図１７】Ｐ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ ６９１９の粗抽出物でのＣＬＡ形成
の時間経過を示す折れ線グラフである。
【図１８】種々のリノール酸レベルでＰ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ ６９１９
の粗抽出物にてＣＬＡを形成するための時間経過を示す折れ線グラフである。
【図１９】粗抽出物にてＣＬＡを形成するための終末点を示す折れ線グラフ
である。
【図２０】Ｐ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ ６９１９の全可溶性タンパク質のＤ
ＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを示すグラフである。
【図２１】Ｐ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ ６９１９の全可溶性タンパク質の疎
水性相互作用クロマトグラフィーを示すグラフである。
【図２２】Ｐ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ ６９１９のイソメラーゼ活性のクロ
マトフォーカシングを示すグラフである。
【図２３Ａ】好気条件下、室温でのＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ
２５７６２によるＣＬＡ形成の時間経過を示すグラフである。
【図２３Ｂ】嫌気条件下、室温でのＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ２
５７６２によるＣＬＡ形成の時間経過を示すグラフである。
【図２３Ｃ】好気条件下、３７℃でのＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ
２５７６２によるＣＬＡ形成の時間経過を示すグラフである。
【図２３Ｄ】嫌気条件下、３７℃でのＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ
２５７６２によるＣＬＡの形成の時間経過を示すグラフである。
【図２４】Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２に関する抽出
プロトコルを示すフロー図である。
【図２５】Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２におけるリノ
ール酸イソメラーゼ最適ｐＨおよび温度を示す折れ線グラフである。
【図２６】Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２リノール酸イ
ソメラーゼに関する最適リノール酸濃度を示す折れ線グラフである。
【図２７】Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２リノール酸イ
ソメラーゼによるＣＬＡ形成のための時間経過を示すグラフである。
【図２８】Ｔｒｉｓおよびリン酸緩衝液中でのＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ
ＡＴＣＣ ２５７６２リノール酸イソメラーゼの安定性を示す棒グラフである。
【図２９】ＤＥＡＥ−５ＰＷからの新鮮なＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴ
ＣＣ ２５７６２リノール酸イソメラーゼ抽出液の溶出プロファイルである。
【図３０】Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２増殖およびリ
ノール酸イソメラーゼ活性に対する培地の影響を証明する棒グラフである。
【図３１】Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２リノール酸イ
ソメラーゼ活性に対するＣａＣｌ2の影響を示す棒グラフである。
【図３２】Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２に対するキレ
ート剤の影響を示す棒グラフである。
【図３３】リノール酸イソメラーゼの安定性に対するキレート剤の影響を示
す棒グラフである。
【図３４】Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２でのリノール
酸イソメラーゼの抽出効率に対するｐＨ値の影響を示す折れ線グラフである。
【図３５】Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２におけるリノ
ール酸イソメラーゼの半減期対ｐＨ値を実証する折れ線グラフである。
【図３６】Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２でのリノール
酸イソメラーゼ活性に対する緩衝液系の影響を示す棒グラフである。
【図３７】Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２のリノール酸
イソメラーゼの粗抽出物の安定性に対するグリセロールおよび塩濃度の影響を示
す折れ線グラフである。
【図３８】界面活性剤可溶化Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７
