JP2003250540A - 耐熱性ヒドロゲナーゼの作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒドロゲナーゼの耐熱性を向上させる手段を
提供する。 【解決手段】 ヒドロゲナーゼにおいて、特定のアミノ
酸をイソロイシンに置換することを特徴とする耐熱性ヒ
ドロゲナーゼの作製方法、該方法によって作製された耐
熱性ヒドロゲナーゼ、該耐熱性ヒドロゲナーゼをコード
するDNA、該DNAを含む耐熱性ヒドロゲナーゼ生産微生
物、該微生物の作製方法、及び該微生物を用いた耐熱性
ヒドロゲナーゼの生産方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、耐熱性ヒドロゲナ
ーゼの作製方法、該方法によって作製された耐熱性ヒド
ロゲナーゼ、該耐熱性ヒドロゲナーゼをコードするDN
A、該DNAを含む耐熱性ヒドロゲナーゼ生産微生物、該微
生物の作製方法、及び該微生物を用いた耐熱性ヒドロゲ
ナーゼの生産方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒドロゲナーゼは、水素による電子伝達
体の還元やその逆反応による水素発生を触媒する酵素
で、水素の工業的生産や燃料電池の触媒など様々な産業
分野での利用が期待されている。このような工業的用途
に利用されるヒドロゲナーゼは、安定性の高いものでな
ければならず、熱により容易に失活してしまうようなも
のは使用できない。

【０００３】熱に対して耐性を示すヒドロゲナーゼは幾
つか知られている。例えば、ヒドロゲノビブリオ・マリ
ナス（Hydrogenovibrio marinus）由来のヒドロゲナー
ゼ（特開2000-350585号公報）や、好熱性細菌のパイロ
コッカス・フリオソス（Pyrococcus furious）由来のヒ
ドロゲナーゼ（R.Sapra, M.F.J.M.Verhagen, and M.W.
W.Adams, J. Bacteriol. 182:3423-3428(2000) ）など
である。これらの酵素を、遺伝子組換技術を用いて大腸
菌等の微生物に生産させることができれば、耐熱性ヒド
ロゲナーゼの生産性は飛躍的に向上する。しかし、クラ
スIヒドロゲナーゼがその機能を発揮するには、多数の
コファクターが必要であり、単純にヒドロゲナーゼ遺伝
子を大腸菌等に導入しても、活性のあるヒドロゲナーゼ
は得られない。また、ヒドロゲナーゼ遺伝子と共にコフ
ァクターの遺伝子を宿主に導入すれば、理論的には活性
のあるヒドロゲナーゼを得られるはずであるが、現在ま
でにこれに成功した事例はない。

【０００４】以上のことから、活性のある耐熱性ヒドロ
ゲナーゼは、もともとこの酵素の生産能を持つ微生物か
ら得るしかないが、耐熱性ヒドロゲナーゼ生産菌は、上
記したヒドロゲノビブリオ・マリナスを除き、ほとんど
が好熱菌である。さらに好熱性ヒドロゲナーゼの遺伝子
を大腸菌に導入して、活性のあるヒドロゲナーゼを得ら
れた事例もない。また好熱菌は、１００℃近い高温で培
養しなければならず、培養コスト等に大きな問題があ
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】非耐熱性ヒドロゲナー
ゼに耐熱性を付与する技術があれば、耐熱性ヒドロゲナ
ーゼを得るために、わざわざ培養の困難な好熱菌等を培
養する必要がなくなる。

【０００６】本発明は、以上のような技術的背景の下に
なされたものであり、その目的は、ヒドロゲナーゼの耐
熱性を向上させる手段を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意検討を重ねた結果、ラルストニア・ユ
ウトロファ由来のヒドロゲナーゼの大サブユニットの１
８１番目のプロリン又は２４３番目のロイシンをイソロ
イシンに置換することにより、ヒドロゲナーゼの耐熱性
が著しく向上することを見出し、本発明を完成するに至
った。

【０００８】即ち、本発明の第一は、ヒドロゲナーゼに
おいて、配列番号２記載のアミノ酸配列の１８１番目の
プロリン又は２４３番目のロイシンに相当するアミノ酸
をイソロイシンに置換することを特徴とする耐熱性ヒド
ロゲナーゼの作製方法である。

【０００９】本発明の第二は、上記方法によって作製さ
れた耐熱性ヒドロゲナーゼである。

【００１０】本発明の第三は、上記耐熱性ヒドロゲナー
ゼをコードするDNAである。

【００１１】本発明の第四は、上記DNAを含み、耐熱性
ヒドロゲナーゼを生産する微生物である。

【００１２】本発明の第五は、上記微生物を培養し、得
られる培養物から耐熱性ヒドロゲナーゼを採取すること
を特徴とする耐熱性ヒドロゲナーゼの生産方法である。

【００１３】本発明の第六は、以下の工程を含む耐熱性
ヒドロゲナーゼを生産する微生物の作製方法である。 （１）ヒドロゲナーゼの全部又は一部をコードするDNA
断片であって、配列番号２記載のアミノ酸配列の１８１
番目のプロリン又は２４３番目のロイシンに相当するア
ミノ酸をコードする配列がイソロイシンをコードする配
列に置換されているDNA断片を作製する工程 （２）（１）で作製したDNA断片、抗生物質に対する耐
性遺伝子、及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子を
含むベクターを作製する工程 （３）（２）で作製したベクターを微生物に導入する工
程 （４）（３）でベクターを導入した微生物とヒドロゲナ
ーゼを生産する微生物を共存させる工程 （５）ヒドロゲナーゼを生産する微生物を前述の抗生物
質を含む培地中で培養し、（１）で作製したDNA断片、
抗生物質に対する耐性遺伝子、及び特定条件下で致死性
を発揮する遺伝子がゲノムDNA中に挿入された菌株を選
抜する工程 （６）（５）で選抜した菌株を前述の致死性遺伝子が致
死性を発揮する条件下で培養し、抗生物質に対する耐性
遺伝子及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子が脱落
した菌株を選抜する工程

