JP2003169680A - 新規ラクトバチルス属細菌および該細菌に特異的なプライマーまたはプローブ、新規ラクトバチルス属細菌の同定方法および新規ラクトバチルス属細菌の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 イタリアンケーキであるパネトーネ独特の風
味、香り、食感、日もち性の良さを左右する元種中の微
生物である新菌種の提供および新菌種について菌種レベ
ルで特異的に同定できるプライマーの提供。 【解決手段】 特定の菌学的性質を有する新規ラクトバ
チルス属細菌であるラクトバチルス・アシディファリナ
リウスを見いだし、それにより課題を解決できた。新規
ラクトバチルス属細菌であるラクトバチルス・アシディ
ファリナリウスに特異的なプライマーであって、特定の
２種類の塩基配列を含むプライマーを作成し、培養する
ことなくパネトーネ元種中に本菌が存在することを迅
速、簡便に解析、同定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規ラクトバチルス
属細菌であるラクトバチルス・アシディファリナリウス
（Lactbacillus acidifarinarius）（受託番号 ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１８５７７）および本菌に特異的なプライマ
ー、新規ラクトバチルス属細菌の同定方法および新規ラ
クトバチルス属細菌の検出方法に関するもので、主とし
て世界的に有名なパネトーネ（イタリアンケーキ）の製
造に極めて有用なものである。

【０００２】

【従来の技術】世界的に有名なイタリアンケーキである
ところのパネトーネの製造は、古来、イタリアのミラノ
を中心とした地方で伝承的に引き継がれており、その根
源はアルプス山麓のコモ湖周辺であるといわれている。
その元種は不安定であり、伝統的な植え継ぎ方法で培養
されていて、その醗酵作用とケーキ独特の風味・食感・
長期間の日持ち等が良好であることの原因については明
らかでない。もちろんこの元種には何らかの微生物の作
用が関与し、醗酵作用とその独特の風味、食感、長期保
存性の原因をなしていると考えられている。

【０００３】この件に関しては、上記パネトーネ元種中
の微生物中特に重要な醗酵作用をするものの１つとし
て、サンフランシスコサワーパンの製造に関係があると
の報告が既になされているサッカロミセス・イグジグー
ス（Saccharomyces exiguus）がある（特公昭５８−５
８０７０号公報）。また、上記パネトーネ元種中に独特
の風味を与えるものとして乳酸菌であるところのラクト
バチルス・サンフランシスエンシス（Lactobacillus sa
nfranciscensis）が存在するという報告がある。この乳
酸菌はサンフランシスコサワーパンにおいても重要なも
のであり、Ｄｒ．スギハラ（Applied Microbiology ２
１、４６５〜４５９（１９７１））によってその微生物
的性質が詳しく報告されている。さらに舟橋はラクトバ
チルス・サンフランシスエンシスと生成乳酸の旋光性が
異なる乳酸菌を上記元種中に発見し、この乳酸菌につい
ては新菌種ラクトバチルス・コモエンシス（L. comoens
is）として報告している（特公平４−４８６９号公
報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、イタリ
アンケーキの特殊な味、香り、食感、日持ちの良さに関
与する微生物は上記のもののみではなく、他に何らかの
微生物の作用があると本発明者等は推察していた。そし
て本発明者等の研究の結果、その微生物が何であるかを
見出すことができた。それは乳酸菌の一種ではあるが、
未だに報告されていない乳酸菌であることが分かった。

【０００５】本発明の第１の目的は、上記のごとき経過
から、上記のサッカロミセス・イグジグース、ラクトバ
チルス・サンフランシスエンシス、ラクトバチルス・コ
モエンシスの他にイタリアンケーキであるところのパネ
トーネ独特の風味、香り、食感、日もち性の良さを左右
する元種中の微生物である新菌種を提供することであ
る。

