JP2003000279A - ｂＨＬＨ−ＰＡＳ蛋白質、その遺伝子及びそれらの利用 - Google Patents

ｂＨＬＨ−ＰＡＳ蛋白質、その遺伝子及びそれらの利用

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JP2003000279A JP2001396288A JP2001396288A JP2003000279A JP 2003000279 A JP2003000279 A JP 2003000279A JP 2001396288 A JP2001396288 A JP 2001396288A JP 2001396288 A JP2001396288 A JP 2001396288A JP 2003000279 A JP2003000279 A JP 2003000279A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ｂＨＬＨ−ＰＡＳ蛋白質をコードするＤＮＡ等
を提供可能とすること。 【解決手段】以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの蛋白質
をコードするＤＮＡ、等。（ａ）特定なアミノ酸配列を
有する蛋白質。（ｂ）特定なアミノ酸配列に対して９０
％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、か
つ転写調節能を有する蛋白質。（ｃ）特定な塩基配列の
塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなる
ＤＮＡ、特定な塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表
される塩基配列からなるＤＮＡまたは特定な塩基配列の
塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤ
ＮＡのいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、
かつ転写調節能を有する蛋白質。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｂＨＬＨ−ＰＡＳ
蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】塩基性
ヘリックス・ループ・ヘリックス（basic helix-loop-h
elix：以下、ｂＨＬＨと記す。）モチーフとＰＡＳドメ
イン（Per-Arnt-Simホモロジードメイン）とを有する蛋
白質（以下、ｂＨＬＨ−ＰＡＳ蛋白質と記す。）は、ホ
モもしくはヘテロ二量体を形成することによりＤＮＡに
結合して転写調節因子として機能し、細胞増殖、発生分
化、生体機能発現などに係る遺伝子の転写調節に重要な
役割を果たしている（Annu Rev Pharmacol Toxicol 200
0;40:519-61）。例えば、Ａｈレセプター（Aryl hydroc
arbon receptor）は、ダイオキシン等のリガンドの結合
により活性化され、同じくｂＨＬＨ−ＰＡＳ蛋白質であ
るＡｒｎｔ（AhR nuclear translocator）とヘテロ二量
体を形成して薬物代謝酵素遺伝子等の転写制御領域に結
合しその転写を活性化する。また、Ｈｉｆは低酸素状態
への生体応答において遺伝子発現を活性化し、Ｐｅｒや
Ｃｌｏｃｋは日周リズムの制御に関与し、ＳＲＣ−１や
ＴＩＦ２はステロイドホルモンレセプターファミリーの
コアクチベーターとして機能する。ショウジョウバエに
おいて正中線の発達に関与するＳｉｍは、ヒト等の哺乳
動物においても発生過程の正中線に発現すること等から
その発達に関係していると考えられており、ヒトのＳｉ
ｍ２については遺伝病であるダウン症との関連も示唆さ
れている（Genome Res 1997;7:615-624, Chrast,R et a
l.）。さらに、成体において主に中枢神経系に発現する
ＮＰＡＳ１及びＮＰＡＳ２は、神経機能や行動に異常を
呈するマウスの遺伝病との関係が示唆されており（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 1997;94:713-18）、ＮＰＡＳ２遺
伝子が破壊されたノックアウトマウスは長期記憶に異常
が認められた（Science 2000;288:2226-2230）。このよ
うにｂＨＬＨ−ＰＡＳ蛋白質は、該蛋白質が発現する組
織において、その組織の発達や機能発現に必要な酵素遺
伝子や構造遺伝子等の遺伝子の転写調節に関っており、
その働きに異常が生じれば、疾病や障害等の原因とな
る。そこで、かかる疾病や障害等の診断、予防、治療に
有用な手段を開発するために、ｂＨＬＨ−ＰＡＳ蛋白質
及び該蛋白質をコードするＤＮＡの取得が望まれてい
た。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者は、かかる状況
の下、鋭意検討した結果、脳で発現するｂＨＬＨ−ＰＡ
Ｓ蛋白質をコードするＤＮＡの単離に成功し、本発明に
至った。即ち、本発明は、 １）以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの蛋白質をコード
するＤＮＡ、 （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
白質。 ２）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列を有す
るＤＮＡ、 （ａ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
〜２５０７で表される塩基配列。 （ｂ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
２４５６で表される塩基配列。 （ｃ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
２４４０で表される塩基配列。 （ｄ）配列番号５４で示される塩基配列の塩基番号１４
１９〜６１６４で表される塩基配列。 ３）前項１）又は２）に記載のＤＮＡを含有するベクタ
ー（以下、本発明ベクターと記す。）、 ４）前項１又は２に記載のＤＮＡの上流に、プロモータ
ーが機能可能な形で結合されてなるＤＮＡを含有するベ
クター、 ５）宿主細胞内で複製可能なベクターに、前項１）又は
２）に記載のＤＮＡを組込むことを特徴とするベクター
の製造方法、 ６）前項１）もしくは２）に記載のＤＮＡ又は前項３）
に記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換
体（以下、本発明形質転換体と記す。）、 ７）宿主細胞が動物細胞である前項６記載の形質転換
体。 ８）宿主細胞が大腸菌又は酵母である前項６記載の形質
転換体。 ９）前項１）もしくは２）に記載のＤＮＡ又は前項３）
に記載のベクターを宿主細胞に導入することを特徴とす
る形質転換体の製造方法、 １０）以下の（ａ）〜（ｅ）の蛋白質（以下、一括して
本発明蛋白質と記す。）、 （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
白質。 １１）以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの蛋白質をコー
ドするＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる形質転換体を
培養する工程を含むことを特徴とする本発明蛋白質の製
造方法、 （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
白質。 １２）本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有する
ポリペプチドを認識する抗体、 １３）本発明蛋白質を検出する方法であって、 （１）本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有する
ポリペプチドを認識する抗体と被検試料とを接触させる
工程、及び （２）被検試料中の蛋白質と前記抗体との複合体を検出
する工程、を含む方法、 １４）本発明蛋白質に結合する物質をスクリーニングす
る方法であって、 （１）本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有する
ポリペプチドと被検物質とを接触させる工程、及び （２）本発明蛋白質又は前記ポリペプチドに結合する物
質を選択する工程、を含む方法、 １５）本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有する
ポリペプチドの転写調節能を測定する方法であって、以
下のi）の遺伝子とii）の遺伝子とが宿主細胞に導入さ
れてなる形質転換体、及び、以下のiii）の遺伝子とi
i）の遺伝子とが宿主細胞に導入されてなる形質転換体
におけるレポーター遺伝子の発現量を測定し、測定され
た発現量を比較する工程を含む方法、 ＜各遺伝子＞ i）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合
領域と、本発明蛋白質またはその部分アミノ酸配列を有
するポリペプチドとの融合蛋白質をコードするＤＮＡ
が、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に接続
されてなるキメラ遺伝子。 ii）i）記載のＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡと宿
主細胞内で機能可能な最小プロモーターとを含むプロモ
ーターの下流に、レポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
が接続されてなるレポーター遺伝子。 iii）i）記載のＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡが、
i）記載のプロモーターの下流に接続されてなる遺伝
子。 １６）本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有する
ポリペプチドの転写調節能を変化させる物質をスクリー
ニングする方法であって、 （１）i）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮ
Ａ結合領域と、本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列
を有するポリペプチドとの融合蛋白質をコードするＤＮ
Ａが、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に接
続されてなるキメラ遺伝子、と ii）i）記載のＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡと宿
主細胞内で機能可能な最小プロモーターとを含むプロモ
ーターの下流に、レポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
が接続されてなるレポーター遺伝子とが宿主細胞に導入
されてなる形質転換体と、被検物質とを接触させ、被検
物質存在下における前記レポーター遺伝子の発現量を測
定する工程、及び （２）（１）で測定されたレポーター遺伝子の発現量
が、被検物質非存在下における当該レポーター遺伝子の
発現量とは実質的に異なる被検物質を選択する工程、を
含む方法、 １７）ツーハイブリッドアッセイのための、前項１記載
のＤＮＡの使用、 １８）本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有する
ポリペプチドの細胞内発現量を変化させる物質をスクリ
ーニングする方法であって、 （１）前記蛋白質をコードする遺伝子の発現調節領域と
レポーター蛋白質をコードするＤＮＡとが機能可能な形
で連結されてなるレポーター遺伝子が宿主細胞に導入さ
れてなる形質転換体と、被検物質とを接触させ、被検物
質存在下における前記レポーター遺伝子の発現量を測定
する工程、及び （２）（１）で測定されたレポーター遺伝子の発現量
が、被検物質非存在下における当該レポーター遺伝子の
発現量とは実質的に異なる被検物質を選択する工程、を
含む方法。 １９）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列から
なるポリヌクレオチドにスリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズすることができる１０塩基以上５０００塩基
以下の塩基からなるポリヌクレオチド、 ２０）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
される塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相
補的な塩基配列を有し、１０塩基以上５０００塩基以下
の塩基からなるポリヌクレオチド、 ２１）本発明蛋白質をコードする核酸を検出する方法で
あって、 （１）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列から
なるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズすることができる１０塩基以上５０００塩
基以下の塩基からなるポリヌクレオチドと被検試料由来
の核酸とをハイブリダイゼーション条件下に接触させる
工程、及び （２）前記ポリヌクレオチドと被検試料由来の核酸との
ハイブリッドを検出する工程、を含む方法、 ２２）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列から
なるポリヌクレオチドに対してポリメラーゼチェイン反
応条件下でアニールすることができ、１０塩基以上５０
塩基以下の塩基からなるポリヌクレオチド、 ２３）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
される塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相
補的な塩基配列を有し、１０塩基以上５０塩基以下の塩
基からなるポリヌクレオチド、 ２４）配列番号４３〜５１のいずれかで示される塩基配
列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌク
レオチドに対してポリメラーゼチェイン反応条件下でア
ニールすることができ、１０塩基以上５０塩基以下の塩
基からなるポリヌクレオチド、 ２５）配列番号４３〜５１のいずれかで示される塩基配
列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配
列を有し、１０塩基以上５０塩基以下の塩基からなるポ
リヌクレオチド、 ２６）配列番号１１〜４２のいずれかで示される塩基配
列を有するポリヌクレオチド、 ２７）以下の（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドから選
ばれる１以上のポリヌクレオチドを含むキット（以下、
本発明キットと記載することもある。）、 （ａ）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列から
なるポリヌクレオチドにスリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズすることができる１０塩基以上５０００塩基
以下の塩基からなるポリヌクレオチド。 （ｂ）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列から
なるポリヌクレオチドに対してポリメラーゼチェイン反
応条件下でアニールすることができ、１０塩基以上５０
塩基以下の塩基からなるポリヌクレオチド。 （ｃ）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
される塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相
補的な塩基配列を有し、１０塩基以上５０００塩基以下
の塩基からなるポリヌクレオチド。 （ｄ）配列番号４３〜５１のいずれかで示される塩基配
列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌク
レオチドに対してポリメラーゼチェイン反応条件下でア
ニールすることができ、１０塩基以上５０塩基以下の塩
基からなるポリヌクレオチド。 （ｅ）配列番号４３〜５１のいずれかで示される塩基配
列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配
列を有し、１０塩基以上５０塩基以下の塩基からなるポ
リヌクレオチド。 （ｆ）配列番号１１〜４２のいずれかで示される塩基配
列を有するポリヌクレオチド。 ２８）本発明蛋白質をコードするゲノムＤＮＡを増幅す
る方法であって、以下の（ｆ）〜（ｊ）のポリヌクレオ
チドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドをプライマ
ーとして用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラー
ゼチェイン反応を行う工程を含む方法、 ＜ポリヌクレオチド群＞ （ｆ）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列から
なるポリヌクレオチドに対してポリメラーゼチェイン反
応条件下でアニールすることができ、１０塩基以上５０
塩基以下の塩基からなるポリヌクレオチド。 （ｇ）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
される塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相
補的な塩基配列を有し、１０塩基以上５０塩基以下の塩
基からなるポリヌクレオチド。 （ｈ）配列番号４３〜５１のいずれかで示される塩基配
列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌク
レオチドに対してポリメラーゼチェイン反応条件下でア
ニールすることができ、１０塩基以上５０塩基以下の塩
基からなるポリヌクレオチド。 （ｉ）配列番号４３〜５１のいずれかで示される塩基配
列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配
列を有し、１０塩基以上５０塩基以下の塩基からなるポ
リヌクレオチド。 （ｊ）配列番号１１〜４２のいずれかで示される塩基配
列を有するポリヌクレオチド。 ２９）本発明蛋白質をコードするｃＤＮＡを増幅する方
法であって、以下の（ｆ）又は（ｇ）のポリヌクレオチ
ドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドをプライマー
として用いて、ｃＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼチェ
イン反応を行う工程を含む方法、 ＜ポリヌクレオチド群＞ （ｆ）配列番号４〜６のいずれかで示される塩基配列又
は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリペプチド
に対してポリメラーゼチェイン反応条件下でアニールす
ることができ、１０塩基以上５０塩基以下の塩基からな
るポリヌクレオチド。 （ｇ）配列番号４〜６のいずれかで示される塩基配列の
部分塩基配列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配列を
有し、１０塩基以上５０塩基以下の塩基からなるポリヌ
クレオチド。 ３０）本発明蛋白質をコードする遺伝子の遺伝子型を分
析する方法であって、被検試料の核酸において、本発明
蛋白質をコードする塩基配列が、標準蛋白質のアミノ酸
配列とは異なるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含
有しているか否かを調べる工程を含む方法、 ３１）標準蛋白質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配
列をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる
工程が、被検試料の核酸を鋳型として本発明蛋白質をコ
ードするＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡの塩基配列
を決定する工程を含む前項３０）に記載の方法、 ３２）標準蛋白質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配
列をコードする塩基配列を有しているか否かを調べる工
程が、被検試料の核酸を鋳型として本発明蛋白質のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮ
Ａを電気泳動してその移動度を測定する工程を含む前項
３０）に記載の方法、 ３３）標準蛋白質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配
列をコードする塩基配列を有しているか否かを調べる工
程が、被検試料の核酸又は該核酸の増幅物と、配列番号
４、５、６もしくは５４のいずれかで示される塩基配列
又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリペプチ
ドにスリンジェントな条件下でハイブリダイズすること
ができる１０塩基以上５０００塩基以下の塩基からなる
ポリヌクレオチドとの、ストリンジェントな条件下にお
けるハイブリダイゼーションのパターンを調べる工程を
含む前項３０）に記載の方法、 ３４）標準蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号１、２又
は３で示されるアミノ酸配列である前項３０）〜３３）
のいずれかに記載の方法、 ３５）哺乳動物細胞に、前項１又は２記載のＤＮＡを、
当該ＤＮＡが前記細胞で発現する位置に置かれるように
提供する工程を含む哺乳動物細胞におけるdrebrin 1の
発現促進方法（以下、本発明発現促進方法と記すことも
ある。）、 ３６）前記哺乳動物細胞が、精神遅滞を伴なう疾患又は
アルツハイマー症に羅患していると診断されうる哺乳動
物の体内にある細胞である、前項３５記載の方法、 ３７）前項１又は２に記載のＤＮＡを有効成分として含
み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化さ
れてなる遺伝子治療剤（以下、本発明遺伝子治療剤と記
すこともある。）、を提供するものである。
【０００４】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明蛋白質には、配列番号１〜３のいずれかで
示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１〜３
のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上
のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写
調節能を有する蛋白質、配列番号４で示される塩基配列
の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からな
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転
写調節能を有する蛋白質、配列番号５で示される塩基配
列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からな
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転
写調節能を有する蛋白質、配列番号６で示される塩基配
列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からな
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転
写調節能を有する蛋白質が含まれる。本発明蛋白質のア
ミノ酸配列において認められる、配列番号１〜３のいず
れかで示されるアミノ酸配列との相違としては、アミノ
酸の欠失、置換、修飾、付加等の変異をあげることがで
きる。これらには、部位特異的変異導入法や突然変異処
理等によって人為的に導入され得る変異に加えて、動物
の系統、個体、器官、組織等の違いによるアミノ酸配列
の相違などの天然に生ずる多型変異も含まれる。
【０００５】本発明において「配列同一性」とは、２つ
の塩基配列又は２つのアミノ酸配列の配列の同一性及び
相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列
の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされ
た２つの配列を比較することにより決定される。ここ
で、比較対象の塩基配列又はアミノ酸配列の最適なアラ
インメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ
等）を許容してもよい。このような配列同一性は、例え
ば、FASTA［Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad.Sci.
USA，4, 2444-2448(1988)］、BLAST［Altschulら、Jou
rnal of MolecularBiology, 215, 403-410(1990)］、CL
USTAL W［Thompson,Higgins＆Gibson, Nucleic Acid Re
search, 22, 4673-4680(1994a)］等のプログラムを用い
て相同性解析を行いアラインメントを作成することによ
って算出することができる。上記のプログラムは、例え
ば、DNA Data Bank of Japan［国立遺伝学研究所 生命
情報・ＤＤＢＪ研究センター (Center for Information
Biology and DNA Data Bankof Japan ;CIB/DDBJ)内で
運営される国際ＤＮＡデータバンク］のホームページ
（http://www.ddbj.nig.ac.jp）等において、一般的に
利用可能である。また、配列同一性は、Vector NTI、GE
NETYX-WIN Ver.5（ソフトウェア開発株式会社製）等の
市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもでき
る。本発明におけるアミノ酸同一性は、例えば、９０％
以上であることが好ましい。
【０００６】また、上記の「ストリンジェントな条件下
にハイブリダイズするＤＮＡ」としては、例えば、高イ
オン濃度下[例えば、6XSSC（900mM塩化ナトリウム、90m
Mクエン酸ナトリウム）などが用いられる。]に、65℃の
温度条件でハイブリダイズさせることによりDNA-DNAハ
イブリッドを形成し、低イオン濃度下[例えば、0.1X SS
C（15mM塩化ナトリウム、1.5mMクエン酸ナトリウム）な
どが用いられる。]に、65℃の温度条件で30分間洗浄し
た後でも該ハイブリッドが維持されうるＤＮＡをあげる
ことができる。本発明蛋白質の転写調節能は、例えば、
後述のレポーター遺伝子を用いたアッセイ等に基づき評
価することができる。
【０００７】本発明蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、
本発明ＤＮＡと記す。）は、例えば、ヒト、マウス、ラ
ットなどの動物の組織から、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.
Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molec
ular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハ
ーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory
発行、1989年）等に記載の遺伝子工学的方法に準じて取
得することができる。具体的には、まず、ヒト、マウ
ス、ラットなどの動物の組織由来の全RNAを調製する。
例えば、脳の組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシ
アネート等の蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さら
に該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えること
により蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心分離等に
より除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジ
ン／フェノール法、SDS−フェノール法、グアニジンチ
オシアネート／CsCl法等の方法により全RNAを抽出す
る。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとして
は、例えばISOGEN（ニッポンジーン製）がある。得られ
た全RNAを鋳型としてオリゴdTプライマーをRNAのポリA
配列にアニールさせ、逆転写酵素により一本鎖cDNAを合
成する。次いで、合成された一本鎖cDNAを鋳型とし、か
つ大腸菌RNaseHを用いてRNA鎖にニックとギャップを入
れることにより得られるRNAをプライマーとして大腸菌
のDNAポリメラーゼＩを用いて二本鎖のcDNAを合成す
る。更に、合成された二本鎖cDNAの両末端をT4 DNAポリ
メラーゼにより平滑化する。末端が平滑化された二本鎖
cDNAは、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈
殿等の通常の方法により精製、回収する。なお、これら
の方法に基づいた市販のキットとしては、例えばcDNA合
成システムプラス（アマシャムファルマシアバイオテク
社製）やTimeSaver cDNA合成キット（アマシャムファル
マシアバイオテク社製）等があげられる。次に、得られ
た二本鎖cDNAを例えば、プラスミドpUC118やファージλ
gt10などのベクターとリガーゼを用いて連結することに
よりｃＤＮＡライブラリーを作製する。尚、ｃＤＮＡラ
イブラリーとしては、市販のｃＤＮＡライブラリー（Ｇ
ＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製やＣｌｏｎｔｅｃｈ社製等）を用
いることも可能である。また、ヒト、マウス、ラットな
どの動物の組織片から、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisc
h,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（M
olecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング
ハーバー ラボラトリー（Cold SpringHarbor Laborato
ry発行、1989年）や、村松正寶、”ラボマニュアル遺伝
子工学”（丸善１９８８）等に記載される通常の方法に
準じてゲノムＤＮＡを調製する。例えば試料が毛髪の場
合には、毛髪２〜３本を滅菌水、次いでエタノールで洗
浄した後、2〜3 mmの長さに切断し、これにBCL-Buffer
［10mM Tris-HCl(pH7.5),5 mM MgCl2, 0.32M Sucrose,
1 Triton X-100］200μｌを加え、さらにProteinaseKを
最終濃度100μｌ/ml 、ＳＤＳを最終濃度0.5 （w/v）に
なるようにそれぞれ加え混合する。この混合物を70℃で
1時間保温した後、フェノール／クロロホルム抽出を行
うことによりゲノムＤＮＡを得ることができる。また、
試料が末梢血の場合は、DNA-Extraction kit(Stratagen
e社製)等を用いて該試料を処理することによりゲノムＤ
ＮＡを得ることができる。得られたゲノムＤＮＡをλgt
10などのベクターとリガーゼを用いて連結することによ
りゲノムＤＮＡライブラリーが得られる。尚、ゲノムＤ
ＮＡライブラリーとしては、市販のゲノムＤＮＡライブ
ラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製等）を用いることも
可能である。
【０００８】上記のようなcDNAライブラリーやゲノムＤ
ＮＡライブラリーから、例えば、配列番号４、５、６も
しくは５４のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配
列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ
チェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）や、配列番号
４、５、６もしくは５４のいずれかで示される塩基配列
又は該塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプロー
ブとして用いるハイブリダイゼーション法により、本発
明ＤＮＡを取得することができる。ＰＣＲに用いられる
プライマーとしては、例えば、約10塩基から約50塩基程
度の長さのオリゴヌクレオチドであって、配列番号４、
５、６もしくは５４のいずれかで示される塩基配列の
５’非翻訳領域から選択した塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチド、及び、配列番号４、５、６もしくは５４の
いずれかで示される塩基配列の３’非翻訳領域から選択
した塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドをあげることができる。具体的には、フォワード
プライマーとしては、例えば、配列番号７で示される塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドや配列番号８で示さ
れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをあげること
ができる。また、リバースプライマーとしては、例え
ば、配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドや配列番号１０で示される塩基配列からなるオ
リゴヌクレオチドをあげることができる。PCRの条件と
しては、例えば、反応液50μl中に、LA-Taqポリメラー
ゼ用10倍濃緩衝液（宝酒造社製）5μl、2.5mM dNTP混合
液（各2.5mMのdATP,dGTP,dCTP及びdTTPを含む。）５μl
（dATP,dGTP,dCTP及びdTTP各々の終濃度が0.25mM）、20
μMプライマー 各0.25〜1.25μl（終濃度が0.1〜0.5μ
M）、鋳型cDNA 0.1〜0.5μg、LA-Taqポリメラーゼ（宝
酒造社製）1.25ユニットを含む組成の反応液にて、95℃で1
分間次いで68℃で3分間の保温を1サイクルとしてこれを
35サイクル行う等の条件が挙げられる。
【０００９】ハイブリダイゼーション法に用いられるプ
ローブとしては、例えば、配列番号４で示される塩基配
列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列から
なるＤＮＡ、配列番号５で示される塩基配列の塩基番号
５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配
列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０
で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５４で示
される塩基配列の塩基番号１４１９〜６１６４で表され
る塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらＤＮＡの部分塩
基配列を有するＤＮＡ等があげられる。ハイブリダイゼ
ーションの条件としては、例えば、6×SSC（0.9M塩化ナ
トリウム、0.09Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト
溶液（0.1(w/v)フィコール400、0.1(w/v)ポリビニルピ
ロリドン、0.1(w/v)BSA）、0.5(w/v)SDS及び100μg/ml
変性サケ精子DNA存在下に、65℃で保温し、次いで１×S
SC（0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウ
ム）及び0.5(w/v)SDS存在下に、室温で15分間の保温を2
回行い、さらに0.1×SSC（0.015M 塩化ナトリウム、0.0
015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5(w/v)SDS存在下に、6
8℃で30分間保温する条件等をあげることができる。ま
た、例えば、5xSSC、50mMHEPES pH7.0、10xデンハルト
溶液及び20μg/ml変性サケ精子DNA存在下に65℃にて保
温し、次いで2xSSC中で室温にて３０分間の保温を行
い、さらに0.1xSSC中で６５℃にて４０分間の保温を２
回行う条件をあげることもできる。尚、本発明ＤＮＡ
は、例えば配列番号４、５、６もしくは５４のいずれか
で示される塩基配列に基づいて、例えばホスファイト・
トリエステル法（Hunkapiller,M.et al.,Nature,310,10
5,1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行
うことにより調製することもできる。
【００１０】このようにして得られた本発明ＤＮＡは、
例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキ
ュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd e
dition）、コールドスプリング ハーバーラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年等に
記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニン
グすることができる。具体的には例えば、TAクローニン
グキット（Invitrogen社）やpBluescriptII（Stratagen
e社）などの市販のプラスミドベクターを用いてクロー
ニングすることができる。得られた本発明ＤＮＡの塩基
配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M &W.Gilb
ert,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,560,1977等に記載され
る)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson,J.Mo
l.Biol.,94,441,1975、Sanger,F,& Nicklen and A.R.Co
ulson.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463,1977等に記載
される）等により確認することができる。本発明ＤＮＡ
の具体例としては、配列番号４で示される塩基配列の塩
基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列を有するＤ
ＮＡ、配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
２４５６で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号
６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表さ
れる塩基配列、配列番号５４で示される塩基配列の塩基
番号１４１９〜６１６４で表される塩基配列を有するＤ
ＮＡ等をあげることができる。本発明ＤＮＡは、drebri
n 1の発現を促進する能力を有している。drebrin 1はア
ルツハイマー症患者の細胞内において激減しており、そ
の改善はアルツハイマー症における認識力機能不全およ
び記憶力不全の治療に寄与する。
【００１１】本発明ＤＮＡを、該遺伝子が導入される宿
主細胞において利用可能なベクター（以下、基本ベクタ
ーと記す。）、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情
報を含み、自立的に増殖でき、宿主細胞からの単離、精
製が可能であり、検出可能なマーカーをもつベクター
に、通常の遺伝子工学的手法に準じて組み込むことによ
り本発明ベクターを構築することができる。本発明ベク
ターの構築に用いることができる基本ベクターとして
は、具体的には大腸菌を宿主細胞とする場合、例えばプ
ラスミドpUC119(宝酒造社製)や、ファージミドpBluescr
iptII(Stratagene社製)等を上げることができる。出芽
酵母を宿主細胞とする場合は、プラスミドpGBT9、pGAD4
24、pACT2(Clontech社製)などをあげることができる。
また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合はpRc/RS
V、pRc/CMV(Invitrogen社製)等のプラスミド、ウシパピ
ローマウイルスプラスミドpBPV(アマシャムファルマシ
アバイオテク社製)もしくはEBウイルスプラスミドpCEP4
(Invitrogen社製)等のウイルス由来の自律複製起点を含
むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルスなどをあ
げることができ、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合
には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげること
ができる。バキュロウイルスやワクシニアウイルス等の
ウイルスに本発明ＤＮＡを組み込むには、使用しようと
するウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するトラ
ンスファーベクターを用いることができる。このような
トランスファーベクターの具体的例としては、Pharming
en社から市販されているpVL1392,pVL1393(Smith,G.E.,S
ummers M.D.et al.:Mol.Cell.Biol.,3,2156-2165(198
3))、pSFB5(Funahashi,S.et al.:J.Virol.,65,5584-558
8(1991))などのプラスミドをあげることができる。本発
明ＤＮＡを前記のようなトランスファーベクターに挿入
し、該トランスファーベクターとウイルスのゲノムとを
同時に宿主細胞に導入すると、トランスファーベクター
とウイルスのゲノムとの間で相同組換えが起こり、本発
明遺伝子がゲノム上にくみこまれたウイルスを得ること
ができる。ウイルスのゲノムとしては、Baculovirus,Ad
enovirus,Vacciniavirusなどのゲノムを用いることがで
きる。より具体的には、例えばバキュロウイルスに本発
明遺伝子を組み込む場合、トランスファーベクターpVL1
393,pVL1392等のマルチクローニング部位に本発明ＤＮ
Ａを挿入した後、該トランスファーベクターのDNAとBac
ulovirus genome DNA(Baculogold;Pharmingen社製)とを
昆虫細胞Sf21株（ATCCから入手可能）にリン酸カルシウ
ム法等により導入し、得られた細胞を培養する。培養液
から遠心分離等により、本発明ＤＮＡが挿入されたウイ
ルスのゲノムを含有するウイルス粒子を回収し、これを
フェノール等で除蛋白処理することにより、本発明ＤＮ
Ａを含有するウイルスのゲノムを得ることができる。さ
らに、該ウイルスのゲノムを、昆虫細胞Sf21株などのウ
イルス粒子形成能を有する宿主細胞にリン酸カルシウム
法等により導入し、得られる細胞を培養することによ
り、本発明ＤＮＡを含有するウイルス粒子を増やすこと
ができる。一方、マウス白血病レトロウイルスなどの比
較的小さなゲノムへは、トランスファーベクターを利用
せずに、本発明ＤＮＡを直接組み込むこともできる。例
えばウイルスベクタ-DC(X)（Eli Gilboa et al.,BioTec
hniques,4,504-512(1986)）などは、該ベクター上のク
ローニング部位に本発明ＤＮＡを組み込む。得られた本
発明ＤＮＡの組込まれたウイルスベクターを、例えばAm
pli-GPE（J.Virol.,66,3755(1992)）などのパッケージ
ング細胞に導入することにより、本発明ＤＮＡの挿入さ
れたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を得るこ
とができる。
【００１２】本発明ＤＮＡの上流に、宿主細胞で機能可
能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上
述のような基本ベクターに組み込むことにより、本発明
ＤＮＡを宿主細胞で発現させることの可能な本発明ベク
ターを構築することができる。ここで、「機能可能な形
で結合させる」とは、本発明ＤＮＡが導入される宿主細
胞において、プロモーターの制御下に本発明ＤＮＡが発
現されるように、該プロモーターと本発明遺伝子とを結
合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモ
ーターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター
活性を示すＤＮＡをあげることができる。例えば、宿主
細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペ
ロンのプロモーター（lacP）、トリプトファンオペロン
のプロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモー
ター(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(gal
P)、tacプロモーター、T7プロモーター、T3プロモータ
ー、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげ
ることができ、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場
合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモータ
ー、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミア
ンウイルス(SV40)の初期又は後期プロモーター、マウス
乳頭腫ウイルス(MMTV)プロモーター等をあげることがで
きる。宿主細胞が出芽酵母である場合にはADH1プロモー
ターなどをあげることができる。また、宿主細胞におい
て機能するプロモーターをあらかじめ保有する基本ベク
ターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーター
と本発明ＤＮＡとが機能可能な形で結合するように、該
プロモーターの下流に本発明ＤＮＡを挿入すればよい。
例えば、前述のプラスミドpRc/RSV、pRc/CMV等は、動物
細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部
位が設けられており、該クローニング部位に本発明ＤＮ
Ａを挿入し動物細胞へ導入することにより、本発明ＤＮ
Ａを発現させることができる。これらのプラスミドには
あらかじめSV40の自律複製起点（ori）が組み込まれて
いるため、oriを欠失したSV40ゲノムで形質転換された
培養細胞、例えばCOS細胞等に該プラスミドを導入する
と、細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大し、結
果として該プラスミドに組み込まれた本発明ＤＮＡを大
量発現させることもできる。また前述の酵母用プラスミ
ドpACT2はADH1プロモーターを有しており、該プラスミ
ド又はその誘導体のADH1プロモーターの下流に本発明Ｄ
ＮＡを挿入すれば、本発明ＤＮＡを例えばCG1945(Clont
ech社製)等の出芽酵母内で大量発現させることが可能な
本発明ベクターが構築できる。
【００１３】さらに、本発明ＤＮＡ又はその部分塩基配
列を有するＤＮＡと、他の所望の蛋白質をコードするＤ
ＮＡとをその読み枠を合わせて結合し、その上流に、宿
主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合
させ、これを上述のような基本ベクターに組み込むこと
により、本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有す
るポリペプチドと、前記所望の蛋白質との融合蛋白質を
コードするＤＮＡを宿主細胞で発現させることの可能な
本発明ベクターを構築することもできる。このような本
発明ベクターの構築には、宿主細胞において機能するプ
ロモーターと、前記所望の蛋白質をコードするＤＮＡと
をあらかじめ保有する基本ベクターを使用することもで
きる。本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有する
ポリペプチドと、Gal４DNA結合領域との融合蛋白質をコ
ードするＤＮＡを発現させる場合には、例えば宿主細胞
が出芽酵母であればpGBT9やpAS2（クロンテック社製）
等を、宿主細胞が動物細胞であればpMベクター（クロン
テック社製）等を用いることができる。本発明蛋白質又
はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドと、LexA
DNA結合領域との融合蛋白質をコードするＤＮＡを発現
させる場合には、例えば出芽酵母発現用pGildaベクター
（クロンテック社製）等を用いることができる。本発明
蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチド
と、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴ
と記す。）との融合蛋白質をコードするＤＮＡを発現さ
せる場合には、例えば大腸菌発現用ｐGEXシリーズベク
ター（アマシャムファルマシア社製）等を用いることが
できる。
【００１４】構築された本発明ベクターを宿主細胞に導
入することにより、本発明形質転換体を取得することが
できる。本発明ベクターを宿主細胞へ導入する方法とし
ては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用すること
ができる。例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合は、J.
Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラークロ
ーニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、
コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Sprin
g Harbor Laboratory）発行、1989年等に記載される塩
化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の
方法を用いることができる。また、哺乳類動物細胞又は
昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合は、例えば、リン
酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレ
ーション法、又はリポフェクション法等の一般的な遺伝
子導入法に準じて前記細胞に導入することができる。酵
母を宿主細胞とする場合は、例えばリチウム法を基にし
たYeast transformation kit(Clontech社製)などを用い
て導入することができる。尚、ウイルスをベクターに用
いる場合には、上述のように一般的な遺伝子導入法によ
りウイルスのゲノムを宿主細胞に導入できるほか、本発
明ＤＮＡの挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイ
ルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによっても、該
ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入することができる。
【００１５】本発明形質転換体を選抜するには、例え
ば、本発明ベクターと同時にマーカー遺伝子を宿主細胞
へ導入し、マーカー遺伝子の性質に応じた方法で細胞を
培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞
に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する
遺伝子である場合には、該薬剤を添加した培地を用い
て、本発明ベクターが導入された宿主細胞を培養すれば
良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとし
ては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイ
シンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子
とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジン
Ｓ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ
などをあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿
主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、
該栄養素を含まない最少培地を用いて、本発明ベクター
が導入された細胞を培養すればよい。本発明ＤＮＡが宿
主細胞の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を取
得するには、例えば、本発明ベクターとマーカー遺伝子
を有するベクターとを制限酵素等で消化することにより
直鎖状にした後、これらを前述の方法で宿主細胞へ導入
して該細胞を通常数週間培養し、導入されたマーカー遺
伝子の発現を指標にして目的とする形質転換体を選抜し
取得すればよい。また、例えば、上記のような選抜薬剤
に対する耐性付与遺伝子をマーカー遺伝子として有する
本発明ベクターを前述の方法で宿主細胞に導入し、該細
胞を選抜薬剤が添加された培地で数週間以上継代培養し
て、コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純
化培養することにより、本発明ＤＮＡが宿主細胞の染色
体に導入されてなる本発明形質転換体を選抜し取得する
こともできる。導入された本発明ＤＮＡが宿主細胞の染
色体に組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲ
ノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、
調製されたゲノムＤＮＡから、導入された本発明ＤＮＡ
の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ
ーに用いるＰＣＲや、導入された本発明ＤＮＡをプロー
ブに用いるサザンハイブリダイゼーション等の方法を利
用して、本発明ＤＮＡの存在を検出すればよい。かかる
形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠
して使用することができるので、実験毎の形質転換体作
製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性質や取
扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を実施す
ることが可能となる。
【００１６】上述のようにして得られた本発明形質転換
体を培養することにより本発明蛋白質を産生させること
ができる。例えば、本発明形質転換体が微生物である場
合、該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に
使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜
含む各種の培地を用いて培養することができる。培養
は、一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体
培養、液体培養（旋回式振とう培養、往復式振とう培
養、ジャーファーメンター（JarFermenter）培養、タン
ク培養等）などが可能である。培養温度及び培地のｐＨ
は、微生物が生育する範囲から適宜選ぶことができ、例
えば、約15℃〜約40℃の培養温度にて、約6〜約8の培地
pHで培養するのが一般的である。培養時間は、種々の培
養条件によって異なるが、通常約１日間〜約5日間であ
る。温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導型のプロモータ
ーを有する発現ベクターを用いた場合には誘導時間は1
日間以内が望ましく、通常数時間である。また、上記形
質転換体が哺乳類、昆虫類等の動物細胞である場合、該
形質転換体は一般の培養細胞における通常の培養に使用
される培地を用いて培養することができる。選抜薬剤を
利用して当該形質転換体を作製した場合は、該選抜薬剤
の存在下に培養するのが望ましい。哺乳類動物細胞の場
合、例えば終濃度が10％(v/v)となるようFBSを添加した
DMEM培地（ニッスイ社製等）を用いて37℃、5％CO2存在
下等の条件で数日ごとに新しい培養液に交換しながら培
養する。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、
例えば0.25(w/v)程度となるようトリプシンが添加され
たPBS溶液を加えて個々の細胞に分散させ、数倍に希釈
して新しいシャーレに播種し培養を続ける。昆虫類動物
細胞の場合も同様に、例えば10％(v/v)FBS及び2％(w/v)
Yeastlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培養液
を用いて培養温度25℃から35℃で培養すればよい。この
際、Sf21細胞などのシャーレからはがれやすい細胞の場
合は、トリプシン液を用いずピペッテイングにより分散
させ継代培養を行なうことができる。また、バキュロウ
イルス等のウイルスベクターを含む形質転換体の場合
は、培養時間は細胞質効果が現れて細胞が死滅する前、
例えばウイルス感染後72時間までとするのが好ましい。
本発明形質転換体により産生された本発明蛋白質の回収
は、適宜、通常の単離、精製の方法を組み合わせて行う
ことができ、例えば、培養終了後、形質転換体の細胞を
遠心分離等で集め、集められた該細胞を通常のバッファ
ーに懸濁した後、ポリトロン、超音波処理、ダウンスホ
モジナイザー等で破砕し、破砕液を遠心分離して上清画
分を回収することにより、本発明蛋白質を含む画分を得
ることができる。さらに、前記上清画分をイオン交換、
疎水、ゲルろ過、アフィニティ等の各種クロマトグラフ
ィーに供することにより、より精製された本発明蛋白質
を回収することもできる。また、本発明蛋白質又はその
部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを、ＧＳＴとの
融合蛋白質として産生させた場合には、グルタチオンセ
ファロース（アマシャムファルマシア社製）を用いたア
フィニティクロマトグラフィーで精製することができ
る。このようにして製造された本発明蛋白質は、例え
ば、本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有するポ
リペプチドを認識する抗体を作製するための免疫抗原と
して用いることができ、また、本発明蛋白質に結合する
物質をスクリーニングするためのアッセイ等に用いるこ
ともできる。
【００１７】上述のように製造された本発明蛋白質を免
疫抗原として、例えばマウス、ウサギ、ニワトリ等の動
物を、Frederick M.Ausubel et al.著；Short Protocol
s inMolecular Biology 3nd Edition, John Wiley＆Son
s,Inc 記載の免疫学的方法に準じて免疫感作することに
より、本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有する
ポリペプチドを認識する抗体を作製することができる。
具体的には例えば、まず、抗原として用いる本発明蛋白
質と完全Freunds adjuvantとを混合してエマルジョン化
する。得られたエマルジョンをウサギに皮下投与する。
約４週間後に、不完全Freunds adjuvantと混合してエマ
ルジョン化した抗原を投与する。必要に応じて、さらに
２週間毎に同様に投与を行なう。採血して血清画分を調
製し、本発明蛋白質に対する抗体価を確認する。このよ
うにして得られた本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配
列を有するポリペプチドを認識する抗体価を有する血清
画分を通常の硫安沈殿法等に準じて分画することによ
り、本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有するポ
リペプチドを認識するIgGを得ることができる。また、
本発明蛋白質の部分アミノ酸配列を有するポリペプチド
を化学合成し、これを免疫抗原として動物に投与するこ
とにより、本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有
するポリペプチドを認識する抗体を作製することもでき
る。免疫抗原として用いるポリペプチドのアミノ酸配列
としては、例えば、配列番号１〜３のいずれかで示され
るアミノ酸配列の中から、他の蛋白質のアミノ酸配列と
のホモロジーがなるべく低くかつ免疫感作する動物種の
有する本発明蛋白質のアミノ酸配列とも相違の多いアミ
ノ酸配列を選択する。選択されたアミノ酸配列からなる
１０アミノ酸から１５アミノ酸程度の長さのポリペプチ
ドを、通常の方法に準じて化学合成し、Limulus plyhem
usのhemocyanin等のキャリアー蛋白質とMBS等により架
橋した後、上記と同様にウサギ等の動物に免疫する。こ
のようにして作製される本発明蛋白質又はその部分アミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体と被検試
料とを接触させ、被検試料中の蛋白質と前記抗体との複
合体を、通常の免疫学的手法に準じて検出することによ
り、該被検試料中の本発明蛋白質を検出することができ
る。このような検出法により、例えば、各種組織におけ
る本発明蛋白質の量や分布の測定などを行うことができ
る。具体的には、精神遅滞を伴う疾患又はアルツハイマ
ー症の診断薬として当該抗体を利用する場合には、当該
抗体を用いた免疫染色により前記疾患の有無や進行具合
を検出するなどの検査が可能となる。
【００１８】本発明蛋白質に結合する物質をスクリーニ
ングする方法は、（１）本発明蛋白質又はその部分アミ
ノ酸配列を有するポリペプチドと被検物質とを接触させ
る工程、及び（２）本発明蛋白質又はその部分アミノ酸
配列を有するポリペプチドに結合する物質を選択する工
程を含む。具体的な方法としては、例えば、本発明蛋白
質を結合させたカラムに被検試料を接触させカラムに結
合した物質を精製する方法、ウェストウェスタンブロッ
ティング法などの公知の方法を利用することができる。
スクリーニングに用いる被検試料としては、例えば、細
胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子
化合物、合成ペプチド、天然由来の化合物などがあげら
れる。かかるスクリーニング方法によれば、本発明蛋白
質のリガンドや、本発明蛋白質に結合してその活性を調
節する機能を有する蛋白質（抗体を含む）等を単離する
ことができる。
【００１９】本発明蛋白質の転写調節能は、例えば、該
蛋白質をコードするＤＮＡとレポーター遺伝子とを用い
たアッセイにより測定することができる。具体的には、
まず、 i）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合
領域と、本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有す
るポリペプチドとの融合蛋白質をコードするＤＮＡが、
宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に接続され
てなるキメラ遺伝子、と ii）i）記載のＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡと宿
主細胞内で機能可能な最小プロモーターとを含むプロモ
ーターの下流に、レポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
が接続されてなるレポーター遺伝子とが宿主細胞に導入
されてなる形質転換体（以下、測定用形質転換体と記
す。）を作製する。また、測定の対照として、 iii）i）記載のＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡが、
i）記載のプロモーターの下流に接続されてなる遺伝
子、と ii）記載のレポーター遺伝子とが宿主細胞に導入されて
なる形質転換体（以下、対照用形質転換体と記す。）を
作製する。 ｉ）記載の「宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤ
ＮＡ結合領域」としては、例えば、酵母由来の転写調節
因子GAL4のDNA結合領域、ハ゛クテリア由来のリフ゜レッサーLexA等を
あげることができる。これらをコードするDNAと、本発
明ＤＮＡもしくは本発明ＤＮＡの部分塩基配列であって
本発明蛋白質の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列
を有するDNAとを、その塩基配列の読み枠を合わせて連
結し、連結されたＤＮＡの上流に、宿主細胞で機能可能
なプロモーターを機能可能な形で結合させることによ
り、ｉ）記載の「宿主細胞内で機能可能な転写調節因子
のＤＮＡ結合領域と、本発明蛋白質又はその部分アミノ
酸配列を有するポリペプチドとの融合蛋白質をコードす
るＤＮＡが、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下
流に接続されてなるキメラ遺伝子」が得られる。なお、
前記の「本発明ＤＮＡの部分塩基配列であって本発明蛋
白質の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する
DNA」としては、例えば、配列番号１〜３のいずれかで
示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１００付近から８
００付近までのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有
するDNA等をあげることができる。プロモーターとして
は、例えば、宿主細胞が出芽酵母細胞である場合には、
GAL1プロモーターのような誘導型プロモーターや、ADH
プロモーターのような恒常的に発現するプロモーター等
を使用することができる。宿主細胞が動物細胞である場
合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモータ
ー、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター等をあげ
ることができる。 ii）記載のレポーター蛋白質としては、ルシフェラー
ゼ、分泌型アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダ
ーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ、成長ホルモンなどを利用することができ、宿主細胞
における安定性が比較的高いレポーター蛋白質が好まし
い。このようなレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
は、i）記載のＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡと宿
主細胞内で機能可能な最小プロモーターとを含むプロモ
ーターの下流に接続される。例えば、GAL4のDNA結合領
域が結合可能なＤＮＡとしては、GAL1プロモーターのGA
L4結合領域をあげることができ、LexAが結合可能なＤＮ
Ａとしては、LexA結合領域があげられる。また、宿主細
胞内で機能可能な最小プロモーターとしては、宿主細胞
で発現可能な遺伝子由来の最小TATAボックス配列からな
るＤＮＡをあげることができ、具体的には、TATAボック
ス及び転写開始点近傍の約５０塩基程度からなる塩基配
列を有するＤＮＡがあげられる。上記iii）の「i）記載
のＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡが、i）記載のプ
ロモーターの下流に接続されてなる遺伝子」は、i）記
載のキメラ遺伝子の作製に使用された「宿主細胞内で機
能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域」をコードする
ＤＮＡを、i）記載のキメラ遺伝子の作製に使用された
「宿主細胞で機能可能なプロモーター」の下流に機能可
能な形で結合させることによって得ることができる。
【００２０】i）〜iii）記載の遺伝子を、例えばそれぞ
れベクターに挿入し、それらを上記の組合わせで宿主細
胞に導入して形質転換体（いわゆるワンハイブリッドシ
ステム）を取得する。また、上記i）記載の遺伝子の代
わりに、(a) 宿主細胞内で２種類の蛋白質からなる複合
体を形成可能な一組の蛋白質のうちの一方の蛋白質と上
記i）記載のＤＮＡ結合領域との融合蛋白質をコードす
るキメラ遺伝子、及び、(b) 宿主細胞内で２種類の蛋白
質からなる複合体を形成可能な一組の蛋白質のうちの他
方の蛋白質と本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を
有するポリペプチドとの融合蛋白質をコードするキメラ
遺伝子、の両者のキメラ遺伝子を宿主細胞に導入して測
定用形質転換体（いわゆるツーハイブリッドシステム）
を取得してもよい。宿主細胞としては、例えば、HeLa細
胞、IMR32細胞などの哺乳類動物細胞や、出芽酵母細胞
等があげられる。尚、ii）記載のレポーター遺伝子を含
有するベクターとして、pFR-LUC（ストラタジーン社
製）のような市販のベクターを使用してもよい。また、
宿主細胞が、上記ii）のレポーター遺伝子として利用可
能な内在性のレポーター遺伝子を有する場合はそれを利
用しても良く、この場合はレポーター遺伝子の導入を省
略することができる。
【００２１】上述のように作製された測定用形質転換体
及び対照用形質転換体を、例えば数時間から数日間した
後、それぞれの形質転換体におけるレポーター遺伝子の
発現量を測定する。具体的には、例えば、レポーター蛋
白質としてルシフェラーゼを用いた場合には、各形質転
換体から調製された細胞粗抽出物に、ルシフェラーゼの
基質であるルシフェリンを加えると、細胞粗抽出物中の
ルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、
この発光強度をルミノメーターなどの測定装置で測定す
ることにより、ルシフェラーゼの量、ひいては、ルシフ
ェラーゼ（レポーター）遺伝子の発現量を知ることがで
きる。対照用形質転換体におけるレポーター遺伝子の発
現量に比較して、測定用形質転換体におけるレポーター
遺伝子の発現量が高い場合には、該測定用形質転換体に
導入されたＤＮＡにコードされる本発明蛋白質又はその
部分アミノ酸配列を有するポリペプチドは、転写調節能
（この場合には転写活性化能）を有すると評価すること
ができる。また、対照用形質転換体におけるレポーター
遺伝子の発現量に比較して、測定用形質転換体における
レポーター遺伝子の発現量が低い場合には、該測定用形
質転換体に導入されたＤＮＡにコードされる本発明蛋白
質又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドは、
転写抑制能を有すると評価することができる。例えば、
本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有するポリペ
プチドは、宿主細胞としてＩＭＲ３２等の神経細胞を用
いる場合において転写活性化能を有している。
【００２２】上記の測定用形質転換体を使用して、本発
明蛋白質の転写調節能を変化させる物質をスクリーニン
グすることもできる。測定用形質転換体を、例えば1日
間から数日間培養する間に、被検物質を培地中に加えて
該形質転換体と接触させ、被検物質存在下におけるレポ
ーター遺伝子の発現量を測定する。一方、同様にして、
測定用形質転換体に被検物質を接触させない条件下にお
けるレポーター遺伝子の発現量を測定する。被検物質非
存在下における発現量と、被検物質存在下における発現
量とを比較し、被検物質の存在の有無により異なる発現
量をもたらす被検物質を選ぶことにより、該測定用形質
転換体に導入されたＤＮＡにコードされる本発明蛋白質
又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドの転写
調節能を変化させる物質を選択することができる。
【００２３】また、細胞単位での本発明蛋白質の転写調
節能を変化させる物質（言い換えれば、本発明蛋白質に
よる転写調節を変化させる物質）をスクリーニングする
ためのアッセイとしては、例えば、本発明蛋白質をコー
ドする遺伝子の発現調節領域とレポーター蛋白質をコー
ドするＤＮＡとが機能可能な形で連結されてなるレポー
ター遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体に、
被検物質を接触させる方法を用いることができる。例え
ば、本発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有するポ
リペプチドの細胞内発現量を変化させる物質をスクリー
ニングする方法であって、 （１）前記蛋白質をコードする遺伝子の発現調節領域と
レポーター蛋白質をコードするＤＮＡとが機能可能な形
で連結されてなるレポーター遺伝子が宿主細胞に導入さ
れてなる形質転換体と、被検物質とを接触させ、被検物
質存在下における前記レポーター遺伝子の発現量を測定
する工程、及び （２）（１）で測定されたレポーター遺伝子の発現量
が、被検物質非存在下における当該レポーター遺伝子の
発現量とは実質的に異なる被検物質を選択する工程、を
含む方法をあげることができる。当該スクリーニング方
法は、いわゆるレポータージーンアッセイを用いて、本
発明蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプ
チドによる転写調節を変化させる物質をスクリーニング
する方法である。
【００２４】前記形質転換細胞は、以下のようにして調
製することができる。まず、本発明蛋白質をコードする
遺伝子の発現調節領域を、必要に応じて例えば、（i）
５’−レース法（5'-RACE法）(例えば、５’full Race
Core Kit（宝酒造社製）等を用いて実施されうる)、オ
リゴキャップ法、S1プライマーマッピング等の通常の方
法により、本発明蛋白質をコードすｍＲＮＡの５’末端
を決定するステップ；（ii）Genome Walker Kit(クロー
ンテック社製)等を用いてｍＲＮＡの５’末端よりも上
流の領域のゲノムＤＮＡを取得し、得られたゲノムＤＮ
Ａについてプロモーター活性を測定するステップ；を含
む手法等により同定する。次いで、同定された発現調節
領域を、通常の遺伝子工学的手法に従って取得し、取得
された発現調節領域を、β-グルクロニダーゼ（GUS）、
ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ（CAT）、β-ガラクトシダーゼ、グリーン
蛍光蛋白質（GFP）等のレポーター蛋白質をコードする
ＤＮＡに機能可能な形で連結することにより、本発明蛋
白質をコードする遺伝子の発現調節領域とレポーター蛋
白質をコードするＤＮＡとが機能可能な形で連結されて
なるレポーター遺伝子を調製する。ここで「機能可能な
形で連結する」とは、シグナルや因子に応答した発現調
節領域の制御下にレポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
が発現されるように、該発現調節領域と該ＤＮＡとを連
結することを意味する。また「発現調節領域」とは、細
胞型特異的もしくは組織特異的な制御に係るプロモータ
ー要素や、シグナルもしくは因子（例えば、転写活性化
蛋白質等）に応答して遺伝子発現を引き起こすプロモー
ター要素などを含み、かつ転写を促すために必要な配列
を含む領域を意味する。尚、上記のようなプロモーター
要素は、発現させようとする蛋白質をコードするＤＮＡ
の５’上流領域または３’下流領域のいずれかに位置さ
せればよい。次に、本発明蛋白質をコードする遺伝子の
発現調節領域とレポーター蛋白質をコードするＤＮＡと
が機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を通
常の遺伝子工学的手法を用いて、当該レポーター遺伝子
を導入する細胞において使用可能なベクターに挿入する
ことにより、プラスミドを作製する。次いで、前記プラ
スミドを、選択マーカー遺伝子とともに細胞へ導入す
る。細胞への導入法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法、電気導入法、ＤＥＡＥデキストラン法、ミセル形
成法等を挙げることができる。リン酸カルシウム法とし
てはGrimm, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93, 10923-10927等に記載される方法、電気導入法及び
ＤＥＡＥデキストラン法としてはTing, A. T. et al.,
EMBO J., 15, 6189-6196等に記載される方法、ミセル形
成法としてはHawkins, C. J. et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 93, 13786-13790等に記載される方法を挙
げることができる。ミセル形成法を用いる場合には、リ
ポフェクトアミン（ギブコ製）やフュージーン（ベーリ
ンガー製）等の市販の試薬を利用してもよい。
【００２５】上記プラスミドの導入処理を施した細胞
を、選択マーカー遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養
することにより、前記蛋白質をコードする遺伝子の発現
調節領域とレポーター蛋白質をコードするＤＮＡとが機
能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子が宿主細
胞に一過性に導入されてなる形質転換体を選抜すること
ができる。さらに選抜を続けて、当該レポーター遺伝子
が宿主細胞の染色体に導入されてなる形質転換体（安定
形質転換体）を取得してもよい。導入されたレポーター
遺伝子が染色体に組込まれたことを確認するには、当該
形質転換体のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に
準じて調製し、上記レポーター遺伝子の部分塩基配列を
有するＤＮＡをプライマーとして用いるＰＣＲや、上記
レポーター遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプロ
ーブとして用いるサザンハイブリダイゼーション等の方
法を利用して、ゲノムＤＮＡ中の上記レポーター遺伝子
の存在を検出・確認すればよい。
【００２６】上記のスクリーニング方法において、上記
形質転換体と接触させる被検物質の濃度は、通常、約
０．１μＭ〜約１０μＭであればよく、１μＭ〜１０μ
Ｍが好ましい。当該形質転換体と被検物質とを接触させ
る時間は、通常、１８時間以上６０時間程度であり、好
ましくは２４時間から４０時間程度が挙げられる。「レ
ポーター遺伝子の発現量を測定する」方法としては、例
えば、上記形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現
量を時間経過に沿って連続的に又は不連続に測定する方
法をあげることができる。例えば、レポーター遺伝子が
ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、ルシフェラーゼ
アッセイ試薬（プロガメ社）等の市販の測定用試薬を利
用することができる。また、「実質的に異なる被検物質
を選択する」とは、被検物質非存在下における発現量と
比較して被検物質存在下における発現量が１０％以上、
好ましくは３０％以上、更に好ましくは５０％以上増加
するような変化が認められた化合物を選択すればよい。
このようなスクリーニング方法により選抜された物質ま
たはその薬学的に許容される塩は、それらを有効成分と
して含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製
剤化されてなることを特徴とする本発明遺伝子の発現調
節剤として利用してもよい。
【００２７】ヒト等の動物個体が保有する本発明蛋白質
をコードする遺伝子の遺伝子型を分析する方法として
は、例えば、被検個体から得られる試料に含まれるゲノ
ムＤＮＡやＲＮＡ等の核酸において、本発明蛋白質をコ
ードする塩基配列が、標準蛋白質のアミノ酸配列とは異
なるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有している
か否かを調べる方法をあげることができる。具体的には
例えば、まず、ヒト等の被検個体から試料を採取し、該
試料からゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを調製する。例えば、
毛髪、末梢血、口腔上皮細胞などの細胞組織の試料か
ら、例えば村松正寶、”ラボマニュアル遺伝子工学”
（丸善１９８８）やTAKARA PCR Technical news No2,宝
酒造（１９９１．９）等に記載される通常の方法に準じ
てゲノムＤＮＡを調製することができる。例えば試料が
毛髪の場合には、毛髪２〜３本を滅菌水、次いでエタノ
ールで洗浄した後、2〜3 mmの長さに切断し、これにBCL
-Buffer［10mM Tris-HCl(pH7.5), 5 mM MgCl2, 0.32M S
ucrose, 1 Triton X-100］200μｌを加え、さらにProte
inaseKを最終濃度100μｌ/ml 、ＳＤＳを最終濃度0.5
（w/v）になるようにそれぞれ加え混合する。この混合
物を70℃で1時間保温した後、フェノール／クロロホル
ム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡを得ることができ
る。また、試料が末梢血の場合は、DNA-Extraction kit
(Stratagene社製)等を用いて該試料を処理することによ
りゲノムＤＮＡを得ることができる。また、試料が新鮮
な生検組織サンプルである場合は、該試料から、例えば
TRIZOL試薬（GIBCO社製）等を用いてＲＮＡを調製す
る。調製されたＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素を作用さ
せることによりｃＤＮＡを合成することができる。
【００２８】このようにして調製されたゲノムＤＮＡ、
ｃＤＮＡ等から、必要に応じて、本発明蛋白質をコード
するＤＮＡをPCR等の手法により増幅する。ゲノムＤＮ
Ａから、本発明蛋白質をコードするＤＮＡを、ＰＣＲで
増幅するために使用することのできるプライマーとして
は、例えば、配列番号４、５、６もしくは５４のいずれ
かで示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配
列からなるポリヌクレオチドに対してポリメラーゼチェ
イン反応条件下でアニールすることができ、１０塩基以
上５０塩基以下の塩基からなるポリヌクレオチドをあげ
ることができ、具体的には、配列番号４、５、６もしく
は５４のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列又
は該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有し、１０塩基
以上５０塩基以下の塩基からなるポリヌクレオチドをあ
げることができる。より具体的にはフォワードプライマ
ーとして、配列番号７又は８で示される塩基配列からな
るポリヌクレオチド等をあげることができ、リバースプ
ライマーとして、配列番号９又は１０で示される塩基配
列からなるポリヌクレオチド等をあげることができる。
ゲノムＤＮＡにおいて、本発明蛋白質は８つのエクソン
に分かれてコードされている（以下、本発明蛋白質をコ
ードする塩基配列を含むエクソンを、５’上流側から順
にエクソン１〜８と記す。）。例えば、ヒト由来の本発
明蛋白質をコードする配列番号４で示される塩基配列
は、以下の８つに分かれてエクソンに含まれる。 塩基番号１〜２７６で表される塩基配列；エクソン１ 塩基番号２７７〜４２８で表される塩基配列；エクソン２ 塩基番号４２９〜５３１で表される塩基配列；エクソン３ 塩基番号５３２〜７９９で表される塩基配列；エクソン４ 塩基番号８００〜９０９で表される塩基配列；エクソン５ 塩基番号９１０〜１０４５で表される塩基配列；エクソン６ 塩基番号１０４６から２４８１で表される塩基配列；エクソン７ 塩基番号２４８２から３２５２で表される塩基配列；エクソン８
【００２９】そこで、ゲノムＤＮＡから、本発明蛋白質
をコードするゲノム遺伝子のエクソンの塩基配列と、該
エクソンに隣接するイントロンの塩基配列の一部とを含
むＤＮＡを増幅してもよい。このようなＤＮＡを増幅す
るために用いることができるプライマーとしては、例え
ば、配列番号４３〜５１のいずれかで示される塩基配列
又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレ
オチドに対してポリメラーゼチェイン反応条件下でアニ
ールすることができ、１０塩基以上５０塩基以下の塩基
からなるポリヌクレオチドをあげることができ、具体的
には、配列番号４３〜５１のいずれかで示される塩基配
列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配
列を有し、１０塩基以上５０塩基以下の塩基からなるポ
リヌクレオチドをあげることができる。かかるプライマ
ーは例えば、以下のようにして設計することができる。
エクソン１とその５’上流側の非翻訳領域の配列を含む
ＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマー；配列番
号４３で示される塩基配列に基づき設計する。 例）配列番号11又は12で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン１とその３’下流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのリバースプライマー；配列番号４４
で示される塩基配列に相補的な塩基配列に基づき設計す
る。 例）配列番号13又は14で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン２とその５’上流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのフォワードプライマー；配列番号４
４で示される塩基配列に基づき設計する。 例）配列番号15又は16で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン２とその３’下流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのリバースプライマー；配列番号４５
で示される塩基配列に相補的な塩基配列に基づき設計す
る。 例）配列番号17又は18で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン３とその５’上流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのフォワードプライマー；配列番号４
５で示される塩基配列に基づき設計する。 例）配列番号19又は20で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン３とその３’下流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのリバースプライマー；配列番号４６
で示される塩基配列に相補的な塩基配列に基づき設計す
る。 例）配列番号21又は22で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン４とその５’上流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのフォワードプライマー；配列番号４
６で示される塩基配列に基づき設計する。 例）配列番号23又は24で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン４とその３’下流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのリバースプライマー；配列番号４７
で示される塩基配列に相補的な塩基配列に基づき設計す
る。 例）配列番号25又は26で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン５とその５’上流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのフォワードプライマー；配列番号４
７で示される塩基配列に基づき設計する。 例）配列番号27又は28で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン５とその３’下流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのリバースプライマー；配列番号４８
で示される塩基配列に相補的な塩基配列に基づき設計す
る。 例）配列番号29又は30で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン６とその５’上流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのフォワードプライマー；配列番号４
８で示される塩基配列に基づき設計する。 例）配列番号31又は32で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン６とその３’下流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのリバースプライマー；配列番号４９
で示される塩基配列に相補的な塩基配列に基づき設計す
る。 例）配列番号33又は34で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン７とその５’上流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのフォワードプライマー；配列番号４
９で示される塩基配列に基づき設計する。 例）配列番号35又は36で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン７とその３’下流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのリバースプライマー；配列番号５０
で示される塩基配列に相補的な塩基配列に基づき設計す
る。 例）配列番号37又は38で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン８とその５’上流のイントロン配列を含むＤＮ
Ａを増幅するためのフォワードプライマー；配列番号５
０で示される塩基配列に基づき設計する。 例）配列番号39又は40で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド エクソン８とその３’下流側の非翻訳領域の配列を含む
ＤＮＡを増幅するためのリバースプライマー；配列番号
５１で示される塩基配列に相補的な塩基配列に基づき設
計する。 例）配列番号41又は42で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド
【００３０】ｃＤＮＡから、本発明蛋白質をコードする
ＤＮＡを、ＰＣＲで増幅するために使用することのでき
るプライマーとしては、例えば、配列番号４〜６のいず
れかで示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基
配列からなるポリヌクレオチドに対してポリメラーゼチ
ェイン反応条件下でアニールすることができ、１０塩基
以上５０塩基以下の塩基からなるポリヌクレオチドをあ
げることができ、具体的には、配列番号４〜６のいずれ
かで示される塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基配
列に相補的な塩基配列を有し、１０塩基以上５０塩基以
下の塩基からなるポリヌクレオチドをあげることができ
る。より具体的には例えば、フォワードプライマーとし
て、配列番号７又は８で示される塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド等をあげることができ、リバースプライマ
ーとして、配列番号９又は１０で示される塩基配列から
なるポリヌクレオチド等をあげることができる。これら
のポリヌクレオチドは、例えばβ-シアノエチルホスホ
アミダイト法やチオホスファイト法を用いる市販の自動
DNA合成装置によって調製することができる。
【００３１】上記のようなポリヌクレオチドをプライマ
ーに用いてPCRを行う場合、一般にはフォワード用とリ
バース用の二種類のプライマーを組み合わせて用いる。
ＰＣＲは、例えばSaikiら、Science、第230巻、第1350
ページから第1354ページ（1985）等に記載の方法に準じ
て行うことができる。例えば、プライマーとして用いら
れるポリヌクレオチドをそれぞれ約10pmol程度添加し、
ＤＮＡポリメラーゼ、4種類の塩基（dATP,dTTP,dGTP,dC
TP）、及び鋳型とするゲノムＤＮＡ約100ng程度又はｃ
ＤＮＡ約10ng程度をあらかじめ加えた約1.5 mMから約3.
