JP2003024077A - ウイルス検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ウイルス病において、臨床状態をよく反映する
ウイルス検出法及びそれを用いたウイルス感染の診断法
を提供する。 【解決手段】ウイルスを含む被検試料を、ウイルス分離
用培養細胞に接触した後、該細胞に対してin situ ハイ
ブリダイゼーションを行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はウイルス検出法に関
する。より詳細には本発明は生体試料中に生きた状態で
存在するウイルスを特異的に検出することのできるウイ
ルス検出法に関する。さらに本発明は、当該方法を利用
したウイルス感染の診断方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ウイルス病の診断を確実に行うこと、又
未知の流行病を新しいウイルス病として同定すること
は、当該ウイルス病の地域分布と流行時期を知り、当該
疾患に対する予防と治療対策を立てる上で重要なことで
ある。しかも、ウイルス病は速やかにしかも正確に診断
されないと、適切な対策処理が手遅れとなることが多
い。

【０００３】ウイルス病の診断方法は、現在、汎用法と
して大きく３つの方法に分けられる。すなわち、患者
血清中のウイルス抗体を検出する方法（血清抗体診
断）、患者の組織や生体試料中のウイルスを直接検出
する方法、ウイルス分離である。

【０００４】血清抗体診断は、抗体保有状況の調査や入
院症例などに行われる方法である。臨床症例では、急性
期と回復期の少なくとも１〜２週間の間隔で採取したペ
ア血清で４倍以上の上昇を認めた場合に陽性として判断
されるので、通常は確認のための検査となる。当該方法
による検査は、急性期にすでに高い抗体価を示したり、
ウイルスの型によっては抗体価の上昇が見られない症例
があるという問題が指摘されている。また、当該方法
は、通常ワクチン株について実施されているために、ワ
クチン接種者や流行ウイルス株の種類によっては、判断
しにくい結果を示す可能性も指摘されている。

【０００５】臨床検体中のウイルスを直接検出する方法
としては、例えば検体中に存在するウイルス抗原を蛍光
等で標識した抗体と反応させて検出する方法が挙げられ
る。当該方法は２〜３時間程度で結果が得られるという
利点はあるが、検体中の夾雑物質との非特異反応による
偽陽性反応の可能性や検体中に一定以上のウイルス抗原
がないと検出できないという検出感度の問題が指摘され
ている。また最近では、生体試料から、生体に潜在して
いるウイルス核酸やｍＲＮＡの存在を証明して診断する
方法が開発されている。当該方法によると、ＰＣＲ法や
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用することによって生体試料中に微
量存在するウイルス核酸でも高感度に検出できるが、こ
の場合検査結果の取得に１日以上要する。かかるウイル
ス核酸の検出法は、生体中にＤＮＡが比較的安定した状
態で存在しているような慢性ウイルス感染の診断には有
効な方法であり、レトロウイルスのプロウイルスＤＮＡ
やヘルペスウイルス、アデノウイルス、Ｂ型肝炎ウイル
スのＤＮＡなどの検出に適しているが、急性ウイルス感
染症の診断には不向きである。また、このような方法で
検体中のウイルスを直接測定する方法は、生きたウイル
スと失活したウイルスとの区別なく検出可能な方法であ
る。

【０００６】ウイルス分離は、ウイルス病を確定診断す
るために極めて重要な方法である。しかし、症状の慢性
期やそれ以後はウイルスは減少しつつあるのでウイルス
分離が困難となる場合が多い。従って、ウイルス分離す
るためには、発症後できるだけ早期に患者から被検材料
を採取する必要がある。ウイルス分離及び同定は、通常
ウイルスを含む生体試料とウイルス分離用細胞とを接触
させて、該細胞へのウイルス感染が成立した後に行われ
る。通常感染成立の有無は細胞変性効果（cytopathic e
ffect:ＣＰＥ）で判定されるが、細胞変性効果が得られ
るまで、通常は３〜４日間、特にサイトメガロウイル
ス、アデノウイルスまたは風疹ウイルスの場合１週間程
度かかるといわれている（医・薬科ウィルス学 医薬ジ
ャーナル社１９９０）。また、ウイルスと分離用細胞の
関係において、必ずしも細胞変性効果が認められない場
合があることも指摘されている。なお、ウイルス分離し
た後、特異的抗血清を用いた中和試験、血球凝集抑制試
験、血球吸着抑制試験、蛍光抗体法などを利用してウイ
ルスが同定される。

