JP2003274990A - オリゴ糖鎖の生産方法 - Google Patents
オリゴ糖鎖の生産方法Info
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- JP2003274990A JP2003274990A JP2002083865A JP2002083865A JP2003274990A JP 2003274990 A JP2003274990 A JP 2003274990A JP 2002083865 A JP2002083865 A JP 2002083865A JP 2002083865 A JP2002083865 A JP 2002083865A JP 2003274990 A JP2003274990 A JP 2003274990A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 医薬・医療・研究支援素材などに利用される
多様なオリゴ糖鎖を、糖鎖プライマーを用いて細胞に生
産させる際に、低コストで生産させる方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、無血清あるいは低濃度血清条
件で順化した細胞培養系に糖鎖プライマーを投与してオ
リゴ糖鎖を産生させ、好ましく、一度糖鎖産生に使用し
た細胞を繰り返して使用する。
多様なオリゴ糖鎖を、糖鎖プライマーを用いて細胞に生
産させる際に、低コストで生産させる方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、無血清あるいは低濃度血清条
件で順化した細胞培養系に糖鎖プライマーを投与してオ
リゴ糖鎖を産生させ、好ましく、一度糖鎖産生に使用し
た細胞を繰り返して使用する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は医薬・医療・研究支
援素材などに利用されるオリゴ糖鎖の生産方法に関す
る。
援素材などに利用されるオリゴ糖鎖の生産方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】生体における細胞の表面は、受精・発生
・分化・増殖・細胞死など様々な段階において特異的な
糖鎖を発現しており、細胞表面はそのような糖鎖で覆わ
れているため、糖鎖の多様性は細胞の多様な機能と密接
に関係していると考えられている。例えば、オリゴ糖鎖
は毒素・ウィルスなどの受容体作用、癌のマーカーとし
ての役割、癌転移に関わるような細胞の接着因子として
重要な役割を果たしている。最近では、アルツハイマー
病の原因と考えられているアミロイドタンパク質との相
互作用も報告されている。
・分化・増殖・細胞死など様々な段階において特異的な
糖鎖を発現しており、細胞表面はそのような糖鎖で覆わ
れているため、糖鎖の多様性は細胞の多様な機能と密接
に関係していると考えられている。例えば、オリゴ糖鎖
は毒素・ウィルスなどの受容体作用、癌のマーカーとし
ての役割、癌転移に関わるような細胞の接着因子として
重要な役割を果たしている。最近では、アルツハイマー
病の原因と考えられているアミロイドタンパク質との相
互作用も報告されている。
【０００３】このように多様なオリゴ糖鎖の機能を研究
し、応用展開するためには、多様な糖鎖を生産する必要
がある。オリゴ糖鎖を生産する方法としては、従来から
ある方法としては、化学合成および酵素を用いる方法が
あげられる。化学合成では一つの天然型のオリゴ糖鎖を
得るのに、多くの反応ステップと特殊な技術を必要と
し、膨大な時間と人件費を必要とするが、その割には収
率が低いため、得られたオリゴ糖鎖は天然物からの抽出
に比べてコストが高いという欠点がある。
し、応用展開するためには、多様な糖鎖を生産する必要
がある。オリゴ糖鎖を生産する方法としては、従来から
ある方法としては、化学合成および酵素を用いる方法が
あげられる。化学合成では一つの天然型のオリゴ糖鎖を
得るのに、多くの反応ステップと特殊な技術を必要と
し、膨大な時間と人件費を必要とするが、その割には収
率が低いため、得られたオリゴ糖鎖は天然物からの抽出
に比べてコストが高いという欠点がある。
【０００４】また、酵素反応によるオリゴ糖鎖の合成に
は、加水分解酵素と糖転移酵素を用いた方法があるが、
いずれも使える酵素に制限があるため、現状では望み通
りのオリゴ糖を作るのはほとんど不可能であり、また、
オリゴ糖鎖合成の原料となる糖ヌクレオチドなどの糖供
与体も入手ができるものが限定され、かつ高価であるな
ど、実用的な段階には至っていない。
は、加水分解酵素と糖転移酵素を用いた方法があるが、
いずれも使える酵素に制限があるため、現状では望み通
りのオリゴ糖を作るのはほとんど不可能であり、また、
オリゴ糖鎖合成の原料となる糖ヌクレオチドなどの糖供
与体も入手ができるものが限定され、かつ高価であるな
ど、実用的な段階には至っていない。
【０００５】しかし、最近になり、動物細胞を使用し、
簡単な構造の糖鎖プライマーを培養細胞に投与すると、
細胞内で糖鎖プライマーに糖鎖が付加され、作られたオ
