JP2003180362A - イネ科植物の選抜方法 - Google Patents
イネ科植物の選抜方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】イネ科植物の生育初期の段階で、個体の発芽性
を、安定、効率的、かつ、簡便に、選抜するために、イ
ネ科植物の発芽性に関与する遺伝子に対する遺伝子マー
カーを見出し、この遺伝子マーカーを用いる、高度の発
芽性を有するイネ科植物の選抜方法を提供すること。 【解決手段】イネに代表されるイネ科植物の高度の発芽
性を発現する遺伝子に連鎖する領域における遺伝子マー
カーを指標として、高度の発芽性を有するイネ科植物を
選抜する、イネ科植物の選抜方法を提供することによ
り、上記の課題を解決し得ることを見出した。
を、安定、効率的、かつ、簡便に、選抜するために、イ
ネ科植物の発芽性に関与する遺伝子に対する遺伝子マー
カーを見出し、この遺伝子マーカーを用いる、高度の発
芽性を有するイネ科植物の選抜方法を提供すること。 【解決手段】イネに代表されるイネ科植物の高度の発芽
性を発現する遺伝子に連鎖する領域における遺伝子マー
カーを指標として、高度の発芽性を有するイネ科植物を
選抜する、イネ科植物の選抜方法を提供することによ
り、上記の課題を解決し得ることを見出した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特定の形質を有す
る植物の選抜方法に関する発明である。
る植物の選抜方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】種子繁殖性の植物は、種子の発芽により
生長を開始する。特に、作物植物においては、種子を播
種する環境条件における発芽性が、栽培上、問題になる
場合がある。種子が播種される環境条件下において、個
体間にばらつきがなく、高率で斉一に、かつ、播種後、
早期のうちに発芽すること、更に、それに続く旺盛な初
期生育が認められる、高度の発芽性を有することが、作
物植物として理想的である。このような、高度の発芽性
を有する品種の育成を目的として、従来から、種子を湿
潤条件下で実際に発芽させて調査する、発芽力検定が行
われていた。また、作物の栽培にあたっては、種子の播
種される環境条件が、その作物植物にとって好ましくな
い場合、例えば、高温、低温、高塩濃度のような、環境
ストレス下においても、なお、発芽、生長することが要
求される場合がある。そのため、播種の環境ストレス下
における、高度の発芽性を有する作物植物を作出するた
めの品種改良が試みられている。
生長を開始する。特に、作物植物においては、種子を播
種する環境条件における発芽性が、栽培上、問題になる
場合がある。種子が播種される環境条件下において、個
体間にばらつきがなく、高率で斉一に、かつ、播種後、
早期のうちに発芽すること、更に、それに続く旺盛な初
期生育が認められる、高度の発芽性を有することが、作
物植物として理想的である。このような、高度の発芽性
を有する品種の育成を目的として、従来から、種子を湿
潤条件下で実際に発芽させて調査する、発芽力検定が行
われていた。また、作物の栽培にあたっては、種子の播
種される環境条件が、その作物植物にとって好ましくな
い場合、例えば、高温、低温、高塩濃度のような、環境
ストレス下においても、なお、発芽、生長することが要
求される場合がある。そのため、播種の環境ストレス下
における、高度の発芽性を有する作物植物を作出するた
めの品種改良が試みられている。
【０００３】具体的な例としては、寒冷地において、イ
ネの直播栽培を行う場合の、イネの発芽性の改良が挙げ
られる。熱帯に起源を有するイネの発芽の最適温度は、
約３０℃である。長年の品種育成により、現在では、冷
涼な気候の高緯度地方においても、イネの栽培が行われ
ているが、この場合、苗代で育苗を行うことにより、播
種期に低温に晒されることを、可能な限り回避すること
が必要である。このような苗代による栽培は、直播栽培
に比べると手間がかかり、作付け密度も、直播に比べる
と粗にならざるを得ず、イネの収率にも限界がある。直
播を可能にするためには、高度の発芽性を有する品種を
開発して、たとえ、発芽時に低温に晒されても、植物体
が生長し、その後も旺盛に発育する手段を提供すること
が必要となる。
ネの直播栽培を行う場合の、イネの発芽性の改良が挙げ
られる。熱帯に起源を有するイネの発芽の最適温度は、
約３０℃である。長年の品種育成により、現在では、冷
涼な気候の高緯度地方においても、イネの栽培が行われ
ているが、この場合、苗代で育苗を行うことにより、播
種期に低温に晒されることを、可能な限り回避すること
が必要である。このような苗代による栽培は、直播栽培
に比べると手間がかかり、作付け密度も、直播に比べる
と粗にならざるを得ず、イネの収率にも限界がある。直
播を可能にするためには、高度の発芽性を有する品種を
開発して、たとえ、発芽時に低温に晒されても、植物体
が生長し、その後も旺盛に発育する手段を提供すること
が必要となる。
【０００４】イネの低温下での発芽性については、複数
の遺伝子が関与すること、また、発芽性に優れる系統
は、初期の生育性にも優れることが報告されている（佐
々木、（１９７４）、北海道立農試報告Ｎｏ．２４：５
−３７）。また、多くの遺伝資源から、低温下での発芽
性に優れるイネ品種のスクリーニングも行われている
（小高、安部（１９８８）、農業技術４３（４）：１６
５−１６８）。現在、わが国では、高度の発芽性を有す
る母本から、栽培品種への導入が、鋭意すすめられつつ
ある。
の遺伝子が関与すること、また、発芽性に優れる系統
は、初期の生育性にも優れることが報告されている（佐
々木、（１９７４）、北海道立農試報告Ｎｏ．２４：５
−３７）。また、多くの遺伝資源から、低温下での発芽
性に優れるイネ品種のスクリーニングも行われている
（小高、安部（１９８８）、農業技術４３（４）：１６
５−１６８）。現在、わが国では、高度の発芽性を有す
る母本から、栽培品種への導入が、鋭意すすめられつつ
ある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上述したように、現在
行われている、種子の発芽力検定を行うには、種子を収
穫して、これを実際に発芽させることが必要である。よ
って、この発芽力検定においては、発芽力の評価と選抜
に多くの時間を要し、さらに、種子の発芽力は、植物の
生育条件、特に、種子の登熟環境に影響されるため、年
次間の誤差が生じ、正確な形質の評価を行うことが困難
な場合があった。また、高度の発芽性を有する品種を育
成するために行う発芽力試験では、種子の調製、発芽の
ための施設と発芽条件の設定、経時的な調査など、多大
な労力と時間を必要とする。
行われている、種子の発芽力検定を行うには、種子を収
穫して、これを実際に発芽させることが必要である。よ
って、この発芽力検定においては、発芽力の評価と選抜
に多くの時間を要し、さらに、種子の発芽力は、植物の
生育条件、特に、種子の登熟環境に影響されるため、年
次間の誤差が生じ、正確な形質の評価を行うことが困難
な場合があった。また、高度の発芽性を有する品種を育
成するために行う発芽力試験では、種子の調製、発芽の
ための施設と発芽条件の設定、経時的な調査など、多大