0 mMの塩化マグネシウム等を含有する増幅用緩衝液を調
製する。調製された増幅用緩衝液を用いて、例えば、95
℃１分間次いで68℃３分間の保温を１サイクルとしてこ
れを３５サイクル程度行なう。
【００３２】上記のようにして被検試料の核酸を鋳型と
して増幅されたＤＮＡの塩基配列を決定することによ
り、被検試料の核酸において本発明蛋白質をコードする
塩基配列が、標準蛋白質のアミノ酸配列とは異なるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を含有しているか否かを
調べることもできる。具体的には例えば、上記のように
してＰＣＲで増幅されたＤＮＡを低融点アガロースゲル
電気泳動等に供してゲルから回収した後、回収されたＤ
ＮＡについて、例えばダイレクトシークエンス[BioTech
niques,7,494(1989)]を行うことにより該ＤＮＡの塩基
配列を決定することができる。塩基配列は、Maxam Gilb
ert法（例えば、Maxam.A.M & W.Gilbert, Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA, 74, 560, 1977等に記載される）やSanger
法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol.,94,
441, 1975.,Sanger,F., & Nicklen and A.R.Coulson.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 74, 5463, 1977等に記載さ
れる）に準じて解析すればよい。ABI社製モデル377等の
自動ＤＮＡシークエンサーを用いる場合には、対応する
ＤＮＡシークエンスキット例えばABI社製BigDye termin
ator cycle sequencing ready reaction kit等を用いて
シークエンス用サンプルを調製することができる。
【００３３】また、上記のようにして被検試料の核酸を
鋳型として増幅されたＤＮＡを電気泳動してその移動度
を測定し、測定された移動度と、標準蛋白質の該当する
領域をコードするＤＮＡの移動度とが異なるか否かを調
べることにより、被検試料の核酸において本発明蛋白質
をコードする塩基配列が、標準蛋白質のアミノ酸配列と
は異なるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有して
いるか否かを調べることもできる。具体的には例えば、
上記のようにしてＤＮＡをＰＣＲで増幅する際に、通常
の方法に準じて32Ｐ標識したポリヌクレオチドをプライ
マーとして用いて前述のようにPCRを行う。また、標準
蛋白質の相当する領域をコードするＤＮＡも同様にして
増幅する。増幅されたＤＮＡを、例えばHum.Mutation,
2巻、338ページに記載されるＳＳＣＰ（single strand
conformation polymorphism）法などに準じて電気泳動
する。具体的には、増幅されたＤＮＡを加熱変性して一
本鎖ＤＮＡに解離せしめ、これを非変性ポリアクリルア
ミド電気泳動に供して一本鎖ＤＮＡを各々分離する。電
気泳動に用いられる緩衝液としては、トリス−リン酸系
（pH7.5-8.0）、トリス-酢酸系（pH7.5-8.0）、トリス
−ホウ酸系(pH7.5-8.3)などがあげられる。また必要に
応じて、ＥＤＴＡ等を添加することもできる。電気泳動
の条件としては、例えば、定電力30W-40W、泳動温度は
室温（約20 ℃から約25℃）又は4 ℃にて、1時間から4
時間泳動する条件をあげることができる。次いで、電気
泳動後のゲルをろ紙上に移し、この上にＸ線フィルムを
密着させ、適当な遮光カセットの中で、放射能ラベルさ
れた各々の一本鎖ＤＮＡの放射線をフィルム上に感光さ
せる。該フィルムを現像し、得られたオートラジオグラ
ム上で、被検試料の核酸を鋳型として増幅されたＤＮＡ
と、標準蛋白質の相当する領域をコードするＤＮＡの移
動度を比較する。これらのＤＮＡの移動度が異なる場合
には、被検試料の核酸において本発明蛋白質をコードす
る塩基配列が、標準蛋白質のアミノ酸配列とは異なるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を含有していると判定
することができる。さらに、この移動度の異なるＤＮＡ
を含むゲルからそこに含まれるＤＮＡを沸騰水中に抽出
し、これを鋳型にしてPCRを行うことにより該ＤＮＡを
増幅し、低融点アガロースゲル電気泳動に供して回収し
たのちダイレクトシークエンスを行うことにより、該Ｄ
ＮＡの塩基配列を確認することもできる。このようにし
て標準蛋白質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を
コードする塩基配列を特定することができる。
【００３４】被検試料中のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡもし
くはｍＲＮＡ等の核酸、又は上記のようにして被検試料
の核酸を鋳型として増幅されたＤＮＡと、配列番号４、
５、６もしくは５４のいずれかで示される塩基配列又は
該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチ
ドにスリンジェントな条件下でハイブリダイズすること
ができる１０塩基以上５０００塩基以下の塩基からなる
ポリヌクレオチドとのストリンジェントな条件下におけ
るハイブリダイゼーションのパターンを調べることによ
り、被検試料の核酸において本発明蛋白質をコードする
塩基配列が、標準蛋白質のアミノ酸配列とは異なるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を含有しているか否かを
調べることもできる。「配列番号４、５、６もしくは５
４のいずれかで示される塩基配列又は該塩基配列に相補
的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにスリンジェン
トな条件下でハイブリダイズすることができる１０塩基
以上５０００塩基以下の塩基からなるポリヌクレオチ
ド」としては、具体的には例えば、配列番号４、５、６
もしくは５４のいずれかで示される塩基配列の部分塩基
配列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有し、１
０塩基以上５０００塩基以下の塩基からなるポリヌクレ
オチドをあげることができる。
【００３５】被検試料から調製されたゲノムＤＮＡ、ｃ
ＤＮＡもしくはｍＲＮＡ等の核酸、又は上記のようにし
て被検試料の核酸を鋳型として増幅されたＤＮＡと、プ
ローブとして用いる上記のポリヌクレオチドとを混合し
てストリンジェントな条件下にハイブリダイゼーション
を行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambro
ok,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニ
ング第２版（MolecularCloning 2nd edition）、コール
ドスプリング ハーバーラボラトリー（Cold Spring Har
bor Laboratory）発行、1989年等に記載される通常のド
ットブロットハイブリダイゼーション法、サザンブロッ
トハイブリダイゼーション法又はノザンブロットハイブ
リダイゼーション法や、ミスマッチハイブリダイゼーシ
ョン部位に結合する酵素であるTaq MutSを利用したミス
マッチ検出方法［ Biswas,I.andHsieh,P. J.Biol.Che
m.,271 9 pp5040-5048(1996)やNippon gene informatio
n 1999 No.125,ニッポンジーン社 、富山 などに記載が
ある］、などに準じて行うことができる。ハイブリダイ
ゼーションのストリンジェントな条件としては、例え
ば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼー
ションを、6×SSC（0.9M 塩化ナトリウム、0.09Mクエン
酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液（0.1(w/v) フィコ
ール400、0.1(w/v) ポリビニルピロリドン、0.1SA）、
0.5(w/v) SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNA存在下に行
うか、又は100μg/ml変性サケ精子DNAを含むDIG EASY H
yb溶液（ベーリンガーマンハイム社）中で行い、洗浄工
程として、１×SSC（0.15M 塩化ナトリウム、0.015Mク
エン酸ナトリウム）及び0.5DS存在下に、室温で15分間
の保温を2回行い、さらに0.1×SSC（0.015M 塩化ナトリ
ウム、0.0015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5DS存在下
に、30分間保温する条件をあげることができる。プレハ
イブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗
浄工程における保温温度は、プローブとして使用される
ポリヌクレオチドの長さと組成によって異なるが、一般
的には、プローブのTm値と同じか、Tm値よりも若干低い
温度に設定される。具体的には例えば、ハイブリダイゼ
ーションにおいて、プローブと試料中の核酸との間に塩
基間水素結合が形成される際の塩基対を想定し、AとTの
塩基対１つにつき2℃、GとCの塩基対１つにつき4℃とし
て、水素結合を形成するすべての塩基対の値を合計して
これをTm値とする。このようにして算出されるTm値と同
じ温度か、およそ２℃〜３℃程度低い温度を選択する。
【００３６】ドットブロットハイブリダイゼーション法
の具体的な手順としては、例えば、まず、被検試料から
調製されたゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ等の核酸、又
は上記のようにして被検試料の核酸を鋳型として増幅さ
れたＤＮＡを、例えば、90℃から100 ℃で、3〜5分間保
温した後、ナイロンフィルター[Hybond N（アマシャム
ファルマシア社製）など]にスポットし、スポットされ
たフィルターを濾紙上で乾燥した後、これに紫外線照射
することによりＤＮＡをフィルターに固定する。次い
で、得られたＤＮＡ固定フィルターと上記のプローブと
を、例えば、40℃〜50℃で、10時間〜20時間インキュベ
ートすることによりハイブリダイズさせ、通常の方法に
準じてプローブを含むハイブリッドを検出する。プロー
ブとして 32Ｐ等の放射性同位元素で標識した放射性プロ
ーブを用いる場合は、ハイブリダイズ後のフィルターを
Ｘ線フィルムに感光させることによりプローブを含むハ
イブリッドを検出することができる。ビオチン化ヌクレ
オチドで標識した非放射性プローブを用いる場合は、ス
トレプトアビジンを介してビオチン化アルカリ性フォス
ファターゼ等により該プローブを含むハイブリッドを酵
素標識し、酵素反応による基質の呈色あるいは発光を検
出することによりプローブを含むハイブリッドを検出す
ることができる。また、アルカリ性フォスファターゼあ
るいはペルオキシダーゼ等の酵素でスぺーサーを介して
直接標識した非放射性プローブを用いることもできる。
被検試料由来のＤＮＡについてプローブを含むハイブリ
ッドが検出されないか、又は標準蛋白質の相当する領域
をコードするＤＮＡについて検出されるハイブリッドの
量よりも、被検試料由来のＤＮＡにおいて検出されるハ
イブリッドの量の方が少ない場合には、被検試料の核酸
に、使用したプローブの塩基配列とは異なる塩基配列が
含まれると判定することができる。
【００３７】サザンブロットハイブリダイゼーション法
やノザンブロットハイブリダイゼーション法の手順とし
ては、被検試料から調製されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ
もしくはｍＲＮＡ等の核酸、又は上記のようにして被検
試料の核酸を鋳型として増幅されたＤＮＡを、必要に応
じて制限酵素で消化した後、アガロースゲル電気泳動や
ポリアクリルアミドゲル電気泳動等の電気泳動に供して
分画し、ニトロセルロースフィルターやナイロンフィル
ター等のフィルターにブロッティングする。得られたフ
ィルターは、上記と同様に処理してプローブとのハイブ
リダイゼーションを行う。プローブを含むハイブリッド
の量やプローブとハイブリッドを形成した核酸の長さ等
が、被検試料由来の核酸と、標準蛋白質の相当する核酸
とで異なる場合には、被検試料の核酸において本発明蛋
白質をコードする塩基配列が、標準蛋白質のアミノ酸配
列とは異なるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有
していると判定することができる。
【００３８】ミスマッチハイブリダイゼーション部位に
結合する酵素であるTaq MutSを利用したミスマッチ検出
方法を利用する場合には、熱（0〜75℃）に対して安定
で、高い温度でも活性を維持してＤＮＡのミスマッチ塩
基対を認識して結合可能なTaq MutSの結合特性を利用し
て、未変性ポリアクリルアミドゲルを利用したゲルシフ
トアッセイ又はナイロンフィルターやニトロセルロース
フィルターなどの固相上でのドットブロッティング法等
にてミスマッチ塩基対を検出することができる。ミスマ
ッチが検出された場合には、被検試料の核酸に、使用し
たプローブの塩基配列とは異なる塩基配列が含まれると
判定することができる。標準蛋白質は、本発明蛋白質の
中から適宜選ぶことでき、例えば、配列番号１、２又は
３で示されるアミノ酸配列からなる本発明蛋白質をあげ
ることができる。
【００３９】本発明キットは、上記の如く、ハイブリダ
イゼーション（例えば、ドットブロットハイブリダイゼ
ーション、サザンブロットハイブリダイゼーション、ノ
ザンブロットハイブリダイゼーション、ミスマッチハイ
ブリダイゼーション等）法、ＳＳＣＰ法（ＤＮＡの移動
度を利用する手法）、ＰＣＲ（例えば、ゲノムＤＮＡを
鋳型としたＰＣＲ、ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等）等
の公知の方法を利用して遺伝子の存在有無、遺伝子型、
蛋白質型等を調べる方法に適用することができる。この
場合、本発明キットは、上記の公知の手法に必要な試薬
を含んでいてもよいし、また当該試薬と組み合わせて使
用してもよい。上述のようにして行うことができるヒト
等の動物個体が保有する本発明蛋白質をコードする遺伝
子の遺伝子型の分析は、本発明蛋白質の変異により惹起
される疾病や障害等の診断、予防、治療等に有用であ
る。また本発明蛋白質をコードする遺伝子は、ヒト染色
体上の１１ｑ１３領域のＳＴＳマーカーＤ１１Ｓ９１３
とＤ１１Ｓ１８８９との間にマップされる。詳細にはＤ
１１Ｓ９１３からテロメア側へ約１７５kbpの位置に存
在する遺伝子であることから、Bardet-Biedl症候群Ｉ型
に関するTightly linked遺伝マーカーとしての利用が期
待でき、前記方法によって当該疾患の診断に応用可能で
ある。
【００４０】さらに、本発明は、本発明蛋白質をコード
する塩基配列に相補的な塩基配列またはその部分塩基配
列からなる核酸をも提供する。例えば、病理切片に対し
てかかる核酸をプローブに用いてIn situハイブリダイ
ゼーションを行うことにより、本発明蛋白質が関わる疾
患の有無や進行具合を調べることができる。プローブと
して利用する上記核酸としては、例えば２０塩基以上の
長さを有するポリヌクレオチドをあげることができる。
当該プローブを診断薬の有効成分とするには、プローブ
が分解されないような適当なバッファー類や滅菌水に溶
解することが好ましい。また、In situハイブリダイゼ
ーションの方法としては、例えば、J. Neurobiol. 29,
1-17 (1996)に記載の手法が挙げられる。また、In situ
PCRを利用することも可能である。
【００４１】本発明は、哺乳動物細胞に、本発明蛋白質
をコードするＤＮＡを、当該ＤＮＡが前記細胞で発現す
る位置に置かれるように提供する工程を含む哺乳動物に
おけるdrebrin 1の発現促進方法も提供している。哺乳
動物細胞としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハム
スター等の哺乳動物由来の細胞を挙げることができる。
当該細胞は、組織から分離された細胞や、同一の機能・
形態を持つ集団を形成している細胞や、前記哺乳動物の
体内にある細胞であってもよい。従って、哺乳動物がヒ
トである場合には、一般にいう遺伝子治療が施されたヒ
トの細胞から各種実験に使用されるような株化細胞まで
を意味し、また哺乳動物が非ヒト動物である場合には、
一般にいう遺伝子治療が施された非ヒト動物の細胞から
各種実験に使用されるようなモデル動物の細胞や株化細
胞までを意味する。後者の場合には、ラット、マウス等
を好ましい動物種として挙げることができる。さらに、
哺乳動物細胞が、精神遅延を伴う疾患又はアルツハイマ
ー症に羅患していると診断されうる哺乳動物の体内にあ
る細胞である場合をより具体的な例としてあげることが
できる。
【００４２】本発明ＤＮＡの調製は、上述と同等な方法
に準じて行えばよい。また、高効率プロモーター（例え
ば、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター）の制御下
に本発明ＤＮＡを発現させるインビボ転写系によって調
製することもできる。調製されたＤＮＡを用いて後述の
ように形質転換細胞を調製することにより、当該ＤＮＡ
が哺乳動物細胞で発現する位置に置かれるように提供さ
れた形質転換細胞を得ることができる。本発明発現促進
方法において「発現する位置に置かれた」とは、ＤＮＡ
分子が、その塩基配列からの転写及び翻訳を指向する
（即ち、例えば、本発明蛋白質をコードするＲＮＡおよ
び本発明蛋白質の産生を促進するような）塩基配列と隣
接した位置に置かれていることを意味する。本発明蛋白
質の発現レベルは、本発明蛋白質をコードするＤＮＡが
提供されていない細胞と比較してdrebrin 1の発現を促
進するために十分である量であればよい。この場合、本
発明ＤＮＡは、本発明蛋白質の全体をコードするＤＮＡ
であってもよいし、当該蛋白質の一部をコードするＤＮ
Ａであってもよい。上記の発現促進方法において、本発
明ＤＮＡがゲノムに組み込まれるように哺乳動物細胞に
提供することにより、drebrin 1の発現を促進してもよ
い。
【００４３】上記の発現促進方法において、本発明ＤＮ
Ａを哺乳動物細胞に導入するために用いられる遺伝子構
築物（以下、本遺伝子構築物と記載することもある。）
および移入送達手段には、当該ＤＮＡが導入される哺乳
動物細胞に対して親和性を有する、レトロウイルスベク
ター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベ
クター又はその他のウイルスベクターを用いることがで
きる。具体的には例えば、ミラー(Miller)，Human Gene
Therapy 15〜14，1990;フリードマン(Friedman)，Scie
nce 244:1275〜1281，1989;エグリティス(Eglitis)およ
びアンダーソン(Anderson)，BioTechniques 6:608〜61
4，1988;トルストシェフ(Tolstoshev)およびアンダーソ
ン(Anderson)，current opinion in Biotechnology 1;5
5〜61，1990;シャープ(Sharp)，The Lancet 337:1277〜
1278，1991;コルネッタ(Cornetta)ら、Nucleic Acid Re
search and Molecular Biology 36:311〜322，1987;ア
ンダーソン(Anderson)，Science 22-:401〜409，1984;
モーン(Moen)，Blood Cells17:407〜416，1991;ミラー
(Miller)ら、Biotechniques 7:980〜990，1989;Le Gai
La Salleら、Science 259:988〜990，1993;およびジョ
ンソン(Johnson)，Chest 107:77S〜83S，1995等に記載
される公知のベクターをあげることができる。ローゼン
バーグ(Rosenberg)ら、N．Engl．J．Med 323:370，199
0;アンダーソン(Anderson)ら、米国特許第5,399,346号
等に記載されるレトロウイルスベクターは特に開発が進
んでおり、臨床の場でもすでに使用されている。また、
本発明ＤＮＡの移入送達手段としては、非ウイルス的手
法を用いることもできる。例えば、フェルグナー(Felgn
er)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413，1987;オ
ノ(Ono)ら、Neurosci．Lett．117:259，1990;ブライア
ム(Brigham)ら、Am．J．Med．Sci．298:278，1989;シュ
タウビンガー(Staubinger)ら、Meth．Enz．101:512，19
83）、アシアロソヌコイド・ポリリジン抱合（ウー(Wu)
ら、J．Biol．Chem．263:14621，1988;ウー(Wu)ら、J．
Biol．Chem．264:16985，1989等に記載されるリポフェ
クション、ウォルフ(Wolff)ら、Science 247:1465，199
0等に記載されるマイクロインジェクション、リン酸カ
ルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーシ
ョン法及びプロトプラスト融合法、リポソーム法等があ
げられる。
【００４４】本遺伝子構築物において、本発明ＤＮＡ
は、当該ＤＮＡを構成的に発現させるようなプロモータ
ーの制御下に置かれていてもよい。例えば、ＳＶ４０ウ
イルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモータ
ー（ＣＭＶプロモーター）、Raus Sarcoma Virusプロモ
ーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロ
モーター等が挙げられる。また、本発明ＤＮＡは、当該
ＤＮＡの発現を環境刺激により調節するようなプロモー
ターの制御下に置かれていてもよい。例えば、上記ＤＮ
Ａは、化学的信号もしくは薬物刺激等の外来性の信号も
しくは薬物の導入により活性化されるプロモーターを用
いて発現させてもよい。また、本発明ＤＮＡは、組織特
異的もしくは細胞型特異的なプロモーターの制御下に置
かれていてもよい。かかるプロモーターには、哺乳動物
における組織または細胞に特異的な転写制御に関与する
プロモーター要素（エンハンサー等）が含まれていても
よい。例えば、必要に応じて、本発明ＤＮＡを発現させ
るために、神経細胞におけるＤＮＡの発現を優先的に指
向することが知られるエンハンサーを用いてもよい。ま
た、本発明蛋白質をコードするゲノムＤＮＡのクローン
を本遺伝子構築物として用いる場合には、本発明蛋白質
をコードする遺伝子の元来の発現調節領域に含まれるコ
グネイト調節配列を介して本発明ＤＮＡを発現させるこ
とができ、必要に応じて、上記の任意のプロモーター又
はプロモーター要素を付加して発現を制御することもで
きる。尚、上記のようなプロモーターまたはプロモータ
ー要素をマルチクローニング部位の上流に含む市販のベ
クターを利用することもできる。
【００４５】上記の発現促進方法を遺伝子治療の手段と
して応用する場合には、本遺伝子構築物は、drebrin 1
過少発現が予想される部位に対して適用される（例え
ば、注入によって）ことがよい。また、drebrin 1過少
発現等の現象が予想される部位の近傍の組織又はdrebri
n 1過少発現が起こると予想される細胞に供給される血
管に対してそれを適用してもよい。また、本遺伝子構築
物を適用しようとする哺乳動物にとって外因性又は内因
性の培養可能な細胞に、本遺伝子構築物を導入し、次い
で、導入された細胞を血清学的に標的組織に対して注入
することもできる。理想的には、かかる遺伝子治療の手
法により、少なくとも非罹患細胞における正常な本発明
蛋白質の細胞内レベルと同等の本発明蛋白質の発現量が
もたらされるとよい。
【００４６】以下に、一例として、哺乳動物が形質転換
非ヒト動物である場合の本発明発現促進方法についてよ
り詳細に説明する。形質転換非ヒト動物の作製における
本発明ＤＮＡの導入法としては、例えば、マイクロイン
ジェクション法、レトロウイルスを用いる方法、胚性未
分化細胞（ＥＳ細胞）を用いる方法等を挙げることがで
きる。このうち、マイクロインジェクション法が最も汎
用されている。マイクロインジェクション法とは、マイ
クロマニピュレーターを用いて、顕微鏡下で受精卵の前
核内部に上記ＤＮＡを含んだ溶液を注入する方法であ
る。まず、本発明ＤＮＡを受精卵に注入する。その際、
当該ＤＮＡを高い確率で染色体へ組込むためには、当該
ＤＮＡの単離に用いたベクター領域を可能な限り除去す
ること、ｍＲＮＡの不安定化に寄与するＡＵに富む領域
を除くこと、直鎖状にすることが好ましい。また、当該
ＤＮＡに対してイントロンを予め挿入しておくことが好
ましく、当該イントロンとしては、例えば、β−グロビ
ンイントロン等を挙げることができる。受精卵は、目的
に応じた系統の非ヒト動物から採取する。例えば、マウ
スの場合には、近交系のＣ５７ＢＬ／６マウスやＣ３Ｈ
マウス、あるいはＣ５７ＢＬ／６マウスと他系統のマウ
スとの交雑系（例えば、（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／
２）Ｆ1等）、非近交系のＩＣＲマウスが挙げられる。
受精卵は、通常、妊馬血清ゴナドトロピンとヒト絨毛性
ゴナドトロピンとの両者の腹腔内投与により過剰排卵を
誘発させた雌マウスと雄マウスとを交尾させた後、前記
雌マウスから採取する。尚、採取した受精卵は培養用ド
ロップに入れ、ＣＯ2ガスインキュベーターで培養・維
持することにより、上記ＤＮＡの注入操作まで保管する
ことができる。上記ＤＮＡの注入はマイクロマニピュレ
ーターをセットした倒立顕微鏡下で行なう。用いられる
受精卵としては、雄性前核が雌性前核より大きくなる頃
から両前核が融合するまでの発達段階にあるものを用い
るとよい。まず受精卵を固定し、当該受精卵の雄性前核
内に当該ＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液を注入する。当該
ＤＮＡ溶液は必要に応じて複合体として調製する。複合
体形成に用いられる物質としては、リポソーム、リン酸
カルシウム、レトロウイルス等を挙げることができる。
ＤＮＡ溶液の注入は雄性前核が膨らむことにより確認で
きる。ＤＮＡ注入量としては、例えば、約２００〜約
３，０００コピーの上記ＤＮＡを含む量を挙げることが
できる。
【００４７】このようにして、本発明ＤＮＡが注入され
た受精卵は胚盤胞になるまで前記と同様にして培養した
後、仮親の子宮に移植する。好ましくは当該ＤＮＡの注
入操作後ただちに仮親の卵管に移植するとよい。仮親と
しては、精管切断手術を施した雄マウスと交尾させて偽
妊娠状態にした雌マウスを用いるとよい。具体的には、
まず当該雌マウス背側の腎臓付近の皮膚と筋層を切開し
て卵巣・卵管・子宮を引き出し、卵巣膜を破いて卵管口
を探し出す。次いで当該ＤＮＡの注入操作後に生き残っ
た受精卵を該卵管口から移入し、卵巣・卵管・子宮を腹
腔内に戻した後、筋層を縫合し、皮膚をクリップでとめ
る。約２０日後に仔が生まれる。得られた仔の体組織の
一部、例えば尾の一部、を切り取り、当該部位から抽出
されたＤＮＡのサザンブロッティング等により当該ＤＮ
Ａの存在有無を確認する。このようにして、当該ＤＮＡ
が非ヒト動物に導入されたことを確認できる。あるいは
他の方法、例えばＰＣＲなどの確認方法を利用してもよ
い。
【００４８】本発明遺伝子治療剤の有効成分となる、本
発明ＤＮＡは、前述の如く調製すればよい。また、例え
ば、当該ＤＮＡを含有する組換えベクター又は組換えウ
イルス等の形態で使用されることもある。このような形
態には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、アデノ関連性ベクター、単純ヘルペスウ
イルスベクター、ＳＶ４０ベクター、ポリオーマウイル
スベクター、乳頭腫ウイルスベクター、ピコルナウイル
スベクター及びワクシニアウイルスベクター等のウイル
スベクターを利用することができる。さらに、アデノウ
イルスベクターを使用する場合には、例えばＱＵＡＮＴ
ＵＭ社製のＡｄＥａｓｙ Ｋｉｔを用い、本発明ＤＮＡ
をＴｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒのマルチクローニン
グサイトに組み込み、得られた組換えベクターを直線化
した後に、ｐＡｄＥａｓｙ ｖｅｃｔｏｒと共に大腸菌
にトランスフォームし、相同組換え体ＤＮＡをヒト２９
３Ａ細胞に組み込むことにより、本発明ＤＮＡを含有す
る組換えウイルスを産生させ、これを回収し、使用する
こともできる。また、ヒトサイトメガウイルスのプロモ
ーター領域を有するプラスミドＤＮＡ等のような非ウイ
ルス系のベクターを用いることもできる。本発明ＤＮＡ
をdrebrin 1過少発現が予想される部位に直接注入する
場合のように、非ウイルスベクターを用いて本発明ＤＮ
Ａを局所的に送達するシステムにおいては、プラスミド
ＤＮＡの使用は極めて有益である。体外に取り出された
細胞に本発明ＤＮＡを含有する組換えベクターを導入し
て体内に戻す方法、すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏ法を使え
ば、あらゆる既知の導入方法が利用可能である。例え
ば、ａ）直接注入、ｂ）リポソームを介する形質導入、
ｃ）リン酸カルシウム法・エレクトロポレーション法・
ＤＥＡＥ−デキストラン法による細胞トランスフェクシ
ョン、ｄ）ポリブレンを介した送達、ｅ）プロトプラス
ト融合、ｆ）マイクロインジェクション、ｇ）ポリリシ
ンを使った形質導入などによって、非ウイルスベクター
を導入することができる。
【００４９】本発明遺伝子治療剤は、その有効量を非経
口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。
例えば、非経口的に投与する方法としては、例えば、上
述のような注射（皮下、静脈内等）等を挙げることがで
きる。前記の適当な投与剤型は薬学的に許容される、例
えば、水溶性溶剤、非水溶性溶剤、緩衝剤、溶解補助
剤、等張剤、安定剤等の担体に本発明ＤＮＡ（本発明Ｄ
ＮＡが組み込まれた組換えベクター、組換えウィルス、
組換えプラスミド等の形態を含む）を配合することによ
り製造することができる。必要に応じて、防腐剤、懸濁
化剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。投与量は、
投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、
本脂肪蓄積抑制剤の種類、投与形態等によって異なる
が、通常は、患者細胞において本発明蛋白質が細胞内で
有効に働くような濃度レベルをもたらす有効成分量を投
与すればよい。１日の投与量を１回または数回に分けて
投与することができる。
【００５０】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれらによって限定されるものではな
い。
【００５１】実施例１（本発明ＤＮＡの取得と本発明ベ
クターの作製） 配列番号７〜１０のいずれかで示される塩基配列からな
るポリヌクレオチドをそれぞれDNA合成機（アプライド
バイオシステムズ社製モデル394）を用いて合成した。
鋳型として、ヒトFetal Brain cDNAライブラリー（＃10
662−013ギブコBRL社製）10 ng、マウスBrain cDNAライ
ブラリー（＃10655−017ギブコBRL社製）、又はラットB
rain cDNAライブラリー（＃9539宝酒造社製）を使用
し、それぞれの鋳型に対してプライマーとして前記ポリ
ヌクレオチドを表１に記載の組合せで用いてPCRを行な
った。
【００５２】
【表１】
【００５３】該ＰＣＲにおいて、反応液５０μｌ当たり
上記のポリヌクレオチドをそれぞれ10pmol添加し、LA-T
aqポリメラーゼ（宝酒造社製）及び該酵素に添付された
バッファーを用いた。反応液の保温は、PCRsystem9700
（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、95℃1
分間次いで68℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを35
サイクル行った。次いで、反応液全量を、低融点アガロ
ース（アガロースL：ニッポンジーン）を用いたアガロ
ースゲル電気泳動に供した。約2.5kbのＤＮＡの単一バ
ンドを確認した後、該DNAを回収した。回収されたＤＮ
Ａの一部とダイターミネーターシークエンスキットFS
（アプライドバイオシステムズ社製）とを用いてダイレ
クトシークエンス用のサンプルを調製し、これを、オー
トシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製、
モデル3700）を用いたダイレクト塩基配列解析に供し
た。ヒトcDNAライブラリーを鋳型として得られたＤＮＡ
は配列番号４で示される塩基配列を有しており、該塩基
配列には配列番号１で示されるアミノ酸配列がコードさ
れていた。マウスcDNAライブラリーを鋳型として得られ
たＤＮＡは配列番号５で示される塩基配列を有してお
り、該塩基配列には配列番号２で示されるアミノ酸配列
がコードされていた。また、ラットcDNAライブラリーを
鋳型として得られたＤＮＡは配列番号６で示される塩基
配列を有しており、該塩基配列には配列番号３で示され
るアミノ酸配列がコードされていた。次に、上記のよう
にして回収され塩基配列の確認された約2.5 kbのDNAの
約１μｇを、それぞれpGEM T easyベクター（プロメガ
社製）10ngと混合し、これにT4 DNAリガーゼを添加して
反応させた。得られた反応液を用いて大腸菌DH5αコン
ピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アン
ピシリン耐性を示したコロニーからプラスミドDNAを調
製し、その塩基配列をABIモデル3700型オートシークエ
ンサーを用いてダイターミネーター法で決定した。決定
された塩基配列を、前述のダイレクトシークエンスで得
られた塩基配列と比較して、翻訳領域の塩基配列が完全
に一致しているプラスミドを選択した。配列番号１で示
されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するプラ
スミドをpGEM-hNXF、配列番号２で示されるアミノ酸配
列をコードするＤＮＡを含有するプラスミドをpGEM-mNX
F、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡを含有するプラスミドをpGEM-rNXFと名付けた。配
列番号１、２又は３で示されるアミノ酸配列を互いに、
GenetyxSV/R ver.4（ソフトウエア開発社製）プログラ
ムを用いて比較した。その結果、配列番号１で示される
アミノ酸配列と配列番号２で示されるアミノ酸配列との
アミノ酸同一性は９３％であり、配列番号２で示される
アミノ酸配列と配列番号３で示されるアミノ酸配列との
アミノ酸同一性は９８％であった。また、配列番号１、
２又は３で示されるアミノ酸配列について、GenomNet
（日本，www.motif.genome.ad.jp）のデータベースサー
ビスを利用し,PROSITE(Nucl.Acids.Res,1997;24:217-22
1,Bairoch,A.et al.),BLOCKS(Nucl.Acids.Res,1991;19:
6565-6572,Henikoff,S.et al.),ProDom(Protein Sci,19
94;3:482-492,Sonnhammer,E.L.et al.),PRINTS(Protein
Eng,1994;7:841-848,Attwood,T.K.et al.)の各モチー
フ辞書に対してモチーフ検索を行なった。その結果、い
ずれのアミノ酸配列においても、アミノ酸番号１〜２４
付近の領域にｂＨＬＨモチーフが存在し、アミノ酸番号
２５付近〜３１０付近の領域にＰＡＳドメインが存在す
ることが判った。
【００５４】実施例２（本発明蛋白質をコードするｃＤ
ＮＡのＰＣＲによる増幅） ヒト76人分の網膜から抽出されたmRNAから作製されたcD
NA（＃7124−1,クロンテック社製）を鋳型にして、配列
番号５２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド
オリゴヌクレオチドと配列番号５３で示される塩基配列
を有するポリヌクレオチドオリゴヌクレオチドとをプラ
イマーとして用いてＰＣＲを行った。50μｌの反応液に
対して前記ポリヌクレオチドをそれぞれ10 pmol添加
し、LA-Taqポリメラーゼ（宝酒造社製）及び該酵素に添
付されたバッファーを用いた。反応液の保温は、PCRsys
tem9700（アプライドバイオシステムズ社製）を用い
て、95℃1分間次いで68 ℃3分間の保温を1サイクルとし
てこれを35サイクル行った。次いで、反応液全量を、ア
ガロース（アガロースS：ニッポンジーン）を用いたア
ガロースゲル電気泳動に供した。約2.5kb付近にＤＮＡ
の単一バンドが認められた。本発明蛋白質をコードする
ｍRNAがヒト網膜で発現していることが確認された。
【００５５】実施例３（本発明蛋白質をコードする核酸
のハイブリダイゼーション法による検出） 実施例１で作製されたプラスミドpGEM-hNXFをBamHIとNo
tIとで消化し、消化物を低融点アガロース（アガロース
L、ニッポンジーン社製）を用いたアガロースゲル電気
泳動に供して、約1.0kbpのＤＮＡ及び約2.3kbpのＤＮＡ
を回収した。回収されたそれぞれのＤＮＡの50ngをラン
ダムプライマー法によるラベリングキット（RediprimeI
I：アマシャムファルマシア社製）とα32P-ｄCTP（アマ
シャムファルマシア社製）とを用いて32P標識した。標
識された約1.0kbpのＤＮＡをプローブとして、ヒトの種
々の組織のｍRNAがブロットされたナイロンフィルター
［Human 12−Lane MTN Blot（＃7780−1、クロンテック
社製）及び Human MTN Blot IV（＃7766−1クロンテッ
ク社製）］に対してハイブリダイズさせた。また、標識
された約2.3kbpのＤＮＡをプローブとして、ヒトの脳等
の組織のｍRNAがブロットされたナイロンフィルター［H
uman Brain MTN BlotII（＃7755−1クロンテック社製）
及び Human Brain MTN BlotIV（＃7769−1クロンテック
社製）］に対してハイブリダイズさせた。ハイブリダイ
ゼーションの条件は、上記ナイロンフィルターの取扱説
明書に記載の条件にしたがった。即ち、5ｍｌのExpress
Hyb液（＃クロンテック社製）中でナイロンフィルター
を68℃で30分間保温した後、上記の標識プローブをそれ
ぞれ50ng加え、68℃で更に１時間保温した。次に、フィ
ルターを、0.05DSを含む２XSSC溶液 約２００ｍｌ中で6
5℃３０分間保温する操作を２回行い、更に0.1％SDSを
含む0.1XSSC溶液で65℃30分間保温する操作を２回行っ
た。次いで、ナイロンフィルターをイメージングプレー
ト（フジフィルム社製）に密着させて1週間放置した
後、イメージングアナライザー（BASstation：フジフィ
ルム社製）でプレート上の感光像を検出した。検討した
ヒト組織は以下の通りである。 Brain,Heart,Skeletal muscle,Colon(no mucosa),Thymu
s,Spleen,Kidney,Liver,Small intestine,Placenta,Lun
g,Peripheral blood leukocyte,Prostate,Testis,Uteru
s(no endometrium), Cerebellum,Cerebral cortex,Medulla,Spinal cord,Occ
ipital pole,Frontal lobe,Temporal lobe,Putamen,Amy
gdala,Caudate nucleus,Corpus callosum,Hippocampus,
Substantia nigra,Thalamus. その結果、ヒトの種々の組織のｍRNAがブロットされて
いるナイロンフィルターにおいて、Brainに強いシグナ
ルが検出され、Skeletal muscle及びKidneyに弱いシグ
ナルが検出され、他の組織についてはシグナルが検出さ
れなかった。また、ヒトの脳等の組織のｍRNAがブロッ
トされたナイロンフィルターにおいては、フィルター上
にブロットされたすべての脳組織と延髄及び脊髄でシグ
ナルが検出された。
【００５６】実施例４（本発明蛋白質をコードする遺伝
子の遺伝子型分析） ヒト脳の凍結サンプル0.1グラムに対してTrizole試薬
（GibcoBRL社製）を１ｍｌ加えホモジナイズする。得ら
れたホモジネートに0.2mlのクロロホルムを加えて攪拌
した後、4℃にて12,000ｘｇで１５分間遠心分離し、有
機層と水層をそれぞれ別のチューブに移す。水層には0.
