JP2003310282A

JP2003310282A - 化学物質の内分泌撹乱性を検出するための核酸、その核酸を含む核酸検出用プローブおよび核酸検出用プライマー、その核酸検出用プローブを具備するプローブ固定化チップ、その核酸に由来するペプチドおよびそのペプチドを認識する抗体、並びにそれらを用いた化学物質の内分泌撹乱性を検出する方法

Info

Publication number: JP2003310282A
Application number: JP2003010742A
Authority: JP
Inventors: Hidekazu Akaboshi; 英一赤星; Mitsuko Ishihara; 美津子石原
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 2002-02-19
Filing date: 2003-01-20
Publication date: 2003-11-05
Also published as: US20040002087A1

Abstract

(57)【要約】【課題】化学物質の内分泌撹乱性を特異的に検出する
ための方法、核酸、プローブおよびプライマー、プロー
ブ固定化チップ、並びに抗体を提供する。【解決手段】化学物質の内分泌撹乱性を検出するため
の核酸であって、配列番号１に記載の塩基配列およびそ
の相補的配列、配列番号３に記載の塩基配列およびその
相補的配列、配列番号４に記載の塩基配列およびその相
補的配列、配列番号５に記載の塩基配列およびその相補
的配列、配列番号１４に記載の塩基配列およびその相補
的配列、配列番号１５に記載の塩基配列およびその相補
的配列、配列番号２３に記載の塩基配列およびその相補
的配列、配列番号２７に記載の塩基配列およびその相補
配列、並びに配列番号２８に記載の塩基配列およびその
相補配列からなる群より選択される塩基配列。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、化学物質の内分泌
撹乱性を特異的に検出するための方法、核酸、プローブ
およびプライマー、プローブ固定化チップ、並びに抗体
に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、化学物質にホルモン類似作用や抗
ホルモン作用が見出された。これらの化学物質は内分泌
撹乱物質と呼ばれ、通称、環境ホルモンと呼ばれる。内
分泌撹乱物質は、生殖系をはじめ免疫系や神経系に変化
を引き起こす毒性を有することが明らかになっている。
現在、ダイオキシンをはじめとする７０種類以上の化学
物質が内分泌撹乱性を有すると疑われている。その他に
も、その毒性の不明な化学物質も数多く存在している。
また一方では、新規化学物質が日々開発されている。

【０００３】従来から使用される化学物質の内分泌撹乱
性の迅速な検出方法としては、例えば、ＤＮＡチップを
用いた方法が挙げられる（宝酒造社製、IntelliGene^TM
Human DNA CHIP for Endocline Disruption Study）。
この種のＤＮＡチップにおいて用いられる遺伝子プロー
ブは、核内レセプター遺伝子群、レセプター共役因子遺
伝子群、性腺分化遺伝子群、および細胞周期に関与する
遺伝子群などから選抜された既知遺伝子群である。しか
しながら、これらの遺伝子群は、化学物質の内分泌撹乱
性に対して特異的に応答する遺伝子ではない。そのた
め、従来の方法では、化学物質の内分泌撹乱性を特異的
に検出することは困難である。

【０００４】

【特許文献１】特表２００２−５２３１１２号公報

【０００５】

【特許文献２】特開２００２−１７３５５号公報

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記の状況に鑑み、本
発明の目的は、化学物質の内分泌撹乱性を特異的に検出
するための方法、核酸、プローブおよびプライマー、プ
ローブ固定化チップ、並びに抗体を提供することであ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の第１の態様に従
うと、化学物質の内分泌撹乱性を検出するための核酸で
あって、配列番号１に記載の塩基配列およびその相補的
配列、配列番号３に記載の塩基配列およびその相補的配
列、配列番号４に記載の塩基配列およびその相補的配
列、並びに配列番号５に記載の塩基配列およびその相補
的配列、配列番号１４に記載の塩基配列およびその相補
的配列、配列番号１５に記載の塩基配列およびその相補
的配列、配列番号２３に記載の塩基配列およびその相補
的配列、配列番号２７に記載の塩基配列およびその相補
配列、配列番号２８に記載の塩基配列およびその相補配
列からなる群より選択される塩基配列で示される核酸が
提供される。

【０００８】本発明の第２の態様に従うと、第１の態様
に従う塩基配列に含まれる連続した１５塩基から３０塩
基よりなる核酸、並びに、配列番号６により示される核
酸、配列番号７により示される核酸、配列番号８により
示される核酸、配列番号９により示される核酸、配列番
号１０により示される核酸、配列番号１１により示され
る核酸、配列番号１２により示される核酸、配列番号１
３により示される核酸、配列番号１７により示される核
酸、配列番号１８により示される核酸、配列番号１９に
より示される核酸、配列番号２０により示される核酸、
配列番号２１により示される核酸、配列番号２２により
示される核酸、配列番号２５により示される核酸および
配列番号２６により示される核酸からなる群より選択さ
れる核酸を含む核酸検出用プローブが提供される。

【０００９】本発明の第３の態様に従うと、第１の態様
に従う塩基配列に含まれる連続した１５塩基から３０塩
基よりなる核酸、並びに配列番号６により示される核
酸、配列番号７により示される核酸、配列番号８により
示される核酸、配列番号９により示される核酸、配列番
号１０により示される核酸、配列番号１１により示され
る核酸、配列番号１２により示される核酸、配列番号１
３により示される核酸、配列番号１７により示される核
酸、配列番号１８により示される核酸、配列番号１９に
より示される核酸、配列番号２０により示される核酸、
配列番号２１により示される核酸、配列番号２２により
示される核酸、配列番号２５により示される核酸および
配列番号２６により示される核酸からなる群より選択さ
れる核酸を含む核酸検出用プライマ−が提供される。

【００１０】本発明の第４の態様に従うと、基体と、前
記基体に固相化された、第２の態様に従う核酸検出用プ
ローブを少なくとも１種類具備するプローブ固定化チッ
プが提供される。

【００１１】本発明の第５の態様に従うと、化学物質の
内分泌撹乱性を検出する方法であって、（ａ）検体に対
して前記化学物質を作用させることと、（ｂ）前記化学
物質を作用させた後に前記検体から検体核酸を得ること
と、（ｃ）前記検体核酸と第２の態様に従う核酸検出用
プローブとを反応させることと、（ｄ）核酸検出用プロ
ーブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する
とにより前記標的核酸の発現程度を得ることと、（ｅ）
前記（ｄ）で得られた前記標的核酸の発現程度と、検体
に対して前記化合物を作用させない場合の前記標的核酸
の発現程度とを比較することによって、前記化学物質の
内分泌撹乱性を検出することと、を具備する方法が提供
される。

【００１２】本発明の第６の態様に従うと、化学物質の
内分泌撹乱性を検出する方法であって、（ａ）検体に対
して前記化学物質を作用させることと、（ｂ）前記化学
物質を作用させた後に前記検体から検体核酸を得ること
と、（ｃ）前記検体核酸を、第３の態様に従う核酸検出
用プライマーの２種類以上と核酸増幅用酵素とを用いて
増幅産物を得ることと、（ｄ）前記（ｃ）で得た増幅産
物を解析するとにより前記標的核酸の発現程度を得るこ
とと、（ｅ）前記（ｄ）で得られた前記標的核酸の発現
程度と、検体に対して前記化合物を作用させない場合の
前記標的核酸の発現程度とを比較することによって、前
記化学物質の内分泌撹乱性を検出することと、を具備す
る方法が提供される。

【００１３】本発明の第７の態様に従うと、配列番号
２、配列番号１６および配列番号２４の何れか１に記載
のアミノ酸配列により示されるペプチドが提供される。

【００１４】本発明の第８の態様に従うと、第７の態様
に従うペプチドを認識する抗体が提供される。

【００１５】また更に、本発明の第９の態様に従うと、
配列番号１、配列番号３、配列番号１５および配列番号
２３の何れか１に記載の塩基配列がコードするペプチド
と、それに対する抗体が提供される。

【００１６】また更に、本発明の第１０の態様に従う
と、基体と、前記基体に固相化された第８または第９の
態様に従う抗体を少なくとも１種類プローブとして具備
するプローブ固定化チップが提供される。

【００１７】また更に、本発明の第１１の態様に従う
と、化学物質の内分泌撹乱性を検出する方法であって、
（ａ）検体に対して前記化学物質を作用させることと、
（ｂ）前記化学物質を作用させた後に前記検体から検体
試料を得ることと、（ｃ）前記検体試料と、検出用プロ
ーブとしての第８または第９の態様に従う抗体とを反応
させることと、（ｄ）前記抗体と標的物質との結合を検
出することにより、前記標的物質の存在を検出すること
と、（ｅ）前記（ｄ）で得られた検出結果と、検体に対
して前記化学物質を作用させない場合の前記標的物質の
存在を検出した結果とを比較することによって、前記化
学物質の内分泌撹乱性を検出することと、を具備する方
法が提供される。

【００１８】

【発明の実施の形態】ここにおいて使用される「内分泌
撹乱物質」の語は、生体の恒常性、生殖、発生または行
動に関する種々の生体内ホルモンの合成、貯蔵、分泌、
体内輸送、受容体結合、ホルモン作用または排出等の諸
過程を阻害するまたは促進する外因性化学物質を指し、
外因性内分泌撹乱物質、内分泌撹乱物質、内分泌撹乱化
学物質、内分泌障害性物質または環境ホルモンなどとも
称される化学物質を示す語でもある。また、本明細書に
おいて、「外因性内分泌撹乱物質」、「内分泌撹乱物
質」、「内分泌撹乱化学物質」、「内分泌障害性物質」
および「環境ホルモン」の語は相互に交換可能に使用さ
れる。

【００１９】ここにおいて使用される「内分泌撹乱性」
の語は、内分泌系ホルモンの作用を撹乱することによっ
て、ホルモンにより維持される細胞の本来の恒常性を崩
壊する作用を指す。例えば、内分泌撹乱物質は、細胞核
内に存在する内分泌系ホルモンの受容体に作用し、それ
によって当該受容体に本来的に作用すべき内分泌系ホル
モンの作用を撹乱する。

【００２０】Ｉ．内分泌撹乱性によりその発現量が特異
的に影響を受ける遺伝子本発明の１側面に従うと、検体におけるその発現量が内
分泌撹乱性によって特異的に影響される遺伝子を含む核
酸が開示される。

【００２１】発明者らは、トリヨードチロニン存在下で
マウス神経芽細胞Ｎｅｕｒｏ２ａに対して、2,3,7,8-テ
トラクロロ−ベンゾ−ｐ−ジオキシン（2,3,7,8-tetrac
hloro-benzo-p-dioxin;以下、ＴＣＤＤと称する）を作
用させた場合と、前記細胞に対してＴＣＤＤを作用させ
なかった場合とについて、それぞれの細胞において発現
した前記ＲＮＡをディファレンシャル・ディスプレイ法
により比較した。その結果、ＴＣＤＤにより特異的にそ
の発現量が変化した遺伝子を明らかにした。

【００２２】ここで使用されたＮｅｕｒｏ２ａは、内分
泌系ホルモンに感受性のある細胞である。即ち、その細
胞の培養系に内分泌系ホルモンが存在している条件下で
は、そのホルモンの支配を受けて種々の細胞機能の発現
等が制御されるが、該培養系に内分泌系ホルモンが存在
していない条件下では該ホルモンによって該発現が制御
されない細胞である。従って、トリヨードチロニンを内
分泌系ホルモンとして存在させながらＮｅｕｒｏ２ａに
対して内分泌撹乱物質を作用させれば、前記内分泌撹乱
物質の内分泌撹乱性のみの作用を前記細胞に対して負荷
することが可能である。従って、このような条件による
解析により、その発現が内分泌撹乱性により特異的に影
響を受ける遺伝子が明らかにできた。

【００２３】本発明者らが特定した内分泌撹乱性によっ
て特異的にその発現量が減少された遺伝子を含む核酸
は、配列番号３に記載される塩基配列で示されるＮＤ８
３−３である。これはクローン名ＩＭＡＧＥ：３４９６
０２３(Database Accession No.BC007484、American Ty
pe Culture Collection(ATCC)寄託受付番号5670434)と
９４％の相同性を示すものである。

【００２４】また、本発明者らが特定した更なる核酸
は、配列番号５に記載される塩基配列により示されるＮ
Ｄ８３−４である。この塩基配列と８５％以上の相同性
を示すクローンは以下の６クローン、ＲＩＫＥＮ：Ｇ４
３１００４Ａ０７(Database Accession No.BB795235)、
ＩＭＡＧＥ：３１５６９４７(Database Accession No.A
W910492、ATCC 寄託受付番号5670434)、ＩＭＡＧＥ：５
４０２３８(Database Accession No.AI427138、ATCC 寄
託受付番号 997352)、ＩＭＡＧＥ：８０５６５１(Datab
ase Accession No.AI467121、ATCC 寄託受付番号106791
7)、ＵＩ−Ｍ−ＣＤ１−ａｚｓ−ｃ−１１−０−ＵＩ(D
atabase Accession No.BE953230)、マウスＲＰ２４−３
８８Ｐ１３(Database Accession No.101915)である。

【００２５】

【表１】

【００２６】また、本発明者らが特定した更なる核酸
は、配列番号１４に記載される塩基配列により示される
ＮＤ１１８−１である。この塩基配列はマウス11番染色
体上の１０７２１３０６７から１０７２１３３０４の領
域にコードされている。

【００２７】また、本発明者らが特定した更なる核酸
は、配列番号２７に記載される塩基配列により示される
ＮＤ８１８−２である。マウス３番染色体上１０５４７
６９５３から１０５４４７７２６０にコードされてお
り、同領域の近傍にはマウス仮想タンパク質ＭＧＣ：７
７２０(Accession No. NM030249)がコードされる。ＭＧ
Ｃ：７７２０はＮＤ８１８−２の最初の塩基対から２９
７３番目の塩基対までの領域が９９％の相同性を示す。

【００２８】また、本発明者らが特定した更なる核酸
は、配列番号２８に記載される塩基配列により示される
ＮＤ８７−３である。マウス１０番染色体上の７６４６
２８３から７６４６４３６の領域にコードされており、
同領域にはＥｎｓｅｍｂｌが予測した機能未知遺伝子
（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＫ０１４４０６）が
コードされていた。

【００２９】ＮＤ８３−３、ＮＤ８３−４、ＮＤ１１８
−１、ＮＤ８１８−２およびＮＤ８７−３の塩基配列で
示される核酸の発現の程度は、内分泌撹乱性を有する化
学物質により影響を受ける。従って、ＮＤ８３−３、Ｎ
Ｄ８３−４、ＮＤ１１８−１、ＮＤ８１８−２およびＮ
Ｄ８７−３の塩基配列で示される核酸の発現程度を解析
することによって、内分泌撹乱性に関して未知の化学物
質について、内分泌撹乱性の有無および内分泌撹乱性の
程度を解析することが可能である。従って、本発明の１
態様として提供される核酸、ＮＤ８３−３、ＮＤ８３−
４、ＮＤ１１８−１、ＮＤ８１８−２およびＮＤ８７−
３と同様の塩基配列で示される核酸は、内分泌撹乱性の
マーカーとして使用され得る。

【００３０】本発明の１態様として提供され得る化学物
質の内分泌撹乱性を検出するための核酸は、化学物質の
内分泌撹乱性を検出するための核酸であって、配列番号
１に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号３
に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号４に
記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号５に記
載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号１４に記
載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号１５に記
載の塩基配列およびその相補的配列、並びに配列番号２
３に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号２
７に記載の塩基配列およびその相補配列、配列番号２８
に記載の塩基配列およびその相補配列からなる群より選
択される塩基配列で示される核酸であればよい。