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 ＜１．耐熱性ヒドロゲナーゼの作製方法＞本発明の耐熱
性ヒドロゲナーゼの作製方法は、ヒドロゲナーゼにおい
て、特定のアミノ酸をイソロイシンに置換することを特
徴とするものである。

【００１５】ヒドロゲナーゼとしては、クラスIヒドロ
ゲナーゼを使用することができるが、他のヒドロゲナー
ゼを使用してもよい。クラスIヒドロゲナーゼとは、膜
結合型で、分子内部にニッケル・鉄クラスターを保持し
ているタイプのヒドロゲナーゼをいい、通常、このヒド
ロゲナーゼをコードする遺伝子は、ゲノムDNA上におい
て、小サブユニット遺伝子、大サブユニット遺伝子の順
に隣接して存在することが知られている（L.-F.Wu and
M.A.Madrand, FEMS Microbiology Reviews 104:243-270
(1993)）。

【００１６】本発明で使用するヒドロゲナーゼとして
は、ラルストニア・ユウトロファ（Ralstonia eutroph
a）、オリゴトロファ・カルボキシドボランス（Oligotr
opha carboxidovorans）、アゾトバクタ・ビネランディ
（Azotobacter vinelandii）、アゾトバクター・クロロ
コッカム（Azotobacter chroococcum）、シュードモナ
ス・ハイドロゲノボーラ（Pseudomonas hydrogenovor
a）、ロドバクタ・カプスラータ（Rhodobacter capsula
tus）、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhiz
obium japonicum）由来のヒドロゲナーゼ等を例示でき
るが、これらに限定されるわけではない。なお、これら
のヒドロゲナーゼはいずれも公知であり、また、そのア
ミノ酸配列はGenBank等に登録されているので（表
１）、当業者はこれらのヒドロゲナーゼを必要に応じ適
宜使用することができる。

【００１７】上述の特定のアミノ酸とは、ラルストニア
・ユウトロファ由来のヒドロゲナーゼの大サブユニット
（このサブユニットのアミノ酸配列は配列番号２に示す
通りである）の１８１番目のプロリンに相当するアミノ
酸（以下、「P181相当アミノ酸」という）、又は２４３
番目のロイシンに相当するアミノ酸（以下、「L243相当
アミノ酸」という）をいう。ヒドロゲナーゼのどのアミ
ノ酸が、P181相当アミノ酸又はL243相当アミノ酸に相当
するかは、ラルストニア・ユウトロファ由来のヒドロゲ
ナーゼの大サブユニットのアミノ酸配列とそのヒドロゲ
ナーゼの大サユニットのアミノ酸配列とをアミノ酸の同
一性等を指標として整列させてみることによりわかる。
上記で例示したヒドロゲナーゼのP181相当アミノ酸又は
L243相当アミノ酸は、表１に示すとおりである。

【００１８】

【表１】 ＜２．耐熱性ヒドロゲナーゼ＞本発明の耐熱性ヒドロゲ
ナーゼは、上記方法によって作製されたものである。 ＜３．DNA＞本発明のDNAは、上記耐熱性ヒドロゲナーゼ
をコードするものである。本発明のDNAの一例として
は、配列番号１記載の塩基配列で表されるDNAを挙げる
ことができる。 ＜４．微生物＞本発明の微生物は、上記DNAを含み、耐
熱性ヒドロゲナーゼを生産するものである。本発明の微
生物としては、M2R株やM3R株を例示することができる。
M2Rは、P181相当アミノ酸がイソロイシンに置換された
変異型ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を持ち、M3R
株は、L243相当アミノ酸がイソロイシンに置換された変
異型ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を持つ。これら
の菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物
寄託センターに、それぞれ受託番号FERM P-18709、FERM
P-18710として寄託されている（受託日：平成14年2月1
3日）。 ＜５．耐熱性ヒドロゲナーゼの生産方法＞本発明の耐熱
性ヒロドゲナーゼの生産方法は、上記微生物を培養し、
得られる培養物から耐熱性ヒドロゲナーゼを採取するこ
とを特徴とするものである。

【００１９】微生物の培養方法は、使用する微生物の種
類に応じて決めればよい。例えば、ラルストニア・ユト
ロファを使用する場合は、LB培地（1% 酵母エキス、0.5
%トリプトン、1% NaCl）、FN培地(O. Lenz, E. Schwart
z, M. Eitinger, B. Friedrich (1994) J. Bacteriol.
176, 4385-4393)などで、培養温度を30〜37℃に設定
し、培養することができる。

【００２０】培養物からの耐熱性ヒドロゲナーゼの採取
は、微生物からタンパク質を採取する際に常用される方
法に従って行うことができる。例えば、耐熱性ヒドロゲ
ナーゼが菌体外に生産される場合には、培養液をそのま
ま使用するか、遠心分離等により菌体を除去し、その
後、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、アフィニティ−クロマトグラフィー等を単独又は適
宜組み合わせて用いることにより、培養物中から耐熱性
ヒドロゲナーゼを採取することができる。また、耐熱性
ヒドロゲナーゼが菌体内に生産される場合には、超音
波、フレンチプレス、ガラスビーズを使用するホモジナ
イザーなどを用いて菌体を破砕し、その破砕液について
上記と同様の処理を行うことにより、培養物中から耐熱
性ヒドロゲナーゼを採取することができる。