リゴ糖鎖が培養液中に排出され、多様な糖鎖が産生され
ることが分かってきている。さらに、培養細胞の種類を
変えれば、異なった構造のオリゴ糖鎖が合成されること
が知られるようになり（Nakajima,H. et al.,J.Bioche
m.,124,148-156(1998)）、この方法による多様な糖鎖生
産への応用が試みられるようになってきた。しかし、こ
の糖鎖プライマーを使用した方法については、その生産
に適した培養方法については未だ検討されていないのが
現状であり、血清培地を大量に使用するような高コスト
オリゴ糖鎖生産方法しか確立されておらず、低コストで
オリゴ糖鎖を生産できるような生産方法を確立すること
が求められていた。
簡単な構造の糖鎖プライマーを培養細胞に投与すると、
細胞内で糖鎖プライマーに糖鎖が付加され、作られたオ
リゴ糖鎖が培養液中に排出され、多様な糖鎖が産生され
ることが分かってきている。さらに、培養細胞の種類を
変えれば、異なった構造のオリゴ糖鎖が合成されること
が知られるようになり（Nakajima,H. et al.,J.Bioche
m.,124,148-156(1998)）、この方法による多様な糖鎖生
産への応用が試みられるようになってきた。しかし、こ
の糖鎖プライマーを使用した方法については、その生産
に適した培養方法については未だ検討されていないのが
現状であり、血清培地を大量に使用するような高コスト
オリゴ糖鎖生産方法しか確立されておらず、低コストで
オリゴ糖鎖を生産できるような生産方法を確立すること
が求められていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従来の糖鎖プライマー
による糖鎖産生の研究では、糖鎖を産生させるためのま
とまった数の細胞を得るために、コスト面でデメリット
となる血清を使用して細胞を増殖あるいは維持させ、培
養系から血清をのぞいた後、細胞に糖鎖プライマーを投
与して糖鎖を産生させていた。この際、長時間糖鎖の産
生を行えば、細胞が死亡してしまうため、糖鎖産生後は
細胞を廃棄するのが一般的であり、血清を使用して細胞
を再度増殖、維持させて使用しなければならないという
非効率的な糖鎖産生方法を利用していた。そこで、本発
明では、医薬・医療・研究支援素材などに利用される多
様なオリゴ糖鎖を、糖鎖プライマーを用いて細胞に生産
させる際に、低コストで生産させる方法を提供すること
を目的とする。
による糖鎖産生の研究では、糖鎖を産生させるためのま
とまった数の細胞を得るために、コスト面でデメリット
となる血清を使用して細胞を増殖あるいは維持させ、培
養系から血清をのぞいた後、細胞に糖鎖プライマーを投
与して糖鎖を産生させていた。この際、長時間糖鎖の産
生を行えば、細胞が死亡してしまうため、糖鎖産生後は
細胞を廃棄するのが一般的であり、血清を使用して細胞
を再度増殖、維持させて使用しなければならないという
非効率的な糖鎖産生方法を利用していた。そこで、本発
明では、医薬・医療・研究支援素材などに利用される多
様なオリゴ糖鎖を、糖鎖プライマーを用いて細胞に生産
させる際に、低コストで生産させる方法を提供すること
を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明は、無血清または低濃度血清条件で維持した
細胞培養系に糖鎖プライマーを投与してオリゴ糖鎖を産
生させ、所望により更に、一度糖鎖産生に使用した細胞
を繰り返して使用することを特徴とするオリゴ糖鎖の生
産方法を提供する。
に、本発明は、無血清または低濃度血清条件で維持した
細胞培養系に糖鎖プライマーを投与してオリゴ糖鎖を産
生させ、所望により更に、一度糖鎖産生に使用した細胞
を繰り返して使用することを特徴とするオリゴ糖鎖の生
産方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明における、糖鎖プライマー
法における糖鎖産生においては、高コストの源になる血
清の使用をなるべく押さえるため、無血清あるいは低濃
度血清条件で細胞を維持しながら糖鎖を生産させ、さら
に、無血清あるいは低濃度血清条件で細胞の活性を維持
しながら糖鎖産生を行うことにより、細胞を再利用す
る。本発明において細胞に糖鎖を生産させるため、無血
清条件で細胞を維持する方法としては、市販の無血清培
養用培地を使用したり、あるいは、細胞を継代する際に
培地に添加する血清の濃度を順次低下させ、無血清条件
に細胞を徐々に順化させる方法を利用する。
法における糖鎖産生においては、高コストの源になる血
清の使用をなるべく押さえるため、無血清あるいは低濃
度血清条件で細胞を維持しながら糖鎖を生産させ、さら
に、無血清あるいは低濃度血清条件で細胞の活性を維持
しながら糖鎖産生を行うことにより、細胞を再利用す
る。本発明において細胞に糖鎖を生産させるため、無血
清条件で細胞を維持する方法としては、市販の無血清培
養用培地を使用したり、あるいは、細胞を継代する際に
培地に添加する血清の濃度を順次低下させ、無血清条件
に細胞を徐々に順化させる方法を利用する。
【０００９】無血清条件で細胞を維持する際に、培養液
