JP2003189868A - サンプル中の標的配列の存在を検出する核酸解析方法、その方法において使用される核酸検出用チップおよびその方法を行うための核酸解析用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 検体核酸と核酸プローブとの間に生じ得る非
特異的な結合が低減された核酸解析方法、特に、核酸検
出用チップを用いた核酸解析方法と、そこにおいて使用
され得る汎用性が高く且つ低経費で製造される核酸検出
用チップを提供する。 【解決手段】 サンプル中の標的配列の存在を検出する
核酸解析方法であって、（ａ）サンプル中に含まれる検
体核酸と、標的配列に相補的な配列および自然界に存在
する確率の低い配列を含む媒介プローブと、前記自然界
に存在する確率の低い配列に相補的な配列を含み且つ固
相面に固定化された捕捉用プローブとを、ハイブリダイ
ゼーションすることと、（ｂ）前記（ａ）のハイブリダ
イゼーションで生じた結合を検出することによって、サ
ンプル中の標的配列の存在を検出することとを具備する
サンプル中の標的配列の存在を検出する核酸解析方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ハイブリダイゼー
ションを利用した核酸解析方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、核酸検出用センサとして核酸鎖固
定化アレイ（一般的にはＤＮＡアレイと称する）による
遺伝子検査技術が注目を集めている（Ｂｅａｔｔｉｅ
ｅｔａｌ． １９９３， Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．
１９９１， Ｋｈｒａｐｋｏｅｔ ａｌ． １９８９，
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ． １９９４）。

【０００３】ＤＮＡアレイは、互いに配列の異なる１０
^１〜１０^５種類のＤＮＡ核酸鎖が固定化された数ｃｍ角
の硝子やシリコン基板からなるアレイである。被検液に
ついて解析を行う場合、まず、蛍光色素や放射線同位元
素（ＲＩ）などで標識した被検液遺伝子をアレイ上で反
応させるか、あるいは未標識の被検液遺伝子と標識オリ
ゴヌクレオチドの混合物をサンドイッチハイブリダイゼ
ーション可能な条件下でアレイ上で反応させる。被検液
中にアレイ上のＤＮＡ核酸鎖に相補的な配列が存在すれ
ば、特定部位において前記標識に由来する信号（例え
ば、蛍光強度、ＲＩ強度）が得られる。このとき、固定
化されたＤＮＡ核酸鎖の配列と位置が分っていれば、被
検液遺伝子中に存在する塩基配列を簡単に調べることが
できる。また、ＤＮＡアレイは、微量サンプルで塩基配
列に関する多くの情報が得られることから、遺伝子検出
技術に止まらずシーケンス技術としても大いに期待され
ている（Ｐｅａｓｅ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｐａ
ｒｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．１９９６）。

【０００４】しかしながら、従来から使用されるＤＮＡ
アレイの場合、検出の対象となる検体ＤＮＡ毎に、所望
のＤＮＡプローブを固定化したＤＮＡチップが製造され
なくてはならない。従って、チップの製造コストが下げ
にくい状況にある。また、ＤＮＡプローブの固定化の際
には、ＤＮＡプローブ同士が誤結合または幾何形状的な
絡まり合いからクラスター化してしまう可能性がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記の状況に鑑み、本
発明の目的は、検体核酸と核酸プローブとの間に生じ得
る非特異的な結合が低減された核酸解析方法、特に、核
酸検出用チップを用いた核酸解析方法を提供することで
ある。また、本発明の更なる目的は、汎用性が高く且つ
低経費で製造される核酸検出用チップを提供することで
ある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上述の目的は、以下の手
段により達成される。即ち、 １． サンプル中の標的配列の存在を検出する核酸解析
方法であって、（ａ） サンプル中に含まれる検体核酸
と、標的配列に相補的な配列および自然界に存在する確
率の低い配列を含む媒介プローブと、前記自然界に存在
する確率の低い配列に相補的な配列を含み且つ固相面に
固定化された捕捉用プローブとを、ハイブリダイゼーシ
ョンすることと、（ｂ） 前記（ａ）のハイブリダイゼ
ーションで生じた結合を検出することによって、サンプ
ル中の標的配列の存在を検出することと、を具備するサ
ンプル中の標的配列の存在を検出する核酸解析方法； ２． 自然界に存在する確率の低い配列に相補的な配列
を含む捕捉用プローブが固定化された核酸検出用チッ
プ；並びに ３． 標的配列に相補的な配列および自然界に存在する
確率の低い配列を含む媒介プローブと、前記自然界に存
在する確率の低い配列に相補的な配列を含む捕捉用プロ
ーブを固定化された核酸検出用チップとを具備するサン
プル中の標的配列の存在を検出するための核酸解析用キ
ットである。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明は、自然界に存在する確率
の低い配列を利用することによって検体核酸と核酸プロ
ーブとの間に生じ得る非特異的な結合の低減された核酸
解析方法を提供するものである。また、そのような自然
界に存在する確率の低い配列を用いることにより提供さ
れる汎用性が高く且つ低経費で製造され得る核酸検出用
チップを提供するものである。更に、そのような核酸解
析方法に使用され得る核酸解析用キットを提供する。

【０００８】図１を用いて本発明の態様の１例を説明す
る。本発明の態様に従う核酸解析方法は、サンプル中に
含まれる検体核酸１に含まれる標的配列２を検出する方
法である。具体的には、先ず、ハイブリダイゼーション
の可能な条件下で、検体核酸１と、媒介プローブ３と、
固相４に固定化された捕捉用プローブ５をハイブリダイ
ゼーションする。ここで、媒介プローブ３は、標的配列
２に相補的な配列６と自然界に存在する確率の低い配列
７とを含む。捕捉用プローブ５は、媒介プローブ３に含
まれる自然界に存在する確率の低い配列７に相補的な配
列８を含む。従って、前記ハイブリダイゼーションによ
って、検体核酸１と媒介プローブ３がハイブリダイズ
し、更に、媒介プローブ３と捕捉用プローブ５がハイブ
リダイズする。これにより生じた相補的配列間での２つ
の結合を検出することにより、サンプル中の標的配列の
存在が検出される。

【０００９】ここで使用される「標的配列」の語は、検
出および／または解析したい配列を示す。本発明に従う
方法において検出および／または解析の対象になり得る
標的配列は、天然に存在し得る塩基配列を有したいずれ
の核酸であってもよい。即ち、そのような塩基配列を有
した核酸であれば、天然由来の核酸であっても、人工的
な合成または遺伝子組換えなどの操作により得られた塩
基配列を有した核酸であってもよい。

【００１０】ここで使用される「核酸」の語は、天然に
存在する種々のＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核
酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およ
びＳ-オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類似体
などを総括した意味で用いる。