【０００６】さらに、本発明の第２の目的は、見出した
新規ラクトバチルス属細菌について菌種レベルで特異的
に同定できるプライマーもしくは検知できるプローブを
合成し、これを用いて新規ラクトバチルス属細菌を迅
速、簡便に解析することができるようなプライマーまた
はプローブを提供することである。さらに、本発明の第
３の目的は、新規ラクトバチルス属細菌の同定方法を提
供することである。さらに、本発明の第４の目的は、新
規ラクトバチルス属細菌の検出方法に関するものであ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記パネト
ーネの元種に存在する微生物が何であるかを研究中、生
理・生化学的性状および１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の特異配
列により、これらのものの一つは新規ラクトバチルス属
細菌であることを見出し本発明を成すに至った。さらに
本発明者等は、新規ラクトバチルス属細菌であるところ
のラクトバチルス・アシディファリナリウスの１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子解析を行い、本菌に特異的な塩基配列に従
い合成した配列番号１および２のＤＮＡプライマーで本
菌を特異的に検出できることを見出し、本発明を成すに
至った。これを用いることで、生理・生化学的性状の確
認など煩雑な操作を行うことなく検体から抽出した本菌
由来のＤＮＡを使ったＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便
に新規ラクトバチルス属細菌の同定・解析を行う事が可
能となった。

【０００８】すなわち本発明の請求項１記載の発明は、
配列番号１または２で表される塩基配列または該塩基配
列に相補的な配列を有する新規ラクトバチルス属細菌で
あるところのラクトバチルス・アシディファリナリウス
（Lactobacillus acidifarinarius 受託番号 ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１８５７７）である。

【０００９】本発明の請求項２記載の発明は、請求項１
記載の新規ラクトバチルス属細菌において、下記の菌学
的性質を有することを特徴とする。 （１）グラム陽性 （２）桿菌 （３）運動性なし （４）無胞子 （５）通性嫌気性 （６）カタラーゼ陰性 （７）生育温度 １５〜３７℃ （８）生育ｐＨ 3.5〜8.0 （９）フラクトース、ガラクトース、グルコン酸ナトリ
ウム、グルコース、マルトース、D-リボース、D-キシロ
ース、D-アラビノースを資化してD(+) −乳酸、L(+)−
乳酸、エタノール及び炭酸ガスを生成する。 （10）細胞壁 L-Lys-D-Asp型 （11）ＧＣ含量 51.2−51.7 mol％

【００１０】本発明の請求項３記載の発明は、配列番号
1または２で表される塩基配列又は該塩基配列に相補的
な配列を有するラクトバチルス・アシディファリナリウ
スに特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブである。

【００１１】本発明の請求項４記載の発明は、検体に請
求項３記載のプライマーまたはプローブを加え、ＰＣＲ
法によりプライマーの伸長反応を標的とするヌクレオチ
ド配列の増殖を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行
う事を特徴とする請求項１記載の新規ラクトバチルス属
細菌の同定方法である。

【００１２】本発明の請求項５記載の発明は、請求項３
記載のプライマーまたはプローブを用いてＰＣＲ反応を
行う工程および該工程により増幅されたＤＮＡ断片を検
出する工程を含む請求項１記載の新規ラクトバチルス属
細菌の検出方法である。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における新規ラクトバチルス属細菌であるところ
のラクトバチルス・アシディファリナリウスの性質は以
下の通りである。 （１）形態的性質 ＭＹＰ培地での２４時間培養で２．０〜５．０×０．４
μｍの長桿菌で単一または連鎖状に存在する。胞子は形
成せず、非運動性で、グラム陽性である。ＭＹＰ培地の
組成は下記の通りである。 マルトース １０ｇ 酵母エキス １０ｇ ペプトン ５ｇ 肉エキス ２ｇ 酢酸ナトリウム3水和物 ２ｇ 硫酸マグネシウム ２００ｍｇ 硫酸マンガン １０ｍｇ 硫酸第一鉄 １０ｍｇ 塩化ナトリウム １０ｍｇ Tween 80 ０．２５ｇ 水 １０００ｍｌ １N HClでpH５．０に調整

【００１４】（２）培養的性質 (1)ＭＹＰ寒天平板培地 ＭＹＰ寒天培地はＭＹＰ培地１０００ｍｌにさらに寒天
12ｇを添加されてなる培地である。２５℃、４日間培養
で直径約１ｍｍまたはそれ以下の円形、金米糖状突起、
半透明の乳白色コロニーを形成する。 (2)ＭＹＰ培地（液体培地） ３０℃、２日培養で菌体が増殖して培地が白濁し、綿毛
状の沈殿を生ずる。 (3)ＭＹＰ寒天培地（穿刺培養） 穿刺によって一様に生育、表面にも生育する。