【００２１】なお、ここでいう培養物とは、培養後の培
地上清、培養により得られた細胞若しくは細胞の破砕物
のいずれをも意味するものである。 ＜６．微生物の作製方法＞本発明の微生物の作製方法
は、以下の（１）〜（６）の工程を含むものである。

【００２２】工程（１）では、ヒドロゲナーゼの全部又
は一部をコードするDNA断片であって、P181相当アミノ
酸又はL243相当アミノをコードする配列がイソロイシン
をコードする配列に置換されているDNA断片を作製す
る。

【００２３】ヒドロゲナーゼは、上述の耐熱性ヒドロゲ
ナーゼの作製方法と同様のものを使用することができ
る。DNA断片は、ヒドロゲナーゼの全長をコードするも
のであることが好ましいが、相同組換えを起こさせるこ
とができるのであれば、ヒドロゲナーゼの一部分をコー
ドするものであってもよい。ヒドロゲナーゼのどのアミ
ノ酸が、P181相当アミノ酸又はL243相当アミノに相当す
るかは、上述の耐熱性ヒドロゲナーゼの作製方法と同様
に、アミノ酸配列の整列によりわかる。配列の置換は、
PCRなどによって行うことができる。

【００２４】工程（２）では、（１）で作製したDNA断
片、抗生物質に対する耐性遺伝子、及び特定条件下で致
死性を発揮する遺伝子を含むベクターを作製する。抗生
物質耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン耐
性遺伝子を使用できるが、他の遺伝子を使用してもよ
い。特定条件下で致死性を発揮する遺伝子としては、例
えば、sacB遺伝子を使用することができるが、他の遺伝
子を使用してもよい。sacB遺伝子は、高スクロース条件
下で致死性を発揮する遺伝子であり、この遺伝子が組み
込まれた菌株は、スクロースを高濃度で含む培地中では
死滅してしまう。なお、sacB遺伝子の配列は、GenBank
に登録されている（Accession No. X02730）。

【００２５】工程（３）では、（２）で作製したベクタ
ーを微生物に導入する。ここで使用する微生物は特に限
定されず、大腸菌などでよい。ベクターを導入する方法
も特に限定されず、常法に従って行うことができる。

【００２６】工程（４）では、（３）でベクターを導入
した微生物とヒドロゲナーゼを生産する微生物を共存さ
せる。このように２種類の微生物を共存させることによ
り、ベクターとヒドロゲナーゼ生産微生物のゲノムDNA
間で相同組換えが起こる。なお、ここでいうヒドロゲナ
ーゼ生産微生物とは、工程（１）におけるヒドロゲナー
ゼと同種のヒドロゲナーゼを生産する微生物である。

【００２７】工程（５）では、ヒドロゲナーゼを生産す
る微生物を前述の抗生物質を含む培地中で培養し、
（１）で作製したDNA断片、抗生物質に対する耐性遺伝
子、及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子がゲノム
DNA中に挿入された菌株を選抜する。

【００２８】工程（６）では、（５）で選抜した菌株を
前述の致死性遺伝子が致死性を発揮する条件下で培養
し、抗生物質に対する耐性遺伝子及び特定条件下で致死
性を発揮する遺伝子が脱落した菌株を選抜する。致死性
を発揮する条件は、使用した致死性遺伝子に応じて決め
ればよく、例えば、致死性遺伝子としてsacB遺伝子を使
用した場合には、高濃度のスクロースを含む培地での培
養が、致死性を発揮する条件になる。

【００２９】

【実施例】ヒドロゲノビブリオ・マリナス由来のヒドロ
ゲナーゼは、高い酸素安定性と耐熱性を示す（特開2000
-350585号公報）。この微生物由来のヒドロゲナーゼの
大サブユニットに存在するイソロイシン残基の数を調べ
てみたところ、他の耐熱性ヒドロゲナーゼと同様にイソ
ロイシン含量が高かった（表２）。

【００３０】

【表２】

【００３１】また、ヒドロゲノビブリオ・マリナス由来
のヒドロゲナーゼ（大サブユニット）のアミノ酸配列と
他の微生物の由来のヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を整
列させてみた（図１及び図２）。

【００３２】デサルホビブリオ・ギガス由来のヒドロゲ
ナーゼについては、その結晶構造が解析されており、タ
ンパク質内部の疎水的コアの存在する位置（図中のInと
記された部位）や大・小サブユニットの境界面の位置
（図中のInterfaceと記された部位）が推定可能なの
で、ヒドロゲノビブリオ・マリナス由来のヒドロゲナー
ゼにおけるこれらの位置も推定することができる。これ
らの部位のアミノ酸について、ヒドロゲノビブリオ・マ
リナス由来のヒドロゲナーゼと他の微生物由来のヒドロ
ゲナーゼを比較したところ、他の微生物では、バリン、
ロイシン、アラニンなどであるのに対し、ヒドロゲノビ
ブリオ・マリナスでは、より疎水的なイソロイシンにな
っていた。

【００３３】以上のことから、非耐熱性ヒドロゲナーゼ
において、疎水的コアや大−小サブユニット境界面に位
置すると推定されるアミノ酸をイソロイシンに置換する
ことにより、非耐熱性ヒドロゲナーゼを耐熱性ヒドロゲ
ナーゼに変換できると予想される。