【０００７】このようなウイルス病の診断方法におい
て、の血清抗体診断は、ウイルスの感染の有無やウイ
ルスの同定には有用であるが、治癒後も血清中に抗体が
残るため、他者への感染リスクの判断や疾患が治癒した
かどうかを判断するのには適していない。またの生体
試料中のウイルスを直接検出する方法は失活して感染力
のないウイルスまでも検出してしまうため、他者への感
染リスクの判断に不向きである。これに対してのウイ
ルス分離法は、生きたウイルスを特異的に検出できる方
法であるが、検出に時間がかかるという問題がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】このように従来のウイ
ルス病の診断方法は、ウイルスが感染力を失って死活し
た場合でも検出されることがあるため、必ずしも臨床状
態が的確に反映されているとはいえないという問題があ
る。本発明は、診断結果と実際の臨床状態との間にある
格差を解消することを目的とするものである。

【０００９】具体的には本発明の目的は、ウイルス病に
関して、患者の臨床状態を迅速にしかも的確に反映する
ことのできるウイルス検出法を提供することである。当
該本発明のウイルス検出法は、ウイルス感染症の診断及
び治療に有効であるだけでなく、他者への感染のリスク
の予測、それによる院内感染の防止、治療効果の追跡に
よる現行処置の適否判断や更なる治療対策の検討が可能
となる。

【００１０】

【発明を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
の解決を目的として種々検討していたところ、ウイルス
に感染した患者の生体試料をウイルス分離用細胞に接触
させ、次いで該細胞に対してin situ ハイブリダイゼー
ションを行うことにより、生体試料中に生きた状態で存
在するウイルスを迅速にしかも特異的に検出することが
できることを見出し、これによって得られた結果が患者
の臨床状態をより的確に反映したものであることを確認
した。本発明は、かかる知見に基づいて開発されたもの
である。

【００１１】すなわち、本発明は下記（１）〜（４）に
掲げるウイルス検出法である： （１） ウイルスを含み得る被検試料をウイルス分離用
細胞に接触させ、次いで得られた細胞に対してin situ
ハイブリダイゼーションを行うことを特徴とするウイル
ス検出法。 （２）被検試料が、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい
液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液（血清、血漿）、
髄液、唾液、尿、汗、精液または組織である（１）記載
のウイルス法。 （３）ウイルスを含み得る被検試料をウイルス分離用細
胞に１５〜３７℃で１時間程度接触させた後に、in sit
uハイブリダーゼーションを行うことを特徴とする
（１）または（２）に記載のウイルス検出法。 （４）検出対象のウイルスが、アデノウイルス、ヘルペ
ス、ムンプス、サイトメガロウイルス、水痘・帯状疱疹
ウイルス、ＥＢウイルス、エンテロウイルス、インフル
エンザウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス及び
ＨＩＶよりなる群から選択される少なくとも１種である
（１）乃至（３）のいずれかに記載のウイルス検出法。

【００１２】さらに本発明は下記に掲げるウイルス感染
の診断方法である： （５）（１）乃至（４）のいずれかに記載のウイルス検
出法を用いて、細胞中のウイルス核酸の存在の有無を判
定することを特徴とするウイルス感染の診断方法。

【００１３】なお、当該診断方法には、ウイルス感染成
立を診断する方法だけでなく、ウイルス感染の経過や治
療経過を診断する方法もまた含まれる。

【００１４】

【発明の実施態様】本発明のウイルス検出法は、ウイル
スを含み得る被検試料をウイルス分離用細胞に接触さ
せ、得られた細胞に対してin situハイブリダイゼーシ
ョンを行うことを特徴とするものである。

【００１５】本発明のウイルス検出法を操作順に説明す
れば下記の通りである。 （１）被検試料を採取する。

【００１６】本発明で用いられる被検材料は、ウイルス
感染によってウイルスが存在しえる生体試料であれば特
に制限されることなく任意に使用することができる。具
体的には、鼻汁、粘膜ぬぐい液（例えば鼻腔ぬぐい液、
眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液等）、喀痰、糞便、血液
（血清、血漿）、髄液、唾液、尿、汗、精液等の各種体
液、または各種組織を例示することができる。

【００１７】被検体は対象とする被験者から、例えば滅
菌綿棒などの滅菌器具及び容器を用いることにより無菌
的に採取することが好ましい。得られた被検体は、採取
後、なるべく速やかにウイルス分離用細胞に接種するこ
とが好ましいが、RPMI-1640、HEPESなどの培養液に浮遊
させることによって室温で１〜２日間保存することが可
能である。