６２のリノール酸イソメラーゼの安定性を示す折れ線グラフである。
【図３９】ＤＥＡＥ ＭｏｎｏＱ上に載せたＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ Ａ
ＴＣＣ ２５７６２リノール酸イソメラーゼの溶出プロファイルである。
【図４０】ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム上に載せた界面活性剤可溶化Ｃ．ｓｐｏ
ｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２リノール酸イソメラーゼの溶出プロファ
イルである。
【図４１】クロマトフォーカシングにより部分的に精製したＣ．ｓｐｏｒｏ
ｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２リノール酸イソメラーゼの分離を示す溶出プ
ロファイルである。
【図４２】クローン化Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８イソメラーゼに特異的
なウサギ抗体を使用してリノール酸イソメラーゼの異なる菌株から調製した細胞
溶菌液におけるウェスタンブロット分析のディジタル化画像である。
【図４３】リノール酸の異性化の時間経過を示す吸光度プロファイルである
。
【図４４】Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２リノール酸イ
ソメラーゼによるＣＬＡへのリノール酸の異性化に対するｐＨ値の影響を示す折
れ線グラフである。
【図４５】リノール酸異性化の割合に対する基質濃度の影響を示す折れ線グ
ラフである。
【図４６】Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７６２リノール酸イ
ソメラーゼの反応動力学のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロットである。
【図４７】イソメラーゼ活性に対するオレイン酸の影響を示す棒グラフであ
る。
【図４８】オレイン酸阻害の二次プロットである。
【図４９】パルミトレイン酸阻害の二次プロットである。
【図５０】オレイン酸の存在下または不在下でのリノール酸異性化動力学の
Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロットである。
【図５１】リノール酸のオレイン酸による阻害のＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプ
ロットである。
【図５２】Ｐ．ａｃｎｅｓにおけるリノール酸イソメラーゼ遺伝子とその隣
接読取枠の略図である。
【図５３】完全なＰ．ａｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼコーディング配列
を含む、発現ベクターｐＥＴ−ＰＡＩＳＯＭの地図である。
【図５４】Ｅ．ｃｏｌｉ中の組換えＰ．ａｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼ
の発現のＩＰＴＧ誘導を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥのディジタル化画像である。
【図５５】組換えＰ．ａｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼの使用により生産
されたＣＬＡの紫外吸収スペクトルを示すグラフである。
【図５６Ａ】１００−ｍ ＳＰ２３８０カラムを使用した、ＣＬＡ異性体の
分割を示すグラフである。
【図５６Ｂ】組換えＰ．ａｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼの使用により生
産されたＣＬＡを示すグラフである。
【図５７】組換えＰ．ａｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼによって生産され
たＣＬＡのＤＭＯＸ誘導体のＧＣ−ＭＳスペクトルのグラフである。
【図５８】本発明のリノール酸イソメラーゼおよび他の酵素が共有している
推定ＮＡＤ結合ドメインを示す配列アラインメントである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/10 ４Ｈ０４５ 5/10 9/14 7/00 9/90 9/10 11/02 9/14 Ｃ１２Ｐ 7/40 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:01 11/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 7/40 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 11/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 デン、ミン−デ アメリカ合衆国 54220 ウィスコンシン 州 マニトウォック ウエスト ホワイト テール コート 4725 (72)発明者 グルント、アラン ディ． アメリカ合衆国 54220 ウィスコンシン 州 マニトウォック リンドバーグ ドラ イブ 3213 (72)発明者 ペン、スーザン シューユン アメリカ合衆国 54220 