JP2003169687A - 骨代謝異常疾患マーカー及びその利用 - Google Patents

骨代謝異常疾患マーカー及びその利用

Info

Publication number
JP2003169687A
JP2003169687A JP2002136030A JP2002136030A JP2003169687A JP 2003169687 A JP2003169687 A JP 2003169687A JP 2002136030 A JP2002136030 A JP 2002136030A JP 2002136030 A JP2002136030 A JP 2002136030A JP 2003169687 A JP2003169687 A JP 2003169687A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
cell
nfatc1
bone metabolism
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2002136030A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4120778B2 (ja
Inventor
Tatsuo Takeya
達夫 竹家
Koji Hayashi
浩司 林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd filed Critical Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority to JP2002136030A priority Critical patent/JP4120778B2/ja
Priority to PCT/JP2002/009882 priority patent/WO2003027284A1/ja
Publication of JP2003169687A publication Critical patent/JP2003169687A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4120778B2 publication Critical patent/JP4120778B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨
代謝異常疾患を反映する疾患マーカー、該疾患マーカー
を利用した骨代謝異常疾患の検出方法、該疾患の改善に
有用な薬物のスクリーニング方法を提供する。 【解決手段】 NF-ATc isoform a遺伝子またはChloride
intracellular channel4遺伝子の塩基配列において、
連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及
び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドを、破骨細
胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の疾
患マーカーとして利用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は破骨細胞の分化や活
性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の診断に有
用な疾患マーカーに関する。より詳細には、本発明は破
骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異
常疾患、例えば関節炎や骨粗鬆症等の疾患の遺伝子診断
において、プライマーまたは検出プローブとして有効に
利用できる疾患マーカーに関する。また本発明は、かか
る疾患マーカーを利用した破骨細胞の分化・活性化の亢
進に関連する骨代謝異常疾患の検出方法（診断方法）に
関する。
【０００２】さらに本発明は、上記疾患マーカーを利用
して、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる
骨代謝異常疾患の改善薬または治療薬として有効な物質
をスクリーニングする方法、並びに該方法で調製される
上記物質を有効成分とする骨代謝異常疾患の改善剤また
は治療剤に関する。
【０００３】
【従来の技術】骨は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞
による骨吸収とが絶えず繰り返されている動的組織であ
る。骨芽細胞と破骨細胞の機能バランスに異常が生じる
と、この動的平衡状態が破綻し様々な骨代謝異常疾患が
引き起こされることが知られている。またステロイド治
療等による治療の副作用によっても骨代謝異常が生じる
場合がある。また骨代謝異常疾患はその進行に従って身
体活動能力の低下が生じ、ひいては腰痛・関節痛等の痛
みを伴うため、日常生活動作に支障をきたすことも多
い。
【０００４】近年、骨密度の測定手法（DXA法；Dual en
ergy X-ray absorptiometry法）が改良されたことから
骨密度の健診が安価で容易に受けられるようになり、こ
れによって骨代謝異常の診断の機会も増している。
【０００５】一方で、最近の医療現場では、骨代謝異常
疾患に限らず、個々の患者の症状に合わせて治療法を的
確に選択することが望まれるようになってきている。高
齢化社会でのQOL（Quality of life）向上の必要性が認
識されてきた近年では、特に、万人に共通した治療では
なく、個々の患者の症状に合わせて適切な治療が施され
ることが強く求められている。このような所謂テイラー
メイド治療を行うためには、個々の疾患について患者の
症状やその原因（遺伝的背景）を的確に反映する疾患マ
ーカーが有用であり、その探索並びに開発を目指した研
究が精力的に行われているのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、骨代謝異常
疾患の診断及び治療に有用な疾患マーカーを提供するこ
とを目的とする。より詳細には、本発明は破骨細胞の分
化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患を特
異的に反映した疾患マーカーを提供することを目的とす
る。さらに本発明は該疾患マーカーを利用した骨代謝異
常疾患の検出方法（遺伝子診断方法）、該疾患の改善ま
たは治療に有用な薬物をスクリーニングする方法、並び
に該疾患の改善または治療に有用な薬物を提供すること
を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行っていたところ、従来、
Ｔ細胞におけるサイトカイン遺伝子の発現誘導で機能す
ることが知られているNF-ATc isoform a 遺伝子（以
下、本明細書において「NFATC1遺伝子」ともいう。）
（GenBank Accession No. U08015, Nature 369, 497-50
2 (1994)）、並びに塩化物イオンチャンネルとして知ら
れているChloride intracellular channel 4遺伝子（以
下、本明細書において「CICC4遺伝子」ともいう。）（G
enBank Accession No. AL117424, Genome Res.11(3), 4
22-435 (2001)）が、骨代謝異常疾患患者の骨組織に特
異的に検出され、しかもそれらの遺伝子は破骨細胞の分
化・活性化の亢進に応じて有意な発現増大挙動を示すこ
とを見出した。さらに、これらの遺伝子は正常骨組織で
は発現がみられないか、みられてもごくわずかである。
このようにこれらの遺伝子は破骨細胞の分化・活性化の
亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患患者に特異的に見
出されることから、本発明者らは当該骨代謝異常疾患の
疾患マーカーとなり得るとの確信を得た。本発明はかか
る知見に基づいて開発されたものである。
【０００８】すなわち、本発明は、下記に掲げるもので
ある： 項１． 配列番号1若しくは３に記載のNFATC1遺伝子の
塩基配列または配列番号２若しくは４に記載のCICC4遺
伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を
有するポリヌクレオチド及び／または該ポリヌクレオチ
ドに相補的なポリヌクレオチドからなる、破骨細胞の分
化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の疾患マー
カー。 項２． 破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代
謝異常疾患の検出においてプローブまたはプライマーと
して使用される項１記載の疾患マーカー。 項３． 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、
破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾
患の検出方法： （ａ）被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれ
から転写された当該RNAに相補的なポリヌクレオチドと
請求項１または２に記載の疾患マーカーとを結合させる
工程、（ｂ）該疾患マーカーに特異的に結合した生体試
料由来のRNAまたは該RNAから転写された相補的なポリヌ
クレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する
工程、（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、破骨細胞の
分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の罹患を
判断する工程。 項４． 配列番号５に記載のNFATC1のアミノ酸配列より
なるタンパク質、または配列番号６に記載のCICC4のア
ミノ酸配列よりなるタンパク質を認識する抗体を有す
る、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異
常疾患の疾患マーカー。 項５． 破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代
謝異常疾患の検出においてプローブとして使用される項
４記載の疾患マーカー。 項６． 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、
破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾
患の検出方法： （ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と項
４または５に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパ
ク質を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、破骨細胞の分化・
活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の罹患を判断す
る工程。 項７． 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、
NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を制御する物質
のスクリーニング方法： (ａ) 被験物質とNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子を発現
可能な細胞とを接触させる工程、(ｂ) 被験物質を接触
させた細胞のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現量
を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞
の上記に対応する遺伝子の発現量と比較する工程、(ｃ)
（ｂ）の比較結果に基づいて、NFATC1遺伝子またはCIC
C4遺伝子の発現量を変動させる被験物質を選択する工
程。 項８． 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、
NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を制御する物質
のスクリーニング方法： (ａ) 被験物質とNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子を発現
可能な細胞とを接触させる工程、(ｂ) 被験物質を接触
させた細胞のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現量
を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞
の上記に対応する遺伝子の発現量と比較する工程、(ｃ)
（ｂ）の比較結果に基づいて、NFATC1遺伝子またはCICC
4遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工
程。 項９． 破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代
謝異常疾患の改善または治療剤の有効成分を探索するた
めの方法である、項８に記載のスクリーニング方法。 項１０． 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含
む、NFATC1またはCICC4の機能または活性を抑制する物
質のスクリーニング方法： (ａ) 被験物質と、NFATC1またはCICC4を含む細胞または
該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、(ｂ)
被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のNFATC
1またはCICC4由来の機能（活性）を測定し、該機能また
は活性を被験物質を接触させない対照細胞またはその細
胞画分の上記NFATC1またはCICC4の機能または活性と比
較する工程、(ｃ)（ｂ）の比較結果に基づいて、上記細
胞またはその細胞画分のNFATC1またはCICC4の機能（活
性）を抑制する被験物質を選択する工程。 項１１．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、
NFATC1の機能または活性を抑制する物質のスクリーニン
グ方法： (ａ) 被験物質と、NFATC1を含みかつInterleukin-2 遺
伝子を発現可能な細胞または該細胞から調製した細胞画
分とを接触させる工程、(ｂ) 被験物質を接触させた細
胞またはその細胞画分のInterleukin-2 遺伝子の発現量
を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞
またはその細胞画分のInterleukin-2 遺伝子の発現量と
比較する工程、(ｃ) (ｂ)の比較結果に基づいて、上記
細胞またはその細胞画分のInterleukin-2遺伝子の発現
量を抑制する被験物質を選択する工程。 項１２． 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含
む、CICC4の機能または活性を抑制する物質のスクリー
ニング方法： (ａ) 被験物質と、CICC4を含む細胞または該細胞から調
製した細胞画分とを接触させる工程、(ｂ) 被験物質を
接触させた細胞またはその細胞画分の塩化物イオンの膜
透過活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない対
照細胞またはその細胞画分の塩化物イオンの膜透過活性
と比較する工程、(ｃ)（ｂ）の比較結果に基づいて、上
記細胞またはその細胞画分の塩化物イオンの膜透過活性
を抑制する被験物質を選択する工程。 項１３． 破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨
代謝異常疾患の改善または治療剤の有効成分を探索する
ための方法である、項１０乃至１２のいずれかに記載の
スクリーニング方法。 項１４． NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を抑
制する物質を有効成分とする破骨細胞の分化・活性化の
亢進に関連した骨代謝異常疾患の改善または治療剤。 項１５． NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を抑
制する物質が項７乃至９のいずれかに記載のスクリーニ
ング法により得られるものである、項１４記載の骨代謝
異常疾患の改善または治療剤。 項１６． NFATC1またはCICC4の機能または活性を抑制
する物質を有効成分とする、破骨細胞の分化・活性化の
亢進に関連した骨代謝異常疾患の改善または治療剤。 項１７． NFATC1またはCICC4の機能・活性抑制物質
が、項１０乃至１３のいずれかに記載のスクリーニング
法により得られるものである、項１６記載の骨代謝異常
疾患の改善または治療剤。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本明細書において、アミノ
酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略
号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IU
B Communication on Biological Nomenclature, Eur.
J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ
酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」
（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号
に従う。
【００１０】本明細書において「遺伝子」または「DN
A」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセ
ンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを
包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に
制限されるものではない。従って、本明細書において遺
伝子(DNA)とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮ
Ａを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮ
Ａ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖
ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含
まれる。また当該「遺伝子」または「DNA」には、特定
の塩基配列（配列番号：1〜4）で示される「遺伝子」ま
たは「DNA」だけでなく、これらによりコードされるタ
ンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例え
ば、同族体(ホモログ)、変異体及び誘導体など）をコー
ドする「遺伝子」または「DNA」が包含される。かかる
同族体、変異体または誘導体をコードする「遺伝子」ま
たは「DNA」としては、具体的には、後述の(1-1)項に記
載のストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：1
〜4で示される特定塩基配列の相補配列とハイブリダイ
ズする塩基配列からなる「遺伝子」または「DNA」を挙
げることができる。
【００１１】例えばヒト由来のタンパク質の同族体をコ
ードする遺伝子（ホモログ）としては、当該タンパク質
をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど
他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（ホモロ
グ）は、HomoloGene（http:// www. ncbi. nlm. nih. G
ov / HomoloGene/）により同定することができる。具体
的には、例えば、特定のヒト遺伝子の塩基配列をBLAST
（Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90:5873-5877, 1993、ht
tp: // www. ncbi. nlm. nih.gov/BLAST/）にかけて一
致する（Scoreが最も高く、E-valueが0でかつIdentity
が100%を示す）配列のアクセッション番号を取得する。
そのアクセッション番号をUniGene（http://www.ncbi.n
lm.nih.gov/UniGene/）に入力して得られたUniGene Clu
ster ID（Hs.で示す番号）をHomoloGeneに入力する。結
果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝
子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列
で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）と
してマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜するこ
とができる。
【００１２】なお、遺伝子またはDNAは、機能領域の別
を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領
域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
【００１３】本明細書において「ポリヌクレオチド」と
は、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用
いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記
ＲＮＡには、total RNA、mRNA、rRNA、及び合成のRNAの
いずれもが含まれる。
【００１４】本明細書において「タンパク質」または
「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列で示さ
れる「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけで
なく、これらと生物学的機能が同等であることを限度と
して、その断片、同族体（ホモログ）、誘導体、および
変異体が包含される。ここで同族体（ホモログ）として
は、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他
生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene
（http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/HomoloGene/）に
より同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定する
ことができる。また変異体には、天然に存在するアレル
変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、
置換、付加および挿入されることによって改変されたア
ミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変
異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペ
プチドと、アミノ酸配列が少なくとも70％、好ましくは
80％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは97％
相同なものを挙げることができる。
【００１５】本明細書でいう「抗体」には、ポリクロー
ナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗
体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによ
って生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を
有する上記抗体の一部が包含される。
【００１６】さらに本明細書において「疾患マーカー」
とは、骨代謝異常疾患、特に破骨細胞の分化・活性化の
亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の罹患の有無若し
くは罹患の程度を診断するために、また破骨細胞の分化
・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の改善
または治療に有用な候補物質をスクリーニングするため
に、直接または間接的に利用されるものであり、これに
は、例えば破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生
体内での発現が変動する遺伝子またはタンパク質を特異
的に認識し、また結合することのできるヌクレオチド
（オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドが含まれ
る）または抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリ
ゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、
生体内で発現した上記遺伝子及びタンパク質を検出する
ためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは
生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマ
ーとして有効に利用することができる。
【００１７】本発明は、前述するように、NFATC1遺伝子
またはCICC4遺伝子が、骨代謝異常疾患患者の骨組織、
特に破骨細胞の分化や活性化に関わる組織で、その破骨
細胞の分化や活性化の亢進に関連して特異的に発現して
いることを見出したことに基づくものである。従って、
これらの遺伝子及びその発現産物〔タンパク質、ペプチ
ド（オリゴペプチド及びポリペプチドが含まれる）〕
は、骨代謝異常疾患、特に破骨細胞の分化や活性化の亢
進に関連して生じる骨代謝異常疾患の解明、診断、予防
及び治療に有効に利用することができ、かかる利用によ
って医学並びに臨床学上、有用な情報や手段を得ること
ができる。また、これらの遺伝子及びその発現産物並び
にそれらからの派生物（例えば、抗体など）は、上記骨
代謝異常疾患の治療、並びに該治療に有効に用いられる
薬剤の開発に好適に利用することができる。さらに、個
体または骨組織における、上記遺伝子の発現またはその
発現産物の検出、または該遺伝子の変異またはその発現
不全の検出は、骨代謝異常疾患の解明や診断に有効に利
用することができる。
【００１８】以下、これらのNFATC1遺伝子またはCICC4
遺伝子、並びにこれらの発現産物（NFATC1またはCICC4
など）やそれらの派生物について、具体的な用途を説明
する。
【００１９】（１）骨代謝異常疾患の疾患マーカー及び
その応用 (1-1) ポリヌクレオチド 本発明の配列番号１および３に示すポリヌクレオチド
は、それぞれヒト由来のNFATC1遺伝子およびマウス由来
のNFATC1遺伝子としていずれも公知の遺伝子であり、そ
れら取得方法についても、Nature 369, pp.497-502 (19
94)、またはBiochem. Biophys. Res. Commun. 240, pp.
314-323 (1997)に記載されるように公知である。
【００２０】また、本発明の配列番号２および４に示す
ポリヌクレオチドは、それぞれヒト由来のCICC4遺伝子
およびマウス由来のCICC4遺伝子として公知の遺伝子で
あり、その取得方法についてもGenome Res.11(3), pp.4
22-435 (2001)またはAm. J. Physiol. 276, F398-F408
(1999)、並びにJ. Biol. Chem. 274, pp.36488-36497
(1999)に記載されるように公知である。
【００２１】本発明は、前述するように、破骨細胞の分
化や活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患に罹
患した患者の骨組織に、上記のNFATC1遺伝子またはCICC
4遺伝子が特異的に発現しているという知見を発端に、
これらの遺伝子発現の有無や発現の程度を検出すること
によって上記骨代謝異常疾患の罹患の有無や罹患の程度
が特異的に検出でき、該疾患の診断を正確に行うことが
できるという発想に基づくものである。
【００２２】上記ポリヌクレオチドは、被験者が破骨細
胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患に罹
患しているか否かまたはその罹患の程度を診断するため
のツール（疾患マーカー）として有用である。具体的に
は、当該ポリヌクレオチド（疾患マーカー）は、被験者
の骨組織におけるNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発
現の有無またはその程度（発現量）の検出に使用され
る。
【００２３】また上記ポリヌクレチドは、後述の(3-1)
項に記載するような破骨細胞の分化・活性化の亢進に関
連した骨代謝異常疾患の改善または治療に有用な候補物
質のスクリーニングにおいて、NFATC1遺伝子またはCICC
4遺伝子の発現変動を検出するためのスクリーニングツ
ール（疾患マーカー）としても有用である。
【００２４】本発明の疾患マーカーは、配列番号１若し
くは３に記載のNFATC1遺伝子の塩基配列または配列番号
２若しくは４に記載のCICC4遺伝子の塩基配列におい
て、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチ
ド及び／または該ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的
な塩基配列をもつポリヌクレオチドからなることを特徴
とするものである。
【００２５】ここで相補的なポリヌクレオチド（相補
鎖、逆鎖）とは、配列番号１、２、３または４に示され
る塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、また
は該塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の
塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これ
らを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといっ
た塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にある
ポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かか
る相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配
列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリン
ジェントな条件でハイブリダイスすることができる程度
の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここで
ストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987,