【００１１】ここで使用される「相補」、「相補的」お
よび「相補性」の語は、５０％〜１００％の範囲で相補
的あればよく、好ましくは１００％で相補的であること
をいう。また、ここで使用される「非相補的」の語は、
相同な配列および相補性が５０％未満の配列を示し、更
に、そこには、その比較の対象となる配列とは長さの異
なる配列も含まれる。ここで使用する「相同な配列」と
は、２つの１本鎖の間の相同性が５０％〜１００％の範
囲で相同であればよく、配列は好ましくは１００％で相
同的であることをいう。

【００１２】「自然界に存在する確率の低い配列」と
は、そこに含まれる塩基配列が自然界に存在する確率が
低い配列を示す。そのような配列は、例えば以下に示す
配列であり得る。

【００１３】１）そこに含まれる塩基の種類に極端な偏
りのある配列 そのような配列は、同一の塩基を連続して含む配列やあ
る規則性の存在する配列などである。例えば、同一の塩
基を連続して含む配列の例は「ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡ」などである。長さや塩基の種類はこれに限
定されるものではない。また「ＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＣ
ＣＧＧＧＧ」や「ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣ」
なども好ましい例である。ここで、「Ａ」はアデニン、
「Ｔ」はチミン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン
を示し、以下これらの記号を用いる。

【００１４】更に、同一種類の塩基が５塩基以上並んで
いる単位配列を有する場合、その単位配列が１以上含ま
れる配列が好ましい。例えば、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから
選択される１種類の塩基がその配列の全塩基長の４０％
以上の割合で含まれる配列、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選
択される２種類の塩基がその配列の全塩基長の８０％以
上の割合で含まれる配列、並びに、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ
から選択される１種類の塩基がその配列の全塩基長の１
０％以下の割合でしか含まれない配列などが好ましい。

【００１５】２）同一の塩基や単位配列を連続して含む
配列 同一の塩基を連続して含む配列の例は上述の通りであ
る。また、単位配列を連続して含む配列の例は、例え
ば、第１の塩基と第２の塩基を含む２塩基長の単位配列
が３単位以上で連続して含まれる配列などである。具体
的には、図２に示すように、例えば、「Ａ」と「Ｔ」か
らなる単位配列が、順同で連続して含まれる配列２１、
順不同で連続して含まれる配列２２および２３を含む配
列などである。順不同の場合、１単位配列に含まれるＡ
およびＴが「ＡＴ」の順で存在しても、その配列が反転
され「ＴＡ」の順で存在してもよい（図２の２４）。ま
た、上記のような配列が、その配列を含む配列の全塩基
長の５０％以上の割合で含まれる配列が好ましい。

【００１６】３）ある程度長さのある配列と、この配列
に対して塩基の並ぶ順序が先頭と終端で、即ち３’末端
と５’末端で、反転した配列を同時に含む配列 例えば、そのような配列は、ある程度の長さのある単位
配列「ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣ」と、前記配
列に対して塩基の並ぶ順序が３’末端と５’末端で反転
した単位配列「ＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡ」と
を同時に含む配列である。また、そのような単位配列を
同種類または他種類同士で組み合わせて２単位以上連続
して含む部分を１以上含む配列も好ましい。また更に、
そのような単位配列は３塩基長以上１０００塩基長以下
であってよい。また、そのような配列が、それを含む配
列の全塩基長の５０％以上の割合で含まれることが更に
好ましい。

【００１７】４）本発明に従う解析方法を行おうとする
サンプルの採取源である対象（例えば、ヒト、ヒト以外
の動物、植物、微生物、ウイルスおよび細胞など）には
含まれる可能性の低い、または含まれないことが実験的
または理論的に明かである配列 そのような配列がそれを含む配列の全塩基長の５０％以
上で含まれる配列が更に好ましい。

【００１８】ここで使用される「固相」の語は、標的配
列とのハイブリダイゼーションを行うための媒介プロー
ブを捕捉するための捕捉用プローブが固定化される基体
を示す。そのような固相は、例えば、非多孔性、硬質お
よび半硬質な材質であってよく、ウェル、溝または平ら
な表面を有する板状であっても、並びに球体などの立体
形状を有する形体であってもよい。基体は、これに限定
されるものではないが、シリコン、ガラス、石英ガラ
ス、石英などのシリカ含有基材、およびポリアクリルア
ミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、等のなどのプ
ラスチックおよびポリマーなどで製造され得る。本発明
の態様に従って好ましく使用される固相は、それ自身公
知の塩基配列検出用チップの製造に使用される基板で
る。

【００１９】また、「固相面」とは、前記固相に具備さ
れる面の１部であればよく、このような固相面に対して
核酸プローブが固定化される。本発明の態様に従って使
用さっる固相面は、好ましくは平面である。また、固相
面には捕捉用プローブが固定される固相領域と、捕捉用
プローブが固定されない非固相領域が含まれ得る。

【００２０】ここで使用される「塩基配列検出用チッ
プ」の語は、塩基配列の検出を目的としたチップを示
し、一般的に、ＤＮＡマイクロアレイまたはＤＮＡチッ
プと称されるものを総括的に示す。

【００２１】本発明の態様に従い使用し得る「ハイブリ
ダイゼーションで生じた結合を検出」するための手段
は、例えば、それ自身公知の２本鎖認識物質を用いて行
う手段であってもよい。ここで使用する「２本鎖認識物
質」は、例えば、特許２５７３４４３号に記載されるよ
うな２本鎖の核酸を認識し特異的に結合する物質を指
す。

【００２２】そのような物質としては、例えば、挿入
剤、２本鎖核酸を認識する生体高分子を挙げることがで
きる。本発明の態様において用いられる電気化学的、光
化学的に活性な挿入剤は特に限定されるものではなく、
例えばエチジュウム、エチジュウムブロマイド、アクリ
ジン、アミノアクリジン、アクリジンオレンジ、プロフ
ラビン、エリブチシン、アクチノマイシンＤ、ドーノマ
イシン、マイトマイシンＣ、並びにルミノ−ル、ルシゲ
ニン、ピレン、ジフェニルアントラセンおよびルブレン
などが用いられる。また、その他の使用可能な挿入剤と
しては、特開昭６２−２８２５９９号公報に記載された
ものを使用してもよい。

【００２３】また、本発明の態様に従い使用し得る「ハ
イブリダイゼーションで生じた結合を検出」するための
手段は、捕捉用プローブが固相化される固相領域として
電極を用い、ハイブリダイゼーションの前と後でコンダ
クタンスを測定する手段（例えば、モトローラによる特
表平11-514748など）を用いてもよい。

【００２４】或いは、本発明の態様に従い使用し得る
「ハイブリダイゼーションで生じた結合を検出」するた
めの手段は、その他の一般的に使用されるそれ自身公知
のいずれの手段、例えば、ハイブリダイゼーションに先
駆けてサンプル中の検体核酸を標識しておき、ハイブリ
ダイゼーション後に遊離している物質を除去した後にそ
の標識を指標にする手段を用いてもよい。しかしなが
ら、これらの手段に限定されるものではない。

【００２５】本発明に従う核酸解析方法は、サンプル中
に含まれる検体核酸の解析、例えば、標的配列の存在の
検出および定量、遺伝子発現の出現消失などの発現解
析、ゲノムにおける単塩基多型（Single Nucleotide Po
lymorphism、即ち、SNP）やマイクロサテライト配列な
どの多型の解析、疾患関連遺伝子の解析による疾患の診
断や発症危険率の予測、感染の存在の検出、ウイルス型
の解析、並びに毒性試験などを実施する場合などに利用
され得る。従って、臨床的診断や発症予測などの種々の
臨床的目的のために利用され得る。また、例えば、食品
検査、検疫、医薬品検査、法医学、農業、畜産、漁業お
よび林業など、種々の基礎的研究および応用研究などに
広範に利用され得る。

【００２６】以下、図面を参照しながら本発明の態様の
例を説明する。

【００２７】＜例＞ （１）第１の態様 固相面に対して水平に固定化された捕捉用プローブを用
いる例 ここでは、捕捉用プローブが、その全塩基、または１以
上の部分によって固相面に対して固定化された核酸検出
用チップを用いた例を示す。

【００２８】図１を用いて、本発明の第１の態様を説明
する。先ず、対象からサンプルを調製する。次に、サン
プルに含まれる検体核酸１と、標的配列２に相補的な配
列６と自然界に存在する確率の低い配列７とを含む媒介
プローブ３とをハイブリダイゼーション可能な条件下で
反応させる。このとき、検体核酸１に標的配列２が含ま
れれば、これらはハイブリダイズし結合を生じる。次
に、得られた反応液を、予め核酸検出用チップ４に固定
化された自然界に存在する確率の低い配列７に相補的な
配列８からなる捕捉用プローブ５に対して、ハイブリダ
イゼーション可能な条件下で反応させる。これにより媒
介プローブ３と捕捉用プローブ５との結合が生じる。検
体核酸１に標的配列２が含まれる場合、以上の工程によ
り、検体核酸１が核酸検出用チップ４に捕捉される。続
いて、上記の工程で得られた結合を検出すれば、標的配
列の存在が検出できる。

【００２９】図１の例において使用される自然界に存在
する確率の低い配列７は「ＴＡＧＣＴＡＧ・・・ＴＡＣ
Ｇ」である。この配列は「ＴＡＧＣ」を単位配列として
連続して含む配列である。図中「・・・」の部分は記載
を省略した部分を示す。ここで使用される自然界に存在
する確率の低い配列７は、３塩基長から１０００塩基長
の配列であってよく、好ましくは１０塩基長から２００
塩基長である。

【００３０】また、本例では、核酸検出用チップ４の固
相面に対して水平に捕捉用プローブ５が固定化されてい
ることが特徴である。このような固相は、例えば、スポ
ッティングにより行うことが可能である。また、半導体
技術を利用した露光による光誘導法を利用することも可
能である。光誘導法は、単一の塩基から鎖状のプローブ
が構成される場合や、単一の塩基から平面状のプローブ
が構成される場合などに実施しやすい。

【００３１】また、ハイブリダイゼーション可能な条件
とは、互いに相補的な配列を有する２本の１本鎖核酸が
十分にハイブリダイズするような条件であればよい。

【００３２】このような本発明の態様によって、互いに
相補性のある２本の核酸が、良好に出会いハイブリダイ
ズされる確率が向上される。

【００３３】このように、予め規定された種類の補足用
プローブを固定化した同一の核酸検出用チップを用いれ
ば、どのような検体核酸に対して検出を行う場合であっ
ても、媒介プローブを介して同じ種類の核酸検出用チッ
プを利用することが可能である。従って、汎用性が高く
且つ低経費で製造される核酸検出用チップが提供され
る。

【００３４】また、本発明の態様に従って自然界に存在
する確率の低い配列を、媒介プローブと捕捉用プローブ
とのハイブリダイゼーションに利用することにより、捕
捉用プローブの固定化の際に生じ得る捕捉用プローブ同
士の誤結合や幾何形状的な絡まりからのクラスター化を
防止することが可能である。

【００３５】また、上述の第１の態様は、図３に示すよ
うに変更してもよい。即ち、使用する媒介プローブ３の
自然界に存在する確率の低い配列７と標的配列に相補的
な配列６の間にギャップ配列９を具備させることも可能
である。ギャップ配列９を用いることにより、検体核酸
１に含まれる標的核酸２と、媒介プローブ３に含まれる
標的核酸に相補的な配列６とのハイブリダイゼーション
が生じやすくなる。本発明の態様において使用されるギ
ャップ配列９は、自然界に存在する確率の低い配列であ
ることが好ましく、また、配列２、配列７および配列８
並びにその相補鎖とは異なる配列であることが好まし
い。また、その長さは１塩基長から１０００塩基長であ
ってよく、１塩基長から２０塩基長が好ましい。

【００３６】また、詳述した態様では、検体核酸１と媒
介プローブ３をハイブリダイズした後に、その反応液を
核酸検出用チップ４に加えたが、このように２段階に反
応を行わずに、検体核酸１、媒介プローブ３、および核
酸検出用チップ４に固定化された捕捉用プローブ５を同
時に反応させることも可能である。

【００３７】（２）第２の態様 固相面に対して垂直に固定化された捕捉用プローブを用
いる例 ここでは、捕捉用プローブがその何れかの末端の１塩基
を介して固定化された核酸検出用チップを用いた例を示
す。

【００３８】本発明の第２の態様を図４を用いて説明す
る。図４は、捕捉用プローブ５が固相面に対して垂直に
固定された核酸検出用チップを使用した例である。捕捉
用プローブ５は、ギャップ配列１０を介して固相面に固
定化されている。このような固定化は、例えば、アフィ
メトリック社により提案されている半導体技術を利用し
た露光による光誘導法を利用して行うことが可能である
（例えば、Affymax Technologies又はAffymetrixによる
US5,744,305、US5,889,165、US5,874,219、US5,445,934
など）。また、高親和性の結合対（例えば、ビオチンと
アビジンなど）を用いたそれ自身公知の固相化方法、更
に他の従来公知の何れかの手段により固定化してもよ
い。

【００３９】反応は上記第１の態様に示した方法と同様
に行うことが可能である。即ち、サンプルに含まれる検
体核酸１と、標的配列２に相補的な配列６と自然界に存
在する確率の低い配列７とを含む媒介プローブ３とをハ
イブリダイゼーション可能な条件下で反応させる。次
に、得られた反応液を、予め核酸検出用チップ４に固定
化された自然界に存在する確率の低い配列７に相補的な
配列８からなる捕捉用プローブ５に対して、ハイブリダ
イゼーション可能な条件下で反応させる。続いて、上記
の工程で得られた結合を検出する。

【００４０】ここで使用される媒介プローブ３は、標的
配列に相補的な配列６と自然界に存在する確率の低い配
列７の間にギャップ配列９を有している。ギャップ配列
９とギャップ配列１０は互いに相補性の低い配列であれ
ばよく、例えば、上述したような非相補的な配列である
ことが好ましい。ギャップ配列９および１０を用いるこ
とにより、互いに相補的な配列間のハイブリダイゼーシ
ョンが生じやすくなる。しかしながら、ギャップ配列は
必ずしも使用されなくてはならないものではなく、何れ
か一方のみが使用されても、両方とも使用されなくても
よい。

【００４１】また、本態様に従い提供される方法は、固
相面に対する捕捉用プローブの固定化を除いて、上記第
１の態様と同様に、また、第１の態様に行い得る変更と
同様に変更されてもよい。

【００４２】また、詳述した態様では、検体核酸１と媒
介プローブ３をハイブリダイズした後に、その反応液を
核酸検出用チップ４に加えたが、このように２段階に反
応を行わずに、検体核酸１、媒介プローブ３および核酸
検出用チップ４に固定化された捕捉用プローブ５を同時
に存在させて反応を行ってもよい。

【００４３】上述の態様に従えば、予め規定された種類
の補足用プローブを固定化した同一の核酸検出用チップ
を用いれば、あらゆる検体核酸に対して検出を行う場合
であっても、同じ種類の核酸検出用チップを利用するこ
とが可能である。従って、汎用性が高く且つ低経費で製
造される核酸検出用チップが提供される。

【００４４】アフィメトリック社から提案されるチップ
の製造方法（例えば、Affymax Technologies又はAffyme
trixによるUS5,744,305、US5,889,165、US5,874,219、U
S5,445,934など）では、半導体技術を用いた光リソグラ
フィー法の繰り返しによって垂直方向に核酸プローブが
形成される。このような方法では、核酸プローブ長に応
じた多数のマスクパターンの作成や塩基の固定化処理が
必要である。従って、多数のマスクの作製と多くの工
程、並びに高額な経費が必要となる。また、そのような
方法により製造される核酸プローブは、通常、２０塩基
程度が限界であった。しかしながら、本発明の態様に従
うと、自然界に存在する確率の低い配列を使用すること
により、核酸検出用チップに固定化する補足用プローブ
の長さを短くすることが可能となる。従って、これによ
り、核酸検出用チップ本体の製造コストを下げることが
できる。また、アフィメトリック社の方法により得られ
る２０塩基程度のプローブでより効率よくハイブリダイ
ゼーションが行われる。

【００４５】更に、この態様においても、自然界に存在
する確率の低い配列を媒介プローブと捕捉用プローブと
のハイブリダイゼーションに利用しているので、捕捉用
プローブの固定化の際に生じ得る捕捉用プローブ同士の
誤結合や幾何形状的な絡まりからのクラスター化を防止
することが可能である。

【００４６】（３）第３の態様 挿入剤を用いて結合を検出する手段を用いた例 図５を用いて、本発明の第３の態様を説明する。本例で
は、電極を具備する核酸検出用チップを固相として用
い、挿入剤でハイブリダイゼーションで生じた結合を検
出する例を示す。先ず、核酸検出用チップに具備される
電極５４に対して捕捉用プローブ５５を水平に固定化す
る。得られた核酸検出用チップの電極５４に、捕捉用プ
ローブ５５の配列に相補的な配列５７および標的配列に
相補的な配列５６を含む媒介プローブ５３と、挿入剤６
０とを添加し、ハイブリダイゼーション可能な条件下で
これらを反応させる（図５−（１））。次に、電極５４
にバイアス電圧を印加し、挿入剤６０（ａ）の酸化還元
電荷を放出させ、計測する（図５−（２））。続いて、
電極５４に対して検体核酸５１を添加し、媒介プローブ
５３とハイブリダイズさせる（図５−（３））。このハ
イブリダイゼーションにより生じた２本鎖に対して挿入
剤６０（ｂ）が絡みつく（図５−（３））。次に、電極
５４にバイアス電圧を印加し、挿入剤６０（ｂ）の酸化
還元電荷を放出させる（図５−（４））。既に、挿入剤
６０（ａ）の酸化還元電荷は図５−（２）の工程におい
て測定している。従って、図５−（２）の工程と図５−
（４）の工程において得られた酸化還元電荷を基に、ハ
イブリダイゼーションにより生じた反応産物に含まれる
結合の存在が検出される。それによって標的核酸２の存
在が検出される。

【００４７】上述の態様では、二段階のハイブリダイゼ
ーションを行っているが、予め各状態で得られる酸化還
元電位を測定しておけば、その後の解析においては、一
段階のハイブリダイゼーション、即ち、検体核酸と媒介
プローブと捕捉用プローブとを同時に反応させてもよ
い。

【００４８】また、本態様では、目的とする結合を、挿
入剤から生じた酸化還元電位を電極によって測定するこ
とにより検出する例を示したが、挿入剤として電気化学
発光的に活性な物質を使用し、フォトカウンタにより光
学的な信号を検出することにより、２本鎖核酸を認識し
てもよい。また、電極の代わりに、光ファイバ−の先端
に透明電極を形成することにより作成した光ファイバ−
電極を用いて間接的に検出してもよい。

【００４９】また、本態様に従い提供される方法は、上
記第１の態様または第２の態様に対して行い得る変更と
同様に変更されてもよい。

【００５０】上述の第１または第２の態様で得られる効
果に加えて、このような態様により、電極反応または光
学的な信号の変化は担体表面でしか起こらないことか
ら、未反応のプロ−ブや未反応の挿入剤を除去すること
なく非常に簡単に検出を行なうことができる。

【００５１】（４）第４の態様 コンダクタンスを測定する例 本発明の第４の態様を図６を用いて説明する。本例で
は、電極を具備する核酸検出用チップを固相として用い
る。前記電極におけるコンダクタンスは、そこに結合さ
れた物質に応じて変化する。従って、本態様は、ハイブ
リダイゼーションにより生じる結合に応じて変化するの
コンダクタンスの変化を測定することにより結合の存在
を検出する方法である。

【００５２】先ず、核酸検出用チップに具備される電極
６４に対して捕捉用プローブ６５を水平に固定化する。
得られた核酸検出用チップの電極６４に、捕捉用プロー
ブ６５の配列に相補的な配列６７および標的配列に相補
的な配列６６を含む媒介プローブ６３を添加し、ハイブ
リダイゼーション可能な条件下で反応させる（図６−
（１））。次に、電極６４のコンダクタンスを測定する
（図６−（２））。続いて、電極６４に対して検体核酸
６１を添加し、媒介プローブ６３とハイブリダイズさせ
る（図６−（３））。その後、電極６４のコンダクタン
スを測定する（図６−（４））。既に、媒介プローブ６
３の結合によるコンダクタンスは図６−（２）の工程に
おいて測定している。従って、図６−（２）と図６−
（４）の工程の工程において得られたコンダクタンスの
差分から、ハイブリダイゼーションにより生じた反応産
物に含まれる結合の存在が検出される。それによって標
的核酸２の存在が検出される。ここで、配列６７は自然
界に存在する確率の低い配列である。

【００５３】上述の態様では、二段階のハイブリダイゼ
ーションを行っているが、予め各状態で得られるコンダ
クタンスを測定しておけば、その後の解析においては、
一段階のハイブリダイゼーション、即ち、検体核酸と媒
介プローブと捕捉用プローブとを同時に反応させてもよ
い。

【００５４】上述の本態様ではコンダクタンスを測定し
ているが、コンダクタンスに代わってインピーダンスを
測定してもよい。

【００５５】上記第１の態様または第２の態様において
記載されると同様に、また、第１および第２の態様で行
い得る変更と同様に変更されてもよい。

【００５６】上述の第１または第２の態様で得られる効
果に加えて、電極のコンダクタンスは、電極に接触して
いる物質によって変化するものであるから、未反応のプ
ロ−ブや未反応の検体核酸を除去することなく非常に簡
単に検出を行なうことができる。

【００５７】（５）第５の態様 固相領域毎に捕捉用プローブを固定化する例 以下に図７を用いて本発明の第５の態様を説明する。

【００５８】上述したように、核酸検出用チップの固相
領域には捕捉用プローブが固定化される。本発明の態様
に従うと、上述に示される核酸解析方法において使用さ
れる核酸検出用チップは、複数の固相領域を有していて
もよい。

【００５９】本態様は、固相領域としての電極を複数で
具備する核酸検出用チップを固相として用い、且つハイ
ブリダイゼーションで生じた結合を検出するための手段
として挿入剤を用いた例である。

【００６０】本態様では、第１の検体核酸７１（ａ）に
含まれる第１の標的核酸と、第２の検体核酸７１（ｂ）
に含まれる第２の標的核酸が検出される。次に、本態様
で使用される媒介プローブ、捕捉用プローブおよび電極
について以下に説明する。

【００６１】第１の媒介プローブ７３（ａ）は、第１の
標的核酸に相補的な配列と第１の自然界に存在する確率
の低い配列を含む。第１の電極７６（ａ）には、前記第
１の自然界に存在する確率の低い配列に相補的な配列を
含む捕捉用プローブ７５（ａ）が固定化されている（図
７）。

【００６２】一方、第２の媒介プローブ７３（ｂ）は、
第２の標的核酸に相補的な配列と第２の自然界に存在す
る確率の低い配列を含む。第２の電極７６（ｂ）には、
前記第２の自然界に存在する確率の低い配列に相補的な
配列を含む捕捉用プローブ７５（ｂ）が固定化されてい
る（図７）。

【００６３】ここで、第１の標的核酸は第２の標的核酸
と異なった配列を有し、第１の自然界に存在する確率の
低い配列は第２の自然界に存在する確率の低い配列と異
なった配列を有する。図７では、第１の自然界に存在す
る確率の低い配列は「ＡＡＡＡＡＡ」であり、第２の自
然界に存在する確率の低い配列は「ＧＧＧＧＧＧ」であ
る（図７）。

【００６４】以上の媒介プローブ７３と捕捉用プローブ
７５を用いて、検体核酸７１に含まれる標的配列を検出
する方法を以下に説明する。先ず、検体核酸７１（ａ）
および（ｂ）を、媒介プローブ７３（ａ）および
（ｂ）、並びに挿入剤８０と混合して反応する。この反
応により、図７に示されるような複合体７７（ａ）およ
び（ｂ）が形成される。次に、この反応液を固相７４に
具備される電極７６（ａ）および（ｂ）に対して添加す
る（図７）。添加された複合体７７（ａ）は、第１の電
極に固定化された捕捉プローブ７５（ａ）とハイブリダ
イズする。複合体７７（ｂ）は、第２の電極に固定化さ
れた捕捉プローブ７５（ｂ）とハイブリダイズする。

【００６５】図７では、便宜上、１電極に対して１捕捉
用プローブが記載されているが、１電極に対して複数の
捕捉用プローブが固定化されてよい。しかしながら、１
電極中には、同じ配列を有する捕捉用プローブが固定化
されることが好ましい。また、図７では、捕捉用プロー
ブが固相面に対して水平に固定化される例を示したが、
これに限定されるものではなく、垂直に固定化されても
よい。

【００６６】また、本態様は、上述の第１から第４の態
様に行い得る方法と同様に行ってもよく、また、それら
に行い得る変更と同様に変更されてもよい。更に、本態
様は、ハイブリダイゼーションで生じた結合の存在を、
電極を用いて検出するための核酸検出用チップに対して
ばかりではなく、上述した全てのタイプの核酸検出用チ
ップに対して利用することが可能である。

【００６７】上述では２種類の標的核酸の存在を検出す
る方法を説明したが、本態様は、それ以上の標的核酸の
存在を同時に検出することも可能である。例えば、第１
から第ｎまでの標的核酸の存在を検出する場合、第１か
ら第ｎまでの媒介プローブが準備されればよい。ここ
で、ｎは２以上の整数である。第ｎの媒介プローブは、
第ｎの標的核酸に相補的な配列と、第ｎの自然界に存在
する確率の低い配列を含む。また、固相領域は、第１か
ら第ｎまで設定され、そこに固定化される捕捉用プロー
ブは、第１から第ｎまでの自然界に存在する確率の低い
配列に相補的な第１から第ｎまでの配列が準備され、前
記第１から第ｎまでの固相領域に対して種類毎に独立し
て固相化される。

【００６８】しかしながら、複数の固相領域に対して同
じ種類の捕捉用プローブが固定化されていてもよい。

【００６９】（６）第６の態様 非固定化領域に排斥用配列を配置する例１ 上述したように本発明の態様では、固相領域には捕捉用
プローブが固定化される。固定化される舗装用プローブ
は、それが捕捉しようとする媒介プローブに含まれる自
然界に存在する確率の低い配列に相補的な配列を有して
いる。本発明の第６および第７の態様は、捕捉用プロー
ブを固定化しない非固相領域に、前記自然界に存在する
確率の低い配列に対して相補性が低い配列を固相化する
ことを提案する。

【００７０】先ず、本発明の第６の態様を図８に示す。
図８の再上部（Ａ）に示したのは、標的配列８２が含ま
れる検体核酸８１と、標的配列８２に相補的な配列８６
と自然界に存在する確率の低い配列８７を含む媒介プロ
ーブとをハイブリダイゼーションし、得られた反応産物
である複合体９１である（図８（Ａ））。この複合体９
１を捕捉するための捕捉用プローブを具備する核酸検出
用チップは、その下部に示した。

【００７１】図８（Ｂ）は本態様の核酸検出用チップ８
４を上から見た図である。図８（Ｂ）に示すように、核
酸検出用チップ８４には４つの固相領域９０が配置され
る。固相領域９０には、媒介プローブ８３に含まれる自
然界に存在する確率の低い配列８７に対する相補性が高
くなるような配列が、規則的な塩基パターンが敷き詰め
られている。一方、非固相領域には、前記自然界に存在
する確率の低い配列８７に対する相補性が低くなるよう
な排斥用配列８９が敷き詰められている（図８）。ここ
で、敷き詰められる塩基は１層であっても、それ以上で
あってもよい。

【００７２】図８には、領域毎に敷き詰められる塩基の
種類が等しい例を示したが、これに限られるものではな
い。規則的な塩基パターンとして敷き詰めればよい。

【００７３】例えば、このような核酸検出用チップへの
捕捉用プローブの固相化は、上述した半導体技術を利用
した露光による光誘導法により行うことが可能である。
或いは、他の方法により、図８のように領域毎に同一種
類の塩基を敷き詰めてもよい。

【００７４】このような本態様の核酸検出用チップ８４
を用いた核酸解析方法を以下に示す。先ず、標的配列８
２が含まれる検体核酸８１と、標的配列８２に相補的な
配列８６と自然界に存在する確率の低い配列８７を含む
媒介プローブとをハイブリダイズする。次に、得られた
複合体９１（図８（Ａ））を核酸検出用チップ８４に対
して反応させる。これにより複合体９１は捕捉用プロー
ブに捕捉される。更に、生じた結合の存在を検出するこ
とにより、標的配列が検出できる。

【００７５】本態様に従って、非固相領域に排斥用配列
を固相化することにより、複合体９１または媒介プロー
ブ８３を効率的に捕捉することが可能である。

【００７６】（７）第７の態様 非固定化領域に排斥用配列を配置する例２ 次に、図９を用いてもう１つの非固定化領域に排斥用配
列を配置する態様を示す。

【００７７】図９の再上部（Ａ）に示したのは、標的配
列８２が含まれる検体核酸８１と、標的配列８２に相補
的な配列８６と自然界に存在する確率の低い配列８７を
含む媒介プローブとをハイブリダイゼーションし、得ら
れた反応産物である複合体９１である（図９（Ａ））。
この複合体９１を捕捉するための捕捉用プローブを具備
する核酸検出用チップは、その下部に示した。

【００７８】図９（Ｂ）は本態様の核酸検出用チップ８
４を上から見た図である。図９（Ｂ）に示すように、核
酸検出用チップ８４には４つの固相領域９０が配置され
る。図９（Ｃ）は、図９（Ｂ）を線Ｃ−Ｃに沿って切っ
た切断図である。図９（Ｃ）と図９（Ａ）から分かるよ
うに、全ての固相領域９０には、前記自然界に存在する
確率の低い配列８７に相補的な配列８８「ＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡ」を含む捕捉用プローブ８５が固相化されてい
る（図９（Ａ）および（Ｃ））。更に、前記固相領域９
０以外の領域、即ち、非固相領域には排斥用配列８９が
固相化されている。排斥用配列８９は、前記媒介プロー
ブ８３に含まれる自然界に存在する確率の低い配列８７
に対して非相補的な配列であればよい。図９に示される
排斥用配列８９の例は「ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ」であ
る。即ち、この配列は、自然界に存在する確率の低い配
列８７に相同な配列である。

【００７９】このような本態様の核酸検出用チップ８４
を用いた核酸解析方法を以下に示す。先ず、標的配列８
２が含まれる検体核酸８１と、標的配列８２に相補的な
配列８６と自然界に存在する確率の低い配列８７を含む
媒介プローブとをハイブリダイズする。次に、得られた
複合体９１（図９（Ａ））を核酸検出用チップ８４に対
して反応させる。これにより複合体９１は捕捉用プロー
ブに捕捉される。更に、生じた結合の存在を検出するこ
とにより、標的配列の存在が検出できる。

【００８０】上述では、４つの固相領域８８を配置した
例を示したが、固相領域の数は所望に応じて変更してよ
い。また、異なる配列を有する捕捉用プローブを固定化
した隣り合う２つの固相領域の間に配置された非固相領
域には、前記２つの固相領域にそれぞれ固定化される捕
捉用プローブに対して非相補的な配列を固定化すること
が好ましい。

【００８１】このような本態様の核酸検出用チップ８４
への捕捉用プローブの固相化は、上述した半導体技術を
利用した露光による光誘導法により行うことが可能であ
る。

【００８２】本態様に従って、非固相領域に排斥用配列
を固相化することにより、複合体９１または媒介プロー
ブ８３を効率的に捕捉することが可能である。

【００８３】（８）核酸検出用チップ 本発明に従うと、上述された核酸解析方法において使用
され得る塩基配列検出用チップも提供される。

【００８４】本発明の態様に従うと、そのような塩基配
列検出用チップは、例えば、蛍光検出用核酸検出用チッ
プおよび電流検出型核酸検出用チップなどを含む。しか
しながらこれに限られるものではない。そのようは塩基
配列検出用チップは以下のように製造することが可能で
ある。

【００８５】（ａ）電流検出型塩基配列検出用チップの
製造 上述した本発明の態様に従う電流検出型塩基配列検出用
チップは、上述したような捕捉用プローブを、固相、例
えば、電極基板に共有結合、イオン結合、物理吸着若し
くは化学吸着などの方法、または光誘導法などのプロー
ブを合成する方法によって固定化することにより製造さ
れてよい。電流検出型塩基配列検出用チップの例は、平
成８年１０月２４日に登録された特許番号２５７３４４
３号の遺伝子検出装置などであるが、これに限られるも
のではない。当該文献は引用することによりここに組み
込まれる。

【００８６】（ｂ）コンダクタンス検出型塩基配列検出
用チップの製造 上述した本発明の態様に従うコンダクタンス検出型塩基
配列検出用チップは、上述したような捕捉用プローブ
を、固相、例えば、電極基板に共有結合、イオン結合、
物理吸着若しくは化学吸着などの方法、または光誘導法
などのプローブを合成する方法によって固定化すること
により製造されてよい。コンダクタンス検出型塩基配列
検出用チップの例は、1997年8月7日にモトローラにより
出願された特願平10-510788、1998年10月27日に登録さ
れたモトローラによるUS5,827,482などであるが、これ
に限られるものではない。当該文献は引用することによ
りここに組み込まれる。

【００８７】（ｃ）蛍光検出用塩基配列検出用チップの
製造 本発明の態様に従う蛍光検出用塩基配列検出用チップ
は、上述したような捕捉用プローブを、固相、例えば、
例えば、ガラス基板およびシリコン基板など、従来用い
られる何れの基板に対して固相化することにより製造さ
れてよい。固定化手段は、スポッターなどを使用する手
段、一般的な半導体技術を利用した手段など、当業者に
それ自身公知の手段を用いて固定することが可能であ
る。

【００８８】（９）核酸解析用キット 本発明に従うと、標的配列に相補的な配列および自然界
に存在する確率の低い配列を含む媒介プローブと、前記
自然界に存在する確率の低い配列に相補的な配列を含む
捕捉用プローブを固定化された核酸検出用チップとを具
備するサンプル中の標的配列の存在を検出するための核
酸解析用キットも提供される。このような核酸解析用キ
ットは上述された核酸解析方法において使用され得る。

【００８９】更に、そのようなキットは、本発明に従う
核酸解析方法を行うために必要な種々の試薬などが共に
具備されてもよい。

【００９０】

【発明の効果】上述したように、本発明に従うと、検体
核酸と核酸プローブとの間に生じ得る非特異的な結合が
低減された核酸解析方法、特に、核酸検出用チップを用
いた核酸解析方法が提供される。本発明の更なる側面に
従うと、汎用性が高く且つ低経費で製造される核酸検出
用チップが提供される。また、本発明の更なる側面に従
うと、そのような核酸解析方法を行うための核酸解析用
キットも提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の態様を示す図。

【図２】本発明で使用される自然界に存在する可能性の
低い配列の例を示す図。

【図３】本発明の更なる態様の例を示す図。

【図４】本発明の第２の態様を示す図。

【図５】本発明の第３の態様を示す図。

【図６】本発明の第４の態様を示す図。

【図７】本発明の第５の態様を示す図。

【図８】本発明の第６の態様を示す図。

【図９】本発明の第７の態様を示す図。

【符号の説明】

１，５１，６１，７１，８１．検体核酸 ２，８
２．標的配列 ３，５３，６３，７３，８３．媒介
プローブ ４，５４，６４，７４，８４．核酸検出
用チップ ５，５５，６５，７５，８５．捕捉用プ
ローブ ６，５６，６６，８６．標的配列に相補的
な配列 ７，５７，６７，８７．自然界に存在する
確率の低い配列 ８，８８．自然界に存在する確率
の低い配列に相補的な配列 ９．ギャップ配列
１０．ギャップ配列 ２１．順同で連続して含ま
れる配列 ２２，２３．順不同で連続して含まれる
配列 ２４．反転例 ６０，８０．挿入剤 ７６．電
極 ７７．複合体 ８９．排斥用配列 ９
０．固相領域 ９１．複合体

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA05 HA19 4B029 AA21 AA23 BB20 CC03 4B063 QA12 QA13 QQ42 QR32 QR55 QS34