な労力と時間を必要とする。
【０００６】そのために、高度の発芽性を有する品種の
育成を行うに際して、多数の種子検体についても、それ
ぞれの発芽性を、安定的、効率的、かつ、簡便に選抜す
る手段の確立が望まれている。
育成を行うに際して、多数の種子検体についても、それ
ぞれの発芽性を、安定的、効率的、かつ、簡便に選抜す
る手段の確立が望まれている。
【０００７】近年、多くの作物植物において、遺伝子マ
ーカーを用いた遺伝子解析により、容易にゲノムの特定
領域の構造を調査することが可能となり、育種におけ
る、種々の形質の選抜を、目的形質遺伝子の近傍に位置
する遺伝子マーカーを用いることにより、行うことがで
きることが報告されている（特開２０００−２７９１７
０号公報、特開平１１−８９５８３号公報、特開平１０
−１２７２９０号公報、特開平１０−８４９６５号公報
等）。
ーカーを用いた遺伝子解析により、容易にゲノムの特定
領域の構造を調査することが可能となり、育種におけ
る、種々の形質の選抜を、目的形質遺伝子の近傍に位置
する遺伝子マーカーを用いることにより、行うことがで
きることが報告されている（特開２０００−２７９１７
０号公報、特開平１１−８９５８３号公報、特開平１０
−１２７２９０号公報、特開平１０−８４９６５号公報
等）。
【０００８】本発明の目的は、イネ科植物の生育初期の
段階で、個体の発芽性を、安定、効率的、かつ、簡便
に、選抜するために、イネ科植物の発芽性に関与する遺
伝子に対する遺伝子マーカーを見出し、この遺伝子マー
カーを用いる、高度の発芽性を有するイネ科植物の選抜
方法を提供することにある。
段階で、個体の発芽性を、安定、効率的、かつ、簡便
に、選抜するために、イネ科植物の発芽性に関与する遺
伝子に対する遺伝子マーカーを見出し、この遺伝子マー
カーを用いる、高度の発芽性を有するイネ科植物の選抜
方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決するために、高度の発芽性を有するイネ科植物の
選抜を可能とする、遺伝子マーカーについての検討を行
った。その結果、イネ科植物の高度の発芽性を発現する
遺伝子に連鎖する領域における遺伝子マーカーを指標と
することにより、高度の発芽性を有するイネ科植物を選
抜することが可能であることを見出し、本発明を完成し
た。
を解決するために、高度の発芽性を有するイネ科植物の
選抜を可能とする、遺伝子マーカーについての検討を行
った。その結果、イネ科植物の高度の発芽性を発現する
遺伝子に連鎖する領域における遺伝子マーカーを指標と
することにより、高度の発芽性を有するイネ科植物を選
抜することが可能であることを見出し、本発明を完成し
た。
【００１０】すなわち、本発明は、イネ科植物の高度の
発芽性を発現する遺伝子（以下、発芽性遺伝子ともい
う）に連鎖する領域における遺伝子マーカーを指標とし
て、高度の発芽性を有するイネ科植物を選抜する、イネ
科植物の選抜方法（以下、本選抜方法ともいう）を提供
する発明である。
発芽性を発現する遺伝子（以下、発芽性遺伝子ともい
う）に連鎖する領域における遺伝子マーカーを指標とし
て、高度の発芽性を有するイネ科植物を選抜する、イネ
科植物の選抜方法（以下、本選抜方法ともいう）を提供
する発明である。
【００１１】本発明における、「高度の発芽性」とは、
少なくとも、発芽から、生長初期における生長の程度
が、その植物の標準的な生長の程度よりも高度であるこ
とを意味する。また、ここで「高度」とは、生長のスピ
ードが速いこと、通常では、発芽から生長初期の生長が
抑制されるストレス環境においても、そのストレスに対
して抵抗性を示し、生長を行うこと等を意味する。「ス
トレス環境」とは、通常、植物の生長を妨げるストレス
が存在する環境であれば、特に限定されず、例えば、低
温、高温、過度の高湿度、乾燥、高い塩濃度等が挙げら
れる。
少なくとも、発芽から、生長初期における生長の程度
が、その植物の標準的な生長の程度よりも高度であるこ
とを意味する。また、ここで「高度」とは、生長のスピ
ードが速いこと、通常では、発芽から生長初期の生長が
抑制されるストレス環境においても、そのストレスに対
して抵抗性を示し、生長を行うこと等を意味する。「ス
トレス環境」とは、通常、植物の生長を妨げるストレス
が存在する環境であれば、特に限定されず、例えば、低
温、高温、過度の高湿度、乾燥、高い塩濃度等が挙げら
れる。
【００１２】「イネ科植物」としては、イネ、オオム
ギ、パンコムギ、タルホコムギ、マカロニコムギ、ライ
ムギ、トウモロコシ等の穀物植物を好適な対象として挙
げることができるが、これらに限定されるものではな
い。
ギ、パンコムギ、タルホコムギ、マカロニコムギ、ライ
ムギ、トウモロコシ等の穀物植物を好適な対象として挙
げることができるが、これらに限定されるものではな
い。
【００１３】本発明において用いる、ｃＭ（センチモル
ガン）とは、乗換え率の単位（交差単位）であり、同一
染色体上の遺伝子間の遺伝的距離を表す単位である。１
ｃＭは、２つの遺伝子間に１％の頻度で交差が起こる場
合の両遺伝子間の距離を示し、１マップ単位(map unit)
と等しい。よって、この数値が小さいほど、遺伝子の乗
換えが起こる頻度が小さく、一般的には、２つの遺伝子
の染色体上の距離が近いこと、すなわち、２つの遺伝子
の連鎖が強いことを意味している。
ガン）とは、乗換え率の単位（交差単位）であり、同一
染色体上の遺伝子間の遺伝的距離を表す単位である。１
ｃＭは、２つの遺伝子間に１％の頻度で交差が起こる場
合の両遺伝子間の距離を示し、１マップ単位(map unit)
と等しい。よって、この数値が小さいほど、遺伝子の乗
換えが起こる頻度が小さく、一般的には、２つの遺伝子
の染色体上の距離が近いこと、すなわち、２つの遺伝子
の連鎖が強いことを意味している。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を説明
する。本発明は、未だ、本体が明らかとなっていない
「発芽性遺伝子」に連鎖する遺伝子マーカー、すなわ
ち、発芽性遺伝子に対応して何らかの変化を示すイネ科
植物の遺伝子のマーカーを見出して、この遺伝子マーカ
ーを指標として、高度の発芽性を形質として有するイネ
科植物を選抜する、植物の選抜方法である。
する。本発明は、未だ、本体が明らかとなっていない
「発芽性遺伝子」に連鎖する遺伝子マーカー、すなわ
ち、発芽性遺伝子に対応して何らかの変化を示すイネ科
植物の遺伝子のマーカーを見出して、この遺伝子マーカ
ーを指標として、高度の発芽性を形質として有するイネ
科植物を選抜する、植物の選抜方法である。
【００１５】遺伝子マーカーは、発芽性遺伝子に対応す
る何らかの変化を、多型として検出することができる遺
伝子マーカーであることが好適である。例えば、特定の
制限酵素に対応する制限パターンの差異を指標として、
多型を検出可能な方法として、ＲＦＬＰ法により検出す
るＲＦＬＰマーカー[Botstein,D,et al.,(1980)AM.J.Hu
m.Genet.32:314-331] 、ＡＦＬＰ法により検出するＡＦ
ＬＰマーカー[Zabeau,M.and P.Vos(1993)European Pate
nt Apprication,EP0534858) 、ＲＬＧＳ法により検出す