Guide toMolecular Cloning Techniques Methods in E
nzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)
に教示されるように、複合体或いはプローブを結合す
る核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができ
る。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常
「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることが
できる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正
鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好
ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイ
ズ条件（ハイブリダイズ後の洗浄条件）として「0.5×S
SC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイ
ズ条件（ハイブリダイズ後の洗浄条件）として「0.1×S
SC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることがで
きる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正
鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列から
なる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％
の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することが
できる。
【００２６】また、正鎖側のポリヌクレオチドには、配
列番号１、２、３または４に記載の塩基配列またはその
部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配
列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる
鎖を含めることができる。
【００２７】さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及びそ
の相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の
形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の
形態で疾患マーカーとして使用されてもよい。
【００２８】本発明の骨代謝異常疾患の疾患マーカー
は、具体的にはNFATC1遺伝子の塩基配列に関する配列番
号１若しくは３、またはCICC4遺伝子の塩基配列に関す
る配列番号２若しくは４に記載される塩基配列（全長配
列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その
相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。ま
た、配列番号１若しくは３で示されるNFATC1遺伝子もし
くは該遺伝子に由来するポリヌクレオチド（例えば、cD
NA等のDNAやRNA等が例示される。）、または配列番号２
若しくは４で示されるCICC4遺伝子もしくは該遺伝子に
由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識
するものであれば、上記全長配列の部分配列またはその
相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。こ
のような部分配列としては、上記全長配列またはその相
補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも15個
の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げるこ
とができる。
【００２９】なお、ここで「選択的に（特異的に）認識
する」とは、例えばノーザンブロット法においては、NF
ATC1遺伝子、CICC4遺伝子またはこれらに由来するポリ
ヌクレオチドが特異的に検出できること、またRT-PCR法
においてはNFATC1遺伝子、CICC4遺伝子またはこれらに
由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを
意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記
検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するもので
あると判断できるものであればよい。
【００３０】そのような本発明の疾患マーカーは、配列
番号１若しくは３で示されるNFATC1遺伝子、または配列
番号２若しくは４で示されるCICC4遺伝子の塩基配列を
もとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK HYPERLINK "htt
p://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.c
gi" http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/pr
imer3.cgi、http: // www. genome.wi.mit.edu/cgi-bin
/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax
社製）を利用して設計することができる。
【００３１】具体的にはNFATC1遺伝子の塩基配列または
CICC4遺伝子の塩基配列をprimer 3またはベクターNTIの
ソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプロ
ーブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含
む配列をプライマーまたはプローブとして使用すること
ができる。
【００３２】本発明で用いる疾患マーカーは、上述する
ように連続する少なくとも15塩基の長さを有するもので
あればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長
さを適宜選択し設定することができる。
【００３３】本発明において骨代謝異常疾患の検出（診
断）は、被験者の生体組織、特に破骨細胞の分化に関わ
る骨組織におけるNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の少
なくとも１方の発現の有無または発現レベル（発現量）
を評価することによって行われる。この場合、上記本発
明の疾患マーカーは、上記遺伝子の発現によって生じた
ＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチド、例えば
該ＲＮＡをもとにしたRT-PCR法において生成されるＤＮ
Ａ等の各種のポリペプチドを特異的に認識し増幅するた
めのプライマーとして、または該ＲＮＡまたはそれに由
来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプロ
ーブとして利用することができる。
【００３４】上記疾患マーカーを骨代謝異常疾患の検出
（遺伝子診断）においてプライマーとして用いる場合に
は、通常15bp〜100bp、好ましくは15bp〜50bp、より好
ましくは15bp〜35bpの塩基長を有するものが例示でき
る。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp
〜全配列の塩基数、好ましくは15bp〜1kb、より好まし
くは100bp〜1kbの塩基長を有するものが例示できる。
【００３５】本発明の疾患マーカーは、ノーザンブロッ
ト法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法な
どといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法
において、常法に従ってプライマーまたはプローブとし
て利用することができ、これによって破骨細胞の分化・
活性化の亢進に関わる骨代謝異常疾患に関連するNFATC1
遺伝子またはCICC4遺伝子の発現の有無または発現レベ
ル（発現量）を評価することができる。なお、測定対象
試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験
者の骨組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常
法に従って調製されるtotal RNAを用いてもよいし、さ
らに該RNAをもとにして調製される各種のポリヌクレオ
チドを用いてもよい。
【００３６】また、生体組織におけるNFATC1遺伝子また
はCICC4遺伝子の遺伝子発現レベルは、DNAチップを利用
して検出あるいは定量することができる。この場合、本
発明の疾患マーカーは当該DNAチップのプローブとして
使用することができる（例えば、Affymetrix社の Gene
Chip Human Genome U95 A,B,C,D,Eの場合、25bpの長さ
のポリヌクレオチドプローブとして用いられる）。かか
るDNAチップを、生体組織から採取したRNAをもとに調製
される標識DNAまたは標識RNAとハイブリダイズさせて、
ハイブリダイズによって形成された上記プローブ（疾患
マーカー）と標識DNAまたは標識RNAとの複合体を該標識
DNAまたは標識RNAの標識を指標として検出することによ
り、生体組織中でのNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の
発現の有無または発現レベル（発現量）が評価できる。
【００３７】本発明の疾患マーカーは、骨代謝異常疾患
の診断、特に破骨細胞の分化・活性化が亢進することに
よって生じた骨代謝異常疾患の検出（罹患の有無や罹患
の程度の診断）に有用である。具体的には、該疾患マー
カーを利用した骨代謝異常疾患の診断は、被験者の骨組
織と正常者の骨組織におけるNFATC1遺伝子またはCICC4
遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによっ
て行うことができる。この場合、遺伝子発現レベルの違
いには、発現のある／なしの違いだけでなく、被験者の
骨組織と正常者の骨組織の両者ともに発現がある場合で
も、両者間の発現量の格差が2倍以上、好ましくは3倍以
上の場合が含まれる。具体的にはNFATC1遺伝子またはCI
CC 4遺伝子は破骨細胞の分化・活性化の亢進が関連した
骨代謝異常疾患で発現誘導を示すので、被験者の骨組織
で発現されており、該発現量が正常者の骨組織の発現量
と比べて2倍以上、好ましくは3倍以上多ければ、当該被
験者について破骨細胞の分化・活性化の亢進が関連した
骨代謝異常疾患の罹患が疑われる。
【００３８】（1-2）抗体 また本発明は、破骨細胞の分化・活性化の亢進が関連す
る骨代謝異常疾患の疾患マーカーとしてNFATC1遺伝子の
発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては
「NFATC1」ともいう）またはCICC4遺伝子の発現産物
（タンパク質）（これを本明細書においては「CICC4」
ともいう）を特異的に認識することのできる抗体を提供
する。
【００３９】本発明は、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝
子が、骨代謝異常疾患患者の骨組織に特異的に検出さ
れ、しかもそれらの遺伝子が破骨細胞の分化・活性化の
亢進に応じて有意な発現増大挙動を示しているという知
見を発端に、これらの遺伝子の発現産物（RNAまたはタ
ンパク質）の発現の有無や発現の程度（RNAまたはタン
パク質の生成量）を検出することによって上記骨代謝異
常疾患の罹患の有無や罹患の程度が特異的に検出でき、
該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基
づくものである。
【００４０】上記抗体は、被験者が破骨細胞の分化・活
性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患に罹患しているか
否かまたはその罹患の程度を診断するためのツール（疾
患マーカー）として有用である。具体的には、当該抗体
（疾患マーカー）は、被験者の骨組織におけるNFATC1ま
たはCICC4の発現の有無またはその程度（発現量）の検
出に使用される。
【００４１】NFATC1としては配列番号１若しくは３に示
されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク
質、CICC 4としては配列番号２若しくは４に示されるポ
リヌクレオチドによってコードされるタンパク質を挙げ
ることができる。なお、配列番号１に示されるポリヌク
レオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様
としては配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質を、また配列番号２に示されるポリヌクレオチ
ドによってコードされるタンパク質の具体的態様として
は配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク
質を例示することができる。
【００４２】なお、ここで配列番号５に示すタンパク質
は、ヒト由来のNFATC1遺伝子によってコードされる公知
のヒトタンパク質であり、その取得方法についてもNatu
re 369, pp.497-502 (1994)に記載されるように公知で
ある。また配列番号６に示すタンパク質はヒト由来のCI
CC4遺伝子によってコードされる公知のヒトタンパク質
であり、その取得方法についてもGenome Res.11(3), p
p.422-435 (2001)またはAm. J. Physiol. 276, F398-F4
08 (1999) に記載されるように公知である。
【００４３】本発明の抗体は、その形態に特に制限はな
く、NFATC1またはCICC4を免疫抗原とするポリクローナ
ル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であっ
てもよく、さらには当該NFATC1またはCICC4のアミノ酸
配列において少なくとも連続する８アミノ酸からなるポ
リペプチドに対して結合性を有する抗体も、本発明の抗
体に含まれる。
【００４４】これらの抗体の製造方法は、すでに周知で
あり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造するこ
とができる（Current protocols in Molecular Biology
edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley a
nd Sons. Section 11.12〜11.13）。具体的には、本発
明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従っ
て大腸菌等で発現し精製したNFATC1またはCICC4を用い
て、あるいは常法に従って当該NFATC1またはCICC4の部
分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、こ
れらを免疫抗原として用いて、家兎等の非ヒト動物に免
疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可
能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法
に従って大腸菌等で発現し精製したNFATC1またはCICC
4、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有
するオリゴペプチドを免疫抗原として、マウス等の非ヒ
ト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細
胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得る
ことができる（Current protocols in Molecular Biolo
gy edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley
and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００４５】また、抗体の作製において免疫抗原として
使用されるタンパク質は、本発明により提供される遺伝
子の配列情報（配列番号１、２、３または４）に基づい
て、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へ
のトランスフェクション、形質転換体の培養および培養
物からのタンパク質の回収の操作により得ることができ
る。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文
献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et a
l., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM.Glover,
IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
具体的にはNFATC1またはCICC4をコードする遺伝子が所
望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクタ
ー）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、
該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タ
ンパク質を回収することによって実施することができ
る。また、これらNFATC1またはCICC4は、本発明により
提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号５、６）に従
って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製
造することもできる。
【００４６】なお、ここで免疫抗原として用いられるNF
ATC1またはCICC4には、配列番号５または配列番号６に
示すタンパク質のみならず、その相同物も包含される。
該相同物としては、上記配列番号５または配列番号６で
示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミ
ノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からな
り、且つ配列番号５または配列番号６で示されるタンパ
ク質と同等の免疫学的活性を有するタンパク質を挙げる
ことができる（当該同様の免疫学的活性を有する限り、
生物学的機能の同等性は特に問わない。）。
【００４７】なお、ここで配列番号５または配列番号６
で示されるタンパク質と免疫学的活性において同等の活
性を有するタンパク質としては、適当な動物あるいはそ
の細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつNFATC1ま
たはCICC4に対する抗体と特異的に結合する能力を有す
るタンパク質を挙げることができる。
【００４８】なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異
数や変異部位は、その免疫学的活性が保持される限り制
限はない。免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残
基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されれ
ばよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュー
タプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出
すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミ
ノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％
以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内で
ある。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタ
ンパク質がNFATC1またはCICC4の免疫学的活性を保持し
ている限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保
持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親
水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質
を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Al
a、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極
性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Th
r、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に
分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性ア
ミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及び
Hisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸であ
る。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸
を適宜選択することができる。
【００４９】また本発明の抗体は、NFATC1またはCICC4
の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドまたはポリ
ペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる
抗体誘導のために用いられオリゴ（ポリ）ペプチドは、
機能的な生物活性を有することは要しないが、NFATC1ま
たはCICC4と同様な免疫原特性を有するものであること
が望ましい。好ましくはかかる特性を有し、NFATC1また
はCICC4のアミノ酸配列において少なくとも連続する８
アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示するこ
とができる。
【００５０】かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗
体の生成は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて
免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。
限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロ
イントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネ
ラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオ
ル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリン
ペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表
面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリ
ネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントなど
がある。
【００５１】なお、NFATC1に特異的に結合する抗体は既
に市販されており（抗NF-ATc1抗体7A6：Santa Cruz社製
など）、これらを本発明の抗体として用いることも可能
である。
【００５２】本発明の抗体はNFATC1またはCICC4に特異
的に結合する性質を有することから、該抗体を利用する
ことによって、被験者の組織内に発現した上記タンパク
質（NFATC1またはCICC4）を特異的に検出することがで
きる。すなわち、当該抗体は被験者の組織内におけるNF
ATC1またはCICC4のタンパク発現の有無を検出するため
のプローブとして有用である。
【００５３】具体的には、患者の骨組織の一部をバイオ
プシ等で採取し、そこから常法に従ってタンパク質を抽
出・精製して、例えばウェスタンブロット法、ELISA法
など公知の検出方法において、上記抗体を常法に従って
プローブとして使用することによってNFATC1またはCICC
4の有無やその量を検出することができる。
【００５４】破骨細胞の分化・活性化の亢進が関連した
骨代謝異常疾患の診断に際しては、被験者の骨組織にお
ける少なくともNFATC1またはCICC4の一方と正常な骨組
織における対応するこれらのタンパク質との量の違いを
判定すればよい。この場合、タンパク量の違いには、タ
ンパクのある／なし、あるいはタンパク量の違いが2倍
以上、好ましくは3倍以上の場合が含まれる。具体的に
は、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子は破骨細胞の分化
・活性化の亢進が関連した骨代謝異常疾患で発現誘導を
示すので、被験者の骨組織で該遺伝子の発現産物（NFAT
C1及び／またはCICC4）が存在しており、該タンパク質
量が正常な骨組織における対応する発現産物量（タンパ
ク質量）と比べて2倍以上、好ましくは3倍以上多いこと
が判定されれば、当該被験者について破骨細胞の分化・
活性化の亢進が関連した骨代謝異常疾患の罹患が疑われ
る。
【００５５】（２）骨代謝異常疾患の検出方法（診断方
法） 本発明は、前述する本発明の骨代謝異常疾患の疾患マー
カーを利用した骨代謝異常疾患の診断、特に破骨細胞の
分化・活性化の亢進に関与した骨代謝異常疾患の診断方
法を提供する。
【００５６】具体的には、本発明の診断方法は、被験者
の骨組織の一部をバイオプシなどで採取し、そこに含ま
れる骨代謝異常疾患に関連するNFATC1遺伝子またはCICC
4遺伝子の遺伝子発現レベル、またはこれらの遺伝子に
由来するタンパク質（NFATC1、CICC4）を検出し、その
発現量（ＲＮＡ量）またはそのタンパク質量を測定する
ことにより、当該被験者について骨代謝異常疾患の罹患
の有無またはその程度を診断するものである。
【００５７】本発明の診断方法は次の(a)、(b)及び(c)
の工程を含む： (a) 被験者の生体試料と本発明の疾患マーカーを接触さ
せる工程、(b) 生体試料中のNFATC1遺伝子またはCICC4
遺伝子の遺伝子発現レベル、またはNFATC1またはCICC4
のタンパク質の量を、上記疾患マーカーと指標として測
定する工程、(c) (b)の結果をもとに、被験者について
破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾
患の罹患を判断する工程。
【００５８】ここで用いられる生体試料としては、被験
者の骨組織から調製される試料を挙げることができる。
具体的には、該組織から調製されるRNA含有試料、若し
くはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む
試料、または上記組織から調製されるタンパク質を含む
試料を挙げることができる。かかるRNA、ポリヌクレオ
チドまたはタンパク質を含む試料は、被験者の骨組織の
一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調
製することができる。
【００５９】本発明の診断方法は、測定対象として用い
る生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにし
て実施される。
【００６０】(2-1) 測定対象物としてRNAを利用する場
合 測定対象物としてRNAを利用する場合、骨代謝異常疾患
の検出は、具体的に下記の工程（a）、（b）及び（c）
を含む方法によって実施することができる： （a）被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれか
ら転写された前記RNAに相補的なポリヌクレオチドと上
記本発明の疾患マーカー（NFATC1遺伝子またはCICC4遺
伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有
するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに
相補的なポリヌクレオチド）とを結合させる工程、
（b）該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来
のRNAまたは該RNAから転写された相補的なポリヌクレオ
チドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（c）（b）の測定結果に基づいて、破骨細胞の分化・活
性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の罹患を判断する
工程。
【００６１】測定対象物としてRNAを利用する場合、本
発明の骨代謝異常疾患の検出方法（診断方法）は該RNA
中のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現レベル（例
えば、これらの遺伝子に対応するRNA量）を検出し、測
定することによって実施することができる。具体的に
は、前述のポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マー
カー（NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の塩基配列にお
いて連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチ
ド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド）をプライマーまたはプローブとして用いて、ノ
ーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析
法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知
の方法を行うことにより実施できる。
【００６２】ノーザンブロット法を利用する場合は、本
発明の上記疾患マーカーをプローブとして用いることに
よって、RNA中のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現
（これらの遺伝子に対応するRNA）の有無やその発現レ
ベル（RNA量）を検出、測定することができる。具体的
には、本発明の疾患マーカー（相補鎖）を放射性同位元
素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それ
を、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファ
ーした被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさ
せた後、形成された疾患マーカー（DNA）とRNAとの二重
鎖を、疾患マーカーの標識物（RI若しくは蛍光物質）に
由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フ
ィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を
例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelli
ng and Detection System (Amersham PharamciaBiotech
社製)を用いて、このプロトコールに従って疾患マーカ
ー（プローブDNA）を標識し、被験者の生体組織由来のR
NAとハイブリダイズさせた後、疾患マーカーの標識物に
由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860
（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する
方法を使用することもできる。
【００６３】RT-PCR法を利用する場合は、本発明の上記
疾患マーカーをプライマーとして用いることによって、
RNA中のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現（これら
の遺伝子に対応するRNA）の有無や発現レベルを検出、
測定することができる。具体的には、被験者の生体組織
由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳
型として標的のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子に対応
する領域が増幅できるように、本発明の疾患マーカーか
ら調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に
結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリ
ダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた
増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができ
る。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣ
Ｒを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用
いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検
出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナ
イロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した
疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリ
ダイズさせて検出する方法などを用いることができる。
なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント21
00バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社
製）などで測定することができる。また、SYBR Green R
T-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロト
コールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7700
Sequence Detection System (Applied Biosystems 社
製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００６４】また、ＤＮＡチップ解析を利用する場合
は、本発明の上記疾患マーカーをＤＮＡプローブ（１本
鎖または２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意
し、これに被験者の生体組織由来のRNAから常法によっ
て調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成された
DNAとcRNAとの二本鎖を、本発明の疾患マーカーから調
製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げ
ることができる。また、上記DNAチップとして、NFATC1
遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、
測定が可能なＤＮＡチップを用いることもできる。かか
る遺伝子の発現レベルを検出、測定することができるＤ
ＮＡチップとしては、Affymetrix社のGene Chip Human
Genome U95 A, B,C, D, Eを挙げることができる。かか
るＤＮＡチップを用いた、被験者RNA中のNFATC1遺伝子
またはCICC4遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定に
ついては、実施例において詳細に説明する。
【００６５】(2-2) 測定対象物としてタンパク質を用い
る場合 測定対象物としてタンパク質を用いる場合、本発明の骨
代謝異常疾患の検出方法（診断方法）は生体試料中のNF
ATC1またはCICC4を検出し、その量を測定することによ
って実施される。具体的に下記の工程（a）、（b）及び
（c）を含む方法によって実施することができる： （a）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と抗
体に関する本発明の疾患マーカー（例えば、配列番号５
または６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を
認識する抗体）とを結合させる工程、（b）該疾患マー
カーに結合した生体試料由来のタンパク質を、上記疾患
マーカーを指標として測定する工程、（c）（b）の測定
結果に基づいて、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連
した骨代謝異常疾患の罹患を判断する工程。
【００６６】より具体的には、抗体に関する本発明の疾
患マーカー（例えば、配列番号５または６で示されるア
ミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体）を用い
てウエスタンブロット法などの公知方法で、NFATC1また
はCICC4を検出、定量する方法を挙げることができる。
ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明の上記
疾患マーカーを用いた後、二次抗体として125Ｉなどの
放射性同位元素、蛍光物質などで標識した標識抗体（一
次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の
放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放
射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）、蛍
光検出器などで検出し、測定することによって実施でき
る。また、一次抗体として本発明の上記疾患マーカーを
用いた後、ECL Plus Western Blotting Detction Syste
m (Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、該プロ
トコールに従って、上記一次抗体と生体試料中のNFATC1
またはCICC4との結合物を検出し、マルチバイオイメー
ジャーSTORM860(AmershamPharmacia Biotech 社製)で測
定することもできる。
【００６７】骨代謝異常疾患の診断は、被験者の骨組織
におけるNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現
レベル（これらの遺伝子に対応するRNAの量）、もしく
はNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現産物であるタ
ンパク質（NFATC1またはCICC4）の量を正常な骨組織に
おける上記に対応する遺伝子発現レベルまたはタンパク
質の量と比較し、両者の違いを判定することによって行
うことができる。
【００６８】この場合、正常な骨組織から採取調製した
生体試料（RNAまたはタンパク質を含む試料）が必要で
あるが、これらは骨代謝異常疾患に罹患していない人の
骨組織をバイオプシ等で採取することによって取得する
ことができる。なお、ここでいう「骨代謝異常疾患に罹
患していない人」とは、少なくとも骨代謝異常疾患の自
覚症状がなく、好ましくは他の検査方法、例えばDXA
法：Dual energy X-ray absorptiometry 法により検査
の結果、骨代謝異常疾患でないと診断された人をいう。
なお、当該「骨代謝異常疾患に罹患していない人」を以
下、本明細書では単に正常者という場合もある。
【００６９】被験者の骨組織と正常な骨組織（骨代謝異
常疾患に罹患していない人の骨組織）との遺伝子発現レ
ベルまたはタンパク質の量の比較は、被験者の生体試料
と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うこ
とで実施できる。並行して行なわない場合は、複数（少
なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以
上）の正常な骨組織を用いて均一な測定条件で測定して
得られたNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発現
レベル、若しくはこれらの遺伝子の発現産物であるタン
パク質（NFATC1またはCICC4）の量の平均値または統計
的中間値を、正常者の当該遺伝子の遺伝子発現レベル若
しくはタンパク質の量として、比較に用いることができ
る。
【００７０】被験者が、破骨細胞の分化・活性化の亢進
に関連した骨代謝異常疾患であるかどうかの判断は、該
被験者の骨組織におけるNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝
子の遺伝子発現レベル（これらの遺伝子に対応するRNA
量）、またはその発現産物であるNFATC1またはCICC4の
量が、正常者のそれらと比較して２倍以上、好ましくは
３倍以上多いことを指標として行うことができる。ま
た、被験者の上記遺伝子発現レベルまたはタンパク質の
量が、いかなる正常者のそれらのレベルまたは量に比べ
て多ければ、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した
骨代謝異常疾患であると判断することができる。
【００７１】（３）候補物質のスクリーニング方法 (3-1) 遺伝子発現レベルを指標とするスクリーニング方
法 本発明は、配列番号１に記載の塩基配列を有するNFATC1
遺伝子または配列番号２に記載の塩基配列を有するCICC
4遺伝子の発現を制御する物質（候補物質）をスクリー
ニングする方法を提供する。
【００７２】本発明のスクリーニング方法は次の工程
(a)、(b)及び(c)を含む： (a) 被験物質とNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子を発現
可能な細胞とを接触させる工程、(b) 被験物質を接触さ
せた細胞のNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の遺伝子発
現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照
細胞の上記に対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
(c) 上記の比較結果に基づいて、NFATC1遺伝子またはCI
CC4遺伝子の遺伝子発現量を変動させる被験物質を選択
する工程。
【００７３】かかるスクリーニングに用いられる細胞と
してはNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子を発現する細胞
であって、かつ破骨細胞への分化が可能である、破骨細
胞前駆細胞を挙げることができる。破骨細胞への分化が
可能な破骨細胞前駆細胞としては、具体的には、脾臓や
骨髄から取得される細胞や、マウスRAW264細胞（RIKEN
Cell Bank; HYPERLINK HYPERLINK "http://www.rtc.ri
ken.go.jp/CELL/HTML/RIKEN" http://www.rtc.riken.g
o.jp/CELL/HTML/RIKEN、http://www.rtc.riken.go.Jp/C
ELL /HTML/RIKEN Cell Bank. Htmlから入手可能）など
を挙げることができる。なお、マウスRAW264細胞は、分
化誘導物質であるODF（osteoclast differentiation fa
ctor）の添加で破骨細胞に分化することが知られている
細胞である（Biochem.Biophys.Res. Commun. 282, 278-
283 (2001)）。好ましくはRAW264細胞である。当該細胞
は、後述する実施例に示すように、ODFの添加によって
破骨細胞に分化し、その過程でNFATC1遺伝子またはCICC
4遺伝子が発現誘導されることが確認されている。
【００７４】候補物質となりえるものとしては、制限さ
れないが、核酸（NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子のア
ンチセンスヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク
質、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニン
グは、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質
を含む試料（被験試料）を上記組織／または細胞と接触
させて行うことができる。かかる被験試料としては細胞
抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化
合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、
これに制限されない。
【００７５】また、スクリーニングに際して、被験物質
と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該
細胞が死滅せず且つNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子を
発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選
択するのが好ましい。
【００７６】実施例に示すように、骨粗鬆症といった骨
代謝異常疾患に罹患した患者の骨組織には、特異的に、
破骨細胞の分化・活性化の亢進が見られるとともにNFAT
C1遺伝子またはCICC4遺伝子が発現している。この知見
から、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現は、破骨
細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代謝異常疾患と
関連していると考えられる。すなわち、本発明のスクリ
ーニング方法は、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発
現またはその発現誘導が、破骨細胞の分化・活性化の亢
進によって生じる骨代謝異常疾患と関連していることを
利用したものである。よって、該骨代謝異常疾患の緩和
／抑制作用を有する（骨代謝異常疾患に対して改善／治
療効果を発揮する）物質の探索には、上記NFATC1遺伝子
またはCICC4遺伝子の発現レベルの減少、あるいは発現
誘導の抑制が指標とされる。
【００７７】すなわち、本発明のスクリーニング方法は
NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を抑制する物質
を探索することによって、破骨細胞の分化・活性化の亢
進に関連する骨代謝異常疾患の改善薬または治療薬の有
効成分となる候補物質を提供するものである。
【００７８】候補物質の選別は、具体的には下記によう
にして行うことができる。すなわち、NFATC1遺伝子また
はCICC4遺伝子が発現している細胞を用いる場合は、被
験物質を添加した細胞におけるNFATC1遺伝子またはCICC
4遺伝子の発現レベルが被験物質を添加しない細胞のそ
のレベルに比して低くなること、またNFATC1遺伝子また
はCICC4遺伝子の発現に発現誘導物質を必要とする細胞
を用いる場合は、発現誘導物質（例えば、RAW264細胞の
場合はODF）によって誘導される発現が被験物質の存在
によって抑制されること、すなわち発現誘導物質存在下
で被験物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導
物質存在下で被験物質を接触させない対照細胞（正のコ
ントロール）に比して低くなることをもって、当該被験
物質を候補物質として選択することができる。
【００７９】より具体的には、例えばRAW264細胞を用い
て破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代謝異常
疾患の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を
スクリーニングするには、ODFを添加したRAW264細胞
（対照細胞）と、ODFと被験物質とを同時に加えたRAW26
4細胞とでNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現レベル
を比較し、その発現レベルの減少を指標として、被験物
質の中から候補物質を選別することができる。また、OD
Fを添加して、既にNFATC１遺伝子またはCICC4遺伝子が
発現誘導された状態のRAW264細胞に被験物質を添加し、
被験物質を添加しない対照のRAW264細胞と、そのNFATC1
遺伝子またはCICC4遺伝子の発現レベルを比較して、そ
の発現レベルの低下を指標として、被験物質の中から候
補物質を選別することもできる。
【００８０】このような本発明のスクリーニング方法に
おける遺伝子発現レベルの検出及び定量は、前記細胞か
ら調製したRNAまたは該RNAから転写された当該RNAに対
して相補的なポリヌクレチドと本発明の疾患マーカーと
を用いて、前記(2-1)項に記述したように、ノーザンブ
ロット法、RT-PCR法など公知の方法の他、DNAチップな
どを利用して実施できる。指標とする遺伝子発現の低下
（減少）の程度は、被験物質を添加した細胞におけるNF
ATC1遺伝子またはCICC4 遺伝子の発現が、被験物質を添
加しない対照細胞での上記に対応する遺伝子の発現量と
比較して10%、好ましくは30%、特に好ましくは50%以上
の低下（減少）を例示することができ、この場合に当該
被験物質を候補物質として選択することができる。
【００８１】またNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発
現レベルの検出及び定量は、NFATC1遺伝子またはCICC4
遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）
に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子
をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マー
カー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することで実
施することもできる。本発明のNFATC1遺伝子またはCICC
4遺伝子の発現制御物質のスクリーニング方法及び本発
明の骨代謝異常疾患の改善または治療剤の有効成分のス
クリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量
を指標として標的物質を探索する方法も包含され、この
意味において請求項７及び８に記載する「NFATC1遺伝
子」の概念には、NFATC1遺伝子の発現制御領域とマーカ
ー遺伝子との融合遺伝子が含まれ、また「CICC4遺伝
子」の概念には、CICC4遺伝子の発現制御領域とマーカ
ー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。
【００８２】なお、上記マーカー遺伝子としては、発光
反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好まし
く、具体的には上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、ク
ロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝
子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺
伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子も
また使用することができる。ここでNFATC1遺伝子または
CICC4遺伝子の発現制御領域としては、例えば該遺伝子
の転写開始部位上流約１kb、好ましくは約2kbを用いる
ことができる。融合遺伝子の作成、およびマーカー遺伝
子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
【００８３】以上のスクリーニング方法により、被験物
質から選別される物質（候補物質）はNFATC1遺伝子また
はCICC4遺伝子の遺伝子発現抑制剤として位置づけるこ
とができる。これらの物質は、NFATC1遺伝子またはCICC
4遺伝子の発現を抑制することによって、破骨細胞の分
化・活性化の亢進を抑制し得ると考えられる。よって、
これらの物質は、破骨細胞の分化・活性化の亢進によっ
て生じる骨代謝異常疾患を緩和、抑制（改善、治療）す
る薬物の有力な候補物質となる。
【００８４】(3-2) タンパク質の機能を指標とするスク
リーニング方法 本発明は、NFATC1またはCICC4の機能または活性を抑制
する物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明
のスクリーニング方法は次の工程(a)、(b)及び(c)を含
む： (a)被験物質と NFATC1またはCICC4を含む細胞または該
細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、(b)被
験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のNFATC1ま
たはCICC4由来の機能または活性を測定し、該機能また
は活性を被験物質を接触させない対照細胞またはその細
胞画分の上記に対応するタンパク質の機能または活性と
比較する工程、(c) (b) の比較結果に基づいてNFATC1ま
たはCICC4由来の機能または活性を抑制する被験物質を
選択する工程。
【００８５】かかるスクリーニングに用いられる細胞と
しては、内在性及び外来性などの由来に関わらず、NFAT
C1遺伝子またはCICC4遺伝子を発現しており、NFATC1ま
たはCICC4を有する細胞を挙げることができる。具体的
には、例えば前記（3-1）に記述したようなマウスRAW26
4細胞などを挙げることができる。また細胞画分とは、
かかる細胞に由来する各種の画分を意味するものであ
り、例えば細胞膜画分、細胞質画分、および細胞核画分
などを挙げることができる。
【００８６】実施例に示すように、骨代謝異常疾患の一
種である骨粗鬆症に罹患した患者の骨組織には、特異的
に破骨細胞の分化・活性化の亢進が見られるとともに、
NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子が発現している。この
知見から、NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子によりコー
ドされるタンパク質の機能（活性）が破骨細胞の分化・
活性化の亢進に関連する骨代謝異常疾患と関連している
と考えられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法
はNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子によりコードされる
タンパク質が、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって
生じる骨代謝異常疾患と関連していることを利用したも
のである。よって、該骨代謝異常疾患の緩和／抑制作用
を有する（骨代謝異常疾患に対して改善／治療効果を発
揮する）物質の探索には、上記NFATC1またはCICC4の少
なくとも１方のタンパク質の機能または活性の低下もし
くは抑制が指標とされる。
【００８７】すなわち、本発明のスクリーニング方法
は、NFATC1またはCICC4の機能または活性を抑制する物
質を探索することによって、破骨細胞の分化・活性化の
亢進によって生じる骨代謝異常疾患の改善薬または治療
薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
【００８８】候補物質となりえるものとしては、制限さ
れないが、核酸、ペプチド、蛋白質（NFATC1またはCICC
4に対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物など
であり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの
候補物質となり得る被験物質を含む試料（被験試料）を
上記細胞または細胞画分と接触させることにより行われ
る。かかる被験試料としては、細胞抽出液、遺伝子ライ
ブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチ
ド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限され
ない。
【００８９】ところで、NFATC1は転写因子であり、Inte
rleukin-2遺伝子の発現に関与することが知られている
（Mol. Cell. Biol. 19, 2300-2307 (1999)）。詳細に
は、NFATC1は、カルシニューリンにより脱リン酸化され
て核内に移行した後、転写因子として機能してInterleu
kin-2遺伝子等の発現を増加させることが知られている
（J. Biol. Chem. 276, 20805-20808 (2001)、Oncogene
20, 2476-2489 (2001)）。従って、この公知の性質に
基づいて、NFATC1の機能または活性を抑制する候補物質
のスクリーニングは、Interleukin-2遺伝子の発現量の
減少を指標にして行うこともできる。この場合は、上記
細胞として、NFATC1を有し、且つInterleukin-2遺伝子
を発現可能な細胞を用いることができる。
【００９０】この場合、Interleukin-2遺伝子の発現量
を直接の指標としてもよいし、前述するようにマーカー
遺伝子に由来するタンパク質の活性を指標としてスクリ
ーニングを行ってもよい。後者の場合、具体的には、NF
ATC1を有し且つInterleukin-2遺伝子を発現可能な細胞
として、例えばNFATC1がInterleukin-2遺伝子を発現制
御するために必要な遺伝子配列を含むInterleukin-2遺
伝子の発現制御領域と、ルシフェラーゼなどのマーカー
遺伝子とをつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用い
て、Interleukin-2遺伝子の発現量をマーカー遺伝子由
来のタンパク質の活性を測定することによって間接的に
検出し、定量する方法を挙げることができる。
【００９１】なお、上記マーカー遺伝子としては、発光
反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好まし
く、具体的には上記ルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロ
ラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝
子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダ−ゼ遺
伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子も
また使用することができる。同様なスクリーニング方法
は公知であり(Biochem. Cell. Biol. 74, 585-593 (199
6), Biologicals 26, 1-5 (1998)) 、これに準じて行う
ことができる。候補物質の選抜は、具体的には被験物質
を添加した細胞におけるマーカー遺伝子由来のタンパク
質の活性が、被験物質を添加しない対照細胞の上記に対
応するタンパク質の活性レベルに比して、低くなること
を指標として、当該被験物質を候補物質として選択する
することができる。
【００９２】またCICC4は塩化物イオンチャンネルであ
ることが知られている（Am. J. Physiol. 276, F398-F4
08 (1999), J. Biol. Chem. 272, 12575-12582 (1997)
）。従ってこの公知の性質に基づいて、CICC4の機能を
抑制する候補物質のスクリーニングは、CICC4を有する
細胞またはその細胞画分における塩化物イオンの膜透過
活性を指標に行うことができる。
【００９３】例えば、常法の遺伝子組換え技術（Molecu
lar Cloning, T. Maniatis et al.,CSH Laboratory(198
3), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS(1985)）を用
いて作成した、CICC4遺伝子を発現する形質転換培養細
胞またはその細胞膜画分を用いてパッチクランプ法によ
り、該細胞またはその細胞画分についてCICC4の塩化物
イオンの膜透過活性を調べることができる。同様な測定
法はCICC４と同種の塩化物イオンチャンネルタンパク質
で公知であり(J. Biol. Chem. 272, 12575-12582 (199
7)) 、これに準じて測定することができる。候補物質の
選抜は、具体的には被験物質を添加した細胞またはその
細胞画分における塩化物イオンの膜透過活性が、被験物
質を添加しない対照細胞またはその細胞画分の該膜透過
活性レベルに比して、低くなることをもって、当該被験
物質を候補物質として選択することができる。
【００９４】斯くして被験物質の中ら選抜取得される物
質は、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨
代謝異常疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有
力な候補物質となる。
【００９５】上記(3-1)または(3-2)に記載する本発明の
スクリーニング方法によって選別された候補物質は、さ
らに骨代謝異常疾患モデル動物を用いた薬効試験、安全
性試験、さらに骨代謝異常疾患患者への臨床試験に供し
てもよく、これらの試験を実施することによって、より
実用的な骨代謝異常疾患改善または治療薬を取得するこ
とができる。このようにして選別された物質は、さらに
その構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合