【００１８】（２）採取試料をウイルス分離用細胞に接
触させる。

【００１９】本発明においてウイルス分離用細胞は、慣
用のウイルス分離において使用される公知の分離用細胞
を任意に使用することができる。従って、ウイルス分離
と同様に、検出対象とするウイルスに対して感受性のあ
る細胞を選択することが好ましい。通常、ウイルス分離
用細胞として株化された培養細胞（継代培養細胞）また
は初代培養細胞が使用されており、本発明においてもこ
れらの細胞の中から、検出対象のウイルスの種類に応じ
て適宜選択して用いることができる。なお、一例として
株化された培養細胞の例を表１に、初代培養細胞の例を
表２に、それぞれ生育ウイルスとともに示す。

【００２０】

【表１】

【００２１】

【表２】

【００２２】生体試料（被検試料）は、採取後、なるべ
く速やかに分離用細胞に接種することが好ましい。細胞
への試料の接種方法は、生体試料が細胞と接触するよう
な方法であれば特に制限されず、慣用方法が任意に使用
できる。

【００２３】具体的には分離用細胞は、生体試料と接触
した状態で１５〜３７℃程度の条件下で培養することが
好ましい。培養方法は特に制限されないが、好ましくは
炭酸ガス環境下で行うことが好ましい。接触処理は１〜
数時間程度で行うことができる。勿論、長時間をかけて
接触処理することもできるが、本発明の方法によれば、
ウイルス検出を迅速に行うという観点から１時間程度の
接触処理で十分である。

【００２４】接触処理後、細胞と被検試料とを分離して
被検試料を除去する。この場合、次工程における検出に
おいて被検試料中に存在するウイルスや夾雑物質による
検出誤差を回避するために、回収した細胞を１〜数回洗
浄することが好ましい。具体的には、被検試料を除去し
た後、ＰＢＳにて分離用細胞を１〜数回洗浄する。

【００２５】（３）得られたウイルス接種細胞に対して
in situハイブリダイゼーションを行う 本発明においてin situ ハイブリダイゼーションは、一
般的な方法を用いることができる（実験医学別冊 新遺
伝子工学ハンドブック 羊土社発行 1996年、第202〜209
など）。本発明において当該方法は大まかに下記の３つ
のステップを包含することができる。

【００２６】 ウイルス接種細胞の調製 in situ ハイブリダイゼーションを行う対象物である試
料、すなわちウイルス接種細胞中に存在するウイルス核
酸を固定化するステップである。具体的には、まず上記
で調製したウイルス接種細胞細胞を乾燥し、次いで常法
に従って固定化することによって実施される。細胞の固
定化は、具体的には細胞をスライドグラス上にのせて風
乾する方法、冷アセトン処理、冷パラホルムアルデヒド
／ＰＢＳ処理などを例示することができる。例えば、冷
パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ処理を例示すると、まず
細胞を乾燥させた後、氷冷したパラホルムアルデヒド／
ＰＢＳで固定処理し、次いで、固定化した標本を３０％
スクロース／ＰＢＳ溶液に移して４℃で２〜４時間ゆっ
くり振盪してパラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液から該
溶液に置換することによって実施することができる。

【００２７】当該細胞固定化処理によって、該細胞中に
存在し得るウイルスの遺伝子またはｍＲＮＡをそれが存
在する位置に固定することができる。

【００２８】 標識プローブの調製 標的ウイルスの遺伝子（ＤＮＡ）またはｍＲＮＡに特異
的な相補配列を、該遺伝子またはｍＲＮＡの検出用プロ
ーブとして調製するステップである。プローブとして用
いる核酸配列はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよ
く、また化学的に合成されたものであっても生化学的に
合成されたものであってもよい。また生化学的合成方法
として適当なベクターに組み込んで増幅することによっ
て調製することもできる。なお、当該プローブは、検出
が容易なように、当業界に使用される任意の方法に従っ
てＲＩ、酵素、蛍光色素などで標識されて使用される。
なお、ここで採用されるＲＩ、酵素、蛍光色素は、当業
界で用られる任意のものを検出手法に応じて適宜選択す
ることができる。