【００３４】そこで、ラルストニア・ユウトロファ由来
の非耐熱性ヒドロゲーナゼに耐熱性を付与するため、以
下の実験を行った。

【００３５】なお、図１及び図２において、アミノ酸配
列上に示された矢印は、以下の実験で変異を導入したア
ミノ酸の位置を表している。また、アルファベットを伴
う矢印はβ-シートを形成している部位を示し、数字を
伴うボックスはα-ヘリックスを形成している部位を示
す（いずれもデサルホビブリオ・ギガス由来のヒドロゲ
ナーゼの結晶解析から推定されたものである。）。更
に、図中のHma、Reu、Oca、Avi、Ach、Phy、Rca、Bja、
Dgiは、それぞれヒドロゲノビブリオ・マリナス、ラル
ストニア・ユウトロファ、オリゴトロファ・カルボキシ
ドボランス、アゾトバクタ・ビネランディ、アゾトバク
タ・クロロコッカム、シュードモナス・ハイドロゲノボ
ーラ、ロドバクタ・カプスラータ、ブラディリゾビウム
・ジャポニカム、デサルホビブリオ・ギガスを表してい
る。

【００３６】〔実施例１〕 ラルストニア・ユウトロフ
ァの野生株の作製 Ralstonia eutropha H16株は細胞内に可溶性ヒドロゲナ
ーゼと膜結合型ヒドロゲナーゼの２種類のヒドロゲナー
ゼを保有する（B. Friedrich, E. Schwartz (1993) Ann
u. Rev. Microbiol. 47, 351-383）。今回ヒドロゲナー
ゼに変異を導入するのは膜結合型のヒドロゲナーゼであ
る。そのため、変異の効果をより明確に判断するため
に、Ralstonia eutropha H16株の可溶性ヒドロゲナーゼ
をマッサンツらの方法（C. Massanz, V.M. Fernandez,
B. Friedrich (1997) Eur. J. Biochem. 245, 441-44
8）で欠落させたRalstonia eutropha HF387株を野生株
として使用した。

【００３７】〔実施例２〕 アミノ酸(１塩基)置換ヒド
ロゲナーゼの作製 Ralstonia eutropha H16株由来の膜結合型ヒドロゲナー
ゼ遺伝子がクローン化されたプラスミドpCH182（M. Ber
nhard, E. Schwartz, J. Rietdorf, B. Frisedrich (19
96) J. Bacteriol. 178, 4522-4529）を保有する大腸菌
をLB培地で培養し、QIAGENのPlasmid Midi Kitを用いて
pCH182を抽出した。抽出したpCH182を鋳型DNAとして、
２段階PCR法（O. P. Kuipers, H. J. Boot, W. M. de V
os (1991)Nucleic Acid Res. 19, 4558）を用いて、以
下の５種類の変異を導入したDNA断片を調製した。

【００３８】

【表３】

【００３９】２段階PCR法は、表６に記載したプライマ
ーを変異導入用プライマーとして1回目のPCRを行い、得
られたPCR産物をQIAGENのQIAquick Gel Extraction Kit
を用いて精製した後、これをメガプライマーとして2回
目のPCRを行った。PCRの条件は以下の通りである。

【００４０】

【表４】

【００４１】

【表５】

【００４２】

【表６】

【００４３】得られたDNA断片をpBluescript(Stratagen
e Cloning Systems)に挿入し、大腸菌XL-1 Blue(Strata
gene Cloning Systems)に形質転換した。形質転換体をL
B培地で培養し、QIAGENのQIAprep Spin Miniprep Kitを
用いてプラスミドを調製してシークエンスを行った。ア
マシャムファルマシアバイオテクのDYEnamic Direct Cy
cle Sequencing Kit with 7-deaza dGTP (no primer)を
用いてシークエンス反応を行い、DNA sequencer LIC-42
00S (LI-COR, Inc.)により解析を行った。

【００４４】〔実施例３〕 変異ヒドロゲナーゼのラル
ストニア・ユウトロファ野生株への形質転換 上記５種類の変異が導入されたヒドロゲナーゼ遺伝子を
含む断片を制限酵素で切り出して、ラルストニア・ユウ
トロファへの相同組換え導入用スーサイド・ベクターpL
O3に挿入した。スーサイド・ベクターpLO3は、レンツら
の方法（O. Lenz, B. Friedrich (1998) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 95, 12474-12479）に従って作製した。
即ち、pNEB194(New England Biolabs, Inc.)のポリリン
カー部位を含む0.08kbのHindIII-EcoRIをKlenow fragme
nt(New England Biolabs, Inc.)で平滑末端化し、同じ
くKlenow fragmentで平滑末端化したpBR322(New Englan
dBiolabs, Inc.)のEcoRI-DraIサイトに連結した(pCH63
9)。pUD800（P. Gay, D. Le Cop, M. Steinmetz, T. Be
rkelman, C. I. Kado (1985) J. Bacteriol. 164,918-9
21）のsacB遺伝子を含む1.96kb BamHI-NdeIを平滑末端
化し、平滑末端化したpCH639のStyI-BsaIサイトに連結
した(pCH640)。pCH640をNdeIで切断して平滑末端化した
後、pJF145（J. P. Fuerste, W. Pansegrau, G. Ziegel
in, M. Kroeger, E. Lanka (1979) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86, 1771-1775）由来のoriTを平滑末端化した
0.47kb BamHI断片としてサブクローニングし、pLO3を作
製した。