【００１５】（３）生理・生化学的性質 (1)生育温度 １５〜３７℃、４５℃では生育せず (2)生育ｐＨ域 ３．５〜８．０ (3)酸素との関係 通性嫌気性。酸素存在下でも嫌気的条件でも生育でき
る。 (4)生育必須物質 上記ＭＹＰ培地中、不飽和脂肪酸を必須要求する。 (5)糖類醗酵性 フラクトース、ガラクトース、グルコース、マルトー
ス、D-リボース、D-キシロース、D-アラビノース、グル
コン酸ナトリウムからは酸及びガスを生成する。しかし
セロビオース、ラクトース、マンノース、メレジトー
ス、メリビオース、ラフィノース、ラムノース、サリシ
ン、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マンニ
トール、でんぷんからは酸及びガスを生成しない。 (6)リトマスミルク：不変 (7)硝酸塩の還元：陰性 (8)ゼラチンを液化しない (9)脱窒反応：陰性 (10) ウレアーゼ：陰性 (11) カタラーゼ：陰性 (12) オキシダーゼ：陰性 (13) インドール生成：陰性 (14) 硫化水素：陰性 (15) でんぷんを加水分解しない (16) ＶＰ反応：陰性 (17) グルコース及びマルトースからの生成物 L(+)−乳酸、D(+)−乳酸、エタノール

【００１６】上記の菌はグラム陽性、無胞子、通性嫌気
性、カタラーゼ陰性の桿菌であり、糖から乳酸とエタノ
ールを生成することから、絶対ヘテロ醗酵型（obligato
ryheterofermentative)のラクトバチルス属に属するも
のと考えられる。

【００１７】またラクトバチルス・アシディファリナリ
ウスの分類学的位置を確認する為に、16SrRNA遺伝子の
塩基配列データと既知種の配列データとを比較し系統解
析を行った。系統樹の作成方法は次の通りである。まず
細菌から鋳型となるゲノムＤＮＡを抽出する。細菌から
ＤＮＡを抽出する方法は様々であるが、一般的には細胞
をリゾチームなどの細胞壁分解酵素で処理する方法やガ
ラスビーズによる物理的破壊方法、凍結融解を繰り返す
処理方法などが用いられる。また抽出用の試薬も市販さ
れている。しかしながらＰＣＲ法にてゲノムＤＮＡを鋳
型として用いる場合、ＤＮＡを必ずしもインタクトな状
態で抽出する必要はない。よって試料のコンタミネーシ
ョンの可能性が低く、操作が簡単で、迅速に行う事ので
きる方法を選ぶ事ができる。

【００１８】次にＰＣＲ法により１６ＳｒＲＮＡをコー
ドする標的ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲ法は基本的には反
対鎖とハイブリッド形成し、かつ鋳型ＤＮＡ上の標的領
域に隣接する２つのプライマーを利用して特定の遺伝子
配列を酵素合成する方法である。鋳型ＤＮＡの変成、ア
ニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸
長というサイクルを繰り返す事により特定の遺伝子配列
を含む断片を指数的に増幅する事ができる。

【００１９】次に、ＰＣＲ法で得られた増幅断片を精製
する。増幅したＤＮＡはスピンカラム（spin column）
を用いて精製する方法が好ましい。

【００２０】次に精製した増幅断片の塩基配列を決定す
る。ＤＮＡの塩基配列を決定する方法には、ジデオキシ
ヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼの合成反応を
塩基特異的に停止させるジデオキシ法と、塩基特異的な
化学修飾を用いる化学分解法がある。現在はＤＮＡシー
クエンス法の中でも操作が簡単でキット類も市販されて
いるジデオキシ法によって、ダイレクトにシークエンス
する方法が一般的であり、すでにＤＮＡシークエンサー
により自動化されている。

【００２１】最後に、増幅したＤＮＡの塩基配列に基づ
き分子進化系統樹を推定し、ラクトバチルス・アシディ
ファリナリウスの分類学的位置を特定する。分子進化系
統樹解析ソフトがインターネット等でも公開されており
利用する事が可能である（CLUSTAL W：DDBJ等）。