ウィスコンシン 州 マニトウォック ウエストウッド レ ーン 1108 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA07 AA10 BA07 BA10 BA11 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B033 NA01 NA02 NA12 NA13 NA16 NA17 NA35 ND02 NH09 4B050 CC01 CC02 CC03 DD02 EE10 LL02 LL05 4B064 AD12 CA02 CA19 CC24 DA01 DA10 DA11 4B065 AA01X AA01Y AA15X AA26X AA57X AA87X AB01 BA01 CA10 CA27 CA29 CA31 CA41 CA43 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA11 DA75 DA89 EA01 EA07 FA72 FA74 GA26 【要約の続き】

Claims (93)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】単離タンパク質であって、 ａ．配列番号４２、配列番号４３および配列番号６１から成るグループより選
    択されたアミノ酸配列； ｂ．配列番号６１の少なくとも約１７０の隣接アミノ酸にわたって配列番号６
    １と少なくとも約３５％同一のアミノ酸配列；および ｃ．（ａ）の前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１５の隣接アミノ酸を含む
    アミノ酸配列； から成るグループより選択されたアミノ酸配列を含み、リノール酸イソメラーゼ
    酵素活性を有する単離タンパク質。
  2. 【請求項２】ａ．配列番号４２、配列番号４３および配列番号６１から成る
    グループより選択されたアミノ酸配列；および ｂ．９の最小マッチ、１．１０のギャップペナルティおよび０．３３のギャッ
    プ長ペナルティにしたＭａｒｔｉｎｅｚ／Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ
    ＤＮＡアラインメント方法を使用して、配列番号７３と整列するアミノ酸配列；
    から成るグループより選択されたアミノ酸配列を含み、リノール酸イソメラーゼ
    酵素活性を有する単離タンパク質。
  3. 【請求項３】前記リノール酸イソメラーゼはリノール酸とリノレン酸を（ｔ
    ｒａｎｓ，ｃｉｓ）−１０，１２−リノール酸に変換する、請求項１または２の
    いずれかに単離タンパク質。
  4. 【請求項４】前記リノール酸イソメラーゼはリノール酸とリノレン酸を（ｃ
    ｉｓ，ｔｒａｎｓ）−９，１１−リノール酸に変換する、請求項１または２のい
    ずれかに記載の単離タンパク質。
  5. 【請求項５】前記タンパク質が、低程度にストリンジェントなハイブリダイ
    ゼーション条件で配列番号６０の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列を含
    む核酸分子によってコードされる、請求項１または２のいずれかに記載の単離タ
    ンパク質。
  6. 【請求項６】前記タンパク質が、中程度にストリンジェントなハイブリダイ
    ゼーション条件で配列番号６０の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列を含
    む核酸分子によってコードされる、請求項１または２のいずれかに記載の単離タ
    ンパク質。
  7. 【請求項７】前記タンパク質が、高程度にストリンジェントなハイブリダイ
    ゼーション条件で配列番号６０の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列を含
    む核酸分子によってコードされる、請求項１または２のいずれかに記載の単離タ
    ンパク質。
  8. 【請求項８】前記タンパク質は、配列番号６１の少なくとも３０の隣接アミ
    ノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項１または２のいずれかに記載の単離タ
    ンパク質。
  9. 【請求項９】前記タンパク質は、配列番号６１の少なくとも４５の隣接アミ
    ノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項１または２のいずれかに記載の単離タ
    ンパク質。
  10. 【請求項１０】前記タンパク質は、配列番号４２、配列番号４３および配列
    番号６１から成るグループより選択されたアミノ酸配列を有する、請求項１また
    は２に記載の単離タンパク質。
  11. 【請求項１１】前記タンパク質は配列番号６１のアミノ酸配列を有する、請
    求項１または２に記載の単離タンパク質。
  12. 【請求項１２】前記タンパク質はＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍおよ
    びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍリノール酸イソメラーゼから成るグループから選択さ
    れる、請求項１または２に記載の単離タンパク質。