成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製
造することができる。
【００９６】（４）骨代謝異常疾患の改善・治療剤 本発明は、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生
じる骨代謝異常疾患の改善・治療剤を提供するものであ
る。
【００９７】本発明はNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子
の発現が破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代
謝異常疾患と関連しているという新たな知見からNFATC1
遺伝子（配列番号１もしくは３）またはCICC4遺伝子
（配列番号２もしくは４）の発現を抑制する物質、ある
いは、CICC4（配列番号５）またはNFATC1（配列番号
６）の機能または活性を抑制する物質が、上記疾患の改
善または治療に有効であるという考えに基づくものであ
る。すなわち、本発明の骨代謝異常疾患の改善・治療剤
はNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現を抑制する物
質、あるいはNFATC1またはCICC4の機能または活性を抑
制する物質を有効成分とするものである。
【００９８】当該有効成分となるNFATC1遺伝子またはCI
CC4遺伝子の発現抑制物質、あるいはNFATC1またはCICC4
の機能または活性を抑制する物質は、上記のスクリーニ
ング方法を利用して選別されたもののみならず、選別さ
れた物質に関する情報に基づいて常法に従って工業的に
製造されたものであってもよい。
【００９９】NFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子の発現抑
制物質、あるいはNFATC1またはCICC4の機能（活性）抑
制物質は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容さ
れる担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含ま
れる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として
調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形
態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ
剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤な
どの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投
与することができる。また投与量は、有効成分の種類、
投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状など
によって異なり一概に規定できないが、１日投与用量と
して、数百ｍｇ〜２ｇ、好ましくは数十ｍｇ程度を、１
日１〜数回にわけて投与することができる。
【０１００】また、上記の物質がDNAによりコードされ
るものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組み
込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。さらに、上
記有効成分がNFATC1遺伝子またはCICC4遺伝子のアンチ
センスオリゴヌクレオチドの場合は、そのまま若しくは
遺伝子治療用ベクターにこれを組み込むことにより、遺
伝子治療を行うこともできる。これらの場合も、投与
量、投与方法は患者の体重や年齢、症状などにより変動
するが、当業者であれば適宜選択することが可能であ
る。
【０１０１】
【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。しかし、本発明はこれらの実施例になんら限
定されるものではない。参考例１ マウスODFタンパク質の作成 破骨細胞分化に必要な分化誘導タンパク質であるODF [o
steoclast differentiation factor](ODFはRANKLともい
う。Bone 27, 761-764 (2000))を下記のようにして作成
した。
【０１０２】ODF遺伝子を有するマウスストローマ細胞S
T2からＲＮＡを抽出し、次いで抽出したRNA 3μgから作
成したｃDNA １μgを鋳型として、配列番号７に示す配
列を有するオリゴヌクレオチドをセンスプライマー、配
列番号８に示す配列を有するオリゴヌクレオチドをアン
チオセンスプライマーとしてPCR法を行って、ODF（oste
oclast differentiation factor)遺伝子を増幅した。な
お、PCR法はPfx DNA polymerase（GIBCO-BRL社製）を用
い、付属のプロトコールに従って50μｌの系で94℃15
秒、52℃30秒、および68℃1分のサイクルを5サイクル行
った後、94℃15秒、56℃30秒、68℃1分のサイクルを15
サイクル行うことによって実施した。かかるPCR法で増
幅させて得られたODF遺伝子を制限酵素MnuIで切断し、p
GEX-2TKベクター（Amersham Pharmacia Biotech社製）
のGST（glutathione S-transferase）のコード領域の下
流に位置するEcoRI部位に挿入して、GST／ODF融合タン
パク質発現プラスミドを作製した。
【０１０３】次いで得られたGST／ODF融合タンパク質発
現プラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、該形質転換
体をアンピシリン（終濃度50ng/ml）を含む培地で7時間
前培養した。得られた形質転換体をさらにアンピシリン
を同様に含む250mlのLB培地でOD550が0.6になるまで37
℃で培養した。その後、終濃度が0.25mMになるようにIP
TG（isopropyl-1-thio-β-D-galactoside）を加えて、1
8℃で12時間培養した。培養後、6000rpmで10分間遠心し
て菌体を回収し、これを20mlのNETN（20mM Tris-HCl pH
8.0, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5% NP-40）に懸濁し
て、4℃でソニケーターを用いて破砕した（power max,
20秒で4回）。これを9000rpm、30分の条件で2回遠心し
て上清を回収し、これを大腸菌破砕液とした。この大腸
菌破砕液に250μlのグルタチオンセファロースビーズを
加え、4℃で2時間以上反応させた。その後、遠心してビ
ーズのみを回収し、NETNで3回、及びElution buffer（2
0mM NaCl, 4mM MgCl2, 1mM 2-メルカプトエタノール, 2
0mM HEPES/NaOH pH7.4）で洗浄し、これにグルタチオン
溶液（100mM グルタチオン還元型, 100mM Tris-HClpH8.
0, 1M NaCl）250μlを加えて、4℃で2時間以上反応さ
せ、ビーズから組換え体タンパク（GST／ODF融合タンパ
ク質）を溶出させた。次いで、得られたGST／ODF融合タ
ンパク質をSDS-PAGEにより精製し、フィルター滅菌し
て、破骨細胞分化誘導タンパク質として下記の実験に用
いた。
【０１０４】また、コントロール品として、ODF遺伝子
を組み込まないｐGEX-2TKベクターについても上記と同
様の操作を行い、GSTタンパク質を得た。
【０１０５】実施例１ ODF添加によるマウスRAW264
細胞の破骨細胞分化 参考例１で調製したODFタンパク質（GST／ODF融合タン
パク質）を用いて、破骨細胞の前駆細胞の性質を有する
マウスRAW264細胞（Leukemic monocyte由来のマクロフ
ァージ様細胞）を、破骨細胞に分化させた。
【０１０６】具体的には、マウスRAW264細胞は、使用す
るまえに、予めE-MEM培地（ウシ胎児血清10％、ペニシ
リン50U/mLを含む）で、37℃、CO2濃度5％の条件下で培
養しておき、このRAW264細胞を一晩培養した翌日、参考
例１で調製したODFタンパク質（GST/ODF融合タンパク
質）またはGSTタンパク質（コントロールタンパク質）
を含む培地と交換し、同条件でさらに4日間培養した。
その破骨細胞への分化状況はTRAP染色（tartrate resis
tantacid phosphatase 染色）を行うことによって調べ
た。ODFタンパク質（GST/ODF融合タンパク質）を添加し
たRAW264細胞は、TRAP染色から72時間後には、TRAP陽性
の多核細胞が見え始め、96時間後には大多数の細胞が破
骨細胞様多核細胞に分化しているのが観察された。それ
に対して、上記ODFタンパク質（GST/ODF融合タンパク
質）に代えてGSTタンパク質をRAW264細胞に加えた場合
には、破骨細胞への分化は見られなかった。このことか
ら、RAW264細胞は参考例１で調製したGST/ODF融合タン
パク質中のODFタンパク質の機能（分化誘導能）に基づ
いて破骨細胞に分化されることが確認された。
【０１０７】実施例２ 破骨細胞分化過程でのRAW264細
胞からのtotal RNAの調製 実施例１で破骨細胞への分化が見られたGST/ODF融合タ
ンパク質添加系RAW264細胞（以下、本明細書において
「ODFタンパク質処理RAW264細胞」ともいう。）につい
てtotal RNAを調製した。具体的には実施例１と同様に
してGST/ODF融合タンパク質を添加した後、培養2, 5, 1
2, 24, 48, 72,及び96時間経過後のRAW264細胞からそれ
ぞれtotal RNAを調製した。なお、total RNAの調製は、
培養上清を除去した細胞を氷冷したPBS（phosphate-buf
fered saline）で3回洗浄した後、ISOGEN（ニッポンジ
ーン社製）を用いて付属のプロトコールに従って行っ
た。得られたtotal RNAはTE溶液（10mM Tris-HCl, pH8.
0, 1mM EDTA）に溶解した。
【０１０８】同様にして、比較対照のため何も添加しな
いで培養したRAW264細胞（以下、本明細書において「未
処理RAW264細胞」ともいう。）からtotal RNAを調製
し、また、GST/ODF融合タンパク質に代えてGSTタンパク
質を添加したRAW264細胞（以下、本明細書において「GS
Tタンパク質処理RAW264細胞」ともいう。）について
も、GSTタンパク質を加えた後、培養2, 5, 12, 24, 48,
72, 96時間経過後に同様にしてtotal RNAを調製した。
【０１０９】実施例３ DNAチップ解析 実施例２で調製したtotal RNAを用いてDNAチップ解析を
行った。なお、DNAチップ解析はAffymetrix社Gene Chip
Murine Genome U74Aを用いて行った。具体的には、解
析は、(1) total RNAからcDNAの調製、(2) 該cDNAから
ラベル化cRNAの調製、(3) ラベル化cRNAのフラグメント
化、(4) フラグメント化cRNAとプローブアレイとのハイ
ブリダイズ、(5) プローブアレイの染色、(6) プローブ
アレイのスキャン、及び(7) 遺伝子発現解析、の手順で
行った。
【０１１０】(1) total RNAからcDNAの調製 実施例２で得られた各total RNA 10μgとT7-(dT)24プラ
イマー(Amersham社製)100pmolを含む11μLの混合液を、
70℃、10分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、Su
perScript Choice System for cDNA Synthesis(Gibco-B
RL社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 4μ
L、該キットに含まれる0.1M DTT （dithiothreitol）2
μL、該キットに含まれる10mM dNTP Mix 1μLを添加
し、42℃で2分間加熱した。更に、該キットに含まれるS
uper ScriptII RT 2μL(400U)を添加し、42℃で1時間加
熱した後、氷上で冷却した。冷却後、DEPC処理水（ナカ
ライテスク社製）滅菌蒸留水91μL、該キットに含まれ
る5×Second Strand Reaction Buffer 30μL、10mM dNT
P Mix 3μL、該キットに含まれるE. coli DNA Ligase 1
μL(10U)、該キットに含まれるE. coli DNA Polymerase
I 4μL(40U)、該キットに含まれるE. coli RNaseH 1μ
L(2U)を添加し、16℃で2時間反応させた。次いで、該キ
ットに含まれるT4 DNA Polymerase 2μL(10U)を加え、1
6℃で5分間反応させた後、0.5M EDTA 10μLを添加し
た。次いで、フェノール/クロロホルム/イソアミルアル
コール溶液（ニッポンジーン社製）162μLを添加し、混
合した。該混合液を、予め室温、14,000rpm、30秒間遠
心分離しておいたPhase Lock Gel Light(エッペンドル
フ社製)に移し、室温で14,000rpm、2分間遠心分離した
後、145μLの水層をエッペンドルフチューブに移した。
得られた溶液に、7.5M酢酸アンモニウム溶液72.5μL、
エタノール362.5μLを加えて混合した後、4℃で14,000r
pm、20分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作
製したcDNAを含むペレットを得た。その後、該ペレット
に80%エタノール0.5mLを添加し、4℃で14,000rpm、5分
間遠心分離した後、上清を捨てた。再度同様の操作を行
った後、該ペレットを乾燥させ、DEPC処理水12μLに溶
解した。以上の操作から実施例２で調製した各total RN
Aから、各cDNAを取得した。
【０１１１】(2) cDNAからラベル化cRNAの調製 各cDNA溶液5μLに、DEPC処理水17μL、BioArray High Y
ield RNA TranscriptLabeling Kit(ENZO社製)に含まれ
る10×HY Reaction Buffer 4μL、該キットに含まれる1
0×Biotin Labeled Ribonucleotides 4μL、該キットに
含まれる10×DTT 4μL、該キットに含まれる10×RNase
Inhibitor Mix 4μL、該キットに含まれる20×T7 RNA P
olymerase 2μLを混合し、37℃で5時間反応させて、ラ
ベル化cRNAを調製した。反応後、該反応液にDEPC処理水
60μLを加えたのち、RNeasy Mini Kit（GIAGEN社製）を
用いて添付プロトコールに従い、調製したラベル化cRNA
を精製した。
【０１１２】(3) ラベル化cRNAのフラグメント化 各ラベル化cRNA 20μgを含む溶液に、5×Fragmentation
Buffer（200mMトリス−酢酸 pH8.1(Sigma社製)、 500
mM酢酸カリウム(Sigma社製)、150mM酢酸マグネシウム(S
igma社製)）8μLを加えた反応液40μLを、94℃で35分間
加熱した後、氷中に置いた。これによって、ラベル化cR
NAをフラグメント化した。
【０１１３】(4) フラグメント化cRNAとプローブアレイ
とのハイブリダイズ 各フラグメント化cRNA 40μLに、5nM Control Oligo B2
（Amersham社製）4μL、100×Control cRNA Cocktail 4
μL、Herring sperm DNA（Promega社製）40μg、Acetyl
ated BSA（Gibco-BRL社製）200μg、2×MES Hybridizat
ion Buffer(200mM MES、2M [Na+], 40mM EDTA、0.02% T
ween20 (Pierce社製)、pH6.5〜6.7) 200μL、及びDEPC
処理水144μLを混合し、400μLのハイブリカクテルを得
た。得られた各ハイブリカクテルを99℃で5分間加熱
し、更に45℃で5分間加熱した。加熱後、室温で14,000r
pm、5分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
【０１１４】一方、1×MESハイブリダイゼーションバッ
ファーで満たしたMurine genome U74Aプローブアレイ
（Affymetrix社製）を、ハイブリオーブン内で、45℃、
60rpmで10分間回転させた後、1×MESハイブリダイゼー
ションバッファーを除去してプローブアレイを調製し
た。上記で得られたハイブリカクテル上清200μLを該プ
ローブアレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で
45℃、60rpmで16時間回転させ、フラグメント化cRNAと
ハイブリダイズしたプローブアレイを得た。
【０１１５】(5) プローブアレイの染色 上記で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイそれ
ぞれからハイブリカクテルを回収除去した後、Non-Stri
ngent Wash Buffer(6×SSPE(20×SSPE(ナカライテスク
社製)を希釈)、0.01%Tween20、0.005%Antifoam0-30(Sig
ma社製))で満たした。次にNon-Stringent Wash Buffer
およびStringent Wash Buffer(100mM MES、0.1M NaCl、
0.01%Tween20)をセットしたGeneChip Fluidics Station
400(Affymetrix社製)の所定の位置にフラグメント化cR
NAとハイブリダイズしたプローブアレイを装着した。そ
の後染色プロトコールEuKGE-WS2に従って、１次染色液
(10μg/mL Streptavidin Phycoerythrin (SAPE)(Molec
μLar Probe社製)、2mg/mL Acetylated BSA、100mM ME
S、1M NaCl(Ambion社製)、0.05%Tween20、0.005%Antifo
am0-30)、 2次染色液（100μg/mL Goat IgG (Sigma社
製)、3μg/mL Biotinylated Anti-Streptavidin antibo
dy (Vector Laboratories社製)、2mg/mL Acetylated BS
A、100mM MES、1M NaCl、0.05%Tween20、0.005%Antifoa
m0-30）により染色した。
【０１１６】(6) プローブアレイのスキャン、 及び
(7) 遺伝子発現解析 染色した各プローブアレイをHP GeneArray Scanner(Aff
ymetrix社製)に供し、染色パターンを読み取った。染色
パターンをもとにGeneChip Workstation System(Affyme
trix社製)によってプローブアレイ上の遺伝子の発現を
解析した。次に、解析プロトコールに従ってNormalizat
ion、遺伝子発現の比較解析を行った。
【０１１７】実施例４ RAW264細胞を用いたin vitro
破骨細胞分化系での遺伝子発現の変動解析 GST/ODF融合タンパク質を添加した後、培養2, 5, 12, 2
4, 48, 72, 及び96時間経過後の各RAW264細胞における
遺伝子発現量（average difference）を、未処理RAW264
細胞における発現量と、GeneChip Workstation System
(Affymetrix社製)にある解析ツールComparison Analysi
sを用いて比較した。Comparison Analysisは解析プロト
コールに基づいて行った。
【０１１８】次に、GST/ODF融合タンパク質を添加した
後、培養2, 5, 12, 24, 48, 72, 96時間経過後の各RAW2
64細胞における遺伝子発現量（average difference）
と、GSTタンパク質を添加した後、培養2, 5, 12, 24, 4
8, 72, 及び96時間経過後の各RAW264細胞での遺伝子発
現量（average difference）とを、経過時間ごとにComp
arison Analysisを同様に行って比較した。
【０１１９】これらの比較解析の結果から得られた、遺
伝子発現の増減の判定（Diff Call）および発現変動倍
率（Fold Change）の値から、発現変動遺伝子を選抜し
た。選抜方法は、各培養時間において、GSTタンパク質
処理RAW264細胞での遺伝子発現量（average differenc
e）が、未処理RAW264細胞での遺伝子発現量、及びGSTタ
ンパク質処理RAW264細胞での遺伝子発現量と比較して、
両方とも2倍以上の発現変動（Diff CallがIあるいはDの
判定、かつFold Changeが-2以下あるいは2以上）を示し
たプローブを選抜した。同様の解析をすべての培養時間
における細胞について行って、全ての培養時間において
2倍以上の発現変動を示したプローブを選抜した。
【０１２０】実施例５ ヒト骨粗鬆症患者の骨とヒト
正常骨での遺伝子発現の変動解析 ヒト骨粗鬆症患者の骨組織１サンプルとヒトの正常な骨
組織３サンプルからtotal RNAを調製し、得られたtotal
RNAを用いてDNAチップ解析を行った。DNAチップ解析は
Affymetrix社Gene Chip Human Genome U95A,B,C,D,Eを
用いて、実施例３と同様な方法で行った。また実施例３
及び４と同様に、遺伝子発現の比較解析から正常骨組織
に比べ、骨粗鬆症患者の骨組織で3倍以上の発現増を示
したプローブを選抜した。選抜プローブの中には、表１
に示すように、TRAP5、CathepsinKなど破骨細胞特異的
な発現遺伝子が含まれており、上記の選抜方法で確かに
破骨細胞特異的な発現遺伝子が得られていることが確認
された。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】なお、表中、発現増倍率とは、正常骨組織
における遺伝子発現量を１とした場合の骨粗鬆症患者の
骨組織で遺伝子発現量を示すものである。
【０１２３】選抜した該プローブの中から、さらに骨粗
鬆症患者の骨組織でのみ発現しているプローブを選抜し
た。具体的には、DNAチップ解析結果から得られるAbs C
allを指標にして、骨粗鬆症患者の骨組織でのAbs Call
がPresentのプローブで、かつ、正常骨組織でのAbs Cal
lがすべてAbsentのプローブを選抜した。
【０１２４】実施例６ in vitro破骨細胞分化での発現
誘導と骨粗鬆症患者の骨での発現増をともに示した遺伝
子 実施例４においてRAW264細胞を用いたin vitro破骨細胞
分化系で発現誘導を示したマウス遺伝子と、実施例５に
おいて骨粗鬆症患者の骨と正常骨での遺伝子発現の比較
で骨粗鬆症患者の骨で特異的な発現していたヒト遺伝子
とから、共通の遺伝子を選抜した。これらのマウス遺伝
子とヒト遺伝子との対応付けは、遺伝子名、タンパク質
名をもとに、あるいはHomologene（http://www.ncbi.nl
m.nih.gov/HomoloGene/）を用いて行った。その結果、N
FATC1遺伝子およびCICC4遺伝子が選抜された（表２、表
３、表４）。
【０１２５】
【表２】
【０１２６】Murine Genome U74A Chipを用いたaverage
difference 値の発現変動の経時変化を示す。GST/ODF
はGST/ODF融合タンパク質添加したRAW264細胞、GSTはGS
Tタンパク質を添加したRAW264細胞をそれぞれ示し、各
細胞の培養時間の経過によるNFATC1遺伝子の発現変動を
示す。なお、0時間は未処理RAW264細胞でのaverage dif
ference値である。NFATC1遺伝子のMurine Genome U74A
Chipにおけるプローブ名は102209#atである。
【０１２７】
【表３】
【０１２８】Murine Genome U74A Chipを用いたaverage
difference 値の発現変動の経時変化を示した。CICC4
遺伝子のMurine Genome U74A Chipにおけるプローブ名
は94255#g#atである。
【０１２９】
【表４】
【０１３０】表中、発現増倍率は、Human Genome U95 C
hipで解析した正常骨組織の遺伝子発現量に１とした場
合における骨粗鬆症患者の骨組織での遺伝子発現量を示
す。
【０１３１】表４の結果からわかるように、これら２つ
の遺伝子は、正常な骨組織では発現しておらず、破骨細
胞の分化・活性化の亢進に関連のある骨代謝異常疾患で
発現が増大しているため、該骨代謝異常疾患に関するマ
ーカー遺伝子として応用可能な遺伝子であると考えられ
た。また、これらの遺伝子を用いることによって破骨細
胞の分化・活性化の亢進に関連のある骨代謝異常疾患を
緩和、抑制する治療薬の候補薬をスクリーニングするこ
とが可能である。
【０１３２】実施例７ 破骨細胞分化とNFATC1遺伝子
発現の相関 24穴プレートに2.5 ×104、5 ×104、1 ×105、2 ×105
個のRAW264細胞をそれぞれ播き、GST/ODF融合タンパク
質添加96時間後に分化した破骨細胞（TRAP positive MN
cells：TRAP染色で染色された多核細胞）数を顕微鏡観
察下で計数した。TRAP染色は細胞をPBSで3回洗浄後、メ
タノール処理30秒で固定し、酒石酸耐性酸ホススファタ
ーゼ（TRAP）の基質（Naphthol AS-MX phosohate）と色
素（Fastredviolet LB salt）を含む溶液を加え、37℃
で30分から2時間インキュベートして行い（Takahasi N.
et al., Endcrinology, 122, p1373-p1382(1988)）、
赤く染色された細胞をTRAP positive MN cells（破骨細
胞）と判定した。プレート内の一定面積内で破骨細胞数
を計数した結果を図１aに示す。図１aには2.5 ×104個
の場合での破骨細胞数（100％）に対する割合(%)として
表す。結果は3回の平均値である。図１aに示すように、
2.5 ×104細胞（低密度培養条件：およそ細胞密度1.3×
104細胞／cm2以下）時には、約2500個の破骨細胞が見ら
れた。しかし、5×104細胞時では破骨細胞数は上記の10
％程度まで減少し、さらに10×104細胞（高密度培養条
件：およそ5×104細胞／cm2以上）時では5％以下まで減
少した。
【０１３３】図１bは、GST/ODF融合タンパク質添加96時
間後のRAW264細胞の形態を示す。左は低密度培養条件
（2.5×104個のRAW264細胞を播いた際）のRAW264細胞
で、巨大な破骨細胞がみられた。右は高密度培養条件
（20×104個RAW264細胞を播いた際）のRAW264細胞であ
る。このことから、RAW264細胞を高密度培養した際には
GST/ODF融合タンパク質を添加しても破骨細胞分化が阻
害されることがわかった。
【０１３４】破骨細胞分化とNFATC1遺伝子の発現増加の
相関を確認するために、高密度培養したRAW264細胞、及
び低密度培養したRAW264細胞のそれぞれに、GST/ODF融
合タンパク質を添加して2, 5, 12および24時間経過後の
RAW264細胞からtotal RNAをそれぞれ調製し、実施例3と
同様にAffymetrix社Gene Chip Murine Genome U74Aを用
いてDNAチップ解析を行った。高密度培養時及び低密度
培養時における各「ODFタンパク質処理RAW264細胞」の
遺伝子発現を比較するために、培養2, 5, 12及び24時間
経過後の各RAW264細胞における遺伝子発現量（average
difference）を、GeneChip Workstation System(Affyme
trix社製)を用いて解析した。表５に、Affymetrix社Gen
e Chip Murine Genome U74Aを用いたGST/ODF融合タンパ
ク質添加後のNFATC1遺伝子の発現量（average differen
ce）の経時変化を示す。表中、「低密度培養」は破骨細
胞分化条件下、「高密度培養」は破骨細胞分化阻害条件
下を表す。なお、0時間の値は未処理RAW264細胞でのave
rage differenceである。NFATC1遺伝子のMurine Genome
U74A Chipにおけるプローブ名は102209#atである。
【０１３５】
【表５】
【０１３６】表５に示すように、ODFタンパク質処理RAW
264細胞でGST/ODF融合タンパク質添加２〜５時間後に顕
著な発現増加を示したNFATC１遺伝子は、高密度培養時
のRAW264細胞では発現増加が見られなかった。破骨細胞
分化とNFATC1遺伝子の発現増加に相関が認められ、NFAT
C1遺伝子が破骨細胞分化に重要であることが確認され
た。
【０１３７】実施例８ 破骨細胞分化過程でのNFATC1
タンパク質の変動 ODFタンパク質処理RAW264細胞の破骨細胞分化過程にお
けるNFATC1（タンパク質）の変動を調べた。未処理RAW2
64細胞とGST/ODF融合タンパク質添加24, 48, 72および9
6時間後のRAW264細胞からそれぞれタンパク質画分を調
製し、抗NF-ATc1抗体7A6（Santa Cruz社製）、抗β-act
in抗体AC-74（Sigma社製）を用いて、ウエスタンブロッ
ト解析を行った。各レーン3μgのタンパク質画分を用
い、ウエスタンブロット解析はBiochem. Biophys. Res.
Commun. 282, 278-283 (2001)に記載の方法と同様な方
法で行った。図２ａに示すように、未処理RAW264細胞で
はNFATC1（タンパク質）はほとんど見られなかったが、
GST/ODF融合タンパク質を添加してから24時間後にはNFA
TC1（タンパク質）の顕著な増加が認められた。なお、
図中、0時間は未処理RAW264細胞の結果を指す。
【０１３８】また、高密度培養条件下RAW264細胞でのNF
ATC1（タンパク質）の発現を調べた。10 cm培養ディッ
シュに5 ×105細胞（低密度培養条件）、10×105細胞、
20×105細胞、40×105細胞（高密度培養条件）のRAW264
細胞をそれぞれ播き、GST/ODF融合タンパク質を添加し
てから24時間後のRAW264細胞からタンパク質を調製し、
うち各5μgのタンパク質画分を用いて上記と同様にウエ
スタンブロット解析を行った。図２bに示すように、破
骨細胞への分化が阻害される高密度培養時にはNFATC1
（タンパク質）は検出されず、破骨細胞分化とNFATC1タ
ンパク質の出現に相関がある結果が得られた。
【０１３９】実施例９ 破骨細胞分化へのサイクロス
ポリンの影響 NFATC1（タンパク質）はカルシニューリンにより脱リン
酸化されて核に移行し、転写因子として機能する（J. B
iol. Chem. 276, 20805-20808 (2001), Oncogene 20, 2
476-2489 (2001)）。一方、サイクロスポリンAはサイク
ロフィリンタンパク質と結合してカルシニューリンの脱
リン酸化反応を阻害し、NFATC1（タンパク質）の核移行
を妨げる（Cell 66, 807-815 (1991), J. Biol. Chem.
271, 10884-10891 (1996), Nature 382, 370-373 (199
6), Nature 383, 837-840 (1996)）。サイクロスポリン
A（CsA：Sigma社製）を終濃度0, 10, 100, 1000 ng/ml
となるようにGST/ODF融合タンパク質と同時にRAW264細
胞に添加し、96時間後に分化した破骨細胞（TRAP posit
ive MN cells）数を実施例７と同様な方法で計数した。
結果を図３に示す。図３ではControl (CsA：0 ng/ml)の
場合での破骨細胞数（100％）に対する割合（％）で表
した。結果は3回の平均値である。サイクロスポリンAを