【００３１】ここで、配列番号３に記載の塩基配列は、
配列番号１の塩基配列の１９６９位から２５０９位まで
を含む配列である。また、配列番号５に記載の塩基配列
は、配列番号４の塩基配列の２６９位から６７８位まで
を含む配列である。

【００３２】また、化学物質の内分泌撹乱性を検出する
ための核酸は、配列番号１に記載の塩基配列と８５％か
ら１００％で相同性を有する核酸配列およびその相補的
配列、配列番号３に記載の塩基配列と８５％から１００
％で相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配
列番号４に記載の記載の塩基配列と８５％から１００％
で相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、並び
に配列番号５に記載の塩基配列と８５％から１００％で
相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番
号１４に記載の記載の塩基配列と８５％から１００％で
相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番
号１５に記載の記載の塩基配列と８５％から１００％で
相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、並びに
配列番号２３に記載の記載の塩基配列と８５％から１０
０％で相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、
配列番号２７に記載の塩基配列と８５％から１００％で
相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番
号２８に記載の塩基配列と８５％から１００％で相同性
を有する核酸配列およびその相補的配列からなる群より
選択される塩基配列で示される核酸であればよい。

【００３３】本発明の更なる１態様として提供され得る
化学物質の内分泌撹乱性を検出するための核酸は、配列
番号１に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番
号３に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号
４に記載の塩基配列およびその相補的配列、並びに、配
列番号５に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列
番号１４に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列
番号１５に記載の塩基配列およびその相補的配列、並び
に、配列番号２３に記載の塩基配列およびその相補的配
列、配列番号２７に記載の塩基配列およびその相補配
列、配列番号２８に記載の塩基配列およびその相補配列
からなる群より選択される塩基配列に含まれる連続した
１５塩基から３０塩基よりなる核酸であってよい。

【００３４】また、化学物質の内分泌撹乱性を検出する
ための核酸は、配列番号１に記載の塩基配列と８５％か
ら１００％で相同性を有する核酸配列およびその相補的
配列、配列番号３に記載の塩基配列と８５％から１００
％で相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配
列番号４に記載の記載の塩基配列と８５％から１００％
で相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列
番号５に記載の塩基配列と８５％から１００％で相同性
を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号１４
に記載の記載の塩基配列と８５％から１００％で相同性
を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号１５
に記載の記載の塩基配列と８５％から１００％で相同性
を有する核酸配列およびその相補的配列、並びに配列番
号２３に記載の記載の塩基配列と８５％から１００％で
相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番
号２７に記載の塩基配列と８５％から１００％で相同性
を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号２８
に記載の塩基配列と８５％から１００％で相同性を有す
る核酸配列およびその相補的配列からなる群より選択さ
れる塩基配列に含まれる連続した１５塩基から３０塩基
よりなる核酸であってもよい。

【００３５】ここにおいて使用される「核酸」の語は、
天然に存在する種々のＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプ
チド核酸、モルホリノ核酸、メチルホスフォネート核酸
およびＳ-オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類
似体などを指す。

【００３６】ここにおいて使用される「８５％から１０
０％で相同性を有する」の語は、２つの塩基配列が互い
に８５％から１００％に相同性であり、残りの０％から
２５％の塩基配列は、１以上の塩基が欠失されるか、お
よび／または１以上の塩基が置換されるか、および／ま
たは１以上の塩基が付加されるかによって、修飾されて
いることにより相同性を有していない部分であることを
示す。

【００３７】ここで、各配列中の「Ｎ」または「ｎ」は
アデニン、チミン、グアニンまたはシトシンの何れかの
ヌクレオチドでよい。

【００３８】ＩＩ．核酸検出用プローブ本発明の１側面に従うと、上述の化学物質の内分泌撹乱
性を検出するための核酸またはその一部は、化学物質の
内分泌撹乱性を検出するための核酸検出用プローブとし
て使用することが可能である。そのような化学物質の内
分泌撹乱性を検出するための核酸検出用プローブも本発
明の範囲内にある。

【００３９】本発明に従って、化学物質の内分泌撹乱性
を検出するために好ましい核酸検出用プローブは、配列
番号１に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番
号３に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号
４に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号５
に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号１４
に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号１５
に記載の塩基配列およびその相補的配列、並びに、配列
番号２３に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列
番号２７に記載の塩基配列およびその相補配列、配列番
号２８に記載の塩基配列およびその相補配列からなる群
より選択される塩基配列に含まれる連続した１５塩基か
ら３０塩基よりなる核酸を含む核酸検出用プローブであ
ってよい。

【００４０】また、化学物質の内分泌撹乱性を検出する
ための核酸検出用プローブは、配列番号１に記載の塩基
配列と８５％から１００％で相同性を有する核酸配列お
よびその相補的配列、配列番号３に記載の塩基配列と８
５％から１００％で相同性を有する核酸配列およびその
相補的配列、配列番号４に記載の記載の塩基配列と８５
％から１００％で相同性を有する核酸配列およびその相
補的配列、配列番号５に記載の塩基配列と８５％から１
００％で相同性を有する核酸配列およびその相補的配
列、配列番号１４に記載の記載の塩基配列と８５％から
１００％で相同性を有する核酸配列およびその相補的配
列、配列番号１５に記載の記載の塩基配列と８５％から
１００％で相同性を有する核酸配列およびその相補的配
列、並びに、配列番号２３に記載の記載の塩基配列と８
５％から１００％で相同性を有する核酸配列およびその
相補的配列、配列番号２７に記載の塩基配列と８５％か
ら１００％で相同性を有する核酸配列およびその相補的
配列、配列番号２８に記載の塩基配列と８５％から１０
０％で相同性を有する核酸配列およびその相補的配列か
らなる群より選択される塩基配列に含まれる連続した１
５塩基から３０塩基よりなる核酸を含んでいてもよい。

【００４１】また更に、化学物質の内分泌撹乱性を検出
するための核酸検出用プローブの好ましい例は、配列番
号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号
１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配
列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２
０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５、配列
番号２６に記載の塩基配列により示される核酸を含む。

【００４２】本発明の１側面に従うと、化学物質の内分
泌撹乱性を検出するための核酸検出用プローブは、所望
の標識物質を含んでいてもよい。また、化学物質の内分
泌撹乱性を検出するための核酸検出用プローブは、上述
の核酸に加えて更なる配列を含んでいてもよい。

【００４３】ＩＩＩ．核酸検出用プローブを用いた内分
泌撹乱性の検出方法このような核酸検出用プローブを用いることにより、次
のような手順によって化学物質の内分泌撹乱性を検出す
ることが可能である。まず、検査対象である化学物質を
検体に作用させる。次に、前記検体から検体核酸を調製
する。得られた検体核酸と、前記核酸検出用プローブと
を反応させる。検体核酸中に標的配列が含まれる場合に
は、ハイブリダイゼーションが生じる。続いて、このハ
イブリダイゼーションの有無および程度を検出する。こ
の結合の検出は、例えば、予め検出可能な標識物質によ
り標識した核酸検出用プローブを用いてハイブリダイゼ
ーションを行い、ハイブリダイゼーション後に前記標識
物質を検出することにより行うことが可能である。

【００４４】また、検査対象である化学物質の内分泌撹
乱性の有無および程度の判定は、前記化学物質を作用さ
せないこと以外は同様の条件で処理された検体から採取
された対照核酸を用いて得た検出結果と比較することに
よって行うことが可能である。また、そのような対照核
酸における結果との比較により予め閾値を設定してお
き、その閾値を越えるか否かによって検査対象である化
学物質の内分泌撹乱性の有無および程度の判定を行って
もよい。このような化学物質の内分泌撹乱性を検出する
方法も本発明の更なる１態様として提供される。

【００４５】ここで使用される「検体」の語は、検査対
象である化学物質を作用させるための生体を指す。例え
ば、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、ブタ、
ヒツジまたはサルなどの生物個体であってもよく、また
はヒトを含む動物生体に由来する培養細胞および組織で
あってもよい。

【００４６】また、検体として生物個体を使用する場合
には、検体核酸は、個体から得た血液、血清、リンパ液
および組織などから調製すればよい。その場合、必要に
応じて、ホモジネートおよび抽出等の必要な任意の前処
理を行ってもよい。このような前処理は、対象となる試
料に応じて当業者によって選択され得るであろう。また
検体が培養細胞または組織である場合、同様に前処理を
行ってから以下のような検体核酸の抽出を行っても、前
処理なしに抽出を行ってもよい。

【００４７】検体核酸は、使用した検体からそれ自身公
知の手段により調製すればよい。ここで使用される「検
体核酸」の語は、一般的には対象において発現されるｍ
ＲＮＡまたは全ＲＮＡを指す。対象から被検核酸を得る
工程はそれ自身公知の手段により行うことが可能であ
る。例えば、市販のキットを使用しても、オリゴｄＴカ
ラムなどの担体を用いる固液抽出法を使用しても、例え
ば、フェノールー−クロロホルム法等の液−液抽出法を
使用してもよいが、これに限定されるのもではない。

【００４８】また、検体核酸の量が少ないときには、必
要に応じてポリヌクレオチドを増幅する操作を行っても
よい。増幅操作は、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反
応(RT-PCR)およびポリメラーゼ連鎖反応（以下PCRと略
記する）などによって行ってよい。

【００４９】ここで使用される「標的配列」の語は、上
述した本発明に従う化学物質の内分泌撹乱性を検出する
ための核酸またはその一部分に対して相補的な配列であ
り、上述の本発明に従う核酸検出用プローブとハイブリ
ダイズすることが可能な配列である。

【００５０】また、上述の増幅操作において使用するプ
ライマーとして、後述する本発明の核酸検出用プライマ
ーを使用してもよい。

【００５１】ＩＶ．プローブ固定化チップ上述した本発明に従う核酸検出用プローブは、基板上に
固定化されてプローブ固定化チップとして提供されても
よい。また、そのようなプローブ固定化チップも本発明
の範囲内に含まれる。

【００５２】本発明の更なる側面に従うと、プローブ固
定化チップは、上述した核酸検出用プローブを、以下の
ような基板に固定化することにより製作することが可能
である。本発明に従って使用される基板の例は、多孔質
体、マイクロタイタープレート、ビーズ、球状物質、粒
子状物質、磁性体および磁気ビーズ等の基体などであ
る。また、核酸検出用プローブを固定化すべき基体の材
質、大きさおよび形状などは特に限定されるものではな
い。

【００５３】前記プローブ固定化チップを用いた試料物
質中の核酸の配列の検出は、例えば、検体から採取した
試料物質から核酸成分の抽出を行った後、前記試料核酸
とプローブ固定化チップとを接触させ、プローブ固定化
チップ上のプローブと試料核酸とのハイブリダイゼーシ
ョン反応を検知すればよい。

【００５４】前記プローブ固定化チップ上のプローブと
試料中の核酸成分とのハイブリダイゼーション反応を検
知するには、主に、（１）標識物質を用いる方法、
（２）電気化学的方法の２種類が考えられる。

【００５５】（１）の標識物質を用いる方法の場合に
は、試料核酸は、予めＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５若しく
はローダミンなどの蛍光色素、またはビオチン、ハプテ
ン、オキシダーゼ若しくはホスファターゼ等の酵素、ま
たはフェロセン若しくはキノン類等の電気化学的に活性
な物質で標識してもよい。或いは前述した物質で標識し
たセカンドプローブを用いることで検出を行ってもよ
い。複数の標識物質を同時に使用してもよい。

【００５６】（２）の電気化学的方法の場合、プローブ
を固定化する基体として導電性物質を用い、プローブ固
定化チップを電極として使用する。この電極を用いたハ
イブリダイゼーション反応の存在の検出は他の一般的な
電気化学的検出法と同じように、この電極の他に、対極
や参照極を使用してよい。参照極を配置する場合、例え
ば、銀／塩化銀電極や水銀／塩化水銀電極などの一般的
な参照極を使用し得る。異なる塩基配列を有するプロー
ブは、それぞれ別々の異なる導電性基体に固定化して同
一の基板などに配設されたチップを構成してよい。これ
により精度の高い測定を行うことが可能である。その場
合、各電極から得られる電気化学的信号がどのプローブ
に対応したものであるのか検知する。

【００５７】試料物質から抽出した核酸成分とプローブ
固定化チップに固定化されたプローブとのハイブリダイ
ゼーション反応は、例えば、以下のように行うことが望
ましい。即ち、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イ
オン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の
緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーショ
ン促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子Ｄ
ＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを
添加してもよい。ここに抽出した核酸成分を添加し、９
０℃以上で熱変性させればよい。プローブ固定化チップ
の挿入は、変性直後、或いは０℃に急冷後に行ってよ
い。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼ
ーション反応を行うことも可能である。反応中は、撹
拌、或いは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよ
い。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反
応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイ
ゼーション反応後、電極を取り出し洗浄を行う。洗浄に
は、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５
〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。

【００５８】（１）の標識物質を用いる方法の場合、ハ
イブリダイゼーション反応の検出は、標識の種類に応じ
た適宜の検出装置を用いて、試料中の標識された塩基配
列又は２次プローブ中の標識を検出することによって行
えばよい。標識が蛍光物質の場合には、例えば、蛍光検
出器を用いて標識を検出すればよい。

【００５９】（２）の電気化学的方法の場合、以下のよ
うな手順で検出を行えばよい。基体は洗浄後、電極表面
に形成した二本鎖部分に選択的に結合する二本鎖認識体
を作用させ、電気化学的な測定を行えばよい。ここで用
いられる二本鎖認識体は特に限定されるものではない
が、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレン
ジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレ
ーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、
トリスインターカレーターおよびポリインターカレータ
ー等を用いることが可能である。更に、これらのインタ
ーカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、
フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能で
ある。ＤＮＡ結合物質の濃度は、その種類によって異な
るが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で
使用する。この際には、イオン強度０．００１〜５の範
囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。電
極を二本鎖認識体と反応させた後、洗浄し、電気化学的
な測定を行えばよい。

【００６０】電気化学的な測定では、二本鎖認識体が電
気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、二本鎖認
識体に由来する反応電流値を測定すればよい。この際、
電位は定速で掃引するか、或いはパルスで印加するか、
或いは定電位を印加することができる。測定には、例え
ば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよ
びファンクションジェネレーター等の装置を用いて電
流、電圧を制御してもよい。得られた電流値を基に、検
量線から標的核酸の濃度が算出され得る。

【００６１】電極を用いた塩基配列検出装置は、例え
ば、核酸抽出部、核酸反応部、二本鎖認識体反応部、電
気化学測定部および洗浄部等から構成される。

【００６２】また、電気化学的な手法に基づくプローブ
固定化チップの他の例は、例えば、以下の文献に開示さ
れている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏｅｔａｌ．１９９
４，Ｗａｎｇｅｔａｌ．１９９８）。この文献は
引用することにより本明細書に組み込まれる。

【００６３】（Ａ）蛍光検出法により検出されるプロ
ーブ固定化チップの作製上述した本発明に従う核酸検出用プローブを基板に固定
化する。基板は、例えば、ガラス基板およびシリコン基
板等、従来用いられる何れの基板も使用することが可能
である。固定化手段は、スポッター等を使用する手段、
一般的な半導体技術を使用した手段等、当業者にそれ自
身公知の手段を用いて固定することが可能である。

