JP2003501091A - ヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一つは海馬細胞中で発現され、一つは乳房細胞中で発現されるヒトｓｅｌ−１０の２つの代替スプライス変異体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む単離した核酸分子を提供する。本発明は、単離したｓｅｌ−１０ポリペプチドおよび、Ａβプロセシングが変化したそれらを発現する細胞系も提供する。すなわち、本発明によれば、ヒトｓｅｌ−１０の薬物インヒビターが提供されるので、これにより、ヒトプレセニリンの定常レベルを増加させ、プレセニリン経路の活性を高める、アルツハイマー病における治療介在の手段が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、一つは海馬細胞中で発現され、一つは乳房細胞中で発現されるヒト
ｓｅｌ−１０の２つの代替(alternative)スプライス変異体のいずれかをコード
するポリヌクレオチドを含む単離した核酸分子を提供する。

【０００２】 発明の背景 アルツハイマー病（ＡＤ）は、中年期ないし老年期の間に進行性記憶および認
識機能の低下を引き起こす中枢神経系の退行性障害である。該疾患は、細胞外ア
ミロイドプラークおよびニューロン内神経原線維のもつれを含む広汎な神経病理
学的特徴を伴なう［Sherrington, R., et al.; Nature 375:754-60 (1995)］。
ＡＤを引き起こす病因経路はよく理解されていないが、いくつかの遺伝子座が該
疾患の発症に関わっていることが知られている。

【０００３】 早期発症アルツハイマー病（ＡＤ）に関連する遺伝子は早期発症ＡＤに罹患し
た家族におけるマッピング研究の使用により同定されている。これらの研究は、
染色体１および１４上の遺伝子座がＡＤに関わっているようであることを示した
。染色体１４遺伝子座のポジショナルクローニングは、後にプレセニリン−１（
presenilin-1;ＰＳ−１）と名付けられた８−経膜ドメインタンパク質［Sherrin
gton, R., et al.; Nature 375:754-60 (1995)］をコードする新規突然変異体遺
伝子を同定した。ヒトＥＳＴデータベースのＢｌａｓｔ調査はＰＳ−１への相同
性を示す単一ＥＳＴを明らかにし、プレセリニン−２（ＰＳ−２）と称され、そ
れは染色体１上のＡＤに関連する遺伝子であると示された［Levy-Lahad, E. et
al., Science 269:973-977 (1995); Rogaev, E.I., et al., Nature 376:775-8
(1995); Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:12180-12184 (199
5)］。

【０００４】 アルツハイマー病に関連するＰＳ−１およびＰＳ−２の突然変異体は主にミス
センス突然変異体である。ＰＳ−１およびＰＳ−２の両方ともタンパク質プロセ
シングを受け、それらは家族性アルツハイマー病に見出された点突然変異により
変化し得る［Perez-Tur, J. et al., Neuroreport 7:27-301 (1995); Mercken,
M. et al., FEBS Lett. 389:297-3032 (1996)。ＰＳ−１遺伝子発現は組織にわ
たって広く分布するが、一方、高レベルのＰＳ−２ ｍＲＮＡは膵臓および骨格
筋に見出される［Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:12180-12
184 (1995); Jinhe Li, 私信］。しかしながら、高レベルのＰＳ−２タンパク質
は脳内では見つかっていない［Jinhe Li, 私信］。ＰＳ−１およびＰＳ−２タン
パク質の両方とも小胞体、ゴルジ体および核エンベロープに位置付けられている
［Jinhe Li, 私信; Kovacs, D.M. et al., Nat. Med. 2:224-229 (1996); Doan,
A. et al., Neuron 17:1023-1030 (1996)］。ＰＳ−１遺伝子またはＰＳ−２遺
伝子のいずれかにおける突然変異は該アミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）の
プロセシングを変化させ、Ａ−ベータ_１〜４２の比をＡ−ベータ_１〜４０に対し
て増大させるようにする［Scheuner, D. et al., Nat. Med. 2:864-870 (1996)
］。トランスジェニックマウスにおいて、ヒトＡＰＰと共発現した場合、Ａ−ベ
ータ_１〜４０と比較して、Ａ−ベータ_１〜４２の比に同様の増大［Borcshelt, D
.R. et al., Neuron 17:1005-1013 (1996); Citron, M. et al., Nat. Med. 3:6
7-72 (1997); Duff, K. et al., Nature 383:710-713 (1996)］が、アミロイド
プラーク中にＡ−ベータ沈着の加速［Borchelt et al., Neuron 19:939 (1997)
］と共に観察される。

【０００５】 ＡＤにおけるＰＳ−１およびＰＳ−２の役割に関してなされた上記観察にもか
かわらず、それらの生物学的機能は分からないままであり、それらは未知の生物
学的機能を有する大多数のヒトの病気遺伝子と共に置かれている。遺伝子または
その産物の機能が未知である場合、モデル生物体における遺伝子解析が、そのよ
うな遺伝子を既知の生化学的または遺伝子学的経路に位置付けるのに有用であり
得る。これは、解析下の遺伝子における突然変異の効果を抑制するか、または促
進するかのいずれかをする外来遺伝子突然変異につきスクリーニングすることに
より行う。例えば、疾患遺伝子における機能損失突然変異体の外来抑圧因子は、
該突然変異体遺伝子の下流にある影響された遺伝子的もしくは生化学的経路を刺
激し、一方、機能獲得突然変異体のサプレッサーは、おそらく、該回路を止める
であろう。

【０００６】 該プレセニリンの機能の解明に用い得る一つのモデル生物体はＣ．ｅｌｅｇａ
ｎｓであり、それは、ヒトプレセニリンをコードする遺伝子に対して高度の相同
性を有するｓｅｌ−１２と共に、ＰＳ−１およびＰＳ−２に相同性を有する３つ
の遺伝子を含有する。Ｓｅｌ−１２は活性化ノッチ受容体(activated notch rec
eptor)、ｌｉｎ−１２（ｄ）のサプレッサーについてのスクリーンにおいて発見
された［Levitan, D. et al. Nature 377:351-354 (1995)］。Ｌｉｎ−１２は発
生において機能して、細胞家系をパターン化する。ｌｉｎ−１２（ｄ）のごとき
ハイパーモーフ突然変異（hypermorphic mutations）は、ｌｉｎ−１２活性を増
大させ、「多重陰門(multi-vulval)」遺伝子型を生じ、一方、ｌｉｎ−１２活性
を低下させるヒポモーフ突然変異（hypomorphic mutations）は、該陰門の反転
ならびにいくつかの他の細胞家系においてホメオティック変化（homeotic chang
e）を生じる［Greenwald, I., et al., Nature 346:197-199 (1990); Sundaram,
M. et al., Gentics 135:755-763 (1993)］。Ｓｅｌ−１２突然変異はハイパー
モーフｌｉｎ−１２（ｄ）突然変異を抑制するが、それは、該ｌｉｎ−１２（ｄ
）突然変異が無傷ｌｉｎ−１２（ｄ）受容体によるシグナリングを活性化すると
きのみである［Levitan, D. et al., 377:351-354 (1995)］。該受容体の細胞質
ドメインを切り出すｌｉｎ−１２突然変異もシグナリングを活性化するが［Gree
nwald, I., et al., Nature 346:197-199 (1990)］、ｓｅｌ−１２の突然変異に
よっては抑制されない［Levitan, D. et al., Nature 377:351-354 (1995)］。
これは、ｓｅｌ−１２突然変異が、おそらく、血漿膜中に存在する機能的ｌｉｎ −１２受容体の量を減少させることによって、該ｌｉｎ−１２シグナリング経路
の上流に作用することが示唆される。ある種のｌｉｎ−１２ハイパーモーフ突然
変異を抑制することに加え、ｓｅｌ−１２に対する突然変異は産卵についての機
能損失、および、かくして卵の内部蓄積を生じるが、それ以外は該突然変異は解
剖学的に正常のようである［Levitan, D. et al., Nature 377:351-354 (1995)
］。Ｓｅｌ−１２突然変異はヒトＰＳ−１またはＰＳ−２のいずれかにより救済
され得、ｓｅｌ−１２、ＰＳ−１およびＰＳ−２は機能的ホモログであることが
示唆される［Levitan, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:14940-
14944 (1996)］。

【０００７】 もう一つの遺伝子、ｓｅｌ−１０がｌｉｎ−１２ヒポモーフ突然変異のサプレ
ッサーについての別の遺伝子スクリーンにおいて同定されている。ｓｅｌ−１０
における機能損失突然変異は、ｌｉｎ−１２ヒポモーフ突然変異体によるシグナ
リングを修復する。ｓｅｌ−１０活性の低下がｌｉｎ−１２活性を上昇させるの
で、ｓｅｌ−１０はｌｉｎ−１２シグナリングのネガティブ・レギュレータとし
て作用すると結論付け得る。Ｓｅｌ−１０はｓｅｌ−１２、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ
プレセニリンホモログのネガティブ・レギュレータとしても作用する［Levy-Lah
ad, E. et al., Science 269:973-977 (1995)］。Ｓｅｌ−１０活性の損失はｓ
ｅｌ−１２におけるヒポモーフ突然変異に関連する産卵障害を抑制する［Iva Gr
eenwald, 私信］。Ｓｅｌ−１０に対する機能損失突然変異のｌｉｎ−１２およ
びｓｅｌ−１２への影響は、ｓｅｌ−１０がｌｉｎ−１２／ノッチおよびプレセ
ニリン活性の両方のネガティブ・レギュレータとして作用することを示す。かく
して、Ｃ．ｅｌｅｇｅｎｓのヒトホモログは、アルツハイマー病の発生病理に関
わる方法で、遺伝子学的および/または生理学的にヒトプレセニリン遺伝子と相
互作用すると予想される。 前記の観点で、ＡＤに関係する遺伝子の同定について、およびＡＤをもたらす
生物学的経路を妨害することができる剤の同定についてのアッセイの開発につい
て絶え間ない必要性があることは明らかであろう。

【０００８】 情報の開示 Hubbard EJA, Wu G, Kitajewski J, and Greenwald I (1997) Sel-10, a negati
ve regulator of lin-12 activity in Caenorhabditis elegans, encodes a mem
ber of the CDC4 family of proteins. Genes & Dev 11: 3182-3193. Greenwald-I; Seydoux-G (1990) Analysis of gain-of-function mutations of
the lin-12 gene of Caenorhabditis elegans Nature 346: 197-9. Kim T-W, Pettingell WH, Hallmark OG, Moir RD, Wasco W, Tanzi R (1997) En
doproteolytic cleavage and proteasomal degradation of presenilin 2 in tr
ansfected cells. J Biol Chem 272:11006-11010. Levitan-D, Greenwald-I (1995) Facliltation of lin-12-mediated signalling
by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene Natur e 377: 351-4. Levitan-D; Doyle-TG; Brousseau-D, Lee-MK, Thinakaran-G; Slunt-HH; Sisodi
a-SS; Greenwald-I (1996) Assessment of normal and mutant human presenili
n function in Caenorhabditis elegans Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 1
4940-4. Sundaram-M; Greenwald-I (1993) Suppressors of a lin-12 hypomorph define
genes that interact with both lin-12 and glp-1 in Caenorhabditis elegans . Genetics. 135: 765-83. Sundaram-M; Greenwald-I (1993) Genetic and phenotypic studies of hypomor
phic lin-12 mutants in Caenorhabditis elegans. Genetics. 135: 755-63. F55B 12.3 GenPep Report (WMBL locus CEF55B12, accession z79757). WO 97/11956

【０００９】 発明の概要 本発明はヒトｓｅｌ−１０をコードするポリヌクレオチドを含む単離した核酸
分子を提供し、それは海馬細胞中および乳房細胞中で発現される。特記しない限
り、ｓｅｌ−１０に対する本明細書におけるいずれの言及もヒトｓｅｌ−１０に
対する言及であり、海馬および乳房ｓｅｌ−１０の両方を包含するものと理解さ
れるであろう。

【００１０】 好ましい具体例において、本発明は、以下の： （ａ） 配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および
配列番号：７よりなる群から選択される完全アミノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−
１０ポリペプチドまたはＡＴＣＣ寄託番号９８９７８に含有されるｃＤＮＡクロ
ーンによりコードされるものをコードするヌクレオチド配列； （ｂ） 配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０よりなる群から
選択される完全アミノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドまたはＡＴ
ＣＣ寄託番号９８９７９に含有されるｃＤＮＡクローンによりコードされるもの
をコードするヌクレオチド配列；および （ｃ） （ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配
列よりなる群から選択される配列に少なくとも９５％相同な配列を有するポリヌ
クレオチドを含む単離した核酸を提供する。 もう一つの局面において、本発明はストリンジェント条件下でｓｅｌ−１０を
コードするポリペプチドまたはそのフラグメントにハイブリダイズするポリヌク
レオチドを含む単離した核酸分子を提供する。

【００１１】 本発明は、本発明の単離した核酸分子を含むベクター、そのようなベクターが
導入されている宿主細胞、および前記宿主細胞を培養し、次いで、該ｓｅｌ−１
０ポリペプチドを単離することを特徴とするｓｅｌ−１０を獲得する方法も提供
する。 もう一つの局面において、本発明は、単離したｓｅｌ−１０ポリペプチドなら
びにそれらのフラグメントを提供する。好ましい具体例において、該ｓｅｌ−１
０ポリペプチドは配列番号：３、４、５、６、７、８、９および１０よりなる群
から選択されるアミノ酸配列を含む。単離した抗体、ポリクローナルおよびモノ
クローナルの両方は、ｓｅｌ−１０ポリペプチドに特異的に結合し、それらも提
供する。 もう一つの局面において、ＡＰＰ産生細胞系において生じるＡβ_１〜４０／Ａ
β_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を変化させることが可能な剤を同定する方法を提
供する。 もう一つの局面において、ＡＰＰ産生細胞系において生じるＡβ_１〜４０／Ａ
β_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を変化させることが可能な化合物を提供する。 もう一つの局面において、１以上のＡＰＰイソタイプを発現する哺乳類宿主の
組織または体液におけるＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を変化
させることが可能な剤を同定する方法であって、該宿主にＡβ_１〜４０／Ａβ_{１ 〜４０} ＋Ａβ_１〜４２の比を変化させるのに有効な量の試験剤を投与することを
特徴とする方法を提供する。

【００１２】 図面の簡単な説明 図１Ａおよび１Ｂ：図１Ａおよび１Ｂは、ＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧ、６−ｍｙｃ
−Ｎ−ｓｅｌ−１０、およびＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫ ｃＤＮＡでトランスフェ
クトしたＨＥＫ２９３細胞におけるタンパク質発現を示すウェスターンブロット
である。

【００１３】 図２Ａおよび２Ｂ：図２Ａおよび２Ｂは、ノーザンブロットである。図２Ａは
、６．５および４．５Ｋｂ転写物のユビキチン発現を示す通常の乳房ｓｅｌ−１ ０ ｍＲＮＡでプローブした複数の組織ノーザンブロットである。図２Ｂは、海
馬ｓｅｌ−１０ ｍＲＮＡの脳内のみでの制限発現を示す複数の組織ノーザンブ
ロットである。

【００１４】 図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ：図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃはウェスターンブロットで
ある。図３Ａは、ＳＥＬ−１０−ｍｙｃは、抗−ＰＳ１ループ抗体での免疫沈降
により示されるように、ＰＳ１と複合体を形成することを論証する。ＨＥＫ２９
３細胞はＳＥＬ−１０−ｍｙｃまたはＰＳ１を含有する構築物でトランスフェク
トするか、両方の構築物で共トランスフェクトするか、（それぞれ、ｐｃＤＮＡ
１またはｐＣＳ）を制御するだけの対応するベクターでトランスフェクトするか
、あるいは、ＤＮＡ無しで擬トランスフェクトした。培養は、ラクタスタチン（
１２μＭ）で処理して、指示されるようにプロテアソーム活性を阻害した。該免
疫沈降物は当該ゲルの左側に負荷し、細胞ライゼートは右に負荷した。免疫沈降
の対照は非特異的ＩｇＧおよび、細胞ライゼート無し（「無タンパク質」）のタ
ンパク質Ｇビーズを持つただの抗−ＰＳ１ループ抗体であった。免疫ブロットは
抗―ｍｙｃ抗体でプローブして、該免疫沈降物および細胞ライゼート中でＳＥＬ
−１０−ｍｙｃを検出した。ＳＥＬ−１０−ｍｙｃは、ＳＥＬ−１０−ｍｙｃで
トランスフェクトした、またはＳＥＬ−１０−ｍｙｃおよびＰＳ１で共トランス
フェクトした細胞由来のライゼート中で発現するが、該ＳＥＬ−１０−ｍｙｃお
よびＰＳ１構築物で共トランスフェクトした細胞中ではＰＳ１との複合体として
しか検出されなかった。図３Ｂは、プロテアソーム分解がラクタシスチンで阻害
されたときしか、ＳＥＬ−１０−ｍｙｃ／ＰＳ１複合体が検出されないことを論
証する。図３Ｃは、該ＳＥＬ−１０−ｍｙｃ／ＰＳ１複合体の抗−ｍｙｃ抗体で
の免疫沈降がＳＥＬ−１０−ｍｙｃが先ず完全長かつ高分子量形態のＰＳ１と会
合することを示すことを論証する。免疫沈降は抗−ＰＳ１ループまたは抗−ｍｙ
ｃ抗体のいずれかでプローブした。ＥＣＬ展開ウェスターンブロットの長めの露
出は、非常に低レベルのＰＳ１−ＮＴＦをＳＥＬ−１０−ｍｙｃとの免疫沈降物
中に示すが、ＰＳ１−ＣＴＦは検出できない。

【００１５】 図４Ａおよび４Ｂ：図４Ａおよび４Ｂは、ウェスターンブロットである。図４
Ａは、ＳＥＬ−１０−ｍｙｃがＰＳ１のユビキチン化を促進することを論証する
。ＰＳ１を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞系をＳＥＬ−１０−ｍｙｃでトラ
ンスフェクトした。抗−ＰＳ１ループ抗体での免疫沈降の後、抗−ユビキチン抗
体で検出した。図４Ｂは、ＳＥＬ−１０−ｍｙｃの増大した発現は、ＰＳ１−Ｎ
ＴＦおよびＰＳ１−ＣＴＦの減少と共に、完全長ＰＳ１の量における対応する増
加をもたらす。細胞ライゼートは抗−ＰＳ１ループ抗体で免疫沈降し、次いで、
ウェスターンブロット上で同一の抗体でプローブして、ＰＳ１およびそのプロセ
シング産物を検出した。

【００１６】 図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ：図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、グラフである。図５Ａ
は、ＡＰＰでのＳＥＬ−１０−ｍｙｃのトランジェント共発現がＡβ１〜４０お
よびＡβ１〜４２の産生を増加させることを論証する。当該効果は共発現された
ＰＳ１に付加的である。図５Ｂは、ＳＥＬ−１０−ｍｙｃまたはＰＳ１の安定発
現は内在Ａβ産生を増大させることを論証する。図５Ｃは、該安定細胞系におけ
るＡＰＰのトランジェント発現はｐｃＤＮＡ３．１ベクター対照でトランスフェ
クトした細胞系において見られるレベルを超えて外来Ａβ産生を増大させること
を論証する。

【００１７】 発明の詳細な記載 本発明はヒトｓｅｌ−１０をコードするポリヌクレオチドを含む単離した核酸
分子を提供する。ヒト海馬ｓｅｌ−１０（ｈｈｓｅｌ−１０）のヌクレオチド配
列は、その配列は配列番号：１に示されるが、それは５つのｈｈｓｅｌ−１０ポ
リペプチド（ｈｈｓｅｌ−１０−（１）、ｈｈｓｅｌ−１０−（２）、ｈｈｓｅ
ｌ−１０−（３）、ｈｈｓｅｌ−１０−（４）、およびｈｈｓｅｌ−１０−（５
）、本明細書においては、まとめてｈｈｓｅｌ−１０という）をコードする。ヒ
ト乳房ｓｅｌ−１０（ｈｍｓｅｌ−１０）は、その配列は配列番号：２に示され
るが、それは３つのｈｍｓｅｌ−１０ポリペプチド（ｈｍＳｅｌ−１０−（１）
、ｈｍＳｅｌ−１０−（２）、およびｈｍＳｅｌ−１０−（３）、本明細書にお
いて、まとめてｈｍＳｅｌ−１０という）をコードする。該ｈｈｓｅｌ−１０ポ
リヌクレオチドのヌクレオチド配列は配列番号：１に与えられ、ここに、配列番
号：１のヌクレオチド残基４５〜１９２８はｈｈｓｅｌ−１０（１）に対応し、
配列番号：１のヌクレオチド残基１５０〜１９２８はｈｈｓｅｌ−１０（２）に
対応し、配列番号：１のヌクレオチド残基２６７〜１９２８はｈｈｓｅｌ−１０
（３）に対応し、配列番号：１のヌクレオチド残基２９１〜１９２８はｈｈｓｅ
ｌ−１０（４）に対応し、および配列番号：１のヌクレオチド残基３０６〜１９
２８はｈｈｓｅｌ−１０（５）に対応する。該ｈｍｓｅｌ−１０ポリヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列は配列番号：２に与えられ、ここに、配列番号：２のヌク
レオチド残基１８０〜１９４９はｈｍｓｅｌ−１０（１）に対応し、配列番号：
２のヌクレオチド残基２７０〜１９４９はｈｍｓｅｌ−１０（２）に対応し、配
列番号：２のヌクレオチド残基３２７〜１９４９はｈｈｓｅｌ−１０（３）に対
応する。ｈｈＳｅｌ−１０およびｈｍ−Ｓｅｌ−１０核酸分子によりコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列は、以下に示される：配列番号：３、４、５、６
、および７は、それぞれ、ｈｈＳｅｌ−１０−（１）、ｈｈＳｅｌ−１０−（２
）、ｈｈＳｅｌ−１０−（３）、ｈｈＳｅｌ−１０−（４）、およびｈｈＳｅｌ
−１０−（５）ポリペプチドに対応し、配列番号：８、９、および１０は、それ
ぞれ、ｈｍＳｅｌ−１０−（１）、ｈｍＳｅｌ−１０−（２）、ｈｍＳｅｌ−１
０−（３）ポリペプチドに対応する。特記しない限り、ｓｅｌ−１０に対する本
明細書におけるいずれの言及もヒトｓｅｌ−１０に対する言及であり、全ての海
馬および乳房ｓｅｌ−１０核酸分子（ｓｅｌ−１０核酸、ポリヌクレオチド、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡまたは遺伝子への言及の場合）、またはポリペプチド（ｓｅｌ−１
０タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列の場合）を包含することが理解され
るであろう。海馬ｓｅｌ−１０および乳房ｓｅｌ−１０核酸分子およびポリペプ
チドのフラグメントも提供する。

【００１８】 配列番号：１のヌクレオチド配列は実施例１に記載されたように得られ、ｃＤ
ＮＡクローンＰＮＶ１０２−１中に含有され、それは１９９８年１１月９日に、
American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 2
0110に寄託され、寄託番号９８９７８が与えられた。配列番号：２のヌクレオチ
ド配列は実施例１に記載されたように得られ、ｃＤＮＡクローンＰＮＶ１０８−
２中に含有され、それは１９９８年１１月９日に、American Type Culture Coll
ection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110に寄託され、寄託番号９
８９７９が与えられた。

【００１９】 本発明のヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１０
、ならびに酵母ＣＤＣ４およびヒトＬＩＳ−１を含むβトランスデューシンタン
パク質ファミリーのメンバーとホモロジーを共有する。このファミリーはＦ−ボ
ックスおよびＷＤ−４０反復の存在により特徴付けられる［Li, J., et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:12180-12184 (1995)］。該反復は２０〜４０
個のアミノ酸長であり、ｇｌｙ−ｈｉｓ（ＧＨ）およびｔｒｐ−ａｓｐ（ＷＤ）
残基に結合される。β−トランスデューシンの三次元構造は、該ＷＤ４０反復は
７枚羽根プロペラ様構造のアームを形成することを示す［Sondek, J., et al.,
Nature 379:369-374 (1996)］。各羽根は、１つの内部ベータ鎖の制限を形成す
るタンパク質モチーフ中の保存されたアスパラギン酸残基の対を持つベータシー
トの４つの互い違いのプリーツにより形成される。ＷＤ４０反復は、様々な機能
的分類を代表する２７を超える異なるタンパク質中に見出される［Neer, E.J.,
et al., Nature 371:297-300 (1994)］。これらは、細胞分裂、細胞成長決定、
遺伝子転写、信号伝達、タンパク質分解、ｍＲＮＡ修飾およびベシクル融合を含
む細胞機能を調節する。機能におけるこの多様性は、β−トランスデューシンフ
ァミリーメンバーは複数のタンパク質複合体がその上で組み立て得る共通骨格を
与えるという仮説を導いた。

【００２０】 配列番号：１に示されるヌクレオチド配列はｈｈｓｅｌ−１０をコードするヌ
クレオチド配列に対応し、配列番号：２に示されるヌクレオチド配列はｈｍｓ１
０をコードするヌクレオチド配列に対応する。ｓｅｌ−１０をコードするＤＮＡ
の単離および配列決定は、以下の実施例１および２に記載される。 実施例１および２に記載されるように、自動化配列決定法を用いて、ｓｅｌ−
１０のヌクレオチド配列を得た。本発明のｓｅｌ−１０ヌクレオチド配列は両方
のＤＮＡ鎖につき得、１００％正確であると確信される。しかしながら、当該分
野において知られているように、そのような自動化方法により得られたヌクレオ
チド配列はある程度の誤差を含んでいるであろう。自動的に決定されたヌクレオ
チド配列は、所与の核酸分子の実際のヌクレオチド配列に対して、典型的に、少
なくとも約９０％、より典型的には、少なくとも９５％ないし約９９．９％同一
である。該実際の配列は、当該分野で知られている手動配列決定法を用いてより
正確に決定することができる。１以上のヌクレオチドの挿入または欠失を生じる
配列中の誤差は翻訳においてフレームシフトを生じ、予想アミノ酸配列は核酸分
子の実際の配列から予想されるものとは異なり、それは突然変異点から開始する
であろう。本発明のｓｅｌ−１０ＤＮＡはｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲに
より単離されたＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびそれらの組合せを含む。ゲノムｓ
ｅｌ−１０ＤＮＡは、当該分野でよく知られている方法を用いて、本明細書に記
載されたｓｅｌ−１０ｃＤＮＡでゲノムライブラリーをスクリーンすることによ
って得ることができる。ｓｅｌ−１０ｃＤＮＡから転写されたＲＮＡも本発明に
包含される。

【００２１】 遺伝子コードの縮重のため、２つのＤＮＡ配列は異なり、それでも同一のアミ
ノ酸配列をコードする。かくして、本発明は、本発明のｓｅｌ−１０ポリペプチ
ドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを有する単離した核酸分子を提供し
、ここに、該ポリペプチド配列は配列番号：３〜１０の完全アミノ酸配列または
それらのフラグメントを有するｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードする。

【００２２】 本明細書において、組換えおよび非組換え両方の精製ｓｅｌ−１０ポリペプチ
ドも提供する。ｓｅｌ−１０の生物学的活性のいずれも保持する天然ｓｅｌ−１
０タンパク質の変異体および誘導体も本発明の範疇にある。上記したごとく、本
発明のｓｅｌ−１０ポリペプチドは酵母ＣＤＣ４と相同性を共有する。ＣＤＣ４
は特異的細胞タンパク質のユビキチン化を触媒することが知られているので［Fe
ldman et al., Cell 91:221 (1997)］、ｓｅｌ−１０もこの活性を有するであろ
うと推測される。そのような活性を論証するためのアッセイ法はよく知られ、精
製したヒトｓｅｌ−１０タンパク質を酵母タンパク質、Ｃｄｃ４ｐ、Ｃｄｃ５３
ｐおよびＳｋｐ１ｐ、またはそれらのヒトオルトログ、およびＥ１酵素、Ｅ２酵
素Ｃｄｃ３４ｐまたはそのヒトオルトログ、ユビキチン、標的タンパク質と共に
精製ヒトｓｅｌ−１０タンパク質を用いるユビキチン化系およびＡＴＰ再生系の
再構成に関わる［Feldman et al., 1997］。Ｆ−ボックスと呼ばれるタンパク質
ドメインを会して、Ｓｋｐ１ｐはＣｄｃ４ｐと会合する［Bai et al.,Cell 86:2
63］。Ｆ−ボックスタンパク質モチーフは、酵母ＣＤＣ４、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ
ｓｅｌ−１０、マウスｓｅｌ−１０、ヒトｓｅｌ−１０に見出される。該ｓｅ
ｌ−１０ユビキチン化系は、該酵母成分の該Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ相当物、例えば
、Ｃｄｃ５３ｐに置き換わるｃｕｌ−１（ｌｉｎ−１９としても知られる）タン
パク質［Kipreos et al., Cell 85:829 (1996)］およびＳｋｐ１ｐに置き換わる
タンパク質Ｆ４６Ａ９、またはそれらの哺乳類相当物、例えば、Ｃｄｃ５３ｐに
置き換わるＣｕｌ−２タンパク質［Kipreos et al., 1996］および酵母Ｓｋｐ１
ｐに置き換わる哺乳類Ｓｋｐ１ｐで再構成することができる。タンパク質キナー
ゼにより供されるリン酸化系も［Feldman et al., 1997］に準じるアッセイシス
テムに含まれる。

【００２３】 Ｓｅｌ−１０変異体は、例えば、天然ｓｅｌ−１０コードヌクレオチド配列の
突然変異により得ることができる。本明細書でいうとき、ｓｅｌ−１０変異体は
天然ｓｅｌ−１０に実質的に相同であるが、アミノ酸配列中に１以上の欠失、挿
入、または置換のために天然ｓｅｌ−１０のものとは異なるアミノ酸配列を有す
る。変異体のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列は、天然ｓｅｌ−１０配列に対
して、好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％
同一、最も好ましくは少なくとも約９５％同一である。かくして、例えば、１０
０個のヌクレオチドごとに５点の突然変異を含有する変異ヌクレオチド配列は、
天然ｓｅｌ−１０遺伝子と比較して、該天然タンパク質にたいして９５％同一で
ある。天然および変異体のｓｅｌ−１０配列の間の配列相同性は、相同性とも称
され、例えば、Smith and Waterman［Adv. Appl. Math. 2:482-489 (1981)］の
アルゴリズムを用いるＧａｐプログラム［Wisconsn Sequence Analysis Package
, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park,
Madison Wisconsin] のごとき、この目的のため普通に用いられているコンピュ
ータプログラムのいずれかを用いて、該２つの配列を比較することによって決定
することもできる。

【００２４】 天然アミノ酸配列の変化は多数の知られた技術のいずれかによって達成するこ
とができる。例えば、突然変異は、［Walder et al. Gene 42:133 (1986)；Baue
r et al. Gene 37:73 (1985); Craik BioTechniques, January 1985, pp. 12-19
; Smith et al. Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press
(1981);および米国特許第４,５１８,５８４および４,７３７,４６２号］に記載
されているオリゴヌクレオチド指向突然変異誘発のごとき、当業者によく知られ
ている手順により特定の位置に導入することができる。

【００２５】 本発明の範疇にあるＳｅｌ−１０変異体は保存的に置換された配列を含むこと
ができ、それはｓｅｌ−１０ポリペプチドの１以上のアミノ酸残基は該ｓｅｌ―
１０ポリペプチドの二次および/または三次構造を変化させない様々な残基によ
り置き換えることを意味する。そのような置換は、１の脂肪族残基（Ｉｌｅ、Ｖ
ａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ）を別のものに置換すること、または塩基性残基Ｌｙ
ｓおよびＡｒｇ、酸性残基ＧｌｕおよびＡｓｐ、アミド残基ＧｌｎおよびＡｓｎ
、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｙｒ、または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ
間での置換のごとき、同様の物理化学的特性を有する残基によるアミノ酸の置換
を含む。遺伝子学的にサイレントなアミノ酸交換を行うことに関するさらなる情
報は、［Bowie et al., Science 247:1306-1310 (1990)］に見出すことができる
。ｓｅｌ−１０の生物学的活性を実質的に保持するであろう他のｓｅｌ−１０は
、アミノ酸置換が当該タンパク質の機能性領域外の部分になされているものであ
る。

【００２６】 もう一つの局面において、本発明は、上記した核酸分子の部分、例えば、前記
核酸分子の１の少なくとも約１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約２０ヌ
クレオチド、より好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド、およびさらに最も
好ましくは約３０ないし約１００ヌクレオチドに、ストリンジェント条件下でハ
イブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離した核酸分子を提供する。記載さ
れた長さを有する核酸分子の部分とは、例えば、引用された核酸分子の少なくと
も約１５ヌクレオチドをいう。ストリンジェント条件により、６×ＳＳＣ／０１
％ＳＤＳ約４２／Ｃにて約２．５時間の一晩インキュベーションに引続き、６５
／Ｃにて１．０×ＳＳＣ０．１％ＳＤＳ中でフィルターを洗浄することが意図さ
れる。本明細書に記載のｓｅｌ−１０コード核酸分子のフラグメントは、そのよ
うな核酸分子にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドと同様に、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プローブまたはプライマーとして用い
ることができる。そのようなプローブを用いて、例えば、イン・ビトロアッセイ
においてならびにサザーンおよびノーザンブロットにおいて、ｓｅｌ−１０核酸
の存在を検出することができる。細胞型発現ｓｅｌ−１０もそのようなプローブ
の使用により同定することができる。そのような手順はよく知られ、当業者は特
定のアプリケーションにとって適した長さのプローブを選ぶことが可能である。
ＰＣＲのため、所望のｓｅｌ−１０核酸分子の末端に対応する５’および３’プ
ライマーを用いて単離し、従来の方法を用いてその配列を増幅する。 該ｓｅｌ−１０核酸分子の他の有用なフラグメントは，（センス鎖を用いて）
標的ｓｅｌ−１０ｍＲＮＡ、または（アンチセンス鎖を用いて）ｓｅｌ−１０Ｄ
ＮＡに結合することが可能な一本鎖核酸配列を含むアンチセンスまたはセンスオ
リゴヌクレオチドである。

【００２７】 もう一つの局面において、本発明は、天然パターングリコシル化に関連するま
たは関連しないｓｅｌ−１０ポリペプチドを含む。酵母または哺乳類発現系にお
いて発現されたＳｅｌ−１０（以下で論じる）は、分子量およびグリコシル化パ
ターンにおいて天然ｓｅｌ−１０ポリペプチドに類似またはそれとは著しく異な
るであろう。細菌発現系におけるｓｅｌ−１０の発現は非グリコシル化ｓｅｌ−
１０を与える。 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離した形態で提供され、好ましくは
、実質的に純粋である。Ｓｅｌ−１０ポリペプチドは硫酸アンモニウムもしくは
エタノール沈殿、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセ
ルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレク
チンクロマトグラフィーを含むよく知られた方法により組換え細胞培養から回収
し、精製することができる。好ましい具体例において、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）を精製に用いる。 本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子を含むベクター、ならびにそのよう
なベクターでトランスフェクトされた宿主にも関する。本発明のポリヌクレオチ
ド分子のいずれかは、宿主中での増殖のために、一般に選択性マーカーおよび複
製の起源を含むベクターに連結することができる。本発明は、上記ポリヌクレオ
チド分子から発現されたｓｅｌ−１０ポリヌクレオチドも提供するので、ｓｅｌ
−１０の発現用のベクターが好ましい。該ベクターは上記または下記のｓｅｌ−
１０ポリヌクレオチドのいずれかをコードし、哺乳類、微生物、細菌、または昆
虫遺伝子から誘導されるもののごとき、適当な転写もしくは翻訳調節配列に作動
可能に連結されたＤＮＡを含む。調節配列の例は、転写のプロモータ、オペレー
タ、もしくはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および転写および翻
訳を制御する適当な配列を含む。ヌクレオチド配列は、該調節配列がｓｅｌ−１
０をコードするＤＮＡに機能的に関連する場合に作動可能に連結される。かくし
て、プロモータヌクレオチド配列は、ｓｅｌ−１０、該プロモータヌクレオチド
配列が該ｓｅｌ−１０配列の転写を管理するならば、ｓｅｌ−１０ＤＮＡ配列に
作動可能に連結される。

【００２８】 ｓｅｌ−１０をコードするポリヌクレオチド分子のクローニングまたはｓｅｌ
−１０ポリヌクレオチドの発現に使用されるべき適当なベクターの選択は、もち
ろん、その中に該ベクターが形質転換される宿主細胞、および、適用可能な場合
、そこから該ｓｅｌ−１０ポリペプチドが発現されるべき宿主細胞に依存する。
ｓｅｌ−１０ポリヌクレオチドの発現に適当な宿主細胞は、原核生物、酵母、お
よびより高度な真核細胞を含み、それらの各々は以下に論ずる。 そのような宿主細胞中で発現されるべきｓｅｌ−１０ポリペプチドは非相同タ
ンパク質からの領域を含む融合たんぱく質であってもよい。そのような領域が含
まれて、例えば、該ポリペプチドの分泌、向上した安定性、または容易化された
精製を許容することができる。例えば、適切なシグナルペプチドをコードする配
列を発現ベクター中に取り込ませ得る。シグナルペプチド（分泌リーダー）につ
いてのＤＮＡ配列をｓｅｌ−１０配列にインフレームで融合させて、ｓｅｌ−１
０を該シグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳するようにすることが
できる。当該意図される宿主中で機能的なシグナルペプチドは該ｓｅｌ−１０ポ
リペプチドの細胞外分泌を促進する。好ましくは、該シグナルペプチドは、該細
胞からのｓｅｌ−１０の分泌により該ｓｅｌ−１０ポリペプチドから切断される
。本発明を実施するのに使用し得るシグナルペプチドの非制限的な例は、酵母Ｉ
因子およびｓｆ９昆虫細胞中のミツバチメラチンリーダーを含む。

【００２９】 好ましい具体例において、該ｓｅｌ−１０ポリペプチドは該ポリペプチドの精
製を容易にするのに用いられる非相同領域を含む融合タンパク質であろう。その
ような機能に用いるための多くの入手可能なペプチドは結合パートナーへの融合
タンパク質の選択的結合を許容する。例えば、該ｓｅｌ−１０ポリペプチドを修
飾して、結合パートナーまたはペプチドタグに特異的に結合する融合タンパク質
を形成するためのペプチドを含むことができる。そのようなペプチドタグの非制
限的な例は、６−Ｈｉｓタグ、チオレドキシンタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチ
ニンタグ、ＧＳＴタグ、およびＯｍｐＡシグナル配列タグを含む。当業者に理解
されているように、該ペプチドを認識し、結合する結合パートナーは、金属イオ
ンを含むいずれの分子または化合物（例えば、金属アフィニティーカラム）、抗
体またはそれらのフラグメント、および該ペプチドに結合するいずれのタンパク
質またはペプチドであってよい。各タイプのタグと特異的に反応するフルオレッ
セインもしくはローダミン標識抗体により、これらのタグを認識することができ
る。

【００３０】 ｓｅｌ−１０ポリペプチドの発現に適当な宿主細胞は、原核生物、酵母、およ
びより高度な真核細胞を含む。ｓｅｌ−１０の発現に用いられるべき適当な原核
は、Ｅｓｃｅｒｉｃｈｉａ、ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属の
細菌、ならびに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメンバーを含む。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中での
発現について、ｓｅｌ−１０ポリペプチドはＮ−末端メチオニン残基を含んで、
原核細胞中で組換えポリペプチドの発現を容易にすることができる。次いで、該
Ｎ−末端Ｍｅｔを所望により該発現ｓｅｌ−１０ポリペプチドから切断すること
ができる。

【００３１】 原核宿主に用いるための発現ベクターは、通常、１以上の遺伝子型選択可能マ
ーカー遺伝子を含む。通常、そのような遺伝子は、例えば、抗菌耐性を与えるか
、あるいは栄養要求性を付与するタンパク質をコードする。広汎なそのようなベ
クターは、簡単に、市販源から入手可能である。例として、ｐＳＰＯＲＴベクタ
ー、ｐＧＥＭベクター（Promega）、ｐＰＲＯＥＸベクター（LTI, Bethesda, MD
）、Ｂｌｕｓｃｒｉｐｔベクター（Stratagene）、およびｐＱＥベクター（Qiag
en）が含まれる。

【００３２】 Ｓｅｌ−１０は、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＫｌｕｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓを含む属由来の酵母宿主細胞中で発現させることもできる。好ま
しい酵母宿主はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓである。
酵母ベクターは、しばしば、２Ｔ酵母プラスミドからの複製配列の起源、自己複
製配列（ＡＲＳ）、プロモータ領域、ポリアデニル化のための配列、転写停止用
の配列、および選択可能なマーカー遺伝子を含有する。

【００３３】 酵母とＥ．ｃｏｌｉとの両方において複製可能なベクター（シャトルベクター
と称される）を用いることもできる。酵母ベクターの上記した特徴に加えて、シ
ャトルベクターはＥ．ｃｏｌｉ中での複製および選択のための配列も含む。酵母
宿主中で発現したｓｅｌ−１０ポリペプチドの直接分泌は、該酵母Ｉ−因子リー
ダー配列をコードするヌクレオチド配列を該ｓｅｌ−１０コードヌクレオチド配
列の５’端に含ませることによって達成することができる。

【００３４】 昆虫宿主細胞培養系もＳｅｌ−１０ポリペプチドの発現に用いることができる
。好ましい具体例において、本発明のｓｅｌ−１０ポリペプチドはバキュロウイ
ルス発現系を用いて発現される。昆虫細胞中での非相同タンパク質の発現のため
のバキュロウイルス系の使用に関するさらなる情報は［Luckow and Summers, Bi
o/Technology 6:47 (1988)］により論評される。 もう一つの好ましい具体例において、該ｓｅｌ−１０ポリペプチドは哺乳類宿
主細胞中で発現される。適当な哺乳類細胞系の非限定的な例は、サル腎臓細胞［
Gluzman et al., Cell 23:175 (1981)］およびチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞のＣＯＳ−７系を含む。

【００３５】 本発明のｓｅｌ−１０ポリペプチドの発現のための適当な発現ベクターの選択
は、もちろん、用いられるべき特別の哺乳類宿主細胞に依存し、それは当業者の
技術の範囲内である。適当な発現ベクターの例は、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen)
およびｐＳＶＬ（Pharmacia Biotech）を含む。哺乳類宿主細胞中で用いる発現
ベクターは、細菌ゲノムから誘導された転写および翻訳制御配列を含むことがで
きる。本発明に用いることができる普通に用いられるプロモータ配列およびエン
ハンサー配列は、限定されないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデ
ノウイルス２、ポリオーマウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）か
ら誘導されたものを含む。哺乳類発現ベクターの構築方法は、例えば、［Okayam
a and Berg Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)］;［Cosman et al., Mol. Immunol
. 23: 935 (1986)］;［Cosman et al., Nature 312:768 (1984)］；ＥＰ−Ａ−
０３６７５６６およびＷＯ９１／１８９５２に開示される。

【００３６】 本発明のポリペプチドを用いて、ｓｅｌ−１０ポリペプチド発現を検出する診
断アッセイに有用なポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生起させること
もできる。そのような抗体は従来の技術により調製することができる。例えば、
［Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring H
arbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988); Monoclonal Ant
ibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et a
l. (eds.), Plenum Press, New York (1980)］を参照せよ。

【００３７】 本発明のｓｅｌ−１０核酸分子は染色体同定にも価値がある。それらはヒト染
色体上の特異的な位置にハイブリダイズし得るからである。現在、該染色体上の
特定部位を同定する必要性がある。実際の配列データ（反復多型性）に基づく染
色体マーキング試薬は、現在、僅かしか、染色体位置をマークするために入手可
能ではないからである。一旦、配列を正確な染色体位置にマップすれば、該染色
体上の配列の物理的位置は遺伝子マップデータに相関付け得る。次いで、遺伝子
と同一の染色体領域にマップされている疾患との間の関係を連鎖解析により同定
し得、ここに、物理的に隣接する遺伝子の共遺伝が決定される。次いで、特定の
疾患に関係していると思われる遺伝子は、罹患したおよび罹患していない個人の
間で核酸配列を比較することによって決定する。

【００３８】 本発明のｓｅｌ−１０ポリペプチドおよびそれらをコードするＤＮＡを用いて
、ＡＤの生物学的機序をさらに調査することもでき、最終的に、そのような機序
を変化させるのに用い得る化合物の同定をもたらすことができる。本発明のｓｅ
ｌ−１０ポリペプチドはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１０に４７．６％同一で
あり、５６．８％類似である。上記したように、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−
１０への突然変異は、産卵の機能損失を生じるｓｅｌ−１２に対する突然変異を
抑制すること、およびｌｉｎ−１２に対するある種のヒポモーフ突然変異を抑制
することも知られている。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１２に対する突然変異
もヒトＡＤ−連結遺伝子ＰＳ−１（ｓｅｌ−１２に４２．７％同一）またはＰＳ
−２（ｓｅｌ−１２に４３．３％同一）のいずれかにより救済される。しかしな
がら、家族性ＡＤ−連結突然変異を持つヒトＰＳ−１はｓｅｌ−１２突然変異を
救済する能力は低下している［Levitan, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 93: 14940-14944 (1996)］。

【００３９】 ノッチシグナリング経路におけるヒトおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓのこの論証さ
れた交換可能性は、特に、ｓｅｌ−１０Ｌの予想構造の観点から、ヒトｓｅｌ−
１０の突然変異が、ＡＤをもたらすＰＳ−１またはＰＳ−２に対する突然変異を
抑制すると予想することを妥当なものにする。上記したようにＡＤをもたらすＰ
Ｓ−１およびＰＳ−２突然変異はＰＳ−１またはＰＳ−２のタンパク質加水分解
プロセシングを妨げるものである。本発明のｓｅｌ−１０ポリペプチドは、ユビ
キチン依存性タンパク質分解経路において機能する酵素の成分である酵母ＣＤＣ
４を含むβ−トランスデューシンタンパク質ファミリーのメンバーである。かく
して、ヒトｓｅｌ−１０は、ユビキチンプロテアソーム経路によりプレセニリン
分解を調節するであろう。あるいは、もしくは加えて、ヒトｓｅｌ−１０は、ユ
ビキチン化による分解のため、プレセニリン活性のモジュレータ、例えば、ネガ
ティブレギュレータを標的する。したがって、ｓｅｌ−１０に対する突然変異は
、ＰＳ−１もしくはＰＳ−２に対する突然変異の結果として生じるＰＳ−１もし
くはＰＳ−２の誤ったタンパク質加水分解プロセシングを戻すか、または、そう
でなければ、プレセニリン機能を増大させる。同じ理由で、ｓｅｌ−１０活性の
阻害もＰＳ−１またはＰＳ−２突然変異を戻すように働く。かくして、本発明の
ヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドの発現または活性のいずれかを阻害する化合物が
ＰＳ−１またはＰＳ−２に対する突然変異の効果を戻し、かくしてＡＤの予防ま
たは治療に有用であると仮説することができる。

【００４０】 かくして、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、本発明のヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドの
活性または発現を阻害することが可能な剤の同定のための遺伝子系として用いる
ことができる。そのようなアッセイに用いるための適当なＣ．ｅｌｅｇａｎｓ株
は、活性なＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１０をコードする遺伝子を欠如し、負
活性化ｓｅｌ−１２遺伝子に起因する産卵の機能損失を示す。ｓｅｌ−１２に対
する突然変異による産卵の機能損失の有するＣ.ｅｌｅｇａｎｓの構築は、規定
の方法を用いて、達成することができる。ｓｅｌ−１２の配列（Ｇｅｎｅｂａｎ
ｋ寄託番号Ｕ３５６０）および産卵の機能損失を生じるｓｅｌ−１２に対する突
然変異の両方が知られているからである（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１２（
ａｒ１７１）の構築を記載する［Levitan et al., Nature 377: 351-354 (1995)
］を参照せよ）。いかにしてそのような株を生成するかの例も［Levitan et al.
, Nature 377: 351-354 (1995)］に示される。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１
２（ａｒ１７１）中の野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１０は、［Levitan e
t al., 前掲］のｓｅｌ−１２突然変異誘発を用いる技術のごとき、規定の方法
を用いても突然変異誘発される。

【００４１】 ヒトｓｅｌ−１０活性を阻害する化合物を同定するために、本発明の野生型ヒ
トｓｅｌ−１０タンパク質のいずれかをコードするヒトｓｅｌ−１０遺伝子を含
有するＤＮＡベクターを上記したＣ．ｅｌｅｇａｎｓに導入する。好ましい具体
例において、非相同ヒトｓｅｌ−１０遺伝子は該Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓゲノムに組
み込む。次いで、該遺伝子を、［Levin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93: 14940-14944 (1996)］に記載された技術を用いて発現させる。次いで、試
験化合物をこの株に投与して、与えた剤が産卵欠陥を生じるｓｅｌ−１２または ｌｉｎ −１２に対する突然変異を抑制するようにｓｅｌ−１０活性を阻害するこ
とが可能であるかどうかを決定する。次いで、例えば、［Levitan et al., Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14940-14944 (1996)］に記載されたアッセイによ
って、この株における産卵を決定する。産卵に対する該化合物の効果がｓｅｌ−
１０活性の阻害によるものであることを確認するため、化合物の作用をｓｅｌ−
１０における機能損失突然変異により影響されることが知られている第二の生化
学的または遺伝子学的経路において試験し得る（例えば、ｌｉｎ−１２（ｄ）ヒ
ポモーフ株のさらなる上昇）。そのようなアッセイは［Sundarem and Greenwald
(Genetics 135: 765-783 (1993)］に記載されているように行うことができる。

【００４２】 あるいは、化合物は、Ｅ３ユビキチンライゲーティング酵素を阻害するそれら
の活性につき試験する。そのような活性を論証するアッセイ法はよく知られ、精
製したヒトｓｅｌ−１０タンパク質を、酵母タンパク質Ｃｄｃ４ｐ、Ｃｄｃ５３
ｐおよびＳｋｐ１ｐおよびＥ１酵素、Ｅ２酵素Ｃｄｃ３４ｐ、ユビキチン、標的
タンパク質と共に精製ｓｅｌ−１０タンパク質を用いるユビキチン化系およびＡ
ＴＰ再生系の再構成に関わる［Feldman et al., 1997］。該ｓｅｌ−１０ユビキ
チン化系は、酵母成分のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ相当物、例えば、Ｃｄｃ５３ｐに置
き換わるｃｕｌ−１（ｌｉｎ−１９としても知られる）タンパク質［Kipreos et
al., Cell 85:829 (1996)］およびＳｋｐ１ｐに置き換わるタンパク質Ｆ４６Ａ
９と、またはそれらの哺乳類相当物、例えば、Ｃｄｃ５３ｐに置き換わるＣｕｌ
−２タンパク質［Kipreos et al.,同書］および酵母Ｓｋｐ１ｐに置き換わる哺
乳類Ｓｋｐ１ｐと再構築することもできる。タンパク質キナーゼにより供される
リン酸化系も［Feldman et al., 1997］によれば該アッセイに含まれるべきであ
る。

【００４３】 あるいは、ヒトｓｅｌ−１０ ｃＤＮＡでの形質転換によりヒトｓｅｌ−１０
を発現し、結果として、上昇したＡＰＰプロセシングおよびＡβ_１〜４０または
Ａβ_１〜４２の形成を有する細胞系は、実施例３におけるようにそのようなアッ
セイに用いることもできる。化合物は、該ｓｅｌ−１０形質転換細胞系に見られ
るｓ上昇したＡβプロセシングを低減させるそれらの能力につき試験することが
でききる。 次いで、産卵欠陥を救済するかまたはＥ３ユビキチンライゲーティング酵素を
阻害する化合物は、ヒト細胞系におけるＡ−ベータ_１〜４０またはＡ−ベータ_{１ 〜４２} の産生において低減を引き起こすそれらの能力につきスクリーンする。試
験化合物は、ＩＭＲ−３２または、Ａ−ベータ_１〜４０またはＡ−ベータ_{１〜４ ２} を産生することが知られている他のヒト細胞系［Asami-Okada et al., Bioche
mistry 34: 10272-10278 (1995)］を暴露するために、または高レベルにてヒト
ＡＰＰを発現するように加工されたヒト細胞系において用いる。これらのアッセ
イにおいて、Ａ−ベータ_１〜４０またはＡ−ベータ_１〜４２は、細胞抽出物中で
、あるいは、当該培地への放出後に、ＥＬＩＳＡまたは当該分野で知られている
他のアッセイ［Borchelt et al., Neuron 17:1005-1013 (1996); Citron et al.
, Nat. Med. 3:67-72 (1997)］により測定する。 一旦、当業者がＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を変更するた
めの化合物をスクリーンする方法を手にすれば、そのような化合物を当業者のも
のにすることは、規定実験の問題であるということは理解されるべきである。 一旦、そのような当業者がＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を
変更する実用性を有する化合物を手にすれば、動物またはヒトの組織および体液
におけるＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２を変更するための動物また
はヒトにおける治療の物理療法の開発は規定実験の問題であることも理解される
べきである。 本発明が全般的に記載されれば、限定する意図なく、例示するように与えられ
る以下の実施例の言及によって、同じことがより容易に理解されるであろう。

【００４４】 実施例 実施例１：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１０に対するヒトホモログの同定 結果 ＡＣＥＤＢにおけるｓｅｌ−１０の同定：Ｓｅｌ−１０は、クローン化多型性
ａｒＰ３とｈｉｍ−５［ＡＣＥＤＢ エントリー ｗｍ９５ｐ５３６］のすぐ隣の
ＴＣＰＡＲＩとの間に位置する。３つのファージラムダクローンが間隔、Ｆ５３
Ｃ１１、Ｆ０９Ｆ３およびＦ５５Ｂ１２を横切って配列決定された。Ｓｅｌ−１ ０ は、酵母ｃｄｃ４［ＡＣＥＤＢ エントリー ｗｍ９７ａｂ２５９］に対して相
同性を有すると報告されている。Ｂｌａｓｔ調査が、ａｒＰ３とＧｅｎＰｅｐエ
ントリーＦ５５Ｂ１２．３に対応するＴＣＰＡＲＩとによって規定される間隔内
に酵母ｃｄｃ４（ＣＣ４＿ＹＳＴ）に対する相同性を持つ単一ＯＲＦを明らかに
した。Ｆ５５Ｂ１２．３は、酵母ｃｄｃ４と同様に、ベータ−トランスデューシ
ンタンパク質ファミリーのメンバーである。このファミリーは、複数のＷＤ４０
反復の存在により特徴付けられる［Neer, E.J. et al., Nature 371:297-300 (1
994)］。

【００４５】 ヒトｓｅｌ−１０ホモログ、Ｉｎｃｙｔｅ０２８９７１：ＧｅｎＰｅｐエント
リーＦ５５Ｂ１２．３を用いて、ｔｂｌａｓｔｎを用いるＬｉｆｅＳｅｑ、Ｌｉ
ｆｅＳｅｑＦＬおよびＥＭＢＬデータベースを調査した。該調査は、ＬＩＳ−１
（Ｓ３６１１３およびＰ４３０５５）、ミラー−ディーカー脳回欠損に関係する
遺伝子、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ遺伝子ＴＲＣＰＸＥＮ（Ｕ６３９２１）
、およびＬｉｆｅＳｅｑ ＦＬ、０２８９７１中のヒトコンティグを含むβ−ト
ランスデューシンファミリーメンバーに多重相同性であることを明らかにした。
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓゲノム内に複数のβ−トランスデューシンファミリーメンバ
ーもあるので、それらは複数のｂｌａｓｔ調査を用いて収集され、次いで、該ｓ ｅｌ−１０ 候補遺伝子とクラスター化された。複数整列は、クラスタル法（the
Clustal method）を用いるDNAStarプログラムMegalignで行った。これは、ＬＩ
Ｓ−１がＴ０３Ｆ６.Ｆ、異なるβ−トランスデューシンファミリーメンバーと
クラスター化することを明らかにし、かくして、それを候補ｓｅｌ−１０ホモロ
グとして除外した。ＴＲＣＰＸＥＮは、Ｆ５５Ｂ１２．３およびＣＣ４ＹＳＴと
もクラスター化する遺伝子であるＫ１０Ｂ２．１とクラスター化し、一方、Ｉｎ
ｃｙｔｅ０２８９７１は、ｓｅｌ−１０とクラスター化した。かくして、Ｉｎｃ
ｙｔｅ０２８９７１はＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１０のヒトホモログをコー
ドするようである。ｓｅｌ−１０と０２８９７１との間の配列相同性は該ＷＤモ
チーフの７つの反復を含有するタンパク質の領域中で最っとも強い。該Ｉｎｃｙ
ｔｅ０２８９７１コンティグは、膵臓、肺、Ｔ−リンパ球、線維芽細胞、乳房、
海馬、心筋、結腸、およびその他を含む複数のライブラリーからの４４個のＥＳ
Ｔを含有する。

【００４６】 公開ＥＳＴ：ＴＲＥＭＢＬＰデータセットに対するＤＮＡ配列０２８９７１での
Ｂｌａｓｔｘ調査は、ＩＭＡＧＥライブラリー、Ｓｏａｒｅｓ マウス胚ＮｂＭ
Ｅ１３．５〜１４．５由来の単一相同マウスＥＳＴ（Ｗ８５１４４）を同定した
。Ｗ８５１４４と、および、次いで、Ｆ５５Ｂ１２．３との０２８９７１のｂｌ
ａｓｔｃ整列は、０２８９７１中のリーディングフレームにおいて変化を明らか
にし、それは、おそらく、配列決定誤差による。該ＥＭＢＬ ＥＳＴデータベー
スの該０２８９７１ＤＮＡ配列でのＢｌｓｔｎ調査は、Ｗ８５１４に加えて、０
２８９７１のコード配列と整列する３つのヒトＥＳＴおよび該０２８９７１配列
の３’未翻訳領域と整列する６つのＥＳＴを明らかにした。

【００４７】 タンパク質モチーフ：２つのタンパク質モチーフがＦ５５Ｂ１２．３中に同定さ
れ、それらは酵母ｃｄｃ４、マウスｗ８５１４４およびヒト０２８９７１と共有
される。それらは、Ｎ−末端ドメインのＦ−ボックスおよびＣ−末端ドメインの
β−トランスデューシン反復である。

【００４８】 考察 該ｓｅｌ−１０遺伝子はβ−トランスデューシンタンパク質ファミリーのメン
バーをコードする。これらは、複数のＷＤ４０反復の存在により特徴付けられる
［Neer, E.J. et al., Nature 371:297-300 (1994)］。該反復は２０〜４０個の
アミノ酸長であり、ｇｌｙ−ｈｉｓ（ＧＨ）およびｔｒｐ−ａｓｐ（ＷＤ）残基
に結合される。β−トランスデューシンの三次元構造の溶液は、該ＷＤ４０反復
は７枚羽根のプロペラ様構造のアームを形成することを示す［Sondek, J. et al
., Nature 379:369-74 (1996)］。各羽根は、１つの内部ベータ鎖の制限を形成
するタンパク質モチーフ中の保存されたアスパラギン酸残基の対を持つベータシ
ートの４つの互い違いのプリーツにより形成される。ＷＤ４０反復は、様々な機
能的分類を代表する２７を超える異なるタンパク質中に見出される［Neer, E.J.
, et al., Nature 371:297-300 (1994)］。これらは、細胞分裂、細胞成長決定
、遺伝子転写、信号伝達、タンパク質分解、ｍＲＮＡ修飾およびベシクル融合を
含む細胞機能を調節する。機能におけるこの多様性は、β−トランスデューシン
ファミリーメンバーは複数のタンパク質複合体がその上で組み立て得る共通骨格
を与えるという仮説を導いた。

【００４９】 該酵母ｃｄｃ４遺伝子に対するｓｅｌ−１０、２８９７１およびＷ８５１４４
の相同性は、タンパク質の細胞内分解のためのユビキチン−プロテアソーム経路
における機能的役割を示唆する。該酵母ｃｄｃ４遺伝子の突然変異は、Ｓ期サイ
クリン／ｃｄｋ複合体のインヒビターであるＳｉｃ１の分解をブロックすること
により、細胞周期停止を引き起こす［King, R.W. et al., Science 274:1652-9
(1996)］。Ｓｉｃ１のリン酸化は該ユビキチン−プロテアソーム経路により破壊
のためそれを標的する。この経路は多重タンパク質複合体により触媒される３つ
の繋がった酵素反応からなる［Ciechannover, A., Cell 79:13-21 (1994); Ciec
hanover, A. and A.L. Schwartz, FASEB J. 8:182-91 (1994)］。先ず、ユビキ
チンのＣ−末端グリシンがＡＴＰにより活性化されて、ユビキチン活性化酵素Ｅ
１により触媒される反応において高エネルギーチオールエステル中間体を形成す
る。活性化の後、Ｅ２酵素（ユビキチン結合酵素）はユビキチンをＥ１から該タ
ンパク質標的に移動させる。いくつかの場合、Ｅ２は単独で働く。他の場合、そ
れは、当該タンパク質基質に結合し、ユビキチン化を触媒するＥ２を補充するＥ
３ユビキチンライゲーティング酵素と協力して働く。Ｅ２ユビキチン結合酵素は
固く保存された遺伝子ファミリーを含み、一方、Ｅ３酵素は配列に分れる［Ceic
hanover, A., Cell 79:13-21 (1994); Ciechanover, A. and A.L. Schwartz, FA
SEB J. 8:182-91 (19994)］。

【００５０】 酵母において、該Ｅ２ユビキチン結合酵素、ｃｄｃ３４の突然変異はＳ期サイ
クリン／ｃｄｋ複合体のＳｉｃ１インヒビターの分解に失敗して細胞周期停止を
引き起こす［King, R.W. et al., Science 274:1652-9 (1996)］。通常、Ｓｉｃ
１は、細胞がＧ１−Ｓ期推移に入るときに分解されるが、ｃｄｃ３４の不存在下
、Ｓｉｃ１は分解を免れ、その蓄積が細胞周期停止を引き起こす。ｃｄｃ３４に
加えて、ｃｄｃ４はＧ１−Ｓ期推移に必要とされる３つの他のタンパク質の一つ
である。他の２つは、ｃｄｃ５３およびＳｋｐ１である。上記したように、ｃｄ
ｃ４は２つの構造的モチーフ、（該タンパク質がベータ−プロペラを形成するこ
とを示唆する）７つのＷＤ４０反復およびＳｋｐ１に対する相互作用ドメインで
あるサイクリンＦと共有する構造的モチーフを含有する［Bai, C. et al., Cell
86:263-74 (1996)］。ｃｄｃ５３、ｃｄｃ４およびｓｋｐ１（およびユビキチ
ン、ｃｄｃ３４およびＥ１も）含有する昆虫細胞ライゼートはユビキチンをＳｉ
ｃ１に移動し、これらの成分のうち１以上がＥ３ユビキチンランゲーティング酵
素として機能することを示す［King, R.W. et al., Science 274:1652-9 (1996)
］。ｃｄｃ４またはＳｋｐ１のいずれかの増大した発現は他方の損失を部分的に
救済する。

【００５１】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて、ｓｅｌ−１０の突然変異は可視的な遺伝子型を
有さず、ｓｅｌ−１０は該細胞周期の調節に役割を演じないことを示す。密接に
関連するＣ．ｅｌｅｇａｎｓβ−トランスデューシンファミリーメンバー、Ｋ１
０Ｂ２．６がその役割を演じるであろう。それは、サイクリンＢの分解に失敗す
ることにより後期アナフェーズにおいて停止された酵母細胞周期を救済するＸｅ
ｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ由来の遺伝子ＴＲＣＰ＿ＸＥＮとクラスター化するか
らである［Spevak, W. et al., Mol. Cell. Biol. 13:4953-66 (1993)］。ｓｅ
ｌ−１０がＥ３−ユビキチンライゲーティング酵素の成分をコードしないならば
、いかにして、それはｓｅｌ−１２を抑制し、ｌｉｎ−１２突然変異を促進する
のであろうか？最も単純な仮説は、ｓｅｌ−１０はユビキチン−プロテアソーム
経路似より両方のタンパク質の分解を調節するというものである。ｓｅｌ−１２
およびｌｉｎ−１２は両方とも経膜タンパク質である。Ｓｅｌ−１２は、そのＮ
−およびＣ−末端が該サイトゾルと面するように該膜を８回横切る［Kim, T.W.
et al., J. Biol. Chem. 272:11006-10 (1997)］、一方、ｌｉｎ−１２はタイプ
１経膜タンパク質である［Greenwald, I. and G. Seydoux, Nature 346:197-9 (
1990)］。両方ともユビキチン化され、ヒトＰＳ２の場合、定常レベルは該プロ
テアソームのインヒビター、Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシンおよび
ラクタシスチンで処理した細胞中で増加する［Li, X. andI. Greenwald Neuron.
17:1015-21 (1996)］。あるいは、ｓｅｌ−１０はプレセニリン機能のネガティ
ブレギュレータの分解のため標的するであろう。 遺伝子解析およびｃｄｃ４に対する相同性により示されたタンパク質機能は、
ヒトｓｅｌ−１０の薬物インヒビターはヒトプレセニリンの定常レベルを増加さ
せるであろうことを示唆する。これは、プレセニリン経路の活性を高め、アルツ
ハイマー病における治療介在の手段を提供する。

【００５２】 実施例２：Ｓｅｌ−１０をコードするヒトｃＤＮＡの５’ＲＡＣＥクローニング
、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるプレセニリン突然変異の遺伝子外サプレッサー 物質および方法 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｃＤＮＡからのｓｅｌ−１０コード配列の増幅のためのオ
リゴヌクレオチドプライマーは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１０についての
コード配列として実施例１で同定されたＦ５５Ｂ１２．３の配列に基づき調製さ
れた。調製されたプライマーは：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧ
ＡＴＧＧＡＴＣＧＡＴＧＡＣＡＣＣ−３’（配列番号：１１）および５’−ＧＧ
ＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＧＧＧＴＡＴＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧ−３’（配
列番号：１２）であった。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｍＲＮＡは、ＢＲＬ Ｓｕｐｅｒ
ｓｃｒｉｐｔＩＩ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用いてｃＤＮＡ
に転換した。当該ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ（LTI, Gai
thersberg, MD）で消化し、ｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）にクローン化した
。２つの単離物を配列決定した（ABI, Perkin-Elmer Corp.）

【００５３】 （Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１０のヒトホモログの部分をコードする）Ｉ
ｎｃｙｔｅクローン０２８９７１の配列を用いて、４つのアンチセンスオリゴヌ
クレオチドプライマー：５’−ＴＣＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡＧ
ＴＣＣ−３’（配列番号：１３）、５’−ＧＧＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＴＴＣＴＴ
ＧＴＴＧＡＡＣＴＧ−３’(配列番号：１４）、５’−ＣＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴ
ＧＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧ−３’（配列番号：１５）および５’−ＣＣＡＧＴＣＴ
ＣＴＧＣＡＴＴＣＣＡＣＡＣＴＴＴＧ−３’（配列番号：１６）をデザインして
、ヒトｓｅｌ−１０の欠落した５’端を増幅した。Ｉｎｃｙｔｅ ＬｉｆｅＳｅ
ｑ「エレクトロニック・ノーザン」分析を用いてｓｅｌ−１０が発現された組織
を同定した。これらの２つ、海馬および乳腺を、ClonTech マラソン（Marathon
）キットを用いる５’ＲＡＣＥクローニングのために選び、海馬および乳腺から
のマラソン−レディ（Marathon-ready）ｃＤＮＡを調製した。ＰＣＲ産物を該Ｔ
ＡベクターｐＣＲ３．１（Invitrogen）にクローンし、単離物を配列決定した。
代替５’オリゴヌクレオチドプライマーも、該海馬ｓｅｌ−１０配列：５’−Ｃ
ＴＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：１７）とは
異なる５’端を有するＩｎｃｙｔｅクローンに基づきデザインした。 Ｂｌａｓｔｎを用いて、ＩｎｃｙｔｅデータベースＬｉｆｅＳｅｑおよびＬｉ
ｆｅＳｅｑＦＬを調査した。ギャップ整列および翻訳はＧＣＣプログラム（Wisc
onsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer G
roup, University Research Park, Madison Wisconsin）で行った。

【００５４】 結果 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１０のコード配列：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ −１０ の予想コード配列、Ｆ５５Ｂ１２．３は、元来、Genom Sequencing Cente
r, Wasington University, St. Louisにて、ゲノムコスミドＦ５５Ｂ１２中のイ
ントロンおよびエキソンを予想するためのコンピュータプログラムGeneFinderを
用いて決定された。仮想ｃＤＮＡ配列は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｃＤＮＡからこ
の領域を増幅し、それをクローン化し、次いで、配列決定することにより確認し
た。

【００５５】 ヒトｓｅｌ−１０遺伝子ホモログのコード配列：全ての０２８９７１アンチセン
スオリゴヌクレオチドはヒト海馬および乳房ｃＤＮＡから５’ＲＡＣＥ産物を増
幅した。海馬反応からの最長ＰＣＲ産物をクローン化し、配列決定した。このＰ
ＣＲ反応をデザインして、当該予想停止コドンにて終了する産物を生成させた。
２つの単離物は、該０２８９７１配列の始まりの前８８０塩基で開始する同一の
配列を含有した。この配列はスパニングＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡクローンとの比
較により確認した。該ヒトｓｅｌ−１０ホモログの５’端に広がるＩｎｃｙｔｅ
クローンはＦ５５Ｂ１２．３と注釈されなかった。ヒトとＣ．ｅｌｅｇａｎｓと
の間でこの領域における相同性は低く、これらのクローンと該注釈されたクロー
ンとの間の重複は、それらが該Ｉｎｃｙｔｅデータベース内でクラスター化する
、あるいは、該Ｉｎｃｙｔｅデータベースを該０２８９７１配列での本発明者ら
のｂｌａｓｔ調査で明らかにするには非常に低い程度しか起らなかった。

【００５６】 ヒトｓｅｌ−１０の予想タンパク質配列はＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１０
に対して、４７．６％同一性および５６．７％の類似性を有する。該ヒトｓｅｌ
−１０配列のＮ−末端は、４つのインフレームメチオニンで始まる。上記したＷ
Ｄ４０反復に加えて、該ヒト配列も、ｓｅｌ−１０ホモログに期待されるように
、Ｓｋｐ１に結合するＣＤＣ４Ｆ−ボックスに対して相同な領域を含有する。

【００５７】 乳房および海馬組織中で発現された様々なヒトｓｅｌ−１０ ｍＲＮＡ： 海馬配列とは異なるいくつかのさらなるヒトｓｅｌ−１０ＥＳＴを同定した。
これらは正確な対合であり、それは、おそらく代替転写物が本物であることを示
す。該ヒト海馬ｓｅｌ−１０配列とのこれらの配列の比較は、４番目のインフレ
ームメチオニンの前に不一致を示し、そして、その後は正確な配列対合を示した
。この代替転写物の５’端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、乳房ｃ
ＤＮＡからの産物を増幅するが海馬ｃＤＮＡからの産物は増幅しないことが見出
された。これは、該ヒトｓｅｌ−１０転写物が組織特異的な様式でディファレン
シャルスプライシングを受けるか、または該遺伝子が複数の組織特異的プロモー
タを含有するかのいずれかを示す。

【００５８】 考察 ５’ＲＡＣＥおよびＰＣＲ増幅を用いて、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子、ｓｅｌ
−１０のヒトホモログをコードする完全長ｃＤＮＡをクローン化した。配列解析
は、ｓｅｌ−１０はＦ−ボックスおよびＷＤ４０反復ドメインを含有するタンパ
ク質のＣＣ４ファミリーのメンバーであるという以前の予想を確認する。該ヒト
ｓｅｌ−１０ ｃＤＮＡの２つの変異体を、翻訳開始の明確な部位の前の５’配
列において異なる、海馬および乳腺からクローン化した。これは、該遺伝子が組
織特異的である転写開始に対して２以上の開始部位を有するか、またはエキソン
スプライシングのパターンが組織特異的であるかを示唆する。

【００５９】 実施例３：ヒト細胞中でのエピトープタグ化Ｓｅｌ−１０の発現、およびヒトＳ
ｅｌ−１０によるアミロイドβペプチドプロセシングの摂動 材料および方法 エピトープタグ化Ｓｅｌ−１０：サブクローニング、細胞成長およびトランス
フェクション： ＥｃｏＲＩ部位は、該オリゴヌクレオチド２３７（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡ
ＴＧＡＡＡＡＧＡＴＴＧＧＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＴＧ−３’）（配列番号：１８
）および２０６（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣＡＣＡＴＣ
ＡＡＡＧＴＣＣＡＧ−３’）（配列番号：１９）でプライムしたポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、該ヒトｓｅｌ−１０ ｃＤＮＡにインフレームで導
入した。得られたＰＣＲ産物をベクターｐＣＳ２＋ＭＴのＥｃｏＲＩ部位にクロ
ーン化した。これは５’６−ｍｙｃエピトープタグをインフレームで該海馬ｓｅ
ｌ−１０ ｃＤＮＡの５番目メチオニン、すなわち、配列番号：１に示される配
列のヌクレオチド３０６の上流に融合した。この構築体のヌクレオチド配列は、
６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０と称され、配列番号：２０に示され、一方、それに
よってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号：２１に示される。
該海馬および乳房ｓｅｌ−１０ ｃＤＮＡはこのメチオニンの上流に分かれる。
３’−ＦＬＡＧタグ付きのＰＳ１ ｃＤＮＡ（ＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧ）を該ｐｃ
ＤＮＡ３．１ベクターにサブクローン化した。スウェディッシュＮＬ突然変異と
ＡＰＰ６９５のＣ−末端へのジリシルモチーフの付加よりなる弱毒化されたＥＲ
保持配列とを含有するＡＰＰ ｃＤＮＡをベクターｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰにクロ
ーン化した［Mullan et al., Nat Genet 1992 Aug;1(5):345-7］。ＨＥＫ２９３
およびＩＮＲ細胞を１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ中で８０％集密性まで増殖させ、
上記ｃＤＮＡでトランスフェクトした。１０ｍｇ全ＤＮＡ／６×１０^６細胞の全
部を単一のプラスミドでのトランスフェクションに用いた。複数プラスミドの共
トランスフェクションについて、同量の各プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉ
ｎｅ（BRL）を用いて、１０ｍｇＤＮＡの全てにつき用いた。

【００６０】 Ｃ−末端Ｖ５ｈｉｓタグ化ｓｅｌ−１０およびＣ−末端ｍｙｃｈｉｓタグ化ｓ
ｅｌ−１０を構築するために、ヒト海馬ｓｅｌ−１０のコード配列を ５’プライマー：５’−ＧＧＧＴＡＣＣＣＣＴＣＡＴＴＡＴＴＣＣＣＴＣＧＡＧ
ＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号：２２）上にＫｐｎＩ制限部位および３’−プラ
イマー：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＣ
−３’（配列番号：２３）上にＥｃｏＲＩ部位を含有するオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて、起源ヒトｓｅｌ−１０ＲＡＣＥｐｃｒ産物をテンプレートと
して用いて、増幅した。該産物は、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩの両方で消化し、
ベクターｐｃＤＮＡ６／Ｖ５−ＨｉｓＡまたはｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉ
ｓ（＋）Ａ（Invitrogen）のいずれかにクローン化した。独立した単離物のヌク
レオチド配列をジデオキシ配列決定により確認した。該Ｃ−末端Ｖ５ｈｉｓタグ
化ｓｅｌ−１０のヌクレオチド配列は配列番号：２４に示され、一方、それによ
りコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号：２５に示される。独立
した単離物のヌクレオチド配列をジデオキシ配列決定により決定した。該Ｃ−末
端ｍｙｈｉｓタグ化ｓｅｌ−１０のヌクレオチド配列は配列番号：２６に示され
、一方、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号：２７
に示される。

【００６１】 ＦＡＣＳによる形質転換細胞のクローナル選択：細胞試料は、空冷アルゴンレー
ザにより供給される４８８ｎｍ励起ラインを備えたEPICS Elite ESP フロー血球
計算器で分析した。ＥＧＦＰ発光は５２５ｎｍバンドパスフィルターを通して測
定し、蛍光強度は、生存可能な細胞上にゲーティング後、全面および直角光散乱
により決定し、４桁対数目盛上に表示した。単一の若い細胞をＧ４１８なしの増
殖培地を含有する一つの９６ウェルプレートの各ウェルに分けた。４日の回復期
の後、Ｇ４１８を該培地に添加して、４００ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。クロ
ーン入りのウェルは該９６ウェルプレートから２４ウェルプレート、次いで、６
ウェルプレートに展開し、最も速い増殖コロニーを各段階の展開に選んだ。

【００６２】 免疫蛍光：スライド上で増殖した細胞は、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドおよ
び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により３０分間氷上でトランスフェクトし
、ＰＢＳ中１０％ヤギ血清（ブロッキング溶液）により室温（すなわち、２５℃
）にて１時間ブロックし、その後、マウス抗ｍｙｃ（１０ｍｇ／ｍｌ）またはウ
サギ抗ＦＬＡＧ（０．５ｍｇ／ｍｌ）抗体で４℃Ｏ／Ｎで、次いで、ブロッキン
グ溶液中のフルオレッセイン標識したヤギ抗マウスまたは抗ウサギ抗体（５ｍｇ
／ｍｌ）で２５℃にて１時間インキュベートしてから４８時間後に固定化した。

【００６３】 ウェスターンブロティング：細胞ライゼートは、１０^５個の細胞をＴＥＮＴ（５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ
、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１×プロテアーゼインヒビターのカクテル）
で１０分間氷上でインキュベートすることによりトランスフェクトしてから４８
時間後に作製し、その後、１４,０００ｇにて遠心した。上清を４〜１２％Ｎｕ
Ｐａｇｅゲル上に負荷し（５０ｍｇタンパク質／レーン）、電気泳動および移行
はＸｃｅｌｌ ＩＩ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌシステム（Novex）を用いて行った。ブ
ロットはＰＢＳ中の５％ミルクで１時間室温にてブロックし（上の「免疫蛍光」
に記載された）、抗ｍｙｃまたは抗ＦＬＡＧ抗体で４℃Ｏ／Ｎでブロックし、次
いで、ヒツジ抗マウスまたは抗ウサギ抗体―ＨＰＲ（０．１ｍｇ／ｍｌ）で、１
時間室温にてインキュベートし、その後、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（Pierce）検
出を行った。

【００６４】 ＥＬＩＳＡ：細胞培養上清または細胞ライゼート（１００ｍｌギ酸／１０^６細胞
）を以下の２重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイし、それは培養上清中で
Ａβ_１〜４０およびＡβ_１〜４２のレベルを検出することが可能である。 ヒトＡβ１〜４０または１〜４２は、２重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡにおい
てモノクローナル抗体（ｍＡｂ）６Ｅ１０（Senetek, St. Louis, MO）およびビ
オチン化ウサギ抗血清１６２または１６４（NYS Insutitute for Basic Researc
h, Staten Island, NY）を用いて測定した。該捕捉抗体６Ｅ１０はｈＡβのＮ−
末端アミノ酸残基１〜１６上に存在するエピトープに対して特異的である。コン
ジュゲートした検出抗体１６２および１６４は、それぞれ、ｈＡβ１〜４０およ
び１〜４２に特異的である。該サンドイッチＥＬＩＳＡは、［Pirttila et al.,
Neurobiology of Aging 18:121-7 (1997)］の方法に準じて行った。簡単には、
Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェル免疫プレートを０．１Ｍ 炭酸塩−炭酸
水素塩バッファー、ｐＨ９．６で希釈した１００μｌ／ウェルのｍＡｂ ６Ｅ１
０（５μｇ／ｍｌ）でコートし、４℃にて一晩インキュベートした。該プレート
を０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する０．０１Ｍ ＤＰＢＳ（Pierce, Roc
kford IIから入手した修飾ダルベッコス・リン酸塩バッファー化サリン（０．０
０８Ｍ リン酸ナトリウム、０．００２Ｍ リン酸カリウム、０．１４Ｍ 塩化ナ
トリウム、０．０１Ｍ 塩化カリウム、ｐＨ７．４））（ＤＰＢＳＴ）で３回洗
浄した後、該プレートを０．０１Ｍ ＤＰＢＳ中の１０％正常ヒツジ血清（Sigma
）の２００μｌでブロックして、非特異的結合を防いだ。ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／
ｍｌの母液から、非トランスフェクト条件の細胞培地で希釈したヒトＡβ１〜４
０または１〜４２標準１００μｌ／ウェル（Bachem, Torrance, CA）は、１００
μｌ／ウェルの試料、すなわち、トランスフェクトした細胞の濾過条件の培地と
共に、該プレートの洗浄後に添加した。該プレートは２時間室温にて、次いで、
４℃にて一晩インキュベートした。翌日、該プレートを洗浄した後、ＤＰＢＳＴ
＋０．５％ ＢＳＡ中で希釈したビオチン化ウサギ抗血清１６２ １：４００ま
たは１６４ １：５０の１００μｌ／ウェルを添加し、室温にて１時間１５分室
温にてインキュベートした。洗浄後、ＤＰＢＳＴで１：１０,０００に希釈した
１００μｌ／ウェル ニュートロアビジン−西洋ワサビペルオキシド（Pierce,
Rockford, II）を適用し、１時間室温にてインキュベートした。最後の洗浄後、
５０ｍＭ クエン酸／１００ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（Sigma Chemical
s, St. Louis, MO）、ｐＨ５．０中のジヒドロ塩化Ｏ−フェニレンジアミン（Si
gma Chemicals, St. Louis, MO）の１００μｌ／ウェルを基質として添加し、発
色は、Soft max Pro ソフトウェアを用いて、２０分間、キネティックマイクロ
プレートリーダーで４５０ｎｍにてモニターした。

【００６５】 結果 ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクト：トランスフェクション効率は、緑色蛍
光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するベクターの使用により、またはエピトープタ
グ化ｓｅｌ−１０またはＰＳ−１の免疫蛍光検出によってモニターした。Ｎ−末
端６−ｍｙｃエピトープを用いて、ヒトｓｅｌ−１０をタグし（６ｍｙｃ−Ｎ−
ｓｅｌ−１０）、一方、ＰＳ１はＣ−末端ＦＬＡＧエピトープ（ＰＳ１−Ｃ−Ｆ
ＬＡＧ）でタグした。ＡＰＰ６９５は、スウェディッシュＭＬ突然変異の取込み
によって修飾して、ＡβプロセシングおよびＣ−末端ジリジンモチーフよりなる
弱毒化した小胞体（ＥＲ）保持信号を増加させた（ＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫ）。
該ジリジンモチーフはＡβプロセシングを約２倍に増加させる。該ＡＰＰ６９５
ＮＬ−ＫＫ構築体はＧＦＰ（ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ、Invitrogen）を含有するビ
シストロンベクターの第１のシストロンに挿入して、本発明者らがトランスフェ
クション効率をモニターできるようにした。ＨＥＫ２９３細胞におけるトランス
フェクション効率は、単一プラスミドＤＮＡでのトランスフェクションについて
、約５０％であった。２つのプラスミドでの共トランスフェクショについて、約
３０〜４０％の細胞が、２重免疫蛍光で検出されたように、両方のタンパク質を
発現させた。

【００６６】 トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における組換えタンパク質の発現は、
ＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧおよび６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０に例示したようにウェ
スターンブロットにより確認した（図１Ａ）。３つのプラスミド（ＰＳ１−Ｃ−
ＦＬＡＧ＋６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０＋ＡＰＰ）での共トランスフェクション
の場合、３つの全てのタンパク質は、適当な抗体を用いたウェスターンブロット
（図１Ｂ）により同一の細胞ライゼート中で検出した。

【００６７】 Ａβプロセシングへの６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０およびＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡ
Ｇの効果：６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０またはＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧと共のＡＰ
Ｐ６９５ＮＬ−ＫＫのＨＥＫ２９３細胞への共トランスフェクションは、該培養
上清中へのＡｂ１〜４０およびＡｂ１〜４２の放出を単にＡＰＰ６９５ＮＬ−Ｋ
Ｋだけでのトランスフェクションよりも２ないし３倍増加させた（テーブル１）
。６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０およびＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧの両方と共のＡＰＰ
６９５ＮＬ−ＫＫは一層さらにＡｂ放出を増加させた（すなわち、４ないし６倍
増加）。対照的に、該上清に放出されたＡｂ１〜４０／（Ａｂ１〜４０＋Ａｂ１
〜４２の比は、約５０％減少した。Ａｂ１〜４０／（Ａｂ１〜４０＋Ａｂ１〜４
２の比における難解な減少は、Ａｂ１〜４２に比してＡｂ１〜４０におけるより
大きな増加を反映している。６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０またはＰＳ１−Ｃ−Ｆ
ＬＡＧのいずれもＨＥＫ２９３細胞中の内在Ａｂ産生に影響しない。同様の観察
がＩＭＲ３２細胞においても得られた（テーブル２）。しかしながら、ＩＭＲ３
２細胞はＨＥＫ２９３細胞よりもあまりよくトランスフェクトされず、それで、
６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０またはＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧとの共トランスによる
ＡＰＰ６９５ＮＬ―ＫＫプロセシングの促進はより低かった。

【００６８】 ＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞中で発現し
たＡｂ１〜４０のレベルは該培養上清および細胞ペレット中でＡｂペプチドを測
定するのに充分であった。単にＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫでトランスフェクトした
細胞において、上清中よりも細胞ペレット中でかなり多いＡｂ１〜４０が検出さ
れる。６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０またはＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧと共の共トラン
スフェクションは、比例的に、該細胞ペレット中のＡｂ１〜４０を減少させ、該
培養中のＡｂを増加させた。これは、６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０およびＰＳ１
−Ｃ−ＦＬＡＧがＡＰＰのプロセシングまたは往来を変化させ、比例的により多
いＡｂを該細胞から放出させるということを示唆する。

【００６９】 内在Ａβプロセシングへの６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０およびＰＳ１−Ｃ−ＦＬ
ＡＧ発現の効果：ヒト細胞による内在ＡＰＰのプロセシングへの６ｍｙｃ−Ｎ−
ｓｅｌ−１０の効果は、これらのタンパク質を発現する安定に形質転換したＨＥ
Ｋ２９３細胞系を作製することにより評価した。６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０を
発現する２つの細胞系は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターＤＮＡで形質転換した対照
細胞系と共に、誘導した（ｓｅｌ−１０／２＆ｓｅｌ−１０／６）。両方の６ｍ
ｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０細胞系は、ウェスターンブロット分析により示されたよ
うに該タンパク質を発現した。Ａｂ１〜４０の内在産生は、ベクターＤＮＡ形質
転換細胞と対照的に、両方の６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０細胞系において増加し
た（テーブル３）。さらに、６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０の安定発現は、ＡＰＰ
６９５ＮＬ−ＫＫプラスミドＤＮＡでのトランスフェクション後、Ａｂ産生を著
しく増加させた（テーブル３）。同様の結果が、ＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧを発現す
る６つの安定細胞系で得られた。全ての６つの細胞系は、内在Ａβプロセシング
の著しい上昇を示し、全てはＡＰＰ６９５ＥＬ−ＫＫでのトランスフェクション
後、Ａｂの促進されたプロセシングも示した（テーブル３）。さらに、６ｍｙｃ
−Ｎ−ｓｅｌ−１０で見られたＡβプロセシングの増大は、Ｃ−末端にてｍｙｃ
ｈｉｓまたはｖ５ｈｉｓのいずれかでタグされたｓｅｌ−１０でも見られた（テ
ーブル４を参照）。Ｃ−末端およびＮ−末端のタグの両方はＡβプロセシングに
おける増大をもたらした。

【００７０】 考察 これらのデータは、過剰発現した場合、６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０ならびに
ＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧが、トランジェントおよび安定発現系の両方においてＡβ
プロセシングを変化させることを示す。６ｍｙｃエピトープタグをこれらの実験
に用いて、ウェスターンブロット分析によるｓｅｌ−１０発現の検出を可能にし
た。酵母ＣＤＣ４に対するその配列相同性が、ｓｅｌ−１０がＥ２−Ｅ３ユビキ
チンリガーゼであると示すのであれば、該タンパク質を同定することは可能であ
り、それはユビキチン化について標的する。該プレセニリンはユビキチン−プロ
テアソーム経路で分解されるので、ＰＳ１＆ＰＳ２はｓｅｌ−１０触媒化ユビキ
チン化の理論的標的である［Kim et al., J. Biol. Chem. 272:11006-11010 (19
97)］。いかにｓｅｌ−１０がＡβプロセシングに影響するかは、現時点では分
らない。将来、ｓｅｌ−１０＆ＰＳ１がＡＰＰの産生、プロセシング、輸送、ま
たはターンオーバーを変化させることによってＡβプロセシングを増大させるか
、およびＰＳ１の効果はｓｅｌ−１０により介在または調節されるかどうかを決
定することが必要になるであろう。 これらの実験は、ｓｅｌ−１０がＡＤの治療において、Ａｂレベルを低下させ
るための可能性のある薬物標的であることを示す。それらは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎ
ｓがＡＤに関連してプレセニリン生物学を調査する優れたモデル系であることも
示す。かくして、共トランスフェクション実験で示されるように、安定形質転換
体においてと同様に、６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０またはＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧ
の発現はＡβプロセシングを増大する。Ａβプロセシングにおける増大はＡＰＰ
６９５ＮＬ−ＫＫと共の６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０またはＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡ
Ｇの共トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３細胞およびＩＭＲ３２細胞の両方
において見られた。６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−１０またはＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧを
発現するＨＥＫ２９３細胞の安定形質転換体において、内在Ａβプロセシングの
増大が、ＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫでのトランスフェクション後のＡβプロセシン
グの増大と同様に観察された。これは、ｓｅｌ−１０および／またはＰＳ１のい
ずれかのインヒビターがＡβプロセシングを増大させ、アルツハイマー病に対す
る治療可能性を有しているであろうことを示す。

【００７１】 実施例４：ＳＥＬ−１０はプレセニリン１と相互作用し、そのユビキチン化を容
易にし、Ａβ産生を変化させる ヒトにおけるプレセニリン遺伝子（ＰＳ１またはＰＳ２）は常染色体優位早期
発症アルツハイマー病を引き起こす。これらは、アミロイドタンパク質前駆体（
ＡＰＰ）^１,２のプロセシングにおける変化に結び付けられた。該プレセニリン
は、６〜８この経膜ドメインを持つ膜タンパク質であり^３,４、それらは、小胞
体、ゴルジ体、核エンベロープ、動原体および中心体に局在する^５,６。ｓｅｌ
−１２の突然変異、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓプレセニリ
ンは産卵に欠陥を生じる^７。Ｓｅｌ−１２は３つのネマトーダプレセニリンホモ
ログ（ｓｅｌ−１２、ｈｏｐ−１およびｓｐｅ−４）のうちの１つである^７〜９ 。該ｓｅｌ−１２突然変異体遺伝子型はヒトＰＳ１またはＰＳ２により救済し得 ^１０ 、ＰＳ１、ＰＳ２およびｓｅｌ−１２は機能的ホモログであることを示して
いる。ｓｅｌ−１２における突然変異はノッチ／ｌｉｎ−１２経路によりシグナ
リングを変化させることによって、産卵に欠陥を生じる。該ｓｅｌ−１２突然変
異体遺伝子型は、別の遺伝子、ｓｅｌ−１０における機能損失突然変異により抑
制され得^１１、それは、おそらく、機能的に冗長なプレセニリン、ｈｏｐ−１の
活性を増強することによって産卵欠陥の共済をもたらす^８,９。ＳＥＬ−１０は
酵母Ｃｄｃ４のホモログであり、ＳＣＦ（Ｓｋｐ１−Ｃｄｃ５３／ＳＵＬ１−Ｆ −ボックスｒタンパク質）Ｅ２−Ｅ３ユビキチンリガーゼファミリーのメンバー
である。この研究において、本発明者らはヒトＳＥＬ−１０がＰＳ１と相互作用
し、ＰＳ１ユビキチン化を促進し、かくして、未プロセスＰＳ１とそのＮ−およ
びＣ−末端フラグメントとの細胞レベルを変化させることを示す。これは、ＡＰ
Ｐの代謝における変化および、アルツハイマー病のアミロイドプラークの重要な
成分であるアミロイドβ−ペプチドの産生の増大をもたらす^１３。

【００７２】 該ＳＣＦ Ｅ２−Ｅ３ユビキチンリガーゼは、Ｓｌｐ１、Ｒｂｘ１、Ｃｄｃ５
３／ＣＵＬ−１およびＥ２ユビキチントランスフェラーゼ、Ｃｄｃ３４からなる
触媒性コアを含有する^１４。これらは、Ｆ−ボックスモチーフおよびＷＤ４０反
復を含有するアダプタータンパク質（例えば、Ｃｃ４、Ｇｒｒ１、Ｍｅｔ３０、
β−ＴｒＣＰ）によるユビキチン化の基質に対して標的される^１５。プレセニリ
ンはユビキチン化され、ユビキチン−プロテアソーム経路で分解されるという証
拠がある^{１６,１７}。Ｃ．ｅｌｅａｎｓ ＳＥＬ−１０とＳＥＬ−１２との間の物
理的相互作用は、以前に示されている^１１。かくして、ＳＥＬ−１０は、ユビキ
チン化およびその後の分解のためにプレセニリンを補給するＦ−ボックスアダプ
タータンパク質であろう。

【００７３】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｓｅｌ−１０のヒトおよびマウスオルトログの両方は、
ＥＳＴデータベースにおいて同定されているが、その配列情報は不完全である^{１ ２} 。本発明者らは、ｃＤＮＡ端の高速増幅（ＲＡＣＥ）を用いて、ヒトおよびマ
ウスｓｅｌ−１０についての完全コード配列を含有する増幅産物をクローンした
海馬由来（海馬形態）および乳腺由来（共通形態）のヒトｓｅｌ−１０ ｃＤＮ
Ａの２つの変異体があり、それらは、共通翻訳開始部位の５’上流において異な
る。これは、該ヒトｓｅｌ−１０転写物が組織特異的様式でディファレンシャル
スプライシングされることか、あるいは、該遺伝子が複数の組織特異的プロモー
タを含有するｋとを示しているであろう。該海馬形態は、共通開始部位の上流に
４つのインフレームメチオニンを含有し該乳房形態は３つ含有する。これらが異
なるＮ−末端を持つタンパク質をコードするか否かは知られていない。共通転写
物は、試験した全ての組織においてユビキチン的に発現され（図２Ａ）、一方、
該海馬形態は脳にのみ存在する（図２Ｂ）。該ヒトｓｅｌ−１０遺伝子は、イン
・サイチュハイブリダイゼーションにより染色体４ｑ１．２〜３１．３に局在化
された（データ示さず）。ヒトおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓＳＥＬ−１０の予想タ
ンパク質配列は４７．６％のアミノ酸同一性および５６．７％の類似性を有する
。ヒトＳＥＬ−１０は他のＳＣＦファミリーメンバーに見出されたようなＦ−ボ
ックスドメインを含有する。それは、酵母Ｃｄｃ４ｐおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ
ＳＥＬ−１０に見られるように、７つのＷＤ４０／β−トランスデューシン反
復も含有し^１８、該タンパク質形態が７枚羽根プロペラ構造^１９を形成すること
を示している。

【００７４】 本発明者らは、初めて、ヒトＳＥＬ−１０とＰＳ１との物理的相互作用を評価
した。Ｎ−末端６ＭｙｃエピトープでタグされたＳＥＬ−１０およびＰＳ１は、
ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）においてトランジェント共発現され、それらの
相互作用が免疫沈降により評価された。ＳＥＬ−１０とＰＳ１との複合体は、ト
ランスフェクションのときに培養に添加されたプロテアソームインヒビター、ラ
クタシスチンの存在下においてのみ検出し得た。抗ＰＳ１ループ抗体と免疫沈降
された場合、共トランスフェクトされた細胞からの免疫沈降物のみがＳＥＬ−１
０−ｍｙｃを含有し（図３Ａ）、ＳＥＬ−１０はＰＳ１と相互作用し得ることを
示している。ラクトシスチン処理をしていない細胞においては、共免疫沈降は観
察されなかったので（図３Ｂ）、これは、該複合体は、ＰＳ１のプロテアソーム
分解経路への進行をブロックすることによってのみ捕捉され得ることを示す。Ｓ
ＥＬ−１０とＰＳ１との相互作用は、ＳＥＬ−１０の免疫沈降のための抗−ｍｙ
ｃ抗体を用いることによる逆行実験において確認された（図３Ｃ）。ＰＳ１は、
経膜ドメイン６と７との間の細胞質ループ内で、Ｎ−およびＣ−末端フラグメン
ト（それぞれ、（ＰＳ１−ＮＴＦおよびＰＳ１−ＣＴＦ）を生成する未知のプロ
テアーゼにより切断される。該ＳＥＬ−１０−ｍｙｃ免疫沈降物は主に完全長お
よび高分子量の形態のＰＳ１を含有するが、非常に低いもしくは検出できない量
のＰＳ１−ＮＴＦしか含有せず、ＰＳ１−ＣＴＦは含有しなかった。これは、Ｓ
ＥＬ−１０が主に未プロセスＰＳ１に結合するのであろうことを示唆する。

【００７５】 次に、本発明者らは、ＰＳ１ユビキチン化へのＳＥＬ−１０共トランスフェク
ションの効果を調べた。共トランスフェクトされた細胞からのＰＳ１免疫沈降物
は、抗ユビキチン抗体でプローブすることによって示されるように、ＰＳ１単独
でトランスフェクトされた細胞と比較して、より高いレベルのユビキチン化を含
有する（図４Ａ）。この結果は、ＳＥＬ−１０とＰＳ１との複合体形成が、ＳＥ
Ｌ−１０／ＰＳ１複合体蓄積を論証するためのラクタシスチンの必要性により以
前示唆されたように、ユビキチン化を容易にする。 次いで、本発明者らは、いかにユビキチン化がＰＳ１タンパク質レベルに影響
するかを調査した。ＨＥＫ２９３細胞は、ＳＥＬ−１０もしくはＰＳ１を単独で
もしくは組み合わせてのいずれかで共トランスフェクトし、免疫沈降を抗−ＰＳ
１ループ抗体でプローブした（図４Ｂ）。ＰＳ１およびＳＥＬ−１０で共トラン
スフェクトした細胞において、ＰＳ１単独でトランスフェクトした細胞と比較し
て、ＰＳ１−ＮＴＦおよびＰＳ１−ＣＴＦは、該抗分子量形態のＰＳ１が減少し
た程度に減少した。しかしながら、未プロセスＰＳ１の量はわずかながら増加し
たようであった。この複雑な細胞効果のいくつかの可能性のある仮説がある。第
１は、ＰＳ１−ＣＴＦおよびＰＳ１−ＮＴＦのＳＥＬ−１０介在ユビキチン化は
それらの分解をもたらすことである。しかしながら、ＰＳ１のフラグメントはＳ
ＥＬ−１０とは免疫沈降せず、それは、ＳＥＬ−１０はＰＳ１−ＮＴＦおよびＰ
Ｓ１−ＣＴＦのユビキチン化を直接容易にしないということを示している。ＳＥ
Ｌ−１０で共トランスフェクトされた細胞において見られる未プロセスＰＳ１に
おけるわずかな増加は、その代わりに、ＰＳ１に結合するＳＥＬ−１０もしくは
ＰＳ１が介在するＰＳ１のユビキチン化が、未プロセス前駆体の蓄積をもたらす
ＰＳ１−ＮＴＦおよびＰＳ１−ＣＴＦのタンパク質分解プロセシングを阻害する
ことを示すのであろう。

【００７６】 アミロイドβ−ペプチド（Ａβ）産生へのＳＥＬ−１０介在ＰＳ１ユビキチン
化への影響を調査するため、野生型ＰＳ１を持ったまたは持たないＨＥＫ２９３
細胞中でトランジェントまたは安定トランスフェクションのいずれかで、ＳＥＬ
−１０を発現させた。Ａβ産生は、該ペプチドの１〜４０および１〜４２形態を
区別できる酵素免疫アッセイにより測定した。トランジェント発現実験において
（図５Ａ）、ＡＰＰとのＳＥＬ−１０の共発現は、Ａβ１〜４０およびＡβ１〜
４２の産生および放出をＡＰＰ発現単独と比較して２倍以上増加させた。ＡＰＰ
とのＰＳ１のトランジェント共発現も、以前の報告^２０と同様に、Ａβ１〜４０
およびＡβ１〜４２レベルを３倍以上増加させたが、これは一致した発見ではな
い^２。ＡＰＰとのＳＥＬ−１０およびＰＳ１の共発現は、Ａβ産生において約７
倍の増加に付加的な効果を有した。Ａβ１〜４２／全Ａβの比への効果は観察さ
れず、全ての値は８．５％ないし１３．５％の範囲に納まった。ＳＥＬ−１０の
発現によるＡβプロセシングの促進は複数の実験にわたって一貫して観察された
が、促進の程度は様々であった。該結果を確認し、拡張するために、一連のＨＥ
Ｋ２９３細胞系をＳＥＬ−１０またはＰＳ１の安定発現で誘導した（図５Ｂ）。
得られた２つのＳＥＬ−１０細胞系は、内在Ａβ１〜４０ペプチド産生において
、単にｐｃＤＮＡ３．１ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞と比
較して、４および７倍の増加を示した。同様に、ＰＳ１の安定発現での６つの細
胞系は、内在Ａβ１〜４０ペプチド産生において２ないし６倍の増加を示した。
ＡＰＰ ｃＤＮＡでの安定細胞系のトランジェントトランスフェクションを行っ
て、この結果を確認し、拡張した（図５Ｃ）。Ａβの産生は、ＳＥＬ−１０およ
びＰＳ１において、単にｐｃＤＮＡベクターで形質転換されたＨＥＫ２９３細胞
系と比較して、より多かった。ＳＥＬ−１０は、ＰＳ１−ＮＴＦおよびＰＳ１−
ＣＴＦフラグメントの細胞レベルを減少させつつ、未プロセスＰＳ１をわずかな
がら増加させるので、未プロセスＰＳ１における増加は観察されたＡβペプチド
プロセシングにおける増加に関係するのであろう。ＰＳ１のトランジェント発現
は同様の効果を有する。それは未プロセスＰＳ１の細胞レベルを増加させつつ、
ＰＳ１−ＮＴＦおよびＰＳ１−ＣＴＦフラグメントのレベルには比較的少ない効
果しか有さない。

【００７７】 本発明者らのデータは、ＳＥＬ−１０がＰＳ１と相互作用し、ＰＳ１ユビキチ
ン化を促進し、次いで、タンパク質分解のためのプロテアソーム経路にそれを補
給することを示している。ＳＥＬ−１０は、ＳＣＦ Ｅ２−Ｅ３ユビキチンリガ
ーゼのコア触媒性複合体を組み立てるアダプタータンパク質として機能するらし
い^１４。Ｆ−ボックス／ＷＤ４０反復アダプタータンパク質によるほとんどのＳ
ＣＦ基質の認識は、リン酸化依存性であり^１５、これはプレセニリンレベルの細
胞内調節の付加的なレベルであろうことを示している。ＨＥＫ２９３細胞中での
ヒトＳＥＬ−１０とＰＳ１との複合体形成を論証するため、ラクタシスチンによ
るプロテアソーム機能の阻害が必要であった。対照的に、プロテアソームインヒ
ビターの不存在下でのＨＥＫ２９３細胞中でのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ＳＥＬ−１
０／ＳＥＬ−１２複合体蓄積は、ネマトーダＳＥＬ−１０はヒトコア触媒性複合
体^１１を組み立てることができないことを示す。プレセニリンのごとき８回通過
経膜タンパク質の分解はトポロジカルなハードルを与える。該プレセニリンタン
パク質は該膜から抽出し、該プロテアソームに運搬しなければならないからであ
る。プレセニリンのように、嚢胞性経膜コンダクタンスレギュレータ（ＣＦＴＲ
）のごとき、大量の細胞質ドメインを持つ多数の他のマルチパスインテグラル（
multipass integral）膜タンパク質はユビキチン−プロテアソーム経路により分
解される^{２１,２２}。この経路も小胞体内での質制御に重要であり^２３、ひょっ
とすると、Ａβペプチドの細胞内産生に影響を与え得る。

【００７８】 一般に、ＰＳ１のヒト細胞へのトランスフェクションは、未プロセスＰＳ１の
細胞レベルを増加させることが観察されるが、ＰＳ１−ＣＴＦおよびＰＳ１−Ｎ
ＴＦのレベルにはほとんど変化を生じさせず、プロセシングは、おそらく、細胞
死経路のそれらの関わりにより、きつい細胞制御下にある^１７。ＰＳ１のトラン
ジェントまたは安定発現の結果として、本発明者らは、おそらく、未プロセスＰ
１の蓄積によるＡβペプチド産生において増加を観察する。Ａβペプチド産生お
よび未プロセスＰＳ１の蓄積への同様の効果はＳＥＬ−１０の増大した発現によ
り引き起こされる。ＳＥＬ−１０は、ＰＳ１の大きな細胞質ループにおける切断
部位に結合することによってＰＳ１プロセシングを直接調節するか、あるいは、
ＳＥＬ−１０介在ユビキチン化がＰＳ１プロセシングをブロックするのであろう
。同様に、家族性アルツハイマー病に関連する多数のＰＳ１突然変異はＮ−およ
びＣ−末端フラグメントへのＰＳ１のプロセシングを低減させることが示されて
いるが、それは一致した発見ではない^２５。しかしながら、ＰＳ１の突然変異形
態はＡβ１〜４２とＡβ１〜４０との比のシフトに関連し、一方、野生型ＰＳ１
またはＳＥＬ−１０の発現はＡβ１〜４２／Ａβ１〜４０の比に何ら影響しない ^１,２ 。

【００７９】 遺伝子データは、ＳＥＬ−１０はＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるプレセニリン活
性のネガティブレギュレータであることを示す。ＳＥＬ−１０機能の損失は、Ｈ
ＯＰ−１プレセニリン活性の容易化により、ＨＯＰ−１のプロセスしたＮ−およ
びＣ−末端フラグメントの増大した蓄積を許容することによって、ｓｅｌ−１２
突然変異体虫における産卵欠陥をおそらく救済するらしい。Ｓｅｌ−１０はプレ
セニリン活性を増大する突然変異についてのスクリーンにおいて同定された^１１ 。本質的に、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのごときモデル生
物体における遺伝子スクリーンを用いて、アルツハイマー病の所望の治療目的で
あるプレセニリン活性を低下させる突然変異を発見し得る^２６。そのようなスク
リーンはこの壊滅的な疾患に対する新規治療標的を同定する可能性を有している
。

【００８０】 方法 クローニング：Ｉｎｃｙｔｅクローン（０２８９７１）は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ
ｓｅｌ−１０のヒトホモログであると同定され、その配列を用いて、４つのアン
チセンスオリゴヌクレオチドプライマー： ５’−ＴＣＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＣ −３’（配列番
号：＿）、５’−ＧＧＴＡＡＴＴＡＣＡＡＡＧＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧ
−３’（配列番号：＿）、５’−ＣＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＴＧＴＡＧＡＣＡＧ
Ｇ −３’（配列番号：＿）、および５’−ＣＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣＣ
ＡＣＡＣＴＴＴＧ−３’（配列番号：＿）をデザインして、ヒトｓｅｌ−１０配
列の残部を増幅した。「エレクトロニック・ノーザン」分析は海馬および乳腺に
おけるｓｅｌ−１０の発現を明らかにし、それで、これらの組織がマラソン（Ma
rathon）キット（CloneTech）を用いる５’ＲＡＣＥのために選ばれた。海馬お
よび乳腺からのマラソン−レディ（Marathon-ready）ｃＤＮＡを該キット中で指
示されたように調製した。ＰＣＲ産物をＴＡベクターｐＣＲ３．１（Invitrogen
）中にクローンし、単離物を配列決定した。代わりの５’オリゴヌクレオチドプ
ライマーも、海馬ｓｅｌ−１０配列（５’−ＣＴＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧＧＡ
ＣＡＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：＿））とは異なる５’端を有するＩｎｃｙｔ
ｅクローンに基づきデザインした。Ｂｌａｓｔｎを用いて、Ｉｎｃｙｔｅデータ
ベースＬｉｆｅＳｅｑおよびＬｉｆｅＳｅｑＦＬを調査した。ギャップ整列およ
び翻訳をＧＣＧプログラムで行った。

【００８１】 プラスミドおよびトランスフェクション：該ヒトｓｅｌ−１０ ｃＤＮＡを該ベ
クターｐＣＳ２＋ＭＴ（Jan Kitajewski, Colombia University College of Phy
sicians and Surgeons からの寄贈）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。これは該海
馬ｓｅｌ−１０ ｃＤＮＡの第５メチオニンにインフレームで５’６−ｍｙｃエ
ピトープタグを融合した。該海馬および乳房ｓｅｌ−１０ ｃＤＮＡはこのメチ
オニンの上流に分れる。３’−ＦＬＡＧタグ付きのＰＳ１ ｃＤＮＡ（ＰＳ１−
Ｃ−ＦＬＡＧ）を該ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入した。スウェディッシュＫ
Ｌ→ＮＬ突然変異および、Ｃ−末端ジリジンモチーフよりなｐＩＲＥＳ−ＥＧＦ
Ｐベクター（Clonetech）に挿入した。ＨＥＫ２９３細胞を１０％ＦＢＳ入りの
ＤＭＥＭ中で８０％集密性まで増殖させ、上記ｃＤＮＡでトランスフェクトした
。１０μｇＤＮＡ／６×１０^６細胞の全てを単一プラスミドでのトランスフェク
ションに用いた。複数プラスミドの共トランスフェクションについて、同量の各
プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（BRL）を用いて、１０ｍｇＤＮＡの
全てにつき用いた。単一の細胞は、空冷アルゴンレーザにより供給される４８８
ｎｍ励起ラインを備えたEPICS Elite ESP フロー血球計算器を用いるＦＡＣＳに
より、Ｇ４１８なしの増殖培地を含有する一つの９６ウェルプレートの各ウェル
に分けた。４日の回復期の後、安定トランスフェクトした細胞経の選択のために
、Ｇ４１８を該培地に添加して、４００ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。ｃＤＮＡ
の安定発現は、ウェスターンブロットによる特異的タンパク質または配列タグの
検出によって確認した。

【００８２】 免疫沈降、ウェスターンブロット、およびＥＬＩＳＡ：ＡβおよびＰＳ１抗体は
特徴付けされている^６,２７。等量のタンパク質入りの細胞ライゼートは、抗体
およびタンパク質Ｇ−セファロースと、４℃にて２時間沈降させ、ビーズはＴＥ
ＮＴバッファー^１１で３回洗浄した。免疫沈降物は、４〜１２％ ＮｕＰａｇｅ
Ｂｉｓ−ＴｒｉｓゲルおよびＰＶＤＦ膜（Novex）、ペルオキシダーゼ−コンジ
ュゲーティド二次抗体（Vector）およびSuperSignal West Pico Luminol/Enhanc
er（Pierce）を用いるウェスターンブロットにより分析した。Ａβ１〜４０およ
びＡβ１〜４２についてのＥＬＩＳＡは、記載したごとく^２７行った。

【００８３】 参考文献： 1. Borchelt, D.R. et al Familial Alzheimer's disease-linked presenilin
1 variants elevate Abeta 1-42/1-40 ratio in vitro and in Vivo Neuron 17,
1005-1013 (1996). 2. Citron, M. et al. Mutant presenilins of Alzhelmer's disease increase
production of 42-residue amyloid beta-protein in both transfected cells
and transgenic mice. Nat. Med. 3, 67-72 (1997). 3. Doan, A. et al. Protein topology of presenilin 1. Neuron. 17, 1023-1
030 (1996). 4. Li, X & Greenwald, I. Membrane topology of the C. elegans SEL-12 pre
senilin. Neuron. 17, 1015-1021 (1996). 5. De Strooper, B. et al. Phosphorylation, subcellular localization, an
d membrane orientation of the Alzhelmer's disease-associated presenilins
. J. Biol. Chem. 272, 3590-3598 (1997). 6. Li, J. et al., Alzheilmer presenilins in the nuclear membrane, inter
phase kinetochores, and centrosomes suggest a role in chromosome segrega tion. Cell 90, 917-927 (1997). 7. Levitan, D. & Greenwald, I. Facilitation of lin, 12, mediated signal
ling by sel, 12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzhelmer's disease gene.
Nature 377, 351-4 (1995). 8. Li, X & Greenwald, I. HOP, 1, a Caenorhabditis elegans presenilin, a
ppears to be functionally redundant with SEL, 12 presenilin and to facil
itate LIN, 12 and GLP, 1 signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94,122
04-9 (1997). 9. Westlund, B. et al. Reverse genetic analysis of Caenorhabditis elega
ns presenilins reveals redundant but unequal roles for sel-12 and hop-1
in Notch-pathway signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2497-2502
(1999). 10. Levitan, D. et al. Assessment of normal and mutant human presenilin
function in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14
940-1494 (1996). 11. Wu, G. et al. Evidence for functional and physical association betwe
en Caenorhabditis elegans SEL, 10, a Cdc4p, related protein, and SEL, 12
presenilin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 15787-1 (1998). 12. Hubbard, E. J. et al. Sel, 10, a negative regulator of lin, 12 activ
ity in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the CDC4 family of pr
oteins. Genes. Dev 11, 3 182-93 (1997). 13. Selkoe, D. J. Physiological production of the b-amyloid protein and
the mechanism of Alzhelrner's disease. Trends Neurosci. 16, 403-409 (199
3). 14. Tyers, M. & Willems, A.R. One ring to rule a superfamily of E3 ubiqu
itin ligases. Science 284, 601-604 (1999). 15. Patton, E.E. et al., Combinatorial control in ubiquitin-dependent pr
oteolysis: don't Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (19
98). 16. Steiner, H. et al. Expression of Alzheimer's disease-associated pres
enilin-1 is controlled by proteolyilc degradation and complex formation.
J Biol. Chem. 273, 32322-32331 (1998). 17. Kim, T.W. et al. Endoproteolytic cleavage and proteasomal degradatio
n of presenilin 2 in transfected cells. J. Biol. Chem. 272, 11006-11010
(1997). 18. Neer E.J. et al. The ancient regulatory-protein family of WD-repeat
proteins. Nature 371, 297-300, (1994) 19. Sondek, J. et al. Crystal structure of a G-protein beta gamma dimmer
at 2.1A resolution. Nature 379, 369-374 (1996). 20. Ancolio, K. et al. Alpha-secretase-derived product of beta-amyloid p
recursor protein is decreased by presenilin 1 mutations linked to famili
al Alzheimer's disease. J. Neurochem. 69, 2494-2499 (1997). 21. Ward, C.L. et al. Degradation of CFTR by the ubiquitin-proteasome pa
thway. Cell 83, 121-127 (1995). 22. Johnston, J.A. et al. Aggresomes: a cellular response to misfolded p
roteins. J. Cell Biol. 143 1883-1898 (1998). 23. Kopito, R.R. ER quality control: the cytoplasmic connection. Cell. 8
8, 427-430 (1997). 24. Zhang, Z. et al. Destabilization of beta-catenin by mutations in pre
senilin-1 potentiates neuronal apoptosis. Nature. 395: 698-702 (1998). 25. Shirotani, K et al. Effects of presenilin N-terminal fragments on pr
oduction of amyloid b peptide and accumulation of endogenous presenilins
. Neurosci. Let. 262, 37-40 (1999). 26. De Strooper, B. et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the norma
l cleavage of amyloid precursor protein. Nature 391, 387-390 (1998). 27. Mehta, P.D. et al. Increased plasma amyloid beta protein 1-42 levels
in Down syndrome. Neurosci Lett 241, 13-16 (1998).

【００８４】 本発明は、前記説明および実施例に特に記載された以外でも実施することがで
きることは明らかであろう。 本発明の多数の修飾および変形が上記教示を考慮して可能であり、したがって
、本発明の範疇である。 本明細書に引用された全ての刊行物の全開示は、出典明示して本明細書の一部
とみなされる。

【００８５】

【表１】

【００８６】

【表２】

【００８７】

【表３】

【００８８】

【表４】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａおよび１Ｂ】 ＰＳ１−Ｃ−ＦＬＡＧ、６−ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ−
１０、およびＡＰＰ６９５ＮＬ−ＫＫ ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ
細胞におけるタンパク質発現を示すウェスターンブロット。

【図２Ａおよび２Ｂ】 ６．５および４．５Ｋｂ転写物のユビキチン発現を
示す普通の乳房ｓｅｌ−１０ ｍＲＮＡでプローブした複数の組織ノーザンブロ
ット（Ａ）および海馬ｓｅｌ−１０ ｍＲＮＡの脳内のみでの制限発現を示す複
数の組織ノーザンブロット（Ｂ）。

【図３Ａ−３Ｃ】 ＳＥＬ−１０−ｍｙｃがＰＳ１とコンプレックスを形成
することを論証するウェスターンブロット（Ａ）、プロテアソーム分解がラクタ
シスチンで阻害されたときしか、ＳＥＬ−１０−ｍｙｃ／ＰＳ１コンプレックス
が検出されないことを論証するウェスターンブロット（Ｂ）および、該ＳＥＬ−
１０−ｍｙｃ／ＰＳ１コンプレックスの抗−ｍｙｃ抗体での免疫沈降がＳＥＬ−
１０−ｍｙｃが先ず完全長かつ高分子量形態のＰＳ１と会合することを示すこと
を論証するウェスターンブロット（Ｃ）。

【図４Ａおよび４Ｂ】 ＳＥＬ−１０−ｍｙｃがＰＳ１のユビキチン化を刺
激することを論証するウェスターンブロット（Ａ）および、ＳＥＬ−１０−ｍｙ
ｃの増大した発現は、ＰＳ１−ＮＴＦおよびＰＳ１−ＣＴＦの減少と共に、完全
長ＰＳ１の量における対応する増加をもたらすことを論証するウェスターンブロ
ット（Ｂ）。

【図５Ａ−５Ｃ】 ＡＰＰでのＳＥＬ−１０−ｍｙｃのトランジェント共発
現がＡβ_１〜４０およびＡβ_１〜４２の産生を増加させることを論証するグラフ
（Ａ）、ＳＥＬ−１０−ｍｙｃまたはＰＳ１の安定発現は内在Ａβ産生を増大さ
せることを論証するグラフ（Ｂ）および、該安定細胞系におけるＡＰＰのトラン
ジェント発現はｐｃＤＮＡ３．１ベクター対照でトランスフェクトした細胞系に
おいて見られるレベルを超えて外来Ａβ産生を増大させることを論証するグラフ
（Ｃ）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 ４Ｈ０４５ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 マーク・イー・ガーニー アメリカ合衆国49506ミシガン州グラン ド・ラピッズ、サウス・イースト、ローズ ウッド・アベニュー910番 (72)発明者 リ・ジンヘ アメリカ合衆国49009ミシガン州カラマズ ー、オールド・オーク・サークル8548番 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB50 FB02 4B024 AA01 AA11 BA44 BA80 CA04 CA11 DA02 DA11 EA02 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B063 QA01 QA17 QA18 QA19 QQ08 QQ13 QR33 QR59 QR77 QR80 QS05 QS36 QX02 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA57X AA90X AA93Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA17 NA14 ZA16 ZC21 ZC41 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 EA20 FA72 FA74

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の： （ａ）配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列
   番号：７よりなる群から選択される完全アミノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０
   ポリペプチドまたはＡＴＣＣ寄託番号９８９７８に含有されるｃＤＮＡによりコ
   ードされるものをコードするヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０よりなる群から選
   択される完全アミノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドまたはＡＴＣ
   Ｃ寄託番号９８９７９に含有されるｃＤＮＡによりコードされるものをコードす
   るヌクレオチド配列； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列 よりなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一な配列を有するポリヌク
   レオチドを含む単離した核酸分子。
2. 【請求項２】 請求項１記載の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド
   配列を有するポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズする
   ポリヌクレオチドを含む単離した核酸分子。
3. 【請求項３】 １（ａ）のポリヌクレオチドが、配列番号：３の完全アミノ
   酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とする請
   求項１記載の核酸分子。
4. 【請求項４】 １（ａ）のポリヌクレオチド分子が配列番号：１の残基４５
   〜１９２８のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３記載の核酸分子
   。
5. 【請求項５】 １（ａ）のポリヌクレオチドが配列番号：４の完全アミノ酸
   配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求
   項１記載の核酸分子。
6. 【請求項６】 １（ａ）のポリヌクレオチド分子が配列番号：１の残基１５
   ０〜１９２８のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項５記載の核酸分
   子。
7. 【請求項７】 １（ａ）のポリヌクレオチドが配列番号：５の完全アミノ酸
   配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求
   項１記載の核酸分子。
8. 【請求項８】 １（ａ）のポリヌクレオチド分子が配列番号：１の残基２６
   ７〜１９２８のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項７記載の核酸分
   子。
9. 【請求項９】 １（ａ）のポリヌクレオチドが配列番号：６の完全アミノ酸
   配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求
   項１記載の核酸分子。
10. 【請求項１０】 １（ａ）のポリヌクレオチド分子が配列番号：１の残基２
    ９１〜１９２８のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項９記載の核酸
    分子。
11. 【請求項１１】 １（ａ）のポリヌクレオチドが配列番号：７の完全アミノ
    酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とする請
    求項１記載の核酸分子。
12. 【請求項１２】 １（ａ）のポリヌクレオチド分子が配列番号：１の残基３
    ０６〜１９２８のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１１記載の核
    酸分子。
13. 【請求項１３】 １（ｂ）のポリヌクレオチドが配列番号：８の完全アミノ
    酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とする請
    求項１記載の核酸分子。
14. 【請求項１４】 １（ｂ）のポリヌクレオチド分子が配列番号：２の残基１
    ８０〜１９４９のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１３記載の核
    酸分子。
15. 【請求項１５】 １（ｂ）のポリヌクレオチドが配列番号：９の完全アミノ
    酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とする請
    求項１記載の核酸分子。
16. 【請求項１６】 １（ｂ）のポリヌクレオチド分子が配列番号：２の残基２
    ７０〜１９４９のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１５記載の核
    酸分子。
17. 【請求項１７】 １（ｂ）のポリヌクレオチドが配列番号：１０の完全アミ
    ノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドをコードすることを特徴とする
    請求項１記載の核酸分子。
18. 【請求項１８】 １（ｂ）のポリヌクレオチド分子が配列番号：２の残基３
    ２７〜１９４９のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１７記載の核
    酸分子。
19. 【請求項１９】 請求項１記載の核酸分子を含むベクター。
20. 【請求項２０】 請求項１記載の核酸分子がｓｅｌ−１０ポリペプチドの発
    現用のプロモータに作動可能に連結されることを特徴とする請求項１９記載のベ
    クター。
21. 【請求項２１】 請求項１９記載のベクターを含む宿主細胞。
22. 【請求項２２】 該宿主が真核生物細胞であることを特徴とする請求項２１
    記載の宿主細胞。
23. 【請求項２３】 請求項２２記載の宿主細胞を培養し、次いで、当該ｓｅｌ
    −１０ポリペプチドを単離することを特徴とするｓｅｌ−１０ポリペプチドを得
    る方法。
24. 【請求項２４】 以下の： （ａ）配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列
    番号：７よりなる群から選択される完全アミノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０
    ポリペプチドまたはＡＴＣＣ寄託番号９８９７８に含有されるｃＤＮＡによりコ
    ードされるものをコードするヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０よりなる群から選
    択される完全アミノ酸配列を有するヒトｓｅｌ−１０ポリペプチドまたはＡＴＣ
    Ｃ寄託番号９８９７９に含有されるｃＤＮＡによりコードされるものをコードす
    るヌクレオチド配列； を含む単離したｓｅｌ−１０ポリペプチド。
25. 【請求項２５】 該ポリペプチドが配列番号：３のアミノ酸配列を含むこと
    を特徴とする請求項２４記載の単離したｓｅｌ−１０ポリペプチド。
26. 【請求項２６】 該ポリペプチドが配列番号：４のアミノ酸配列を含むこと
    を特徴とする請求項２４記載の単離したｓｅｌ−１０ポリペプチド。
27. 【請求項２７】 該ポリペプチドが配列番号：５のアミノ酸配列を含むこと
    を特徴とする請求項２４記載の単離したｓｅｌ−１０ポリペプチド。
28. 【請求項２８】 該ポリペプチドが配列番号：６のアミノ酸配列を含むこと
    を特徴とする請求項２４記載の単離したｓｅｌ−１０ポリペプチド。
29. 【請求項２９】 該ポリペプチドが配列番号：７のアミノ酸配列を含むこと
    を特徴とする請求項２４記載の単離したｓｅｌ−１０ポリペプチド。
30. 【請求項３０】 該ポリペプチドが配列番号：８のアミノ酸配列を含むこと
    を特徴とする請求項２４記載の単離したｓｅｌ−１０ポリペプチド。
31. 【請求項３１】 該ポリペプチドが配列番号：９のアミノ酸配列を含むこと
    を特徴とする請求項２４記載の単離したｓｅｌ−１０ポリペプチド。
32. 【請求項３２】 該ポリペプチドが配列番号：１０のアミノ酸配列を含むこ
    とを特徴とする請求項２４記載の単離したｓｅｌ−１０ポリペプチド。
33. 【請求項３３】 請求項２４記載のｓｅｌ−１０ポリペプチドに特異的に結
    合する単離した抗体。
34. 【請求項３４】 請求項１記載のｓｅｌ−１０単離核酸分子のいずれかを発
    現する変化したＡβプロセシングを有する細胞系。
35. 【請求項３５】 該Ａβプロセシングを増大することを特徴とする請求項３
    ４記載の細胞系。
36. 【請求項３６】 該Ａβプロセシングを低減することを特徴とする請求項３
    ４記載の細胞系。
37. 【請求項３７】 該細胞系が６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ１０／２である請求項３
    ４記載の細胞系。
38. 【請求項３８】 該細胞系が６ｍｙｃ−Ｎ−ｓｅｌ１０／６である請求項３
    ４記載の細胞系。
39. 【請求項３９】 以下の： （ａ）当該細胞系の試験培養および対照培養を得； （ｂ）該試験培養を試験剤に接触させ； （ｃ）ステップ（ｂ）の試験培養および対照培養により生成されるＡβ_{１〜４ ０} およびＡβ_１〜４２のレベルを測定し； （ｄ）ステップ（ｃ）で測定したＡβ_１〜４０およびＡβ_１〜４２のレベルか
    ら、該試験培養および該対照培養につきＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_{１〜 ４２} の比を算出し；次いで （ｅ）ステップ（ｄ）で該試験培養および該対照培養につき測定したＡβ_{１〜 ４０} ／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を比較するステップを含み、 これにより、該試験培養のＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比が
    該対照培養のＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比よりも高いか低い
    かの決定が該試験剤がＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を変化さ
    せたことを示す、請求項３４、３７および３８記載の細胞系のいずれかにおいて
    作成されたＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を変化させることが
    可能な剤を同定する方法。
40. 【請求項４０】 該試験剤によりＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_{１〜４ ２} の比を増大することを特徴とする請求項３９記載の方法。
41. 【請求項４１】 該試験剤によりＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_{１〜４ ２} の比を低減することを特徴とする請求項３９記載の方法。
42. 【請求項４２】 請求項３９記載の方法により同定された試験剤。
43. 【請求項４３】 該試験剤がＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の
    比を減少させることが可能であることを特徴とする請求項４２記載の試験剤。
44. 【請求項４４】 該試験剤によりＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_{１〜４ ２} の比が増大されることを特徴とする請求項４２記載の試験剤。
45. 【請求項４５】 以下の： （ａ）Ａβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を変化させることが可
    能な試験剤を同定し； （ｂ）該宿主にＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を変化させる
    のに有効な量の試験剤を投与するステップを含み、１以上のＡＰＰイソタイプを
    発現哺乳類宿主の組織もしくは体液中のＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_{１〜 ４２} の比を変化させる方法。
46. 【請求項４６】 Ａβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を増大す
    ることを特徴とする請求項４５記載の方法。
47. 【請求項４７】 Ａβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を低減す
    ることを特徴とする請求項４５記載の方法。
48. 【請求項４８】 １以上のＡＰＰイソタイプを発現哺乳類宿主の組織もしく
    は体液中のＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を変化させる方法で
    あって、該宿主にＡβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を変化させる
    のに有効な量の試験剤を投与することを特徴とする該方法。
49. 【請求項４９】 Ａβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を増大す
    ることを特徴とする請求項４８記載の方法。
50. 【請求項５０】 Ａβ_１〜４０／Ａβ_１〜４０＋Ａβ_１〜４２の比を低減す
    ることを特徴とする請求項４８記載の方法。