【００２２】以上ラクトバチルス・アシディファリナリ
ウスの分類学的位置を特定した結果、本菌は分類学上他
種とは別の独立したクラスターを形成しており、これま
で報告されているどの種にもあてはまらなかった。

【００２３】上記の理由から本発明者等は本菌を新規ラ
クトバチルス属細菌とみなし、ラクトバチルス・アシデ
ィファリナリウスと命名した。なおラクトバチルス・ア
シディファリナリウスの菌学的性質および新規ラクトバ
チルス属細菌として命名した準拠については以下に示す
通りである。同定の方法は「乳酸菌実験マニュアル」
（朝倉書店）に従った。また分類同定の基準としてバー
ジーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジーＶｏｌ．２（１９８６）を参照した。

【００２４】こうした特性を有するラクトバチルス・ア
シディファリナリウスは、例えばパン製造に用いられる
パネトーネ元種から公知の方法により単離する事ができ
る。すなわち元種を滅菌した生理食塩水にて段階的に希
釈し、ＭＹＰ寒天培地などの分離用寒天培地に混釈、培
養する方法である。上記により得られたラクトバチルス
・アシディファリナリウスはＦＥＲＭ Ｐ−１８５７７
として平成１３年１１月２日付けで、独立行政法人産業
技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託している。

【００２５】またラクトバチルス・アシディファリナリ
ウスに特異的なプライマーを作成するにあたり、そのタ
ーゲットには系統分類の指標として信頼性の高い１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子を用い、同定・解析にはＰＣＲ法などの
手段が必要となる為、ＲＮＡではなくＤＮＡを用いた。

【００２６】プライマー設計の際には本菌に近縁の菌の
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を収集し、塩基配列の整列
（アライメント）を実施した。アライメントにはインタ
ーネットで公開されているアライメントソフト（CLUSTA
L Ｗ：DDBJ）を利用する事ができる。その結果、大腸菌
のナンバリングシステムにおけるポジションでフォワー
ド：65‐79、リバース：250‐232にラクトバチルス・ア
シディファリナリウスに特異的な箇所があったので、こ
の領域をターゲットとしてＰＣＲプライマーを設計し
た。

【００２７】このようにして得られたプライマーである
配列表に示した配列番号１および２記載の塩基配列を有
するものはラクトバチルス・アシディファリナリウスに
特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、本菌の同
定、解析を行う為のプライマーとして使用する事ができ
る。

【００２８】上記のように設計したオリゴヌクレオチド
プライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機によ
り人工的に合成できる。その特異性は以下の実施例に示
す近縁種のＤＮＡに対するプライマーのバンド形成能を
指標として確認した。結果として特異性に問題はなかっ
た。

【００２９】本発明のプライマーは、このようにラクト
バチルス・アシディファリナリウスへの特異性を有する
ため、培地に形成したコロニーを釣菌、培養した菌体か
らDNAを抽出し、本プライマーとの反応性を調べる事に
よって菌の簡易同定を行う事ができる。例えばまず培養
液１ｍｌを遠心分離して得られるペレットから塩化ベン
ジル法などによってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡ
とする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合
わせ、増幅反応を行う事により、菌に特異的なDNA配列
（ＰＣＲ産物）を得る事ができる。このようにして得ら
れたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無により本菌
を同定する事ができる。

【００３０】また本発明のプライマーを用いれば培養を
行うことなく各種サワー種およびその他生地中における
本菌の同定を行う事が可能である。この場合は極少量の
サンプルを１．５ｍｌのエッペンチューブにとり、塩化
ベンジル法にて直接ＤＮＡを抽出、その後は上記と同様
の方法により本菌の同定を行う。