【００２９】具体的な標識物質として、³Ｈ、¹⁴Ｃ等の
放射性同位元素；アルカリホスファターゼ、パーオキシ
ダーゼ（ＰＯＸ）、マイクロパーオキシダーゼ、キモト
リプシノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グリセ
ロアルデヒド−３−リン酸脱水酵素、アミラーゼ、ホス
ホリラーゼ、Ｄ−ナーゼ、Ｐ−ナーゼなどの酵素；フル
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメ
チルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の蛍
光物質；及び１Ｎ−（2,2,6,6−テトラメチル-1-オキシ
ル-4-ピペリジル）−５Ｎ−（アスパルテート）−２，
４−ジニトロベンゼン（ＴＯＰＡ）、染料ゾル、金属ゾ
ル、ラテックス粒子等が例示される。これらの標識物質
による標識方法は、自体公知の方法に従って行うことが
できる。好ましくは、蛍光物質標識プローブ、ジゴキシ
ゲニンとビオチン標識ＤＮＡプローブ（蛍光検出法）、
ジゴキシゲニンとビオチン標識ＤＮＡプローブ（酵素標
識抗体法）などの非放射性標識プローブである。これら
のプローブによれば、細胞内のＤＮＡ又はｍＲＮＡにハ
イブリダイズした標識プローブを直接的に見ることが可
能である。更に、標識剤として異なる発色物質を用いて
もよく、これによって同時多色分析を行うことができ、
複数の遺伝子あるいはｍＲＮＡを見ることが可能であ
る。

【００３０】一例を挙げると下記の方法によって標識プ
ローブが調製できる。 (i) テンプレートクローンの構築 ０.５〜１.５ｋｂのプローブとなる配列を含んだゲノム
ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを、ＳＰ６、T３、T７などのプ
ロモーターを持ったプラスミド（Stratagene社のBluesc
ript、Promega社のｐＧＥＭなど）に組み込む。テンプ
レートにするとき制限酵素でプラスミドＤＮＡの直線化
を行うが、３’突出末端が生じるところの末端からＲＮ
Ａ合成がおきてしまうので、インサートの両端のマルチ
プルクローニング部位にインサート中には現れないよう
な５’突出末端があるようにクローニングをデザインし
ておく。センスＲＮＡ，アンチセンスＲＮＡの両者が合
成できるようにしておくのが良い。インサートには、po
lyＡ，反復配列、ベクターなどが含まれないようにす
る。テンプレートはアルカリ法で抽出し、ＲＮase処理
した後ＰＥＧ沈殿を行い、CsCl密度平衡遠心で精製す
る。

【００３１】(ii) テンプレートの調整 センス及びアンチセンス用に各々１０μg 程度のプラス
ミドＤＮＡを５〜１０倍量の酵素で完全に切断する。切
断はアガロースゲル電気泳動で確認する。

【００３２】混入しているＲＮase活性を完全に除去す
るためにプロティナーゼＫ処理を行う。テンプレートＤ
ＮＡ１０μgを最終濃度１％ＳＤＳ，２００μg/ml プロ
ティナーゼＫを含む溶液２００μｌ中で３７℃で３０分
処理する。５Ｍ NaCl溶液２０μｌを加えた後、フェノ
ール・クロロホルム抽出を２回、クロロホルム抽出を１
回行った後、エタノール沈殿を行う。沈殿を７０％エタ
ノールで洗浄の後減圧下で乾燥し、最終濃度１mg/lにな
るように10nM Tris-HCl，0.1nM ＥＤＴＡに溶解する。

【００３３】(iii) ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブ
の合成 ＲＮＡプローブの合成は、市販のキットを利用して行う
ことができる。

【００３４】例えば、ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプロー
ブの合成は、下記の調整液を軽く遠心して溶液を底に集
めた後、３７℃の水浴中で２時間反応を行うことによっ
て実施できる： テンプレートＤＮＡ １μl １０倍希釈 ＮＴＰ mixture ２μl １０倍希釈 transcriptoin buffer ２μl ＤＥＰＣ処理water １３μl ＲＮase inhibitor １μl ＲＮＡポリメラーゼ ２μl。

【００３５】反応後、１μlを２本分取して１つについ
て電気泳動により反応チェックすることが好ましい。も
う一つは、断片化のあとのホルムアルデヒド入りのアガ
ロースゲル電気泳動に用いる。結果が分かるまで残りは
マイナス２０℃で保存する。電気泳動はＲＮaseの混入
をできるだけ避けるようにして、２％アガロースででＴ
ＥＢを用いたミューピッドで行う。

【００３６】(iv) ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブ
の精製と断片化 次いで未反応の基質を除去し、エタノール沈殿を行って
精製する。０.１Ｍ ＤＴＴとアルカリ処理溶液を１：１
９で混ぜ、ＲＮＡの沈殿をμlのこの溶液に完全に溶解
させる。６０℃の湯浴あるいはヒートブロックで、計算
した時間加熱する。３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１０μl、
２０mg/ml E．coli tRNA溶液５μl及び冷１００％エタ
ノール３５０μlを加えて常法でＲＮＡを沈殿させる。
遠心にて回収したＲＮＡは真空乾燥し、５０μlの蒸留
水（Distilled Water：ＤＷ)に溶解後２０ユニットのＲ
Ｎase inhibitorを加えてからマイナス２０℃で保存す
る。