るＲＬＧＳマーカー[Hatada,I. et al.,(1991)Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA88:9523-9527]等が例示可能である。特
に、イネにおいては、多数のＲＦＬＰマーカーが見出さ
れ[Harushima,Y. et al.,(1998)Genetics 148:479-49
4]、ＲＦＬＰ法が、一般的な方法として挙げられる。
る何らかの変化を、多型として検出することができる遺
伝子マーカーであることが好適である。例えば、特定の
制限酵素に対応する制限パターンの差異を指標として、
多型を検出可能な方法として、ＲＦＬＰ法により検出す
るＲＦＬＰマーカー[Botstein,D,et al.,(1980)AM.J.Hu
m.Genet.32:314-331] 、ＡＦＬＰ法により検出するＡＦ
ＬＰマーカー[Zabeau,M.and P.Vos(1993)European Pate
nt Apprication,EP0534858) 、ＲＬＧＳ法により検出す
るＲＬＧＳマーカー[Hatada,I. et al.,(1991)Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA88:9523-9527]等が例示可能である。特
に、イネにおいては、多数のＲＦＬＰマーカーが見出さ
れ[Harushima,Y. et al.,(1998)Genetics 148:479-49
4]、ＲＦＬＰ法が、一般的な方法として挙げられる。
【００１６】また、多型の存在する遺伝子領域を、ＰＣ
Ｒ法等の遺伝子領域を増幅させて、得られた遺伝子増幅
産物の塩基長の差異で、多型による遺伝子型の異同を検
出可能な方法も用いることができる。特に、遺伝子増幅
産物による検出を行う場合には、多型頻度が高い、ＳＳ
Ｒ(Simple sequence repeats) 領域[Powell,W.et al.,
(1996) Trends Plant Sci 1:215-222、McCouch,SR.et a
l.,(1997)Plant Mol Biol 35:89-99]を、本発明で用い
る遺伝子マーカーを選択する場合の指標とすることが好
適である。ＳＳＲ領域は、既存のソフトウエアで検索を
行うことができる〔例えば、「ＳＳＲＩＴ」(http://ar
s-genome.cornell.edu/cgi-bin/rice/ssrtool.pl)
等〕。
Ｒ法等の遺伝子領域を増幅させて、得られた遺伝子増幅
産物の塩基長の差異で、多型による遺伝子型の異同を検
出可能な方法も用いることができる。特に、遺伝子増幅
産物による検出を行う場合には、多型頻度が高い、ＳＳ
Ｒ(Simple sequence repeats) 領域[Powell,W.et al.,
(1996) Trends Plant Sci 1:215-222、McCouch,SR.et a
l.,(1997)Plant Mol Biol 35:89-99]を、本発明で用い
る遺伝子マーカーを選択する場合の指標とすることが好
適である。ＳＳＲ領域は、既存のソフトウエアで検索を
行うことができる〔例えば、「ＳＳＲＩＴ」(http://ar
s-genome.cornell.edu/cgi-bin/rice/ssrtool.pl)
等〕。
【００１７】本選抜方法における、発芽性遺伝子と連鎖
する遺伝子マーカーは、可能な限り、発芽性遺伝子との
遺伝的距離が近いことが、発芽性遺伝子との連鎖の信頼
性が高く好適である。具体的には、発芽性遺伝子と２０
ｃＭ以内の領域が好適であり、特に好適には、同１１．
２ｃＭ以内、極めて好適には、同７．９ｃＭ以内の領域
である。
する遺伝子マーカーは、可能な限り、発芽性遺伝子との
遺伝的距離が近いことが、発芽性遺伝子との連鎖の信頼
性が高く好適である。具体的には、発芽性遺伝子と２０
ｃＭ以内の領域が好適であり、特に好適には、同１１．
２ｃＭ以内、極めて好適には、同７．９ｃＭ以内の領域
である。
【００１８】イネ科植物が、イネである場合、上記の２
０ｃＭ以内の遺伝子領域としては、ＡＰ０００６１５、
ＡＣ０９７６２７、ＡＣ０９８６９５、ＡＣ０９９７３
９、ＡＣ０９８６９３、ＡＣ０９９３９９等（イネゲノ
ム研究プログラムhttp://rgp.dna.affrc.go.jp、ＣＣＷ
イネゲノム研究コンソーシアムhttp://www.genome.clem
son.edu/projects/rice/ccw/等）を挙げることができ
る。
０ｃＭ以内の遺伝子領域としては、ＡＰ０００６１５、
ＡＣ０９７６２７、ＡＣ０９８６９５、ＡＣ０９９７３
９、ＡＣ０９８６９３、ＡＣ０９９３９９等（イネゲノ
ム研究プログラムhttp://rgp.dna.affrc.go.jp、ＣＣＷ
イネゲノム研究コンソーシアムhttp://www.genome.clem
son.edu/projects/rice/ccw/等）を挙げることができ
る。
【００１９】上述した遺伝子領域内で、イネ科植物の表
現型として、高度の発芽性が認められるか否かを指標と
して、多型の有無を検討することにより、目的とする遺
伝子マーカーを見出すことができる。
現型として、高度の発芽性が認められるか否かを指標と
して、多型の有無を検討することにより、目的とする遺
伝子マーカーを見出すことができる。
【００２０】例えば、イネ科植物が、イネである場合、
本発明において用いられ得る、ＲＦＬＰマーカーとして
は、例えば、Ｃ８１４ｂ、Ｓ１４７３、Ｒ１７１３、Ｓ
１５５４、Ｃ１１５３、Ｃ７２１、Ｃ５６７、Ｓ１７１
４、Ｒ１４６８Ａ、Ｃ７２５等（イネゲノム研究http:/
/rgp.dna.affrc.go.jp）が挙げられ、中でも、Ｃ８１４
ｂが好適である。
本発明において用いられ得る、ＲＦＬＰマーカーとして
は、例えば、Ｃ８１４ｂ、Ｓ１４７３、Ｒ１７１３、Ｓ
１５５４、Ｃ１１５３、Ｃ７２１、Ｃ５６７、Ｓ１７１
４、Ｒ１４６８Ａ、Ｃ７２５等（イネゲノム研究http:/
/rgp.dna.affrc.go.jp）が挙げられ、中でも、Ｃ８１４
ｂが好適である。
【００２１】また、例えば、上記の遺伝子領域ＡＰ００
０６１５内の増幅遺伝子マーカーを１種または２種以
上、本選抜方法で用いる場合、その中の少なくとも１種
を、配列番号１で表される塩基配列のＳＳＲ配列を含む
遺伝子領域を増幅遺伝子マーカーとすることが好適であ
る。このＳＳＲ配列を含む遺伝子領域は、イネにおける
高度の発芽性の形質の有無に応じて、塩基長が変化する
ことが認められており（実施例参照）、非常に好適な増
幅遺伝子マーカーである。
０６１５内の増幅遺伝子マーカーを１種または２種以
上、本選抜方法で用いる場合、その中の少なくとも１種
を、配列番号１で表される塩基配列のＳＳＲ配列を含む
遺伝子領域を増幅遺伝子マーカーとすることが好適であ
る。このＳＳＲ配列を含む遺伝子領域は、イネにおける
高度の発芽性の形質の有無に応じて、塩基長が変化する
ことが認められており（実施例参照）、非常に好適な増
幅遺伝子マーカーである。
【００２２】特定の遺伝子領域を、ＰＣＲ法等の遺伝子
増幅法で増幅させて、増幅遺伝子マーカーとする場合、
増幅を行う鋳型遺伝子の５’末端と３’末端に対して、
実質的に相補的な、遺伝子増幅反応を行うための遺伝子
増幅用プライマーが必要である。かかる遺伝子増幅用プ
ライマーの選択は、目的とする遺伝子領域を、遺伝子増