【００３１】

【実施例】以下、実施例により本発明の内容をさらに具
体的に説明するが、本発明の主旨を逸脱しない限り本発
明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。 （実施例１） 本菌の培養方法 培地には目的に応じて寒天培地及び液体培地が使用でき
る。ラクトバチルス・アシディファリナリウス菌体の培
養には、前述のＭＹＰ培地が最適である。酢酸ナトリウ
ム添加は生育の促進に有効である。また、硫酸マグネシ
ウム、硫酸第一鉄、塩化ナトリウムなどの無機塩類の添
加も生育促進に有効である。本菌は不飽和脂肪酸を必須
要求するので、オレイン酸、ツイーン８０などの添加が
必要である。培養温度は１５℃〜３７℃、好ましくは２
５℃〜３０℃で、ｐＨ３．５〜８．０、好ましくはｐＨ
４．０〜８．０である。具体的に本菌について実施例で
説明すれば、パネトーネ元種１ｇを滅菌した０．８５％
塩化ナトリウム水溶液５０ｍｌ中に懸濁した。その後段
階的に希釈を行い、シャーレに１ｍｌずつ採り、その後
溶解した寒天培地（１０ｐｐｍのシクロヘキシミドおよ
び１０ｐｐｍのアジ化ナトリウムを加えたもの）を流し
込み混和した。寒天が固まった後、シャーレを３０℃で
４〜５日間培養し形成したコロニーを分離した。分離し
た菌株の同定は本発明のラクトバチルス・アシディファ
リナリウス特異的プライマーを用いて行った。

【００３２】（実施例２） 本菌の系統解析 本菌の系統解析は次のように行った。塩化ベンジル法に
て本菌より抽出したＤＮＡより１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を
ＰＣＲ反応により増幅した。得られたＰＣＲ産物をPCR
Kleen spin Columns (BIO-RAD)を用いて精製した後、 １
２種のプライマーを用いてシークエンス反応を行った。
シークエンス反応は BigDye TerminatorCycle Sequenci
ng FS Ready Reaction Kit (ABI) を用いて行い、ABI P
RISM 310 Automatic sequencer を用いて塩基配列を読
み取った。各プライマーによって得られた配列データは
オーバーラップ部分をつなげて連続したＤＮＡ配列デー
タとした。データはCLUSTAL X（DDBJ）を用いて多重ア
ライメントを行い、この結果に基づいて系統樹を作成し
たところ新規ラクトバチルス属細菌であるとの結果が得
られた。得られた系統樹を図１に示す。

【００３３】（実施例３） ラクトバチルス・アシディファリナリウス特異的プライ
マーの作成 プライマー設計の際にはラクトバチルス・アシディファ
リナリウスおよび本菌の近縁菌であるL. brevis、L. pl
antarum、L. hilgardi、L. collinoides、L. vermiform
およびE. coliの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列をアライメ
ントし、ラクトバチルス・アシディファリナリウスに特
異的な領域をターゲットとしてＰＣＲプライマーを設計
した（表１に本菌種と近縁種とのアライメントの結果得
られた特異箇所を示す）。

【００３４】

【表１】

【００３５】その結果、表２に示したように配列番号１
および２の塩基配列を有するラクトバチルス・アシディ
ファリナリウスの特異的プライマーが設計できた。こう
して設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプ
ライマーの合成を行った。

【００３６】

【表２】

【００３７】プライマーの特異性の確認 上記のように設計したプライマーの特異性を、本菌およ
び近縁種であるL. brevis、L. collinoides、L. farcim
inus、L. casei、L. sanfranciscensis、L. plantaru
m、L. kimuchii、L. fermentumの基準株について、プラ
イマーのＰＣＲ反応によるバンド形成能を指標として確
認した。

【００３８】各菌の培養は以下のように行った。各菌は
MYPもしくはMRS培地（Difco）にて２４時間培養した。
培養液１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンチューブに採取後
遠心分離し、塩化ベンジル法にてＤＮＡを抽出した後で
ＰＣＲ反応を行った。

【００３９】ＰＣＲ反応は以下のように行った。10mM T
ris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、1.5mM MgCl2、200μM dNTP
mixture、1.2μM(PrimerF,PrimerRともに)、1.0u Taq D
NA polymerase(Takara EX)、D.W.19.7μl、10ng鋳型Ｄ
ＮＡを含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラー（DNA
Engine Model PTC-200,MJ RESERCH,INC）により、９４
℃２分の後、９４℃４５秒、６５℃２分、７２℃２分を
２９回サイクル、さらに７２℃１０分のＰＣＲ反応を行
った。

【００４０】上で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バ
ンドの有無によりプライマーと各菌株のＤＮＡとの結合
能を確認してプライマーの特異性を判定した。１％Agar
oseLO3（宝酒造株式会社製）でミューピットにより１０
０Ｖ３０分間電気泳動し、Ethidium Bromideで染色後、
ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果プライマー
はラクトバチルス・アシディファリナリウスにのみ特異
的にバンドを形成した。結果をまとめて表３に示す。

【００４１】

【表３】

【００４２】（実施例４） 特異的プライマーによるラクトバチルス・アシディファ
リナリウスの同定 本発明のプライマーは、このようにラクトバチルス・ア
シディファリナリウスへの特異性を有するため、これを
用いて分離した菌の菌種同定およびパネトーネ元種中の
ラクトバチルス・アシディファリナリウスの存在を迅速
に確認した。まず培養菌体またはごく少量のパネトーネ
元種サンプルから塩化ベンジル法によってＤＮＡを抽出
し、これを鋳型ＤＮＡとした。この鋳型ＤＮＡに本発明
のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより
本菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得た。この
ようにして得られたＤＮＡを電気泳動した結果、バンド
が形成されており、培養物中でのラクトバチルス・アシ
ディファリナリウスを同定する事ができた。

【００４３】各菌の特異的プライマーを用いたパネトー
ネ元種中に存在する菌の調査 国内３箇所で使用されているパネトーネ元種について菌
の調査を行った。調査はL. brevis、L. farciminus、L.
casei、L. sanfranciscensis、L. plantarum、L. kimu
chii、L. fermentumおよび本菌それぞれの特異的プライ
マーを用いて、ＰＣＲ法により各菌の存在を調査した。
その結果、表４に示すように、パネトーネ元種３種類と
もにL.sanfranciscensisおよびL. acidifarinariusの特
異的プライマーを使用した場合のみでバンドが認めら
れ、この２種類の菌が複数のパネトーネ元種中に存在す
ることが明らかとなった。

【００４４】

【表４】

【００４５】（実施例５） 新規ラクトバチルス属細菌であるラクトバチルス・アシ
ディファリナリウスを添加したパネトーネの製造 酵母であるサッカロミセス・イグジグース、乳酸菌であ
るラクトバチルス・サンフランシスコおよびラクトバチ
ルス・コモエンシスを含む小麦粉生地に、別に培養して
おいたラクトバチルス・アシディファリナリウスを添加
して元種とした。この元種を醗酵させ、その他原料を添
加、成形、醗酵、焼成、冷却工程を経てパネトーネを製
造した。その結果、保存性が良く、風味および食感に優
れたパネトーネが製造できた。

【００４６】

【発明の効果】本発明の請求項１記載のラクトバチルス
・アシディファリナリウスは、イタリアンケーキである
ところのパネトーネ元種中から分離・発見された新規ラ
クトバチルス属細菌である。本研究の結果、パネトーネ
元種中には舟橋らが報告したサッカロミセス・イグジグ
ース、ラクトバチルス・サンフランシスコ、ラクトバチ
ルス・コモエンシス３菌種だけでなく、本発明のラクト
バチルス・アシディファリナリウスを含めた計４種類の
微生物が存在することにより、パネトーネ独特の風味、
食感と長期間の日持ち性が生ずるものであることがわか
った。これまで従来のイタリア北部の伝承的な秘法によ
って作られていたパネトーネが、本発明のラクトバチル
ス・アシディファリナリウスの利用により広く世界の国
々で作られるようになるという段階に来たことは、本菌
の持つ大きな効果ということができる。

【００４７】本発明の請求項２記載のラクトバチルス・
アシディファリナリウスは、請求項１記載の新規ラクト
バチルス属細菌において下記の菌学的性質を有すること
を特徴とするものであり、これら性質により他の菌と区
別できるという顕著な効果を奏する。 （１）グラム陽性 （２）桿菌 （３）運動性なし （４）無胞子 （５）通性嫌気性 （６）カタラーゼ陰性 （７）生育温度 １５〜３７℃ （８）生育ｐＨ ３．５〜８．０ （９）フラクトース、ガラクトース、グルコン酸ナトリ
ウム、グルコース、マルトース、D-リボース、D-キシロ
ース、D-アラビノースを資化してD(+)−乳酸、L(+)−乳
酸、エタノール及び炭酸ガスを生成する。 （10）細胞壁 L-Lys-D-Asp型 （11）ＧＣ含量 51.2−51.7 mol％