【００４５】変異型ヒドロゲナーゼ遺伝子を挿入したス
ーサイド・ベクターpLO3をRalstonia eutropha HF387株
に接合伝達し、相同組換えにより膜結合型ヒドロゲナー
ゼ遺伝子に変異が導入された組換え体を選抜した。接合
伝達は、R. Simonらの方法（R. Simon, U. Priefer, U.
Puehler (1983) Bio/Technology 1, 784-791）に従っ
て行い、組換え体の選抜は、O. Lenzらの方法（O. Len
z, E. Schwartz, M. Eitinger, B. Friedrich (1994)
J. Bacteriol. 176, 4385-4393）に従って行った。即
ち、上述のプラスミドを保有する大腸菌をテトラサイク
リン含有LB培地10mlで、 R.eutropha HF387株をLB培地1
0mlで37℃で一晩培養した。滅菌水で菌体を洗浄した
後、菌体を1mlの滅菌水に懸濁し、0.2mlずつをLB平板培
地上で混合して37℃で一晩培養することによってプラス
ミドの接合伝達を行わせた。次に、相同組換えにより野
生型ヒドロゲナーゼ遺伝子に変異が導入された組換え体
を選抜した。まず、pLO3に連結した変異型ヒドロゲナー
ゼ遺伝子とラルストニア・ユウトロファに存在する野生
型ヒドロゲナーゼ遺伝子との間で相同組み換えを１ヶ所
で起こした組換え体（pLO3がゲノム中にインテグレート
された状態）を、pLO3にコードされているテトラサイク
リン耐性をマーカーとして選抜した。次に、この組換え
体をLB培地10mlに植菌して37℃で一晩培養した後、15%
のスクロースを含むLB平板培地に植菌して37℃で培養
し、ゲノムにインテグレートされたpLO3上にある変異型
ヒドロゲナーゼ遺伝子と野生型ヒドロゲナーゼ遺伝子と
の間の別の部位で、再度組み換えが生じることによって
pLO3が脱落した組み換え体をsacBをマーカーとして選抜
した。すなわち、この15%スクロース含有培地でコロニ
ーを形成する高濃度スクロース耐性株を、外部から導入
した変異型ヒドロゲナーゼ遺伝子と野生型ヒドロゲナー
ゼ遺伝子との間で遺伝子配列の交換が起こった相同組換
え体として選抜した。

【００４６】〔実施例４〕 ヒドロゲナーゼの活性中心
の耐熱性評価 上記のようにして得られたヒドロゲナーゼ変異株をヒド
ロゲナーゼ発現用培地であるFGN培地（O. Lenz, E. Sch
wartz, M. Eitinger, B. Friedrich (1994) J.Bacterio
l. 176, 4385-4393）で培養し、菌体から膜結合型ヒド
ロゲナーゼを含む膜画分をNishiharaらの方法（H. Nish
ihara, Y. Miyashita, K. Aoyama, T. Kodama, Y. Igar
ashi, Y. Takamura (1997) Biochem. Biophys. Res. Co
mmun. 232, 766-770）により調製した。

【００４７】この膜画分を70℃に加熱して経時的にサン
プリングし、残存する重水素置換活性を測定し、これに
よりヒドロゲナーゼの活性中心の耐熱性を評価した。重
水素置換反応の測定は、 Cammackらの方法（R. Cammac
k, V. M. Fernandez, E. C. Hatchikian (1994) Method
s. Enzymol. 234, 43-68）に従って行った。即ち、あら
かじめ重水素で飽和した10mlの50mM酢酸バッファーに、
シリンジで酵素液を添加することにより反応を開始し
た。気相中に発生する水素の量を質量分析計で経時的に
測定し、単位時間当たりの水素発生量で活性強度を表し
た。この結果を図３に示す。

【００４８】図３に示すように、変異の導入されたヒド
ロゲナーゼは、いずれも野生型ヒドロゲナーゼよりも活
性が高く、活性中心の耐熱性は向上した。

【００４９】〔実施例５〕 ヒドロゲナーゼのサブユニ
ット構造の耐熱性評価 実施例４で調製した膜画分を55℃に加熱して経時的にサ
ンプリングし、残存するメチレンブルー還元活性を測定
した。メチレンブルーを還元するためには、ヒドロゲナ
ーゼの活性中心(大サブユニット)で水素から引き抜かれ
た電子が小サブユニットにうまく伝達されることが必要
なので、メチレンブルー還元活性を測定することによ
り、サブユニット構造の耐熱性を評価することができ
る。メチレンブルー還元反応の測定は、SchinkとH. G.
Schlegelの方法（B. Schink, H. G. Schlegel (1979) B
iochem. Biophys. Acta 567, 315-324）に従って行っ
た。この結果を図４に示す。

【００５０】図４に示すように、サブユニット構造の安
定性については、野生型ヒドロゲナーゼよりも安定性が
低下したものもあり（V115I、V253I、N168I,L170I）、
安定性が向上したのは、P181I及びL243Iの２つだけであ
った。