ODFタンパク質処理RAW264細胞に加えたところ、破骨細
胞分化はサイクロスポリンの濃度依存的に阻害され、サ
イクロスポリンAを1000 ng/ml添加した際には破骨細胞
がほとんど検出されなかった。
【０１４０】サイクロスポリンA（CsA）を終濃度0, 10,
100, 1000 ng/ml となるようにGST/ODF融合タンパク質
と同時にRAW264細胞に添加し、72時間後に各細胞から調
製した総タンパク質画分、核画分、細胞質画分を用い
て、NFATC1（タンパク質）の細胞内局在を調べた。核画
分、細胞質画分の分画は「Cells: a laboratory manua
l」DL. Spector, RD. Goldman, LA. Leinwand, Cold Sp
ring Harbor LaboratoryPress (1998)に記載の方法に準
じて行った。ウエスタンブロット解析は、サイクロスポ
リン処理条件毎に等量の細胞から調製した総タンパク質
画分、核画分および細胞質画分を用いて抗NF-ATc1抗体7
A6（Santa Cruz社製）、抗β-actin抗体AC-74（Sigma社
製）、抗Rb抗体G3-245（PharMingen社製）を用いて行っ
た。結果を図４に示す。図からわかるように、サイクロ
スポリンAを添加しないRAW264細胞ではNFATC1（タンパ
ク質）は核画分において多く検出された。しかし、サイ
クロスポリンAを1000 ng/ml添加した際には、NFATC1
（タンパク質）は細胞質画分に多く、核画分では少量し
か検出されなかった（図４）。
【０１４１】実施例１０ NFATC1遺伝子の発現抑制に
よる破骨細胞分化への影響 まずNFATC1遺伝子の発現抑制に用いるプラスミドを以下
のように作製した。ODFタンパク質処理RAW264細胞から
調製したRNAからcDNAを合成し、配列番号９および配列
番号１０に記載のプライマーを用いてPCR法によりNFATC
1 遺伝子のDNA断片を得た。このDNA断片をpGEM-Tベクタ
ー（Promega社製）にクローニングした後、制限酵素Not
IとSma IでNFATC1遺伝子の5’末端側を含む231塩基を
切り出し、pTRE2ベクター（Clontech社製）のTRE／minC
MVプロモーター下流の制限酵素部位Not IとPvu II間に
逆向きに挿入した。こうしてテトラサイクリンやドキシ
サイクリンに依存してNFATC1アンチセンスRNAを生成可
能なプラスミドpNFATC1-ASを作製した。
【０１４２】NFATC1アンチセンスを発現する細胞は、プ
ラスミドpNFATC1-ASをRT3細胞（あらかじめpTet-Onプラ
スミド（Clontech社製）を導入したRAW264細胞）へと導
入し、ネオマシンおよびハイグロマイシン耐性な細胞を
選抜することで調製した。なお、当該NFATC1アンチセン
スを発現する細胞（RT3／NFATC1-AS細胞）の作製、選抜
にはTet-OnTM gene expression system（Clontech社
製）を用い、添付ユーザーマニュアルや「Molecular Cl
oning, a laboratory manual 3rd edition」J.Sambroo
k, DW. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s (2001) に準じて行った。
【０１４３】GST/ODF融合タンパク質添加72時間後の20
μM ドキシサイクリン（図中DOXで示す）添加（DOX
＋）、あるいは無添加（DOX-）条件下でのRAW264細胞、
RT3細胞(pTet-Onプラスミドのみを導入したRT3細胞)お
よびRT3／NFATC1-AS細胞からタンパク質画分を調製し、
抗NF-ATc1抗体7A6（Santa Cruz社製）、抗β-actin抗体
AC-74（Sigma社製）を用いてウエスタンブロット解析を
行った。抗NF-ATc1抗体を用いたウエスタンブロット解
析では各10μgのタンパク質画分を用いた。抗β-actin
抗体を用いたウエスタンブロット解析では各5.7μgのタ
ンパク質画分を用いた。RT3／NFATC1-AS細胞ではNFATC1
（タンパク質）の減少が見られ、NFATC1の発現抑制が確
認された（図５a）。
【０１４４】上記と同条件下でRAW264細胞、RT3細胞お
よびRT3／NFATC1-AS細胞から分化した破骨細胞（TRAP p
ositive MN cells）数を実施例７と同様な方法で計数し
た。結果を図５bに示す。当該図は、ドキシサイクリン
無添加（DOX-）における形質転換していないRAW264細胞
での破骨細胞数（100％）に対する割合（％）を示す。
結果は3回の平均値である。GST/ODF融合タンパク質添加
により分化した破骨細胞数は、pTet-Onプラスミドのみ
を導入したRT3細胞では、形質転換をしていないRAW264
細胞と同程度見られたが、RT3／NFATC1-AS細胞では破骨
細胞数は有意に減少した。
【０１４５】以上説明するように、上記の実施例９か
ら、サイクロスポリンAを用いてNFATC1の核移行を阻止
してNFATC1の働きを阻害することによって、破骨細胞の
分化が抑制されることが示された（なお、NFATC1は核に
移行しないとその機能を発揮しない。）。また上記の実
施例１０から、NFATC1遺伝子のアンチセンスヌクレオチ
ドによりNFATC1の発現を抑制することによって、破骨細
胞の分化が抑制されることが示された。これらの結果
は、NFATC1の機能または活性を抑制することによって、
またはNFATC1遺伝子の発現を抑制することによって、破
骨細胞の分化を抑制することができることを実証するも
のである。すなわち、上記の実施例９及び１０の結果か
ら、NFATC1遺伝子の発現を抑制することによって、また
はNFATC1の機能または活性を抑制することによって、破
骨細胞の分化亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患を改
善または治療することができると考えられる。
【０１４６】実施例１１ NFATC1遺伝子および／また
はCICC４遺伝子発現抑制剤のスクリーニング マウスRAW264細胞を実施例１と同じ条件で培養する。計
数したRAW264細胞を5x103/cm2でプレートに播種し、37
℃、CO2濃度5%で一夜培養する。翌日、参考例１記載のO
DFタンパク質を終濃度100ng/ml含む培地と交換し、それ
ぞれ100μM、10μM、および1μMの濃度に調製した被験
物質含有溶液を添加し、37℃、CO2濃度５％で２日間培
養する。ここで、対照実験として、被験物質無添加の細
胞についても同様に培養する（コントロール）。これら
の各培養細胞より抽出したRNAを用いて実施例３に記載
された方法で、NFATC1遺伝子および／またはCICC４遺伝
子の発現量を調べる。その発現量からコントロールと比
べてNFATC1遺伝子および／またはCICC４遺伝子の発現量
が10%、好ましくは30%、特に好ましくは50%以上減少し
ている培養系に添加した被験物質を骨代謝異常疾患の緩
和、抑制（改善、治療）する候補化合物として選択す
る。
【０１４７】
【発明の効果】本発明によって、破骨細胞の分化・活性
化の亢進が関連した骨代謝異常疾患、例えば関節炎や骨
粗しょう症などの疾患で発現が特異的に増大している遺
伝子（NFATC1遺伝子およびCICC4遺伝子）が明らかにな
った。かかる遺伝子は破骨細胞の分化・活性化の亢進に
関連した骨代謝異常疾患の遺伝子診断に用いられるマー
カー遺伝子（プローブ、プライマー）として有用であ
る。かかるマーカー遺伝子によれば骨代謝異常疾患が破
骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した疾患であるかど
うか、その原因を明らかにすることができ（診断精度が
向上）、これによりより適切な治療を施すことが可能と
なる。すなわち、骨代謝異常疾患の適切な治療のための
ツールとして利用することができる。
【０１４８】また、上記遺伝子の発現増加と破骨細胞の
分化・活性化の亢進並びにそれによる骨代謝異常疾患と
の関連性から、該遺伝子の発現を抑制する化合物は、上
記骨代謝異常疾患の治療薬として有用であると思われ
る。従って、本発明の遺伝子によれば、その発現の抑制
若しくは減少を指標にすることによって、破骨細胞の分
化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の治
療薬となり得る候補薬をスクリーニング選別することが
可能である。すなわち、本発明は、破骨細胞の分化・活
性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の治療薬の開発に
有用である。
【０１４９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Pharmaceuticals <110> Takeya Tatsuo <120> A marker of bone disease and its use <130> 37102JP <150> JP2001-294804 <151> 2001-9-26 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2743 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaattccgca gggcgcgggc accggggcgc gggcagggct cggagccacc gcgcaggtcc 60 tagggccgcg gccgggcccc gccacgcgcg cacacgcccc tcgatgactt tcctccgggg 120 cgcgcggcgc tgagcccggg gcgagggctg tcttcccgga gacccgaccc cggcagcgcg 180 gggcggccac ttctcctgtg cctccgcccg ctgctccact ccccgccgcc gccgcgcgga 240 tgccaagcac cagctttcca gtcccttcca agtttccact tggccctgcg gctgcggtct 300 tcgggagagg agaaactttg gggcccgcgc cgcgcgccgg cggcaccatg aagtcagcgg 360 aggaagaaca ctatggctat gcatcctcca acgtcagccc cgccctgccg ctccccacgg 420 cgcactccac cctgccggcc ccgtgccaca accttcagac ctccacaccg ggcatcatcc 480 cgccggcgga tcacccctcg gggtacggag cagctttgga cggtgggccc gcgggctact 540 tcctctcctc cggccacacc aggcctgatg gggcccctgc cctggagagt cctcgcatcg 600 agataacctc gtgcttgggc ctgtaccaca acaataacca gtttttccac gatgtggagg 660 tggaagacgt cctccctagc tccaaacggt ccccctccac ggccacgctg agtctgccca 720 gcctggaggc ctacagagac ccctcgtgcc tgagcccggc cagcagcctg tcctcccgga 780 gctgcaactc agaggcctcc tcctacgagt ccaactactc gtacccgtac gcgtcccccc 840 agacgtcgcc atggcagtct ccctgcgtgt ctcccaagac cacggacccc gaggagggct 900 ttccccgcgg gctgggggcc tgcacactgc tgggttcccc gcagcactcc ccctccacct 960 cgccccgcgc cagcgtcact gaggagagct ggctgggtgc ccgctcctcc agacccgcgt 1020 ccccttgcaa caagaggaag tacagcctca acggccggca gccgccctac tcaccccacc 1080 actcgcccac gccgtccccg cacggctccc cgcgggtcag cgtgaccgac gactcgtggt 1140 tgggcaacac cacccagtac accagctcgg ccatcgtggc cgccatcaac gcgctgacca 1200 ccgacagcag cctggacctg ggagatggcg tccctgtcaa gtcccgcaag accaccctgg 1260 agcagccgcc ctcagtggcg ctcaaggtgg agcccgtcgg ggaggacctg ggcagccccc 1320 cgcccccggc cgacttcgcg cccgaagact actcctcttt ccagcacatc aggaagggcg 1380 gcttctgcga ccagtacctg gcggtgccgc agcaccccta ccagtgggcg aagcccaagc 1440 ccctgtcccc tacgtcctac atgagcccga ccctgcccgc cctggactgg cagctgccgt 1500 cccactcagg cccgtatgag cttcggattg aggtgcagcc caagtcccac caccgagccc 1560 actacgagac ggagggcagc cggggggccg tgaaggcgtc ggccggagga caccccatcg 1620 tgcagctgca tggctacttg gagaatgagc cgctgatgct gcagcttttc attgggacgg 1680 cggacgaccg cctgctgcgc ccgcacgcct tctaccaggt gcaccgcatc acagggaaga 1740 ccgtgtccac caccagccac gaggctatcc tctccaacac caaagtcctg gagatcccac 1800 tcctgccgga gaacagcatg cgagccgtca ttgactgtgc cggaatcctg aaactcagaa 1860 actccgacat tgaacttcgg aaaggagaga cggacatcgg gaggaagaac acacgggtac 1920 ggctggtgtt ccgcgttcac gtcccgcaac ccagcggccg cacgctgtcc ctgcaggtgg 1980 cctccaaccc catcgaatgc tcccagcgct cagctcagga gctgcctctg gtggagaagc 2040 agagcacgga cagctatccg gtcgtgggcg ggaagaagat ggtcctgtct ggccacaact 2100 tcctgcagga ctccaaggtc attttcgtgg agaaagcccc agatggccac catgtctggg 2160 agatggaagc gaaaactgac cgggacctgt gcaagccgaa ttctctggtg gttgagatcc 2220 cgccatttcg gaatcagagg ataaccagcc ccgttcacgt cagtttctac gtctgcaacg 2280 ggaagagaaa gcgaagccag taccagcgtt tcacctacct tcccgccaac ggtaacgcca 2340 tctttctaac cgtaagccgt gaacatgagc gcgtggggtg ctttttctaa agacgcagaa 2400 acgacgtcgc cgtaaagcag cgtggcgtgt tgcacattta actgtgtgat gtcccgttag 2460 tgagaccgag ccatcgatgc cctgaaaagg aaaggaaaag ggaagcttcg gatgcatttt 2520 ccttgatccc tgttgggggt ggggggcggg ggttgcatac tcagatagtc acggttattt 2580 tgcttcttgc gaatgtataa cagccaaggg gaaaacatgg ctcttctgct ccaaaaaact 2640 gagggggtcc tggtgtgcat ttgcacccta aagctgctta cggtgaaaag gcaaataggt 2700 atagctattt tgcaggcacc tttaggaata aactttgctt tta 2743 <210> 2 <211> 4290 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aagcggctcg ggctgcggct ggctcagagt gccgcggggg gcgtggggcg gtgctgagga 60 gctgaagccg tggccagctc gactccggac agtccagcga gcagcacggc gggaaccggc 120 agccggagca gtcccggagc agaagcagca gcagcagcag cagccctcgc cgttcgcgga 180 gcgcagccga gccggccatg gcgttgtcga tgccgctgaa tgggctgaag gaggaggaca 240 aagagcccct catcgagctc ttcgtcaagg ctggcagtga tggtgaaagc ataggaaact 300 gccccttttc ccagaggctc ttcatgattc tttggctcaa aggagttgta tttagtgtga 360 cgactgttga cctgaaaagg aagccagcag acctgcagaa cttggctccc gggacccacc 420 caccatttat aactttcaac agtgaagtca aaacggatgt aaataagatt gaggaatttc 480 ttgaagaggt cttatgccct cccaagtact taaagctttc accaaaacac ccagaatcaa 540 atactgctgg aatggacatc tttgccaaat tctctgcata tatcaagaat tcaaggccag 600 aggctaatga agcactggag aggggtctcc tgaaaaccct gcagaaactg gatgaatatc 660 tgaattctcc tctccctgat gaaattgatg aaaatagtat ggaggacata aagttttcta 720 cacgtaaatt tctggatggc aatgaaatga cattagctga ttgcaacctg ctgcccaaac 780 tgcatattgt caaggtggtg gccaaaaaat atcgcaactt tgatattcca aaagaaatga 840 ctggcatctg gagataccta actaatgcat acagtaggga cgagttcacc aatacctgtc 900 ccagtgataa ggaggttgaa atagcatata gtgatgtagc caaaagactc accaagtaaa 960 atcgcgtttg taaaagagat gtcttcatgt cttcccctaa gaatacgctt ttcctaacag 1020 gctactcctt cctgtagagc agaaattgta ttttgcacga acatgcagtt attgaagatt 1080 aggatcaagg atagacaagg tatagtagtt atcttaaaat atacactcct aagcagtatt 1140 attttaaaat cctttaccct ggctacctcc cctacccggg ttcccctctc tttaatttgg 1200 agacactcca ccacaaactt ttcactttag aggtagcttg ccatctctca ggagccctca 1260 ccattgtgtc cattcactgt gtatagatgg cagaactttt gaggtgcaat gtttaattgt 1320 taaaaatagt agccacgact ttatcaggca gccccaaact ggtgcataat gcatggtaca 1380 agaaatattt atgtattttt tggaattttg taatatttag taggagtata tgaaaggatt 1440 gctactgtat cagaaatatt gtttcaattt agtctatcct ggatatgtac taacgaatat 1500 taccaccaga gaagagagct ttctacaaaa gtcactacag attttgctat attgctttgt 1560 agatagattt ttacttttgc ctaaaagcat ttatccttca taccaattgt aacatctgac 1620 accatgtaga agctaaaagt ttagagggag tgagcgtttt ctcaagacct tcctcaagca 1680 ttttatcttt agaagagaaa ctgatgggca cctgatactc tgtctaaata cgtttgttat 1740 atgtgttttg ccctgtgcca ttcatttgga actttattgc attctttatt ttaaaaagct 1800 tgtttttacg taatcataga gcttgctatt tgtacatctg ttgagcaaca ctacataact 1860 gatttttagt tgacttagct atagcagtac aatgattagt aatgtaaaaa ttaacacaga 1920 aattaaccta aggaatgaag ggtgggtttg tcaaaatatc aagtaaattt ttgtttctaa 1980 agtacattta atgtagatga cctaaagaat gcgttatcca tcctatataa aagaaagata 2040 aaacacaggt caccaatttt ctcatttcac cccatttacc ttgtatagag gattgttcat 2100 tcctttggga ctaagttata gttatggtga gtgtgtattt actgtagttt tgcctgatct 2160 cactcattgc acttcctgga gttaaatttt ccaacagcca tgttgaggaa tagcactctg 2220 catgtttttg ttttgttttt cggggttttt tttaattgaa gccctaaacc aggaattatt 2280 tgtgttctaa caggaggatg aacttgctga aaataaaact ttgctatgta tttactcttt 2340 tttaaaagac aaaagcaaaa ccagactttc tacgtactac tccaaagact gtgattgtga 2400 ctataataca tttttggtaa tttttttata cctaatttgt ataggaagtg ctatttctca 2460 taggctgttt cttgaaattt taagtttatt gctttaaaat ggcagtgttt ctcccacttt 2520 gatatgctaa catttagtaa gcactggctt tatgaaagcg gctttttata agtatactgc 2580 attttttgag cctatcatta attagcttag tatgaaagat aagaaaatct ccatgttgta 2640 tccatttggc tcaggaagat tctttgcctt acctttctta gaactcttta ttgcttatca 2700 aaagtttgag tacccgcttg gttttttttt ggtaattaaa tattgtatga tttatctggt 2760 tcaaggaaga tgcactattc agttatctat tgagaaatta ttttgcagtg gttttagtgg 2820 gtgaaaatgt cccatctgca ccagtacaca ggcaggcatt atcattcttc acctactttt 2880 taaatagtgg caacttggga ttctttctgg tgattctgaa ccttgcctca tagcttaaag 2940 tataaaaaaa gattcaagag cagtgaggtt tgttctttcc agtgaatggt ggactgagtg 3000 gtgcgaggtg gagggctaac aagaggaaag aactacattc ttcagaatac agtgatgaaa 3060 attcattttg aaactcaaat attttcattt tggatattct cctgttttta ttaaaccagt 3120 gattacacct ggccatccct ctaaatgttc taggaaggca tgtctattgt gattttgatg 3180 aagacagaat tatttttctc tgtagaaaca cagataccac tttatcaggg aagttagtca 3240 aatgaaatgg aaattggtaa atggacaaaa gctagctagt aaaaaggacg acccagcaac 3300 atgctttaac cccattgtat gtttgtggaa agagcatagt ttaacatctt gagaaatttg 3360 ggacataaag ttttcatggt agacagttca tgcagtatat gaattgacat aatggaaata 3420 atctgatttt atttttacaa ctaacatcca ttccccttca tttaaacacc ttttgtgttt 3480 tacttcagtg aggagattgg agtctgaatg gatctgtttt ccaagagatt ctgagaaatt 3540 tttgtattca gcagttggaa agctctctat tctagttgat aaaacttccc ttttttgatg 3600 tagatgcaga tattctatac agttctgttg tcttttacta ggactgtaaa cttttgtgat 3660 aaaattcaaa taagatttta tttctttgta attttggctt tcacaattta tctttaaatc 3720 cttgagcaat ctgtatacaa ttaagagatt tctgacattt attcttacac taaatggatc 3780 aactctagga tttaggcatg ttaacttctg ttgtgttttg aatctctcca gagttgcatg 3840 tagatagcat ttatttctgt gcccttaaac ccatttagaa aataactaca aagtaaaaat 3900 gtagaggaaa tagaaatgta ttttttcatg aacattttga tacaaatttc atcatttaat 3960 gattcaccaa tttcttgcat taatttgaat ttaagcattt aattcaaaga gaggggagca 4020 tccattattg gtacatgtgg gcttttaaaa actccatcct ttataaatag tcaaggtttg 4080 ggccacacaa agtatatttt tatcatggaa aaatttcaac tcctcaagcc gtaatgttga 4140 acagaattgg agtattttct ttataatttc ttgaacaggc aaatgaaagc ttattataga 4200 atgcatgtat tttcttttat ctttggaaca tcagcaccag tatattgctg gcagctattg 4260 tattaaaaaa taaagtatat tttcactatc 4290 <210> 3 <211> 3469 <212> DNA <213> Mouse <400> 3 atgccaaata ccagctttcc agtcccttcc aagtttccac tcggccctcc ggccgcagtc 60 tgcgggagcg gagaaacttt gcggcccgcg ccgccctccg gcggcaccat gaaggcggcc 120 gaggaagaac actacagtta tgtgtcccct agtgtcacct cgaccctgcc ccttcccaca 180 gcacactctg ccttgccagc agcatgccac gacctccaga cgtccacccc gggtatctca 240 gctgttcctt cagccaatca tccccccagt tacggagggg ctgtggacag cgggccttcg 300 ggatacttcc tgtcctctgg caacaccaga cccaacgggg ccccgactct ggagagtccg 360 agaatcgaga tcacctccta cctgggccta caccatggca gcggccagtt tttccacgac 420 gtggaggtgg aagacgtact tcctagctgc aagcgctcac cgtctacagc aaccctgcac 480 ctgcccagcc tggaagccta cagagacccc tcctgcctga gcccagccag cagtctctcc 540 tccagaagct gtaactctga ggcctcctcc tacgagtcca actactccta cccatacgcg 600 tccccccaga cctctccgtg gcagtcaccc tgcgtgtctc ccaagaccac ggacccggag 660 gagggttttc cccgaagcct gggtgcctgc cacctgctag gatcgcccag gcactcccca 720 tccacctctc ctcgggcaag catcacggag gagagctggc tcggtgcccg cggctcccgg 780 cccacgtccc cctgcaacaa gcgcaagtac agtctcaatg gccggcagcc ctcctgctca 840 ccccaccact cacccacacc atccccccat ggctcccctc gggtcagtgt gaccgaagat 900 acctggctcg gtaacaccac ccagtatacc agctctgcca ttgtggcagc catcaacgcc 960 ctgaccaccg atagcactct ggacctgggt gatggggtcc ctatcaagtc tcgaaagaca 1020 gcactggagc atgcgccctc tgtggccctc aaagtagagc cagctgggga agacctgggc 1080 accactccac ccacttctga cttcccaccc gaggagtaca ccttccagca ccttcggaag 1140 ggtgcctttt gcgagcagta tctgtcggtg ccacaggcct cgtatcagtg ggcgaagccc 1200 aagtctcttt ccccgacatc atatatgagc ccatccttgc ctgcccttga ctggcagctc 1260 ccgtcacatt ctggtccata cgagcttcgg atcgaggtgc agcccaagtc tcaccacagg 1320 gctcactatg agacggaagg cagccggggg gctgtgaagg cttcagctgg aggacacccc 1380 attgtgcagc tacacggtta cttggagaat gaacctctca cgctacagct gttcattggg 1440 acggctgacg accgcctgct gaggccccac gccttctacc aggtccaccg gatcacgggg 1500 aagactgtct ccaccaccag ccacgagatc atcctgtcca acaccaaagt cctggagatc 