  13. 【請求項１３】前記タンパク質はＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａ
    ｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉ
    ｃｉおよびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉ
    ｉリノール酸イソメラーゼから成るグループから選択される、請求項１または２
    のいずれかに記載の単離タンパク質。
  14. 【請求項１４】前記タンパク質はＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａ
    ｃｎｅｓリノール酸イソメラーゼである、請求項１または２のいずれかに記載の
    単離タンパク質。
  15. 【請求項１５】前記タンパク質はｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓリノール酸イソメラ
    ーゼである、請求項１または２のいずれかに記載の単離タンパク質。
  16. 【請求項１６】前記タンパク質は、少なくとも約１０ｎｍｏｌｅｓＣＬＡ
    ｍｇ-1分-1のリノール酸異性化比活性を有する、請求項１または２のいずれかに
    記載の単離タンパク質。
  17. 【請求項１７】前記タンパク質が、９の最小マッチ、１．１０のギャップペ
    ナルティおよび０．３３のギャップ長ペナルティにしたＭａｒｔｉｎｅｚ／Ｎｅ
    ｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ ＤＮＡアラインメント方法を使用して、配列番
    号７３と整列するアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列中のアミノ酸残基は、
    配列番号７３中の非Ｘａａ残基の少なくとも約７０％と整列する、請求項１に記
    載の単離タンパク質。
  18. 【請求項１８】前記タンパク質が、９の最小マッチ、１．１０のギャップペ
    ナルティおよび０．３３のギャップ長ペナルティにしたＭａｒｔｉｎｅｚ／Ｎｅ
    ｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ ＤＮＡアラインメント方法を使用して、配列番
    号７３と整列するアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列中のアミノ酸残基は、
    配列番号７３中の非Ｘａａ残基の少なくとも約８０％と整列する、請求項１また
    は２のいずれかに記載の単離タンパク質。
  19. 【請求項１９】前記タンパク質が、９の最小マッチ、１．１０のギャップペ
    ナルティおよび０．３３のギャップ長ペナルティにしたＭａｒｔｉｎｅｚ／Ｎｅ
    ｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ ＤＮＡアラインメント方法を使用して、配列番
    号７３と整列するアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列中のアミノ酸残基は、
    配列番号７３中の非Ｘａａ残基の少なくとも約９０％と整列する、請求項１また
    は２のいずれかに記載の単離タンパク質。
  20. 【請求項２０】前記タンパク質は可溶性酵素である、請求項１または２のい
    ずれかに記載の単離タンパク質。
  21. 【請求項２１】前記タンパク質は、前記タンパク質を発現する細胞の細胞膜
    への前記タンパク質の挿入を引き起こすリーダー配列を含む、請求項１または２
    のいずれかに記載の単離タンパク質。
  22. 【請求項２２】前記タンパク質は、配列番号４２、配列番号４３および配列
    番号６１から成るグループより選択されたアミノ酸配列を有するリノール酸イソ
    メラーゼと特異的に結合する抗体によって結合される少なくとも１つのエピトー
    プを有する、請求項１または２のいずれかに記載の単離タンパク質。
  23. 【請求項２３】請求項１または２のいずれかに記載の単離タンパク質に選択
    的に結合する単離抗体。
  24. 【請求項２４】リノール酸イソメラーゼ酵素活性を有するタンパク質をコー
    ドする核酸配列を含む組換え核酸分子で形質導入される固定化細胞であって、前
    記タンパク質は、 ａ．配列番号４２、配列番号４３および配列番号６１から成るグループより選択
    されたアミノ酸配列； ｂ．配列番号６１の少なくとも約１７０の隣接アミノ酸にわたって配列番号６
    １と少なくとも約３５％同一のアミノ酸配列；および ｃ．（ａ）の前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１５の隣接アミノ酸を含む
    アミノ酸配列； から成るグループより選択されたアミノ酸配列を含み、 前記核酸配列は転写調節配列と機能的に連結している、固定化細胞。
  25. 【請求項２５】前記組換え核酸分子が、中程度にストリンジェントなハイブ
    リダイゼーション条件で配列番号６０の相補的配列とハイブリダイズする核酸配
    列を含む、請求項２４に記載の固定化細胞。
  26. 【請求項２６】前記組換え核酸分子は、配列番号６０の少なくとも２４の隣