【００３７】なお、標識プローブは上記のように調製し
てもよいが、検出するウイルスの種類によっては市販の
標識プローブを使用することもできる。よって当該標識
プローブの調製は、本発明の方法において必須工程では
ない。

【００３８】 in situ ハイブリダイゼーション 標識したプローブを固定化したウイルス接種細胞と接触
させてin situ ハイブリダイゼーション反応を行う。反
応後、非特異的に吸着したプローブあるいは未反応のプ
ローブをＲＮaseなどで除去し洗浄した後、標識プロー
ブの標識剤に応じた検出方法に付すことにより、細胞中
のウイルス遺伝子またはｍＲＮＡを測定する。

【００３９】in situ ハイブリダイゼーションは、具体
的には標識プローブを含むバッファーを、固定化したウ
イルス接種細胞にかけて９０〜９５℃、あるいは３５〜
４５℃の恒温槽で反応させることによって実施され、こ
れによって標識プローブが細胞内に局在化するウイルス
のＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリダイズする。

【００４０】in situ ハイブリダイゼーション溶液（バ
ッファー）及び反応方法の一例として下記の溶液及び方
法を挙げることができる。これらの溶液、使用当日に調
製することが好ましい。

【００４１】＜in situ ハイブリダイゼーション溶液＞ プローブ溶液 ２３０μl ２０mg/ml E．coli tRNA溶液 １００μl １．０Ｍ Tris-HCl ｐＨ８．０ ４０μl ０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ ２μl ２０倍希釈 Denhard溶液 １００μl ５Ｍ NaCl １２０μl deionized formamide １０００μl ５０％ dextrun sulfate ４００μl。

【００４２】＜反応方法＞これらの溶液は混合後、一旦
９０℃程度で５分間ほど加熱した後室温に戻したものを
使用することが好ましい。混液は予めウイルス接触細胞
をのせたスライドガラス上にのせて良く混ぜてある程度
広げた後に、泡を入れないようにしてカバーグラスをか
け、４０±５℃程度で２分〜１６時間ハイブリダイズす
る。標識プローブの至適濃度は検出する対象のウイルス
遺伝子によって異なるので、好ましくはプローブ濃度を
変えて予備実験をすることが望ましいが、濃度目安とし
てハイブリダイゼーション混液中での最終濃度が０．１
〜１μg/mlの範囲を挙げることができる。

【００４３】ハイブリダイズ物の検出 反応後、必要に応じて洗浄し、上記のハイブリダイゼー
ション反応で形成されたハイブリダイズ物を検出する。
検出は、標識プローブで使用した標識剤に応じて自体公
知の方法を利用することができる。例えば酵素活性の測
定は、使用する酵素の種類に応じて公知の方法に従って
行うことができ、例えば標識酵素としてパーオキシダー
ゼを用いる場合は基質としてＡＢＴＳＪ2,2'-アジノー
ビ（3'エチルベンツチアゾリンスルホン酸）を用い、ま
たアルカリホスファターゼを用いる場合は基質としてｐ
−ニトロフェニルホスフェートを用いて、それぞれイン
キュベートし、各基質の分解を分光光度計等を用いて測
定する方法等が挙げられる（「酵素免疫測定法」第２
版、石川栄治 他著、医学書院、１９８２年等参考）。
なお、上記酵素標識の代わりに、放射性同位元素や蛍光
物質による標識体を用いる場合も、自体公知の方法に従
って測定することができる。

【００４４】通常、放射性同位元素標識の場合はオート
ラジオグラフィー、蛍光標識の場合は蛍光顕微鏡又は蛍
光強度計、酵素標識の場合は所定の酵素基質と反応させ
て比色計を用いて呈色反応を見ることによって測定する
ことができる。

【００４５】以上の本発明の方法によって検出されるの
は生きたウイルスのみである。

【００４６】ここで生きたウイルスとは、細胞への感染
性を有し、細胞に感染することで増殖可能であるもの、
言いかえれば活性化されたウイルスをいう。一方、ウイ
ルス形態を失い細胞に対する結合部分を失ったウイル
ス、すなわちＤＮＡ核酸やＲＮＡ等、細胞等への感染性
が認めれられない状態にあるパルボウイルス、アデノウ
イルス、ピコルナウイルス、コロナウイルス、トガウイ
ルスなどの核酸は検出されない。本発明の方法は、細胞
へ感染させる段階において活性化されたウイルスのみを
検出することができる。