【００４８】また本発明の請求項３記載の発明は、配列
番号１または２で表される塩基配列または該塩基配列に
相補的な配列を有する新規ラクトバチルス属細菌である
ところのラクトバチルス・アシディファリナリウスに特
異的なＤＮＡプライマーまたはプローブである。本菌特
異的プライマーまたはプローブを作成したことにより、
生理・生化学的性状の確認など煩雑な操作を行うことな
く検体から抽出した本菌由来のＤＮＡのＰＣＲ反応によ
り、培養液中、元種および生地中に本菌が存在するかど
うかが迅速、簡便かつ高精度に調査できるようになっ
た。本発明のプライマーまたはプローブは、今後様々な
サワー種を調査するにあたり大変有用であるということ
ができる。

【００４９】本発明の請求項４記載の発明は、検体に請
求項３記載のプライマーまたはプローブを加え、ＰＣＲ
法によりプライマーの伸長反応を標的とするヌクレオチ
ド配列の増殖を行い、そのヌクレオチド配列の検出を行
う請求項１記載の新規ラクトバチルス属細菌の同定方法
であり、迅速、簡便かつ高精度に本菌を同定できるとい
う顕著な効果を奏する。

【００５０】本発明の請求項５記載の発明は、請求項３
記載のプライマーまたはプローブを用いてＰＣＲ反応を
行う工程および該工程により増幅したＤＮＡ断片を検出
する工程を含む請求項１記載の新規ラクトバチルス属細
菌の検出方法であり、迅速、簡便かつ高精度に本菌を同
定できるという顕著な効果を奏する。

【００５１】

【配列表】 〈110〉 株式会社ヤクルト本社（KABUSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA ） 株式会社コモ（KABUSHIKI KAISHA COMO) 〈120〉 new species of bacteria and primer for them 〈130〉 COMO２００１０１ 〈160〉 2 〈210〉 1 〈211〉 19 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 1 aacgagttcc cgttgattg 〈210〉 2 〈211〉 19 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 2 tagctaatgc gccgcggaa

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の新規ラクトバチルス属細菌の系統樹を
示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者 森田 寛人 東京都世田谷区桜丘１丁目１番１号 東京 農業大学菌株保存室内 (72)発明者 渡辺 幸一 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 丸山 佳美 愛知県小牧市大字村中字下之坪505−１ 株式会社コモ内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 CA20 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ41 QQ42 QR32 QR56 QR62 QS16 QS25 QS34 4B065 AA30X AA30Y CA46

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１または２で表される塩基配列
   または該塩基配列に相補的な配列を有するラクトバチル
   ス・アシディファリナリウス（Lactobacillus acidifar
   inarius）。
2. 【請求項２】 下記の菌学的性質を有することを特徴と
   する請求項１記載の新規ラクトバチルス属細菌。 （１）グラム陽性 （２）桿菌 （３）運動性なし （４）無胞子 （５）通性嫌気性 （６）カタラーゼ陰性 （７）生育温度 １５〜３７℃ （８）生育ｐＨ ３．５〜８．０ （９）フラクトース、ガラクトース、グルコン酸ナトリ
   ウム、グルコース、マルトース、D-リボース、D-キシロ
   ース、D-アラビノースを資化してD(+)−乳酸、L(+)−乳
   酸、エタノール及び炭酸ガスを生成する。 （10）細胞壁 L-Lys-D-Asp型 （11）ＧＣ含量 ５１．２−５１．７ｍｏｌ％
3. 【請求項３】 配列番号１または２で表される塩基配列
   又は該塩基配列に相補的な配列を有するラクトバチルス
   ・アシディファリナリウスに特異的なＤＮＡプライマー
   またはプローブ。
4. 【請求項４】 検体に請求項３記載のプライマーまたは
   プローブを加え、ＰＣＲ法によりプライマーの伸長反応
   を標的とするヌクレオチド配列の増殖を行い、そのヌク
   レオチド配列の検出を行う事を特徴とする請求項１記載
   の新規ラクトバチルス属細菌の同定方法。
5. 【請求項５】 請求項３記載のプライマーまたはプロー
   ブを用いてＰＣＲ反応を行う工程および該工程により増
   幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含む請求項１記載
   の新規ラクトバチルス属細菌の検出方法。