中に中にインスリン、血小板由来増殖因子、上皮細胞成
長因子、線維芽細胞成長因子、ソマトメジン、ヒドロコ
ーチゾント、トリヨードチロニンなどの成長因子、ある
いは、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、リ
ノール酸、コレステロール、ダイズ脂質などの脂質関連
因子、その他、トランスフェリン、ウシ血清アルブミ
ン、微量必須重金属、亜セレン酸、ビタミンＥ、HEPE
S、β−グリセロリン酸ナトリウムなどを添加してもか
まわない。
中に中にインスリン、血小板由来増殖因子、上皮細胞成
長因子、線維芽細胞成長因子、ソマトメジン、ヒドロコ
ーチゾント、トリヨードチロニンなどの成長因子、ある
いは、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、リ
ノール酸、コレステロール、ダイズ脂質などの脂質関連
因子、その他、トランスフェリン、ウシ血清アルブミ
ン、微量必須重金属、亜セレン酸、ビタミンＥ、HEPE
S、β−グリセロリン酸ナトリウムなどを添加してもか
まわない。
【００１０】無血清培地での培養が無理な細胞において
は、血清を低濃度で添加して細胞を維持しても良い、血
清濃度としては１％以下が好ましく、さらに好ましくは
0.5％以下である。また、血清濃度を低下させるため
に、継代の際に添加する血清の濃度を順次低下させ、低
濃度血清条件に細胞を徐々に順化させる方法を利用して
も良い。また、無血清あるいは低濃度血清条件で培養す
る場合に、細胞の接着性を維持するために、接着因子で
あるコラーゲンやフィブロネクチンなどを培養容器面な
どの細胞接着面にコーティングしてもかまわない。
は、血清を低濃度で添加して細胞を維持しても良い、血
清濃度としては１％以下が好ましく、さらに好ましくは
0.5％以下である。また、血清濃度を低下させるため
に、継代の際に添加する血清の濃度を順次低下させ、低
濃度血清条件に細胞を徐々に順化させる方法を利用して
も良い。また、無血清あるいは低濃度血清条件で培養す
る場合に、細胞の接着性を維持するために、接着因子で
あるコラーゲンやフィブロネクチンなどを培養容器面な
どの細胞接着面にコーティングしてもかまわない。
【００１１】使用する培地としては、MEM培地、D-MEM培
地、α-MEM培地、BME培地、ハムF12培地、ハムF10培
地、RPMI1640培地、BME培地、DF培地、199培地、L-15培
地、マッコイ5A培地、NCTC109培地、NCTC135培地、ウイ
リアムスＥ培地などの通常培地の他に、ASF104培地など
各種の無血清用の培地が使用できるが、これらに限定さ
れるものではない。また、糖鎖プライマーの細胞への取
り込み効率が悪くなる、あるいは産生物の抽出の際に不
純物になるなどの理由からからフェノールレッドを含有
しない培地の方が好ましい。
地、α-MEM培地、BME培地、ハムF12培地、ハムF10培
地、RPMI1640培地、BME培地、DF培地、199培地、L-15培
地、マッコイ5A培地、NCTC109培地、NCTC135培地、ウイ
リアムスＥ培地などの通常培地の他に、ASF104培地など
各種の無血清用の培地が使用できるが、これらに限定さ
れるものではない。また、糖鎖プライマーの細胞への取
り込み効率が悪くなる、あるいは産生物の抽出の際に不
純物になるなどの理由からからフェノールレッドを含有
しない培地の方が好ましい。
【００１２】糖鎖プライマーを添加してオリゴ糖鎖を産
生させるのに使用する細胞としては、動物細胞、昆虫細
胞、植物細胞、あるいは酵母があり、動物細胞として
は、各種動物由来細胞、ヒト組織由来正常細胞、ヒト癌
細胞などが挙げられる。また、糖鎖合成酵素、特にヒト
型の糖鎖合成酵素をコードするDNAを組み込んだベクタ
ーを含む各種細胞を用いることもできるが、これらに限
定されるものではない。酵母を用いた糖鎖の生産におい
ては、酵母特有のハイマンノース型糖鎖合成経路を断
ち、ヒト型の糖鎖遺伝子を組み込んで使用することが望
ましい。
生させるのに使用する細胞としては、動物細胞、昆虫細
胞、植物細胞、あるいは酵母があり、動物細胞として
は、各種動物由来細胞、ヒト組織由来正常細胞、ヒト癌
細胞などが挙げられる。また、糖鎖合成酵素、特にヒト
型の糖鎖合成酵素をコードするDNAを組み込んだベクタ
ーを含む各種細胞を用いることもできるが、これらに限
定されるものではない。酵母を用いた糖鎖の生産におい
ては、酵母特有のハイマンノース型糖鎖合成経路を断
ち、ヒト型の糖鎖遺伝子を組み込んで使用することが望
ましい。
【００１３】本発明において、細胞の増殖や維持あるい
は糖鎖産生の際に用いる細胞培養方法としては、一般の
接着細胞に用いる単層培養法以外にも、高密度培養法と
して、マイクロキャリアー培養法、細胞固定用ディスク
を用いた培養槽、中空糸モジュールを用いた培養システ
ム、浮遊細胞のサスペンションカルチャー、多段式培養
装置やローラーボトルを用いる方法、または、マイクロ
カプセルに細胞を固定化培養する方法などがあり、高密
度培養法を用いた系の方が、糖鎖産生の効率の点からも
好適である。