1560 ccgttgcttc cagaaaataa catgcgagcc atcatcgact gtgctgggat cctgaagctc 1620 agaaactctg atattgagct gaggaaaggg gagacagaca tcgggaggaa gaacaccagg 1680 gtgaggctgg tcttccgagt tcacatccca cagcccaatg gccggacgct gtctctccag 1740 gtggcctcga accctatcga gtgttcccag cggtcagccc aggagctgcc cctcgtggag 1800 aagcagagca cagacagcta cccagtcatc ggcgggaaga agatggtgct gtctggccat 1860 aactttctgc aagactccaa agtcattttc gtggagaagg ctccagatgg ccaccacgtc 1920 tgggagatgg aagcaaagac tgaccgggac ctgtgcaagc caaattccct ggtggttgag 1980 ataccacctt tccgcaacca gaggataacc agccccgccc aagtcagttt ctatgtctgc 2040 aacgggaaac ggaagagaag ccagtaccag cgtttcacgt accttcctgc caatggtaac 2100 tctgtctttc taaccttaag ctctgagagt gagctgagag gaggttttta ctgagcagcc 2160 ccccgaggct ataagaggat gttgttgtaa acaaaacaaa acaaaacaaa acatacctgt 2220 agcctcttca caccacgtga tagccctatt cacaagacca agtcgcccac cccctcaaag 2280 aaaagcgaag cctgggtgtg ttttcctgtg actggtgcat gctggggtca tcacttgctc 2340 gccttttgca aatacagcag cgcggccaac caagcagctc tgctgcgctc aggggctgat 2400 gcggtctggg ggtgtatatc taacctctgt gagtctttgg gttagaagaa agtatttgtc 2460 aacgcagttt tgtaagtagc ttcgaaaata agcctgccgt ggtcactggg gaacatacat 2520 gatgttgtcc tcatggtgac gcttctacac agcgtgcggt gtgtctccac tgaataatgc 2580 tgtcccctgg tgacgtgaga ctttcagatg gaagctcttc tgctcgagtt tactcattta 2640 gggaatggct tctttcattc agaagtgatc ggctcgcctt ttcaactttc tagggtgttt 2700 tatttacgaa aataccgttt ttaactgctc cccgccccgc aagcttctag aaaggtgtgt 2760 cccaggcgtc cagggtttcc tgtgtggtgc aggccattct cctgcagcag gatgtataaa 2820 cagagagcag agtcggttgt tatcctgagt tctattgtat tttgagtaag ctaggctatg 2880 tcaacaacct ttttaaattg ctactttttt ttttcctcta aaaacttaag atagtcatgt 2940 aatttaagag ggaagttata caataaatac tagccatgaa agcagccata ttgctatctt 3000 agtaaaatca aggtggtttt gttgttgtta ttttgttttg ttttttgttt tttaaggttt 3060 caaggttttt tgtttttgaa gtgtaaaggc atttggaaca gtttagacag tacgaaaagt 3120 tggtattaaa attctgaaac caattgtctt atcaggaaac ccctagaaat gccctttaaa 3180 aatgaggaca atagctttgt tgcattctca aacaaggaca tcagtgaaag ggcagcaact 3240 gtctgtgctg tgggtgaccc cagaacagcg gcccatcccc catcccgtct ctgctcttca 3300 gattatttca caggcctctt cctttcggga aataatgcac actctctctt acaaaaaaac 3360 caaacatttg gtcttttatt ttattttatt ttattttttg aaagtgcaat gattgtgtcc 3420 tacctatact tcaagcatgg ttgatctaag atttttgaaa ggtctaaac 3469 <210> 4 <211> 4061 <212> DNA <213> Mouse <400> 4 gcgcgcgagc gtgaggcggt gctgaggatc tgaggccacg ggcagccaga cgccgggact 60 gtccagcgaa cgagcaagcc agcgagtgag cgagcggcgg gaacccgagc cacagcagcc 120 ccggagccac agccgcagcc gccgtccgcg gagcccagcc caaccggcca tggcgctgtc 180 gatgcccctg aacgggctga aggaggagga caaagagccc ctcatcgagc tyttcgtcaa 240 ggccggaagt gatggtgaaa gcattggaaa ctgccccttt tcacagaggc tcttcatgat 300 cctttggctc aaaggagtcg tgttcagtgt cacaaccgtt gacctgaaaa ggaaacctgc 360 agatctacag aacttggctc ctgggaccca cccgccattt ataaccttca acagcgaagt 420 caagacggat gtgaataaga ttgaggaatt tctcgaagaa gtcttgtgcc cacccaagta 480 cctaaagctt tcaccaaagc acccagagtc gaacactgct ggaatggaca tctttgccaa 540 attctctgct tacatcaaga actcaagacc agaggctaat gaagcgctgg agagggggct 600 cttgaaaacg ctgcagaaac tggatgagta cctcaactct cccctccccg acgaaatcga 660 cgagaacagc atggaggaca tcaaattttc cacacgtcgg tttctggacg gcgatgagat 720 gacattagca gactgtaacc tgctgcccaa gctccacatt gtcaaggtgg tggccaaaaa 780 ataccgcaac tttgatattc ctaaaggaat gacaggcatc tggaggtacc tgacaaacgc 840 ctacagcagg gacgagttca ccaacacctg tcccagcgac aaggaggtgg aaatcgcgta 900 cagcgatgtc gccaagagac ttaccaagta gacagcactt tcgagagaga tgccttccga 960 tcccccgaga atccgctttc ctaacagact gctccgcctc ctaaagtaga agtgtatttt 1020 gcatgaacac acagttactc aagactagga gtaaggctag acagagtagg cctctccagt 1080 acacactcct gagcagtatt attctaaatt cttctaccca gcccacctac cctaccctgc 1140 cctgcccatc tgctgccctc cagtttggag gcacttcgcc acaagcgtgt cacccaagag 1200 gcagtttgct gtcactctgg agccccgacc atcacgtccc ttcactgtgt agatggcaga 1260 acttgaggtg ctatgttcca ccattagaaa agtcgcctgc gacatcagtg gaccccatgt 1320 tgctgtgtgc atggtatagg aacatttatg tactggggga gttgtaatat tgtgtaagga 1380 gtctggaagg attactactg tgtcagacgt gctgtttcag agtagtctgt tctggagtgt 1440 ctgagtgaga aggccacttc tgtagagaca ctggtttcta ggtagacatt taattttgac 1500 taaaatgtgt catttgtata aattgtaaca tccgatagat actacataga aaatgaagga 1560 ctgaggggtt aggaaggcat tttcaaaatg acaagagaag gttgggtggg gtctctgtct 1620 atcttgcctg ctgtgagggt atcacccagg cccacttatc catctacagc gagtagtatg 1680 gcggccttcc tttgtaacag gctttttctt ttctctcttc gtggtgcttg ggatggaacc 1740 cagggctttg tttaggcctg acaaggctct gcccctgagc tgtgccaagc ccacctccct 1800 ctgtgtacaa agctcctttc ttgggtgacc aacatcttcc tgtctttgag caaccaaggc 1860 cagcatgcga gccacccaga agttaattaa accaggttca tcgggagttt gctgaaatgt 1920 taagcatact ctgttctaga gagggagtga agaaggggcc atcttaaact cccgtgaggc 1980 ccaggcctcg tgctcctgcc ccacctccat gtgcatcaga ctgggtgaga ggtccttcac 2040 ttgtcttggg ataaattgta gttgtcttag tgagtgtgta tttccacagt tttgcctcat 2100 gtcagtcccc acgcggaagg atagccttct gtgttcttct tgcctttgtt ttgagacagg 2160 atgttactct gaaaccctgg ttggcctgga acctgatagg tgaccaagcc agcctcaaac 2220 tcgtggcagc cctcttgcat ttgcctcctg aattggagct aggattcagc ctgcaccacc 2280 acggctggct tgttttctca tctctaaaaa caaagtctaa gctaaaagtt gtttgcagtc 2340 taacaaaggg gaatgagctt tgtaaaacca gaggcccctc ccgcccagac aaaatggcct 2400 ttctcagtag tactccagag cctgctgtga ctttgtgtac tgtgctacat ttttttttag 2460 tgatcttttt aaaaacatgt tcaagaaatg ctctttctta aagtcgtctc actccacagt 2520 tcgctgcttt aaagtggcca tgctttcccc tacgctgtgc tgacacttaa aataaatgcc 2580 agctttatgg aaccattctg actcatggca gctccctttg aaaacttacc aatacttcac 2640 ctagcacggg ggtcagggag agcttgacag tggtccccgt ggctcaggga gatgccgtgg 2700 ccacagcttt caccccattg ctaatcaggg tgtgagcacc ctttatatgc aaactgggtg 2760 gtggtctgtc tggttccagt gggaggtacc atctcttctc ctttgagaaa tgcccctgca 2820 gtgtctccgt gggtggggtg gggttgagct ttgacgattc cagagaagag gtctctgttc 2880 ttctgtgagg ggccaagcga gggctcctgg gtcagagctg tactcacagc agagggtgtg 2940 cagacaggcc ttagtgggtg tgaggtgccc acgattgggt gtttattctc tttggcttcc 3000 taaattgcct cttggttgct cttgccgtct ctggatatcc aaggaaagtc tgtctaggtt 3060 ttggcaaggg tagaattgtt ttcctttata gagagacaca gttttgtcaa ggaagtgaaa 3120 acggattcga gattggcaga tggacagaag ctttaaaaag gaagagccca cagcaagcat 3180 tctgaccctg agccgagatc atggcttaca gtcttgaaat gtgaactgtg atgtctccat 3240 gcggctgatg caggccatgg gccgacatct acagagtggc tcctccctcg ctcttgctta 3300 gcctccgatc tgtataagcc ctccaccttg gagccgggat tttgagtgga gtctgcctat 3360 tttccagtgg atactaagaa actattaaac agtgggaagc ctggctgttt taagtaccgt 3420 cgcttccttt ttgatataga tacagacttt gaatacaatg cagtttcctc agtaacatta 3480 gctttcgtag cagtttatac cataagatgt tctgactggt ttgtacacta ggtgggtcag 3540 ctagtagaat ttaggcattt atacttttcc tgagttatac tcccagaacc tcctcagagt 3600 tgcatgtaga tagcatttat ttctgcatat ttaaaaaaaa aaaaacccat ttaggaaata 3660 tctacaaaga agaaatgaaa aatagtaatt attttttcat gaagattttg gtccacacct 3720 cattgagttg taatggattc tccagtttct tgagttggca ataatcaaca tttggtttgg 3780 agagcgagca tgagagagcg tttgttagtg aaactcacag acttctaaaa gttcattgct 3840 acagttatca aagtggggga aactaaaatt accttatcaa ggaaaaaata ttaagtcaca 3900 agccatatac atttagctcc caagccataa tgccgaacag ctttggagta tcgtacagaa 3960 agctcattac aaaatgcttg cgttttcttt tctctggaac atcaacacca gtgtattgct 4020 ggcagctatt gtattaaaaa aataaatata ttttcactat c 4061 <210> 5 <211> 716 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Pro Ser Thr Ser Phe Pro Val Pro Ser Lys Phe Pro Leu Gly Pro 1 5 10 15 Ala Ala Ala Val Phe Gly Arg Gly Glu Thr Leu Gly Pro Ala Pro Arg 20 25 30 Ala Gly Gly Thr Met Lys Ser Ala Glu Glu Glu His Tyr Gly Tyr Ala 35 40 45 Ser Ser Asn Val Ser Pro Ala Leu Pro Leu Pro Thr Ala His Ser Thr 50 55 60 Leu Pro Ala Pro Cys His Asn Leu Gln Thr Ser Thr Pro Gly Ile Ile 65 70 75 80 Pro Pro Ala Asp His Pro Ser Gly Tyr Gly Ala Ala Leu Asp Gly Gly 85 90 95 Pro Ala Gly Tyr Phe Leu Ser Ser Gly His Thr Arg Pro Asp Gly Ala 100 105 110 Pro Ala Leu Glu Ser Pro Arg Ile Glu Ile Thr Ser Cys Leu Gly Leu 115 120 125 Tyr His Asn Asn Asn Gln Phe Phe His Asp Val Glu Val Glu Asp Val 130 135 140 Leu Pro Ser Ser Lys Arg Ser Pro Ser Thr Ala Thr Leu Ser Leu Pro 145 150 155 160 Ser Leu Glu Ala Tyr Arg Asp Pro Ser Cys Leu Ser Pro Ala Ser Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Arg Ser Cys Asn Ser Glu Ala Ser Ser Tyr Glu Ser Asn 180 185 190 Tyr Ser Tyr Pro Tyr Ala Ser Pro Gln Thr Ser Pro Trp Gln Ser Pro 195 200 205 Cys Val Ser Pro Lys Thr Thr Asp Pro Glu Glu Gly Phe Pro Arg Gly 210 215 220 Leu Gly Ala Cys Thr Leu Leu Gly Ser Pro Gln His Ser Pro Ser Thr 225 230 235 240 Ser Pro Arg Ala Ser Val Thr Glu Glu Ser Trp Leu Gly Ala Arg Ser 245 250 255 Ser Arg Pro Ala Ser Pro Cys Asn Lys Arg Lys Tyr Ser Leu Asn Gly 260 265 270 Arg Gln Pro Pro Tyr Ser Pro His His Ser Pro Thr Pro Ser Pro His 275 280 285 Gly Ser Pro Arg Val Ser Val Thr Asp Asp Ser Trp Leu Gly Asn Thr 290 295 300 Thr Gln Tyr Thr Ser Ser Ala Ile Val Ala Ala Ile Asn Ala Leu Thr 305 310 315 320 Thr Asp Ser Ser Leu Asp Leu Gly Asp Gly Val Pro Val Lys Ser Arg 325 330 335 Lys Thr Thr Leu Glu Gln Pro Pro Ser Val Ala Leu Lys Val Glu Pro 340 345 350 Val Gly Glu Asp Leu Gly Ser Pro Pro Pro Pro Ala Asp Phe Ala Pro 355 360 365 Glu Asp Tyr Ser Ser Phe Gln His Ile Arg Lys Gly Gly Phe Cys Asp 370 375 380 Gln Tyr Leu Ala Val Pro Gln His Pro Tyr Gln Trp Ala Lys Pro Lys 385 390 395 400 Pro Leu Ser Pro Thr Ser Tyr Met Ser Pro Thr Leu Pro Ala Leu Asp 405 410 415 Trp Gln Leu Pro Ser His Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Arg Ile Glu Val 420 425 430 Gln Pro Lys Ser His His Arg Ala His Tyr Glu Thr Glu Gly Ser Arg 435 440 445 Gly Ala Val Lys Ala Ser Ala Gly Gly His Pro Ile Val Gln Leu His 450 455 460 Gly Tyr Leu Glu Asn Glu Pro Leu Met Leu Gln Leu Phe Ile Gly Thr 465 470 475 480 Ala Asp Asp Arg Leu Leu Arg Pro His Ala Phe Tyr Gln Val His Arg 485 490 495 Ile Thr Gly Lys Thr Val Ser Thr Thr Ser His Glu Ala Ile Leu Ser 500 505 510 Asn Thr Lys Val Leu Glu Ile Pro Leu Leu Pro Glu Asn Ser Met Arg 515 520 525 Ala Val Ile Asp Cys Ala Gly Ile Leu Lys Leu Arg Asn Ser Asp Ile 530 535 540 Glu Leu Arg Lys Gly Glu Thr Asp Ile Gly Arg Lys Asn Thr Arg Val 545 550 555 560 Arg Leu Val Phe Arg Val His Val Pro Gln Pro Ser Gly Arg Thr Leu 565 570 575 Ser Leu Gln Val Ala Ser Asn Pro Ile Glu Cys Ser Gln Arg Ser Ala 580 585 590 Gln Glu Leu Pro Leu Val Glu Lys Gln Ser Thr Asp Ser Tyr Pro Val 595 600 605 Val Gly Gly Lys Lys Met Val Leu Ser Gly His Asn Phe Leu Gln Asp 610 615 620 Ser Lys Val Ile Phe Val Glu Lys Ala Pro Asp Gly His His Val Trp 625 630 635 640 Glu Met Glu Ala Lys Thr Asp Arg Asp Leu Cys Lys Pro Asn Ser Leu 645 650 655 Val Val Glu Ile Pro Pro Phe Arg Asn Gln Arg Ile Thr Ser Pro Val 660 665 670 His Val Ser Phe Tyr Val Cys Asn Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Tyr 675 680 685 Gln Arg Phe Thr Tyr Leu Pro Ala Asn Gly Asn Ala Ile Phe Leu Thr 690 695 700 Val Ser Arg Glu His Glu Arg Val Gly Cys Phe Phe 705 710 715 <210> 6 <211> 253 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Leu Ser Met Pro Leu Asn Gly Leu Lys Glu Glu Asp Lys Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ile Glu Leu Phe Val Lys Ala Gly Ser Asp Gly Glu Ser Ile 20 25 30 Gly Asn Cys Pro Phe Ser Gln Arg Leu Phe Met Ile Leu Trp Leu Lys 35 40 45 Gly Val Val Phe Ser Val Thr Thr Val Asp Leu Lys Arg Lys Pro Ala 50 55 60 Asp Leu Gln Asn Leu Ala Pro Gly Thr His Pro Pro Phe Ile Thr Phe 65 70 75 80 Asn Ser Glu Val Lys Thr Asp Val Asn Lys Ile Glu Glu Phe Leu Glu 85 90 95 Glu Val Leu Cys Pro Pro Lys Tyr Leu Lys Leu Ser Pro Lys His Pro 100 105 110 Glu Ser Asn Thr Ala Gly Met Asp Ile Phe Ala Lys Phe Ser Ala Tyr 115 120 125 Ile Lys Asn Ser Arg Pro Glu Ala Asn Glu Ala Leu Glu Arg Gly Leu 130 135 140 Leu Lys Thr Leu Gln Lys Leu Asp Glu Tyr Leu Asn Ser Pro Leu Pro 145 150 155 160 Asp Glu Ile Asp Glu Asn Ser Met Glu Asp Ile Lys Phe Ser Thr Arg 165 170 175 Lys Phe Leu Asp Gly Asn Glu Met Thr Leu Ala Asp Cys Asn Leu Leu 180 185 190 Pro Lys Leu His Ile Val Lys Val Val Ala Lys Lys Tyr Arg Asn Phe 195 200 205 Asp Ile Pro Lys Glu Met Thr Gly Ile Trp Arg Tyr Leu Thr Asn Ala 210 215 220 Tyr Ser Arg Asp Glu Phe Thr Asn Thr Cys Pro Ser Asp Lys Glu Val 225 230 235 240 Glu Ile Ala Tyr Ser Asp Val Ala Lys Arg Leu Thr Lys 245 250 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:sense primer <400> 7 caattgcgga tcctaacaga atatcag 27 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:antisense primer <400> 8 caattggaaa tgagtctcag tcaatg 26 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer <400> 9 cccaagcttg gatgccaaat accagctttc 30 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer <400> 10 ggaattcgct gctcagtaaa aacctcc 27
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1aは、実施例７において、24穴プレートに
播いたRAW264細胞数と、GST/ODF融合タンパク質添加96
時間後の破骨細胞（TRAP positive MN cells）数との関
係を調べた結果を示す図である。当該図は、RAW264細胞
2.5×104個の場合での破骨細胞数(100％)に対する割合
(%)で表している。結果は3回の平均値である。また図1b
は、実施例７において、低密度培養条件下および高密度
培養条件下でのGST/ODF融合タンパク質添加96時間後のR
AW264細胞の形態を示す図である。左は低密度培養条件
下（2.5×104個のRAW264細胞を播いた際）でのRAW264細
胞である。右は高密度培養条件下（2 ×105個RAW264細
胞を播いた際）でのRAW264細胞である。
【図２】 図２aは、実施例８において、未処理RAW264
細胞とGST/ODF融合タンパク質添加24, 48, 72および96
時間後のRAW264細胞におけるNFATC1（タンパク質）、β
-actin（タンパク質）の発現をウエスタンブロット解析
によって調べた結果を示す図である。なお、0時間は未
処理RAW264細胞を指している。また図２bは、実施例８
において、10 cm培養ディッシュに播いたRAW264細胞数
と、GST/ODF融合タンパク質添加24時間後のNFATC1（タ
ンパク質）、β-actin（タンパク質）の出現との関係を
ウエスタンブロット解析によって調べた結果を示す図で
ある。
【図３】 図３は、実施例９において、RAW264細胞に加
えたサイクロスポリンA（CsA）濃度と、GST/ODF融合タ
ンパク質添加96時間後の破骨細胞（TRAP positive MN c
ells）数との関係を調べた結果を示す図である。図では
Control (CsA ：0 ng/ml)の場合での破骨細胞数（100
％）に対する割合（％）を示す。結果は3回の平均値で
ある。
【図４】 図４は、実施例９において、RAW264細胞に加
えたサイクロスポリンA（CsA）濃度と、GST/ODF融合タ
ンパク質添加72時間後のRAW264細胞におけるNFATC1（タ
ンパク質）、retinoblastoma（タンパク質）、β-actin
（タンパク質）の出現との関係をウエスタンブロット解
析によって調べた結果を示す図である。図中、totalと
は総タンパク質画分を、nuclearとは核画分を、cytopla
smとは細胞質画分を示す。
【図５】 図５aは、実施例１０において、ドキシサイ
クリン（図中DOXで示す）添加（DOX＋）、無添加（DOX
-）条件下で、RAW264細胞、RT3細胞およびRT3／NFATC1-
AS細胞におけるNFATC1（タンパク質）、β-actin（タン
パク質）の出現をウエスタンブロット解析によって調べ
た結果を示す図である。また図５bは、実施例１０にお
いて、ドキシサイクリン添加（DOX＋）、無添加（DOX
-）条件下で、RAW264細胞、RT3細胞およびRT3／NFATC1-
AS細胞から分化した破骨細胞（TRAPpositive MN cell
s）数を調べた結果を示す図である。図はドキシサイク
リン無添加（DOX-）における形質転換していないRAW264
細胞での破骨細胞数（100％）に対する割合（％）で示
す。結果は3回の平均値である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 33/50 Ｚ Ｃ０７Ｋ 16/18 // Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 林 浩司 大阪府大阪市此花区春日出中３丁目１番98 号 住友製薬株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 4B024 AA11 CA02 CA09 CA11 DA02 EA04 GA11 GA18 HA12 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ20 QQ42 QQ52 QR32 QR38 QR41 QR55 QR69 QR80 QR82 QS24 QS25 QS28 QS34 QS39 QX01 QX07 4C084 AA17 BA44 CA53 CA56 CA59 NA14 ZA962 ZC212 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 EA50 FA72