【００６４】（Ｂ）電気化学的方法により検出されるプ
ローブ固定化チップの作製上述した本発明に従う核酸検出用プローブを、基板、例
えば、電極基板、に共有結合、イオン結合、物理吸着ま
たは化学吸着等によって固定化する。電気化学的方法に
より検出されるプローブ固定化チップの例は、平成８年
１０月２４日に登録された特許番号第２５７３４４３号
の自動遺伝子検出装置等であるが、これに限られるもの
ではない。当該文献は引用することによりここに組み込
まれる。

【００６５】本発明の更なる１側面に従うと、基板と、
前記基板に固定化された上述した本発明に従う核酸検出
用プローブとを具備するプローブ固定化チップを提供す
るものであり、そのようなプローブ固定化チップも本発
明の範囲内にある。

【００６６】本発明の１側面に従うと、上述の化学物質
の内分泌撹乱性を検出するための核酸またはその一部
は、化学物質の内分泌撹乱性を検出するための核酸検出
用プローブとして使用することが可能である。そのよう
な化学物質の内分泌撹乱性を検出するための核酸検出用
プローブも本発明の範囲内にある。

【００６７】以下に本発明の態様に従うプローブ固定化
チップの例を示す。

【００６８】第１の例図４に本発明の態様に従い使用され得るプローブ固定化
基体の第１の例を模式的に示した。第１の例であるプロ
ーブ固定化基体は、基体１６とその表面に存在する１以
上の固定化領域１５に夫々１以上で固定化されたプロー
ブ１１から１４を具備する（図４）。本発明の態様に従
うと、少なくとも、例えば、プローブ１１として第１の
プローブを固定化し、プローブ１２として第２のプロー
ブを固定化すればよい。

【００６９】このようなプローブ固定化基体は、例え
ば、それ自身公知の手段によりシリコン基板などの基体
に対してプローブを固定化することにより製造すること
が可能である。

【００７０】本発明の態様に従うと、１つの基体に配置
する固定化領域１５の数も、そこに固定化されるプロー
ブの数もこれに限定するものではなく、所望に応じて変
更してよい。また、複数種類の塩基配列をプローブとし
て１つの基体に配置してもよい。複数および／または複
数種類のプローブの基体への固相パターンは、当業者が
必要に応じて適宜設計変更することが可能である。この
ようなプローブ固定化基体は本発明の範囲内である。

【００７１】第２の例図５を用いて、本発明の態様において使用され得るプロ
ーブ固定化基体の第２の例を説明する。第２例であるプ
ローブ固定化基体は、基体２２に具備された１以上の電
極２３に夫々１以上で固定化されたプローブ１７から２
０を具備する（図５）。電極２３は、電気的情報を取り
出すためのパット２４に接続されている。

【００７２】このようなプローブ固定化基体は、例え
ば、それ自身公知の手段によりシリコン基板などの基体
に電極を配置し、その電極表面に対してプローブを固定
化することにより製造することが可能である。本発明の
態様に従うと、少なくとも、例えば、プローブ１７とし
て第１のプローブを固定化し、プローブ１８として第２
のプローブを固定化すればよい。

【００７３】本態様においては、電極の数を５としたが
１つの基体に配置する電極の数はこれに限定するもので
はない。また、電極の配置パターンも図５に示したもの
に限定されるものではなく、当業者が必要に応じて適宜
設計変更することが可能である。必要に応じて参照電極
および対極を設けてもよい。そのようなプローブ固定化
基体も本発明の範囲内である。

【００７４】上記の例に記載するような蛍光検出を行う
ためのプローブ固定化基体の場合は、上記の何れかの基
体に対してプローブを固定化すればよい。また、上記の
第２の例に記載するような電気化学的検出を行うための
プローブ固定化基体の場合は、上記の何れかの基体に電
気化学的な検出が可能であるように電極を配置し、その
電極上にプローブを固定化すればよい。

【００７５】Ｖ．核酸検出用プライマー本発明の１側面に従うと、上述の化学物質の内分泌撹乱
性を検出するための核酸またはその一部は、化学物質の
内分泌撹乱性を検出するための核酸検出用プライマーと
して使用することも可能である。そのような化学物質の
内分泌撹乱性を検出するための核酸検出用プライマーも
本発明の範囲内にある。

【００７６】本発明に従って、化学物質の内分泌撹乱性
を検出するために好ましい核酸検出用プライマーは、配
列番号１に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列
番号３に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番
号４に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号
５に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号１
４に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号１
５に記載の塩基配列およびその相補的配列、並びに、配
列番号２３に記載の塩基配列およびその相補的配列、配
列番号２７に記載の塩基配列およびその相補配列、配列
番号２８に記載の塩基配列およびその相補配列からなる
群より選択される塩基配列に含まれる連続した１５塩基
から３０塩基よりなる核酸を含む核酸検出用プライマー
であってよい。

【００７７】また、化学物質の内分泌撹乱性を検出する
ための核酸検出用プライマーは、配列番号１に記載の塩
基配列と８５％から１００％で相同性を有する核酸配列
およびその相補的配列、配列番号３に記載の塩基配列と
８５％から１００％で相同性を有する核酸配列およびそ
の相補的配列、配列番号４に記載の記載の塩基配列と８
５％から１００％で相同性を有する核酸配列およびその
相補的配列、配列番号５に記載の塩基配列と８５％から
１００％で相同性を有する核酸配列、配列番号１４に記
載の記載の塩基配列と８５％から１００％で相同性を有
する核酸配列およびその相補的配列、配列番号１５に記
載の記載の塩基配列と８５％から１００％で相同性を有
する核酸配列およびその相補的配列、並びに配列番号２
３に記載の記載の塩基配列と８５％から１００％で相同
性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号２
７に記載の塩基配列と８５％から１００％で相同性を有
する核酸配列およびその相補的配列、配列番号２８に記
載の塩基配列と８５％から１００％で相同性を有する核
酸配列およびその相補的配列からなる群より選択される
塩基配列に含まれる連続した１５塩基から３０塩基より
なる核酸を含んでいてもよい。

【００７８】また更に、化学物質の内分泌撹乱性を検出
するための核酸検出用プライマーの好ましい例は、ＮＤ
８３−３を検出するためには、配列番号６、配列番号
７、配列番号１０、配列番号１１に記載の塩基配列によ
り示される核酸が含まれる。また、より好ましくは配列
番号６と配列番号７、配列番号１０と配列番号１１を、
それぞれ、フォワードプライマーとリバースプライマー
として使用する。

【００７９】ＮＤ８３−４を検出するために好ましく
は、配列番号８、配列番号９、配列番号１２および配列
番号１３に記載の塩基配列により示される核酸が含まれ
る。また、より好ましくは配列番号８と配列番号９、配
列番号１２と配列番号１３を、それぞれフォワードプラ
イマーとリバースプライマーとして使用する。

【００８０】ＮＤ１１８−１を検出するために好ましく
は、配列番号１７、配列番号１８に記載の塩基配列によ
り示される核酸が含まれる。より好ましくは配列番号１
７と配列番号１８をフォワードプライマーとリバースプ
ライマーとして使用する。

【００８１】ＮＤ８１８−２を検出するために好ましく
は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および
配列番号２２に記載の塩基配列により示される核酸が含
まれる。また、より好ましくは配列番号１９と配列番号
２０、および配列番号２１と配列番号２２を、それぞれ
フォワードプライマーとリバースプライマーとして使用
する。

【００８２】ＮＤ８７−３を検出するために好ましく
は、配列番号２５および配列番号２６に記載の塩基配列
により示される核酸が含まれる。より好ましくは配列番
号２５と配列番号２６を、それぞれフォワードプライマ
ーとリバースプライマーとして使用する。

【００８３】本発明の１側面に従うと、化学物質の内分
泌撹乱性を検出するための核酸検出用プライマーは、所
望の標識物質を含んでいてもよい。また、化学物質の内
分泌撹乱性を検出するための核酸検出用プライマーは、
上述の核酸に加えて更なる配列を含んでいてもよい。

【００８４】ＶＩ．核酸検出用プライマーを用いた内分
泌撹乱性の検出方法このような核酸検出用プライマーを用いることにより、
次のような手順によって化学物質の内分泌撹乱性を検出
することが可能である。まず、検査対象である化学物質
を検体に作用させる。次に、前記検体から検体核酸を調
製する。得られた検体核酸を上記の本発明に従うプライ
マーと、核酸増幅用酵素を用いて増幅する。次に、得ら
れた増幅産物と、前記化学物質を作用させないこと以外
は同様の条件で処理された検体から採取された対照核酸
から得た対照増幅産物とを比較すればよい。

【００８５】ここで使用される「検体」の語は、検査対
象である化学物質を作用させるための生体を指す。例え
ば、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、ブタ、
ヒツジまたはサルなどの生物個体であってもよく、また
はヒトを含む動物生体に由来する培養細胞および組織で
あってもよい。

【００８６】また、検体として生物個体を使用する場合
には、検体核酸は、個体から得た血液、血清、リンパ液
および組織などから調製すればよい。その場合、必要に
応じて、ホモジネートおよび抽出等の必要な任意の前処
理を行ってもよく、このような前処理は、対象となる試
料に応じて当業者によって選択され得るであろう。また
検体が培養細胞または組織である場合、同様に前処理を
行ってから以下のような検体核酸の抽出を行っても、前
処理なしに抽出を行ってもよい。

【００８７】検体核酸は、使用した検体からそれ自身公
知の手段により調製すればよい。ここで使用される「検
体核酸」の語は、一般的には対象において発現されるｍ
ＲＮＡまたは全ＲＮＡを指す。対象から被検核酸を得る
工程はそれ自身公知の手段により行うことが可能であ
る。例えば、市販のキットを使用しても、オリゴｄＴカ
ラムなどの担体を用いる固液抽出法を使用しても、例え
ば、フェノールー−クロロホルム法等の液−液抽出法を
使用してもよいが、これに限定されるのもではない。

【００８８】ここで使用され得る核酸増幅用酵素は、核
酸を増幅するために使用される何れかの酵素であればよ
い。例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写活性を有
するＤＮＡポリメラーゼなどであってよい。

【００８９】ＶＩ．内分泌撹乱性によりその発現量が特
異的に影響を受けるペプチド本発明の１側面に従うと、検体におけるその発現量が内
分泌撹乱性によって特異的に影響される遺伝子に由来す
るペプチドも提供される。そのようなペプチドも化学物
質の内分泌撹乱性の検出に利用することが可能である。

【００９０】ここで使用される「ペプチド」の語は、複
数のアミノ酸同士がペプチド結合により互いに連結され
たものを示し、少数のアミノ酸がペプチド結合で繋がっ
たペプチド、多数のアミノ酸がペプチド結合で繋がった
ポリペプチド、および単一または複数のポリペプチドか
らなる蛋白質を総括的に指し示す。

【００９１】本発明に従うと、化学物質の内分泌撹乱性
を検出するためのペプチドは、配列番号１に記載の塩基
配列、配列番号３に記載の塩基配列、配列番号１５に記
載の塩基配列、並びに、配列番号２３に記載の塩基配列
からなる群より選択される塩基配列がコードする配列番
号２、配列番号１６並びに配列番号２４のペプチドであ
ればよい。

【００９２】また、配列番号１に記載の塩基配列と８５
％から１００％で相同性を有する塩基配列、配列番号３
に記載の塩基配列と８５％から１００％で相同性を有す
る塩基配列、配列番号４に記載の記載の塩基配列と８５
％から１００％で相同性を有する塩基配列、配列番号５
に記載の塩基配列と８５％から１００％で相同性を有す
る塩基配列、配列番号１４に記載の記載の塩基配列と８
５％から１００％で相同性を有する塩基配列、配列番号
１５に記載の記載の塩基配列と８５％から１００％で相
同性を有する塩基配列、並びに配列番号２３に記載の記
載の塩基配列と８５％から１００％で相同性を有する塩
基配列からなる群より選択される塩基配列で示される核
酸がコードするペプチドであってもよい。

【００９３】更に、化学物質の内分泌撹乱性を検出する
ためのペプチドは、上記のペプチドを含む蛋白質であっ
てもよい。

【００９４】（１）ＮＤ８３−３がコードするペプチド
の作製本発明の１側面に従う化学物質の内分泌撹乱性を検出す
るためのペプチドは、例えば、以下のように作製するこ
とが可能である。

【００９５】ＮＤ８３−３がコードするペプチドは、配
列番号１によって提供される核酸配列を用いて組換えＤ
ＮＡ技術を使用して取得することが可能である。例え
ば、配列番号１に含まれるペプチドの翻訳領域をｐＧＥ
Ｘ、ｐＥＴ、ｐＹＥＳなどの公知の発現ベクターに組み
換えることによって、大腸菌などの原核生物や酵母、昆
虫細胞、哺乳類細胞および植物細胞などの真核細胞で、
ＮＤ８３−３がコードするペプチドを大量に作製するこ
とができる。このとき得られるペプチドは発現ベクター
のシステムによっては他のタンパク質との融合ペプチド
であってもよい。

【００９６】或いは、配列番号１で提供される核酸配列
をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩなどのベクターに組み込
みインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型
としてインビトロ翻訳によってＮＤ８３−３がコードす
るペプチドを作製してもよい。また、配列番号１によっ
て提供されるアミノ酸配列にもとづき化学合成によって
ペプチドを合成することもできる。

【００９７】また、同様にＮＤ８１８−２およびＮＤ８
７−３がコードするペプチドを、それぞれ、配列番号１
５および配列番号２３に示される塩基配列を基に作製す
ることが可能である。

【００９８】また、他のそれ自身公知の方法により、配
列番号１、配列番号３、配列番号１５および配列番号２
３を基にして所望のペプチドを作製することも可能であ
る。このようなペプチドも本発明の範囲内にある。

【００９９】配列番号２、配列番号１６および配列番号
２４に示されるアミノ酸配列は、上記のようにして得ら
れるペプチドの例である。

【０１００】また、更に、本発明の更なる側面によれ
ば、上述のペプチドを認識するポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体も提供される。例えば、そのよう
なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、そ
れ自身公知の方法により作製することが可能である。ポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体をそれぞれ
作製する方法の例を以下に示す。

【０１０１】（２）ペプチドを認識するポリクローナル
抗体の作製上記（１）の「ＮＤ８３−３がコードするペプチドの作
製」に記載の方法により取得したペプチドを抗原とし
て、たとえばウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスタ
ーなどに投与する。抗原として投与するペプチドは、牛
チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結合させたも
のを用いてもよい。抗原の投与は、１回目の投与の後１
〜２週間おきに３〜１０回行い、各投与後３〜７日目に
採血して、血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵
素免疫測定法などで確認する。血清が充分な抗体価を示
した動物から血清を取得し、分離、精製することでポリ
クローナル抗体を取得する。抗原として使用したペプチ
ドが他のタンパク質との融合ペプチドであった場合に
は、たとえばペプチドに融合したタンパク質部分を固定
化したアフィニティーカラムなどを使用してペプチド部
以外を認識する抗体を除く必要がある。

【０１０２】（３）ペプチドを認識するモノクローナル
抗体の作製（１）の「ＮＤ８３−３がコードするペプチドの作製」
で取得したペプチドを抗原として免疫したマウスの脾臓
細胞と骨髄腫細胞を細胞融合して、ハイブリドーマ群を
作製する。（１）で作製したペプチドを、例えば、酵素
免疫測定法用のマイクロタイタープレートなどに固定化
し、アッセイプレートを作製する。作製したハイブリド
ーマ群から、上記のアッセイプレートを使用して、ペプ
チドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマ
のみを選定する。抗原として使用したペプチドが他のタ
ンパク質との融合ペプチドであった場合には、ペプチド
に融合したタンパク質部分のみを固定化したアッセイプ
レートを作製して、融合した蛋白質部分を認識する抗体
を除く必要がある。得られたハイブリドーマは、例えば
限界希釈法などでクローニングした後、マウス腹腔に注
射して、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗
体を得る。