幅反応で増幅可能なものである限り、特に限定されず、
ＰＣＲ法等の遺伝子増幅反応を、一般的に行う際におけ
る、プライマー選択基準に基づき選択することができ
る。
増幅法で増幅させて、増幅遺伝子マーカーとする場合、
増幅を行う鋳型遺伝子の５’末端と３’末端に対して、
実質的に相補的な、遺伝子増幅反応を行うための遺伝子
増幅用プライマーが必要である。かかる遺伝子増幅用プ
ライマーの選択は、目的とする遺伝子領域を、遺伝子増
幅反応で増幅可能なものである限り、特に限定されず、
ＰＣＲ法等の遺伝子増幅反応を、一般的に行う際におけ
る、プライマー選択基準に基づき選択することができ
る。
【００２３】例えば、配列番号１で表される塩基配列の
ＳＳＲ配列を含む遺伝子領域を増幅遺伝子マーカーとす
る場合には、センスプライマーとして、１種または２種
以上の配列番号２で表されるヌクレオチド鎖の塩基配列
から選ばれる、連続した１５〜３０塩基のヌクレオチド
鎖を５’末端側に含み、かつ、全体の塩基長が、１５〜
５０塩基のヌクレオチド鎖とすることが好適な態様とし
て挙げることができる。また、アンチセンスプライマー
としては、１種または２種以上の配列番号３で表される
ヌクレオチド鎖の塩基配列から選ばれる、連続した１５
〜３０塩基のヌクレオチド鎖を３’末端側に含み、か
つ、全体の塩基長が、１５〜３０塩基のヌクレオチド
鎖、からなる群から選ばれる、１種または２種以上のヌ
クレオチド鎖とすることを好適な態様として挙げること
ができる。
ＳＳＲ配列を含む遺伝子領域を増幅遺伝子マーカーとす
る場合には、センスプライマーとして、１種または２種
以上の配列番号２で表されるヌクレオチド鎖の塩基配列
から選ばれる、連続した１５〜３０塩基のヌクレオチド
鎖を５’末端側に含み、かつ、全体の塩基長が、１５〜
５０塩基のヌクレオチド鎖とすることが好適な態様とし
て挙げることができる。また、アンチセンスプライマー
としては、１種または２種以上の配列番号３で表される
ヌクレオチド鎖の塩基配列から選ばれる、連続した１５
〜３０塩基のヌクレオチド鎖を３’末端側に含み、か
つ、全体の塩基長が、１５〜３０塩基のヌクレオチド
鎖、からなる群から選ばれる、１種または２種以上のヌ
クレオチド鎖とすることを好適な態様として挙げること
ができる。
【００２４】配列番号１と配列番号２で表されるヌクレ
オチド鎖は、共に、報告されているイネの遺伝子の塩基
配列に対して相補的な配列のヌクレオチド鎖であり、後
述する実施例に示すように、これらのヌクレオチド鎖
を、遺伝子増幅反応のセンスプライマーとアンチセンス
プライマーとして用いることが好適である。しかしなが
ら、例えば、これら連続する３０塩基全体を用いなくて
も、少なくとも、これらの配列のうち、少なくとも、連
続する１５塩基が、鋳型遺伝子における遺伝子増幅反応
の開始点において相補的であれば、プライマーの全ての
部分が鋳型遺伝子と、完全に相補的である必要はない
（センスプライマーであれば、５’末端側１５塩基以上
が配列番号１の配列と一致し、アンチセンスプライマー
であれば３’末端側１５塩基以上が配列番号２の配列と
一致することが好適である）。また、このような条件を
満たす、遺伝子増幅用プライマーの全塩基長は、５０塩
基以下程度であることが、一般的である。
オチド鎖は、共に、報告されているイネの遺伝子の塩基
配列に対して相補的な配列のヌクレオチド鎖であり、後
述する実施例に示すように、これらのヌクレオチド鎖
を、遺伝子増幅反応のセンスプライマーとアンチセンス
プライマーとして用いることが好適である。しかしなが
ら、例えば、これら連続する３０塩基全体を用いなくて
も、少なくとも、これらの配列のうち、少なくとも、連
続する１５塩基が、鋳型遺伝子における遺伝子増幅反応
の開始点において相補的であれば、プライマーの全ての
部分が鋳型遺伝子と、完全に相補的である必要はない
（センスプライマーであれば、５’末端側１５塩基以上
が配列番号１の配列と一致し、アンチセンスプライマー
であれば３’末端側１５塩基以上が配列番号２の配列と
一致することが好適である）。また、このような条件を
満たす、遺伝子増幅用プライマーの全塩基長は、５０塩
基以下程度であることが、一般的である。
【００２５】このように、配列番号１にかかわるセンス
プライマーと、配列番号２にかかわるアンチセンスプラ
イマーを用いて、遺伝子増幅を行うことにより、被験イ
ネの発芽性遺伝子に応じて、異なる塩基長を与える増幅
遺伝子マーカーが得られる。
プライマーと、配列番号２にかかわるアンチセンスプラ
イマーを用いて、遺伝子増幅を行うことにより、被験イ
ネの発芽性遺伝子に応じて、異なる塩基長を与える増幅
遺伝子マーカーが得られる。
【００２６】
【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。ただし、
この実施例の記載により、本発明の技術的範囲が限定さ
れるものではない。 〔実施例１〕 ＲＦＬＰ分析 寒冷に対する高度の発芽性が認められる品種のイネ（It
alica Livorno)と、寒冷に対する通常の発芽性が認めら
れる品種のイネ（はやまさり）の緑葉から、ＣＴＡＢ法
により、ＤＮＡを抽出した。ここで行ったＣＴＡＢ法
は、マーレイ・トンプソン法[Murray,H.G. and Thompso
n,W.F.(1980)Nucleic.Acid Res.8:4321-4325) の改変法
であり、各々の緑葉の凍結組織をホモジネートして、こ
れから、ＤＮＡを抽出した。
この実施例の記載により、本発明の技術的範囲が限定さ
れるものではない。 〔実施例１〕 ＲＦＬＰ分析 寒冷に対する高度の発芽性が認められる品種のイネ（It
alica Livorno)と、寒冷に対する通常の発芽性が認めら
れる品種のイネ（はやまさり）の緑葉から、ＣＴＡＢ法
により、ＤＮＡを抽出した。ここで行ったＣＴＡＢ法
は、マーレイ・トンプソン法[Murray,H.G. and Thompso
n,W.F.(1980)Nucleic.Acid Res.8:4321-4325) の改変法
であり、各々の緑葉の凍結組織をホモジネートして、こ
れから、ＤＮＡを抽出した。
【００２７】得られたＤＮＡを用いて、ＲＦＬＰ分析を
行った。このＲＦＬＰ分析に用いられた、ＲＦＬＰマー
カーは、イネゲノムプログラムにより開発されたもので
ある[Harushima,Yら(1998)Genetics 148-494] 。
行った。このＲＦＬＰ分析に用いられた、ＲＦＬＰマー
カーは、イネゲノムプログラムにより開発されたもので
ある[Harushima,Yら(1998)Genetics 148-494] 。
【００２８】また、ＲＦＬＰ分析の手法は、常法[Kurat
a,N.et al.,(1994)Nature Genet.8:365-372]に従って行
った。すなわち、ＤＮＡは、８種類の制限酵素（BamHI
，BglII ，EcoRV ，HindIII ，ApaI，DraI，EcoRI ，K
pnI）で消化し、消化したＤＮＡを、０．６％のアガロ
ースゲルを用いて電気泳動を行い、ナイロンメンブレン
（ロシュ社製）へ、サザンブロッティングを行った。サ
ザンハイブリダイゼーションおよび検出は、ＥＣＬシス
テム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）により