は糖鎖産生の際に用いる細胞培養方法としては、一般の
接着細胞に用いる単層培養法以外にも、高密度培養法と
して、マイクロキャリアー培養法、細胞固定用ディスク
を用いた培養槽、中空糸モジュールを用いた培養システ
ム、浮遊細胞のサスペンションカルチャー、多段式培養
装置やローラーボトルを用いる方法、または、マイクロ
カプセルに細胞を固定化培養する方法などがあり、高密
度培養法を用いた系の方が、糖鎖産生の効率の点からも
好適である。
【００１４】以上の方法により、無血清あるいは低血清
濃度で維持した細胞の培養系に糖鎖プライマーを投与し
て糖鎖を産生させる。本発明に用いる糖鎖プライマー
は、生体内で糖脂質糖鎖合成のプレカーサーとなるラク
トシドセラミドを模倣して作られたラクトースもしくは
ガラクトースに疎水性鎖をつけたアナログ、あるいはＮ
−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン、マンノース、キシロース、グルコースなどに疎水性
鎖をつけた糖鎖プライマーが用いられるが、これらに限
定されるものではない。
濃度で維持した細胞の培養系に糖鎖プライマーを投与し
て糖鎖を産生させる。本発明に用いる糖鎖プライマー
は、生体内で糖脂質糖鎖合成のプレカーサーとなるラク
トシドセラミドを模倣して作られたラクトースもしくは
ガラクトースに疎水性鎖をつけたアナログ、あるいはＮ
−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン、マンノース、キシロース、グルコースなどに疎水性
鎖をつけた糖鎖プライマーが用いられるが、これらに限
定されるものではない。
【００１５】培養細胞に糖鎖プライマーを投与してオリ
ゴ糖鎖を生産させるためには、無血清あるいは低血清濃
度条件で維持した細胞に、10〜100μMの糖鎖プライマー
を投与し、37℃で１〜５日間培養することにより、糖鎖
プライマーに糖が付加した多様なオリゴ糖鎖が培養液中
に排出されるため糖鎖産生原液を得ることができる。こ
の原液を濃縮、分離、抽出、精製を行うことにより、多
種類のオリゴ糖鎖の生産が可能となる。また、無血清あ
るいは低濃度血清の条件で増殖してしまう細胞は、使用
する細胞の細胞密度をコンフルエントの1/2〜1/20程度
に希釈して使用する。希釈倍率は糖鎖産生の日数および
細胞の増殖速度に応じて決定する。
ゴ糖鎖を生産させるためには、無血清あるいは低血清濃
度条件で維持した細胞に、10〜100μMの糖鎖プライマー
を投与し、37℃で１〜５日間培養することにより、糖鎖
プライマーに糖が付加した多様なオリゴ糖鎖が培養液中
に排出されるため糖鎖産生原液を得ることができる。こ
の原液を濃縮、分離、抽出、精製を行うことにより、多
種類のオリゴ糖鎖の生産が可能となる。また、無血清あ
るいは低濃度血清の条件で増殖してしまう細胞は、使用
する細胞の細胞密度をコンフルエントの1/2〜1/20程度
に希釈して使用する。希釈倍率は糖鎖産生の日数および
細胞の増殖速度に応じて決定する。
【００１６】また、培養細胞に糖鎖プライマーを投与し
て糖鎖を産生させる際に、培養液への添加物として、細
胞内での糖代謝の活性化および細胞内への糖鎖プライマ
ーの取り込みを促進するためのインシュリン、繊維芽細
胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、インターフェロン、イ
ンターロイキン、TNFなどの増殖因子やサイトカイン、
あるいはリポソームや血清アルブミンなどの細胞内への
キャリアー物質、あるいは二酸化セレンなどの酵素活性
を促すような因子、トランスフェリンなどの鉄輸送タン
パク質、糖供与体となるUDP-グルコース、UDP-ガラクト
ース、UDP-N-アセチルガラクトサミン、UDP-N-アセチル
グルコサミン、GDP-フコース、CMP-N-アセチルノイラミ
ン酸などの糖ヌクレオチドや、その前駆体のグルコー
ス、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクト
ース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルマンノサミ
ンなどを添加しても良い。
て糖鎖を産生させる際に、培養液への添加物として、細
胞内での糖代謝の活性化および細胞内への糖鎖プライマ
ーの取り込みを促進するためのインシュリン、繊維芽細
胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、インターフェロン、イ
ンターロイキン、TNFなどの増殖因子やサイトカイン、
あるいはリポソームや血清アルブミンなどの細胞内への
キャリアー物質、あるいは二酸化セレンなどの酵素活性
を促すような因子、トランスフェリンなどの鉄輸送タン
パク質、糖供与体となるUDP-グルコース、UDP-ガラクト
ース、UDP-N-アセチルガラクトサミン、UDP-N-アセチル
グルコサミン、GDP-フコース、CMP-N-アセチルノイラミ
ン酸などの糖ヌクレオチドや、その前駆体のグルコー
ス、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクト
ース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルマンノサミ
ンなどを添加しても良い。
【００１７】また本発明では、細胞に糖鎖を産生させ、
糖鎖産生原液を採取した後、細胞を回収して再利用する
ことができる、この際、遠心分離により細胞やマイクロ
キャリアーを沈殿させて細胞と糖鎖産生原液を分離して
も良いし、分離膜や中空糸を用いて分離しても良い。回
収した細胞は、上記したような糖鎖産生用の培養液で適
度な細胞密度に調整した後、糖鎖プライマーを投与すれ
ば、再度糖鎖を産生させることが可能である。
糖鎖産生原液を採取した後、細胞を回収して再利用する
ことができる、この際、遠心分離により細胞やマイクロ
キャリアーを沈殿させて細胞と糖鎖産生原液を分離して
も良いし、分離膜や中空糸を用いて分離しても良い。回
収した細胞は、上記したような糖鎖産生用の培養液で適
度な細胞密度に調整した後、糖鎖プライマーを投与すれ
ば、再度糖鎖を産生させることが可能である。
【００１８】本発明によって産生された糖鎖は、ウィル
スや細菌、毒素、病因タンパク質、病因細胞などに対す
る拮抗剤、抗炎症剤、抗癌転移剤や免疫誘導を促すため
のワクチンなどの医薬、ウィルスや毒素や癌細胞などを
吸着、除去するような中空糸や膜素材あるいは、遺伝子
や薬などのデリバリー素材などとして使用する医療材、
多様な糖鎖を基板上に並べてその上で相互作用を検出す
る糖鎖チップや癌マーカー、試薬、細胞培養器材などの
研究支援素材として使用できる。
スや細菌、毒素、病因タンパク質、病因細胞などに対す
る拮抗剤、抗炎症剤、抗癌転移剤や免疫誘導を促すため
のワクチンなどの医薬、ウィルスや毒素や癌細胞などを
吸着、除去するような中空糸や膜素材あるいは、遺伝子
や薬などのデリバリー素材などとして使用する医療材、
多様な糖鎖を基板上に並べてその上で相互作用を検出す
る糖鎖チップや癌マーカー、試薬、細胞培養器材などの
研究支援素材として使用できる。
【００１９】
【実施例】実施例１. 骨髄性白血病細胞株HL-60の繰り
返し利用 オリゴ糖鎖を産生させる細胞として骨髄性白血病細胞株
HL-60を使用した。通常この細胞は浮遊細胞なので、ウ
シ胎児血清10%を含むRPMI1640培地を用いて1.0×106細
胞/mlとなるように維持する。この細胞を無血清条件で
維持するために、トランスフェリン50mg/ml、インシュ
リン5mg/ml、二酸化セレン30nMを含むDF培地（フェノー
ルレッド不含）を用意し、最初ウシ胎児血清10%を含むD
F培地で継代し、継代するごとに血清濃度を半分にして
いき、無血清条件に順化させた。
返し利用 オリゴ糖鎖を産生させる細胞として骨髄性白血病細胞株
HL-60を使用した。通常この細胞は浮遊細胞なので、ウ
シ胎児血清10%を含むRPMI1640培地を用いて1.0×106細
胞/mlとなるように維持する。この細胞を無血清条件で
維持するために、トランスフェリン50mg/ml、インシュ
リン5mg/ml、二酸化セレン30nMを含むDF培地（フェノー
ルレッド不含）を用意し、最初ウシ胎児血清10%を含むD
F培地で継代し、継代するごとに血清濃度を半分にして
いき、無血清条件に順化させた。
【００２０】この細胞を5.0×105細胞/mlになるように
無血清培地に懸濁し、糖鎖プライマー（GlcNAc-C12 ：1
-(n-dodecyl)-2-N-acetyl-β-Glucopyranoside）を50μ
Mとなるように投与し、48時間培養して糖鎖を産生させ
た後、1000rpmで5分間遠心分離して、細胞を沈降させ
て、培養上清を回収した。残った細胞を、再度5.0×105
cells/mlになるように無血清培地に懸濁し、GlcNAc-C12
糖鎖プライマーを50μMとなるように投与し、糖鎖を産
生させる操作を四回繰り返した。
無血清培地に懸濁し、糖鎖プライマー（GlcNAc-C12 ：1
-(n-dodecyl)-2-N-acetyl-β-Glucopyranoside）を50μ
Mとなるように投与し、48時間培養して糖鎖を産生させ
た後、1000rpmで5分間遠心分離して、細胞を沈降させ
て、培養上清を回収した。残った細胞を、再度5.0×105
cells/mlになるように無血清培地に懸濁し、GlcNAc-C12
糖鎖プライマーを50μMとなるように投与し、糖鎖を産
生させる操作を四回繰り返した。
【００２１】回収した培養上清については、Sep-PakC-1
8(Waters)を用いて産生されたオリゴ糖鎖（糖脂質）を
含む脂質成分を抽出した。Sep-PakC-18にメタノール10m
lを通してカラムを活性化し、超純水10mlでカラムを平
衡化させた。次に培地成分10mlを二度カラムに通して脂
質成分を吸着させ、超純水10mlを通してカラムを洗浄し
た。続いてメタノール4ml、クロロホルム／メタノール
（2/1(v/v)）を2ml通して脂質成分をカラムから溶出
し、溶出液を蒸発乾燥させた。
8(Waters)を用いて産生されたオリゴ糖鎖（糖脂質）を
含む脂質成分を抽出した。Sep-PakC-18にメタノール10m
lを通してカラムを活性化し、超純水10mlでカラムを平
衡化させた。次に培地成分10mlを二度カラムに通して脂
質成分を吸着させ、超純水10mlを通してカラムを洗浄し
た。続いてメタノール4ml、クロロホルム／メタノール
（2/1(v/v)）を2ml通して脂質成分をカラムから溶出
し、溶出液を蒸発乾燥させた。
【００２２】抽出した脂質成分をクロロホルム／メタノ
ール（2/1(v/v)）に溶解し、回収量の1/5をHPTLCプレー
ト（Silicagel 60）にスポットし、展開溶媒としてクロ
ロホルム／メタノール／0.2%CaCl2水溶液＝50/40/10(v/
v/v)を使用して展開した。溶媒を乾燥した後、プレート
をレゾルシノール塩酸試薬、オルシノール硫酸試薬で染
色し発色させ、４回の繰り返し操作で産生されたオリゴ
糖鎖を検出、比較した結果を図１に示す。
ール（2/1(v/v)）に溶解し、回収量の1/5をHPTLCプレー
ト（Silicagel 60）にスポットし、展開溶媒としてクロ
ロホルム／メタノール／0.2%CaCl2水溶液＝50/40/10(v/
v/v)を使用して展開した。溶媒を乾燥した後、プレート
をレゾルシノール塩酸試薬、オルシノール硫酸試薬で染
色し発色させ、４回の繰り返し操作で産生されたオリゴ
糖鎖を検出、比較した結果を図１に示す。
【００２３】４回の繰り返し利用の結果、糖鎖産生物の
バンド位置、バンド濃度に変化がなかったため、上記の
方法で無血清に順化させたHL-60細胞の無血清培養系にG
lcNAc-C12プライマを投与することにより、この条件下
で細胞を維持、回収して繰り返し使用しても、繰り返し
オリゴ糖鎖が産生させることが可能であることが分かっ
た。
バンド位置、バンド濃度に変化がなかったため、上記の
方法で無血清に順化させたHL-60細胞の無血清培養系にG
lcNAc-C12プライマを投与することにより、この条件下
で細胞を維持、回収して繰り返し使用しても、繰り返し
オリゴ糖鎖が産生させることが可能であることが分かっ
た。
【００２４】実施例２. ヒト平滑筋細胞の繰り返し利
用 糖鎖を産生させる細胞として、ヒト平滑筋細胞（SMC;sm
ooth muscle cell）を使用し、低血清条件の1%のFBSを
含むＭＥＭ培地を用いて増殖、維持させた。この細胞は
接着性細胞であるため、マイクロキャリアーを用いた高
密度培養方法を利用し、DEAE-デキストランビーズ（Cyt
odexTM-1(Amersham Pharmacia Biotech)）に細胞を接着
させ、スピナーフラスコを用いることにより高密度培養
を行った。
用 糖鎖を産生させる細胞として、ヒト平滑筋細胞（SMC;sm
ooth muscle cell）を使用し、低血清条件の1%のFBSを
含むＭＥＭ培地を用いて増殖、維持させた。この細胞は
接着性細胞であるため、マイクロキャリアーを用いた高
密度培養方法を利用し、DEAE-デキストランビーズ（Cyt
odexTM-1(Amersham Pharmacia Biotech)）に細胞を接着
させ、スピナーフラスコを用いることにより高密度培養
を行った。
【００２５】この培養系に、糖鎖プライマー（Lac-C1
2：1-(n-dodecyl)-β-Lactoside）を50μMとなるように
投与して糖鎖を産生させ、72時間後にスピナーフラスコ
を静置することにより、細胞の付着したマイクロキャリ
アーを沈殿させて、培養上清を回収した。その後、再度
1%のFBSを含むＭＥＭ培地により糖鎖プライマーを投与
し、糖鎖を産生させる操作を３回繰り返した。回収した
培養上清については実施例１と同様の操作で産生糖鎖を
抽出、分析し、３回の繰り返し操作で産生されたオリゴ
糖鎖を検出、比較した結果を図２に示す。
2：1-(n-dodecyl)-β-Lactoside）を50μMとなるように
投与して糖鎖を産生させ、72時間後にスピナーフラスコ
を静置することにより、細胞の付着したマイクロキャリ
アーを沈殿させて、培養上清を回収した。その後、再度
1%のFBSを含むＭＥＭ培地により糖鎖プライマーを投与
し、糖鎖を産生させる操作を３回繰り返した。回収した
培養上清については実施例１と同様の操作で産生糖鎖を
抽出、分析し、３回の繰り返し操作で産生されたオリゴ
糖鎖を検出、比較した結果を図２に示す。
【００２６】実施例３.与えた糖鎖プライマーをLac-C1
2：1-(n-dodecyl)-β-Lactoside からGlcNAc-C12 ：1-
(n-dodecyl)-2-N-acetyl-β-Glucopyranosideに代えた
以外は、実施例２と同様の操作を行った。結果を図３に
示す。３回の繰り返し利用の結果、糖鎖産生物のバンド
位置、バンド濃度に変化がなかっため、低血清濃度での
平滑筋細胞の培養系にLac-C12、GlcNAc-C12プライマを
投与することにより、この条件下で細胞を維持、回収し
て繰り返し使用しても、繰り返しオリゴ糖鎖が産生させ
ることが可能であることが分かった。
2：1-(n-dodecyl)-β-Lactoside からGlcNAc-C12 ：1-