【０１０３】本発明の更なる側面に従うと、上述のペプ
チド並びにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体からなる群より選択されたものを利用して、それに対
して特異的に結合する抗原を検出することによって、化
学物質の内分泌撹乱性を検出する方法も提供される。

【０１０４】ここで使用される「検体試料」の語は、検
体から採取された所望の試料であればよい。例えば、検
体が個体である場合、その個体から得た血液、血清、リ
ンパ液および組織などであってよく、また、培養細胞、
培養組織およびそれらの培養液であってもよい。また、
それらは必要に応じて、ホモジネートおよび抽出等の必
要な任意の前処理を行っておいてもよい。このような前
処理は、対象となる試料に応じて当業者によって選択さ
れ得るであろう。

【０１０５】そのような方法は以下のように行うことと
が可能である。まず、検体に対して化学物質を作用さ
せ、その後に前記検体から検体試料を得る。次に、前記
検体試料と、前記ペプチドを認識するポリクローナル抗
体およびモノクローナル抗体からなる群より選択された
少なくとも１の検出用プローブを反応させる。反応後、
前記検出用プローブと標的物質との反応を検出するとに
より前記標的物質の存在を検出する。この検出によって
得られた検出結果と、検体に対して前記化合物を作用さ
せない場合の前記標的物質の存在の検出結果とを比較す
ることによって、前記化学物質の内分泌撹乱性を検出す
ることが可能になる。

【０１０６】このような検出は、上記の抗体を基体に固
相化することにより作製したプローブ固相化チップ（一
般的に、プロテインチップと称される）を用いて行うこ
とも可能である。これにより、そのようなペプチドを簡
便に検出することが可能になる。このようなプローブ固
相化チップも本発明の範囲内に含まれる。そのようなプ
ローブ固相化チップは以下のように作製することが可能
である。

【０１０７】（４）プロテインチップの作製上記の（２）「ペプチドを認識するポリクローナル抗体
の作製」または（３）「ペプチドを認識するモノクロー
ナル抗体の作製」に記載した方法で得られた抗体を基板
上、例えばガラス基板上に市販のスポッタ−を用いて集
積化し、化学物質の内分泌撹乱性を検出することが可能
なプローブ固定化チップを作製できる。

【０１０８】

【実施例】例１：ＴＣＤＤ応答性の高い遺伝子の検索（１）Ｎｅｕｒｏ２ａの培養まず、マウス神経芽細胞Ｎｅｕｒｏ２ａの培養に使用す
るためのトリヨードチロニン除去牛胎児血清を調製し
た。まず、陰イオン交換樹脂ＡＧ１−Ｘ８と牛胎児血清
とを、血清１ｍＬ当たり樹脂５０ｍｇの割合で混合し、
室温で５時間インキュベートした。続いて、１０００×
ｇで１０分間遠心して樹脂を除去した。続いて、新しい
前記樹脂を血清１ｍＬ当たり樹脂５０ｍｇの割合で添加
し、更に室温で１８時間インキュベートした。その後、
１０００×ｇおよび３０，０００×ｇでそれぞれ２０分
間の遠心を行い、樹脂を完全に除去した。次に、０．２
２μｍ孔サイズのフィルターにより滅菌を行い、トリヨ
ードチロニン除去牛胎児血清を調製した。

【０１０９】Ｎｅｕｒｏ２ａの培養に使用したＤＦ培地
は、上記の方法により得られたトリヨードチロニン除去
牛胎児血清を１０％で含むダルベッコＭＥＭ培地とハム
培地を１：１の割合で混合することにより調製した。

【０１１０】まず、Ｎｅｕｒｏ２ａを、ＤＦ培地中で３
７℃、５％二酸化炭素存在下で１日間培養した。次に、
３０ｎＭのトリヨードチロニンをその培養液に添加し、
３７℃、５％二酸化炭素存在下で３日間培養した。この
培養の後、得られた細胞を２つの培養容器に分注するこ
とにより２つの区に分けた。片方の区には、2,3,7,8-テ
トラクロロ−ベンゾ−ｐ−ジオキシン（2,3,7,8-tetrac
hloro-benzo-p-dioxin;以下、ＴＣＤＤと称する）を終
濃度が１０ｎＭとなるように加えた（以下、これをＴＣ
ＤＤ添加区と称する）。これに対してもう一方の区には
ＴＣＤＤを加えなかった（以下、これをＴＣＤＤ未添加
区と称する）。これら２つの区のＮｅｕｒｏ２ａを２４
時間培養した。

【０１１１】（２）ＴＣＤＤ添加区およびＴＣＤＤ未添
加区において発現された遺伝子の比較上記（１）に記載の方法により培養した２つの条件の区
（ＴＣＤＤ添加区およびＴＣＤＤ未添加区）の細胞にお
いて発現された遺伝子をディファレンシャル・ディスプ
レイ法を用いて比較した。

【０１１２】まず、上記（１）に記載の２つの区の細胞
から、それぞれ全ＲＮＡを抽出した。この抽出は、ＲＮ
ＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ファルマシア社
製）を用いて、付属のマニュアルに従って行った。この
抽出により得られた全ＲＮＡから、ＤＮＡを除去するた
めにＤＮａｓｅＩを処理した。その後、得られた溶液中
に含まれる全ＲＮＡ量を分光光度計で測定し、１μＬ当
たりのＲＮＡが２５０ｐｍｏｌとなるように濃度を調節
した。

【０１１３】蛍光ディファレンシャル・ディスプレイ法
は、ＴａｋａｒａＦＤＤＫｉｔＦｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｉｎＶｅｒｓｉｏｎ１．１（宝酒造社製）を用い
て、付属のマニュアルに従って行った。

【０１１４】全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するためのプ
ライマーには、アンカープライマーとして設計された前
記キット付属のＤｏｗｎｓｔｒｅｅｍＰｒｉｍｅｒ
Ｎｏ．１およびＮｏ．８、即ち、（ｄＴ）プライマーを
用いた。

【０１１５】ＰＣＲには、ｃＤＮＡ合成時と同じアンカ
ープライマー（即ち、ＤｏｗｎｓｔｒｅｅｍＰｒｉｍ
ｅｒＮｏ．１およびＮｏ．８；これは（ｄＴ）プライ
マーである）を下流プライマーとして使用した。上流プ
ライマーには、キットに付属のランダムプライマーであ
るＵｐｓｔｒｅａｍＰｒｉｍｅｒＮｏ．１からＮ
ｏ．２４までの２４種類のプライマーを使用した。

【０１１６】前記（１）ＴＣＤＤ添加区とＴＣＤＤ未添
加区から抽出した全ＲＮＡに対して、上記のプライマー
を用いてｃＤＮＡを合成し、更に前記プライマーを用い
てＰＣＲを行った後、４％のポリアクリルアミドゲルで
電気泳動を行った。この電気泳動によって、ＰＣＲの増
幅産物は分子量に基付いて分離された。分離後、ゲル中
のポリヌクレオチドを蛍光イメージスキャナにより可視
化した。その状態で１０ｎＭのＴＣＤＤ添加区とＴＣＤ
Ｄ未添加区を比較し、濃さに違いのあるバンドをゲルか
ら切り出した。切り出して得たバンドを含むゲルに、滅
菌水を加え、室温に３０分以上放置した。その後、これ
に対して１００℃で１０分間の熱抽出を行い、ポリヌク
レオチドを回収した。更に上述に記載の条件で再増幅を
行い、アガロースゲルを用いた電気泳動により精製を行
った。得られた７つの遺伝子断片の塩基配列を決定し
た。得られた遺伝子断片であるポリヌクレオチドを、そ
れぞれ、ＮＤ８１−１、ＮＤ８３−２、ＮＤ８３−３、
ＮＤ８３−４、ＮＤ１１８−１、ＮＤ８１８−２および
ＮＤ８７−３と命名した。

【０１１７】（３）ＮＤ８３−３、ＮＤ８３−４、ＮＤ
１１８−１、ＮＤ８１８−２およびＮＤ８７−３の配列上記（２）で決定したＮＤ８３−３、ＮＤ８３−４、Ｎ
Ｄ１１８−１、ＮＤ８１８−２およびＮＤ８７−３の塩
基配列をそれぞれ配列番号３、配列番号５、配列番号１
４、配列番号２７および配列番号２８に示す。これらを
特異的に増幅できるＰＣＲプライマーの例として次のプ
ライマーを設計した。

【０１１８】ＮＤ８３−３を増幅するためのＰＣＲプラ
イマーは、上流プライマーが配列番号６に記載の塩基配
列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマーが
配列番号７に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
である。

【０１１９】ＮＤ８３−４を増幅するためのＰＣＲプラ
イマーは上流プライマーが配列番号８に記載の塩基配列
を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマーが配
列番号９に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドで
ある。

【０１２０】ＮＤ１１８−１を増幅するためのＰＣＲプ
ライマーは上流プライマーが配列番号１７に記載の塩基
配列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマー
が配列番号１８に記載の塩基配列を有するポリヌクレオ
チドである。

【０１２１】ＮＤ８１８−２を増幅するためのＰＣＲプ
ライマーは上流プライマーが配列番号１９に記載の塩基
配列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマー
が配列番号２０に記載の塩基配列を有するポリヌクレオ
チドである。

【０１２２】ＮＤ８７−３を増幅するためのＰＣＲプラ
イマーは上流プライマーが配列番号２５に記載の塩基配
列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマーが
配列番号２６に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチ
ドである。

【０１２３】新たに、上記（１）に記載の方法と同じ条
件で、但し、ＴＣＤＤ添加濃度は０、１０および１００
ｎＭでＮｅｕｒｏ２ａを培養した。それらの各区につい
て全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡから（ｄＴ）
プライマーを用いて逆転写反応を行った後で、ＰＣＲを
行った。このＰＣＲでは、上記のＮＤ８３−３、ＮＤ８
３−４、ＮＤ１１８−１、ＮＤ８１８−２およびＮＤ８
７−３に特異的なＰＣＲプライマーをそれぞれ用いて増
幅した。結果を図１に示す。

【０１２４】図１から明かであるように、ＮＤ８３−
３、ＮＤ８３−４、ＮＤ１１８−１、ＮＤ８１８−２お
よびＮＤ８７−３は前記ＰＣＲによって特異的に増幅さ
れた。ＮＤ８３−３およびはＮＤ８３−４は、１０ｎＭ
ＴＣＤＤの添加によって発現量は減少した（図１）更
に、１００ｎＭのＴＣＤＤを添加すると１０ｎＭを添加
した場合よりも発現量は減少した（図１）。従って、Ｎ
Ｄ８３−３およびＮＤ８３−４はＴＣＤＤ応答性である
ことが確認できた。またＮＤ１１８−１およびＮＤ８７
−３は、１０ｎＭＴＣＤＤの添加によって発現量は減少
した（図１）。ＮＤ８１８−２は、１０ｎＭＴＣＤＤの
添加によって発現量は増加した（図１）。従って、ＮＤ
１１８−１、ＮＤ８１８−２およびＮＤ８７−３はＴＣ
ＤＤ応答性であることが確認できた。

【０１２５】本発明の態様に従うとＴＣＤＤ応答性の遺
伝子が提供される。また、その遺伝子の核酸配列を基
に、化学物質の内分泌核酸作用を特異的に検出するため
の核酸検出用プライマ−が提供された。

【０１２６】（４）ＴＣＤＤ応答遺伝子の選抜上記（２）で得られた遺伝子断片群についてＴＣＤＤ応
答性を比較した。

【０１２７】まず、上記（２）で得られた塩基配列を基
に、各遺伝子断片を特異的に増幅できるＰＣＲプライマ
ーを設計した。

【０１２８】一方、上記（１）と同じ条件で、但し、Ｔ
ＣＤＤ添加濃度は０、１０および１００ｎＭでＮｅｕｒ
ｏ２ａを培養した。それらの各区について全ＲＮＡを抽
出した。抽出した全ＲＮＡから（ｄＴ）プライマーを用
いて逆転写反応を行った。その後、各遺伝子断片を特異
的に増幅できるＰＣＲプライマーを用いて各遺伝子断片
を増幅した。その増幅産物を電気泳動し、得られたバン
ドを比較することによって、ＴＣＤＤによる発現量を比
較した。

【０１２９】ＴＣＤＤに対する応答性の見られた遺伝子
断片のうちの７つについて、その結果を図２に示す。図
２に示すように、ＮＤ８３−３、ＮＤ８３−４、ＮＤ１
１８−１、ＮＤ８１８−２およびＮＤ８７−３の５遺伝
子は、ＴＣＤＤ添加によりその発現量が大きく変化して
いた。従って、ＮＤ８３−３、ＮＤ８３−４、ＮＤ１１
８−１、ＮＤ８１８−２およびＮＤ８７−３はＴＣＤＤ
応答性の高い遺伝子断片であるので、化学物質の内分泌
撹乱性の判定に使用可能な遺伝子マーカーとして選抜し
た。

【０１３０】本発明の態様に従うと、化学物質の内分泌
核酸作用を特異的に検出するための核酸検出用プライマ
−が提供された。

【０１３１】例２：ＮＤ８３−３、ＮＤ８３−４、ＮＤ
１１８−１、ＮＤ８１８−２およびＮＤ８７−３の同定例１で塩基配列を決定した遺伝子断片のうち、ＮＤ８３
−３およびＮＤ８３−４について相同性検索を行った。
相同性検索は、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）の
データベースに対して、ＦＡＳＴＡプログラムを実行す
ることにより行った。その結果、ＮＤ８３−３と８５％
以上の相同性を示したのは、ＩＭＡＧＥ：３４９６０２
３のみであった。その相同性は９４％である。また、こ
のクローンは、ＮＩＨ（National Institute of Healt
h;国立衛生研究所）が登録したＥＳＴ（Expressed Sequ
ence Tags;発現配列タグ）クローンであり、遺伝子の機
能は未知であった。この同定から明らかにされたＮＤ８
３−３のｃＤＮＡ全長の塩基配列を配列番号１に記載し
た。また、このｃＤＮＡがコードするアミノ酸は配列の
１例を配列番号２に記載した。

【０１３２】また、ＮＤ８３−４と８５％以上の相同性
を示すクローンは６クローン存在した。ＲＩＫＥＮ：Ｇ
４３１００４Ａ０７は理化学研究所が登録したマウスＥ
ＳＴクローンであり、遺伝子の機能は未知であった。Ｉ
ＭＡＧＥ：３１５６９４７、ＩＭＡＧＥ：５４０２３
８、ＩＭＡＧＥ：８０５６５１、ＵＩ−Ｍ−ＣＤ１−ａ
ｚｓ−ｃ−１１−０−ＵＩは何れもＮＩＨが登録したマ
ウスＥＳＴクローンであり、遺伝子の機能は全て未知で
あった。また、マウスＲＰ２４−３８８Ｐ１３はマウス
のゲノミッククローンであり、遺伝子の機能は未知であ
った。この同定から明らかにされたＮＤ８３−４のｃＤ
ＮＡ全長の塩基配列を配列番号４に記載した。

【０１３３】またＮＤ１１８−１、ＮＤ８１８−２およ
びＮＤ８７−３についても相同性検索をおこなった．相
同性検索はマウスゲノムデータベースに対して、ＳＳＡ
ＨＡプログラムを実行することにより行なった．その結
果、ＮＤ１１８−１は、ほぼ全長にあたる２５２塩基対
がマウス１１番染色体上の１０７２１３０６７から１０
７２１３３０４の領域と１００％の相同性を示したが、
同領域から機能が既知である遺伝子に関する情報は得ら
れなかった。