【００４７】本発明の検出法が対象とするウイルスは、
上記のごとく生きたウイルスであれば特に制限されない
が、具体的にはアデノウイルス、ヘルペス、ムンプス、
サイトメガロウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ＥＢ
ウイルス、エンテロウイルス、インフルエンザウイル
ス、ライノウイルス、コロナウイルス、ＨＩＶを好適に
例示することができる。

【００４８】現在行われているウイルス分離は、生きて
いるウイルスを証明する方法であり、ウイルス感染症患
者の病態を反映していると言われている。本発明の方法
は、生きたウイルスを遺伝学的に検出するものであり、
これゆえにウイルス感染症患者の病態を的確に反映する
ことができる。

【００４９】従って、本発明のウイルス検出法は、該検
出法において、ウイルス接種細胞中に検出対象のウイル
ス遺伝子（ＤＮＡ）またはｍＲＮＡが存在するかどうか
を判定することによって、ウイルス感染の診断に利用す
ることができる。当該ウイルス検出法を利用した診断に
よれば、所定のウイルス感染成立の有無がわかるだけで
なく、第三者への感染リスクの予測、治療効果を追跡す
ることによる該治療方法の適切性判断や最善な治療方法
の探索に有効に利用することができる。

【００５０】

【発明の効果】本発明のウイルス検出法は、ウィルス感
染患者から採取した鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい
液、咽頭ぬぐい液、喀痰、便などの各種の生体試料を、
まずウイルス分離用細胞に接触させた後、得られた細胞
を対象として in situ ハイブリダイゼーションを行う
ことを特徴とするものである。今まで、患者から採取し
た生体試料を対象として、該生体試料中に含まれるウイ
ルス核酸の検出を目的として in situ ハイブリダイゼ
ーションが広く行われてきているが、本発明のように、
ウイルスを含む生体試料と短時間に接触させて調製した
細胞に対して insitu ハイブリダイゼーションを行って
ウイルスを検出する方法は知られていなかった。

【００５１】また、従来ウイルス病の診断に使用されて
いるウイルス分離には、通常数日〜数ヶ月の孵卵器中で
の培養が必要とされる。それに対して、本発明のウイル
ス検出法では、生体試料と分離用細胞との接触は１５〜
３７℃でわずか１時間程度で実施可能である。

【００５２】この短時間の操作により迅速に生きたウィ
ルスのみを検出することができる。

【００５３】すなわち、本発明によると、短時間で且つ
高感度に生きたウィルスを検出できるため、ウイルス感
染症患者の病態を的確に反映することができる。

【００５４】

【実施例】以下、実施例をあげて本発明を更に詳細に説
明する。但し、本発明はこれらの実施例によって何ら制
限されるものではない。実施例１ （１）アデノウイルス５型を分離用細胞(ＨＥｐ−２、
国立感染症研究所分与株）に接種し、孵卵器中で３７℃
で１時間放置した。なお、分離用細胞はあらかじめ５×
１０⁴／１０mlに調整したＨＥｐ−２細胞浮遊液をチャ
ンバースライド（LAB-TEK社製：１枚８ウェル）に、１
ウェル当たり1.0mlずつ播いて、３７℃、５％ＣＯ₂下で
１日培養したものを使用した。次いでさらに５×１０³
個／mlに調整して２４穴マイクロプレートにまき、軽く
遠心分離をかけて単層に調整した。また、アデノウイル
ス５型は、アデノウィルス５型（力価：１.６×１０³Ｔ
ＣＩＤ₅₀／０．５ml）の抗原を用いて仔牛血清及びＰＨ
７.４イーグル培養液で所定の希釈倍率に調整したもの
を使用した（生菌）。比較のために、死菌（ホルマリン
固定）から分離用細胞への感染が成立するかどうかを見
るために、１０％ホルマリンで殺菌したアデノウィルス
５型死菌についても生菌と同様の希釈倍率のものを調整
した。

【００５５】これらのアデノウィルス５型の生菌及び死
菌を前日に調整したＨＥｐ−２細胞を播種したウェルに
５０μlずつ播種し、２％仔牛血清添加イーグルＭＥＭ
倍地を４５０μl加え、３７℃、５％の孵卵器中で培養
する。培養後１時間（感染時間１時間）、２時間（感染
時間２時間）、１２時間（感染時間１２時間）、及び２
４時間（感染時間２４時間）経過した後のアデノウイル
ス感染細胞スライドについて、それぞれ風乾し、次いで
冷アセトンで１０分間固定した後、更に風乾して、ジゴ
キシゲニン標識ＲＮＡプローブを用いたin situ ハイブ
リダイゼーションを行って、細胞中におけるウイルス核
酸の存在有無からウイルス感染が生じているかどうかを
調べた。

【００５６】（２）プローブの調製 ジゴキシゲニン(DIG)標識ＤＮＡプローブ ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブの合成
は、ＰＣＲ ＤＩＧ合成キット（ロッシュ社）を利用し
て行った。鋳型ＤＮＡとしては、アデノウイルスゲノム
ＤＮＡを用いた。

【００５７】以下、アデノウイルス５型特異的ＤＩＧ標
識プローブの合成について説明する。下記のＰＣＲ反応
液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。鋳型ＤＮＡとしてア
デノウイルス５型ウイルス株を細胞に接種し、培養した
上清からウイルスＤＮＡを抽出したものを用いた： ＜反応液＞ ＰＣＲ緩衝液（10×） ５ μｌ ＰＣＲ、ＤＩＧ合成ミックス ５ μｌ （2mM dATP, 2mM dCTP, 2mM dGTP, 1.3mM dTTP, 0.7mM DIG-11dUTP） 20μＭセンスプライマー ２.５ μｌ 20μＭアンチセンスプライマー ２.５ μｌ 蒸留水 ３３.２５μｌ 酵素ミックス ０.７５μｌ 鋳型ＤＮＡ（10ng/μｌ） １ μｌ 合 計 ５０ μｌ。

【００５８】＜ＰＣＲ反応＞ ９５℃−２分 ９４℃−１０秒、５０℃−３０秒、７２℃−２分：１０
サイクル ９４℃−１０秒、５０℃−３０秒、７２℃−２分２０
秒：１サイクル ９４℃−１０秒、５０℃−３０秒、７２℃−２分４０
秒：１サイクル 以下、１サイクル進む毎に７２℃での反応時間を２０秒
ずつ延長する 最初の１０サイクルに２０サイクルを加えた全３０サイ
クルを行う ７２℃−７分 ４℃。

【００５９】反応後、ＰＣＲ産物を３％アガロースゲル
による電気泳動を行って１２８ｂｐのバンドを確認す
る。

【００６０】なお、プライマーは、図１に示すようにア
デノウイルスのヘキソン領域内に設計し、センスプライ
マー及びアンチセンスプライマーとして下記のものを利
用した。なお、括弧内はヘキソン領域の対応する塩基番
号を意味する。 センスプライマー AD5AYUS：GGAAGGTAACTCACGAGAA
CTAATGGGCC(921-941) アンチセンスプライマーAD5AKUA：CCGCCAGAACACCCATATT
ACCCGT (1049-1024) ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブの精
製 上記のＰＣＲ反応によりＤＩＧ標識反応を行った後、得
られたＰＣＲ産物を電気泳動し、アガロースゲルから切
り出すことによってプローブの精製を行った。アガロー
スゲルからの精製は、QIAGEN社の QIA quick Gel Extra
ction Kitを用いて行った。具体的には、１.５％アガロ
ースゲルで電気泳動し、ＵＶタランスイルミネーター上
でアガロースゲルから目的のバンド部分のみを切り出し
た。そのゲル断片の重量の３倍量のQG Bufferを加え、
５０℃で１０分間加温した。次にゲル断片の１倍量のイ
ソプロパノールを加え、混和後、カラムに入れて8000rp
mで１分間遠心した。カラムにQG Buffer 500μｌを入
れ、8000rpmで１分間遠心し、完全にアガロースゲルを
除去した。次にPE Bufferを750μｌ入れ、12000rpmで１
分間遠心した。EB Buffer 100μlで溶出し、ＤＩＧ標識
プローブとして用いた。

【００６１】（３）in situ ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション溶液 ハイブリダイゼーション溶液は、使用する当日に下記の
組成で調製する。

【００６２】 ＤＩＧ標識プローブ溶液（0.2μg/ml） ２３０μl ２０mg/ml E．coli tRNA溶液 １００μl １．０Ｍ Tris-HCl ｐＨ８．０ ４０μl ０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ ２μl ２０倍希釈 Denhard溶液 １００μl ５Ｍ ＮａＣｌ １２０μl 脱イオン化ホルムアミド １０００μl ５０％ 硫酸デキストラン ４００μl。