(n-dodecyl)-2-N-acetyl-β-Glucopyranosideに代えた
以外は、実施例２と同様の操作を行った。結果を図３に
示す。３回の繰り返し利用の結果、糖鎖産生物のバンド
位置、バンド濃度に変化がなかっため、低血清濃度での
平滑筋細胞の培養系にLac-C12、GlcNAc-C12プライマを
投与することにより、この条件下で細胞を維持、回収し
て繰り返し使用しても、繰り返しオリゴ糖鎖が産生させ
ることが可能であることが分かった。
【００２７】
【発明の効果】本発明により、無血清あるいは低濃度血
清条件で維持した細胞培養系に糖鎖プライマーを投与し
てオリゴ糖鎖を産生させ、さらに、一度糖鎖産生に使用
した細胞を繰り返して使用することにより、細胞を再利
用できるという低コスト構造の糖鎖産生方法を提供する
ことができる。
清条件で維持した細胞培養系に糖鎖プライマーを投与し
てオリゴ糖鎖を産生させ、さらに、一度糖鎖産生に使用
した細胞を繰り返して使用することにより、細胞を再利
用できるという低コスト構造の糖鎖産生方法を提供する
ことができる。
【図１】図１は、実施例１の培養上清から脂質を抽出し
た後、HPTLCで分析した結果である。なお、レーン1：ガ
ングリオシドミクスチャー（スタンダード）、レーン2
〜5：ＨＬ６０細胞にプライマを投与した培地画分(1,2,
3,4回目)、レーン6：投与した糖鎖プライマ（GlcNAc-C1
2）。また、糖鎖プライマに糖鎖が伸長したオリゴ糖鎖
のバンド（生成物のバンド）をX-1,2,3,4,5,6で示し
た。生成物X-1はGalβ1-4GlcNAc-C12、生成物X-2はGal
β1-4-(Fuc-)GlcNAc-C12、生成物X-3はNeuAcα2-3Gal-G
lcNAc-C12、生成物X-4はNeuAcα2-3Galβ1-4-(Fuc-)Glc
NAc-C12、生成物X-5はNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3G
alβ1-4GlcNAc-C12、生成物X6はNeuAcα2-3Galβ1-4Glc
NAcβ1-3Galβ1-4-(Fuc-)GlcNAc-C12である。
た後、HPTLCで分析した結果である。なお、レーン1：ガ
ングリオシドミクスチャー（スタンダード）、レーン2
〜5：ＨＬ６０細胞にプライマを投与した培地画分(1,2,
3,4回目)、レーン6：投与した糖鎖プライマ（GlcNAc-C1
2）。また、糖鎖プライマに糖鎖が伸長したオリゴ糖鎖
のバンド（生成物のバンド）をX-1,2,3,4,5,6で示し
た。生成物X-1はGalβ1-4GlcNAc-C12、生成物X-2はGal
β1-4-(Fuc-)GlcNAc-C12、生成物X-3はNeuAcα2-3Gal-G
lcNAc-C12、生成物X-4はNeuAcα2-3Galβ1-4-(Fuc-)Glc
NAc-C12、生成物X-5はNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3G
alβ1-4GlcNAc-C12、生成物X6はNeuAcα2-3Galβ1-4Glc
NAcβ1-3Galβ1-4-(Fuc-)GlcNAc-C12である。
【図２】図２は、実施例２において培養上清から脂質抽
出した後、HPTLCで分析した結果である。なお、レーン
1：ガングリオシドスタンダード(GM3,GM2,GM1,GD1a)、
レーン2：内皮細胞に糖鎖プライマを投与した培地画
分、レーン3,4,5：SMC細胞に糖鎖プライマを投与した培
地画分(1,2,3回目)、レーン6：投与した糖鎖プライマ(L
ac型)。また、糖鎖プライマに糖鎖が伸長したオリゴ糖
鎖のバンド（生成物のバンド）をX-1,2,3で示した。生
成物X-1はGal-Lac-C12、生成物X-2はNeuAc-Lac-C12、生
成物X-3は、GalNAc-(NeuAc)- Lac-C12である。
出した後、HPTLCで分析した結果である。なお、レーン
1：ガングリオシドスタンダード(GM3,GM2,GM1,GD1a)、
レーン2：内皮細胞に糖鎖プライマを投与した培地画
分、レーン3,4,5：SMC細胞に糖鎖プライマを投与した培
地画分(1,2,3回目)、レーン6：投与した糖鎖プライマ(L
ac型)。また、糖鎖プライマに糖鎖が伸長したオリゴ糖
鎖のバンド（生成物のバンド）をX-1,2,3で示した。生
成物X-1はGal-Lac-C12、生成物X-2はNeuAc-Lac-C12、生
成物X-3は、GalNAc-(NeuAc)- Lac-C12である。
【図３】図３は、実施例３において培養上清から脂質抽
出した後、HPTLCで分析した結果である。なお、レーン
1：ガングリオシドスタンダード(GM3,GM2,GM1,GD1a)、
レーン2：GlcNAc型プライマ、レーン3,4,5：SMC細胞にG
lcNAc型プライマを投与した培地画分(1,2,3回目)。ま
た、糖鎖プライマに糖鎖が伸長したオリゴ糖鎖のバンド
（生成物のバンド）をX-1,2,3で示した。生成物X-1はGa
lβ1-4GlcNAc-C12、生成物X-2はGalβ1-4-(Fuc-)GlcNAc