【０１３４】ＮＤ８１８−２はマウス３番染色体上の１
０５４７６９５３から１０５４４７７２６０の領域にコ
ードされていた．同領域の近傍には生物工学情報センタ
ー（ＮＣＢＩ）が登録した参照塩基配列（ＲｅｆＳｅ
ｑ）中の機能未知遺伝子であるマウス仮想タンパク質Ｍ
ＧＣ：７７２０（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ０
３０２４９）がコードされていた。この同定から明らか
にされたＮＤ８７−３のｃＤＮＡ全長の塩基配列を配列
番号１５に記載した。また、このｃＤＮＡがコードする
アミノ酸配列の１例を配列番号１６に記載した。

【０１３５】ＮＤ８７−３はマウス１０番染色体上の７
６４６２８３から７６４６４３６の領域にコードされて
いた。同領域にはＥｎｓｅｍｂｌが予測した機能未知遺
伝子（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＫ０１４４０
６）がコードされていた。この同定から明らかにされた
ＮＤ８７−３のｃＤＮＡ全長の塩基配列を配列番号２３
に記載した。また、このｃＤＮＡがコードするアミノ酸
配列の１例を配列番号２４に記載した。

【０１３６】例３：更なるプライマー上記の例２で決定したＮＤ８３−３、ＮＤ８３−４およ
びＮＤ８１８−２の塩基配列を基に、更なるプライマー
を設計した。

【０１３７】ＮＤ８３−３に特異的な更なるプライマー
は、配列番号１０に記載の塩基配列を有するフォワード
プライマーと、配列番号１１に記載の塩基配列を有する
リバースプライマーである。

【０１３８】ＮＤ８３−４に特異的な更なるプライマー
は、配列番号１２に記載の塩基配列を有するフォワード
プライマーと、配列番号１３に記載の塩基配列を有する
リバースプライマーである。

【０１３９】ＮＤ８１８−２に特異的な更なるプライマ
ーは、配列番号２１に記載の塩基配列を有するフォワー
ドプライマーと、配列番号２２に記載の塩基配列を有す
るリバースプライマーである。

【０１４０】上述した例１の（１）に記載の方法により
培養した２つの条件の区（１０ｎＭのＴＣＤＤ添加区お
よびＴＣＤＤ未添加区）の細胞から全ＲＮＡを抽出し
た。得られた抽出産物について上記のプライマーを用い
て逆転写ＰＣＲ法を行い、それぞれの遺伝子の発現量を
比較した。その結果、ＮＤ８３−３、ＮＤ８３−４は１
０ｎＭのＴＣＤＤの添加によってその発現量が減少した
（図３）。ＮＤ８１８−２は１０ｎＭのＴＣＤＤの添加
によってその発現量が増加した（図３）。

【０１４１】本発明の態様に従うと、化学物質の内分泌
核酸作用を特異的に検出するための更なる核酸検出用プ
ライマ−が提供された。

【０１４２】例４上記例１に記載した条件でＮｅｕｒｏ２ａを培養し、１
０ｎＭのＴＣＤＤ添加区および未添加区について全ＲＮ
Ａを抽出した。抽出されたＲＮＡを変性条件下でゲル電
気泳動を行い、分子量による分離を行った。次に、分離
後のＲＮＡを前記ゲルからナイロン膜に転写した。

【０１４３】上記例１で単離した核酸ＮＤ８３−３およ
びＮＤ８３−４、並びにＮＤ１１８−１、ＮＤ８１８−
２およびＮＤ８７−３を検出可能な核酸検出用プローブ
として、それぞれ、配列番号１１および配列番号１３、
並びに配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２およ
び配列番号２６に記載の塩基配列を有する核酸検出用プ
ローブを用いた。まず、これらの核酸検出用プローブを
化学標識した。その後、それぞれを前記ナイロン膜に対
してハイブリダイズした。その後、化学発光を検出し
た。

【０１４４】その結果、ＮＤ８３−３およびＮＤ８３−
４、並びにＮＤ１１８−１、およびＮＤ８７−３に対応
する核酸検出用プローブを用いた場合には、１０ｎＭの
ＴＣＤＤの添加によってハイブリダイゼーションで得ら
れるシグナルは減少した。またＮＤ８１８−２に対応す
る核酸検出用プローブを用いた場合には、１０ｎＭのＴ
ＣＤＤの添加によってハイブリダイゼーションで得られ
るシグナルは増加した．本発明の態様に従うと、化学発
光を指標にする検出により内分泌撹乱性を特異的に検出
することが可能な方法が提供された。

【０１４５】例５上記例１で単離した核酸ＮＤ８３−３およびＮＤ８３−
４、並びにＮＤ１１８−１、ＮＤ８１８−２およびＮＤ
８７−３を検出可能な核酸検出用プローブとして、それ
ぞれ、配列番号１１および配列番号１３、並びに配列番
号１８、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２
６に記載の塩基配列を有する核酸検出用プローブを用い
た。これらの核酸検出用プローブを基板に固定化してプ
ローブ固定化チップを作成した。上記例１に記載した条
件でＮｅｕｒｏ２ａを培養し、１０ｎＭのＴＣＤＤ添加
区および未添加区について全ＲＮＡを抽出し、蛍光標識
した。その後、蛍光標識した全ＲＮＡを前記の核酸検出
用チップのポリヌクレオチドに対してハイブリダイズし
た。その結果、ＮＤ８３−３およびＮＤ８３−４、並び
にＮＤ１１８−１およびＮＤ８７−３については、その
チップ上で観察されるシグナルは、１０ｎＭのＴＣＤＤ
を添加した区の方が減少した。また、ＮＤ８１８−２に
ついては、そのチップ上で観察されるシグナルは、１０
ｎＭのＴＣＤＤを添加した区の方が増加した。

【０１４６】本発明の態様に従うと、内分泌撹乱性を特
異的に検出することが可能なプローブ固定化チップが提
供された。

【０１４７】例６上記例１で単離した核酸ＮＤ８３−３およびＮＤ８３−
４、並びにＮＤ１１８−１、ＮＤ８１８−２およびＮＤ
８７−３を検出可能な核酸検出用プローブとして、それ
ぞれ、配列番号１１および配列番号１３、並びに、並び
に配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２および配
列番号２６に記載の塩基配列を有する核酸検出用プロー
ブを用いた。これらの核酸検出用プローブをそれぞれ異
なる金電極上の所定の位置に固定化してプローブ固定化
チップを作成した。上記例１に記載した条件でＮｅｕｒ
ｏ２ａを培養し、１０ｎＭのＴＣＤＤ添加区および未添
加区について全ＲＮＡを抽出した。それを前記核酸検出
用チップに対して反応させた。ハイブリダイズしている
核酸から電気信号を得るための試薬にはヘキスト３３２
５８を使用した。その結果、ＮＤ８３−３およびＮＤ８
３−４、並びにＮＤ１１８−１およびＮＤ８７−３に対
する核酸検出用プローブから得られる電流値は、１０ｎ
ＭのＴＣＤＤの添加によって減少した。またＮＤ８１８
−２に対する核酸検出用プローブから得られる電流値
は、１０ｎＭのＴＣＤＤの添加によって増加した。

【０１４８】本発明の態様に従うと、内分泌撹乱性を特
異的に検出することが可能な電気化学的に検出が行われ
るプローブ固定化チップが提供された。

【０１４９】例７：大腸菌によるＧＳＴ融合ペプチドの
作製ＮＤ８３−３について、次のようにＧＳＴ融合ペプチド
を作製した。５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列
を付加した上流プライマ−(即ち、5’-GGGAATTCGGACGCG
TGGGCTTGATGC-3’)と５’末端にＮｏｔＩの認識配列を
付加した下流プライマ−(即ち、5’-CCGCGGCCGCTCAAACA
CTGTGGATGT-3’)を用いて配列番号１に示した核酸配列
をＰＣＲで増幅した後、発現ベクター：ｐＧＥＸ−６Ｐ
−２（アマシャムバイオサイエンス社製）のＥｃｏＲＩ
とＮｏｔＩ部位に組み込んだ。塩基配列の解析を行い核
酸断片が正しく発現ベクターに挿入されていることを確
認した後に、宿主大腸菌ＢＬ２１の形質転換を行った。
ＬＢ培地中で３７℃で５時間培養した後、ＩＰＴＧを最
終濃度０．４ｍＭになるように加え、更に３７℃で２．
５時間培養した。その後、菌体を遠心によって回収し
た。回収した菌体は、溶解溶液(50mMのTris-HCl(pH7.
5)、1mMのEDTA、1%のTriton X-100、0.2%のSDS、0.2mM
のPMSF)に懸濁してから超音波破砕した。破砕後、１０
００ｇで３０分遠心し、上清にグルタチオンセファロー
ス４Ｂを加えて、４℃で１時間インキュベートした。ビ
ーズを十分洗浄した後、溶出溶液(10mMのTris-HCl(pH7.
5)、50mMのク゛ルタチオン)で融合ペプチドを溶出した。また、ＮＤ８１８−２については、５’末端に制限酵素
ＥｃｏＲＩの認識配列を付加した上流プライマー（即
ち、5’-CCGGAATTCATGAATCTGGAAAAACTCAGCAAGC -3’）
と、５’末端にＮｏｔＩの認識配列を付加した下流プラ
イマ−（即ち、5’-GGGCGGCCGCTACTGCTGGTAGGCAAAAGTAT
CTC-3’）を用い、発現ベクターとしてｐＧＥＸ−６Ｐ
−１を用いたこと以外は、上述のＮＤ８３−３と同様に
ＧＳＴ融合ペプチドを作製した。

【０１５０】ＮＤ８７−３については、５’末端に制限
酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加した上流プライマー
（即ち、5’-CCGGATTCCATGGCGGTTCTCTTGGAGACCACTC-
3’）と、５’末端にＮｏｔＩの認識配列を付加した下
流プライマ−（即ち、5’-GGGCGGCCGCTCATCTGTACTTGGAT
TTTTCTT-3’）を用い、発現ベクターとしてｐＧＥＸ−
６Ｐ−３を用いたこと以外は、上述のＮＤ８３−３と同
様にＧＳＴ融合ペプチドを作製した。

【０１５１】例８：ポリクローナル抗体の作製例７で作製したＧＳＴ融合ペプチドを抗原として、ウサ
ギ１羽あたり１００μｇを腹腔内に注射した。１回目の
投与後、約２週間おきに３〜１０回、抗原の投与を続け
た。各投与後は、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、
得られた血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素
免疫測定法で確認した。免疫に用いた抗原に対して充分
な抗体価を示したウサギから血清をとり、４０％飽和硫
安沈殿画分からＧＳＴアフィニティーカラムによってＧ
ＳＴ抗体を除いた後、素通り画分を更にＧＳＴ誘導ペプ
チドの抗原カラムで精製した。

【０１５２】例９：モノクローナル抗体の作製（１）ハイブリドーマの作製例７で作製したＧＳＴ融合ペプチドとコンプリートアジ
ュバンドを等量で、それぞれ１ｍＬのシリンジにとり、
ジョイントで繋いで乳化するまでよく攪拌した。これを
マウスの腹腔内に注射して免疫を行なった。１回目の免
疫の２週間後に２回目の免疫を行い、その更に２週間後
にブーストとして免疫し、ブースト３日後に細胞融合操
作を行なった。細胞融合は免疫マウスの頚椎を脱臼して
脾臓を取り出し予めＲＰＭＩを５ｍＬ入れた６ｃｍのデ
ィッシュに移した。この脾臓から余分な脂肪などを除去
し、更に新たに２枚の５ｍＬのＲＰＭＩ入りの６ｃｍの
ディッシュを用いて洗った。洗浄した脾臓を、２つに折
った５ｃｍ角のステンレス製金属網の間にピンセットで
擦り移し、遠心により１０ｍＬのＰＲＭＩで２回洗浄し
た。沈殿した細胞に０．１７ＭのＮＨ_４Ｃｌを加え、氷
中に５分間つけて溶血させた。この溶血操作の後、５ｍ
ＬのＲＰＭＩを加えて１，６００ｒｐｍで５分間遠心し
て洗浄し、更に２０ｍＬにメスアップして脾臓細胞懸濁
液とした。一方対数増殖期にある骨髄腫細胞の２〜４デ
ィッシュ分を、１，２００ｒｐｍ、５分間の遠心で集
め、血清を含まないＲＰＭＩで２回洗い、最後に１０ｍ
ＬのＲＰＭＩに懸濁して骨髄腫細胞懸濁液とした。脾臓
細胞懸濁液と骨髄腫細胞懸濁液の細胞数を数えて、骨髄
腫細胞が脾臓細胞の１／５〜１／２０になるように脾臓
細胞懸濁液に骨髄腫細胞懸濁液を加えた。この骨髄腫細
胞懸濁液を５分間遠心して上清を除き、得られた沈殿に
０．３ｍＬの５０％ポリエチレングリコール１５００を
一気に加え、直ちによく攪拌した。攪拌を続けながら、
４０ｍＬのＲＰＭＩを加えた。この懸濁液を１，０００
ｒｐｍで５分間遠心し、得られた沈殿にＨＡＴ培地（最
終濃度で、1X10^-7Mのヒポキサンチン、4X10^-4Mのアミノ
プテリン、16X10^-4Mのチミジンを含むRPMI-FCS）を５０
ｍＬ加えて、１００μＬ／ウェルずつ９６ウェルプレー
ト約３枚に播いた。４〜５日後、９６ウェルプレートに
は約１００μＬ／ウェルのＨＡＴ培地を加えた。この結
果、約１週間で殆どのウェルにハイブリドーマが増殖し
た。

【０１５３】（２）ペプチドを固相化したアッセイプレ
ートの作製例７で作成したＧＳＴ融合ペプチドを３０μｇ／ｍＬと
なるようにＰＢＳに溶解した後、酵素免疫測定法用の９
６穴マイクロタイタープレートに５０μＬずつ分注し
た。４℃に一晩静置した後、溶液を吸引除去してハイブ
リドーマ選定用のアッセイプレートとした。同様の方法
によってＧＳＴタンパク質のみを吸着させたアッセイプ
レートも作成した。

【０１５４】（３）ペプチドを認識する抗体を産生する
ハイブリドーマの選定上記（２）で作製したＧＳＴタンパク質のアッセイプレ
ートを１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１時間ブロッキング処理し
た後、前記（１）で調製したハイブリドーマの二倍希釈
した培養上清を２０μＬ加え、４℃に１６時間静置し
た。アッセイプレートを１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄
して非結合の抗体を除去した後、フルオロセインで蛍光
標識したプロテインＡ溶液５０μＬをウェルに加えて２
時間、室温に静置した後、非結合のプロテインＡを除く
ために１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄した。洗浄後、アッセ
イプレートを蛍光検出器にかけ、フルオロセインの蛍光
が観察されるウェルに存在したハイブリドーマをＧＳＴ
タンパク質を認識する抗体を産生するハイブリドーマと
して除いた。次にＧＳＴ融合ペプチドのアッセイプレー
トを用いて上記と同様の操作を行い、ここでフルオロセ
インの蛍光が観察されたウェルに存在したハイブリドー
マをペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブ
リドーマとして選定した。