行った。
a,N.et al.,(1994)Nature Genet.8:365-372]に従って行
った。すなわち、ＤＮＡは、８種類の制限酵素（BamHI
，BglII ，EcoRV ，HindIII ，ApaI，DraI，EcoRI ，K
pnI）で消化し、消化したＤＮＡを、０．６％のアガロ
ースゲルを用いて電気泳動を行い、ナイロンメンブレン
（ロシュ社製）へ、サザンブロッティングを行った。サ
ザンハイブリダイゼーションおよび検出は、ＥＣＬシス
テム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）により
行った。
【００２９】およそ、１０００種類のＲＦＬＰマーカー
を解析したところ、約１００種類のＲＦＬＰマーカー
で、上記の２品種間における、多型が認められた。これ
らの約１００種類の、多型が認められたＲＦＬＰマーカ
ーと、発芽性遺伝子との遺伝的連鎖関係を明らかとする
遺伝解析を、以下のように行った。
を解析したところ、約１００種類のＲＦＬＰマーカー
で、上記の２品種間における、多型が認められた。これ
らの約１００種類の、多型が認められたＲＦＬＰマーカ
ーと、発芽性遺伝子との遺伝的連鎖関係を明らかとする
遺伝解析を、以下のように行った。
【００３０】まず、低温に対する高度の発芽性を有する
イネ品種である「Italica Livorno」と、通常の発芽性
が認められているイネ品種である「はやまさり」との交
雑Ｆ１に、「はやまさり」を戻し交配した、ＢＣ１Ｆ１
世代から、単粒系統法により、組換え自殖系統ＢＣ１Ｆ
５世代を作出した。
イネ品種である「Italica Livorno」と、通常の発芽性
が認められているイネ品種である「はやまさり」との交
雑Ｆ１に、「はやまさり」を戻し交配した、ＢＣ１Ｆ１
世代から、単粒系統法により、組換え自殖系統ＢＣ１Ｆ
５世代を作出した。
【００３１】この組換え自殖系統ＢＣ１Ｆ５世代の発芽
性の評価は、従来から行われている種子を用いる発芽力
検定（低温下）により行った。すなわち、発芽力検定
を、温度条件を１５℃として行い、その発芽率により、
各系統の発芽性を評価した。
性の評価は、従来から行われている種子を用いる発芽力
検定（低温下）により行った。すなわち、発芽力検定
を、温度条件を１５℃として行い、その発芽率により、
各系統の発芽性を評価した。
【００３２】また、各系統の緑葉から、上述した条件
で、ＤＮＡを抽出して、これについて、ＲＦＬＰ分析を
行った。ＲＦＬＰマーカーとしては、上述の多型を示し
た１００種類のマーカーを用いた。ＲＦＬＰマーカーの
遺伝子型と発芽率の連鎖関係を解析したところ、ＲＦＬ
ＰマーカーＣ８１４ｂ[Harushima,Yら(1998)Genetics 1
48-494] が発芽性遺伝子に連鎖していることが明らかと
なった。第１表と第１図に、ＲＦＬＰマーカーを用いた
ＲＦＬＰ分析の結果と、低温条件下における発芽性につ
いての関係を示した（第１図において、黒棒は、Italic
a Livorno の系統数を表し、白棒は、はやまさりの系統
数を表す）。
で、ＤＮＡを抽出して、これについて、ＲＦＬＰ分析を
行った。ＲＦＬＰマーカーとしては、上述の多型を示し
た１００種類のマーカーを用いた。ＲＦＬＰマーカーの
遺伝子型と発芽率の連鎖関係を解析したところ、ＲＦＬ
ＰマーカーＣ８１４ｂ[Harushima,Yら(1998)Genetics 1
48-494] が発芽性遺伝子に連鎖していることが明らかと
なった。第１表と第１図に、ＲＦＬＰマーカーを用いた
ＲＦＬＰ分析の結果と、低温条件下における発芽性につ
いての関係を示した（第１図において、黒棒は、Italic
a Livorno の系統数を表し、白棒は、はやまさりの系統
数を表す）。
【００３３】
【表１】
第 １ 表
───────────────────────────────────
Ｃ８１４ｂ遺伝子型と系統数
─────────────────────────
発芽率（％） 「はやまさり」型 「Italica Livorno 」型
───────────────────────────────────
０ ６ １
１０ ２７ ２
２０ ２０ ４
３０ １３ ５
４０ １０ ７
５０ ６ ４
６０ １ ５
７０ ２ ４
８０ ２ ０
９０ ０ ２
１００ ０ ０
───────────────────────────────────
第１表と第１図により、ＲＦＬＰマーカーＣ８１４ｂに
よる遺伝子型分析のパターンが、「Italica Livorno 」
の場合には、低温における高度の発芽性が認められ、同
「はやまさり」の場合には、通常の発芽性が認められ
た。
よる遺伝子型分析のパターンが、「Italica Livorno 」
の場合には、低温における高度の発芽性が認められ、同
「はやまさり」の場合には、通常の発芽性が認められ
た。
【００３４】この結果、ＲＦＬＰマーカーＣ８１４ｂ
は、発芽性遺伝子と強く連鎖しており、高度の発芽性を
有するイネを選択するためのＲＦＬＰマーカーとして好
適であることが判明した。
は、発芽性遺伝子と強く連鎖しており、高度の発芽性を
有するイネを選択するためのＲＦＬＰマーカーとして好
適であることが判明した。
【００３５】ＲＦＬＰマーカーＣ８１４ｂは、イネの第
３染色体の１１．２に位置するＲＦＬＰマーカーであ
る。連鎖解析の結果、発芽性遺伝子は、このＣ８１４ｂ
近傍から短腕末端部に存在することが示された。すなわ
ち、Ｃ８１４ｂと発芽性遺伝子は、１１．２ｃＭ以内の
連鎖関係にあることが明らかとなった。
３染色体の１１．２に位置するＲＦＬＰマーカーであ
る。連鎖解析の結果、発芽性遺伝子は、このＣ８１４ｂ
近傍から短腕末端部に存在することが示された。すなわ
ち、Ｃ８１４ｂと発芽性遺伝子は、１１．２ｃＭ以内の
連鎖関係にあることが明らかとなった。
【００３６】〔実施例２〕 ＰＣＲマーカーによる分析
（１）イネゲノム研究プログラムの公開データー（htt
p://rgp.dna.affrc.go.jp）を用いて、上記実施例１に
おいて、発芽性遺伝子と連鎖していることが判明した、
ＲＦＬＰマーカーＣ８１４ｂの座乗する染色体領域近傍
の塩基配列である、ＡＰ０００６１５の情報を得た。こ
の塩基配列における、ＳＳＲ配列〔イネにおいて、多型
を得やすい繰り返し配列であることが知られている：Mc
Couch,SR.et al.,(1997)Plant.Mol.Biol.35:89-99 〕
を、ＳＳＲ検索ソフトウエア「ＳＳＲＩＴ」(http://ar
s-genome.cornell.edu/cgi-bin/rice/ssrtool.pl) を用
いて、配列番号１に示すＳＳＲ配列〔（ＴＡ）２１（Ｔ
Ｇ）１２〕の情報を得た。次いで、この配列番号１記載
のＳＳＲ配列近傍の、イネ遺伝子における塩基配列を基
に、このＳＳＲ近傍領域を、ＰＣＲ法により増幅可能な
ＰＣＲプライマーを、コンピューターソフトウエア「Ol
igo4.04 」(National Bioscience社製）を用いて設計
し、下記の塩基配列のオリゴヌクレオチド（配列番号
２，３）を、ＤＮＡシンセサイザー（System plus ：ベ
ックマン社製）で合成した〔アール・エル・レンジャー
等の方法(R.T.Letsinger,W.B.Lursford,J.Am.Chem.Soci
ety.98,3655)に従う〕。