【００５１】

【発明の効果】本発明は、ヒドロゲナーゼに耐熱性を付
与する手段を提供する。これにより、非耐熱性のヒドロ
ゲナーゼ生産菌を耐熱性ヒドロゲナーゼ生産菌に変える
ことができるようになる。従って、培養の容易な細菌を
選択し、効率的に耐熱性ヒドロゲナーゼの生産が可能に
なる。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOKYO GAS CO., LTD. <120> Method for producing Thermostable Hydrogenases <130> P02-001 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1857 <212> DNA <213> Ralstonia eutropha <220> <221> CDS <222> (1)..(1854) <400> 1 atg tca gct tac gca acc caa ggc ttc aat ctt gac gac cgc ggc cgt 48 Met Ser Ala Tyr Ala Thr Gln Gly Phe Asn Leu Asp Asp Arg Gly Arg 1 5 10 15 cgc att gtc gtc gat ccc gtc acc cgc atc gag ggt cat atg cgc tgc 96 Arg Ile Val Val Asp Pro Val Thr Arg Ile Glu Gly His Met Arg Cys 20 25 30 gag gtg aat gtc gat gcc aac aat gtc att cgc aac gct gtt tcc act 144 Glu Val Asn Val Asp Ala Asn Asn Val Ile Arg Asn Ala Val Ser Thr 35 40 45 ggt acc atg tgg cgc gga ctg gaa gtg att ctc aag ggc cgc gat ccg 192 Gly Thr Met Trp Arg Gly Leu Glu Val Ile Leu Lys Gly Arg Asp Pro 50 55 60 cgc gac gcc tgg gcg ttc gta gaa cgc atc tgc ggt gtt tgt acc ggt 240 Arg Asp Ala Trp Ala Phe Val Glu Arg Ile Cys Gly Val Cys Thr Gly 65 70 75 80 tgt cac gcg ctt gcg tcg gtg cgt gcc gtg gaa aac gcg ctc gac atc 288 Cys His Ala Leu Ala Ser Val Arg Ala Val Glu Asn Ala Leu Asp Ile 85 90 95 aga att cca aag aac gcc cat ctg atc cga gag atc atg gcc aag acg 336 Arg Ile Pro Lys Asn Ala His Leu Ile Arg Glu Ile Met Ala Lys Thr 100 105 110 ttg cag gtg cat gac cat gcg gtg cat ttc tat cac ctg cat gcg ctg 384 Leu Gln Val His Asp His Ala Val His Phe Tyr His Leu His Ala Leu 115 120 125 gat tgg gtg gat gtc atg tca gcc ctg aaa gcc gac ccg aag agg act 432 Asp Trp Val Asp Val Met Ser Ala Leu Lys Ala Asp Pro Lys Arg Thr 130 135 140 tcc gag ttg cag cag tta gtt tcg cct gcg cat ccg ctg tcc tcg gca 480 Ser Glu Leu Gln Gln Leu Val Ser Pro Ala His Pro Leu Ser Ser Ala 145 150 155 160 ggc tat ttc cgc gat att caa aat cga ctc aag cgc ttt gtc gag agt 528 Gly Tyr Phe Arg Asp Ile Gln Asn Arg Leu Lys Arg Phe Val Glu Ser 165 170 175 ggt cag ctt ggc cct ttc atg aat ggg tac tgg gga tcc aag gct tat 576 Gly Gln Leu Gly Pro Phe Met Asn Gly Tyr Trp Gly Ser Lys Ala Tyr 180 185 190 gtg ctg ccg ccg gag gcc aat ctg atg gcg gtc acg cat tat ttg gaa 624 Val Leu Pro Pro Glu Ala Asn Leu Met Ala Val Thr His Tyr Leu Glu 195 200 205 gcg ctg gac cta cag aag gag tgg gtg aaa atc cac acc atc ttc ggc 672 Ala Leu Asp Leu Gln Lys Glu Trp Val Lys Ile His Thr Ile Phe Gly 210 215 220 ggc aag aat ccg cac ccg aac tac ttg gtc ggt ggc gtg ccg tgc gcg 720 Gly Lys Asn Pro His Pro Asn Tyr Leu Val Gly Gly Val Pro Cys Ala 225 230 235 240 atc aat ctc gat ggt atc ggg gct gcc agc gcg ccg gta aat atg gag 768 Ile Asn Leu Asp Gly Ile Gly Ala Ala Ser Ala Pro Val Asn Met Glu 245 250 255 cgc ttg agc ttc gtt aag gcg cgc atc gac gag atc atc gaa ttc aat 816 Arg Leu Ser Phe Val Lys Ala Arg Ile Asp Glu Ile Ile Glu Phe Asn 260 265 270 aag aat gta tac gtg cca gac gtg ctc gcc atc ggc aca ctg tat aaa 864 Lys Asn Val Tyr Val Pro Asp Val Leu Ala Ile Gly Thr Leu Tyr Lys 275 280 285 cag gcc ggg tgg ctg tac ggc ggc ggg ctg gca gcc acc aac gtg ctt 912 Gln Ala Gly Trp Leu Tyr Gly Gly Gly Leu Ala Ala Thr Asn Val Leu 290 295 300 gac tac ggc gag tac ccg aac gtt gcc tac aac aag agc act gac caa 960 Asp Tyr Gly Glu Tyr Pro Asn Val Ala Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Gln 305 310 315 320 ctg ccc ggc ggc gcg atc ctc aac ggc aac tgg gac gaa gta ttt cca 1008 Leu Pro Gly Gly Ala Ile Leu Asn Gly Asn Trp Asp Glu Val Phe Pro 325 330 335 gtg gat ccg cgc gac tcc caa cag gtg cag gaa ttc gtg tcg cac agc 1056 Val Asp Pro Arg Asp Ser Gln Gln Val Gln Glu Phe Val Ser His Ser 340 345 350 tgg tac aag tat gcc gac gag agc gta ggt ctg cat ccc tgg gac ggc 1104 Trp Tyr Lys Tyr Ala Asp Glu Ser Val Gly Leu His Pro Trp Asp Gly 355 360 365 gtg act gag ccc aat tac gtg ctc ggt gca aac act aag ggt aca cgc 1152 Val Thr Glu Pro Asn Tyr Val Leu Gly Ala Asn Thr Lys Gly Thr Arg 370 375 380 acg cgc atc gag caa atc gac gag agc gcg aag tac tcg tgg att aaa 1200 Thr Arg Ile Glu Gln Ile Asp Glu Ser Ala Lys Tyr Ser Trp Ile Lys 385 390 395 400 tcg ccg cgc tgg cgc ggc cac gcg atg gag gta ggg ccg ctg tcg cgc 1248 Ser Pro Arg Trp Arg Gly His Ala Met Glu Val Gly Pro Leu Ser Arg 405 410 415 tac atc ctt gcc tat gcc cat gcg cgg agc ggc aac aag tac gct gag 1296 Tyr Ile Leu Ala Tyr Ala His Ala Arg Ser Gly Asn Lys Tyr Ala Glu 420 425 430 cgt ccc aag gag cag ctt gag tac tcc gcg cag atg atc aac agt gcg 1344 Arg Pro Lys Glu Gln Leu Glu Tyr Ser Ala Gln Met Ile Asn Ser Ala 435 440 445 ata cca aag gca ttg gga ttg cca gaa aca caa tac acg ctc aag cag 1392 Ile Pro Lys Ala Leu Gly Leu Pro Glu Thr Gln Tyr Thr Leu Lys Gln 450 455 460 ttg ttg ccc agc acg atc ggt cgt acg ctg gcg cgc gca ctc gag agc 1440 Leu Leu Pro Ser Thr Ile Gly Arg Thr Leu Ala Arg Ala Leu Glu Ser 465 470 475 480 caa tat tgc