【００６３】 ハイブリダイゼーション 上記（１）で調製した被験細胞（生菌、死菌）の上に、
上記のハイブリダイゼーション溶液を載せて、カバーグ
ラスをかけた。これを９２℃で２分間反応させた後（ハ
イブリダイゼーション）にＴＢＳＴ（Tris Buffered Sa
line with Tween20）でカバーグラスを剥がして、ＴＢ
ＳＴで１分間×３回、ＴＢＳｔで５分間洗浄した。その
後、抗ジゴキシゲニン抗体（マウスモノクロナール抗
体：CovalAb社製）で１５分間処理して、ＴＢＳＴで３
分間×２回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識マウス抗
体ポリマー重合体（エンビジョンキット、ダコ社）で６
０分処理し、ＤＡＢ発色処理並びにマイヤーヘマトキシ
ン処理を行って発色させた。ウイルス感染の有無は発色
の有無と対応している。結果を表３に示す。発色の有無
を＋−で示す。

【００６４】

【表３】

【００６５】この結果からわかるように、死菌群では検
出されないのに対して、生菌群は感染時間１時間、TCID
₅₀／50μlで検出可能であることが判明した。

【００６６】実施例２ アデノウイルス感染患者２例について、本発明のウイル
ス検出法の結果と臨床症状との関係を調べた。なお、比
較のためウイルス分離法及びＰＣＲ法を同様に行って、
これらの方法で得られる結果と臨床症状との相関関係も
みた。結果を表４に示す。

【００６７】

【表４】

【００６８】以上の結果からわかるように、本発明のウ
イルス検出法は他の方法に比べてより臨床症状を鋭敏に
反映していた。すなわち、ウイルス分離法では臨床症状
が改善する前に陰性となり、ＰＣＲ法では臨床症状が軽
快し退院する段階においても陽性であるのに対し、本方
法では、臨床症状が軽快した段階で陰性となり臨床症状
をよく反映した。

【００６９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. <120> Detection method of Virus <130> 22901JP <160> 3 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> sense primer <222> Adenovirus 5 Hexon(921-941) <400> 1 ggaaggtaac tcacgagaac taatgggcc 29 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> antisense primer <222> Adenovirus 5 Hexon(1049-1024) <400> 2 ccgccagaac acccatatta cccgt 25 <210> 3 <211> 128 <212> DNA <213> Adenovirus <220> <221> <222> Adenovirus 5 Hexon(921-1049) <400> 3 ggaaggtaac tcacgagaac taatgggcca acaatctatg cccaacaggc ctaattacat 60 tgcttttagg gacaatttta ttggtctaat gtattacaac agcacgggta atatgggtgt 120 tctggcgg 128

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１において、プローブの製造に際してＰ
ＣＲ増幅したアデノウイルス５型ヘキソン領域、及びＰ
ＣＲに使用したプライマーの位置を示す概略図である。
なお、センスプライマー：AD5AYUSの塩基配列及びアン
チセンスプライマー：AD5AKUAの塩基配列をそれぞれ下
線部で示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石川 太 東京都北区田端２−３−12−205 (72)発明者 平石 佳之 東京都東久留米市中央町１−15−22 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA14 CA01 CA09 DA03 GA18 HA12 HA14 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ10 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR38 QR56 QR66 QS25 QS28 QS34 QX01

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウイルスを含み得る被検試料をウイルス
   分離用細胞に接触させ、次いで得られた細胞に対してin
   situハイブリダーゼーションを行うことを特徴とする
   ウイルス検出法。
2. 【請求項２】被検試料が、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜
   ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液（血清、血
   漿）、髄液、唾液、尿、汗、精液または組織である請求
   項１記載のウイルス法。
3. 【請求項３】ウイルスを含み得る被検試料をウイルス分
   離用細胞に１５〜３７℃で１時間程度接触させた後に、
   in situハイブリダイゼーションを行うことを特徴とす
   る請求項１または２に記載のウイルス検出法。
4. 【請求項４】検出対象のウイルスが、アデノウイルス、
   ヘルペス、ムンプス、サイトメガロウイルス、水痘・帯
   状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、エンテロウイルス、イ
   ンフルエンザウイルス、ライノウイルス、コロナウイル
   ス及びＨＩＶよりなる群から選択される少なくとも１種
   である請求項１乃至３のいずれかに記載のウイルス検出
   法。
5. 【請求項５】請求項１乃至４のいずれかに記載のウイル
   ス検出法を用いて、細胞中のウイルス核酸の存在の有無
   を判定することを特徴とするウイルス感染の診断方法。