【０１５５】（４）クローニング上記（３）で選定したハイブリドーマを取り出し、その
一部を用いて、血球計数板で細胞数を数えた。ハイブリ
ドーマを適当に希釈し、４０個のハイブリドーマとマウ
スから調製した約１Ｘ１０^８個の脾臓細胞とを４０ｍＬ
のＲＰＭＩ中で混合した。混合した細胞懸濁液を２００
μＬずつ９６ウェルプレート約２枚に分注して、３７℃
で培養を行った。１週間に２回、培地を交換し、約２週
間培養を続けた。２週間後、ウェルの上清をとって抗体
活性を確認した。抗体活性を示したウェルのハイブリド
ーマを、今度は２４ウェルプレートで更に培養を行っ
た。この培養により細胞密度が十分に高くなった後で、
３５ｍｍプレートで培養した。更にもう１度同様の操作
を繰り返した後、確立されたハイブリドーマとして凍結
保存した。

【０１５６】（５）ペプチドを認識するモノクローナル
抗体の選定約４週齢のマウスの腹腔内に０．５ｍＬのプリスタンを
注射した。プリスタン注射の約１週間後に、あらかじめ
培養しておいたハイブリドーマを遠心によって集め、３
７℃に温めておいたＲＰＭＩで約４Ｘ１０^６個／ｍＬに
分散させた。そのうちの５００μＬをマウスの腹腔内に
注射した。約２週間後、腹水が溜まりマウスの腹が膨れ
てきた段階で、マウスの腹部を切開し、パスツールピペ
ットを用いて腹水を採取した。採取した０．２ｍＬのＮ
ａＮ_３ＥＤＴＡ溶液を入れた１５ｍＬの遠心管に入れ
た。２，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心し、得られた上
清をモノクローナル抗体溶液として取得した。

【０１５７】例１０：ペプチドに対する抗体をもちいた
化学物質の内分泌撹乱性の検出例１の（１）に記載した方法でＴＣＤＤを作用させた細
胞から、タンパク質を抽出した後、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行なった。泳動後、ゲルをガラス
板からはずし、蒸留水の入ったプラスチック容器に入れ
て洗浄した後、ゲル中の蛋白質をエレクトロトランスフ
ァー法でＰＶＤＦ膜上に転写した。ＰＶＤＦ膜をブロッ
クエース（雪印乳業）中に浸して室温で２時間ブロッキ
ングを行った。続いてＰＢＳで希釈した例９で得た抗体
中に浸して室温で２時間抗体と反応させた。２時間後、
ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ中に移して室温、１５分間の洗浄を
３回行なった後、ペルオキシダ−ゼで標識された抗マウ
ス−ウサギ二次抗体を含む１０％のブロックエースに浸
して室温で１時間反応させた。二次抗体との反応が終了
した後、発色液(50mg/mLのDAB、50mMのTris-HCl緩衝液
(pH7.5)、過酸化水素)中にＰＶＤＦ膜を浸して発色させ
た。

【０１５８】例１１：蛍光検出型プロテインチップの作
製ビオチン化したＢＳＡでコートしたガラス基板をストレ
プトアビジンで更にコーティングした。例９で得たペプ
チドを認識する抗体をビオチン化して、上記のガラス基
板上に市販のスポッターを用いて固定化し、蛍光検出型
のプロテインチップを作製した。

【０１５９】例１２：電流検出型プロテインチップの作
製例９で得たペプチドを認識する抗体を市販のスポッター
で金電極上にスポッティングして化学的に結合させるこ
とで、電流検出型のプロテインチップを作製した。

【０１６０】

【発明の効果】以上のように、本発明により、化学物質
の内分泌撹乱性を特異的に検出するための方法、核酸、
プローブおよびプライマー、プローブ固定化チップ、並
びに抗体を提供された。

【０１６１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOSHIBA CORPORATION <120> Nucleic acid for detecting the endocrine disruptive action of che micals, probe and primer including the nucleic acid for detecting the ac tion, probe-immobilized chip comprising the probe, peptide derived from the nucleic acid and the antibody recognizing the nucleic acid, probe-im mobilized chip comprising the peptide or the antibody, and method for de tecting the endocrine disruptive action of chemicals with them <130> 02S0899 <160> 26 <210> 1 <211> 2560 <212> DNA <213> mouse <400> 1 cggacgcgtg ggcttgatgc ccactgtgag gtggcagtta actggtatgc tccacttgta 60 gcccccatat ctaaggacag aaccatttgc actgtgccga ttatagatgt cataagcggc 120 aacacatatg aaattatacc ccaagggggt ggtgatgaag atgggtatgc ccgaggagca 180 tgggactgga gtatgctctg gaaacgggtg cctctgacct ctcgagagaa gagactgaga 240 aagacaaaaa ctgagccgta tcggtctcca gctatggcgg gtggattgtt tgccatagag 300 aaggacttct tcttcgaact gggtctctat gatcctggtc tccagatctg gggtggtgaa 360 aactttgaaa tttcatacaa gatctggcag tgcggtggca aattgttatt tgtgccttgt 420 tctcgtgttg ggcacatcta ccgtcttgag ggctggcaag gaaacccccc acccctttac 480 gttggctcct ctccaactct gaagaattat gttagagtcg tggaagtctg gtgggatgaa 540 tataaagact acttctatgc tagccgtcct gagtcaaagg cgctgcccta cggggacata 600 tctgagctga agaaatttcg agaagatcac aactgcaaaa gtttcaagtg gtttatggaa 660 gaaatcgctt atgacatcac tgcccactac cctttgcccc ccagaaatgt cgagtggggt 720 gaaatccgag gcctcgaaac tgcatactgt attgatagca tggggaagac gaatggaggc 780 ttcgtggagc taggaccctg ccacaggatg ggtgggaacc agcttttccg aatcaatgaa 840 gcaaaccagc tcatgcagta cgaccagtgt ttgacaaagg ggcctgatgg atccaaagtc 900 atgatcacac actgtaacct aaatgaattt aaggaatggc agtacttcaa gagcctgcac 960 aggtttacgc acatcacttc cggaaagtgc ttagatcgat cggaggtcct gcatcaagtg 1020 ttcatctcca cctgtgactc cagtaaaatg actcagaagt gggagatgaa taacatccac 1080 agtgtttgac aagaacagag gaaaccaaca atctacctac tgacaagtac atttatggag 1140 gactgaaaac cgcctggaac ctgctgcaac cattattact aattttgtac agctccaaac 1200 ctggaacctc tctgatcagt tggaaggggc attgataaac tgtgatttta caataacatt 1260 atcatctgca gtgactgttt acaaaactgc tcttacctta aactctagat gtttacatcg 1320 ttttttgttt tgttttatga tgatgttggt aatttgtgcc tttaactcgg tttcctgaac 1380 cgccgagtta aagcatgtgt tgtcttcttt gggaatacac tcaggggtct ggaaggcagt 1440 ttggtttttt ttgttgttga tgatgttgtt cttgtttttt aacacacttg aaaaaaaaaa 1500 aaggttggag taagcagact ttcacatccg acttggtgat gatcaacctg ctgtgtattt 1560 aattttacat ctttcggaag cactgccacg ggtcgttggc cagggtggcc ttccttcagt 1620 tacgctgctg tttgaaaggt gaatttcaac acatttagtg cctctttcat ttctcagtat 1680 attgtttgag agcttctagt gacacttcta tgatggtgac aatgaatgtc acctggggaa 1740 cccgtctgtt actcacagga gaatttcttg gctatgaagt ggaatgttgt atggctgggt 1800 cgaggacaac agtgggccca actcaaggct gttccgtggg gcttgaagat tctgtggcat 1860 tacctccctg gcctctgttc acaccagctt ctaggctagc aaaggagtcc ttcttctaaa 1920 aggaggggtt ggtttttgcc catctacatt ttgcatctgc tttccccagt accagtcata 1980 gaaaactaaa cataattctc agtttgaaac ttgaaggggg gttgaggggc agggaaacaa 2040 cacaataaag ccctagtgtg gacgccttag gttggtcctg aggtaaaaat ccccaagccc 2100 ttgtgagatg gaagccttag agaaccacct cgaagcacaa gctgtgcaca gagataaact 2160 gacactttgt ctacattcaa aggaaattcc atgagcattc tctttaattt aggaaaatta 2220 gtatctaatt ttctattctt agatcttatt atctaagaat acaaatcatc aacaaatgtg 2280 gacgacattc tgcgaagtta gatgctagct ctgtagggtt ccttaatttc ttttttaaga 2340 agtataaatt ttttttatat tccccaggga aaagaagatt taatttgaac atttattaat 2400 acaataccta ctttaagaga accaaatgtt gaaaacttta atttctagga agtctcttat 2460 tacacccccc ttcccccaag ataaaatgtc tacattgagt gctaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2560 <210> 2 <211> 362 <212> PRT <213> mouse <400> 2 Arg Thr Arg Gly Leu Asp Ala His Cys Glu Val Ala Val Asn Trp Tyr 1 5 10 15 Ala Pro Leu Val Ala Pro Ile Ser Lys Asp Arg Thr Ile Cys Thr Val 20 25 30 Pro Ile Ile Asp Val Ile Ser Gly Asn Thr Tyr Glu Ile Ile Pro Gln 35 40 45 Gly Gly Gly Asp Glu Asp Gly Tyr Ala Arg Gly Ala Trp Asp Trp Ser 50 55 60 Met Leu Trp Lys Arg Val Pro Leu Thr Ser Arg Glu Lys Arg Leu Arg 65 70 75 80 Lys Thr Lys Thr Glu Pro Tyr Arg Ser Pro Ala Met Ala Gly Gly Leu 85 90 95 Phe Ala Ile Glu Lys Asp Phe Phe Phe Glu Leu Gly Leu Tyr Asp Pro 100 105 110 Gly Leu Gln Ile Trp Gly Gly Glu Asn Phe Glu Ile Ser Tyr Lys Ile 115 120 125 Trp Gln Cys Gly Gly Lys Leu Leu Phe Val Pro Cys Ser Arg Val Gly 130 135 140 His Ile Tyr Arg Leu Glu Gly Trp Gln Gly Asn Pro Pro Pro Leu Tyr 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Pro Thr Leu Lys Asn Tyr Val Arg Val Val Glu Val 165 170 175 Trp Trp Asp Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Tyr Ala Ser Arg Pro Glu Ser 180 185 190 Lys Ala Leu Pro Tyr Gly Asp Ile Ser Glu Leu Lys Lys Phe Arg Glu 195 200 205 Asp His Asn Cys Lys Ser Phe Lys Trp Phe Met Glu Glu Ile Ala Tyr 210 215 220 Asp Ile Thr Ala His Tyr Pro Leu Pro Pro Arg Asn Val Glu Trp Gly 225 230 235 240 Glu Ile Arg Gly Leu Glu Thr Ala Tyr Cys Ile Asp Ser Met Gly Lys 245 250 255 Thr Asn Gly Gly Phe Val Glu Leu Gly Pro Cys His Arg Met Gly Gly 260 265 270 Asn Gln Leu Phe Arg Ile Asn Glu Ala Asn Gln Leu Met Gln Tyr Asp 275 280 285 Gln Cys Leu Thr Lys Gly Pro Asp Gly Ser Lys Val Met Ile Thr His 290 295 300 Cys Asn Leu Asn Glu Phe Lys Glu Trp Gln Tyr Phe Lys Ser Leu His 305 310 315 320 Arg Phe Thr His Ile Thr Ser Gly Lys Cys Leu Asp Arg Ser Glu Val 325 330 335 Leu His Gln Val Phe Ile Ser Thr Cys Asp Ser Ser Lys Met Thr Gln 340 345 350 Lys Trp Glu Met Asn Asn Ile His Ser Val 355 360 <210> 3 <211> 942 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 3 gnccagtacc agtcatagaa aactaaacat aattctcagt ttgaaacttg aaggggggtt 60 gaggggcagg gaaacaacac aataaagccc tagtgtggac gccttaggtt ggtcctgagg 120 taaaaatccc caagcccttg tgagatggaa gccttagaga accacctcga agcacaagct 180 gtgcacagag ataaactgac actttgtcta cattcaaagg aaattccatg agcattcttt 240 ttaatttagg aaaattagta tctaattttc tattcttaga tcttattatc taagaataca 600 aatcatcaac aaatgtggac gacattctgc naagttagat gctanctctg tanggttcct 360 taattncttt tttaanaant ataaattttt tttatattcc ccangnaaaa naaaatttaa 420 tttnaacatt tattaataca atacctactt taacaaaacc aaatnttnaa aactttaatt 480 tctaaataaa nctcttatta caccccccct tccccnaata taaaatttcc tcnttaantn 540 ccatatnnnn actcnccttn nccntctttt tncatcctcc tnncctctnn tncnccnttn 600 cntnnnnccn nctcnctttt tttncncccc nntnccntct nnncntcttn ttnnctnncc 660 nttnctccnn tccccnnntt tntctntatt cntcntnctt tncctctntt ctcntncccn 720 ttntttctcc ctttcccctt cnntncnntn ctntnttttc tcttcctcct nnctnntnnc 780 ttnttcnctt ccncttttct cttcnctttn cccntcctnn ccctncccnn cntnncctct 840 nttctctntc cctttnnctn ccctcntctt ctnncncntn ctnctntctn tnntncntct 900 ccttctctnc tcnntcttcc cnntctccnc nnnttntccc cn 942 <210> 4 <211> 678 <212> DNA <213> mouse, bone marrow stroma cell <400> 4 aaatattatt catgttgtac caanctagta tagtatgtat gttttgtggg tgtgtatata 60 cgtaatatat tttatatata natanatatg agagagagng ntttagtgac tttgatacgg 120 gttggtgcag gtgantttat tactgagcca aatgaggcac ataccgagtc agcagttgga 180 gtccagggca ttcagtgctg tgcatggttg gcatacatgt acagtgccta tcccgtgcag 240 taagaatcac caccggcatg ccacatccag tactcagaac tcagagccag caatatttta 300 tttgtagaca atcagcttga atctatagat tttatgactg gcaaatgatt ataatcctga 360 acccataacg ctcgcaaaag gagacccaga gcgtcttgga gagacgtttg gtttggtttt 420 gtgcctggga gtcagtcagt acaacagcaa ctgtatgtgc ttatgttagt ctcaagatcc 480 ttaacttgtt gaccttatta ttttggaaat ttttttgtat tatatttgtg ggaaggtaaa 540 ataatgattt taagattttt atcaaatatg gagattagtt atttatgaaa aacaaagaaa 600 tgtctatttt tgtttctttg ttcccaatta atgtagataa ctttttaaaa tgcattaaag 660 caatggtgaa gaaaatgt 678 <210> 5 <211> 412 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 5 gnccagtact cagaactcag agccagcaat attttatttg tagacaatca gcttgaatct 60 atagatttta tgactggcaa atgattataa tcctgaaccc ataacgctcg caaaaggaga 120 cccagagcgt cttggagaga cgtttggttt ggttttgtgc ctgggagtca gtcagtacaa 180 cagcaactgt atgtgcttat gttagtctca agatccttaa cttgttgacc ttattatttt 240 ggaaattttt ttgtattata tttgtgggaa ggtaaaataa tgattttaag atttttatca 300 aatatggaga ttagttattt atgaaaaaca aagaaatgtc tatttttgtt tctttgttcc 360 caattaatgt agataacttt ttaaaatgca ttaaagcaat ggtgaagaaa at 412 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 6 aaatgtggac gacatt 16 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 7 tttggttttg ttaaagtagg t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 8 agacaatcag cttgaatcta t 21 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 9 aggtcaacaa gttaagga 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> mouse <400> 10 gaggtggcag ttaactggta t 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> mouse <400> 11 cgcactgcca gatcttgta 19 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> mouse, bone marrow stroma cell <400> 12 tagtgacttt gatacgggtt g 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> mouse, bone marrow stroma cell <400> 13 cccaggcaca aaaccaaacc a 21 <210> 14 <211> 271 <212> DNA <213> mouse, bone marrow stroma cell <400> 14 ggagnnnnnn cgtacaggtc cagagccaag ggtgaagaca aagacaaagc ctcttgatag 60 gaaaaaaaag gcttgtgggc tggagagatg gctcagcggt taagagtaca gactgctcta 120 ccagaggtcc tgacttcaat tcccagtaac cacatgttgg cccacaacca tctataatgg 180 gatctgatac cctcttctgg tgtgtctgaa gacagcaaca gtgtactcac atacataaaa 240 caaataaata tatcttaaaa aaaaaaaaaa a 271 <210> 15 <211> 4818 <212> DNA <213> mouse, bone marrow stroma cell <400> 15 ggagcgccga ggccagtgtt ggacactttc ccaccatgcc gacaacagtt taaatatctg 60 tcagctttct aaaagtttaa ctgaaggaaa cctctaagac ttcgtacctg aggaccaaag 120 tgcagccacc aattatcaga ctttcaggat gaatctggaa aaactcagca agcctgaac 180 tcctgacactg ttcagtatcc ttgaaggaga acttgaagca agagaccttg ttatagaagc 240 tttaaaggcc caacacagag atactttcat tgaagaacgc tatggaaaat ataacatcag 300 tgaccctcta atggctcttc agagagattt tgaaacactg aaggagaaaa atgatagtga 360 gaagcagcca gtgtgcacaa accccctctc tgtcctcaag gcggtgatga agcagtgcaa 420 gaacatgcag gagcgcatgc tgtcccagct ggccgcagcc gagagcaggc accgcaaggt 480 gatcctcgac cttgaagaag aaagacagag gcatgcacag gacactgctg aaggagatga 540 tgtcacctac atgctggaga aggagaggga gagactgacg cagcagttgg aatttgagaa 600 gtcccaagtg aaaaagtttg aaaaagaaca aaagaagctg tccagtcagt tggaggagga 660 gcgcacccgc cacaagcagc tctcttccat gctggtgctc gagtgcagga aggccactag 720 caaggcagcc gaggaagggc agaaggccgg agagctgagc ctgaaactgg acaaggagaa 780 gagccgggcg agcaagctag aggaagagtt ggcagccgag aggaagcggg gcctgcagac 840 ggaggcccag gtggagaagc agctgtctga gttcgatatc gaaagggagc agctgagagc 900 caaactgaac cgagaggaga accggacccg tgccctgaag gaggaggtgg agagcctgaa 960 gaagcttgtg aaagacctag aggcagccca gcagcaccgc agcaccagtg agcagggcag 1020 ggagccagtg accatgtcca gaggcacagc cacggagcct cccatgcgag tgtctgcgtt 1080 ttgtcaaaca gagagtgttc agacagaaag aagccacggg agtgtcataa ccaagctgac 1140 agacactggt cttccaggtc ccaccacggc tgcttactca tatgctaaag ctaatggcca 1200 ctgtgaccca gagatacaga ctaccaggga gttgacctca gacagcagca cagaaaacca 1260 agggcctcca cgggagaaat ctgcagtagc ggctcaggag aaaccagtgg agaatggtgg 1320 gtgtcctgta ggaactgaga ctccagtcac gatgcctagt cacctccctt ccagtggcag 1380 ctccctgtct cccagcagca cagcctcttc ctctctgaca tcatctcctt gctcctcccc 1440 agttctaacc aagcgtctct tggggtcagc agccagcagc ccgggctacc agtcttccta 1500 ccaagtcggg atcaaccagc gcttccatgc cgctcggcac aaatttcagt cccaggcgga 1560 tcaggatcag caagccagcg gtctccagag ccctccatcc agggacctgt cccctaccct 1620 gttagacaac tctgctgcca agcagctggc ccgaaacaca gtcactcagg tgctctccag 1680 attcactaac caagggccaa ttaagcccgt ctctcccaac agttctccct ttgggacaga 1740 ctaccgaaat ctggccagca ctgccagccc aagaggtgac accagccatt cacccactcc 1800 agggaaagtg tccagccctc tgagccccct ctctccagga atcaagtccc caaccatccc 1860 cagagctgag agaggaaacc ctccgccaat cccgcccaaa aagcctggcc tcaccccttc 1920 gcagtctgcc accactccag taaccaagac tcattcccag gcatcctccc tggccgccac 1980 agaagacctc gccagcagct gctcccccag tgccgtggtg gccaatggca aagatgttga 2040 gatacttttg cctaccagca gctagtccct agggctgagt ctccacattt gacattccat 2100 cagactcggg ccaagagctc agcgttaaac cctggagtca aatcatgtta tttatttgat 2160 agtagctaca gccatctgta taatacattc agtgtattta cctttttgta tttttttaag 2220 tagaaattga atactttgga tttttatgac tcacctcttt gtactaagct agaaggggac 2280 ctcatagaca tagcgcatct caagctctgc acttgccagc gtgctgcgac gaggcggctg 2340 actggggacc aggcggtgct actgccagtc ggggagctag aattcattac tcagcactca 2400 tttcaaatta tgcagaagcg gttcgtgcag atttttattc cagatgaaca tgttttaaaa 2460 gtgcctgaaa tcgcctgcca cgggaatgtg attctgcggc agaaacaaaa gacagagcat 2520 ttcttgcagc aaatgagatc ctctgtgaat ctgaatgtca aaaaaaccaa cactgctttt 2580 aatcctctct gactgtttaa tgccagcttt gtgttctgaa ccgaggtttg cataagtaga 2640 gtggaaatcc ttctgaaggg cgggaactct gtcaggctga gctctgtaaa gccctcaaga 2700 aaccctccag aacacttagc agttggggtg ctgattttct tgtgctttgg aaaaccttaa 2760 gtcattctcc gtttcctgca tcacttcttg agtagtgaag tcacgtctcc attcaaacca 2820 accctcaagc atcggccatg ggaacttctg attctggttg cttttacttg aataggaaat 2880 gacataatga actctttatt ctgtgatcaa aaagcaataa cttaacaagt cagtctttgt 2940 aatactgtaa gtcagaatta tacagatttt accaaattgt tacattcact ctccatgctg 3000 ccagcacttc tatctatgga accaaatggg cgtatatctg tatctgtata gtacacaccc 3060 cttttacatg ttcagcattc tcacactcaa gcacataagt attagtgcaa ttgtatctct 3120 ggagcttgca gctgtagcat aaaggacaaa gtagaatcaa tcgcatgtta agattaccta 3180 ccaaagcaat tagactgtga cttggagcca gtcagtcaac aaagaaatcc atttgacaag 3240 gaagtggaca atcccaaact aagctcacat catcagcatc ataggaaagc ccattaaatc 3300 gtcctagtgc cacagaactc agctagccat gtgagtgagt gagacagcac agcccctcaa 3360 gtgctatcca ctcagccata gcatcctagc cccgtgtaat ggggccaccc ctttgagccc 3420 cagctcctgt catgcaaaaa ttgcagatgg aggttaccaa ttctctaaac gttcatggaa 3480 ttgagattcc cacaagaaga ttctcattct gattttaaat gttttttaaa tgctgctgat 3540 tagacaaaca tggctgcaaa tgactttagc ttgcaggcta ccaagctgca gcctctccct 3600 ccctagaacc tgtgctgttt cccttgtagt gagttgtaca gacagaaacc cccaggcttc 3660 tccactgtgt cagctacatc tgaccaagtc cacagagcag gacagccttg ctcttggcaa 3720 gcagaacccc cgacacacca gctcaggaca ctggttacac agttttttat ccagagtaag 3780 agagaggaag gccttggtgt ctttacataa attgttctgg ccagcatcta cccagaagcc 3840 cctgcactac tgtaaccgtt tatagggaag gagaatgggt gatcattgga aacacctgat 3900 catgtttggc aaaaccaaag gattcagtgg gcccattcag atgagtcaca aggaattagc 3960 aattgatgtc cgtctggaac cacagagctg aaaacaaaaa gtctccctaa taatttagct 4020 aatagctctt aagtaaaatt ttattaaccc tttgagtcag tgggcaagag gcaggtgatt 4080 aaaatcttgg tgggcaagtc aacaacaggg tatactgttg actctccagc ttacagttta 4140 aatggttaag gtaaatgcat gacacatgaa agtgtggctg gtgtctgctg aaatgatgga 4200 gacatgtgaa actgtcccga gcgatcctgc atggaattta ctcctattgc ggacgcaaaa 4260 tagaccagtg atgatcaaac gctgaacctt ctcctcagga gagactgcag ggcctcagtg 4320 ttcttacctc tcttgcttta aatggtaatc ttaaaagctg tgttgtgctc ttcctctgtt 4380 tggagacaga tatatataga gaaagagaaa tgctataggg gagtttattt cttggggggg 4440 atgcactgaa caatatttct tttacagtat aatacagggg tgggatatgc aaaagaaatg 4500 tgtatttttg ctagttccta tcttctgaga taataagcac aatcctgaaa tggatccaat 4560 aattcagcta gatattatag attagtattt cagtttgcag tagattgtga gtgtgtgcgc 4620 taagtaaaag ttccatgatt cacaatttgg gtattaacca tatcaaagaa gctgttactg 4680 gtcagcagaa tctaatgatg tgctcggtgt aacacaagcg ttaactaagt cattaacatt 4740 tgtaaggcca agtgcagaag tcttcatttt tatagtagac tacattaaaa caagttaaat 4800 cgcaaaaaaa aaaaaaaa 4818 <210> 16 <211> 600 <212> PRT <213> mouse, bone marrow stroma cell <400> 16 Met Asn Leu Glu Lys Leu Ser Lys Pro Glu Leu Leu Thr Leu Phe Ser 1 5 10 15 Ile Leu Glu Gly Glu Leu Glu Ala Arg Asp Leu Val Ile Glu Ala Leu 20 25 30 Lys Ala Gln His Arg Asp Thr Phe Ile Glu Glu Arg Tyr Gly Lys Tyr 35 40 45 Asn Ile Ser Asp Pro Leu Met Ala Leu Gln Arg Asp Phe Glu Thr Leu 50 55 60 Lys Glu Lys Asn Asp Ser Glu Lys Gln Pro Val Cys Thr Asn Pro Leu 65 70 75 80 Ser Val Leu Lys Ala Val Met Lys Gln Cys Lys Asn Met Gln Glu Arg 85 90 95 Met Leu Ser Gln Leu Ala Ala Ala Glu Ser Arg His Arg Lys Val Ile 100 105 110 Leu Asp Leu Glu Glu Glu Arg Gln Arg His Ala Gln Asp Thr Ala Glu 115 120 125 Gly Asp Asp Val Thr Tyr Met Leu Glu Lys Glu Arg Glu Arg Leu Thr 130 135 140 Gln Gln Leu Glu Phe Glu Lys Ser Gln Val Lys Lys Phe Glu Lys Glu 145 150 155 160 Gln Lys Lys Leu Ser Ser Gln Leu Glu Glu Glu Arg Thr Arg His Lys 165 170 175 Gln Leu Ser Ser Met Leu Val Leu Glu Cys Arg Lys Ala Thr Ser Lys 180 185 190 Ala Ala Glu Glu Gly Gln Lys Ala Gly Glu Leu Ser Leu Lys Leu Asp 195 200 205 Lys Glu Lys Ser Arg Ala Ser Lys Leu Glu Glu Glu Leu Ala Ala Glu 210 215 220 Arg Lys Arg Gly Leu Gln Thr Glu Ala Gln Val Glu Lys Gln Leu Ser 225 230 235 240 Glu Phe Asp Ile Glu Arg Glu Gln Leu Arg Ala Lys Leu Asn Arg Glu 245 250 255 Glu Asn Arg Thr Arg Ala Leu Lys Glu Glu Val Glu Ser Leu Lys Lys 260 265 270 Leu Val Lys Asp Leu Glu Ala Ala Gln Gln His Arg Ser Thr Ser Glu 275 280 285 Gln Gly Arg Glu Pro Val Thr Met Ser Arg Gly Thr Ala Thr Glu Pro 290 295 300 Pro Met Arg Val Ser Ala Phe Cys Gln Thr Glu Ser Val Gln Thr Glu 305 310 315 320 Arg Ser His Gly Ser Val Ile Thr Lys Leu Thr Asp Thr Gly Leu Pro 325 330 335 Gly Pro Thr Thr Ala Ala Tyr Ser Tyr Ala Lys Ala Asn Gly His Cys 340 345 350 Asp Pro Glu Ile Gln Thr Thr Arg Glu Leu Thr Ser Asp Ser Ser Thr 355 360 365 Glu Asn Gln Gly Pro Pro Arg Glu Lys Ser Ala Val Ala Ala Gln Glu 370 375 380 Lys Pro Val Glu Asn Gly Gly Cys Pro Val Gly Thr Glu Thr Pro Val 385 390 395 400 Thr Met Pro Ser His Leu Pro Ser Ser Gly Ser Ser Leu Ser Pro Ser 405 410 415 Ser Thr Ala Ser Ser Ser Leu Thr Ser Ser Pro Cys Ser Ser Pro Val 420 425 430 Leu Thr Lys Arg Leu Leu Gly Ser Ala Ala Ser Ser Pro Gly Tyr Gln 435 440 445 Ser Ser Tyr Gln Val Gly Ile Asn Gln Arg Phe His Ala Ala Arg His 450 455 460 Lys Phe Gln Ser Gln Ala Asp Gln Asp Gln Gln Ala Ser Gly Leu Gln 465 470 475 480 Ser Pro Pro Ser Arg Asp Leu Ser Pro Thr Leu Leu Asp Asn Ser Val 485 490 495 Ala Lys Gln Leu Ala Arg Asn Thr Val Thr Gln Val Leu Ser Arg Phe 500 505 510 Thr Asn Gln Gly Pro Ile Lys Pro Val Ser Pro Asn Ser Ser Pro Phe 515 520 525 Gly Thr Asp Tyr Arg Asn Leu Ala Ser Thr Ala Ser Pro Arg Gly Asp 530 535 540 Thr Ser His Ser Pro Gly Thr Pro Ser Gln Ser Ala Thr Thr Pro Val 545 550 555 560 Thr Lys Thr His Ser Gln Ala Ser Ser Leu Ala Ala Thr Glu Asp Leu 565 570 575 Ala Ser Ser Cys Ser Pro Ser Ala Val Val Ala Asn Gly Lys Asp Val 580 585 590 Glu Ile Leu Leu Pro Thr Ser Ser 595 600 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 17 acaaagcctc ttgatagga 19 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 18 agacacacca gaagagggta t 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 19 attgtgagtg tgtgcgctaa 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 20 gacttctgca cttggcctta c 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 21 ctctgtcctc aaggcggtga t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 22 gagctgcttg tggcgggtgc g 21 <210> 23 <211> 2896 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 23 gtgtttgttc ctgcggagga gccggcgcca tggcggttct cttggagacc actctgggcg 60 acgtggtcat cgacttgtac actgaagagc gtccccgggc ttgcttgaat tttttgaagc 120 tgtgcaaaat aaaatattac aactattgcc tcatacacaa tgtacagagg gattttatca 180 tacaaacagg agatcccacg gggactggcc gcggaggaga gtctatattt ggacaactgt 240 atggtgatca agcaagcttt tttgaagcag aaaaagtacc aaggataaag cacaagaaga 300 aaggcactgt gtccatggtg aacaacggca gtgaccagca cgggtctcag tttcttatca 360 ctacaggaga aaacttagat taccttgacg gtgttcatac agtgtttggt gaagtgacag 420 aaggcatgga catagttaag aaaatcaatg agacctttgt ggacaaggat tttgtaccat 480 atcaagatat aaggataaat catacagtga ttttagatga tccatttgat gaccctcctg 540 atttattaat tcctgatcga tcacccgagc ctacaaagga acaattagat agtggtcgaa 600 taggagcaga tgaagaaatt gatgacttca aaggaagatc agctgaagaa gtagaagaaa 660 taaaggcaga aaaagaggct aaaactcaag ctattctctt ggagatggtg ggagacttac 720 ctgatgcaga tattaaacct ccagaaaatg tgctgtttgt gtgtaaattg aatccagtga 780 ccacagatga ggacttggag ataatattct caagatttgg gccaataaga agttgtgaag 840 ttatccggga ttggaaaaca ggagagtccc tctgttatgc ttttattgaa tttgaaaagg 900 aagaagactg tgagaaagca ttcttcaaaa tggataatgt gcttatagat gacaggagga 960 tacatgtgga tttcagccag tctgttgcaa aggttaaatg gaaaggaaaa ggtgggaaat 1020 ataccaagag tgatttcaag gagtatgaaa aggaacagga taaaccagcc aatttggttc 1080 tgaaagaaaa agtaaagccc aaacaggatg caaaatatga tcttatacta gatgagcagg 1140 gagaagactc caaatcaagt cactcacaca caagtaaaaa gcacaaaaag aaaacacgcc 1200 actgctccga agaaaaagaa gatgaagagt acatgccaat caaaaatcct aatcaggata 1260 tctacaggga aatgggtttt ggtcattatg aagaagaaga aagctgttgg gagaaacaga 1320 agaatgaaaa gagagaccga cgtcagaacc gcagtcgtag ccggtctcga gaaagggatg 1380 gtcactatag caacagccac aaacccaagt accagacaga accttatgag agggaaagaa 1440 gcagaaagag ggacagaagc aggagtccaa agaaatccaa agctaaagaa aaatccaagt 1500 acagatgagc agaggaggtg gacaattgta gcaggtctgc tccggcctga gctggggcac 1560 gcagacgcac tcagtgcctg ccagcacagc tgactgcggt ttcgatgtta gcgttgttgc 1620 ctttcaggtt acactgatgg tgtggggctc tggaagagag ggaggcattt tgtgtatact 1680 ttttatacaa attttattgt tgtgcataca tggtaacgtt catatttgac atctttcata 1740 gtttcagtct tttaagaatg aatcatttca tatcacagaa gtccataaac ttgtatgtaa 1800 agcataaaac agaaaatgta cctggctgca gcgcaagagg taagagtgtc actcactatg 1860 aaagctccat atatcccttc tccttgcagg aattattctg agttgtgttt accctgctgt 1920 taattttgta tgtttttgaa ttttatacaa atggcacaat gtatattttc cttctgtgac 1980 tttctttttt taagagtcca tttattttta ttgttacata gttgtgaatg tactacgctt 2040 gatctgttga tggactttta ggttgtttgt tagtttttgc tatctgagga atgccactgt 2100 gaacatttca actgagcatg gcactttctg gccatgtggt ttgagttttc aatgcattta 2160 tagttatggt tgctgtaatt tacctggtat gtgaattgta tggggtcagg ggtagccaca 2220 agagtagtta gtctaccata cagctcagag cacatttgct ccattattgt acatagtttt 2280 gactaccaat agaaaaggct taactatatc aggagctagc atcttttcta gggagatggc 2240 tcagtgggta cagtgtttcc tcatcagcac aggactgagt tcagatcctc accacatacc 2400 cagtgcatgc gactaataat ccagtactgg ggagacagga gcgggggaag ctccaggcag 2460 ttcgagtgac cgaggaagac actcggcact gacctcttgc ctccacatac tgtacaaact 2520 cgtgcgtgca ggcacacaca cacccgaata cacagctgtt ctgcatacag aacggtaggt 2580 gttgctcaca cagatgaacc taaaacatgg tctagaagaa tgagcaggga caggctggaa 2640 gcaacgagaa gtcatccact gactgcggag actcgattta agagctctgg agtattgaaa 2700 taggaaaatg tatgcaccaa gcgtttcaag gaaaacatat ccttgattcc aaatgataag 2760 aaaccgtttt atttttccta tgtatttgac agtaactata tgcttatggg agtgtaatat 2820 gtttgctata tgttaatatt ctggaacaag taaatccatt tgcagacata tcagcttact 2880 tttttctttc ttttgg 2896 <210> 24 <211> 493 <212> PRT <213> mouse, Neuro2a <400> 24 Met Ala Val Leu Leu Glu Thr Thr Leu Gly Asp Val Val Ile Asp Leu 1 5 10 15 Tyr Thr Glu Glu Arg Pro Arg Xaa Xaa Cys Leu Asn Phe Leu Lys Leu 20 25 30 Cys Lys Ile Lys Tyr Tyr Asn Tyr Cys Leu Ile His Asn Val Gln Arg 35 40 45 Asp Phe Ile Ile Gln Thr Gly Asp Pro Thr Gly Thr Gly Arg Gly Gly 50 55 60 Glu Ser Ile Phe Gly Gln Leu Tyr Gly Asp Gln Ala Ser Phe Phe Glu 65 70 75 80 Ala Glu Lys Val Pro Arg Ile Lys His Lys Lys Lys Gly Thr Val Ser 85 90 95 Met Val Asn Asn Gly Ser Asp Gln His Gly Ser Gln Phe Leu Ile Thr 100 105 110 Thr Gly Glu Asn Leu Asp Tyr Leu Asp Gly Val His Thr Val Phe Gly 115 120 125 Glu Val Thr Glu Gly Met Asp Ile Val Lys Lys Ile Asn Glu Thr Phe 130 135 140 Val Asp Lys Asp Phe Val Pro Tyr Gln Asp Ile Arg Ile Asn His Thr 145 150 155 160 Val Ile Leu Asp Asp Pro Phe Asp Asp Pro Pro Asp Leu Leu Ile Pro 165 170 175 Asp Arg Ser Pro Glu Pro Thr Lys Glu Gln Leu Asp Ser Gly Arg Ile 180 185 190 Gly Ala Asp Glu Glu Ile Asp Asp Phe Lys Gly Arg Ser Ala Glu Glu 195 200 205 Val Glu Glu Ile Lys Ala Glu Lys Glu Ala Lys Thr Gln Ala Ile Leu 210 215 220 Leu Glu Met Val Gly Asp Leu Pro Asp Ala Asp Ile Lys Pro Pro Glu 225 230 235 240 Asn Val Leu Phe Val Cys Lys Leu Asn Pro Val Thr Thr Asp Glu Asp 245 250 255 Leu Glu Ile Ile Phe Ser Arg Phe Gly Pro Ile Arg Ser Cys Glu Val 260 265 270 Ile Arg Asp Trp Lys Thr Gly Glu Ser Leu Cys Tyr Ala Phe Ile Glu 275 280 285 Phe Glu Lys Glu Glu Asp Cys Glu Lys Ala Phe Phe Lys Met Asp Asn 290 295 300 Val Leu Ile Asp Asp Arg Arg Ile His Val Asp Phe Ser Gln Ser Val 305 310 315 320 Ala Lys Val Lys Trp Lys Gly Lys Gly Gly Lys Tyr Thr Lys Ser Asp 325 330 335 Phe Lys Glu Tyr Glu Lys Glu Gln Asp Lys Pro Ala Asn Leu Val Leu 340 345 350 Lys Glu Lys Val Lys Pro Lys Gln Asp Ala Lys Tyr Asp Leu Ile Leu 355 360 365 Asp Glu Gln Gly Glu Asp Ser Lys Ser Ser His Ser His Thr Ser Lys 370 375 380 Lys His Lys Lys Lys Thr Arg His Cys Ser Glu Glu Lys Glu Asp Glu 385 390 395 400 Glu Tyr Met Pro Ile Lys Asn Pro Asn Gln Asp Ile Tyr Arg Glu Met 405 410 415 Gly Phe Gly His Tyr Glu Glu Glu Glu Ser Cys Trp Glu Lys Gln Lys 420 425 430 Asn Glu Lys Arg Asp Arg Arg Gln Asn Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg 435 440 445 Glu Arg Asp Gly His Tyr Ser Asn Ser His Lys Pro Lys Tyr Gln Thr 450 455 460 Glu Pro Tyr Glu Arg Glu Arg Ser Arg Lys Arg Asp Arg Ser Arg Ser 465 470 475 480 Pro Lys Lys Ser Lys Ala Lys Glu Lys Ser Lys Tyr Arg 485 490 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 25 aataggaaaa tgtatgcacc 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 26 tagcaaacat attacactcc c 21 <210> 27 <211> 348 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> ２７ gatacagggg tgggatatgc aaaagaaatg tgtatttttg ctagttccta tcttctgaga 60 taataagcac aatcctgaaa tggatccaat aattcagcta gatattatag attagtattt 120 cagtttgcag tagattgtga gtgtgtgcgc taagtaaaag ttccatgatt cacaatttgg 180 gtattaacca tatcaaagaa gctgttactg gtcagcagaa tctaatgatg tgctcggtgt 240 aacacaagcg ttaactaagt cattaacatt tgtaaggcca agtgcagaag tcttcatttt 300 tatagtagac tacattaaaa caagttaaat cgcaaaaaaa aaaaaaaa 34 8 <210> 28 <211> 280 <212> DNA <213> mouse, Neuro2a <400> 28 gncatggtcc ataanaatga gcagggacag gcnggangcn acnanaangc ntccactgnc 60 tgcggngact cnantcaana gctntggngn atngaaatag gaaaatgtat gcaccaagcg 120 ttncaaggaa aacatatcct tgattccaaa tgataagaaa ccgttttatt tttcctatgt 180 atttgacagt aactatatgc ttatgggagt gtaatatgtt tgctatatgt taatattctg 240 gaacaagtaa atccatttgc agncatanca aaaaaaaaaa 280