gga gaa atg atg cat agc gac tgg cat gat ctg gtc gcc 1488 Gln Tyr Cys Gly Glu Met Met His Ser Asp Trp His Asp Leu Val Ala 485 490 495 aac atc cgg gcg ggc gat acg gca acc gcc aac gtt gac aag tgg gat 1536 Asn Ile Arg Ala Gly Asp Thr Ala Thr Ala Asn Val Asp Lys Trp Asp 500 505 510 cct gcc acc tgg ccg ctg caa gcc aag ggc gtt ggg acc gtc gct gcg 1584 Pro Ala Thr Trp Pro Leu Gln Ala Lys Gly Val Gly Thr Val Ala Ala 515 520 525 ccg cgc ggc gct ctc gga cac tgg att cgt atc aag gac ggc cgg atc 1632 Pro Arg Gly Ala Leu Gly His Trp Ile Arg Ile Lys Asp Gly Arg Ile 530 535 540 gag aac tat cag tgc gta gtg cct acc acg tgg aat ggc agt ccg cgt 1680 Glu Asn Tyr Gln Cys Val Val Pro Thr Thr Trp Asn Gly Ser Pro Arg 545 550 555 560 gat tac aag ggg cag atc ggc gca ttt gag gct tcg ctg atg aac acc 1728 Asp Tyr Lys Gly Gln Ile Gly Ala Phe Glu Ala Ser Leu Met Asn Thr 565 570 575 cca gtg gtc aac ccg gag cag ccg gtg gaa atc ttg cgc acg ctg cat 1776 Pro Val Val Asn Pro Glu Gln Pro Val Glu Ile Leu Arg Thr Leu His 580 585 590 tcg ttc gat ccc tgt ctg gcg tgt tcg act cac gtc atg agc gcg gaa 1824 Ser Phe Asp Pro Cys Leu Ala Cys Ser Thr His Val Met Ser Ala Glu 595 600 605 ggc cag gaa ctc act aca gtc aag gtg cga taa 1857 Gly Gln Glu Leu Thr Thr Val Lys Val Arg 610 615 <210> 2 <211> 618 <212> PRT <213> Ralstonia eutropha <400> 2 Met Ser Ala Tyr Ala Thr Gln Gly Phe Asn Leu Asp Asp Arg Gly Arg 1 5 10 15 Arg Ile Val Val Asp Pro Val Thr Arg Ile Glu Gly His Met Arg Cys 20 25 30 Glu Val Asn Val Asp Ala Asn Asn Val Ile Arg Asn Ala Val Ser Thr 35 40 45 Gly Thr Met Trp Arg Gly Leu Glu Val Ile Leu Lys Gly Arg Asp Pro 50 55 60 Arg Asp Ala Trp Ala Phe Val Glu Arg Ile Cys Gly Val Cys Thr Gly 65 70 75 80 Cys His Ala Leu Ala Ser Val Arg Ala Val Glu Asn Ala Leu Asp Ile 85 90 95 Arg Ile Pro Lys Asn Ala His Leu Ile Arg Glu Ile Met Ala Lys Thr 100 105 110 Leu Gln Val His Asp His Ala Val His Phe Tyr His Leu His Ala Leu 115 120 125 Asp Trp Val Asp Val Met Ser Ala Leu Lys Ala Asp Pro Lys Arg Thr 130 135 140 Ser Glu Leu Gln Gln Leu Val Ser Pro Ala His Pro Leu Ser Ser Ala 145 150 155 160 Gly Tyr Phe Arg Asp Ile Gln Asn Arg Leu Lys Arg Phe Val Glu Ser 165 170 175 Gly Gln Leu Gly Pro Phe Met Asn Gly Tyr Trp Gly Ser Lys Ala Tyr 180 185 190 Val Leu Pro Pro Glu Ala Asn Leu Met Ala Val Thr His Tyr Leu Glu 195 200 205 Ala Leu Asp Leu Gln Lys Glu Trp Val Lys Ile His Thr Ile Phe Gly 210 215 220 Gly Lys Asn Pro His Pro Asn Tyr Leu Val Gly Gly Val Pro Cys Ala 225 230 235 240 Ile Asn Leu Asp Gly Ile Gly Ala Ala Ser Ala Pro Val Asn Met Glu 245 250 255 Arg Leu Ser Phe Val Lys Ala Arg Ile Asp Glu Ile Ile Glu Phe Asn 260 265 270 Lys Asn Val Tyr Val Pro Asp Val Leu Ala Ile Gly Thr Leu Tyr Lys 275 280 285 Gln Ala Gly Trp Leu Tyr Gly Gly Gly Leu Ala Ala Thr Asn Val Leu 290 295 300 Asp Tyr Gly Glu Tyr Pro Asn Val Ala Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Gln 305 310 315 320 Leu Pro Gly Gly Ala Ile Leu Asn Gly Asn Trp Asp Glu Val Phe Pro 325 330 335 Val Asp Pro Arg Asp Ser Gln Gln Val Gln Glu Phe Val Ser His Ser 340 345 350 Trp Tyr Lys Tyr Ala Asp Glu Ser Val Gly Leu His Pro Trp Asp Gly 355 360 365 Val Thr Glu Pro Asn Tyr Val Leu Gly Ala Asn Thr Lys Gly Thr Arg 370 375 380 Thr Arg Ile Glu Gln Ile Asp Glu Ser Ala Lys Tyr Ser Trp Ile Lys 385 390 395 400 Ser Pro Arg Trp Arg Gly His Ala Met Glu Val Gly Pro Leu Ser Arg 405 410 415 Tyr Ile Leu Ala Tyr Ala His Ala Arg Ser Gly Asn Lys Tyr Ala Glu 420 425 430 Arg Pro Lys Glu Gln Leu Glu Tyr Ser Ala Gln Met Ile Asn Ser Ala 435 440 445 Ile Pro Lys Ala Leu Gly Leu Pro Glu Thr Gln Tyr Thr Leu Lys Gln 450 455 460 Leu Leu Pro Ser Thr Ile Gly Arg Thr Leu Ala Arg Ala Leu Glu Ser 465 470 475 480 Gln Tyr Cys Gly Glu Met Met His Ser Asp Trp His Asp Leu Val Ala 485 490 495 Asn Ile Arg Ala Gly Asp Thr Ala Thr Ala Asn Val Asp Lys Trp Asp 500 505 510 Pro Ala Thr Trp Pro Leu Gln Ala Lys Gly Val Gly Thr Val Ala Ala 515 520 525 Pro Arg Gly Ala Leu Gly His Trp Ile Arg Ile Lys Asp Gly Arg Ile 530 535 540 Glu Asn Tyr Gln Cys Val Val Pro Thr Thr Trp Asn Gly Ser Pro Arg 545 550 555 560 Asp Tyr Lys Gly Gln Ile Gly Ala Phe Glu Ala Ser Leu Met Asn Thr 565 570 575 Pro Val Val Asn Pro Glu Gln Pro Val Glu Ile Leu Arg Thr Leu His 580 585 590 Ser Phe Asp Pro Cys Leu Ala Cys Ser Thr His Val Met Ser Ala Glu 595 600 605 Gly Gln Glu Leu Thr Thr Val Lys Val Arg 610 615 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 3 gcaccgcatg gtcatggatc tgcaacgtct tggcc 35 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 4 ccccagtacc cattcatgaa aatgccaagc tgaccactc 39 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 5 ggcagccccg ataccatcga tattgatcgc gcacgg 36 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 6 caagcgctcc atattaatcg gcgcgctggc agcc 34 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 7 cgacaaagcg cttgattcga atttgaatat cgcggaaata gc 42

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒドロゲナーゼ大サブユニットのアライメント
の結果を示す図である（前半）。

【図２】ヒドロゲナーゼ大サブユニットのアライメント
の結果を示す図である（後半）。

【図３】ヒドロゲナーゼ画分の重水素置換活性の経時的
変化を示す図である。

【図４】ヒドロゲナーゼ画分のメチレンブルー還元活性
の経時的変化を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高村 義親 茨城県土浦市木田余東台二丁目13番30号 (72)発明者 西原 宏史 茨城県牛久市南６丁目23番４号 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 DA05 DA06 HA01 HA06 4B050 CC04 DD02 LL05 4B065 AA01X AA01Y AB01 CA28

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒドロゲナーゼにおいて、配列番号２記
   載のアミノ酸配列の１８１番目のプロリン又は２４３番
   目のロイシンに相当するアミノ酸をイソロイシンに置換
   することを特徴とする耐熱性ヒドロゲナーゼの作製方
   法。
2. 【請求項２】 ヒドロゲナーゼが、ラルストニア・ユウ
   トロファ由来のヒドロゲナーゼである請求項１記載の耐
   熱性ヒドロゲナーゼの作製方法。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載の方法によって作製
   された耐熱性ヒドロゲナーゼ。
4. 【請求項４】 請求項３記載の耐熱性ヒドロゲナーゼを
   コードするDNA。
5. 【請求項５】 請求項４記載のDNAを含み、耐熱性ヒド
   ロゲナーゼを生産する微生物。
6. 【請求項６】 請求項５記載の微生物を培養し、得られ
   る培養物から耐熱性ヒドロゲナーゼを採取することを特
   徴とする耐熱性ヒドロゲナーゼの生産方法。
7. 【請求項７】 以下の工程を含む耐熱性ヒドロゲナーゼ
   を生産する微生物の作製方法。 （１）ヒドロゲナーゼの全部又は一部をコードするDNA
   断片であって、配列番号２記載のアミノ酸配列の１８１
   番目のプロリン又は２４３番目のロイシンに相当するア
   ミノ酸をコードする配列がイソロイシンをコードする配
   列に置換されているDNA断片を作製する工程 （２）（１）で作製したDNA断片、抗生物質に対する耐
   性遺伝子、及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子を
   含むベクターを作製する工程 （３）（２）で作製したベクターを微生物に導入する工
   程 （４）（３）でベクターを導入した微生物とヒドロゲナ
   ーゼを生産する微生物を共存させる工程 （５）ヒドロゲナーゼを生産する微生物を前述の抗生物
   質を含む培地中で培養し、（１）で作製したDNA断片、
   抗生物質に対する耐性遺伝子、及び特定条件下で致死性
   を発揮する遺伝子がゲノムDNA中に挿入された菌株を選
   抜する工程 （６）（５）で選抜した菌株を前述の致死性遺伝子が致
   死性を発揮する条件下で培養し、抗生物質に対する耐性
   遺伝子及び特定条件下で致死性を発揮する遺伝子が脱落
   した菌株を選抜する工程
8. 【請求項８】 ヒドロゲナーゼが、ラルストニア・ユウ
   トロファ由来のヒドロゲナーゼである請求項７記載の耐
   熱性ヒドロゲナーゼを生産する微生物の作製方法。