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１若しくは３に記載のNF-ATc i
    soform a遺伝子の塩基配列または配列番号２若しくは４
    に記載のChloride intracellular channel 4遺伝子の塩
    基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポ
    リヌクレオチド及び／または該ポリヌクレオチドに相補
    的なポリヌクレオチドからなる、破骨細胞の分化・活性
    化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の疾患マーカー。
  2. 【請求項２】 破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連し
    た骨代謝異常疾患の検出においてプローブまたはプライ
    マーとして使用される請求項１記載の疾患マーカー。
  3. 【請求項３】 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を
    含む、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝
    異常疾患の検出方法： （ａ）被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれ
    から転写された前記RNAに相補的なポリヌクレオチドと
    請求項１または２に記載の疾患マーカーとを結合させる
    工程、（ｂ）該疾患マーカーに特異的に結合した生体試
    料由来のRNAまたは該RNAから転写された相補的なポリヌ
    クレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する
    工程、（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、破骨細胞の
    分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の罹患を
    判断する工程。
  4. 【請求項４】 配列番号５に記載のNF-ATc isoform aの
    アミノ酸配列よりなるタンパク質、または配列番号６に
    記載のChloride intracellular channel 4のアミノ酸配
    列よりなるタンパク質を認識する抗体を有する、破骨細
    胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の疾
    患マーカー。
  5. 【請求項５】 破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連し
    た骨代謝異常疾患の検出においてプローブとして使用さ
    れる請求項４記載の疾患マーカー。
  6. 【請求項６】 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を
    含む、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝
    異常疾患の検出方法：（ａ）被験者の生体試料から調製
    されたタンパク質と請求項４または５に記載の疾患マー
    カーとを結合させる工程、（ｂ）該疾患マーカーに結合
    した生体試料由来のタンパク質を、上記疾患マーカーを
    指標として測定する工程、（ｃ）（ｂ）の測定結果に基
    づいて、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代
    謝異常疾患の罹患を判断する工程。
  7. 【請求項７】 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を
    含む、NF-ATc isoform a遺伝子またはChloride intrace
    llular channel 4遺伝子の発現を制御する物質のスクリ
    ーニング方法： (ａ) 被験物質とNF-ATc isoform a遺伝子またはChlorid
    e intracellular channel 4遺伝子を発現可能な細胞と
    を接触させる工程、(ｂ) 被験物質を接触させた細胞のN
    F-ATc isoform a遺伝子またはChloride intracellular
    channel 4遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物
    質を接触させない対照細胞の上記に対応する遺伝子の発
    現量と比較する工程、(ｃ) （ｂ）の比較結果に基づい
    て、NF-ATc isoform a遺伝子またはChloride intracell
    ular channel 4遺伝子の発現量を変動させる被験物質を
    選択する工程。
  8. 【請求項８】 請求項７のスクリーニング方法におい
    て、工程（ｃ）に代えて、下記の（ｃ）’：（ｃ）’．
    （ｂ）の比較結果に基づいて、NF-ATc isoform a遺伝子
    またはChloride intracellular channel 4遺伝子の発現
    量を減少させる被験物質を選択する工程、を用いる、NF
    -ATc isoform a遺伝子またはChloride intracellular c
    hannel 4遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング
    方法。
  9. 【請求項９】 破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連し
    た骨代謝異常疾患の改善または治療剤の有効成分を探索
    するための方法である、請求項８に記載のスクリーニン
    グ方法。
  10. 【請求項１０】 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）
    を含む、NF-ATc isoformaまたはChloride intracellula
    r channel 4の機能または活性を抑制する物質のスクリ
    ーニング方法： (ａ) 被験物質と、NF-ATc isoform aまたはChloride in
    tracellular channel 4を含む細胞または該細胞から調
    製した細胞画分とを接触させる工程、(ｂ) 被験物質を
    接触させた細胞またはその細胞画分のNF-ATc isoform a
    またはChloride intracellular channel 4由来の機能ま
    たは活性を測定し、該機能または活性を被験物質を接触
    させない対照細胞またはその細胞画分の上記NF-ATc iso
    form aまたはChloride intracellular channel 4の機能
    または活性と比較する工程、(ｃ)（ｂ）の比較結果に基
    づいて、上記細胞またはその細胞画分のNF-ATc isoform
    aまたはChloride intracellular channel 4の機能また
    は活性を抑制する被験物質を選択する工程。
  11. 【請求項１１】下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を
    含む、NF-ATc isoform aの機能または活性を抑制する物
    質のスクリーニング方法： (ａ) 被験物質と、NF-ATc isoform aを含みかつInterle
    ukin-2 遺伝子を発現可能な細胞または該細胞から調製
    した細胞画分とを接触させる工程、(ｂ) 被験物質を接
    触させた細胞またはその細胞画分のInterleukin-2 遺伝
    子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させな
    い対照細胞またはその細胞画分のInterleukin-2 遺伝子
    の発現量と比較する工程、(ｃ) (ｂ)の比較結果に基づ
    いて、上記細胞またはその細胞画分のInterleukin-2遺
    伝子の発現量を抑制する被験物質を選択する工程。
  12. 【請求項１２】 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）
    を含む、Chloride intracellular channel 4の機能また
    は活性を抑制する物質のスクリーニング方法： (ａ) 被験物質と、Chloride intracellular channel 4
    を含む細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触
    させる工程、(ｂ) 被験物質を接触させた細胞またはそ
    の細胞画分の塩化物イオンの膜透過活性を測定し、該活
    性を被験物質を接触させない対照細胞またはその細胞画
    分の塩化物イオンの膜透過活性と比較する工程、(ｃ)
    （ｂ）の比較結果に基づいて、上記細胞またはその細胞
    画分の塩化物イオンの膜透過活性を抑制する被験物質を
    選択する工程。
  13. 【請求項１３】破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連し
    た骨代謝異常疾患の改善または治療剤の有効成分を探索
    するための方法である、請求項１０乃至１２のいずれか
    に記載のスクリーニング方法。
  14. 【請求項１４】NF-ATc isoform a遺伝子またはChloride
    intracellular channel4遺伝子の発現を抑制する物質
    を有効成分とする破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連
    した骨代謝異常疾患の改善または治療剤。
  15. 【請求項１５】NF-ATc isoform a遺伝子またはChloride
    intracellular channel4遺伝子の発現を抑制する物質
    が請求項７乃至９のいずれかに記載のスクリーニング法
    により得られるものである、請求項１４記載の骨代謝異
    常疾患の改善または治療剤。
  16. 【請求項１６】 NF-ATc isoform aまたはChloride int
    racellular channel 4の機能または活性を抑制する物質
    を有効成分とする、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関
    連した骨代謝異常疾患の改善または治療剤。
  17. 【請求項１７】 NF-ATc isoform aまたはChloride int
    racellular channel 4の機能・活性抑制物質が、請求項
    １０乃至１３のいずれかに記載のスクリーニング法によ
    り得られるものである、請求項１６記載の骨代謝異常疾
    患の改善または治療剤。
JP2002136030A 2001-09-26 2002-05-10 骨代謝異常疾患マーカー及びその利用 Expired - Fee Related JP4120778B2 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002136030A JP4120778B2 (ja) 2001-09-26 2002-05-10 骨代謝異常疾患マーカー及びその利用
PCT/JP2002/009882 WO2003027284A1 (en) 2001-09-26 2002-09-25 Bone metablic disease markers and utilization thereof