5mlのイソプロパノールを加えて混合し5分間室温放置し
た後、４℃にて12,000ｘｇで１０分間の遠心分離してRN
Aの沈殿を回収する。回収された沈殿を７０％エタノー
ルでリンスした後風乾し、水に溶解させ、これをヒトRN
A試料とする。上記のように調製されたヒト脳ＲＮＡ1μ
ｇを鋳型にして、オリゴdTプライマー（アマシャムファ
ルマシア社製）1μｇをプライマーとして用い、Supersc
riptII（ギブコ社製）及び該酵素に添付のバッファーを
添加して37℃で1時間保温する。得られたヒト脳cDNA溶
液の50分の1を鋳型にして、配列番号７で示される塩基
配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９で示され
る塩基配列からなるポリヌクレオチドをプライマーとし
て用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲを行いＤＮＡを
増幅する。得られたＤＮＡを、1％の低融点アガロース
（アガロースL、ニッポンジーン社製）ゲルで電気泳動
して回収する。回収されたＤＮＡの全量を鋳型にして、
ダイターミネーターシークエンスキットFS（アプライド
バイオシステムズ社製）によりダイレクトシークエンス
用のサンプルを調製する。これを、オートシークエンサ
ー（アプライドバイオシステムズ社製、モデル3700）を
用いた塩基配列解析に供し塩基配列を決定する。一方、
ヒト肝臓凍結サンプル0.1グラム分にTrizole試薬を加え
て上記と同様にして有機層を分取した。得られた有機層
に0.3mlのエタノールを加えて、4℃にて2,000ｘｇで５
分間遠心分離し、沈殿を回収した。この沈殿を0.1M ク
エン酸ナトリウムと10％エタノールとの混合溶液でリン
スした後風乾し、TEに溶解させてヒトゲノムDNA試料と
した。該ヒトゲノムDNAを鋳型としてＰＣＲを行い、本
発明蛋白質をコードするゲノム遺伝子のエクソンの塩基
配列と、該エクソンに隣接するイントロンの塩基配列の
一部とを含むＤＮＡを増幅した。プライマーとしては、
配列番号１１〜４２のいずれかで示される塩基配列から
なるポリヌクレオチドをそれぞれDNA合成機（アプライ
ドバイオシステムズ社製モデル394）を用いて合成し、
表２に記載の組合せで用いた。
【００５７】
【表２】
【００５８】ＰＣＲは、LA−Taq DNAポリメラーゼ（宝
酒造製）を使用し、100μMの４種類の各々の塩基（dAT
P,dTTP,dGTP,dCTP）及び前記酵素に添付された専用バッ
ファー中で、９５℃にて1分間次いで６８℃にて１分間
の保温を１サイクルとして、これを35サイクル実施し
た。得られた反応液の一部をそれぞれアガロースゲル電
気泳動に供した。サンプル番号１〜１６のいずれにおい
ても、アガロースゲル上でＤＮＡの単一バンドが検出さ
れた。残りのＰＣＲ反応液を、1％の低融点アガロース
（アガロースL、ニッポンジーン社製）ゲルで電気泳動
し、バンドとして検出されるＤＮＡを回収する。回収さ
れたＤＮＡを鋳型にして、ダイターミネーターシークエ
ンスキットFS（アプライドバイオシステムズ社製）によ
りダイレクトシークエンス用のサンプルを調製する。こ
れを、オートシークエンサー（アプライドバイオシステ
ムズ社製、モデル3700）を用いた塩基配列解析に供し塩
基配列を決定する。検体の毛髪２〜３本を滅菌水で洗浄
した後、さらに100％エタノールで洗浄し、室温で風乾
した後、2〜3mmの長さに切断してプラスチック製チュー
ブに移す。これにBCL buffer[10mM Tris-HCl(pH7.5), 5
mM MgCl2, 0.32M sucrose, 1TritonX-100]200μｌを加
え、さらに最終濃度100μｇ/mlのProteinase K溶液及び
最終濃度0.5(w/v)のＳＤＳ溶液をそれぞれ添加し混合す
る。得られた混合物を70℃にて１時間保温した後、等量
のフェノール／クロロホルムを加え、激しく振とうした
後、遠心分離（15,000rpm,5分間、4℃）する。フェノー
ル層を乱さないようにピペットで水層を回収し、もう一
度フェノール抽出を行なう。回収された水層に等量のク
ロロホルムを加え、激しく振とうした後、遠心分離によ
り水層を回収する。回収された水層に500μｌの100％エ
タノールを加え、-80℃にて20分間保温した後、遠心分
離する。得られたペレットを乾燥した後、滅菌水に溶解
させゲノムDNAとして上記と同様にPCRを行なう。ヒト末
梢血を被検試料として用いる場合は、10mlの血液を採取
し、DNA Extraction kit（ストラタジーン社製）を用い
て添付マニュアルに従いゲノムＤＮＡを抽出する。得ら
れるゲノムDNAを上記と同様にPCRに供する。
【００５９】実施例５（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法による遺伝
子型の分析） 実施例４でプライマーに用いたポリヌクレオチドを、DN
A MEGALABELキット（宝酒造社製）を用いて、末端を32
Ｐ標識する。実施例４と同様にして得られるゲノムＤＮ
Ａ1μｇ程度を鋳型にして、標識されたポリヌクレオチ
ド100pmol程度ずつをプライマーとして用いてＰＣＲを
行い本発明蛋白質をコードするゲノム遺伝子のＤＮＡを
増幅する。該ＰＣＲは、LA-Taq(宝酒造製)を使用し、10
0μMの４種類の各々の塩基（dATP,dTTP,dGTP,dCTP）及
び前記酵素に添付された専用バッファー中で、95℃にて
1分間次いで68℃1分間の保温を１サイクルとしてこれを
35サイクル実施する。増幅されたＤＮＡの1/20量を80％
ホルムアミド中で80℃、5分間の条件で加熱変性した
後、その1/20量を5％未変性中性ポリアクリルアミドゲ
ルを用いて、180mMトリス−ホウ酸緩衝液（pH8.0）中で
電気泳動する。電気泳動の条件は、室温空冷、定電力40
Ｗ、60分である。泳動終了後、ゲルをＸ線フィルムに密
着させてオートラジオグラムをとることにより、標識さ
れたポリヌクレオチドをプライマーとして増幅されたＤ
ＮＡを検出する。標準蛋白質の該当する領域をコードす
るＤＮＡを隣り合わせて泳動しておき、被検試料由来の
ＤＮＡの移動度と比較する。これらのＤＮＡの移動度が
異なる場合には、被検試料の核酸において本発明蛋白質
をコードする塩基配列が、標準蛋白質のアミノ酸配列と
は異なるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有して
いると判定する。さらに、オートラジオグラフィーによ
り検出される被検試料由来のＤＮＡのバンドに対応する
位置のゲルの一部を１ｍｍｘ１ｍｍ角に切り取り、滅菌
水100μｌ中で90℃にて10分間処理し、その1/20量を鋳
型にしてPCRを行う。増幅したＤＮＡを低融点アガロー
スゲル電気泳動に供してゲルからＤＮＡを回収した後、
回収されたＤＮＡを鋳型にして、BigDye Terminator cy
cle sequence ready reaction kit（アプライドバイオ
システムズ社製）と自動ＤＮＡシークエンサー（アプラ
イドバイオシステムズ社製モデル377）を使用して塩基
配列を決定することにより変異を特定する。
【００６０】実施例６ （本発明蛋白質の転写調節能） （６−１）pGL3-TATA-Galx4の調製 GAL4のDNA結合領域と任意の転写調節因子との融合蛋白
質の転写調節能を測定するために用いたレポーター遺伝
子プラスミドであるpGL3-TATA-Galx4には、TATA最小プ
ロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、Ga
l4のDNA結合領域が結合可能なDNAがタンデムに４コピー
導入されている。GAL4のDNA結合領域と任意の転写調節
因子との融合蛋白質を当該レポーター遺伝子プラスミド
に作用させルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定するこ
とによって、前記融合蛋白質が有する転写調節能を測定
することができる。当該pGL3-TATA-Galx4レポーター遺
伝子プラスミドは以下のようにして作製した。まず、GA
L4のDNA結合領域が結合可能な塩基配列を有する２種の
オリゴヌクレオチド［5´-cgcgtcgagc tcgggtcgga ggac
tgtcct ccgactgctc gagtcgagct cgggtcggag gactgtcctc
cgactgctcg aga-３´（配列番号５６）、5´-cgcgtctc
ga gcagtcggag gacagtcctc cgacccgagc tcgactcgag cag
tcggagg acagtcctcc gacccgagct cga-３´（配列番号５
７）］をアニールした後にT4 Kinaseで5´末端をリン酸
化し、これをT4 Ligaseと反応させた。得られた反応物
を、低融点アガロース（NuseiveGTG；FMCbio社製）を用
いた電気泳動に供することにより、上記２種のオリゴヌ
クレオチドがアニールしてなるＤＮＡがタンデムに２つ
結合してなるＤＮＡを回収した。これをインサートＤＮ
Ａとし、pGL3-TATAベクターをMluIで切断した後アルカ
リフォスファターゼ（BAP C75；宝酒造製）処理して得
られたＤＮＡ0.1μｇにT4 Ligase(宝酒造製)を添加して
１６℃１６時間反応させることにより結合させた。この
ようにして、レポーター遺伝子プラスミドpGL3-TATA-Ga
lx4を得た。
【００６１】（６−２）pRC/RSV-Gal4-DBDの調製 GAL4のDNA結合領域（以下、Gal4-DBDと記すことがあ
る。）を発現するプラスミドであるpRC/RSV-Gal4-DBD
は、以下のようにして作製した。Gal4-DBDをコードする
塩基配列を有するプラスミドpM（市販キットK1602-1に
含まれる；Clontech社より購入）をNheIとXbaIとで切断
した後、更にT4 ポリメラーゼで平滑末端化した。それ
を低融点アガロース（アガロースL；ニッポンジーン社
製）を用いた電気泳動に供することにより、Gal4-DBDを
コードするＤＮＡ（約500bp）を回収した。回収された
ＤＮＡをインサートＤＮＡとした。次に、pRC/RSV（Inv
itorgen社製）をHindIIIで切断した後に、更にT4ポリメ
ラーゼで平滑末端化した。それをBAP処理して得られた
ＤＮＡ（0.1μg）に前記インサートＤＮＡ（0.5μg）を
T4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-Gal4-DBD
を作製した。尚、得られたプラスミドの塩基配列をABI
モデル3700型オートシークエンサーを用いたダイターミ
ネーター法で決定することにより、RSVプロモーターの
制御下にGal4-DBDが発現するようにプラスミドが構築さ
れていることを確認した。
【００６２】（６−３）pRC/RSV-MAの調製 GAL4のDNA結合領域と任意の転写調節因子の転写調節領
域等とが結合した融合蛋白質を発現させるために、Gal4
-DBDをコードするＤＮＡの下流に、制限酵素PmaCIの認
識部位が導入されたプラスミドpRC/RSV-MAを作製した。
当該プラスミドは、RSVプロモーターの下流にGal4-DBD
をコードするＤＮＡを有しており、さらにその下流のPm
aCI切断末端に、Gal4-DBDをコードするＤＮＡの翻訳フ
レームに対して任意の平滑末端化DNAの翻訳フレームが
一致するように当該DNAを結合させることができる。具
体的には、pRC/RSV-MAは以下のようにして作製した。ま
ず、２種のオリゴヌクレオチド［5´-agcttcatcccacgtg
agtcat-3´（配列番号５８）、5´-ctagatgactcacgtggg
atga-3´（配列番号５９）］をアニールした後にT4 kin
aseでその5'末端をリン酸化した。得られたＤＮＡをイ
ンサートＤＮＡとし、前記（６−２）で調製されたpRC/
RSV-Gal4-DBDをHindIIIとXbaIとで切断した後BAP処理し
て得られたＤＮＡとT4 Ligaseで結合させることによ
り、pRC/RSV-MAを作製した。
【００６３】（６−４）pRC/RSV-MA-mNXF(AvaI frg)の
調製 RSVプロモータの制御下に、GAL4のDNA結合領域（GAL4-D
BD）と本発明蛋白質の転写調節領域との融合蛋白質を発
現するためのプラスミドであるpRC/RSV-MA-mNXF（AvaI
frg）（以下、このプラスミドをGal4-NXF Ctermと記す
こともある。）は、以下のようにして作製した。まず、
実施例１で調製されたpGEM-mNXFをAvaIとNotIとで切断
した後、更にT4ポリメラーゼで平滑末端化した。それ
を、低融点アガロースゲル電気泳動（AgaroseL；ニッポ
ンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約1.8kb
p）を回収した。回収されたＤＮＡは、本発明蛋白質のb
HLHモチーフ-PASドメイン以降からC末端までの、転写調
節領域をコードするＤＮＡである。この回収されたＤＮ
Ａと、前記（６−３）で調製されたpRC/RSV-MAをPmaCI
制限酵素で切断した後BAP処理して得られたＤＮＡとをT
4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-MA-mNXF（A
vaI frag）を作製した。次に、約１ｘ１０7細胞の神経
細胞IMR32（ATCC No.CCL127；大日本製薬から購入し
た）を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社
製）を用いて３７℃にて５％ＣＯ2存在下に、直径約１
０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培養し
た。翌日、培養された細胞をトリプシン処理により分散
し、FBSを含まないDMEM培地で２回洗浄した後、再度１
ｘ１０7に細胞密度がなるようにFBSを含まないDMEM培地
に分散した。この細胞分散液0.4ｍｌに、レポーター遺
伝子プラスミドpGL3-TATA-Galx4と、前記（６−２）で
調製されたプラスミドpRC/RSV-Gal4-DBDまたは（６−
４）で調製されたプラスミドpRC/RSV-MA-mNXF(AvaI fra
g)とを３μｇずつ添加し混合した後、この混合物をエレ
クトロポレーション用キュベットに移し、Geneパルサー
（BIORAD社製）を用いたエレクトロポレーション法によ
り200V、950μFの条件でトランスフェクションを行っ
た。トランスフェクション後、培地を１０％ＦＢＳを含
むＤＭＥＭ培地に置換してさらに６穴プレート内で約24
時間培養した。次いで、ウェルから培地を除き、器壁に
接着している細胞をPBS(-)で２回洗浄した後、５倍に希
釈したＰＧＣ５０（東洋インキ社製）をウェルあたり２
００μｌずつ加えてさらに室温に３０分間放置した。こ
の細胞液２０μｌずつをオペークプレート（コーニング
コースター社製）上に分注し、当該プレートを酵素基質
自動インジェクター付きルミノメーターＬＢ９６Ｐ（ベ
ルトールド社製）にセットし、５０μｌの基質液ＰＧＬ
１００（東洋インキ社製）を自動分注した後、各ウェル
内のルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定した。その結果
を図１に示した。レポーター遺伝子プラスミドpGL3-TAT
A-Galx4を用いたワンハイブリッドアッセイ（One hybri
d assay）を行った結果、Gal4のＤＮＡ結合領域と本発
明蛋白質の転写調節領域（AvaI切断部位に相当するアミ
ノ酸からC末端まで）とが結合してなる融合蛋白質を発
現する形質転換体の場合（図中ではGal4-NXF Ctermと記
載される）には、レポーター遺伝子の高発現が認められ
た。一方、対照であるGal4のＤＮＡ結合領域のみを発現
する形質転換体の場合（図中ではGal4 DBDと記載され
る）には、レポーター遺伝子の発現は認められなかっ
た。このように宿主細胞としてIMR32等の神経細胞を用
いた場合において、本発明蛋白質は、転写活性化能を有
することが確認された。
【００６４】（６−５）pGL3-TATAベクターの調製 上記の実施例でpGL3-TATA-Galx4を構築するために用い
られたpGL3-TATAベクターは、以下のようにして作製さ
れた。まず、マウスメタロチオネインI遺伝子のTATA bo
x近傍の塩基配列とリーダー配列（Genbank Accession N
o.J00605）に由来する塩基配列とからなる塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドと前記塩基配列に相補的な塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド［５'-GATCTCGACTATAA
AGAGGGCAGGCTGTCCTCTAAGCGTCACCACGACTTCA-3'（配列番
号６０）、5'-AGCTTGAAGTCGTGGTGACGCTTAGAGGACAGCCTGC
CCTCTTTATAGTCGA-3'（配列番号６１）］とをアニールし
た後に、T４ kinaseで5'末端をリン酸化した（以下、当
該ＤＮＡをTATA ＤＮＡと記すこともある。）。このTAT
A DNA1μｇと、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むベク
タープラスミドpGL3（プロメガ社製）を制限酵素Bgl II
及びHind IIIで消化した後アルカリフォスファターゼ
（BAP C75；宝酒造製）処理して得られたＤＮＡ（0.1μ
ｇ）とをT4Ligase（宝酒造製で結合させる（１６℃、１
６時間反応）ことにより、pGL3−TATAを得た。
【００６５】実施例７（本発明蛋白質の転写調節能を変
化させる物質のスクリーニング） 動物細胞発現用pMベクター（クロンテック社製）をSmaI
で消化し、次いでアルカリフォスファターゼ（BAP）を
添加して65℃１時間保温した後、低融点アガロースゲル
電気泳動に供し、ベクターＤＮＡを回収する。一方、実
施例１で作製されたpGEM-hNXFをNcoIとNotIとで消化
し、Blunting kit（宝酒造製）で末端を平滑化する処理
をした後、低融点アガロースゲル電気泳動に供し、約２
ｋｂのＤＮＡを回収する。回収された上記のベクターＤ
ＮＡと約２ｋｂのＤＮＡとを混合し、T4リガーゼを反応
させる。この反応液を大腸菌DH5αコンピテントセル（T
OYOBO製）に導入する。得られた大腸菌形質転換体を培
養し、保有するプラスミドを抽出して、得られたプラス
ミドＤＮＡについて制限酵素分析及び塩基配列分析を行
なう。pMベクターに上記の約２ｋｂのＤＮＡが挿入され
たプラスミドを選択し、pM-hNXF(SmaI)と名付ける。こ
のようにしてGal4DNA結合領域と、本発明蛋白質の部分
アミノ酸配列を有するポリペプチドとの融合蛋白質を発
現させるためのベクターが得られる。HeLa細胞を10cmプ
レートに約2x106細胞播種し、FBS含有E-MEM培地で、5O2
存在下37℃にて１日間培養を行う。得られた細胞に、リ
ポフェクトアミン（Life Technologies社製）を用いて
その添付プロトコールに従い、3.75μgのプラスミドｐM
−ｈNXF(SmaI)と3.75μgのプラスミドｐFR-LUC（ストラ
タジーン社製；Gal４応答ルシフェラーゼレポーター遺
伝子を含有する。）とを導入する。37℃にて16時間培養
した後、培地を交換しさらに3時間培養する。細胞を集
めてFBS含有E-MEM培地に懸濁して均一化し、DMSOで溶解
した様々な濃度の各種被検物質を添加した培養液をあら
かじめ加えておいた96穴プレート（DMSO終濃度0.1）に
播種する。このプレートを37℃にて約40時間培養した
後、5倍に希釈した細胞溶解剤PGC50（ニッポンジーン社
製）を50μｌ／wellずつ加えて、時々軽くゆすりながら
室温にて30分間放置して細胞を溶解させる。このように
して調製された細胞溶解液を10μｌずつ96穴白色サンプ
ルプレート（ベルトールド社製）に採取し、基質自動イ
ンジェクター付きのルミノメーターLB96p（ベルトール
ド社製）で50μｌ/wellずつ酵素基質液PGL100（ニッポ
ンジーン社製）を添加しながら直ちに発光量を5秒間測
定する。
【００６６】実施例８（本発明蛋白質をコードするゲノ
ムＤＮＡの取得） 実施例１で得られたプラスミドｐGEM-mNXFのＤＮＡをEc
oRIとHindIIIで消化した後、低融点アガロース（アガロ
ースL：ニッポンジーン）を用いたアガロースゲル電気
泳動に供し、0.6kbのＤＮＡ、0.9kbのＤＮＡ及び1ｋbの
ＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを等量ずつ混合
し、そのうち約２５ngを分取してアマシャム社製マルチ
プライムDNA標識システムを用いて該システムの添付プ
ロトコールに従い32Ｐ標識した。大腸菌XL1-Blue MRA
（Stratagene社より入手）を一晩培養し、得られた培養
液0.3mlに、直径１５ｃｍのプレート１枚あたり５ｘ１
０4プラークが形成される量のマウス（129SvJ系統）ゲ
ノムＤＮＡライブラリー（＃946313、Stratagene社から
購入）を加え、37℃にて20分間保温した後、50℃に保温
された6.5mlの0.7アガロースを加え、直ちに直径15cmの
NZYM（NZamine 10g、NaCl 5g、Yeast Extract5g、MgSO4
・７H2O 2g及びAgar 15ｇを水１Lに溶解）プレート上へ
広げた。このプレートを３７℃にて一晩保温した。次い
で、プラークの生じたプレートの表面に、直径１５cmの
丸型ニトロセルロースフィルター（ハイボンドN、アマ
シャム社製）を静かにのせ、このフィルターにプラーク
をトランスファーした。このフィルターを室温で２０分
間放置した後、変性バッファー（組成：0.2N NaOH,1.5M
NaCl）に浸した濾紙上に５分間載せた。次にこのフィ
ルターを、中和バッファー（組成：0.4M Tris-HCl pH7.
5, 2xSSC）に浸した濾紙上に１分間載せ、さらに500ｍ
ｌの2xSSCに５分間浸した。次いで、フィルターを乾い
た濾紙上へ移し、室温で数時間、乾燥するまで放置した
後、８０℃のオーブン中で２時間保温した。得られたフ
ィルターをプラスチック製シールバックに入れ、50mlの
ハイブリバッファー（組成：5xSSC、50mM HEPES pH7.
0、10xデンハルト溶液、20μg/ml変性Salmon sperm DN
A）中で65℃にて一晩保温した。次にこれに、上記の32
Ｐ標識されたＤＮＡを熱変性させた後全量加え、65℃で
一晩保温した。次いでフィルターを取り出し、2xSSC中
で室温にて３０分間リンスし、さらに0.1xSSC中で６５
℃にて４０分間リンスした。次にフィルターを新しい0.
1xSSCに移して６５℃にて４０分間リンスした後、濾紙
上で室温にて放置して乾燥させ、オートラジオグラフィ
ー（−８０℃にて２日間）を行った。上記のオートラジ
オグラフィーで陽性シグナルが検出された部分のプレー
トからファージを回収して100μlのSM buffer（NaCl 5.
8g、MgSO4・７H2O 2g及びゼラチン0.1gを１Lに溶解、ｐ
H7.5）に懸濁した。得られたファージ懸濁液を用いて、
上記と同様にしてハイブリダイゼーション法による２次
スクリーニングを行った。但し、プレート１枚あたりに
形成させるプラークの数は、約１０００個程度とした。
このスクリーニングで陽性シグナルが検出された部分の
プレートからプラークを回収し、２次スクリーニングと
同じ方法で３次スクリーニングを行い、陽性シグナルを
与えるファージクローンを得た。前記の陽性シグナルが
検出されたファージクローンの懸濁液１μlを、１００
μlのTE bufferに添加して煮沸し、これを鋳型にしてPC
Rを行った。プライマーには、上記ゲノムＤＮＡライブ
ラリーの作製に用いられたLambda FIXIIベクターの保有
するクローニングサイトの両側にそれぞれアニールする
２種のプライマー［T7ユニバーサルプライマー及びT3ユ
ニバーサルプライマー（Stratagene社製）］を使用し
た。PCRの反応液は、上記の煮沸液５μl、上記２種のプ
ライマーそれぞれ１０pmol、LA-taq polymerase(宝酒
造)、該酵素に添付のバッファーを添加して全量５０μ
ｌとした。反応は、９５℃１分間次いで５０℃１分間さ
らに７２℃１０分間の保温を１サイクルとしてこれを３
５サイクル行った。次いで、反応液をアガロースゲル電
気泳動に供して、約7kbpのDNAを回収した。回収された
ＤＮＡの約１０μgを鋳型にして、DyeTerminator Cycle
Sequence FSキット（パーキンエルマーABI）を用い
て、該キットに添付プロトコールに従い、ダイレクトシ
ークエンスを行った。その結果、上記のＤＮＡは、配列
番号５４で示される塩基配列を有することがわかった。
得られた塩基配列と配列番号５で示される塩基配列とを
比較することにより、イントロン/エクソンの構成が明
らかとなった。
【００６７】実施例９ （本発明蛋白質によるdrebrin
1の発現促進） （９−１）pRC/RSV-mNXFsense及びpRC/RSV-mNXFantisen
seの調製 哺乳動物細胞内において本発明蛋白質の全長を発現させ
るためのプラスミドを、以下のようにして作製した。実
施例１で得られたpGEM-mNXFは、市販のpGEMベクターのS
p6プロモーターの下流にマウス由来の本発明蛋白質をコ
ードする翻訳領域の開始コドンが位置するように構築さ
れていた。そこでこのpGEM-mNXF（1μg）を鋳型にし
て、かつ、配列番号６２で示されるオリゴヌクレオチド
（フォワードプライマー 5´-gggcgctgcagcccagccaccat
gtaccgatccaccaaggg-3´）および配列番号６３で示され
るオリゴヌクレオチド（リバースプライマー 5´-aatct
cggcgttgatctggt-3´）をプライマーとして、KODplusポ
リメラーゼ（TOYOBO社製）を用いたPCRを行うことによ
り、本発明蛋白質をコードする翻訳領域の開始コドンの
直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）が導入され、
さらにその上流にPstI制限酵素部位が導入された本発明
蛋白質の一部をコードするＤＮＡを得た。該PCRは、95
℃１分間次いで55℃３０秒間さらに72℃１分間の保温を
1サイクルとしてこれを35サイクル行った。このように
して得られたＤＮＡをPstIとBssHIIとで切断した後、低
融点アガロースゲル電気泳動（NusieveGTGアガロース；
FMCbio社製）に供することにより精製・回収した。精製
・回収されたＤＮＡを下記で用いるインサートＤＮＡと
した。次に、pGEM-mNXFをPstIとBssHIIとで切断した後B
AP処理して得られたＤＮＡを低融点アガロースゲル電気
泳動（AgaroseL；ニッポンジーン社製）に供し、前記Ｄ
ＮＡを回収した。回収されたＤＮＡ（0.1μｇ）に上記
のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させ
ることにより、マウス由来の本発明蛋白質をコードする
翻訳領域の開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGC
CACC-3'）が導入されているプラスミドpGEM-mNXFコザッ
クを作製した。次に、プラスミドｐGEM-mNXFコザックを
PstI、NotI及びScaIの３者で同時に切断した後、これを
低融点アガロース電気泳動に供し、約2.5kbpのＤＮＡ
（mNXFコザックPstI-NotI）を回収した。そして、回収
されたＤＮＡをT4ポリメラーゼで平滑末端化し、得られ
たＤＮＡをインサートＤＮＡとした。RSVプロモーター
を保有するプラスミドpRC/RSV（Invitorgen社製）をHin
dIIIで切断した後T4ポリメラーゼで平滑末端化して得ら
れたＤＮＡをBAP処理し、これをベクターＤＮＡとし
た。このベクターＤＮＡ（0.1μg）に前記インサートＤ
ＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、
（ａ）コザック配列の下流にマウス由来の本発明蛋白質
をコードする翻訳領域が接続されてなるＤＮＡのセンス
鎖がRSVプロモーターの制御下に発現するプラスミドで
あるpRC/RSV-mNXFsense、及び（ｂ）コザック配列の下
流にマウス由来の本発明蛋白質をコードする翻訳領域が
接続されてなるＤＮＡのアンチセンス鎖がRSVプロモー
ターの制御下に発現するプラスミドであるpRC/RSV-mNXF
antisenseを作製した。尚、作製されたプラスミドが所
望の構造を有することを、ベクターＤＮＡとインサート
ＤＮＡとの境界領域の塩基配列を調べることにより確認
した。
【００６８】（９−２）本発明蛋白質によるdrebrin 1
の発現促進 まず、約１ｘ１０7細胞のSK-N-MC細胞（ATCC No.HTB1
0；大日本製薬より購入した）を、１０％ＦＢＳを含む
ＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）を用いて３７℃にて５％
ＣＯ2存在下に、直径約１０ｃｍのシャーレ（ファルコ
ン社製）を用いて培養した。翌日、培養された細胞をト
リプシン処理により分散し、FBSを含まないDMEM培地で
２回洗浄した後、再度１ｘ１０7に細胞密度がなるよう
にFBSを含まないDMEM培地に分散した。この細胞分散液
0.4ｍｌに、上記のようにして調製されたプラスミド、
即ち、（ａ）本発明蛋白質の全長をコードするＤＮＡの
センス鎖がRSVプロモーターの制御下に発現するプラス
ミドであるpRC/RSV-mNXFsense、又は（ｂ）本発明蛋白
質の全長をコードするＤＮＡのアンチセンス鎖がRSVプ
ロモーターの制御下に発現するプラスミドであるpRC/RS
V-mNXFantisense、10μｇを混合した後、この混合物を
エレクトロポレーション用キュベットに移し、Geneパル
サー（BIORAD社製）を用いたエレクトロポレーション法
により200V、950μFの条件でトランスフェクションを行
った。トランスフェクション後、培地を１０％ＦＢＳを
含むＤＭＥＭ培地に置換してさらに10ｃｍシャーレ内で
約24時間培養した。培養後、（ａ）pRC/RSV-mNXFsense
導入細胞シャーレ５枚分、又は（ｂ）pRC/RSV-mNXFanti
sense導入細胞シャーレ５枚分を材料にしてRNA精製及び
放射能ラベル用市販キットであるAtlas Pure Total RNA
Labeling system（K1038-1；クロンテック社製）を用
いてDNAを含まないtotalRNAを精製した。RNA収量は、
（ａ）の場合には23μｇ、（ｂ）の場合には26μｇであ
った。次に、得られたRNAを材料にして、上記キットに
含まれる特異的プライマー及び逆転写酵素を用いて[α-
P32] -dATP（アマシャムファルマシア社製）でそれぞれ
のRNAを放射能ラベルした。次に、放射能ラベルされた
ＲＮＡ（以下、プローブと記す。）を上記キットを用い
て精製した後、精製されたＲＮＡの1.3ｘ105DPM相当分
を以下のハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリ
ダイゼーションは、種々の遺伝子がブロットされたナイ
ロン膜を含むキット（Atlas ｃDNA Expression array-N
eurobiology ；7736-1 クロンテック社製）及び該キッ
トに付属のハイブリダイゼーションバッファーを用い
て、（ａ）pRC/RSV-mNXFsense導入細胞由来のプローブ
または（ｂ）pRC/RSV-mNXFantisense導入細胞由来のプ
ローブをそれぞれ添加し、同一条件のもとで１８時間行
った。ハイブリダイゼーションの後、各ナイロン膜を２
XSSC、1%SDSバッファーで洗浄（68℃、30分間）した。
これを４回繰り返した後、更に0.1XSSC、0.5%SDSバッフ
ァーで洗浄（68℃、30分間）した。それぞれのナイロン
膜をプラスチックラップに包み、IPプレート（富士フィ
ルム社製）に7日間感光させたのち、イメージングアナ
ライザー（BASstation；富士フィルム社製）でナイロン
膜上の種々の遺伝子に対応するハイブリダイゼーション
シグナルの強度の定量と比較を行った。その結果、dreb
rin 1遺伝子について、（ａ）pRC/RSV-mNXFsense導入細
胞由来のプローブとハイブリダイズさせたナイロン膜上
のハイブリダイゼーションシグナルが、（ｂ）pRC/RSV-
mNXFantisense導入細胞由来のプローブとハイブリダイ
ズさせたナイロン膜上のハイブリダイゼーションシグナ
ルよりも有意に強く検出された。このように、本発明蛋
白質にはdrebrin 1の発現を促進する能力が存在するこ
とが確認できた。
【００６９】実施例１０ （本発明蛋白質をコードする
遺伝子の発現調節領域とレポーター蛋白質をコードする
ＤＮＡとが機能可能な形で連結されてなるレポーター遺
伝子の作製及びそのプロモーター活性確認：マウス由来
の本発明蛋白質のゲノムの塩基配列の決定） （１０−１）材料の調製 配列番号５５で示される本発明蛋白質をコードするマウ
ス由来のゲノムＤＮＡの塩基配列を以下のようにして決
定した。実施例８に記載のマウスゲノムＤＮＡライブラ
リーのスクリーニングにより取得された本発明蛋白質を
コードするゲノムファージクローンのうちの1つのファ
ージ液1μlを鋳型とし、上記ゲノムＤＮＡライブラリー
の作製に用いられたLambda FIXIIベクター上に設定され
たプライマー対であるT7ユニバーサルプライマー及びT3
ユニバーサルプライマー（Stratagene社製）を使用し、
LA-Taqポリメラーゼ（宝酒造製）を用いてＰＣＲを行な
った。ＰＣＲは、95℃１分間次いで68℃ 20分間の保温
を1サイクルとし、これを３５サイクル繰り返した。得
られた増幅ＤＮＡ（約21kbp）を、0.8％低融点アガロー
ス（アガロースL；日本ジーン社製）を用いた電気泳動
に供することにより、ＤＮＡ（約21kbp）を精製・回収
した。精製・回収されたＤＮＡについてキャピラリーシ
ークエンサー（PE-biosystems社製model3700）とダイタ
ーミネーターシークエンスキットFS ver2（PE-biosyste
ms社製）とを用いたカスタムプライマーダイレクトシー
クエンスを行うことにより当該DNAの全塩基配列（配列
番号５５）を決定した。
【００７０】（１０−２）本発明蛋白質をコードする遺
伝子の発現調節領域とレポーター蛋白質をコードするＤ
ＮＡとが機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝
子の作製 マウス由来の本発明蛋白質をコードする遺伝子の転写開
始点（配列番号５５における塩基番号9437-9442）から
それぞれ約10kbp、約5kbp、約2.5kbpまたは約1kbp上流
までを含む、本発明蛋白質をコードする遺伝子の発現調
節領域を取得するために、まず、配列番号５５で示され
る塩基配列に基づき、以下の塩基配列からなるフォワー
ド側ＰＣＲプライマーを設計した。 上流約10kbp用：5´-gggcggtaccatacctagggccaataggagt
gatgagcccatgtc-3´：配列番号６４ 上流約5kbp用：5´-gggcggtaccaacgaggaatctctcttcctct
ccactgtccgggc-3´：配列番号６５、 上流約2.5kbp用：5´-gggcggtaccctgcttaaattgcttggaga
ccagctgtggaccca-3´：配列番号６６、 上流約1kbp用：5´-gggcggtaccctcagtgacaagtgcacaggca
gaacgaggagccc-3´：配列番号６７ また同様に配列番号５５で示される塩基配列に基づき、
以下の塩基配列からなるリバース側PCRプライマーを設
計した。5´-gggcacgcgttcgcctgcctcgatccgccttatgtagc
tcctgac-3´：配列番号６８。 上記のフォワード側プライマーにはKpnI制限酵素サイト
が設けられており、リバース側プライマーにはMluI制限
酵素サイトが設けられている。上記のフォワード側プラ
イマーのいずれかとリバース側プライマーとをプライマ
ー対とし、かつ、マウス由来の本発明蛋白質をコードす
るゲノムファージクローンのファージ液1μｌを鋳型に
し、KODplusポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用いてＰＣ
Ｒを行なった。ＰＣＲは、95℃１分間次いで68℃10分間
の保温を1サイクルとして35サイクル行った。このよう
にして、マウス由来の本発明蛋白質をコードする遺伝子
の転写開始点からそれぞれ約10kbp、約5kbp、約2.5kbp
または約1kbp上流までを含むＤＮＡを増幅した。これら
それぞれを制限酵素KpnI及びMluIの両者で切断した後、
低融点アガロースゲル電気泳動（Agarose L；日本ジー
ン社製）に供することによりそれぞれの増幅ＤＮＡを回
収した。回収されたそれぞれの増幅ＤＮＡ（約0.5μ
ｇ）と、実施例６で調製されたpGL3-TATAベクターをKpn
I及びMluIの両者で切断した後アルカリフォスファター
ゼ（BAP C75；宝酒造製）処理して得られたＤＮＡ（0.1
μｇ）とをT4 Ligase(宝酒造製)で結合させる（１６
℃、１６時間反応）ことにより、TATA最小プロモーター
を有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、マウス由来の
本発明蛋白質をコードする遺伝子の転写開始点からそれ
ぞれ約10kbp（配列番号５５で示される塩基配列におけ
る塩基番号72-9436）、約5kbp（配列番号５５で示され
る塩基配列における塩基番号4364-9436）、約2.5kbp
（配列番号５５で示される塩基配列における塩基番号68
89-9436）または約1kbp（配列番号５５で示される塩基
配列における塩基番号8216-9436）上流までを含む、本
発明蛋白質をコードする遺伝子の発現調節領域がそれぞ
れ挿入されたプラスミドを得た。
【００７１】（１０−３）発現調節領域が有するプロモ
ーター活性の確認 本発明蛋白質をコードする遺伝子の発現調節領域が有す
るプロモーター活性の相対活性を調べるために、対照レ
ポータープラスミドであるｐGL3-TK-BSDを以下のように
して作製した。尚、この対照レポータープラスミドのル
シフェラーゼ遺伝子は、ヘルペス単純ウイルスのチミジ
ンキナーゼのプロモーターによる制御を受ける。まず、
プラスミドpRL-TK（プロメガ社製）をHind III及びBgl
IIの両者で切断した後、それを低融点アガロースゲル電
気泳動（アガロースL；ニッポンジーン社製）に供する
ことにより、TKプロモーターを含むＤＮＡ（７６０ｂ
ｐ）を回収した。次に、プラスミドpGL3をHind IIIとBg
l IIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡを、低
融点アガロースゲル電気泳動に供することにより、pGL3
由来のルシフェラーゼ遺伝子を含むBgl II−Hind IIIの
ＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡのうち約0.1μｇ
を、上記のTKプロモーターを含むＤＮＡ約0.2μｇと混
合し、この混合物をT4 リガーゼと反応させることによ
り、pGL3のHind III切断部位とBgl II切断部位との間に
上記のTKプロモーターを含むDNAが挿入された構造を有
するプラスミドであるpGL3-TKを作製した。作製されたp
GL3-TKのＤＮＡをBamH Iで切断した後BAP処理て得られ
たＤＮＡを、低融点アガロースゲル電気泳動に供するこ
とにより、単一のバンドとして検出されるＤＮＡを回収
した。当該ＤＮＡと、プラスミドpUCSV-BSD（フナコシ
社より購入）をBamHIで消化することにより調製された
ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子発現カセットを
コードするＤＮＡとを、T4 Ligaseで結合させることに
より、ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子発現カセ
ットがpGL3-TKのBamHI切断部位に挿入された構造を有す
るプラスミドであるpGL3-TK−BSDを作製した。約５ｘ１
０6の293細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（日
水製薬社製）を用いて３７℃で５％ＣＯ2存在下に、直
径約１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培
養した。翌日、培養された細胞をトリプシン処理により
分散し、FBSを含まないDMEM培地で２回洗浄した後、再
度５ｘ１０6に細胞密度がなるようにFBSを含まないDMEM
培地に分散した。この細胞分散液0.4ｍｌに、（１０−
２）で調製されたプラスミドまたは上記のプラスミドpG
L3-TK−BSDのいずれかをそれぞれ３μｇ混合した後、こ
の混合物をエレクトロポレーション用キュベットに移
し、Geneパルサー（BIORAD社製）を用いたエレクトロポ
レーション法により220V、950μFの条件でトランスフェ
クションを行った。トランスフェクション後、培地を１
０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換してさらに６穴プ
レート内で約24時間培養した。次いで、ウェルから培地
を除き、器壁に接着している細胞をPBS(-)で２回洗浄し
た後、５倍に希釈したＰＧＣ５０（東洋インキ社製）を
ウェルあたり２００μｌずつ加えてさらに室温に３０分
間放置した。この細胞液２０μｌずつをオペークプレー
ト（コーニングコースター社製）上に分注し、当該プレ
ートを酵素基質自動インジェクター付きルミノメーター
ＬＢ９６Ｐ（ベルトールド社製）にセットし、５０μｌ
の基質液ＰＧＬ１００（東洋インキ社製）を自動分注し
た後、各ウェル内のルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定
した。その結果を図２に示した。ヘルペス単純ウイルス
のチミジンキナーゼプロモーター（HSV-TK）と本発明蛋
白質をコードする遺伝子の発現調節領域とのプロモータ
ー活性を比較したところ、本発明蛋白質をコードする遺
伝子の転写開始点から約5kbp、約2.5kbpまたは約1kbp上
流までを含む、本発明蛋白質をコードする遺伝子の発現
調節領域（図中では-5kbp NXFgenome、-2.5kbp NXFgeno
me、-1kbp NXFgenomeと記載される）は、いずれも293細
胞の中でHSV-TKプロモーター（図中ではHSV-TK enhance
rと記載される）との比較において同等またはより高い
プロモーター活性を示した。特に、ここで確認されたプ
ロモーター活性にクリテイカルな部分は、本発明蛋白質
の遺伝子の転写開始点から約1kbp上流までを含む領域に
存在していることが確認された。
【００７２】実験例１１ （本発明蛋白質をコードする
遺伝子の発現調節領域を利用した本発明蛋白質の転写調
節能を変化させる物質のスクリーニング方法） 実施例１０で作製された、TATA最小プロモーターを有す
るルシフェラーゼ遺伝子の上流に、本発明蛋白質をコー
ドする遺伝子の発現調節領域（マウス由来の本発明蛋白
質の転写開始点からそれぞれ約10kbp、約5kbp、約2.5kb
pまたは約1kbp上流までを含む）が、それぞれ挿入され
たプラスミドを293細胞にエレクトロポレーション法を
用いてトランスフェクションする。トランスフェクショ
ン後、（ａ）被検物質を添加しない培養液、又は（ｂ）
被検物質を添加した培養液、をそれぞれあらかじめ加え
ておいた９６穴プレートに、トランスフェクションされ
た細胞を播種する。この細胞を３７℃で約２４時間培養
した後、ルシフェラーゼ活性を測定する。測定されたル
シフェラーゼ活性の比較において、（ａ）で培養した場
合におけるルシフェラーゼ活性に対して（ｂ）で培養し
た場合におけるルシフェラーゼ活性が高い場合には、そ
の被検物質は、本発明蛋白質をコードする遺伝子の発現
を増大させる物質であると判断する。逆に、低い場合に
は、本発明蛋白質をコードする遺伝子の発現を減少させ
る物質であると判断する。このようにして本発明蛋白質
による転写調節能を変化させる物質をスクリーニングす
ることができる。
【００７３】
【発明の効果】本発明により、ｂＨＬＨ−ＰＡＳ蛋白
質、該蛋白質をコードするＤＮＡ等が提供可能となる。
【００７４】 ［配列表フリーテキスト］ 配列番号７ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号８ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号９ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１０ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１１ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１２ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１３ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１４ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１５ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１６ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１７ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１８ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１９ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号２０ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号２１ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号２２ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号２３ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号２４ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号２５ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号２６ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号２７ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号２８ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号２９ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号３０ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号３１ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号３２ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号３３ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号３４ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号３５ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号３６ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号３７ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号３８ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号３９ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号４０ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号４１ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号４２ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号５２ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号５３ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号５６ 設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号５７ 設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号５８ 設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号５９ 設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号６０ 設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号６１ 設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号６２ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号６３ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号６４ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号６５ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号６６ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号６７ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号６８ ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００７５】
【配列表】 <110> Sumitomo Chemical Company Limited <120> bHLH-PAS Proteins, its gene and use thereof <130> P153771 <150> JP 2000/398548 <151> 2000-12-27 <150> JP 2001/077740 <151> 2001-03-19 <160> 68 <210> 1 <211> 802 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Tyr Arg Ser Thr Lys Gly Ala Ser Lys Ala Arg Arg Asp Gln Ile 1 5 10 15 Asn Ala Glu Ile Arg Asn Leu Lys Glu Leu Leu Pro Leu Ala Glu Ala 20 25 30 Asp Lys Val Arg Leu Ser Tyr Leu His Ile Met Ser Leu Ala Cys Ile 35 40 45 Tyr Thr Arg Lys Gly Val Phe Phe Ala Gly Gly Thr Pro Leu Ala Gly 50 55 60 Pro Thr Gly Leu Leu Ser Ala Gln Glu Leu Glu Asp Ile Val Ala Ala 65 70 75 80 Leu Pro Gly Phe Leu Leu Val Phe Thr Ala Glu Gly Lys Leu Leu Tyr 85 90 95 Leu Ser Glu Ser Val Ser Glu His Leu Gly His Ser Met Val Asp Leu 100 105 110 Val Ala Gln Gly Asp Ser Ile Tyr Asp Ile Ile Asp Pro Ala Asp His 115 120 125 Leu Thr Val Arg Gln Gln Leu Thr Leu Pro Ser Ala Leu Asp Thr Asp 130 135 140 Arg Leu Phe Arg Cys Arg Phe Asn Thr Ser Lys Ser Leu Arg Arg Gln 145 150 155 160 Ser Ala Gly Asn Lys Leu Val Leu Ile Arg Gly Arg Phe His Ala His 165 170 175 Pro Pro Gly Ala Tyr Trp Ala Gly Asn Pro Val Phe Thr Ala Phe Cys 180 185 190 Ala Pro Leu Glu Pro Arg Pro Arg Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly 195 200 205 Pro Ala Ser Leu Phe Leu Ala Met Phe Gln Ser Arg His Ala Lys Asp 210 215 220 Leu Ala Leu Leu Asp Ile Ser Glu Ser Val Leu Ile Tyr Leu Gly Phe 225 230 235 240 Glu Arg Ser Glu Leu Leu Cys Lys Ser Trp Tyr Gly Leu Leu His Pro 245 250 255 Glu Asp Leu Ala His Ala Ser Ala Gln His Tyr Arg Leu Leu Ala Glu 260 265 270 Ser Gly Asp Ile Gln Ala Glu Met Val Val Arg Leu Gln Ala Lys Thr 275 280 285 Gly Gly Trp Ala Trp Ile Tyr Cys Leu Leu Tyr Ser Glu Gly Pro Glu 290 295 300 Gly Pro Ile Thr Ala Asn Asn Tyr Pro Ile Ser Asp Met Glu Ala Trp 305 310 315 320 Ser Leu Arg Gln Gln Leu Asn Ser Glu Asp Thr Gln Ala Ala Tyr Val 325 330 335 Leu Gly Thr Pro Thr Met Leu Pro Ser Phe Pro Glu Asn Ile Leu Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Cys Ser Ser Thr Asn Pro Leu Phe Thr Ala Ala Leu Gly 355 360 365 Ala Pro Arg Ser Thr Ser Phe Pro Ser Ala Pro Glu Leu Ser Val Val 370 375 380 Ser Ala Ser Glu Glu Leu Pro Arg Pro Ser Lys Glu Leu Asp Phe Ser 385 390 395 400 Tyr Leu Thr Phe Pro Ser Gly Pro Glu Pro Ser Leu Gln Ala Glu Leu 405 410 415 Ser Lys Asp Leu Val Cys Thr Pro Pro Tyr Thr Pro His Gln Pro Gly 420 425 430 Gly Cys Ala Phe Leu Phe Ser Leu His Glu Pro Phe Gln Thr His Leu 435 440 445 Pro Thr Pro Ser Ser Thr Leu Gln Glu Gln Leu Thr Pro Ser Thr Ala 450 455 460 Thr Phe Ser Asp Gln Leu Thr Pro Ser Ser Ala Thr Phe Pro Asp Pro 465 470 475 480 Leu Thr Ser Pro Leu Gln Gly Gln Leu Thr Glu Thr Ser Val Arg Ser 485 490 495 Tyr Glu Asp Gln Leu Thr Pro Cys Thr Ser Thr Phe Pro Asp Gln Leu 500 505 510 Leu Pro Ser Thr Ala Thr Phe Pro Glu Pro Leu Gly Ser Pro Ala His 515 520 525 Glu Gln Leu Thr Pro Pro Ser Thr Ala Phe Gln Ala His Leu Asp Ser 530 535 540 Pro Ser Gln Thr Phe Pro Glu Gln Leu Ser Pro Asn Pro Thr Lys Thr 545 550 555 560 Tyr Phe Ala Gln Glu Gly Cys Ser Phe Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Pro 565 570 575 Ser Pro Ser Ser Pro Gly Asn Gly Asp Cys Thr Leu Leu Ala Leu Ala 580 585 590 Gln Leu Arg Gly Pro Leu Ser Val Asp Val Pro Leu Val Pro Glu Gly 595 600 605 Leu Leu Thr Pro Glu Ala Ser Pro Val Lys Gln Ser Phe Phe His Tyr 610 615 620 Ser Glu Lys Glu Gln Asn Glu Ile Asp Arg Leu Ile Gln Gln Ile Ser 625 630 635 640 Gln Leu Ala Gln Gly Met Asp Arg Pro Phe Ser Ala Glu Ala Gly Thr 645 650 655 Gly Gly Leu Glu Pro Leu Gly Gly Leu Glu Pro Leu Asp Ser Asn Leu 660 665 670 Ser Leu Ser Gly Ala Gly Pro Pro Val Leu Ser Leu Asp Leu Lys Pro 675 680 685 Trp Lys Cys Gln Glu Leu Asp Phe Leu Ala Asp Pro Asp Asn Met Phe 690 695 700 Leu Glu Glu Thr Pro Val Glu Asp Ile Phe Met Asp Leu Ser Thr Pro 705 710 715 720 Asp Pro Ser Glu Glu Trp Gly Ser Gly Asp Pro Glu Ala Glu Gly Pro 725 730 735 Gly Gly Ala Pro Ser Pro Cys Asn Asn Leu Ser Pro Glu Asp His Ser 740 745 750 Phe Leu Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Glu Thr Ala Phe Glu Thr Gly Val 755 760 765 Ser Ala Phe Pro Tyr Asp Gly Phe Thr Asp Glu Leu His Gln Leu Gln 770 775 780 Ser Gln Val Gln Asp Ser Phe His Glu Asp Gly Ser Gly Gly Glu Pro 785 790 795 800 Thr Phe 802 <210> 2 <211> 802 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Tyr Arg Ser Thr Lys Gly Ala Ser Lys Ala Arg Arg Asp Gln Ile 1 5 10 15 Asn Ala Glu Ile Arg Asn Leu Lys Glu Leu Leu Pro Leu Ala Glu Ala 20 25 30 Asp Lys Val Arg Leu Ser Tyr Leu His Ile Met Ser Leu Ala Cys Ile 35 40 45 Tyr Thr Arg Lys Gly Val Phe Phe Ala Gly Gly Thr Pro Leu Ala Gly 50 55 60 Pro Thr Gly Leu Leu Ser Ala Gln Glu Leu Glu Asp Ile Val Ala Ala 65 70 75 80 Leu Pro Gly Phe Leu Leu Val Phe Thr Ala Glu Gly Lys Leu Leu Tyr 85 90 95 Leu Ser Glu Ser Val Ser Glu His Leu Gly His Ser Met Val Asp Leu 100 105 110 Val Ala Gln Gly Asp Ser Ile Tyr Asp Ile Ile Asp Pro Ala Asp His 115 120 125 Leu Thr Val Arg Gln Gln Leu Thr Met Pro Ser Ala Leu Asp Ala Asp 130 135 140 Arg Leu Phe Arg Cys Arg Phe Asn Thr Ser Lys Ser Leu Arg Arg Gln 145 150 155 160 Ser Ser Gly Asn Lys Leu Val Leu Ile Arg Gly Arg Phe His Ala His 165 170 175 Pro Pro Gly Ala Tyr Trp Ala Gly Asn Pro Val Phe Thr Ala Phe Cys 180 185 190 Ala Pro Leu Glu Pro Arg Pro Arg Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly 195 200 205 Pro Gly Pro Ala Ser Leu Phe Leu Ala Met Phe Gln Ser Arg His Ala 210 215 220 Lys Asp Leu Ala Leu Leu Asp Val Ser Glu Ser Val Leu Ile Tyr Leu 225 230 235 240 Gly Phe Glu Arg Ser Glu Leu Leu Cys Lys Ser Trp Tyr Gly Leu Leu 245 250 255 His Pro Glu Asp Leu Ala Gln Ala Ser Ser Gln His Tyr Arg Leu Leu 260 265 270 Ala Glu Ser Gly Asp Ile Gln Ala Glu Met Val Val Arg Leu Gln Ala 275 280 285 Lys His Gly Gly Trp Thr Trp Ile Tyr Cys Met Leu Tyr Ser Glu Gly 290 295 300 Pro Glu Gly Pro Phe Thr Ala Asn Asn Tyr Pro Ile Ser Asp Thr Glu 305 310 315 320 Ala Trp Ser Leu Arg Gln Gln Leu Asn Ser Glu Asp Thr Gln Ala Ala 325 330 335 Tyr Val Leu Gly Thr Pro Ala Val Leu Pro Ser Phe Ser Glu Asn Val 340 345 350 Phe Ser Gln Glu Gln Cys Ser Asn Pro Leu Phe Thr Pro Ser Leu Gly 355 360 365 Thr Pro Arg Ser Ala Ser Phe Pro Arg Ala Pro Glu Leu Gly Val Ile 370 375 380 Ser Thr Pro Glu Glu Leu Pro Gln Pro Ser Lys Glu Leu Asp Phe Ser 385 390 395 400 Tyr Leu Pro Phe Pro Ala Arg Pro Glu Pro Ser Leu Gln Ala Asp Leu 405 410 415 Ser Lys Asp Leu Val Cys Thr Pro Pro Tyr Thr Pro His Gln Pro Gly 420 425 430 Gly Cys Ala Phe Leu Phe Ser Leu His Glu Pro Phe Gln Thr His Leu 435 440 445 Pro Pro Pro Ser Ser Ser Leu Gln Glu Gln Leu Thr Pro Ser Thr Val 450 455 460 Thr Phe Ser Glu Gln Leu Thr Pro Ser Ser Ala Thr Phe Pro Asp Pro 465 470 475 480 Leu Thr Ser Ser Leu Gln Gly Gln Leu Thr Glu Ser Ser Ala Arg Ser 485 490 495 Phe Glu Asp Gln Leu Thr Pro Cys Thr Ser Ser Phe Pro Asp Gln Leu 500 505 510 Leu Pro Ser Thr Ala Thr Phe Pro Glu Pro Leu Gly Ser Pro Ala His 515 520 525 Glu Gln Leu Thr Pro Pro Ser Thr Ala Phe Gln Ala His Leu Asn Ser 530 535 540 Pro Ser Gln Thr Phe Pro Glu Gln Leu Ser Pro Asn Pro Thr Lys Thr 545 550 555 560 Tyr Phe Ala Gln Glu Gly Cys Ser Phe Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Pro 565 570 575 Ser Pro Ser Ser Pro Gly Asn Gly Asp Cys Thr Leu Leu Ala Leu Ala 580 585 590 Gln Leu Arg Gly Pro Leu Ser Val Asp Val Pro Leu Val Pro Glu Gly 595 600 605 Leu Leu Thr Pro Glu Ala Ser Pro Val Lys Gln Ser Phe Phe His Tyr 610 615 620 Thr Glu Lys Glu Gln Asn Glu Ile Asp Arg Leu Ile Gln Gln Ile Ser 625 630 635 640 Gln Leu Ala Gln Gly Val Asp Arg Pro Phe Ser Ala Glu Ala Gly Thr 645 650 655 Gly Gly Leu Glu Pro Leu Gly Gly Leu Glu Pro Leu Asn Pro Asn Leu 660 665 670 Ser Leu Ser Gly Ala Gly Pro Pro Val Leu Ser Leu Asp Leu Lys Pro 675 680 685 Trp Lys Cys Gln Glu Leu Asp Phe Leu Val Asp Pro Asp Asn Leu Phe 690 695 700 Leu Glu Glu Thr Pro Val Glu Asp Ile Phe Met Asp Leu Ser Thr Pro 705 710 715 720 Asp Pro Asn Gly Glu Trp Gly Ser Gly Asp Pro Glu Ala Glu Val Pro 725 730 735 Gly Gly Thr Leu Ser Pro Cys Asn Asn Leu Ser Pro Glu Asp His Ser 740 745 750 Phe Leu Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Glu Thr Ala Phe Glu Thr Gly Val 755 760 765 Ser Thr Phe Pro Tyr Glu Gly Phe Ala Asp Glu Leu His Gln Leu Gln 770 775 780 Ser Gln Val Gln Asp Ser Phe His Glu Asp Gly Ser Gly Gly Glu Pro 785 790 795 800 Thr Phe 802 <210> 3 <211> 802 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 3 Met Tyr Arg Ser Thr Lys Gly Ala Ser Lys Ala Arg Arg Asp Gln Ile 1 5 10 15 Asn Ala Glu Ile Arg Asn Leu Lys Glu Leu Leu Pro Leu Ala Glu Ala 20 25 30 Asp Lys Val Arg Leu Ser Tyr Leu His Ile Met Ser Leu Ala Cys Ile 35 40 45 Tyr Thr Arg Lys Gly Val Phe Phe Ala Gly Gly Thr Pro Leu Ala Gly 50 55 60 Pro Thr Gly Leu Leu Ser Ala Gln Glu Leu Glu Asp Ile Val Ala Ala 65 70 75 80 Leu Pro Gly Phe Leu Leu Val Phe Thr Ala Glu Gly Lys Leu Leu Tyr 85 90 95 Leu Ser Glu Ser Val Ser Glu His Leu Gly His Ser Met Val Asp Leu 100 105 110 Val Ala Gln Gly Asp Ser Ile Tyr Asp Ile Ile Asp Pro Ala Asp His 115 120 125 Leu Thr Val Arg Gln Gln Leu Thr Met Pro Ser Ala Leu Asp Ala Asp 130 135 140 Arg Leu Phe Arg Cys Arg Phe Asn Thr Ser Lys Ser Leu Arg Arg Gln 145 150 155 160 Ser Ala Gly Asn Lys Leu Val Leu Ile Arg Gly Arg Phe His Ala His 165 170 175 Pro Pro Gly Ala Tyr Trp Ala Gly Asn Pro Val Phe Thr Ala Phe Cys 180 185 190 Ala Pro Leu Glu Pro Arg Pro Arg Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly 195 200 205 Pro Gly Pro Ala Ser Leu Phe Leu Ala Met Phe Gln Ser Arg His Ala 210 215 220 Lys Asp Leu Ala Leu Leu Asp Ile Ser Glu Ser Val Leu Ile Tyr Leu 225 230 235 240 Gly Phe Glu Arg Ser Glu Leu Leu Cys Lys Ser Trp Tyr Gly Leu Leu 245 250 255 His Pro Glu Asp Leu Ala His Ala Ser Ser Gln His Tyr Arg Leu Leu 260 265 270 Ala Glu Asn Gly Asp Ile Gln Ala Glu Met Val Val Arg Leu Gln Ala 275 280 285 Lys His Gly Gly Trp Thr Trp Ile Tyr Cys Met Leu Tyr Ser Asp Gly 290 295 300 Pro Glu Gly Pro Ile Thr Ala Asn Asn Tyr Pro Ile Ser Asp Thr Glu 305 310 315 320 Ala Trp Ser Leu Arg Gln Gln Leu Asn Ser Glu Asn Thr Gln Ala Ala 325 330 335 Tyr Val Leu Gly Thr Pro Ala Val Leu Pro Ser Phe Ser Glu Asn Val 340 345 350 Phe Ser Gln Glu His Cys Ser Asn Pro Leu Phe Thr Pro Ala Leu Gly 355 360 365 Thr Pro Arg Ser Ala Ser Phe Pro Arg Ala Pro Glu Leu Gly Val Ile 370 375 380 Ser Thr Ser Glu Glu Leu Ala Gln Pro Ser Lys Glu Leu Asp Phe Ser 385 390 395 400 Tyr Leu Pro Phe Pro Ala Arg Pro Glu Pro Ser Leu Gln Ala Asp Leu 405 410 415 Ser Lys Asp Leu Val Cys Thr Pro Pro Tyr Thr Pro His Gln Pro Gly 420 425 430 Gly Cys Ala Phe Leu Phe Ser Leu His Glu Pro Phe Gln Thr His Leu 435 440 445 Pro Pro Pro Ser Ser Ser Leu Gln Glu Gln Leu Thr Pro Ser Thr Val 450 455 460 Thr Phe Ser Glu Gln Leu Thr Pro Ser Ser Ala Thr Phe Pro Asp Pro 465 470 475 480 Leu Thr Ser Ser Leu Gln Gly Gln Leu Thr Glu Ser Ser Ala Arg Ser 485 490 495 Phe Glu Glu Gln Leu Thr Pro Cys Thr Ser Thr Phe Pro Asp Gln Leu 500 505 510 Leu Pro Ser Thr Ala Thr Phe Pro Glu Pro Leu Gly Ser Pro Thr His 515 520 525 Glu Gln Leu Thr Pro Pro Ser Thr Ala Phe Gln Ala His Leu Asn Ser 530 535 540 Pro Ser Gln Thr Phe Pro Glu Gln Leu Ser Pro Asn Pro Thr Lys Thr 545 550 555 560 Tyr Phe Ala Gln Glu Gly Cys Ser Phe Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Pro 565 570 575 Ser Pro Ser Ser Pro Gly Asn Gly Asp Cys Thr Leu Leu Ala Leu Ala 580 585 590 Gln Leu Arg Gly Pro Leu Ser Val Asp Val Pro Leu Val Pro Glu Gly 595 600 605 Leu Leu Thr Pro Glu Ala Ser Pro Val Lys Gln Ser Phe Phe His Tyr 610 615 620 Thr Glu Lys Glu Gln Asn Glu Ile Asp Arg Leu Ile Gln Gln Ile Ser 625 630 635 640 Gln Leu Ala Gln Gly Met Asp Arg Pro Phe Ser Ala Glu Ala Gly Thr 645 650 655 Gly Gly Leu Glu Pro Leu Gly Gly Leu Glu Pro Leu Asn Pro Asn Leu 660 665 670 Ser Leu Ser Gly Ala Gly Pro Pro Val Leu Ser Leu Asp Leu Lys Pro 675 680 685 Trp Lys Cys Gln Glu Leu Asp Phe Leu Val Asp Pro Asp Asn Leu Phe 690 695 700 Leu Glu Glu Thr Pro Val Glu Asp Ile Phe Met Asp Leu Ser Thr Pro 705 710 715 720 Asp Pro Asn Gly Glu Trp Gly Ser Gly Asp Pro Glu Ala Glu Val Pro 725 730 735 Gly Gly Thr Leu Ser Pro Cys Asn Asn Leu Ser Pro Glu Asp His Ser 740 745 750 Phe Leu Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Glu Thr Ala Phe Glu Thr Gly Val 755 760 765 Ser Thr Phe Pro Tyr Glu Gly Phe Ala Asp Glu Leu His Gln Leu Gln 770 775 780 Ser Gln Val Gln Asp Ser Phe His Glu Asp Gly Ser Gly Gly Glu Pro 785 790 795 800 Thr Phe 802 <210> 4 <211> 3252 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (102)...(2510) <400> 4 tgagcgagag acggggaagc acggaggagg aagccgccgg tgcgtcggga cgggagcgca 60 ggtgctcggg cacccgagct ggagctccgc agccgccggt c atg tac cgc tcc acc 116 Met Tyr Arg Ser Thr 1 5 aag ggc gcc tcc aag gcg cgc cgg gac cag atc aac gcc gag atc cgg 164 Lys Gly Ala Ser Lys Ala Arg Arg Asp Gln Ile Asn Ala Glu Ile Arg 10 15 20 aac ctc aag gag ctg ctg ccg ctg gcc gaa gcg gac aag gtc cgg ctg 212 Asn Leu Lys Glu Leu Leu Pro Leu Ala Glu Ala Asp Lys Val Arg Leu 25 30 35 tcc tac ctg cac atc atg agc ctc gcc tgc atc tac act cgc aag ggc 260 Ser Tyr Leu His Ile Met Ser Leu Ala Cys Ile Tyr Thr Arg Lys Gly 40 45 50 gtc ttc ttc gct ggt ggc act cct ctg gcg ggc ccc acg ggg ctt ctc 308 Val Phe Phe Ala Gly Gly Thr Pro Leu Ala Gly Pro Thr Gly Leu Leu 55 60 65 tca gct caa gag ctt gag gac atc gta gcg gca cta ccc ggc ttt ctg 356 Ser Ala Gln Glu Leu Glu Asp Ile Val Ala Ala Leu Pro Gly Phe Leu 70 75 80 85 ctt gtg ttc aca gcc gag ggg aaa ttg ctc tac ctg tct gag agt gtg 404 Leu Val Phe Thr Ala Glu Gly Lys Leu Leu Tyr Leu Ser Glu Ser Val 90 95 100 agc gag cat ctg ggc cac tcc atg gtg gac ctg gtt gcc cag ggt gac 452 Ser Glu His Leu Gly His Ser Met Val Asp Leu Val Ala Gln Gly Asp 105 110 115 agc atc tac gac atc att gac cca gct gac cac ctc act gtg cgc cag 500 Ser Ile Tyr Asp Ile Ile Asp Pro Ala Asp His Leu Thr Val Arg Gln 120 125 130 caa ctc acc ctg ccc tct gcc ctg gac act gat cgc ctc ttc cgc tgc 548 Gln Leu Thr Leu Pro Ser Ala Leu Asp Thr Asp Arg Leu Phe Arg Cys 135 140 145 cgc ttc aac acc tcc aag tcc ctc agg cgc cag agt gca ggc aac aaa 596 Arg Phe Asn Thr Ser Lys Ser Leu Arg Arg Gln Ser Ala Gly Asn Lys 150 155 160 165 ctc gtg ctt att cga ggc cga ttc cat gct cac cca cct gga gcc tac 644 Leu Val Leu Ile Arg Gly Arg Phe His Ala His Pro Pro Gly Ala Tyr 170 175 180 tgg gca gga aat ccc gtg ttc aca gct ttc tgt gcc cct ctg gag ccg 692 Trp Ala Gly Asn Pro Val Phe Thr Ala Phe Cys Ala Pro Leu Glu Pro 185 190 195 aga ccc cgc cca ggt cct ggc cct ggc cct ggc cct gcc tcg ctc ttc 740 Arg Pro Arg Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Ala Ser Leu Phe 200 205 210 ctg gcc atg ttc cag agc cgc cat gct aaa gac ctg gct cta ctg gac 788 Leu Ala Met Phe Gln Ser Arg His Ala Lys Asp Leu Ala Leu Leu Asp 215 220 225 atc tcc gag agt gtc cta atc tac ctg ggc ttt gag cgc agt gaa ctg 836 Ile Ser Glu Ser Val Leu Ile Tyr Leu Gly Phe Glu Arg Ser Glu Leu 230 235 240 245 ctt tgt aaa tca tgg tat gga ctg ctg cac ccc gag gac ctg gcc cac 884 Leu Cys Lys Ser Trp Tyr Gly Leu Leu His Pro Glu Asp Leu Ala His 250 255 260 gct tct gct caa cac tac cgc ctg ttg gct gag agt gga gat att cag 932 Ala Ser Ala Gln His Tyr Arg Leu Leu Ala Glu Ser Gly Asp Ile Gln 265 270 275 gca gag atg gtg gtg agg cta cag gcc aag act gga ggc tgg gca tgg 980 Ala Glu Met Val Val Arg Leu Gln Ala Lys Thr Gly Gly Trp Ala Trp 280 285 290 att tac tgc ctg tta tac tca gaa ggt cca gag gga ccc att act gcc 1028 Ile Tyr Cys Leu Leu Tyr Ser Glu Gly Pro Glu Gly Pro Ile Thr Ala 295 300 305 aat aac tac cca atc agt gac atg gaa gcc tgg agc ctc cgc cag cag 1076 Asn Asn Tyr Pro Ile Ser Asp Met Glu Ala Trp Ser Leu Arg Gln Gln 310 315 320 325 ttg aac tct gaa gac acc cag gca gct tat gtc ctg ggc act ccg acc 1124 Leu Asn Ser Glu Asp Thr Gln Ala Ala Tyr Val Leu Gly Thr Pro Thr 330 335 340 atg ctg ccc tca ttc cct gaa aac att ctt tcc cag gaa gag tgc tcc 1172 Met Leu Pro Ser Phe Pro Glu Asn Ile Leu Ser Gln Glu Glu Cys Ser 345 350 355 agc act aac cca ctc ttc acc gca gca ctg ggg gct ccc aga agc acc 1220 Ser Thr Asn Pro Leu Phe Thr Ala Ala Leu Gly Ala Pro Arg Ser Thr 360 365 370 agc ttc ccc agt gct cct gaa ctg agt gtt gtc tct gca tca gaa gag 1268 Ser Phe Pro Ser Ala Pro Glu Leu Ser Val Val Ser Ala Ser Glu Glu 375 380 385 ctt ccc cga ccc tcc aaa gaa ctg gac ttc agt tac ctg aca ttc cct 1316 Leu Pro Arg Pro Ser Lys Glu Leu Asp Phe Ser Tyr Leu Thr Phe Pro 390 395 400 405 tct ggg cct gag cct tct ctc caa gca gaa cta agc aag gat ctt gtg 1364 Ser Gly Pro Glu Pro Ser Leu Gln Ala Glu Leu Ser Lys Asp Leu Val 410 415 420 tgc act cca cct tac acg ccc cat cag cca gga ggc tgt gcc ttc ctc 1412 Cys Thr Pro Pro Tyr Thr Pro His Gln Pro Gly Gly Cys Ala Phe Leu 425 430 435 ttc agc ctc cat gag ccc ttc cag acc cat ttg ccc acc cca tcc agc 1460 Phe Ser Leu His Glu Pro Phe Gln Thr His Leu Pro Thr Pro Ser Ser 440 445 450 act ctt caa gaa cag ctg act cca agc act gcg acc ttc tct gat cag 1508 Thr Leu Gln Glu Gln Leu Thr Pro Ser Thr Ala Thr Phe Ser Asp Gln 455 460 465 ttg acg ccc agc agt gca acc ttc cca gat cca cta act agc cca ctg 1556 Leu Thr Pro Ser Ser Ala Thr Phe Pro Asp Pro Leu Thr Ser Pro Leu 470 475 480 485 caa ggc cag ttg act gaa acc tcg gtc aga agc tat gaa gac cag ttg 1604 Gln Gly Gln Leu Thr Glu Thr Ser Val Arg Ser Tyr Glu Asp Gln Leu 490 495 500 act ccc tgc acc tcc acc ttc cca gac cag ctg ctt ccc agc aca gcc 1652 Thr Pro Cys Thr Ser Thr Phe Pro Asp Gln Leu Leu Pro Ser Thr Ala 505 510 515 acc ttc cca gag cct ctg ggc agc cct gcc cat gaa cag ctg act cct 1700 Thr Phe Pro Glu Pro Leu Gly Ser Pro Ala His Glu Gln Leu Thr Pro 520 525 530 ccc agc aca gca ttc caa gca cac ctg gac agc ccc agc caa acc ttc 1748 Pro Ser Thr Ala Phe Gln Ala His Leu Asp Ser Pro Ser Gln Thr Phe 535 540 545 cca gag caa ctg agc ccc aac cct acc aag act tac ttt gcc cag gag 1796 Pro Glu Gln Leu Ser Pro Asn Pro Thr Lys Thr Tyr Phe Ala Gln Glu 550 555 560 565 gga tgc agt ttt ctc tat gag aag ttg ccc cca agt cct agc agc cct 1844 Gly Cys Ser Phe Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Pro Ser Pro Ser Ser Pro 570 575 580 ggt aat ggg gac tgc acg ctc ttg gcc cta gcc cag ctc cgg ggc ccc 1892 Gly Asn Gly Asp Cys Thr Leu Leu Ala Leu Ala Gln Leu Arg Gly Pro 585 590 595 ctc tct gtg gat gtc ccc ctg gtg ccc gaa ggc ctg ctc aca cct gag 1940 Leu Ser Val Asp Val Pro Leu Val Pro Glu Gly Leu Leu Thr Pro Glu 600 605 610 gcc tct cca gtc aag cag agt ttc ttc cac tac tct gaa aag gag cag 1988 Ala Ser Pro Val Lys Gln Ser Phe Phe His Tyr Ser Glu Lys Glu Gln 615 620 625 aat gag ata gac cgt ctc atc cag cag att agc caa ttg gct cag ggc 2036 Asn Glu Ile Asp Arg Leu Ile Gln Gln Ile Ser Gln Leu Ala Gln Gly 630 635 640 645 atg gac aga ccc ttc tca gct gag gct ggc act ggc gga cta gag cca 2084 Met Asp Arg Pro Phe Ser Ala Glu Ala Gly Thr Gly Gly Leu Glu Pro 650 655 660 ctt gga gga ctg gag ccc ctg gac tcc aac ctg tcc ctg tca ggg gca 2132 Leu Gly Gly Leu Glu Pro Leu Asp Ser Asn Leu Ser Leu Ser Gly Ala 665 670 675 ggc ccc cct gtg ctc agc ctg gac ctg aaa ccc tgg aaa tgc cag gag 2180 Gly Pro Pro Val Leu Ser Leu Asp Leu Lys Pro Trp Lys Cys Gln Glu 680 685 690 ctg gac ttc ctg gct gac cct gat aac atg ttc ctg gaa gag acg ccc 2228 Leu Asp Phe Leu Ala Asp Pro Asp Asn Met Phe Leu Glu Glu Thr Pro 695 700 705 gtg gaa gac atc ttc atg gat ctc tct acc cca gat ccc agt gag gaa 2276 Val Glu Asp Ile Phe Met Asp Leu Ser Thr Pro Asp Pro Ser Glu Glu 710 715 720 725 tgg ggc tca ggg gat cct gag gca gag ggc cca gga ggg gcc cca tcg 2324 Trp Gly Ser Gly Asp Pro Glu Ala Glu Gly Pro Gly Gly Ala Pro Ser 730 735 740 cct tgc aac aac ctg tcc cca gaa gac cac agc ttc ctg gag gac ctg 2372 Pro Cys Asn Asn Leu Ser Pro Glu Asp His Ser Phe Leu Glu Asp Leu 745 750 755 gcc aca tat gaa acc gcc ttt gag aca ggt gtc tca gca ttc ccc tat 2420 Ala Thr Tyr Glu Thr Ala Phe Glu Thr Gly Val Ser Ala Phe Pro Tyr 760 765 770 gat ggg ttt act gat gag ttg cat caa ctc cag agc caa gtt caa gac 2468 Asp Gly Phe Thr Asp Glu Leu His Gln Leu Gln Ser Gln Val Gln Asp 775 780 785 agc ttc cat gaa gat gga agt gga ggg gaa cca acg ttt tga ataagtctg 2519 Ser Phe His Glu Asp Gly Ser Gly Gly Glu Pro Thr Phe 790 795 800 tgacttaacg tcgtcaagta tggcatattg tcatcaagac gtggagccgc tctccacccc 2579 cccgggactg ttggggggat tctgagggcc agagggggat atatatgatt ccccaggccc 2639 tgcaggattt tggggggggg gaggtgggag ggcaagggag gggagcttct ttttaaaatc 2699 aagagacttc gagcgatccc agtttccatt tcaatctgta ttcactcgta gtgagtttcc 2759 ttgaatggga tttcaagcgg agaatggggg agtctcactt ccccgccgcc ttgccccatt 2819 ggcctgggcc agttctccac tcctaggggc caagccaccc ctagccttgg tgggggaaag 2879 gcagggccca cccgggccag cccgtgccct gaggggctct tgacacccac gtagaattct 2939 ctacacacca gtaacgggat ttcaattccg atggactctg ccgccctggc ggcccttcct 2999 gtgacttttg cgccccgcgc ctggggtggg gggtgcgaaa aaacgctacg ttcctttccg 3059 atggaggaag gcagacctgc cgtcacacgt gtgcttgcac gagtgcgtgt acctggtgcg 3119 ggactcaccc ggccgccaga ctgcctgggc ctgcccaaat ggccacctcg gtggtgctgc 3179 ggtgactttg tagccaactt tataataaag tccagtttgc ctttttggta aaaaaaaaaa 3239 aaaaaaaaaa aaa <210> 5 <211> 3087 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (51)...(2459) <400> 5 aggatcgcag gtgctcggga gccggagctg gagctccaca gccggcagtc atg tac 56 Met Tyr 1 cga tcc acc aag ggc gcc tcc aag gcg cgc cgc gac cag atc aac gcc 104 Arg Ser Thr Lys Gly Ala Ser Lys Ala Arg Arg Asp Gln Ile Asn Ala 5 10 15 gag att cgg aac ctc aag gag ctg ctg ccg ttg gct gaa gcg gac aag 152 Glu Ile Arg Asn Leu Lys Glu Leu Leu Pro Leu Ala Glu Ala Asp Lys 20 25 30 gtc cgg ctg tcc tac ctg cac atc atg agt ctt gcc tgc atc tac act 200 Val Arg Leu Ser Tyr Leu His Ile Met Ser Leu Ala Cys Ile Tyr Thr 35 40 45 50 cgc aag ggt gtc ttc ttt gct gga ggc act cct ttg gct ggc ccc acc 248 Arg Lys Gly Val Phe Phe Ala Gly Gly Thr Pro Leu Ala Gly Pro Thr 55 60 65 ggg ctt ctc tct gct caa gag ctt gaa gac att gtg gca gca cta cct 296 Gly Leu Leu Ser Ala Gln Glu Leu Glu Asp Ile Val Ala Ala Leu Pro 70 75 80 gga ttt ctc ctt gta ttc aca gct gag ggg aag ttg cta tac ctg tcg 344 Gly Phe Leu Leu Val Phe Thr Ala Glu Gly Lys Leu Leu Tyr Leu Ser 85 90 95 gag agt gtg agc gag cat ctg ggc cac tct atg gtg gac ctg gtt gcc 392 Glu Ser Val Ser Glu His Leu Gly His Ser Met Val Asp Leu Val Ala 100 105 110 cag ggc gac agt atc tac gat atc att gac cct gct gac cat ctc act 440 Gln Gly Asp Ser Ile Tyr Asp Ile Ile Asp Pro Ala Asp His Leu Thr 115 120 125 130 gtg cgc cag cag ctc acc atg ccc tct gct ctg gat gct gat cgc ctt 488 Val Arg Gln Gln Leu Thr Met Pro Ser Ala Leu Asp Ala Asp Arg Leu 135 140 145 ttc cgt tgt cga ttc aac acc tcc aag tcc ctc cgg cgc cag agt tca 536 Phe Arg Cys Arg Phe Asn Thr Ser Lys Ser Leu Arg Arg Gln Ser Ser 150 155 160 gga aac aaa ctg gtg ctt att cga ggt cga ttc cat gct cac cca cct 584 Gly Asn Lys Leu Val Leu Ile Arg Gly Arg Phe His Ala His Pro Pro 165 170 175 ggg gcc tac tgg gca gga aac cct gtg ttc acc gct ttc tgc gcc cca 632 Gly Ala Tyr Trp Ala Gly Asn Pro Val Phe Thr Ala Phe Cys Ala Pro 180 185 190 ctg gag cca aga ccc cgc cct ggc ccc ggc cct ggc cct ggc cct ggt 680 Leu Glu Pro Arg Pro Arg Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly 195 200 205 210 cct gct tct ctc ttc ctg gcc atg ttc cag agc cgg cat gct aag gac 728 Pro Ala Ser Leu Phe Leu Ala Met Phe Gln Ser Arg His Ala Lys Asp 215 220 225 cta gcc cta ctg gac gtt tct gaa agt gtc cta atc tac ctg ggc ttt 776 Leu Ala Leu Leu Asp Val Ser Glu Ser Val Leu Ile Tyr Leu Gly Phe 230 235 240 gag cgc agc gaa ctg ctc tgt aaa tca tgg tat gga ctg cta cac ccc 824 Glu Arg Ser Glu Leu Leu Cys Lys Ser Trp Tyr Gly Leu Leu His Pro 245 250 255 gag gac ctg gcc caa gct tct tct caa cac tac cgc ctg ttg gct gaa 872 Glu Asp Leu Ala Gln Ala Ser Ser Gln His Tyr Arg Leu Leu Ala Glu 260 265 270 agt gga gat att cag gct gaa atg gtg gtg aga ctt caa gcc aag cat 920 Ser Gly Asp Ile Gln Ala Glu Met Val Val Arg Leu Gln Ala Lys His 275 280 285 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Ser Phe Pro Asp Gln Leu Leu Pro 500 505 510 agc act gcc aca ttc cca gag cct ctg ggc agc ccc gcc cat gag cag 1640 Ser Thr Ala Thr Phe Pro Glu Pro Leu Gly Ser Pro Ala His Glu Gln 515 520 525 530 ctg act cct ccc agc aca gca ttc cag gct cat ctg aac agc ccc agc 1688 Leu Thr Pro Pro Ser Thr Ala Phe Gln Ala His Leu Asn Ser Pro Ser 535 540 545 caa acc ttc cca gag caa ctg agc ccc aat cct acc aag act tac ttc 1736 Gln Thr Phe Pro Glu Gln Leu Ser Pro Asn Pro Thr Lys Thr Tyr Phe 550 555 560 gcc cag gag gga tgc agt ttt ctc tat gag aag ttg ccc cca agt cct 1784 Ala Gln Glu Gly Cys Ser Phe Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Pro Ser Pro 565 570 575 agc agc cct ggt aat ggg gac tgt aca ctc ctg gcc cta gct cag ctc 1832 Ser Ser Pro Gly Asn Gly Asp Cys Thr Leu Leu Ala Leu Ala Gln Leu 580 585 590 cgg ggc ccc ctc tct gtg gat gtc ccc ctg gtg ccc gaa ggc ctg ctc 1880 Arg Gly Pro Leu Ser Val Asp Val Pro Leu Val Pro Glu Gly Leu Leu 595 600 605 610 aca cct gag gcc tct cca gtc aag caa agt ttc ttc cac tac aca gag 1928 Thr Pro Glu Ala Ser Pro Val Lys Gln Ser Phe Phe His Tyr Thr Glu 615 620 625 aaa gag caa aat gag ata gat cgt ctc att cag cag atc agc cag ttg 1976 Lys Glu Gln Asn Glu Ile Asp Arg Leu Ile Gln Gln Ile Ser Gln Leu 630 635 640 gct cag ggc gtg gac agg ccc ttc tca gct gag gct ggc act ggg ggg 2024 Ala Gln Gly Val Asp Arg Pro Phe Ser Ala Glu Ala Gly Thr Gly Gly 645 650 655 ctg gag cca ctt gga ggg ctg gag ccc ctg aac cct aac ctg tcc ctg 2072 Leu Glu Pro Leu Gly Gly Leu Glu Pro Leu Asn Pro Asn Leu Ser Leu 660 665 670 tca ggg gct gga ccc cct gtg ctt agc ctg gat ctt aaa ccc tgg aaa 2120 Ser Gly Ala Gly Pro Pro Val Leu Ser Leu Asp Leu Lys Pro Trp Lys 675 680 685 690 tgc cag gag ctg gac ttc ctg gtt gac cct gat aat tta ttc ctg gaa 2168 Cys Gln Glu Leu Asp Phe Leu Val Asp Pro Asp Asn Leu Phe Leu Glu 695 700 705 gag acg cca gtg gaa gac atc ttc atg gat ctt tct act cca gac ccc 2216 Glu Thr Pro Val Glu Asp Ile Phe Met Asp Leu Ser Thr Pro Asp Pro 710 715 720 aat ggg gaa tgg ggt tca ggg gat cct gag gca gag gtc cca 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tctcacttcc tcaccgcgct 2755 gccccatggg cctgggccag ttctccactc ctaggggcaa agccacccct gggctttggt 2815 gggggaaagg catggcccac ctggggctag cctgtgcccc gaggggctct tgacacccac 2875 gtagaattct ctacaaacca gtaacgggat ttcaattccg acggactctg ccgccctggc 2935 ggctcttcct gtgacttttg cgccccgcgc ctggggtggg gggcgcgaag agacgctaca 2995 ttcctttccg atggaggaag gcagatctgc cgtcacacgt gtgcttgcac gagtgcgtgt 3055 acctggtgcg ggactcaccc ggccgccaga cc 3087 <210> 6 <211> 2459 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (35)...(2443) <400> 6 gggagccgga gctggagctc cacggccggc agtc atg tac cga tcc acc aag ggc 55 Met Tyr Arg Ser Thr Lys Gly 1 5 gcc tcc aag gcg cgc cgc gac cag atc aac gcc gag att cgg aac ctc 103 Ala Ser Lys Ala Arg Arg Asp Gln Ile Asn Ala Glu Ile Arg Asn Leu 10 15 20 aag gaa ctg ctg ccg ttg gct gaa gcg gac aag gtc cgg ctg tcc tac 151 Lys Glu Leu Leu Pro Leu Ala Glu Ala Asp Lys Val Arg Leu Ser Tyr 25 30 35 ctg cac atc atg agt ctt gcc tgc atc tac act cgc aag ggt gtc ttc 199 Leu His Ile Met Ser Leu Ala 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Gln His Tyr Arg Leu Leu Ala Glu Asn Gly Asp Ile Gln 265 270 275 gct gaa atg gtg gtg aga ctt caa gcc aag cat gga ggc tgg aca tgg 919 Ala Glu Met Val Val Arg Leu Gln Ala Lys His Gly Gly Trp Thr Trp 280 285 290 295 att tac tgc atg cta tac tcg gat ggt cca gaa ggc cct att act gcc 967 Ile Tyr Cys Met Leu Tyr Ser Asp Gly Pro Glu Gly Pro Ile Thr Ala 300 305 310 aat aac tac cct atc agt gac acg gaa gcc tgg agt ctt cgc cag cag 1015 Asn Asn Tyr Pro Ile Ser Asp Thr Glu Ala Trp Ser Leu Arg Gln Gln 315 320 325 cta aac tct gaa aac acc cag gca gcc tat gtc cta gga acc cca gct 1063 Leu Asn Ser Glu Asn Thr Gln Ala Ala Tyr Val Leu Gly Thr Pro Ala 330 335 340 gtg cta ccc tca ttc tct gag aat gtc ttc tcc cag gag cac tgc tct 1111 Val Leu Pro Ser Phe Ser Glu Asn Val Phe Ser Gln Glu His Cys Ser 345 350 355 aat cca ctc ttt aca cca gcc ctg ggg act cct aga agt gcc agc ttc 1159 Asn Pro Leu Phe Thr Pro Ala Leu Gly Thr Pro Arg Ser Ala Ser Phe 360 365 370 375 ccc agg gcc cct gaa cta ggt gtg atc tca aca tca gaa gag ctt gcc 1207 Pro Arg Ala Pro Glu Leu Gly Val Ile Ser Thr Ser Glu Glu Leu Ala 380 385 390 caa ccc tcc aaa gaa ctg gac ttc agt tac ctg cca ttc cct gca agg 1255 Gln Pro Ser Lys Glu Leu Asp Phe Ser Tyr Leu Pro Phe Pro Ala Arg 395 400 405 cct gag cct tcc ctc caa gca gac ttg agc aag gat ttg gtg tgt act 1303 Pro Glu Pro Ser Leu Gln Ala Asp Leu Ser Lys Asp Leu Val Cys Thr 410 415 420 cca cct tac aca ccc cac cag cca gga ggc tgc gcc ttc ctc ttc agc 1351 Pro Pro Tyr Thr Pro His Gln Pro Gly Gly Cys Ala Phe Leu Phe Ser 425 430 435 ctc cat gaa ccc ttc cag act cac ttg ccc cct cca tcc agc tct ctc 1399 Leu His Glu Pro Phe Gln Thr His Leu Pro Pro Pro Ser Ser Ser Leu 440 445 450 455 caa gaa cag ctg acg cca agc acg gtg act ttc tct gaa cag ttg aca 1447 Gln Glu Gln Leu Thr Pro Ser Thr Val Thr Phe Ser Glu Gln Leu Thr 460 465 470 cca agc agt gca acc ttc cca gat cca cta acc agt tca cta caa gga 1495 Pro Ser Ser Ala Thr Phe Pro Asp Pro Leu Thr Ser Ser Leu Gln Gly 475 480 485 cag ttg act gaa agc tca gcc aga agc ttt gaa gaa caa ttg act ccg 1543 Gln Leu Thr Glu Ser Ser Ala Arg Ser Phe Glu Glu Gln Leu Thr Pro 490 495 500 tgc acc tct acc ttc cct gac cag ctg ctt ccc agc act gcc acg ttc 1591 Cys Thr Ser Thr Phe Pro Asp Gln Leu Leu Pro Ser Thr Ala Thr Phe 505 510 515 cca gaa cct ctg ggt agc ccc acc cat gag cag ctg act cct ccc agc 1639 Pro Glu Pro Leu Gly Ser Pro Thr His Glu Gln Leu Thr Pro Pro Ser 520 525 530 535 aca gca ttc caa gca cat ctg aac agt cct agc caa acc ttc cca gag 1687 Thr Ala Phe Gln Ala His Leu Asn Ser Pro Ser Gln Thr Phe Pro Glu 540 545 550 caa ctg agc cct aat cct acc aag act tac ttc gcc cag gag gga tgc 1735 Gln Leu Ser Pro Asn Pro Thr Lys Thr Tyr Phe Ala Gln Glu Gly Cys 555 560 565 agt ttt ctc tat gag aag ttg ccc cca agt cct agc agc cct ggt aat 1783 Ser Phe Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Pro Ser Pro Ser Ser Pro Gly Asn 570 575 580 ggg gac tgt aca ctc ttg gcc cta gct caa ctc cgg ggt ccc ctc tct 1831 Gly Asp Cys Thr Leu Leu Ala Leu Ala Gln Leu Arg Gly Pro Leu Ser 585 590 595 gtg gac gtc ccc ctg gtg cct gaa ggc ctg ctc aca cct gag gcc tct 1879 Val Asp Val Pro Leu Val Pro Glu Gly Leu Leu Thr Pro Glu Ala Ser 600 605 610 615 cca gtc aag caa agt ttc ttc cac tat aca gag aaa gag cag aat gag 1927 Pro Val Lys Gln Ser Phe Phe His Tyr Thr Glu Lys Glu Gln Asn Glu 620 625 630 ata gat cgt ctc atc cag cag atc agc cag ttg gct cag ggc atg gac 1975 Ile Asp Arg Leu Ile Gln Gln Ile Ser Gln Leu Ala Gln Gly Met Asp 635 640 645 agg ccc ttc tca gct gag gct ggc act ggg ggg ctg gag cca ctt gga 2023 Arg Pro Phe Ser Ala Glu Ala Gly Thr Gly Gly Leu Glu Pro Leu Gly 650 655 660 ggg ctg gag ccc ctg aac ccc aac ctg tcc ctg tca ggg gct gga ccc 2071 Gly Leu Glu Pro Leu Asn Pro Asn Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly Pro 665 670 675 cct gtg ctt agc ctg gat ctt aaa ccc tgg aaa tgc cag gag ctg gac 2119 Pro Val Leu Ser Leu Asp Leu Lys Pro Trp Lys Cys Gln Glu Leu Asp 680 685 690 695 ttc ttg gtt gac cct gat aat tta ttc ctg gaa gag acg cca gtg gaa 2167 Phe Leu Val Asp Pro Asp Asn Leu Phe Leu Glu Glu Thr Pro Val Glu 700 705 710 gac atc ttc atg gat ctt tct act cca gac ccc aat ggg gaa tgg ggt 2215 Asp Ile Phe Met Asp Leu Ser Thr Pro Asp Pro Asn Gly Glu Trp Gly 715 720 725 tca ggg gat cct gag gca gag gtc cca gga ggg acc ctg tca cct tgc 2263 Ser Gly Asp Pro Glu Ala Glu Val Pro Gly Gly Thr Leu Ser Pro Cys 730 735 740 aac aac ctg tcc cca gaa gat cac agc ttc ctg gag gac ttg gcc acc 2311 Asn Asn Leu Ser Pro Glu Asp His Ser Phe Leu Glu Asp Leu Ala Thr 745 750 755 tat gaa acc gcc ttt gag aca ggt gtc tca aca ttc ccc tat gaa ggg 2359 Tyr Glu Thr Ala Phe Glu Thr Gly Val Ser Thr Phe Pro Tyr Glu Gly 760 765 770 775 ttt gct gat gag ttg cat caa ctc cag agc caa gtt caa gac agc ttc 2407 Phe Ala Asp Glu Leu His Gln Leu Gln Ser Gln Val Gln Asp Ser Phe 780 785 790 cat gaa gat gga agt gga ggg gaa cca acg ttt tga ataagtctgt gactta 2459 His Glu Asp Gly Ser Gly Gly Glu Pro Thr Phe 795 800 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 7 aagcacggag gaggaagccg ccggtgcgtc gggac 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 8 acgggagcgc aggtgctcgg gcacccgagc tggag 35 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 9 ggagagcggc tccacgtctt gatgacaata tgcca 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 10 ccacgtcttg atgacaatat gccatacttg acgac 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 11 gcctggcagg agctatataa ggcggcgtga ggcag 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 12 ccaggagagc agagagcgag cctgagcgag agacg 35 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 13 gtagaaagtc ccgaatctcc cgagtcccga atctc 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 14 gaatctcccg agtcccgaat ctccccagct cgcca 35 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 15 atggagatac agcaacaggt tccctggcca agagc 35 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 16 aagagctgcg ggcacgggtt caacaggtgt ttgca 35 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 17 tcgtagatgc tgtcaccctg ggcaaccagg tccac 35 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 18 cctggaggga ggaaaagaag agatgaccat tagg 34 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 19 atctgggcca ctccatggtg agtgctaagg gtcct 35 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 20 ttcagctgag gctgggcatg gagtgggtgc cgtga 35 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 21 cgcctgaggg acttggaggt gttgaagcgg cagcg 35 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 22 cctgcactct ggcgcctgag ggacttggag gtgtt 35 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 23 ccttctccct tcctcggtcc aatttcccac ctgct 35 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 24 tcggtccaat ttcccacctg ctgcccttct cccca 35 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 25 tgggaaggtg gaaagggtga ggtcagcttt ctgtt 35 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 26 ttccttgctt gatacccatg catctcactc cctcc 35 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 27 gagaaaggca ggccagagat gaagggaccc tagat 35 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 28 accctagatt ctggagtcag gggcagggag gatg 34 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 29 cagctctcta ccttgacctc accactcaga gtcc 34 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 30 cgaaactgtt ggcctctgtt atctccccag catca 35 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 31 agtggttcag gtgagggtag tcagaagaga ggatg 35 <210> 32 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 32 gagggtagtc agaagagagg atgtcacggc tatct 35 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 33 agaagaggca gctggtaagg gtccgacgtc catat 35 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 34 tccgacgtcc atatccagag cagttccctg atttg 35 <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 35 aaatcaggga actgctctgg atatggacgt cggac 35 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 36 ctgccaataa ctacccaatc aggtaagcca caagc 35 <210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 37 gcctaaatct acccagcatt tcattggcag gacag 35 <210> 38 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 38 ctacccagca tttcattggc aggacaggga cttga 35 <210> 39 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 39 acagccacag tttcactccg tccatccaaa ttgcc 35 <210> 40 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 40 ttgcccccta atctactgag cctctggcca tcatt 35 <210> 41 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 41 cagattgaaa tggaaactgg gatcgctcga agtct 35 <210> 42 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 42 aaatggaaac tgggatcgct cgaagtctct tgatt 35 <210> 43 <211> 1386 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 ggacagaaaa agaaacgaag gtggaaagtg gagagctgaa ggtggagagg cagagccagg 60 agccttagag gcgcaaatgt ggagaggggt ggagggaacc tggcaaaaat acagggtccc 120 tggtaggtgc aggggtcatg gagggtccgg cgctgcccct tcgcttctca gctgctcccc 180 catcttgccc gcctaggcag ggcggggagc ctccggagcg gtgcggaggc agccaggccc 240 cgcccgccgc agccgcgcag ccgccggagg attcctgtcc taatatggag ctgggattcc 300 cccggccccg ccccgccccc cggcccgcgg ggagacagag gctggcagca gggcgggggg 360 aagcgctcgc ttgggggccg gcaacggggg gaagggatgc ctaagtgcag acccaggtcc 420 tcgccgtgcc cccacgtccc tgcctcagtt tccccttcag taaggttaat tagctgagag 480 ggaaaccacg aatcactgca gactacagcg ctgatgttgg tttctattct tggctgtggg 540 aaaacaggat caacgccaaa ttcagctggt ccctttccca ccggactccc tttccaccca 600 tcctcgggac ttagaccccc atgaacaccc cctgataagc cgccaaggcc cgatttggga 660 agcgggggcg ggaatttgtt ctctaaaaat ggccaaggga atcccaggtt aaatagtccc 720 cagagaggaa ccccagcagt gacctgtccc acggaggcca aggaaagtcc tccttccctg 780 catgtgaacg tgaccttgtc tgtcaagtaa cgagggggat ttgtagacaa ccctgttctt 840 ccccattccc tcaactcctc agaaaaatta gtgtcagtgc cggcccctct ctgccctctg 900 cggactcctg ccgcgggctt caggccgccc taaacctggc cctgtcgctt ccctcaactg 960 aacgcattca gacgccaggg tccccacact ccattcaagc tttcctaacg cagcgccttc 1020 ctctccgctc agctcccgcc aggcttggcc ccctccgcag cctcctgctc ccccctcgcc 1080 cgcctccctc cctctctcat tctacgtcat gagatgacgt cggaagccgg gcgggaggag 1140 gagcccccct ccccagtcag cggtcacgct gcagcttgct tagcccagcc tcccgctctc 1200 gcgccccccc ggctctaaaa cgagcccccc acgcctggca ggagctatat aaggcggcgt 1260 gaggcaggcg aggggggcag cgcagccgag cggagcccag gagagcagag agcgagcctg 1320 agcgagagac ggggaagcac ggaggaggaa cgcgccggtg cgtcgcgacg ggagcgcagg 1380 tgtcga 1386 <210> 44 <211> 764 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 gtgagcatgc tggggctacc gcagatccga gctgccaggc gccggagacc ctggagctga 60 gggaacccgc tggggctgtc gcatgtctag ggcagcgtgc tggcgagctg gggagattcg 120 ggactcggga gattcgggac tttctacttt tcctcctgag ctccctccag acctcacctt 180 agttctgaat gagagttaga gagcctggac ggtgtcccta acaccagatt atgagaggat 240 aagagccagg acagagcggc ctcggtgccc gccagtgcag aagcgctccg ggagccgggg 300 agggaagccc gggaagttgc agggatggag ctgcctgagc ctaggggaac atagctactg 360 tccgcggtgc tgaaagggat ctcctgtcgc cttcggggcg ctgcccatgg tgctgacggc 420 tgcgggnccg tgtatggctc tgtccatggt tctgaaccca cagtcggctt cggagctctg 480 tccgcggttc tgaaattcag agccgctttg gagctctgtc cgcggttctg aaattaagag 540 ccgagaggag ccgaccccgc tttagaagtc gagggcttgt gggctatgga gatacagcaa 600 caggttccct ggccaagagc tgcgggcacg ggttcaacag gtgtttgcag aggcaggtcc 660 atgagaaatt cctctggatt ctctgaaact cagaccatgc cttcctcact tcttctctgc 720 ctcccagtct tactcctgac gcactacgtc ttctcgccct acag 764 <210> 45 <211> 179 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 gtgagtgcta agggtccttt cagctgaggc tgggcatgga gtgggtgccg tgagccttcc 60 actcctgagg aactgggaat tactatggag ggagaggtta taccctacaa gatactgtag 120 atcaaagatt ggctcctgct gttctcccta atggtcatct cttcttttcc tccctccag 179 <210> 46 <211> 120 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 gtaaggactc ccttctccct tcctcggtcc aatttcccac ctgctgccct tctccccacc 60 atccactgtc tctctctcag ccactcaccc tcttatctgt ttttctcttc atctatctag 120 <210> 47 <211> 181 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 gtaagcctgg agtgttcaga ttccaagaga aaggcaggcc agagatgaag ggaccctaga 60 ttctggagtc aggggcaggg aggatggggt ttaggggggc agaggatctg ggagggagtg 120 agatgcatgg gtatcaagca aggaaaacag aaagctgacc tcaccctttc caccttccca 180 g 181 <210> 48 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 gtgagtgtcc agagaggctg gggacaagat 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tacacaccag taacgggatt tcaattccga tggactctgc cgcctggcgg 480 cccttcctgt gacttttgcg ccccgcgcct ggggtggggg gtgcgaagag acgctacgtt 540 cctttccgat ggaggaaggc agacctgccg tcacacgtgt gcttgcacga gtgcgtgtac 600 ctggtgcggg actcacccgg ccgccagact gcctgggcct gcccagatgg ccacctcgtg 660 gtgctgcggt gactttgtag ccaactttat aataaagtcc agtttgcctt tttggtacct 720 ctggtgtcat gcgctgctgt gtaaaaggaa gggtggagga taagtttggg aggcttggat 780 gggagcctgg gggccaggag gtaaaagctg gacctgttta tggccccagc atttcttcat 840 ccacttgtga attcattcat tcattcactc attcattcat tctttcactc aacgtccaca 900 tgtacattgt gtggcccata ctgtgctaga agctggaaag tttagggctg aaacagatgt 960 tatgtcttgc cctcaaggtg cttggcgtcc agtactagag aatactggca tctcctctct 1020 gcgccaggct tgcagtgctc gtggtgtggg aggggacaga gggcctagga gtggacatga 1080 ggattcaatt tgatgttggg tctgggcatg ggtttgaagc ttctgctcac aagttctttc 1140 ttcacctggt ccttcaggga agcaacttcc ttgtggggcc ctggatcgac tcactggaaa 1200 ttataaccac gtctgttatc cttgcacagg gctttcagct gacacacact tttacctctc 1260 ttatttgctg caacaattct tctgggcagg catattagcc catctcactg atgaagaaac 1320 tgaggaccac aggtaaaaag ttatttgttc ccacaattga tgacaggcat gggtggatgg 1380 gcaacatacc cagagcatct gcatcccagc cctgggctgt tttctctgct ggcagagcca 1440 gtgaatcacc acccatccca aatcatctca tcccagatta ctcaagaagg gcaaatgtgg 1500 gctggagcag ggtcctctct cccaagtgtg gggtgagaaa ccccttcttt ttgctctcca 1560 ggtctgtaaa gtagagctga gcagaatata actcagtaag tcaagagaaa aaagtttcca 1620 aaaatgctgt tttcctccaa gcttgaagcc caaacagcca caaggtaggg tgaggggcaa 1680 atgaaaatga ggagatgggc tgggcacagt gggtcatgcc tgtaatccca gcaccttggg 1740 aggacaaggc aggaggattg cttgagccca ggagtttgag atcagcctgg gaaacatggt 1800 gaaatcccat ctttacaaaa aatacaaaaa ttatctgggt gtggtgcaca cttgtagtcc 1860 cagctacatg agagcctgag gctggagaat ctcttgagcc tgggaggtgg aggttgcagt 1920 gagccaagac tgcaccactg tactccagcc taggcgacag agcgaaccct ggattcaaat 1980 ctcatctcca ccaattattt gccaaatggg acttgaggct cagtttctcc acaagtgaag 2040 cagggctgac aaacatggta cttatctccc aaagatgctg ttagaacttg atagtgtcca 2100 tttataagca gagaagcaca gaattgactt aagttattca attgaattag aaggcaacgg 2160 tgacctcaaa ggcttcccca gtgaagtaca gaggctgggt tccaggaact gagggcacaa 2220 cctgagaaag cccctaagcc tccttttatt ccaaatcctc cagctctggg gccatgccct 2280 tcagacagtc ccatgggaag gaagacactc ctagggacct gtcactattt ttccaacttg 2340 gatgggtcct tgggtggaaa aggagggtgg agttttgccc tctgccttcc ttgtgcatct 2400 gttctccaac ttggacaaaa taactggatt gtcagcccca ggaggaccct ggcatggagc 2460 acagg 2465 <210> 52 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 52 ggtcatgtac cgctccacca aggcgctcca aggcg 35 <210> 53 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 53 cccaatatca cgggcacagc agactgccag catct 35 <210> 54 <211> 7408 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> intron <222> (1594)..(2347) <220> <221> intron <222> (2500)..(2673) <220> <221> intron <222> (2777)..(2886) <220> <221> intron <222> (3161)..(3347) <220> <221> intron <222> (3458)..(3784) <220> <221> intron 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Lys Glu Leu Leu Pro Leu Ala Glu Ala Asp Lys Val Arg Leu Ser 25 30 35 tac ctg cac atc atg agt ctt gcc tgc atc tac act cgc aag ggt gtc 1580 Tyr Leu His Ile Met Ser Leu Ala Cys Ile Tyr Thr Arg Lys Gly Val 40 45 50 ttc ttt gct gga g gtgagcagct tgggctaccg gagaccagag ctgacgggga cca 1636 Phe Phe Ala Gly 55 gggatggagg agctgaggga atgtgctaaa actgccgctt gtctagcaca gcgtgctgga 1696 agcctgtgga gagaagggac ttgaggggac cctggacttc ctactttttc ttctgagctc 1756 catctagact agcctaaacg atagtcctag cactggattt gtgtgagata gagcgctaaa 1816 acagaatggt ccaggctccc attgcctcag aggcactcca ggaatccggg gagggtacgg 1876 aaggaagcct ggcaagctac agggaaagcc tgcaaaggca aagtatgagg aagagtagct 1936 tgtgctagaa aatgctgaga gggtctttct atgcgctctg gagctgttcg acgtcctgaa 1996 gccatcaccc tttctggcgc tgcccgcggt gctgaaatgg ccatagcccc ttttcgcagg 2056 agctgtccgc ggtgctgaat cccagtcctt tcgggagagc tctgtccaca gtgctgacag 2116 cagagggctg ctgaggttcc ggccaggctt ggaagtccag gggctccctg gctagatagt 2176 tttagcaaca ggtctcctgg ccaagatcca caagcatagg gtcaacaggt gttggcagaa 2236 ataggtctat gggaatttcc tgtgtcttct ccaagactca aaagatgttc tctttatttc 2296 tgtgttgtcc ctgattctta tcctgactca ccacatcttc tcaccctaca g gc act 2352 Gly Thr 60 cct ttg gct ggc ccc acc ggg ctt ctc tct gct caa gag ctt gaa gac 2400 Pro Leu Ala Gly Pro Thr Gly Leu Leu Ser Ala Gln Glu Leu Glu Asp 65 70 75 att gtg gca gca cta cct gga ttt ctc ctt gta ttc aca gct gag ggg 2448 Ile Val Ala Ala Leu Pro Gly Phe Leu Leu Val Phe Thr Ala Glu Gly 80 85 90 aag ttg cta tac ctg tcg gag agt gtg agc gag cat ctg ggc cac tct 2496 Lys Leu Leu Tyr Leu Ser Glu Ser Val Ser Glu His Leu Gly His Ser 95 100 105 atg gtgagtacta aaagtccttg catctcaagt tggggtatat gtgagataaa atgagc 2555 Met ctctcactac tgaaaacaga gttattagag gcgagtgtgg gggagtcttc cctaagaaaa 2615 atcattggtt gcagataggc tcttgctgcc ttcactaatg atcacttctc ctttctag 2673 gtg gac ctg gtt gcc cag ggc gac agt atc tac gat atc att gac cct 2721 Val Asp Leu Val Ala Gln Gly Asp Ser Ile Tyr Asp Ile Ile Asp Pro 110 115 120 125 gct gac cat ctc act gtg cgc cag cag ctc acc atg ccc tct gct ctg 2769 Ala Asp His Leu Thr Val Arg Gln Gln Leu Thr Met Pro Ser Ala Leu 130 135 140 gat gct g gtaagaacct cctctcggtt cttcagttta ctcctctgct gccctgccct 2826 Asp Ala aactatctac tctcctccaa tgcccaccct cttagtcagt ttttcctttt gctcacctag 2886 at cgc ctt ttc cgt tgt cga ttc aac acc tcc aag tcc ctc cgg cgc 2933 Asp Arg Leu Phe Arg Cys Arg Phe Asn Thr Ser Lys Ser Leu Arg Arg 145 150 155 cag agt tca gga aac aaa ctg gtg ctt att cga ggt cga ttc cat gct 2981 Gln Ser Ser Gly Asn Lys Leu Val Leu Ile Arg Gly Arg Phe His Ala 160 165 170 175 cac cca cct ggg gcc tac tgg gca gga aac cct gtg ttc acc gct ttc 3029 His Pro Pro Gly Ala Tyr Trp Ala Gly Asn Pro Val Phe Thr Ala Phe 180 185 190 tgc gcc cca ctg gag cca aga ccc cgc cct ggc ccc ggc cct ggc cct 3077 Cys Ala Pro Leu Glu Pro Arg Pro Arg Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro 195 200 205 ggc cct ggt cct gct tct ctc ttc ctg gcc atg ttc cag agc cgg cat 3125 Gly Pro Gly Pro Ala Ser Leu Phe Leu Ala Met Phe Gln Ser Arg His 210 215 220 gct aag gac cta gcc cta ctg gac gtt tct gaa ag gtaagcccaa agtgttc 3177 Ala Lys Asp Leu Ala Leu Leu Asp Val Ser Glu Ser 225 230 235 aaactccagt aagaagggag gccagaaaga agggaacttt agattcgtga tcttagattc 3237 agggcaggga ggatggggct taagtgggca gagagcatgg gagggagtga agtgcatgca 3297 ttttgagtaa ggtaaacaga aagctgacct catcatttcc accttcccag t gtc cta 3354 Val Leu atc tac ctg ggc ttt gag cgc agc gaa ctg ctc tgt aaa tca tgg tat 3402 Ile Tyr Leu Gly Phe Glu Arg Ser Glu Leu Leu Cys Lys Ser Trp Tyr 240 245 250 gga ctg cta cac ccc gag gac ctg gcc caa gct tct tct caa cac tac 3450 Gly Leu Leu His Pro Glu Asp Leu Ala Gln Ala Ser Ser Gln His Tyr 255 260 265 cgc ctg t gtgagtgtcc tgagaggccg tgcataacac aggaagctgg gagaaagcat 3507 Arg Leu 270 gggagacagg ccagggactg gctgtggtcc aaactgatgt taaggagttt cggaggctac 3567 agagtgagct tgaggatgag aagtcaaggc aagaatagga cagagttaga aaacactgtg 3627 tgataaggtc aagtggggag cctagaggta caggttaggg tagttagaag agaatatgtc 3687 atggctccct caattcagtg tagaggtaag aaaggtgggt gtgtaggtgg tgttgattga 3747 tggaccttct aatccggtat tccttttttc tccccag tg gct gaa agt gga gat 3801 Leu Ala Glu Ser Gly Asp 275 att cag gct gaa atg gtg gtg aga ctt caa gcc aag cat gga ggc tgg 3849 Ile Gln Ala Glu Met Val Val Arg Leu Gln Ala Lys His Gly Gly Trp 280 285 290 aca tgg att tac tgc atg cta tac tca gaa ggt cca gaa ggc cct ttt 3897 Thr Trp Ile Tyr Cys Met Leu Tyr Ser Glu Gly Pro Glu Gly Pro Phe 295 300 305 act gcc aat aac tac cct atc ag gtaagctgta agatacaaga tggcggagag g 3951 Thr Ala Asn Asn Tyr Pro Ile Ser 310 315 ggaggggagc tgaggtcagc atagaagaaa tgcaacgaag aaaactactc tggtaatgga 4011 cagcagaccc ttacaagctg ccacctcttc cctttccag t gac acg gaa gcc tgg 4066 Asp Thr Glu Ala Trp 320 agc ctc cgc cag cag cta aac tct gaa gac acc cag gca gcc tat gtc 4114 Ser Leu Arg Gln Gln Leu Asn Ser Glu Asp Thr Gln Ala Ala Tyr Val 325 330 335 cta gga acc cca gct gtg cta ccc tca ttc tct gag aat gtc ttc tcc 4162 Leu Gly Thr Pro Ala Val Leu Pro Ser Phe Ser Glu Asn Val Phe Ser 340 345 350 cag gag caa tgc tct aat cca ctc ttt aca cca tcc ctg ggg act cct 4210 Gln Glu Gln Cys Ser Asn Pro Leu Phe Thr Pro Ser Leu Gly Thr Pro 355 360 365 370 aga agt gcc agc ttc ccc agg gct cct gaa cta ggt gtg atc tca aca 4258 Arg Ser Ala Ser Phe Pro Arg Ala Pro Glu Leu Gly Val Ile Ser Thr 375 380 385 cca gaa gag ctt ccc caa ccc tcc aaa gag ctg gac ttc agt tac ctg 4306 Pro Glu Glu Leu Pro Gln Pro Ser Lys Glu Leu Asp Phe Ser Tyr Leu 390 395 400 cca ttc cct gct agg cct gag cct tcc ctc caa gca gac ctg agc aag 4354 Pro Phe Pro Ala Arg Pro Glu Pro Ser Leu Gln Ala Asp Leu Ser Lys 405 410 415 gat ttg gtg tgt act cca cct tac aca ccc cac cag cca gga ggc tgt 4402 Asp Leu Val Cys Thr Pro Pro Tyr Thr Pro His Gln Pro Gly Gly Cys 420 425 430 gcc ttc ctc ttc agc ctc cat gaa ccc ttc cag act cac ttg ccc cct 4450 Ala Phe Leu Phe Ser Leu His Glu Pro Phe Gln Thr His Leu Pro Pro 435 440 445 450 ccg tcc agc tct ctc caa gaa cag ctg aca cca agt aca gtg act ttc 4498 Pro Ser Ser Ser Leu Gln Glu Gln Leu Thr Pro Ser Thr Val Thr Phe 455 460 465 tct gaa cag ttg aca ccc agc agt gct acc ttc cca gac cca cta acc 4546 Ser Glu Gln Leu Thr Pro Ser Ser Ala Thr Phe Pro Asp Pro Leu Thr 470 475 480 agt tca cta caa gga cag ttg aca gaa agc tca gcc aga agc ttt gaa 4594 Ser Ser Leu Gln Gly Gln Leu Thr Glu Ser Ser Ala Arg Ser Phe Glu 485 490 495 gac cag ttg act cca tgc acc tct tcc ttc cct gac cag cta ctt ccc 4642 Asp Gln Leu Thr Pro Cys Thr Ser Ser Phe Pro Asp Gln Leu Leu Pro 500 505 510 agc act gcc aca ttc cca gag cct ctg ggc agc ccc gcc cat gag cag 4690 Ser Thr Ala Thr Phe Pro Glu Pro Leu Gly Ser Pro Ala His Glu Gln 515 520 525 530 ctg act cct ccc agc aca gca ttc cag gct cat ctg aac agc ccc agc 4738 Leu Thr Pro Pro Ser Thr Ala Phe Gln Ala His Leu Asn Ser Pro Ser 535 540 545 caa acc ttc cca gag caa ctg agc ccc aat cct acc aag act tac ttc 4786 Gln Thr Phe Pro Glu Gln Leu Ser Pro Asn Pro Thr Lys Thr Tyr Phe 550 555 560 gcc cag gag gga tgc agt ttt ctc tat gag aag ttg ccc cca agt cct 4834 Ala Gln Glu Gly Cys Ser Phe Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Pro Ser Pro 565 570 575 agc 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tgagaggccg tgcataacac aggaag 11668 Ser Gln His Tyr Arg Leu L 270 ctgggagaaa gcatgggaga caggccaggg actggctgtg gtccaaactg atgttaagga 11728 gtttcggagg ctacagagtg agcttgagga tgagaagtca aggcaagaat aggacagagt 11788 tagaaaacac tgtgtgataa ggtcaagtgg ggagcctaga ggtacaggtt agggtagtta 11848 gaagagaata tgtcatggct ccctcaattc agtgtagagg taagaaaggt gggtgtgtag 11908 gtggtgttga ttgatggacc ttctaatccg gtattccttt tttctcccca g tg gct 11964 eu Ala gaa agt gga gat att cag gct gaa atg gtg gtg aga ctt caa gcc aag 12012 Glu Ser Gly Asp Ile Gln Ala Glu Met Val Val Arg Leu Gln Ala Lys 275 280 285 cat gga ggc tgg aca tgg att tac tgc atg cta tac tca gaa ggt cca 12060 His Gly Gly Trp Thr Trp Ile Tyr Cys Met Leu Tyr Ser Glu Gly Pro 290 295 300 305 gaa ggc cct ttt act gcc aat aac tac cct atc ag gtaagctgta agataca 12112 Glu Gly Pro Phe Thr Ala Asn Asn Tyr Pro Ile Se 310 315 agatggcgga gaggggaggg gagctgaggt cagcatagaa gaaatgcaac gaagaaaact 12172 actctggtaa tggacagcag acccttacaa gctgccacct cttccctttc cag t gac 12229 r Asp acg gaa gcc tgg agc ctc cgc cag cag cta aac tct gaa gac acc cag 12277 Thr Glu Ala Trp Ser Leu Arg Gln Gln Leu Asn Ser Glu Asp Thr Gln 320 325 330 gca gcc tat gtc cta gga acc cca gct gtg cta ccc tca ttc tct gag 12325 Ala Ala Tyr Val Leu Gly Thr Pro Ala Val Leu Pro Ser Phe Ser Glu 335 340 345 350 aat gtc ttc tcc cag gag caa tgc tct aat cca ctc ttt aca cca tcc 12373 Asn Val Phe Ser Gln Glu Gln Cys Ser Asn Pro Leu Phe Thr Pro Ser 355 360 365 ctg ggg act cct aga agt gcc agc ttc ccc agg gct cct gaa cta ggt 12421 Leu Gly Thr Pro Arg Ser Ala Ser Phe Pro Arg Ala Pro Glu Leu Gly 370 375 380 gtg atc tca aca cca gaa gag ctt ccc caa ccc tcc aaa gag ctg gac 12469 Val Ile Ser Thr Pro Glu Glu Leu Pro Gln Pro Ser Lys Glu Leu Asp 385 390 395 ttc agt tac ctg cca ttc cct gct agg cct gag cct tcc ctc caa gca 12517 Phe Ser Tyr Leu Pro Phe Pro Ala Arg Pro Glu Pro Ser Leu Gln Ala 400 405 410 gac ctg agc aag gat ttg gtg tgt act cca cct tac aca ccc cac cag 12565 Asp Leu Ser Lys Asp Leu Val Cys Thr Pro Pro Tyr Thr Pro His Gln 415 420 425 430 cca gga ggc tgt gcc ttc ctc ttc agc ctc cat gaa ccc ttc cag act 12613 Pro Gly Gly Cys Ala Phe Leu Phe Ser Leu His Glu Pro Phe Gln Thr 435 440 445 cac ttg ccc cct ccg tcc agc tct ctc caa gaa cag ctg aca cca agt 12661 His Leu Pro Pro Pro Ser Ser Ser Leu Gln Glu Gln Leu Thr Pro Ser 450 455 460 aca gtg act ttc tct gaa cag ttg aca ccc agc agt gct acc ttc cca 12709 Thr Val Thr Phe Ser Glu Gln Leu Thr Pro Ser Ser Ala Thr Phe Pro 465 470 475 gac cca cta acc agt tca cta caa gga cag ttg aca gaa agc tca gcc 12757 Asp Pro Leu Thr Ser Ser Leu Gln Gly Gln Leu Thr Glu Ser Ser Ala 480 485 490 aga agc ttt gaa gac cag ttg act cca tgc acc tct tcc ttc cct gac 12805 Arg Ser Phe Glu Asp Gln Leu Thr Pro Cys Thr Ser Ser Phe Pro Asp 495 500 505 510 cag cta ctt ccc agc act gcc aca ttc cca gag cct ctg ggc agc ccc 12853 Gln Leu Leu Pro Ser Thr Ala Thr Phe Pro Glu Pro Leu Gly Ser Pro 515 520 525 gcc cat gag cag ctg act cct ccc agc aca gca ttc cag gct cat ctg 12901 Ala His Glu Gln Leu Thr Pro Pro Ser Thr Ala Phe Gln Ala His Leu 530 535 540 aac agc ccc agc caa acc ttc cca gag caa ctg agc ccc aat cct acc 12949 Asn Ser Pro Ser Gln Thr Phe Pro Glu Gln Leu Ser Pro Asn Pro Thr 545 550 555 aag act tac ttc gcc cag gag gga tgc agt ttt ctc tat gag aag ttg 12997 Lys Thr Tyr Phe Ala Gln Glu Gly Cys Ser Phe Leu Tyr Glu Lys Leu 560 565 570 ccc cca agt cct agc agc cct ggt aat ggg gac tgt aca ctc ctg gcc 13045 Pro Pro Ser Pro Ser Ser Pro Gly Asn Gly Asp Cys Thr Leu Leu Ala 575 580 585 590 cta gct cag ctc cgg ggc ccc ctc tct gtg gat gtc ccc ctg gtg ccc 13093 Leu Ala Gln Leu Arg Gly Pro Leu Ser Val Asp Val Pro Leu Val Pro 595 600 605 gaa ggc ctg ctc aca cct gag gcc tct cca gtc aag caa agt ttc ttc 13141 Glu Gly Leu Leu Thr Pro Glu Ala Ser Pro Val Lys Gln Ser Phe Phe 610 615 620 cac tac aca gag aaa gag caa aat gag ata gat cgt ctc att cag cag 13189 His Tyr Thr Glu Lys Glu Gln Asn Glu Ile Asp Arg Leu Ile Gln Gln 625 630 635 atc agc cag ttg gct cag ggc gtg gac agg ccc ttc tca gct gag gct 13237 Ile Ser Gln Leu Ala Gln Gly Val Asp Arg Pro Phe Ser Ala Glu Ala 640 645 650 ggc act ggg ggg ctg gag cca ctt gga ggg ctg gag ccc ctg aac cct 13285 Gly Thr Gly Gly Leu Glu Pro Leu Gly Gly Leu Glu Pro Leu Asn Pro 655 660 665 670 aac ctg tcc ctg tca ggg gct gga ccc cct gtg ctt agc ctg gat ctt 13333 Asn Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly Pro Pro Val Leu Ser Leu Asp Leu 675 680 685 aaa ccc tgg aaa tgc cag gag ctg gac ttc ctg gtt gac cct gat aat 13381 Lys Pro Trp Lys Cys Gln Glu Leu Asp Phe Leu Val Asp Pro Asp Asn 690 695 700 tta ttc ctg gaa gag acg cca gtg gaa gac atc ttc atg gat ctt tct 13429 Leu Phe Leu Glu Glu Thr Pro Val Glu Asp Ile Phe Met Asp Leu Ser 705 710 715 act cca gac ccc aat ggg gaa tgg ggt tca ggg gat cct gag gca gag 13477 Thr Pro Asp Pro Asn Gly Glu Trp Gly Ser Gly Asp Pro Glu Ala Glu 720 725 730 gtc cca gga ggg acc ctg tca cct tgc aac aac ctg tcc cca gaa gat 13525 Val Pro Gly Gly Thr Leu Ser Pro Cys Asn Asn Leu Ser Pro Glu Asp 735 740 745 750 cac agc ttc ctg gag gac ttg gcc acc tat gaa acc gcc ttt gag aca 13573 His Ser Phe Leu Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Glu Thr Ala Phe Glu Thr 755 760 765 ggt gtc tca aca ttc ccc tac gaa ggg ttt gct gat gag ttg cat caa 13621 Gly Val Ser Thr Phe Pro Tyr Glu Gly Phe Ala Asp Glu Leu His Gln 770 775 780 ctc cag agc caa gtt caa gac agc ttc cat gaa g gtaagtctag cctgaatg 13673 Leu Gln Ser Gln Val Gln Asp Ser Phe His Glu A 785 790 tccaagagcc ctgcccttct aatcagacat tgcatagatt gggtgaatca gtccccaact 13733 ctgaaactct gttttattaa gagaacaata ttacctccta ctaagaagag tagtgaggta 13793 ggaataatac aaagctttgt gtgaaagatg agtagacctg gtgggcgggg gaggtgagct 13853 agaaaaacgc gatagacaat ccctaggcaa aagcttgaaa gcttctgaga gacctagacc 13913 agacaacacc gtcattttat agacaaaaat aatcaaggcc ccagagttaa agaaacttta 13973 agtggcacaa aaattgatag aagttgatgc ttccccctga aggggaccca gagcaacaac 14033 tggttaaaat taggagacag aaagaacaat gccaagcccc tagctccaat ctggcggcct 14093 tgtgctgttt gtccaaagct gtggccacag tttccctcca tatttgcata ttgcctctta 14153 tctgctgaca ccctggggat cagttcattt ggctaacaca tttgacgtcc atagactata 14213 gcaatattgt accactgcct gagcccaatg acgcttttac tgaataagct tgactaacat 14273 acgcactttc tctcttctct ctctctctct ttccccacag at gga agt gga ggg 14327 sp Gly Ser Gly Gly 795 gaa cca acg ttt tga ataagtctgt gacttaacgt cttcaagtat ggcatattgt c 14383 Glu Pro Thr Phe Stop 800 atcaagacgt ggagccgctc tccacccccc cgggactgtt ggggggattc tgggggccag 14443 agggggatat atctgattct ccaggccctg aaggatttag gggggaggtg ggagggtaag 14503 ggaggggagc aactttttaa aatcaagaga cttcgagcga tcccagtttc catttcaatc 14563 tgtattcact cgtagtgagt ttccttgaat ggatttcaag cggagaatgg gggagtctca 14623 cttcctcacc gcgctgcccc atgggcctgg gccagttctc cactcctagg ggcaaagcca 14683 cccctgggct ttggtggggg aaaggcatgg cccacctggg gctagcctgt gccccgaggg 14743 gctcttgaca cccacgtaga attctctaca aaccagtaac gggatttcaa ttccgacgga 14803 ctctgccgcc ctggcggctc ttcctgtgac ttttgcgccc cgcgcctggg gtggggggcg 14863 cgaagagacg ctacattcct ttccgatgga ggaaggcaga tctgccgtca cacgtgtgct 14923 tgcacgagtg cgtgtacctg gtgcgggact cacccggccg ccagaccgcc taggcttgcc 14983 caggtggcca cctcgtggtg ctgcggtgac tttgtagcca actttataat aaagtccagt 15043 ttgccttttt ggtatctctg gtgtcatgcg ctattgtgaa aagggaaggg aggggaaggg 15103 agagattgag gagcccagat aggaggctgg ggcaggagtc acaggttaga cctcctctca 15163 gccctggtat ctctaagtga gtttgttcat atctccattt gactctgctt ggtccacact 15223 gtgctagaag actaagtact tgtcagaagc agacattgca ccaaagacac tggagtcttc 15283 tctctgccct gggtttatgg tgtgatgggg aggaaagagc ctggggctga gcaagtttgt 15343 cactggtctt ggatatgggt ttaaagtttc tggtcatttc ctgcctggtc tttcaggata 15403 ttgatttcct catggaggct tagattttaa aaatcagaag ctgaaacctg ttacgcttgc 15463 gtagggctgt tcagttagca aatacccaat ccactgcaat aaatttccac ttcattggga 15523 aagcaacccg ataacgggtg ttcctccagt tacaggtgag aaacacatca acccctcccc 15583 aaatctgggg agctcccaga tctcaatgcc agcgaataac catcatagac catctcacca 15643 cagagctgag gaccagtcac tggggaggaa atttcagaaa atggtgtttg actctaaact 15703 cgtaggctca accccacagg gtgtggttag tggaggacaa atgaaagtta ggtggtagaa 15763 ggacctgaca gatccaatca cgatcccacc ttttgtattt ggagtgcacc taaagccccc 15823 acttcctcac aggtcaaagg agggcagcaa tcaagaggca gtgtcagaac aggacaagtc 15883 tcttccagct cacgaagtgc agtgaaggct tggtcggtgc gacctccatt tcagtggtga 15943 cccgcagact tagagaaagc cttgtcctca aggagaggac aacaactcca ggctccagtc 16003 tttccacaga agcacagggg cacagccttg aaaaccctgt agcctccact catcctgaag 16063 cccagctgtg gagacagaca ggccctttgg agggtccttc cttcactgtg gagacagaca 16123 ggccctttgg agggtccttc cttcactgtg gagacagaca ggccctttgg agggtccttc 16183 cttcactgtg gagacaggcc ctttggatcc ttccttcaca gaaaggaagg atccacaggg 16243 acctttccct tctttgatgg gtatttgggt ggagccaaga acttccctgt cactcccaag 16303 aggaacctgt cttagctcag ttccctcctc agcacaggga cacggagatg gggagatgga 16363 taaaggtgct gggccaagca tgatgctctg atttgatcct tgatgggaag agataactga 16423 cagttgtcct ctgacgtgta actgcactcc aggacatgtt acactcacat gtgcacacac 16483 acacactaca cacactacat acacatacca tacacatact atacacaata taccacacac 16543 acacatacta tacacacata ccacatacac tacacacagt acacatgcta cacatacata 16603 cacacaccac acacatatac cacacacaaa cactctacac acacacacta cacacactac 16663 atacatatac cacacacact taccacacat acagtatata cagtacatac atatgccaca 16723 cacacataac acacactcac acacaccata tatactacta atagaaaata ataaaaattt 16783 ttaaatgggg tggatttagg aaatgaaatt tctgtgagaa taaaggaaag gcttccttga 16843 tgtttggtgg tggctggcaa tagtgtatgc tttctttgtc tttgtttgtt gtagtttttt 16903 tgtttatttt gcttttgatt ttttttttgt tgttgttgtt acttgtttgt tgaaaacctg 16963 cctctgcctc ctaagcactg aattgtcttg ggtggttttt aaaaattaat taatgttgaa 17023 atattttttt catttttgag acaagatttc tttgtgtagc cttagctgtc ttagaactag 17083 ctctgtagac taagctggcc ttaaacttac agagatctgc ttgcttctgc ctcctgagtg 17143 ctgggattaa agtttttagt ttttaaaaaa atataattac agatatgcac tgtctttgca 17203 tcatgtcctc ttgttttggg cttatttttg ttgttgtggt ggtgataagt gatttttttt 17263 gtttgttttt gtttttagtt ttgtttttct tcagctcagg tcaatctgga gttcactatg 17323 tagtccaagg tggccacaga cttttgcaaa tccccctgcc tcagcctccc aggtgctagg 17383 attacagaag aaccagacca actggtcctg tgtgaggaaa ataaagtaga agaggcaata 17443 ctgccacctg ctggaaggaa aagaagctgc ttccttgctg gctgctgagg cccttgcagc 17503 tcagaatatc ttcaccttag aatggagaga taaactgagt ccctgggaga gaaaaggact 17563 tcaggatctg agagtgagtg atgttctgga agcagagtgc atgagagaag gtgtcttaat 17623 cattgtagta ctgctgtgag aagacaccat gaccaaggta acataaaata aagcatttag 17683 ttggggactt gcttagagtt taaaagggtt gctccatgac cagcagagca gggagcatgg 17743 gagtatgcag gtagacacgg cactggagaa gtacctgaga gcttccatct gatccccaag 17803 atagaggcag agagaaccct caaagcccac accccctcca acaacaaaca cctcctgatc 17863 cttcctaaac agtccaccaa atggagacta agcattcaga tatggggacc attatcatcc 17923 aaaccactat ggaaggctcg agtctgggga ccagacagac tgaacccagg agaccaaggg 17983 gatagcttag tgggtaaagg cgctagctgc cgagcttgga gacgcaagtc caatccctag 18043 gttctgtatg gtggaaagaa acgggattcc agtaagtcac cccctggcct tcgcgcacac 18103 catgatgctc atgcccacac acatacaaat ccaaaagaaa gaccgaacct aaggatggtt 18163 ctgctgttgt acatttttcc tgtaatagat catccatgac acttgcctga gttctgggaa 18223 aactgaacaa acaagatggg tggggccaga cagctgtgct ctaactggga acatcacaag 18283 aggtaagaca gagcctgagt gctgaaggca agagctaggg tatcgtgaca gagtaaccgg 18343 ggactgattt atagtgccac tttctgagaa ggtgacactg agcttgttag caacaggtga 18403 caacaaagaa gagtccaacc taaaggaagc atctgtaatg acattaaaac gggagagtgt 18463 ctgagctgct taagaagtac acaggaagtg ggctgagaca agcaggagag gggctggaga 18523 gaaggtcgcc cagtacttct agaccacaat aaaagatgta ggttgcattc tggctgagcg 18583 tggtagtgca cacctgcaat tgcagcctca aaaggccgag ggtggaaaat cttgagctcc 18643 tggacagcct gggctccata gaaagaaaag tctgcaaaca acagcaacaa aaaacccaaa 18703 ccaaaaacca aagtgctggt gtcctagtga gggttcctat tgctatgagg aaaaacaatg 18763 atcaaaaaca aactgcggac gaaagggttt gtttgcctgg cacttccaca tcacagtcca 18823 tcattgaagg aatccagaac aggaacgcaa gcaaggcagg aacctggagg caggagccaa 18883 tgaagaggtc atgaagggtt gctgcttatg gcttgctcca catggcttta cagcctgcta 18943 gatctcagca ccaacagcct accatgagcg tggccctcct ccatcaatca ctgattaaga 19003 aaatgtccta cacaggaagg gaggaaggaa gagagagtta ggagcatatt ggatggggat 19063 agtgacagga taagatgtag ctactagagt cttctggttt agatggtgaa tctgccagaa 19123 tttgccactg aaggatttag atttagattt aacataactt acaagattag cattctagtt 19183 gttgcaccca gagactgagt taccattgtt tctgaactaa gtttgtgtgc tgtttttctt 19243 cacgcggtgg ctcgactggg ttcaagagag aaaggtacag cggcaaagcc tgggtttgcc 19303 agatgcgcac cacaaaggca gtgggggttt gaacgatggg gctagcacgg cagtgggaac 19363 tcattgagcc gggtggaggg attttggagc tccaggtcag agagtttgct gagatgagaa 19423 caccaggctg gagccatgtg gcctgccggt accttggcat aatgagggaa cttgctgttc 19483 tttttaatat ttcccacaac aggtggtgaa ccagcatgtt ggggaagaat ccactagaaa 19543 tgtaagatta tgccgggcgt ggtggtgctc gcctttaatc ccagcactcg ggaggcagag 19603 gcaggcagat ttctgagttc gaggccagcc tggtctacaa agtgagttcc aggacagcca 19663 gggctacaca gagaaaccct gtctcgaaag acaaaacaaa acaaaacaaa caaaacaaaa 19723 caaaacgtat gatcattagc ctgagagtta gagttttatt tgtttgtttg tttgtttgtt 19783 atttaaaatg agtagctggg tagtgctgac acaagtcatg tggacccaag cgtggaattg 19843 aaacaaagac tgtaactctg aggtcccctg ctgtgggggc tgcaggctgt tctgagtcag 19903 gagaagaagg atgaagttgc ctacttctta gggcagagat ggattgaact gtgaatttat 19963 aaaattggta ttatttgctt ttaggaaaga tttatatctg ggttttgcct gaatcacatg 20023 gggattttcg cccactgttc agaattagga taggaaaaaa atcagtccct gactccaggt 20083 agaaaagaca gtgattatcg tctgctacaa acaggtatca attaactatg tctgtggctc 20143 cctgtagaga gctcaaaaga tggatattat aacaggtatt aataaaatta atgtcaccca 20203 ggcagtggtg gcacacgcct ttaatcccag cacttgggag gcagaggcag gcggatttct 20263 gagttcgagg ccagcctggt ctacagagtg agttccagca cagccagggc tacacagaga 20323 aaccctatct tgaaaaaaaa attaaataaa attaatgtct gtggccccag tgctgagcag 20383 atagacagtg taacaagatg gctgctctag gcagagagct gaacaggaag atggtatgaa 20443 gatagtttgc tctaacacac ctcacaggat gctcaaatcc tgtctatgtg ggctccatgg 20503 gaatcttttt tttaattagg tattttcctc atttacattt ccaatgctat cccaaaagtc 20563 ccccataccc tcctcccaac cccccaacca cccactccca ctttttggcc ctggcgttcc 20623 cctgtactgg ggcatataaa gtttgcgtgt ccaatgggcc tctctttcca gtgatggctg 20683 actaggccac cttttgatac atatgcagct agagtcaaga gctccggggt actggttagt 20743 tcataatgtt gttccaccta tagggttgca ga 20775 <210> 56 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 56 cgcgtcgagc tcgggtcgga ggactgtcct ccgactgctc gagtcgagct cgggtcggag 60 gactgtcctc cgactgctcg aga 83 <210> 57 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 57 cgcgtctcga gcagtcggag gacagtcctc cgacccgagc tcgactcgag cagtcggagg 60 acagtcctcc gacccgagct cga 83 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 58 agcttcatcc cacgtgagtc at 22 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 59 ctagatgact cacgtgggat ga 22 <210> 60 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 60 gatctcgact ataaagaggg caggctgtcc tctaagcgtc accacgactt ca 52 <210> 61 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide <400> 61 agcttgaagt cgtggtgacg cttagaggac agcctgccct ctttatagtc ga 52 <210> 62 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 62 gggcgctgca gcccagccac catgtaccga tccaccaagg g 41 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 63 aatctcggcg ttgatctggt 20 <210> 64 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 64 gggcggtacc atacctaggg ccaataggag tgatgagccc atgtc 45 <210> 65 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 65 gggcggtacc aacgaggaat ctctcttcct ctccactgtc cgggc 45 <210> 66 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 66 gggcggtacc ctgcttaaat tgcttggaga ccagctgtgg accca 45 <210> 67 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 67 gggcggtacc ctcagtgaca agtgcacagg cagaacgagg agccc 45 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 68 gggcacgcgt tcgcctgcct cgatccgcct tatgtagctc ctgac 45
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明蛋白質の転写調節能を確認するための、
レポーター遺伝子プラスミドであるpGL3-TATA-Galx4を
用いたワンハイブリッドアッセイ（One hybrid assay）
の結果を示す図である。横軸は供試された形質転換体
（右端がGal4のＤＮＡ結合領域のみを発現する形質転換
体であって、対照に相当する。一方、左端はGal4のＤＮ
Ａ結合領域と本発明蛋白質の転写調節領域等とが結合し
てなる融合蛋白質を発現する形質転換体である。）を示
す。縦軸はルシフェラーゼ活性の測定値（即ち、レポー
ター遺伝子の発現量）であり、これは転写調節因子の転
写調節能を示す指標値である。
【図２】本発明蛋白質をコードする遺伝子の発現調節領
域が有するプロモーター活性を確認するための、レポー
ター遺伝子アッセイの結果を示す図である。横軸は供試
された発現調節領域である。最左端から順に、本発明蛋
白質をコードする遺伝子の転写開始点から約1kbp、約2.
5kbp、約5kbp上流までをそれぞれ含む、本発明蛋白質を
コードする遺伝子の発現調節領域（図中では-1kbp NXFg
enome、-2.5kbp NXFgenome、-5kbp NXFgenomeと記載さ
れる）、及び、対照であるヘルペス単純ウイルスのチミ
ジンキナーゼプロモーター（HSV-TK enhancer）であ
る。縦軸はルシフェラーゼ活性の測定値（即ち、レポー
ター遺伝子の発現量）であり、これは蛋白質遺伝子の発
現調節領域が有するプロモーター活性を示す指標値であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/483 Ｆ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/483 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｇ０１Ｎ 27/447 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３２５Ｅ ３１５Ｇ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BB20 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB04 FB05 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 DA06 DA12 EA04 GA11 HA12 HA15 HA17 4B063 QA01 QA12 QA18 QA19 QQ20 QQ42 QQ52 QR55 QR59 QR77 QR80 QS12 QS24 QS25 QS34 4B064 AG01 CA02 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA72X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA13 NA14 ZA02 ZA16 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 DA86 EA21 EA50 FA74

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの蛋白質
    をコードするＤＮＡ。 ＜蛋白質群＞ （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
    配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
    ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
    蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。
  2. 【請求項２】以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配
    列を有するＤＮＡ。 ＜塩基配列群＞ （ａ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列。 （ｂ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列。 （ｃ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列。 （ｄ）配列番号５４で示される塩基配列の塩基番号１４
    １９〜６１６４で表される塩基配列。
  3. 【請求項３】請求項１又は２に記載のＤＮＡを含有する
    ベクター。
  4. 【請求項４】請求項１又は２に記載のＤＮＡの上流に、
    プロモーターが機能可能な形で結合されてなるＤＮＡを
    含有するベクター。
  5. 【請求項５】宿主細胞内で複製可能なベクターに、請求
    項１又は２に記載のＤＮＡを組込むことを特徴とするベ
    クターの製造方法。
  6. 【請求項６】請求項１もしくは２に記載のＤＮＡ又は請
    求項３もしくは４に記載のベクターが宿主細胞に導入さ
    れてなる形質転換体。
  7. 【請求項７】宿主細胞が動物細胞である請求項６記載の
    形質転換体。
  8. 【請求項８】宿主細胞が大腸菌又は酵母である請求項６
    記載の形質転換体。
  9. 【請求項９】請求項１もしくは２に記載のＤＮＡ又は請
    求項３もしくは４に記載のベクターを宿主細胞に導入す
    ることを特徴とする形質転換体の製造方法。
  10. 【請求項１０】以下の（ａ）〜（ｅ）の蛋白質。 ＜蛋白質群＞ （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
    配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
    ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
    蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。
  11. 【請求項１１】以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの蛋白
    質をコードするＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる形質
    転換体を培養する工程を含むことを特徴とする前記蛋白
    質の製造方法。 ＜蛋白質群＞ （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
    配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
    ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
    蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。
  12. 【請求項１２】以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの蛋白
    質又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを認
    識する抗体。 ＜蛋白質群＞ （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
    配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
    ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
    蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。
  13. 【請求項１３】以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの蛋白
    質を検出する方法であって、 （１）前記蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有するポ
    リペプチドを認識する抗体と被検試料とを接触させる工
    程、及び （２）被検試料中の蛋白質と前記抗体との複合体を検出
    する工程、を含む方法。 ＜蛋白質群＞ （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
    配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
    ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
    蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。
  14. 【請求項１４】以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの蛋白
    質に結合する物質をスクリーニングする方法であって、 （１）前記蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有するポ
    リペプチドと被検物質とを接触させる工程、及び （２）前記蛋白質又は前記ポリペプチドに結合する物質
    を選択する工程、を含む方法。 ＜蛋白質群＞ （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
    配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
    ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
    蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。
  15. 【請求項１５】以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの蛋白
    質又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドの転
    写調節能を測定する方法であって、以下のi）の遺伝子
    とii）の遺伝子とが宿主細胞に導入されてなる形質転換
    体、及び、以下のiii）の遺伝子とii）の遺伝子とが宿
    主細胞に導入されてなる形質転換体におけるレポーター
    遺伝子の発現量を測定し、測定された発現量を比較する
    工程を含む方法。 ＜蛋白質群＞ （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
    配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
    ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
    蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 ＜各遺伝子＞ i）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合
    領域と、前記蛋白質またはその部分アミノ酸配列を有す
    るポリペプチドとの融合蛋白質をコードするＤＮＡが、
    宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に接続され
    てなるキメラ遺伝子。 ii）i）記載のＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡと宿
    主細胞内で機能可能な最小プロモーターとを含むプロモ
    ーターの下流に、レポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
    が接続されてなるレポーター遺伝子。 iii）i）記載のＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡが、
    i）記載のプロモーターの下流に接続されてなる遺伝
    子。
  16. 【請求項１６】以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載
    の蛋白質又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチ
    ドの転写調節能を変化させる物質をスクリーニングする
    方法であって、 （１）i）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮ
    Ａ結合領域と、前記蛋白質又はその部分アミノ酸配列を
    有するポリペプチドとの融合蛋白質をコードするＤＮＡ
    が、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に接続
    されてなるキメラ遺伝子、と ii）i）記載のＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡと宿
    主細胞内で機能可能な最小プロモーターとを含むプロモ
    ーターの下流に、レポーター蛋白質をコードするＤＮＡ
    が接続されてなるレポーター遺伝子とが宿主細胞に導入
    されてなる形質転換体と、被検物質とを接触させ、被検
    物質存在下における前記レポーター遺伝子の発現量を測
    定する工程、及び （２）（１）で測定されたレポーター遺伝子の発現量
    が、被検物質非存在下における当該レポーター遺伝子の
    発現量とは実質的に異なる被検物質を選択する工程、を
    含む方法。 ＜蛋白質群＞ （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
    配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
    ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
    蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。
  17. 【請求項１７】ツーハイブリッドアッセイのための、請
    求項１記載のＤＮＡの使用。
  18. 【請求項１８】以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの蛋白
    質又はその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドの細
    胞内発現量を変化させる物質をスクリーニングする方法
    であって、 （１）前記蛋白質をコードする遺伝子の発現調節領域と
    レポーター蛋白質をコードするＤＮＡとが機能可能な形
    で連結されてなるレポーター遺伝子が宿主細胞に導入さ
    れてなる形質転換体と、被検物質とを接触させ、被検物
    質存在下における前記レポーター遺伝子の発現量を測定
    する工程、及び （２）（１）で測定されたレポーター遺伝子の発現量
    が、被検物質非存在下における当該レポーター遺伝子の
    発現量とは実質的に異なる被検物質を選択する工程、を
    含む方法。 ＜蛋白質群＞ （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
    配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
    ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
    蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。
  19. 【請求項１９】配列番号４、５、６もしくは５４のいず
    れかで示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基
    配列からなるポリヌクレオチドにスリンジェントな条件
    下でハイブリダイズすることができる１０塩基以上５０
    ００塩基以下の塩基からなるポリヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】配列番号４、５、６もしくは５４のいず
    れかで示される塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基
    配列に相補的な塩基配列を有し、１０塩基以上５０００
    塩基以下の塩基からなるポリヌクレオチド。
  21. 【請求項２１】以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載
    の蛋白質をコードする核酸を検出する方法であって、 （１）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
    される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列から
    なるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハ
    イブリダイズすることができる１０塩基以上５０００塩
    基以下の塩基からなるポリヌクレオチドと被検試料由来
    の核酸とをハイブリダイゼーション条件下に接触させる
    工程、及び （２）前記ポリヌクレオチドと被検試料由来の核酸との
    ハイブリッドを検出する工程、を含む方法。 ＜蛋白質群＞ （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
    配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
    ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
    蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。
  22. 【請求項２２】配列番号４、５、６もしくは５４のいず
    れかで示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基
    配列からなるポリヌクレオチドに対してポリメラーゼチ
    ェイン反応条件下でアニールすることができ、１０塩基
    以上５０塩基以下の塩基からなるポリヌクレオチド。
  23. 【請求項２３】配列番号４、５、６もしくは５４のいず
    れかで示される塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基
    配列に相補的な塩基配列を有し、１０塩基以上５０塩基
    以下の塩基からなるポリヌクレオチド。
  24. 【請求項２４】配列番号４３〜５１のいずれかで示され
    る塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなる
    ポリヌクレオチドに対してポリメラーゼチェイン反応条
    件下でアニールすることができ、１０塩基以上５０塩基
    以下の塩基からなるポリヌクレオチド。
  25. 【請求項２５】配列番号４３〜５１のいずれかで示され
    る塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相補的
    な塩基配列を有し、１０塩基以上５０塩基以下の塩基か
    らなるポリヌクレオチド。
  26. 【請求項２６】配列番号１１〜４２のいずれかで示され
    る塩基配列を有するポリヌクレオチド。
  27. 【請求項２７】以下の（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチ
    ドから選ばれる１以上のポリヌクレオチドを含むキッ
    ト。 ＜ポリヌクレオチド群＞ （ａ）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
    される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列から
    なるポリヌクレオチドにスリンジェントな条件下でハイ
    ブリダイズすることができる１０塩基以上５０００塩基
    以下の塩基からなるポリヌクレオチド。 （ｂ）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
    される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列から
    なるポリヌクレオチドに対してポリメラーゼチェイン反
    応条件下でアニールすることができ、１０塩基以上５０
    塩基以下の塩基からなるポリヌクレオチド。 （ｃ）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
    される塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相
    補的な塩基配列を有し、１０塩基以上５０００塩基以下
    の塩基からなるポリヌクレオチド。 （ｄ）配列番号４３〜５１のいずれかで示される塩基配
    列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌク
    レオチドに対してポリメラーゼチェイン反応条件下でア
    ニールすることができ、１０塩基以上５０塩基以下の塩
    基からなるポリヌクレオチド。 （ｅ）配列番号４３〜５１のいずれかで示される塩基配
    列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配
    列を有し、１０塩基以上５０塩基以下の塩基からなるポ
    リヌクレオチド。 （ｆ）配列番号１１〜４２のいずれかで示される塩基配
    列を有するポリヌクレオチド。
  28. 【請求項２８】以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載
    の蛋白質をコードするゲノムＤＮＡを増幅する方法であ
    って、以下の（ｆ）〜（ｊ）のポリヌクレオチドから選
    ばれる１以上のポリヌクレオチドをプライマーとして用
    いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼチェイン
    反応を行う工程を含む方法。 ＜蛋白質群＞ （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
    配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
    ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
    蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 ＜ポリヌクレオチド群＞ （ｆ）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
    される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列から
    なるポリヌクレオチドに対してポリメラーゼチェイン反
    応条件下でアニールすることができ、１０塩基以上５０
    塩基以下の塩基からなるポリヌクレオチド。 （ｇ）配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示
    される塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相
    補的な塩基配列を有し、１０塩基以上５０塩基以下の塩
    基からなるポリヌクレオチド。 （ｈ）配列番号４３〜５１のいずれかで示される塩基配
    列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌク
    レオチドに対してポリメラーゼチェイン反応条件下でア
    ニールすることができ、１０塩基以上５０塩基以下の塩
    基からなるポリヌクレオチド。 （ｉ）配列番号４３〜５１のいずれかで示される塩基配
    列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配
    列を有し、１０塩基以上５０塩基以下の塩基からなるポ
    リヌクレオチド。 （ｊ）配列番号１１〜４２のいずれかで示される塩基配
    列を有するポリヌクレオチド。
  29. 【請求項２９】以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載
    の蛋白質をコードするｃＤＮＡを増幅する方法であっ
    て、以下の（ｆ）又は（ｇ）のポリヌクレオチドから選
    ばれる１以上のポリヌクレオチドをプライマーとして用
    いて、ｃＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼチェイン反応
    を行う工程を含む方法。 ＜蛋白質群＞ （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
    配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
    ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
    蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 ＜ポリヌクレオチド群＞ （ｆ）配列番号４〜６のいずれかで示される塩基配列又
    は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリペプチド
    に対してポリメラーゼチェイン反応条件下でアニールす
    ることができ、１０塩基以上５０塩基以下の塩基からな
    るポリヌクレオチド。 （ｇ）配列番号４〜６のいずれかで示される塩基配列の
    部分塩基配列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配列を
    有し、１０塩基以上５０塩基以下の塩基からなるポリヌ
    クレオチド。
  30. 【請求項３０】以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載
    の蛋白質をコードする遺伝子の遺伝子型を分析する方法
    であって、被検試料の核酸において、前記蛋白質をコー
    ドする塩基配列が、標準蛋白質のアミノ酸配列とは異な
    るアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有しているか
    否かを調べる工程を含む方法。 ＜蛋白質群＞ （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
    列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
    配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質。 （ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２
    〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコー
    ドされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する
    蛋白質。 （ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜
    ２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。 （ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜
    ２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコード
    されるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋
    白質。
  31. 【請求項３１】標準蛋白質のアミノ酸配列とは異なるア
    ミノ酸配列をコードする塩基配列を含有しているか否か
    を調べる工程が、被検試料の核酸を鋳型として、前記
    （ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の蛋白質をコードする
    ＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡの塩基配列を決定す
    る工程を含む請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】標準蛋白質のアミノ酸配列とは異なるア
    ミノ酸配列をコードする塩基配列を有しているか否かを
    調べる工程が、被検試料の核酸を鋳型として、前記
    （ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の蛋白質のアミノ酸配
    列をコードするＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡを電
    気泳動してその移動度を測定する工程を含む請求項３０
    に記載の方法。
  33. 【請求項３３】標準蛋白質のアミノ酸配列とは異なるア
    ミノ酸配列をコードする塩基配列を有しているか否かを
    調べる工程が、被検試料の核酸又は該核酸の増幅物と、
    配列番号４、５、６もしくは５４のいずれかで示される
    塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポ
    リペプチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイ
    ズすることができる１０塩基以上５０００塩基以下の塩
    基からなるポリヌクレオチドとの、ストリンジェントな
    条件下におけるハイブリダイゼーションのパターンを調
    べる工程を含む請求項３０に記載の方法。
  34. 【請求項３４】標準蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号
    １、２又は３で示されるアミノ酸配列である請求項３０
    〜３３のいずれかに記載の方法。
  35. 【請求項３５】哺乳動物細胞に、請求項１又は２記載の
    ＤＮＡを、当該ＤＮＡが前記細胞で発現する位置に置か
    れるように提供する工程を含む哺乳動物細胞におけるdr
    ebrin1の発現促進方法。
  36. 【請求項３６】前記哺乳動物細胞が、精神遅滞を伴なう
    疾患又はアルツハイマー症に羅患していると診断されう
    る哺乳動物の体内にある細胞である、請求項３５記載の
    方法。
  37. 【請求項３７】請求項１又は２に記載のＤＮＡを有効成
    分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中
    に製剤化されてなる遺伝子治療剤。
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