【図面の簡単な説明】

【図１】例１において行った電気泳動の結果を示す模
式図。

【図２】例１において行った電気泳動の結果を示す模
式図。

【図３】例３において行った電気泳動の結果を示す模
式図。

【図４】本発明の態様に従うプローブ固定化基体の１
例を示す図。

【図５】本発明の態様に従うプローブ固定化基体の１
例を示す図。

【符号の説明】

１１，１２，１３，１４，１７，１８，１９，２０，２
１．プローブ１５．固定化領域１６，２２．基
体２３．電極２４．パット

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/00 １０２ＦＦターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 CA05 CA06 CA07 CA09 CA11 DA02 DA06 EA04 FA10 GA11 GA18 GA19 HA03 HA08 HA12 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ52 QR08 QR14 QR32 QR38 QR41 QR42 QR55 QR62 QR66 QR82 QS12 QS25 QS34 QS39 QX02 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 DA86 EA50 FA72 FA74 GA26 (54)【発明の名称】化学物質の内分泌撹乱性を検出するための核酸、その核酸を含む核酸検出用プローブおよび核酸検出用プライマー、その核酸検出用プローブを具備するプローブ固定化チップ、その核酸に由来するペプチドおよびそのペプチドを認識する抗体、並びにそれらを用いた化学物質の内分泌撹乱性を検出する方法

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】化学物質の内分泌撹乱性を検出するため
の核酸であって、配列番号１に記載の塩基配列およびそ
の相補的配列、配列番号３に記載の塩基配列およびその
相補的配列、配列番号４に記載の塩基配列およびその相
補的配列、並びに配列番号５に記載の塩基配列およびそ
の相補的配列、配列番号１４に記載の塩基配列およびそ
の相補的配列、配列番号１５に記載の塩基配列およびそ
の相補的配列、配列番号２３に記載の塩基配列およびそ
の相補的配列、配列番号２７に記載の塩基配列およびそ
の相補配列、配列番号２８に記載の塩基配列およびその
相補配列からなる群より選択される塩基配列で示される
核酸。
【請求項２】請求項１に記載の塩基配列と８５％から
１００％で相同性を有する塩基配列により示される核
酸。
【請求項３】請求項１に記載の塩基配列に含まれる連
続した１５塩基から３０塩基よりなる核酸。
【請求項４】請求項３に記載の核酸、並びに、配列番
号６により示される核酸、配列番号７により示される核
酸、配列番号８により示される核酸、配列番号９により
示される核酸、配列番号１０により示される核酸、配列
番号１１により示される核酸、配列番号１２により示さ
れる核酸、配列番号１３により示される核酸、配列番号
１７により示される核酸、配列番号１８により示される
核酸、配列番号１９により示される核酸、配列番号２０
により示される核酸、配列番号２１により示される核
酸、配列番号２２により示される核酸、配列番号２５に
より示される核酸および配列番号２６により示される核
酸からなる群より選択される核酸を含む核酸検出用プロ
ーブ。
【請求項５】請求項３に記載の核酸、並びに配列番号
６により示される核酸、配列番号７により示される核
酸、配列番号８により示される核酸、配列番号９により
示される核酸、配列番号１０により示される核酸、配列
番号１１により示される核酸、配列番号１２により示さ
れる核酸、配列番号１３により示される核酸、配列番号
１７により示される核酸、配列番号１８により示される
核酸、配列番号１９により示される核酸、配列番号２０
により示される核酸、配列番号２１により示される核
酸、配列番号２２により示される核酸、配列番号２５に
より示される核酸および配列番号２６により示される核
酸からなる群より選択される核酸を含む核酸検出用プラ
イマ−。
【請求項６】基体と、前記基体に固相化された、請求
項４に記載の核酸検出用プローブを少なくとも１種類具
備するプローブ固定化チップ。
【請求項７】化学物質の内分泌撹乱性を検出する方法
であって、（ａ）検体に対して前記化学物質を作用させることと、（ｂ）前記化学物質を作用させた後に前記検体から検体
核酸を得ることと、（ｃ）前記検体核酸と請求項４に記載の核酸検出用プロ
ーブとを反応させることと、（ｄ）核酸検出用プローブと標的核酸とのハイブリダイ
ゼーションを検出するとにより前記標的核酸の発現程度
を得ることと、（ｅ）前記（ｄ）で得られた前記標的核酸の発現程度
と、検体に対して前記化合物を作用させない場合の前記
標的核酸の発現程度とを比較することによって、前記化
学物質の内分泌撹乱性を検出することと、を具備する方
法。
【請求項８】化学物質の内分泌撹乱性を検出する方法
であって、（ａ）検体に対して前記化学物質を作用させることと、（ｂ）前記化学物質を作用させた後に前記検体から検体
核酸を得ることと、（ｃ）前記検体核酸を、請求項５に記載の核酸検出用プ
ライマーの２種類以上と核酸増幅用酵素とを用いて増幅
産物を得ることと、（ｄ）前記（ｃ）で得た増幅産物を解析するとにより前
記標的核酸の発現程度を得ることと、（ｅ）前記（ｄ）で得られた前記標的核酸の発現程度
と、検体に対して前記化合物を作用させない場合の前記
標的核酸の発現程度とを比較することによって、前記化
学物質の内分泌撹乱性を検出することと、を具備する方
法。
【請求項９】配列番号２、配列番号１６および配列番
号２４の何れか１に記載のアミノ酸配列により示される
ペプチド。
【請求項１０】請求項９の何れか１項に記載のペプチ
ドを認識する抗体。