p://rgp.dna.affrc.go.jp）を用いて、上記実施例１に
おいて、発芽性遺伝子と連鎖していることが判明した、
ＲＦＬＰマーカーＣ８１４ｂの座乗する染色体領域近傍
の塩基配列である、ＡＰ０００６１５の情報を得た。こ
の塩基配列における、ＳＳＲ配列〔イネにおいて、多型
を得やすい繰り返し配列であることが知られている：Mc
Couch,SR.et al.,(1997)Plant.Mol.Biol.35:89-99 〕
を、ＳＳＲ検索ソフトウエア「ＳＳＲＩＴ」(http://ar
s-genome.cornell.edu/cgi-bin/rice/ssrtool.pl) を用
いて、配列番号１に示すＳＳＲ配列〔（ＴＡ）２１（Ｔ
Ｇ）１２〕の情報を得た。次いで、この配列番号１記載
のＳＳＲ配列近傍の、イネ遺伝子における塩基配列を基
に、このＳＳＲ近傍領域を、ＰＣＲ法により増幅可能な
ＰＣＲプライマーを、コンピューターソフトウエア「Ol
igo4.04 」(National Bioscience社製）を用いて設計
し、下記の塩基配列のオリゴヌクレオチド（配列番号
２，３）を、ＤＮＡシンセサイザー（System plus ：ベ
ックマン社製）で合成した〔アール・エル・レンジャー
等の方法(R.T.Letsinger,W.B.Lursford,J.Am.Chem.Soci
ety.98,3655)に従う〕。
【００３７】センスプライマー：ＡＧＣＣＡＧＧＴＡＴ
ＧＴＣＡＴＡＡＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＣＡＡ（配列番号
２） アンチセンスプライマー：ＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣ
ＡＣＴＡＴＡＡＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧ（配列番号３）
ＧＴＣＡＴＡＡＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＣＡＡ（配列番号
２） アンチセンスプライマー：ＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣ
ＡＣＴＡＴＡＡＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧ（配列番号３）
【００３８】これらのＰＣＲプライマーを、実施例１に
記載した要領で、被験イネの緑葉から抽出したＤＮＡを
鋳型として、ＰＣＲ反応を行い、配列番号１で示すＳＳ
Ｒ配列近傍の遺伝子増幅産物を調製して、被験イネ毎の
この遺伝子増幅産物の塩基長の差異を検出することによ
り、この増幅遺伝子マーカーが、発芽性遺伝子に連鎖し
た遺伝子であるか否かを検討した。本例において、ＰＣ
Ｒ反応は、ウイリアムズ(Williams)らの方法に従い、反
応混液を調製し、ジーン・アンプＰＣＲ９７００（パー
キンエルマー社製）とｉサイクラー（バイオラッド社
製）を用いて、ＤＮＡの増幅を行った[Theor.Apple.Gen
et.82,489-498(1990)]。このＰＣＲ反応より得られたＤ
ＮＡ増幅産物の検出は、ＰＣＲ反応が終了した反応液
に、泳動用色素液を添加し、電気泳動装置（フォーラッ
クサブマリン電気泳動装置：日本エイドー社製）を用
い、１８０Ｖで、約９０分間通電し、泳動終了後、０．
５μg/mlエチジウムブロマイド溶液に、２０分間浸漬す
ることにより行った。なお、泳動用バッファーとして
は、ＴＢＥバッファーを用い、ゲルは、１．５または２
％（Ｗ／Ｖ）アガロース（シグマ社製：タイプＩ）を、
ＴＢＥバッファーに溶解して調製した。写真撮影は、上
述のエチジウムブロマイドで染色したゲルを、軽く水洗
し、透過型紫外線照明装置の上に置き、紫外線を照射し
て撮影した。その結果を、第２図に示す（レーン１：は
やまさりのＤＮＡ増幅産物のバンド、レーン２：Italic
a Livorno のＤＮＡ増幅産物のバンド、Ｍ：分子マーカ
ー（Φ×１７４-HaeIII ））。
記載した要領で、被験イネの緑葉から抽出したＤＮＡを
鋳型として、ＰＣＲ反応を行い、配列番号１で示すＳＳ
Ｒ配列近傍の遺伝子増幅産物を調製して、被験イネ毎の
この遺伝子増幅産物の塩基長の差異を検出することによ
り、この増幅遺伝子マーカーが、発芽性遺伝子に連鎖し
た遺伝子であるか否かを検討した。本例において、ＰＣ
Ｒ反応は、ウイリアムズ(Williams)らの方法に従い、反
応混液を調製し、ジーン・アンプＰＣＲ９７００（パー
キンエルマー社製）とｉサイクラー（バイオラッド社
製）を用いて、ＤＮＡの増幅を行った[Theor.Apple.Gen
et.82,489-498(1990)]。このＰＣＲ反応より得られたＤ
ＮＡ増幅産物の検出は、ＰＣＲ反応が終了した反応液
に、泳動用色素液を添加し、電気泳動装置（フォーラッ
クサブマリン電気泳動装置：日本エイドー社製）を用
い、１８０Ｖで、約９０分間通電し、泳動終了後、０．
５μg/mlエチジウムブロマイド溶液に、２０分間浸漬す
ることにより行った。なお、泳動用バッファーとして
は、ＴＢＥバッファーを用い、ゲルは、１．５または２
％（Ｗ／Ｖ）アガロース（シグマ社製：タイプＩ）を、
ＴＢＥバッファーに溶解して調製した。写真撮影は、上
述のエチジウムブロマイドで染色したゲルを、軽く水洗
し、透過型紫外線照明装置の上に置き、紫外線を照射し
て撮影した。その結果を、第２図に示す（レーン１：は
やまさりのＤＮＡ増幅産物のバンド、レーン２：Italic
a Livorno のＤＮＡ増幅産物のバンド、Ｍ：分子マーカ
ー（Φ×１７４-HaeIII ））。
【００３９】第２図により、寒冷に対する高度の発芽性
を有する、Italica Livorno のＤＮＡ増幅産物のバンド
は、約７５０bp、通常の発芽性を有する、はやまさりの
ＤＮＡ増幅産物のバンドは、約７２０bpであり、両ＤＮ
Ａ増幅産物の塩基長は、明らかに異なっており、電気泳
動像において、明確な識別が可能であることがわかっ
た。
を有する、Italica Livorno のＤＮＡ増幅産物のバンド
は、約７５０bp、通常の発芽性を有する、はやまさりの
ＤＮＡ増幅産物のバンドは、約７２０bpであり、両ＤＮ
Ａ増幅産物の塩基長は、明らかに異なっており、電気泳
動像において、明確な識別が可能であることがわかっ
た。
【００４０】（２）次に、実施例１において行った、組
換え自殖系統ＢＣ１Ｆ５世代の発芽性の評価を、低温下
（１５℃）で行い、この発芽性の評価結果と、上述のＰ
ＣＲプライマー（配列番号２，３）を用いて、各々の系
統の緑葉から抽出したＤＮＡの遺伝子増幅反応を、上記
（１）に準じて行い、遺伝子型を明らかにし（第３図：
レーン１：はやまさりのＤＮＡ増幅産物のバンド、レー
ン２：Italica Livorno のＤＮＡ増幅産物のバンド、レ
ーン３〜１２：組換え自殖系統のＤＮＡ増幅産物のバン
ド、Ｍ：分子マーカー（Φ×１７４-HaeIII ））、得ら
れたＤＮＡ増幅産物（増幅遺伝子マーカー）の塩基長
と、発芽性の連鎖関係を検討した。その結果を、第２表
と第４図に示す（第４図において、黒棒は、Italica Li
vorno の系統数を表し、白棒は、はやまさりの系統数を
表す）。
換え自殖系統ＢＣ１Ｆ５世代の発芽性の評価を、低温下
（１５℃）で行い、この発芽性の評価結果と、上述のＰ
ＣＲプライマー（配列番号２，３）を用いて、各々の系
統の緑葉から抽出したＤＮＡの遺伝子増幅反応を、上記
（１）に準じて行い、遺伝子型を明らかにし（第３図：
レーン１：はやまさりのＤＮＡ増幅産物のバンド、レー
ン２：Italica Livorno のＤＮＡ増幅産物のバンド、レ
ーン３〜１２：組換え自殖系統のＤＮＡ増幅産物のバン
ド、Ｍ：分子マーカー（Φ×１７４-HaeIII ））、得ら
れたＤＮＡ増幅産物（増幅遺伝子マーカー）の塩基長
と、発芽性の連鎖関係を検討した。その結果を、第２表
と第４図に示す（第４図において、黒棒は、Italica Li
vorno の系統数を表し、白棒は、はやまさりの系統数を
表す）。
【００４１】
【表２】
第 ２ 表
───────────────────────────────────
増幅遺伝子マーカーの遺伝子型と系統数
─────────────────────────
発芽率（％） 「はやまさり」型 「Italica Livorno 」型
───────────────────────────────────
０ ６ １
１０ ２８ １
２０ １９ ４
３０ １５ ３
４０ １０ ７
５０ ６ ４
６０ ０ ６
７０ ２ ４
８０ ２ ０
９０ ０ ２
１００ ０ ０
───────────────────────────────────
この結果、Italica Livorno 型の増幅断片を示す系統
の平均発芽率は、４２．８％であるのに対し、はやまさ
り型の増幅断片を示す系統の平均発芽率は、２０．６％
であり、約２倍の明らかな差異が認められた。発芽率
が５０％を超える、高度の寒冷に対する発芽性を示す系
統は、組換え自殖系統において１３．１％（１２２系統
中１６系統）存在したが、その１６系統のうちの７５％
は、Italica Livorno 型の増幅断片を示した。
の平均発芽率は、４２．８％であるのに対し、はやまさ
り型の増幅断片を示す系統の平均発芽率は、２０．６％
であり、約２倍の明らかな差異が認められた。発芽率
が５０％を超える、高度の寒冷に対する発芽性を示す系
統は、組換え自殖系統において１３．１％（１２２系統
中１６系統）存在したが、その１６系統のうちの７５％
は、Italica Livorno 型の増幅断片を示した。
【００４２】この結果により、配列番号２，３で表され
る塩基配列の遺伝子増幅用プライマーによって得られる
増幅遺伝子マーカーは、高度の寒冷に対する発芽性を有
するイネの系統を選抜するマーカーとなり得ることが示
唆された。
る塩基配列の遺伝子増幅用プライマーによって得られる
増幅遺伝子マーカーは、高度の寒冷に対する発芽性を有
するイネの系統を選抜するマーカーとなり得ることが示
唆された。
【００４３】ＡＰ０００６１５は、ＲＦＬＰマーカーＳ
１５５４を含む領域であることが知られており、このＳ
１５５４は、イネの第３染色体の７．９に位置するＲＦ
ＬＰマーカーである。つまり、ここで用いた増幅遺伝子
マーカーと発芽性遺伝子とは、７．９ｃＭ以内の連鎖関
係にあることが明らかとなった。
１５５４を含む領域であることが知られており、このＳ
１５５４は、イネの第３染色体の７．９に位置するＲＦ
ＬＰマーカーである。つまり、ここで用いた増幅遺伝子
マーカーと発芽性遺伝子とは、７．９ｃＭ以内の連鎖関
係にあることが明らかとなった。
【００４４】（３）この増幅遺伝子マーカーによる、高
度の発芽性を有するイネの選抜の汎用性を検討するため
に、他品種のイネ（全て、寒冷に対する発芽性は、通常
程度であることが認められている：きたいぶき，きらら
３９７，ほしのゆめ，彩，農林２０号，キタアケ）につ
いて、上記（１）（２）と同様の、配列番号２，３で表
される塩基配列の遺伝子増幅用プライマーを用いて、Ｐ
ＣＲ法を行うことにより得た、遺伝子増幅産物の塩基長
を検討した。その結果（電気泳動像）を、第５図に示す
（レーン１：Italica Livorno ，レーン２：はやまさ
り，レーン３：きたいぶき，レーン４：きらら３９７，
レーン５：ほしのゆめ，レーン６：彩，レーン７：農林
２０号，レーン８：キタアケ，Ｍ：分子マーカー（Φ×
１７４-HaeIII ））。第５図において、被験系統の増幅
遺伝子マーカーの塩基長は同一ではなかったが、通常の
寒冷に対する発芽性の系統に由来する、いずれのマーカ
ーも、高度の寒冷に対する発芽性が認められているItal
ica Livorno の増幅遺伝子マーカーの塩基長とは異なっ
ていた。
度の発芽性を有するイネの選抜の汎用性を検討するため
に、他品種のイネ（全て、寒冷に対する発芽性は、通常
程度であることが認められている：きたいぶき，きらら
３９７，ほしのゆめ，彩，農林２０号，キタアケ）につ
いて、上記（１）（２）と同様の、配列番号２，３で表
される塩基配列の遺伝子増幅用プライマーを用いて、Ｐ
ＣＲ法を行うことにより得た、遺伝子増幅産物の塩基長
を検討した。その結果（電気泳動像）を、第５図に示す
（レーン１：Italica Livorno ，レーン２：はやまさ
り，レーン３：きたいぶき，レーン４：きらら３９７，
レーン５：ほしのゆめ，レーン６：彩，レーン７：農林
２０号，レーン８：キタアケ，Ｍ：分子マーカー（Φ×
１７４-HaeIII ））。第５図において、被験系統の増幅
遺伝子マーカーの塩基長は同一ではなかったが、通常の
寒冷に対する発芽性の系統に由来する、いずれのマーカ
ーも、高度の寒冷に対する発芽性が認められているItal
ica Livorno の増幅遺伝子マーカーの塩基長とは異なっ
ていた。
【００４５】このことにより、配列番号２，３で表され
る塩基配列の遺伝子増幅用プライマーによって、遺伝子
増幅産物として得られる増幅遺伝子マーカーは、高度の
寒冷に対する発芽性を有するイネの系統を選抜するマー
カーとなり得ることが明らかとなった。
る塩基配列の遺伝子増幅用プライマーによって、遺伝子
増幅産物として得られる増幅遺伝子マーカーは、高度の
寒冷に対する発芽性を有するイネの系統を選抜するマー
カーとなり得ることが明らかとなった。
【００４６】
【発明の効果】本発明により、イネ科植物の生育初期の
段階で、個体の発芽性を、安定、効率的、かつ、簡便
に、選抜するために、イネ科植物の発芽性に関与する遺
伝子に対する遺伝子マーカーが見出され、この遺伝子マ
ーカーを用いる、高度の発芽性を有するイネ科植物の選
抜方法が提供される。
段階で、個体の発芽性を、安定、効率的、かつ、簡便
に、選抜するために、イネ科植物の発芽性に関与する遺
伝子に対する遺伝子マーカーが見出され、この遺伝子マ
ーカーを用いる、高度の発芽性を有するイネ科植物の選
抜方法が提供される。
【００４７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Hokkaido Green-Bio Institute
National Institute of Agrobiological Sciences
<120> Method of Screening Plants belonging to
Poaceae(Gramineae)
<130> PHO7
<140>
<141>
<160> 3
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> Oryza sp.
<400> 1
tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatgtgtgtg tgtgtgtgtg 60
tgtgtg 66
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Oryza sp.
<400> 2
agccaggtat gtcataaatg ataataacaa 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Oryza sp.
<400> 3
aatcagaatc tacactataa atggccgaag 30
【図１】ＲＦＬＰマーカーを用いたＲＦＬＰ分析の結果
と、低温条件下における発芽性についての関係を示した
グラフを表した図面である。
と、低温条件下における発芽性についての関係を示した
グラフを表した図面である。
【図２】はやまさりと、Italica Livorno の、本発明に
かかわる遺伝子増幅産物の塩基長を比較した電気泳動像
を示す図面である。
かかわる遺伝子増幅産物の塩基長を比較した電気泳動像
を示す図面である。
【図３】組換え自殖系統の、本発明にかかわる遺伝子増
幅産物の塩基長を比較した電気泳動像を示す図面であ
る。
幅産物の塩基長を比較した電気泳動像を示す図面であ
る。
【図４】増幅遺伝子マーカーの塩基長と、低温条件下に
おける発芽性との関係を示したグラフを表した図面であ
る。
おける発芽性との関係を示したグラフを表した図面であ
る。
【図５】複数の品種のイネについての、本発明にかかわ
る遺伝子増幅産物の塩基長を比較した電気泳動像を示す
図面である。
る遺伝子増幅産物の塩基長を比較した電気泳動像を示す
図面である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 藤野 賢治
北海道夕張郡長沼町東５線北15番地 株式
会社北海道グリーンバイオ研究所内
(72)発明者 佐藤 毅
北海道夕張郡長沼町東５線北15番地 株式
会社北海道グリーンバイオ研究所内
Ｆターム(参考） 2B030 AB03 CA06 CA14
4B024 AA08 CA01 CA04 DA01 EA04
FA10 GA11 HA14
4B063 QA18 QQ04 QQ42 QR62 QS25
QX01 QX04
Claims (10)
- 【請求項１】イネ科植物の高度の発芽性を発現する遺伝
子に連鎖する領域における遺伝子マーカーを指標とし
て、高度の発芽性を有するイネ科植物を選抜する、イネ
科植物の選抜方法。 - 【請求項２】指標となる遺伝子マーカーが存在する、イ
ネ科植物の高度の発芽性を発現する遺伝子に連鎖する領
域が、この遺伝子から、２０ｃＭ（センチモルガン）以
内の領域である、請求項１記載のイネ科植物の選抜方
法。 - 【請求項３】遺伝子マーカーが、ＲＦＬＰマーカーおよ
び／または増幅遺伝子マーカーである、請求項１または
２記載のイネ科植物の選抜方法。 - 【請求項４】イネ科植物が、イネである、請求項１〜３
のいずれかの請求項記載のイネ科植物の選抜方法。 - 【請求項５】遺伝子マーカーとして、少なくも１種類の
増幅遺伝子マーカーを用いる場合の増幅遺伝子マーカー
が、イネにおける遺伝子領域ＡＰ０００６１５内の増幅
遺伝子マーカーである、請求項４記載のイネ科植物の選
抜方法。 - 【請求項６】イネにおける遺伝子領域ＡＰ０００６１５
内の増幅遺伝子マーカーが、配列番号１で表されるＳＳ
Ｒ配列を含む増幅遺伝子マーカーである、請求項５記載
イネ科植物の選抜方法。 - 【請求項７】配列番号１で表されるＳＳＲ配列を含む遺
伝子領域の遺伝子増幅産物を得るためのセンスプライマ
ーが、配列番号２で表されるヌクレオチド鎖の塩基配列
から選ばれる、連続した１５〜３０塩基のヌクレオチド
鎖を５’末端側に含み、かつ、全体の塩基長が、１５〜
５０塩基のヌクレオチド鎖であり、同アンチセンスプラ
イマーが、配列番号３で表されるヌクレオチド鎖の塩基
配列から選ばれる、連続した１５〜３０塩基のヌクレオ
チド鎖を３’末端側に含み、かつ、全体の塩基長が、１
５〜５０塩基のヌクレオチド鎖である、請求項６記載の
イネ科植物の選抜方法。 - 【請求項８】配列番号１で表されるＳＳＲ配列を含む遺
伝子領域の遺伝子増幅産物を得るためのセンスプライマ
ーが、配列番号２で表されるヌクレオチド鎖であり、同
アンチセンスプライマーが、配列番号３で表されるヌク
レオチド鎖である、請求項６記載のイネ科植物の選抜方
法。 - 【請求項９】高度の発芽性が、寒冷に対する高度の発芽
性である、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の植物
の選抜方法。 - 【請求項１０】１種または２種以上の配列番号２で表
されるヌクレオチド鎖の塩基配列から選ばれる、連続し
た１５〜３０塩基のヌクレオチド鎖を５’末端側に含
み、かつ、全体の塩基長が、１５〜５０塩基のヌクレオ
チド鎖、および、 １種または２種以上の配列番号３で表されるヌクレオ
チド鎖の塩基配列から選ばれる、連続した１５〜３０塩
基のヌクレオチド鎖を３’末端側に含み、かつ、全体の
塩基長が、１５〜３０塩基のヌクレオチド鎖、からなる
群から選ばれる、１種または２種以上のヌクレオチド
鎖。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001382705A JP4100541B2 (ja) | 2001-12-17 | 2001-12-17 | イネの選抜方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001382705A JP4100541B2 (ja) | 2001-12-17 | 2001-12-17 | イネの選抜方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003180362A true JP2003180362A (ja) | 2003-07-02 |
| JP4100541B2 JP4100541B2 (ja) | 2008-06-11 |
Family
ID=27592964
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001382705A Expired - Fee Related JP4100541B2 (ja) | 2001-12-17 | 2001-12-17 | イネの選抜方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4100541B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7977087B2 (en) | 2004-03-31 | 2011-07-12 | Japan Science And Technology Agency | Detection instrument with the use of polynucleotides mapped on barley chromosome |
| US8212112B2 (en) | 2007-09-07 | 2012-07-03 | Hokuren Federation Of Agricultural Cooperatives | Gene participating in low temperature germinability in rice and utilization of the same |
| CN109652577A (zh) * | 2016-02-04 | 2019-04-19 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 与水稻高杆qtl紧密连锁的ssr分子标记l08与应用 |
-
2001
- 2001-12-17 JP JP2001382705A patent/JP4100541B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| US7977087B2 (en) | 2004-03-31 | 2011-07-12 | Japan Science And Technology Agency | Detection instrument with the use of polynucleotides mapped on barley chromosome |
| US8212112B2 (en) | 2007-09-07 | 2012-07-03 | Hokuren Federation Of Agricultural Cooperatives | Gene participating in low temperature germinability in rice and utilization of the same |
| CN109652577A (zh) * | 2016-02-04 | 2019-04-19 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 与水稻高杆qtl紧密连锁的ssr分子标记l08与应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4100541B2 (ja) | 2008-06-11 |
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