-C12、生成物X-3はNeuAcα2-3Gal-GlcNAc-C12である。
出した後、HPTLCで分析した結果である。なお、レーン
1：ガングリオシドスタンダード(GM3,GM2,GM1,GD1a)、
レーン2：GlcNAc型プライマ、レーン3,4,5：SMC細胞にG
lcNAc型プライマを投与した培地画分(1,2,3回目)。ま
た、糖鎖プライマに糖鎖が伸長したオリゴ糖鎖のバンド
（生成物のバンド）をX-1,2,3で示した。生成物X-1はGa
lβ1-4GlcNAc-C12、生成物X-2はGalβ1-4-(Fuc-)GlcNAc
-C12、生成物X-3はNeuAcα2-3Gal-GlcNAc-C12である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 近藤 哲司
滋賀県大津市園山１−１−１ 東レ株式会
社滋賀事業場内
Ｆターム(参考） 4B064 AF04 CA10 CC03 CD01 CD09
CD20 CD21 CD30 DA01
Claims (8)
- 【請求項１】 無血清または低濃度血清条件に順化した
細胞培養系に糖鎖プライマーを投与してオリゴ糖鎖を産
生させることを特徴とするオリゴ糖鎖の生産方法。 - 【請求項２】 オリゴ糖鎖の産生時の血清濃度を１％以
下とすることを特徴とする請求項１記載のオリゴ糖鎖の
生産方法。 - 【請求項３】 前記培養系に細胞成長因子が含有される
ことを特徴とする請求項１記載のオリゴ糖鎖の生産方
法。 - 【請求項４】 前記培養系にインシュリンおよび/また
はトランスフェリンが含有されることを特徴とする請求
項１記載のオリゴ糖鎖の生産方法。 - 【請求項５】 前記培養系に微量必須重金属が含有され
ることを特徴とする請求項１記載のオリゴ糖鎖の生産方
法。 - 【請求項６】 継代培養しながら血清濃度を徐々に減少
させて無血清またはは低血清培地に順化させた細胞を使
用することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載
のオリゴ糖鎖の生産方法。 - 【請求項７】 前記培養系が高密度大量培養系であるこ
とを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のオリゴ
糖鎖の生産方法。 - 【請求項８】 細胞が一度オリゴ糖鎖の生産に用いられ
たものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか
に記載のオリゴ糖鎖の生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002083865A JP2003274990A (ja) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | オリゴ糖鎖の生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002083865A JP2003274990A (ja) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | オリゴ糖鎖の生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003274990A true JP2003274990A (ja) | 2003-09-30 |
Family
ID=29206947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002083865A Pending JP2003274990A (ja) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | オリゴ糖鎖の生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003274990A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005099338A1 (ja) * | 2003-10-14 | 2007-08-16 | 株式会社グライコメディクス | 新規糖鎖プライマー |
| JP2007282630A (ja) * | 2006-03-22 | 2007-11-01 | Glycomedics Inc | オリゴ糖鎖合成方法 |
-
2002
- 2002-03-25 JP JP2002083865A patent/JP2003274990A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005099338A1 (ja) * | 2003-10-14 | 2007-08-16 | 株式会社グライコメディクス | 新規糖鎖プライマー |
| JP2007282630A (ja) * | 2006-03-22 | 2007-11-01 | Glycomedics Inc | オリゴ糖鎖合成方法 |
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