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サンプル中の標的配列の存在を検出する
   核酸解析方法であって、 （ａ） サンプル中に含まれる検体核酸と、標的配列に
   相補的な配列および自然界に存在する確率の低い配列を
   含む媒介プローブと、前記自然界に存在する確率の低い
   配列に相補的な配列を含み且つ固相面に固定化された捕
   捉用プローブとを、ハイブリダイゼーションすること
   と、 （ｂ） 前記（ａ）のハイブリダイゼーションで生じた
   結合を検出することによって、サンプル中の標的配列の
   存在を検出することと、を具備するサンプル中の標的配
   列の存在を検出する核酸解析方法。
2. 【請求項２】 前記捕捉用プローブが、その全塩基に亘
   って、または１以上の部分によって前記固相面に対して
   固定化される手段によって、前記固相に固定化されてい
   ることを特徴とする請求項１に記載のサンプル中の標的
   配列の存在を検出する核酸解析方法。
3. 【請求項３】 前記捕捉用プローブが、その何れかの末
   端の１塩基を介して前記固相面に対して固定化される手
   段によって、前記固相に固定化されていることを特徴と
   する請求項１に記載のサンプル中の標的配列の存在を検
   出する核酸解析方法。
4. 【請求項４】 前記媒介プローブが、標的配列に相補的
   な配列と自然界に存在する確率の低い配列の間に、更に
   第１のギャップ配列を含むことを特徴とする請求項１か
   ら３の何れか１項に記載のサンプル中の標的配列の存在
   を検出する核酸解析方法。
5. 【請求項５】 前記捕捉用プローブが、第２のギャップ
   配列を含み且つ第２のギャップ配列を介して前記固相面
   に固定化されていることを特徴とする請求項１から４の
   何れか１項に記載のサンプル中の標的配列の存在を検出
   する核酸解析方法。
6. 【請求項６】 前記（ｂ）における結合を検出すること
   が、ハイブリダイゼーションで生じた２本鎖を２本鎖認
   識体を用いて検出することによって行われることを特徴
   とする請求項１から５の何れか１項に記載のサンプル中
   の標的配列の存在を検出する核酸解析方法。
7. 【請求項７】 前記２本鎖認識体が電気化学的に活性な
   挿入剤であり、且つ前記捕捉用プローブは前記固相面に
   具備される前記挿入剤の活性を電気化学的に測定可能な
   電極に固定化されており、それにより、前記（ｂ）にお
   ける結合の検出が、前記ハイブリダイゼーションの結果
   生じた２本鎖に前記挿入剤が挿入され生じた電気化学的
   活性を前記電極が検出することにより行われることを特
   徴とする請求項６に記載のサンプル中の標的配列の存在
   を検出する核酸解析方法。
8. 【請求項８】 前記捕捉用プローブは前記固相面に具備
   されるコンダクタンス測定可能な電極に固定化されてお
   り、それにより、前記（ｂ）における結合の検出が、少
   なくとも前記ハイブリダイゼーションの前後に測定され
   た前記電極のコンダクタンスの変化を基に行われること
   を特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載のサン
   プル中の標的配列の存在を検出する核酸解析方法。
9. 【請求項９】 前記固相面には、前記捕捉用プローブを
   固定化するための固相領域と前記捕捉用プローブが固定
   化されない非固相領域が存在し、前記非固相領域には、
   前記媒介プローブに含まれる自然界に存在する確率の低
   い配列に対して非相補的な配列が固相化されていること
   を特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載のサン
   プル中の標的配列の存在を検出する核酸解析方法。
10. 【請求項１０】 前記核酸解析方法において、検出の対
    象となる標識配列が第１から第ｎの互いに異なる複数の
    配列であり、前記媒介プローブが第１から第ｎの標的配
    列にそれぞれ相補的な配列と第１から第ｎの自然界に存
    在する確率の低い配列とを含み、前記捕捉用プローブが
    前記第１から第ｎの自然界に存在する確率の低い配列に
    相補的な第１から第ｎの配列を含み、且つ前記捕捉用プ
    ローブが固相面の第１から第ｎの領域に配列毎に独立し
    て固定化されていることを特徴とする請求項１から９の
    何れか１項に記載のサンプル中の標的配列の存在を検出
    する核酸解析方法（ここで、ｎは２以上の整数であ
    る）。
11. 【請求項１１】 前記固相面を具備する固相が核酸検出
    用チップであることを特徴とする請求項１から１０の何
    れか１項に記載のサンプル中の標的配列の存在を検出す
    る核酸解析方法。
12. 【請求項１２】 前記自然界に存在する確率の低い配列
    が以下の配列から選択されることを特徴とする請求項１
    から１１の何れか１項に記載のサンプル中の標的配列の
    存在を検出する核酸解析方法； （１） 同一種類の塩基が５塩基以上並んでいる単位配
    列が１単位以上含まれる配列、 （２） アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンか
    ら選択される１種類の塩基がその配列の全塩基長の４０
    ％以上の割合で含まれる配列、 （３） アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンか
    ら選択される２種類の塩基がその配列の全塩基長の８０
    ％以上の割合で含まれる配列、 （４） アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンか
    ら選択される１種類の塩基がその配列の全塩基長の１０
    ％以下の割合で含まれる配列、並びに （５） 第１の塩基と第２の塩基からなる２塩基長の単
    位配列が３単位以上で連続して含まれる配列、 （６） 前記（５）の配列がその配列の全塩基長の５０
    ％以上の割合で含まれる配列、 （７） 第１番目の塩基から第ｘ番目までの塩基を含む
    ３塩基長以上１０００塩基長以下の配列またはその配列
    が反転した順で第ｘ番目から第１番目に向かって並ぶ塩
    基を含む３塩基長以上１０００塩基長以下の配列からな
    る単位配列を、２単位以上連続して含む部分を１以上含
    む配列（ここで、ｘは３以上１０００以下の整数であ
    る）、 （８） 前記（７）の配列がその配列の全塩基長の５０
    ％以上の割合で含まれる配列、 （９） 前記サンプルの採取源である対象が有する全核
    酸中に含まれていない塩基配列を有する単位配列が１単
    位以上含まれ、その存在割合がその配列の全塩基長の５
    ０％以上である配列。
13. 【請求項１３】 自然界に存在する確率の低い配列に相
    補的な配列を含む捕捉用プローブが固定化された核酸検
    出用チップ。
14. 【請求項１４】 前記自然界に存在する確率の低い配列
    が以下の配列から選択されることを特徴とする請求項１
    ３に記載の核酸検出用チップ； （１） 同一種類の塩基が５塩基以上並んでいる単位配
    列が１単位以上含まれる配列、 （２） アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンか
    ら選択される１種類の塩基がその配列の全塩基長の４０
    ％以上の割合で含まれる配列、 （３） アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンか
    ら選択される２種類の塩基がその配列の全塩基長の８０
    ％以上の割合で含まれる配列、 （４） アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンか
    ら選択される１種類の塩基がその配列の全塩基長の１０
    ％以下の割合で含まれる配列、並びに （５） 第１の塩基と第２の塩基からなる２塩基長の単
    位配列が３単位以上で連続して含まれる配列、 （６） 前記（５）の配列がその配列の全塩基長の５０
    ％以上の割合で含まれる配列、 （７） 第１番目の塩基から第ｘ番目までの塩基を含む
    ３塩基長以上１０００塩基長以下の配列またはその配列
    が反転した順で第ｘ番目から第１番目に向かって並ぶ塩
    基を含む３塩基長以上１０００塩基長以下の配列からな
    る単位配列を、２単位以上連続して含む部分を１以上含
    む配列（ここで、ｘは３以上１０００以下の整数であ
    る）、 （８） 前記（７）の配列がその配列の全塩基長の５０
    ％以上の割合で含まれる配列、 （９） 前記サンプルの採取源である対象が有する全核
    酸中に含まれていない塩基配列を有する単位配列が１単
    位以上含まれ、その存在割合がその配列の全塩基長の５
    ０％以上である配列。
15. 【請求項１５】 標的配列に相補的な配列および自然界
    に存在する確率の低い配列を含む媒介プローブと、前記
    自然界に存在する確率の低い配列に相補的な配列を含む
    捕捉用プローブを固定化された核酸検出用チップとを具
    備するサンプル中の標的配列の存在を検出するための核
    酸解析用キット。
16. 【請求項１６】 前記自然界に存在する確率の低い配列
    が以下の配列から選択されることを特徴とする請求項１
    ５に記載のサンプル中の標的配列の存在を検出するため
    の核酸解析用キット； （１） 同一種類の塩基が５塩基以上並んでいる単位配
    列が１単位以上含まれる配列、 （２） アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンか
    ら選択される１種類の塩基がその配列の全塩基長の４０
    ％以上の割合で含まれる配列、 （３） アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンか
    ら選択される２種類の塩基がその配列の全塩基長の８０
    ％以上の割合で含まれる配列、 （４） アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンか
    ら選択される１種類の塩基がその配列の全塩基長の１０
    ％以下の割合で含まれる配列、並びに （５） 第１の塩基と第２の塩基からなる２塩基長の単
    位配列が３単位以上で連続して含まれる配列、 （６） 前記（５）の配列がその配列の全塩基長の５０
    ％以上の割合で含まれる配列、 （７） 第１番目の塩基から第ｘ番目までの塩基を含む
    ３塩基長以上１０００塩基長以下の配列またはその配列
    が反転した順で第ｘ番目から第１番目に向かって並ぶ塩
    基を含む３塩基長以上１０００塩基長以下の配列からな
    る単位配列を、２単位以上連続して含む部分を１以上含
    む配列（ここで、ｘは３以上１０００以下の整数であ
    る）、 （８） 前記（７）の配列がその配列の全塩基長の５０
    ％以上の割合で含まれる配列、 （９） 前記サンプルの採取源である対象が有する全核
    酸中に含まれていない塩基配列を有する単位配列が１単
    位以上含まれ、その存在割合がその配列の全塩基長の５
    ０％以上である配列。