    接ヌクレオチドを有する核酸配列を含む、請求項２４に記載の固定化細胞、。
  27. 【請求項２７】前記組換え核酸分子は配列番号６０の核酸配列を有する、請
    求項２４に記載の固定化細胞。
  28. 【請求項２８】前記タンパク質は、配列番号４２、配列番号４３および配列
    番号６１から成るグループより選択されたアミノ酸配列を有する、請求項２４に
    記載の固定化細胞。
  29. 【請求項２９】前記タンパク質は配列番号６１のアミノ酸配列を有する、請
    求項２４に記載の固定化細胞。
  30. 【請求項３０】前記組換え核酸分子は前記細胞のゲノムへ組み込まれる、請
    求項２４に記載の固定化細胞。
  31. 【請求項３１】前記組換え核酸分子はプラスミドである、請求項２４に記載
    の固定化細胞、
  32. 【請求項３２】前記組換え核酸分子は、配列番号６１を有する天然リノール
    酸イソメラーゼと比較して前記リノール酸イソメラーゼ酵素活性を増大させる遺
    伝子修飾を含む核酸配列を有する、請求項２４に記載の固定化細胞。
  33. 【請求項３３】前記遺伝的修飾は、配列番号６１を有する天然リノール酸イ
    ソメラーゼと比較して、リノール酸イソメラーゼ酵素活性を有する前記タンパク
    質の基質阻害を減少させる、請求項３２に記載の固定化細胞。
  34. 【請求項３４】前記遺伝的修飾は、配列番号６１を有する天然リノール酸イ
    ソメラーゼと比較して、リノール酸イソメラーゼ酵素活性を有する前記タンパク
    質の生成物阻害を減少させる、請求項３２に記載の固定化細胞。
  35. 【請求項３５】前記細胞は細菌細胞、細菌細胞、真菌類細胞、微小藻類細胞
    、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳類細胞から成るグループから選択される、請
    求項２４に記載の固定化細胞。
  36. 【請求項３６】前記細胞は細菌細胞である、請求項２４に記載の固定化細胞
    。
  37. 【請求項３７】Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
    ｉａ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ細胞から成るグループから選択された細菌細胞で
    ある、請求項２４に記載の固定化細胞。
  38. 【請求項３８】前記細胞は酵母細胞である、請求項２４に記載の固定化細胞
    。
  39. 【請求項３９】前記細胞は溶解される、請求項２４に記載の固定化細胞。
  40. 【請求項４０】前記細胞は二機能または多機能の架橋剤で架橋により固定化
    される、請求項２４に記載の固定化細胞。
  41. 【請求項４１】前記架橋剤はグルタルアルデヒドである、請求項４０の固定
    化細胞。
  42. 【請求項４２】単離核酸分子であって、 ａ．ｉ．配列番号４２、配列番号４３および配列番号６１； ｉｉ．配列番号６１の少なくとも約１７０の隣接アミノ酸にわたって配列番
    号６１と少なくとも約３５％同一のアミノ酸配列；および ｉｉｉ．（ａ）の前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１５の隣接アミノ酸
    を含むアミノ酸配列； から成るグループより選択されたアミノ酸配列を含み、かつリノール酸イソメラ
    ーゼ酵素活性を有する単離タンパク質をコードする核酸配列と、 ｂ．（ａ）の前記核酸配列と完全に相補的な核酸配列と、 から成るグループより選択された核酸配列を含む単離核酸分子。
  43. 【請求項４３】（ｂ）の前記核酸配列が、低程度にストリンジェントなハイ
    ブリダイゼーション条件で配列番号６０の相補的配列とハイブリダイズする、請
    求項４２に記載の単離核酸分子。
  44. 【請求項４４】（ｂ）の前記核酸配列が、中程度にストリンジェントなハイ
    ブリダイゼーション条件で配列番号６０の相補的配列とハイブリダイズする、請
    求項４２に記載の単離核酸分子。
  45. 【請求項４５】（ｂ）の前記核酸配列が、高程度にストリンジェントなハイ
    ブリダイゼーション条件で配列番号６０の相補的配列とハイブリダイズする、請
    求項４２に記載の単離核酸分子。
  46. 【請求項４６】前記核酸分子は、配列番号５９および配列番号６０から成る
    グループより選択された核酸配列を含む、請求項４２に記載の単離核酸分子。
  47. 【請求項４７】前記核酸分子は配列番号６０の核酸配列を含む、請求項４２
    に記載の単離核酸分子。
  48. 【請求項４８】前記核酸分子は、配列番号４２、配列番号４３および配列番
    号６１から成るグループより選択されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を含
    む、請求項４２に記載の単離核酸分子。
  49. 【請求項４９】前記核酸分子は配列番号６１のアミノ酸配列をコードする核
    酸配列を含む、請求項４２に記載の単離核酸分子。
  50. 【請求項５０】転写調節配列と機能的に連結している請求項４２の（ａ）、
    （ｂ）または（ｃ）に記載の単離核酸分子を含む組換え核酸分子。
  51. 【請求項５１】請求項４２の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載の単離核酸
    分子を含む組換えウイルス。
  52. 【請求項５２】請求項４２の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載の単離核酸
    分子を含み、該核酸分子を発現している組換え細胞。
  53. 【請求項５３】前記細胞は細菌細胞、細菌細胞、真菌類細胞、微小藻類細胞
    、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳類細胞から成るグループから選択される、請
    求項５２に記載の組換え細胞。
  54. 【請求項５４】前記細胞は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎ
    ｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ
    Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ、Ｅｓ
    ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、および
    Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから成るグループより選択され
    た微生物である、請求項５２に記載の組換え細胞。
  55. 【請求項５５】前記細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌ
    ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
    ｓから成るグループより選択された微生物である、請求項５２に記載の組換え細
    胞。
  56. 【請求項５６】リノール酸イソメラーゼの生産方法であって、 請求項５２に記載の組換え細胞を、前記リノール酸イソメラーゼが生産される条
    件下で培養する工程から成る、方法。
  57. 【請求項５７】前記組換え細胞は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
    ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈ
    ｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ
    、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓお
    よびＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから成るグループより選択
    された微生物である、請求項５６に記載の方法。
  58. 【請求項５８】前記組換え細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂ
    ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆ
    ｏｒｍｉｓから成るグループより選択された微生物である、請求項５６に記載の
    方法。
  59. 【請求項５９】ＣＬＡ（共役リノール酸または共役リノレン酸）またはその
    誘導体を生産する方法であって、 リノール酸、リノレン酸、およびリノール酸またはリノレン酸の誘導体から成る
    グループより選択された脂肪酸を含有する油を、前記脂肪酸の少なくとも一部を
    ＣＬＡまたはその誘導体に変換するために、請求項１に記載の単離タンパク質と
    接触させる工程から成る方法。
  60. 【請求項６０】前記タンパク質は、中程度にストリンジェントなハイブリダ
    イゼーション条件で配列番号６０の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列を
    含む核酸分子によってコードされる、請求項５９に記載の方法。
  61. 【請求項６１】前記タンパク質は、配列番号６１の少なくとも３０の隣接ア
    ミノ酸を含む、請求項５９に記載の方法。
  62. 【請求項６２】前記タンパク質は、配列番号４２、配列番号４３および配列
    番号６１から成るグループより選択されたアミノ酸配列を有する、請求項５９に
    記載の方法。
  63. 【請求項６３】前記タンパク質はアミノ酸配列配列番号６１を有する、請求
    項５９に記載の方法。
  64. 【請求項６４】前記リノール酸イソメラーゼ酵素は固相支持体に結合される
    、請求項５９に記載の方法。
  65. 【請求項６５】前記固相支持体には、有機支持体、人工膜、生体高分子支持
    体、無機支持体から成るグループから選択される、請求項６４に記載の方法。
  66. 【請求項６６】ＣＬＡ（共役リノール酸または共役リノレン酸）またはその
    誘導体を生産する方法であって、 リノール酸、リノレン酸、およびその誘導体から成るグループより選択された脂
    肪酸を含有する油を、請求項２４に記載の固定化細胞と接触させる工程から成る
    方法。
  67. 【請求項６７】前記細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌ
    ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
    ｓから成るグループより選択された細菌細胞である、請求項６６に記載の方法。
  68. 【請求項６８】前記脂肪酸は、トリグリセリドの形をしており、前記方法が
    、前記トリグリセリドの少なくとも一部を遊離脂肪酸に変換するために前記油を
    加水分解酵素と接触させる工程をさらに含む、請求項５９または６６のいずれか
    一項に記載の方法。
  69. 【請求項６９】前記加水分解酵素はリパーゼ、ホスホリパーゼおよびエステ
    ラーゼから成るグループから選択される、請求項６８の方法。
  70. 【請求項７０】前記ＣＬＡまたはその誘導体を回収するステップをさらに含
    む、請求項５９または６６のいずれか一項に記載の方法。
  71. 【請求項７１】前記油はヒマワリ油、ベニバナ油、コーン油、亜麻仁油、パ
    ーム油、菜種油、イワシ油、ニシン油、からし油、落花生油、胡麻油、紫蘇油、
    綿実油、大豆油、脱水ひまし油およびクルミ油から成るグループから選択される
    、請求項５９または６６のいずれか一項に記載の方法。
  72. 【請求項７２】前記油から前記ＣＬＡを生産するステップは、前記油を前記
    ＣＬＡまたはその誘導体に少なくとも約５０％変換する、請求項５９または６６
    のいずれか一項に記載の方法。
  73. 【請求項７３】前記脂肪酸の少なくとも約３０％がＣＬＡまたはその誘導体
    に変換される、請求項５９または６６のいずれか一項に記載の方法。
  74. 【請求項７４】前記脂肪酸の少なくとも約５０％がＣＬＡまたはその誘導体
    に変換される、請求項５９または６６のいずれか一項に記載の方法。
  75. 【請求項７５】前記脂肪酸の少なくとも約７０％がＣＬＡまたはその誘導体
    に変換される、請求項５９または６６のいずれか一項に記載の方法。
  76. 【請求項７６】単離タンパク質であって、 ａ．配列番号６４；および ｂ．配列番号６４と少なくとも約３５％同一である配列番号６４の同族体； から成るグループより選択されたアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
  77. 【請求項７７】前記タンパク質が、中程度にストリンジェントなハイブリダ
    イゼーション条件で配列番号６３の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列を
    含む核酸分子によってコードされる、請求項７６の単離タンパク質。
  78. 【請求項７８】前記タンパク質が、高程度にストリンジェントなハイブリダ
    イゼーション条件で配列番号６３の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列を
    含む核酸分子によってコードされる、請求項７６の単離タンパク質。
  79. 【請求項７９】前記タンパク質は、配列番号６３の少なくとも２４の隣接ヌ
    クレオチドを含む核酸配列によってコードされる、請求項７６の単離タンパク質
    。
  80. 【請求項８０】前記タンパク質は、配列番号６３によって表わされる核酸配
    列を含む核酸分子によってコードされる、請求項７６の単離タンパク質。
  81. 【請求項８１】前記タンパク質は配列番号６４のアミノ酸配列を有する、請
    求項７６の単離タンパク質。
  82. 【請求項８２】前記タンパク質は、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ Ｐｒｏｆｉｌ
    ｅ ＰＳ５０１８７によって示されたエステラーゼ／リパーゼ／チオエステラー
    ゼ活性部位を有するアミノ酸配列を含む、請求項７６の単離タンパク質。
  83. 【請求項８３】前記タンパク質は、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ Ｐｒｏｆｉｌ
    ｅ Ｎｏ．ＧＣ０２６５によって示されたカルボキシエステラーゼタイプＢ活性
    部位を有するアミノ酸配列を含む、請求項７６の単離タンパク質。
  84. 【請求項８４】前記タンパク質はリパーゼ酵素活性を有している、請求項７
    ６の単離タンパク質。
  85. 【請求項８５】単離核酸分子であって、 ａ．配列番号６４；および ｂ．配列番号６４と少なくとも約３５％同一である配列番号６４の同族体； から成るグループより選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核
    酸配列を含む単離タンパク質。
  86. 【請求項８６】単離タンパク質であって、 ａ．配列番号６９； ｂ．配列番号６９の少なくとも約６０の隣接アミノ酸残基にわたって配列番号６
    ９に少なくとも約４０％同一である配列番号６９の同族体； から成るグループより選択されたアミノ酸配列を有する単離核酸分子。
  87. 【請求項８７】前記タンパク質が、中程度にストリンジェントなハイブリダ
    イゼーション条件で配列番号６８の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列を
    含む核酸分子によってコードされる、請求項８６の単離タンパク質。
  88. 【請求項８８】前記タンパク質が、高程度にストリンジェントなハイブリダ
    イゼーション条件で配列番号６８の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列を
    含む核酸分子によってコードされる、請求項８６の単離タンパク質。
  89. 【請求項８９】前記タンパク質は配列番号６８によって表わされる核酸配列
    を含む核酸分子によってコードされる、請求項８６の単離タンパク質。
  90. 【請求項９０】前記タンパク質は配列番号６９のアミノ酸配列を有する、請
    求項８６の単離タンパク質。
  91. 【請求項９１】タンパク質が、ＰｒｏＳｃａｎＰｒｏｆｉｌｅ Ｎｏ．ＰＦ
    ００５８３によって示されたアセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡＴ）ファミリ
    ープロファイルを表示するアミノ酸配列を含む、請求項８６の単離タンパク質。
  92. 【請求項９２】前記タンパク質はアセチルトランスフェラーゼ酵素活性を有
    している、請求項８６の単離タンパク質。
  93. 【請求項９３】単離核酸分子であって、 ａ．配列番号６９；および ｂ．配列番号６９の少なくとも約６０の隣接アミノ酸残基にわたって配列番号６
    ９と少なくとも約４０％同一である配列番号６９の同族体； から成るグループより選択されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする
    核酸配列を含む単離核酸分子。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI108730B (fi) * 1999-11-19 2002-03-15 Valio Oy Menetelmä konjugoidun linolihapon valmistamiseksi
EP1264893A1 (en) * 2001-06-08 2002-12-11 Teagasc Dairy Products Research Centre CLA biosynthesis by bifidobacteria
US7700833B2 (en) 2002-03-01 2010-04-20 Cornell University Process for the production of unsaturated fatty acids
DE10208812A1 (de) * 2002-03-01 2003-09-11 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren
WO2004005442A1 (de) * 2002-07-03 2004-01-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung von konjugierten mehrfach ungesättigten fettsäuren mit mindestens zwei doppelbindungen in pflanzen
WO2007074010A1 (en) 2005-12-24 2007-07-05 Teagasc Dairy Products Research Centre Process for the production of trans-10, cis 12 octadecadienoic acid
CN102093994A (zh) * 2010-12-07 2011-06-15 淮阴工学院 一种同时纯化和固定化亚油酸异构酶的方法
CN103087935A (zh) * 2013-01-16 2013-05-08 天津科技大学 共轭亚油酸的发酵方法及所用菌株
CN106834262B (zh) * 2017-02-21 2019-08-16 杭州师范大学 一种亚油酸异构酶突变体及其应用
CN109943515B (zh) * 2019-04-30 2021-07-27 江南大学 一种产羧酸酯酶的重组菌及其应用
CN110577897A (zh) * 2019-09-27 2019-12-17 中国药科大学 一种快速分离小鼠肠道罗伊氏乳杆菌的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5674901A (en) 1995-06-01 1997-10-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods of treating animals to maintain or increase CD-4 and CD-8 cell populations
US5856149A (en) 1995-06-01 1999-01-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of producing conjugated fatty acids
SE9704584L (sv) 1997-12-05 1999-07-19 Lennart Bjoerck Framställning av konjugerad linolsyra
US6015833A (en) 1998-03-17 2000-01-18 Conlinco., Inc. Conjugated linoleic acid compositions

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