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001294804 2001-09-26
JP2001-294804 2001-09-26
JP2002136030A JP4120778B2 (ja) 2001-09-26 2002-05-10 骨代謝異常疾患マーカー及びその利用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2003169687A true JP2003169687A (ja) 2003-06-17
JP4120778B2 JP4120778B2 (ja) 2008-07-16

Family

ID=26622982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002136030A Expired - Fee Related JP4120778B2 (ja) 2001-09-26 2002-05-10 骨代謝異常疾患マーカー及びその利用

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP4120778B2 (ja)
WO (1) WO2003027284A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008044378A1 (fr) * 2006-10-11 2008-04-17 Oriental Yeast Co., Ltd. Réactif contenant une protéine fusionnée de rankl soluble avec un marqueur d'épitope
JP2009525730A (ja) * 2006-02-13 2009-07-16 アレシア・バイオセラピューティクス・インコーポレーテッド 骨リモデリングのプロセスと関係があるポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列
US8741289B2 (en) 2009-10-06 2014-06-03 Alethia Biotherapeutics Inc. Siglec 15 antibodies in treating bone loss-related disease
JP2014230493A (ja) * 2013-05-28 2014-12-11 三菱レイヨン株式会社 間葉系幹細胞からの分化状態を識別する遺伝子群及び分化状態の評価方法
US9493562B2 (en) 2012-07-19 2016-11-15 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-Siglec-15 antibodies

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106918696B (zh) * 2015-12-25 2019-10-29 广州瑞博奥生物科技有限公司 一种检测骨代谢相关细胞因子的抗体芯片试剂盒

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9040246B2 (en) 2006-02-13 2015-05-26 Alethia Biotherapeutics Inc. Methods of making antibodies that bind polypeptides involved in the process of bone remodeling
JP2009525730A (ja) * 2006-02-13 2009-07-16 アレシア・バイオセラピューティクス・インコーポレーテッド 骨リモデリングのプロセスと関係があるポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列
US8431126B2 (en) 2006-02-13 2013-04-30 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies that bind polypeptides involved in the process of bone remodeling
US8540988B2 (en) 2006-02-13 2013-09-24 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies that bind polypeptides involved in the process of bone remodeling
US9695419B2 (en) 2006-02-13 2017-07-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Polynucleotides and polypeptide sequences involved in the process of bone remodeling
US9067984B2 (en) 2006-02-13 2015-06-30 Alethia Biotherapeutics Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind Siglec-15
WO2008044378A1 (fr) * 2006-10-11 2008-04-17 Oriental Yeast Co., Ltd. Réactif contenant une protéine fusionnée de rankl soluble avec un marqueur d'épitope
US9388242B2 (en) 2009-10-06 2016-07-12 Alethia Biotherapeutics Inc. Nucleic acids encoding anti-Siglec-15 antibodies
US8900579B2 (en) 2009-10-06 2014-12-02 Alethia Biotherapuetics Inc. Siglec-15 antibodies in treating bone loss-related disease
US9617337B2 (en) 2009-10-06 2017-04-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Siglec-15 antibodies in treating bone loss-related disease
US8741289B2 (en) 2009-10-06 2014-06-03 Alethia Biotherapeutics Inc. Siglec 15 antibodies in treating bone loss-related disease
US9493562B2 (en) 2012-07-19 2016-11-15 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-Siglec-15 antibodies
JP2014230493A (ja) * 2013-05-28 2014-12-11 三菱レイヨン株式会社 間葉系幹細胞からの分化状態を識別する遺伝子群及び分化状態の評価方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003027284A1 (en) 2003-04-03
JP4120778B2 (ja) 2008-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2808338T3 (da) Mutant calreticulin til diagnose af myeloide maligniteter
KR101828290B1 (ko) 자궁내막암 마커
US20110288034A1 (en) Methods of identifying adipocyte specific genes, the genes identified, and their uses
KR20010034436A (ko) 폐암 치료 및 진단용 화합물 및 이의 용법
CA2500472A1 (en) Genes and polypeptides relating to human pancreatic cancers
CA2655933A1 (en) Polynucleotides and polypeptide sequences involved in cancer
KR20110015409A (ko) 염증성 장 질환에 대한 유전자 발현 마커
CN110199032A (zh) 羟基类固醇17-β脱氢酶13(HSD17B13)变体及其用途
US20120115134A1 (en) Methods for diagnosis and prognosis of cancer
KR20110014979A (ko) 항바이러스 요법
EP2126566A2 (en) Metastasis specific splice variants of mena and uses thereof in diagnosis, prognosis and treatment of tumors
JP2005110602A (ja) アトピー性皮膚炎の疾患マーカー及びその利用
US6686147B1 (en) Cancer associated antigens and uses therefor
JPWO2003057874A1 (ja) 腎疾患の疾患マーカー及びその利用
JP2003169687A (ja) 骨代謝異常疾患マーカー及びその利用
WO2008038832A1 (fr) Agent thérapeutique, procédé de détection et kit de détection pour cancer du sein et cancer ovarien
US20060078913A1 (en) Compositions, splice variants and methods relating to cancer specific genes and proteins
JP2004187620A (ja) 腎疾患の疾患マーカーおよびその利用
US20030092898A1 (en) Compositions and methods relating to breast specific genes and proteins
JP2004135546A (ja) クローン病の疾患マーカー及びその利用
US20070032415A1 (en) Compositions, splice variants and methods relating to breast specific genes and proteins
US20030175715A1 (en) Compositions and methods relating to breast specific genes and proteins
JP2005000056A (ja) ホルモン依存性癌疾患マーカー及びその利用
KR101996141B1 (ko) Bcar4 엑손 4 또는 이를 포함하는 융합 유전자를 이용하는 종양 진단용 조성물
JP2004194534A (ja) 炎症性腸疾患疾患マーカーおよびその利用

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050510

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20050516

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20050516

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20050516

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070822

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20071018

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20071121

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080118

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20080326

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20080415

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110509

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees