JP2002543845A - 植物における獲得耐性遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物における新規獲得耐性遺伝子を記載する。疾患に対して耐性であるトランスジェニック植物を作製するための該遺伝子の使用方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、植物における獲得耐性遺伝子およびその使用方法に関する。特に、
本発明は、獲得耐性遺伝子をコードする新規核酸配列、獲得耐性遺伝子を含有す
る形質転換宿主細胞およびトランスジェニック植物、ならびに植物における病原
体に対する耐性を付与するための使用方法を開示する。また、該形質転換宿主細
胞およびトランスジェニック植物の製造方法も開示する。

【０００２】 （発明の背景） 植物は、細菌、ウイルス、真菌および線虫を含むそれらの環境の多数の生息動
物にさらされる。これらの生物と植物との間の相互作用の多く（特に、植物の根
を介するもの）は有益であるが、その相互作用の多くは植物に有害である。植物
病原体、特に真菌病原体により引き起こされる疾患による農作物、観賞植物およ
び他の植物の枯死は、甚大な経済的影響を及ぼす世界的な問題である。

【０００３】 植物に対する損害は、多数の属の病原体により引き起こされる。これらの属に
は、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔ
ａ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｉ
ｓ）、セルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）、コレトトリチュム（Ｃｏｌｌｅ
ｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ディプロディア（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エルウィニア（
Ｅｒｗｉｎｉａ）、うどんこ病菌属（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）、フザリウム（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ）、ゲウマノマイセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘルミント
スポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、マクロフォミナ（Ｍａｃｒ
ｏｐｈｏｍｉｎａ）、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、コタマカビ（
Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、アカツブタケ（Ｎｅｃｔｒｉａ）、ツユカビ
（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）、フォーマ（Ｐｈｏｍａ）、フィマトトリチュム（
Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、エキビョウキン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ
）、タンジクツユカビ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓ
ｐｈａｅｒａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、プクシニア（Ｐ
ｕｃｃｉｎｉａ）、プチウム（Ｐｕｔｈｉｕｍ）、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏ
ｐｈｏｒａ）、イモチキン（Ｐｒｉｃｕｌａｒｉａ）、フハイカビ（Ｐｙｔｈｉ
ｕｍ）、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、セロチウム（Ｓｃｅｒｏｔ
ｉｕｍ）、キンカクキン（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、セプトリア（Ｓｅｐｔｏ
ｒｉａ）、チエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）、ウンシヌラ（Ｕ
ｎｃｉｎｕｌａ）、ベンツリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）、ベルティシリウム（Ｖｅ
ｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）およびキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）が含
まれる。

【０００４】 これらの種々の病原体と戦うために、多数の化合物が開発されている。化学抗
真菌剤の具体例には、ポリオキシン、ニッコウマイシン、カルボキシアミド、芳
香族炭水化物、カルボキシン、モルホリン、ステロール生合成インヒビターおよ
び有機リン化合物（ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎおよびＷａｌｋｅｒ，１９８３；米
国特許第５，４２１，８３９号）が含まれる。これらの化合物の活性は、典型的
には、いくつかの種に制限される。病原性真菌の数の多さ及び多様性の結果とし
て、これらの化合物は、植物における感染症の抑制に対する有効な解決をもたら
していない。

【０００５】 植物における病原性感染症を防除するためのもう１つのアプローチは、耐性を
付与するために植物の自然防御メカニズムを利用することを含む。多数の植物は
、いくつかの病原体に対する自然耐性を発達させてきた。しかし、耐性は或る属
の病原体に制限されたり、あるいは作物栽培学的に関心のある作物が、十分な耐
性を示さないことがある。したがって、自然植物防御は、病原体に対する十分な
防御をもたらさないことが多い。病原体防御のスペクトルを広げたり防御応答を
強化することにより、既存の耐性メカニズムを増強し病原体防御を促すことが、
そうでなければ感受性である植物において可能かもしれない。

【０００６】 植物の自然防御メカニズムは、それが存在し活性である場合には、病原体の集
落形成および疾患を予防するのに非常に有効である。耐性は、受動的および能動
的な構成的および誘導性な要素で重層化される（Ｂａｋｅｒら，１９９７；Ｋｅ
ｅｎ，１９９０；Ｒｙａｌｓら，１９９６）。誘導性防御は、病原体の攻撃部位
における局在化細胞死または過敏性反応（ＨＲ）を病原体の攻撃部位において誘
発するように病原体決定因子またはエリシター（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）の植物認識
の作用を介して活性化されうる（Ｄｉｘｏｎら，１９９４）。この局在化アポト
ーシス細胞死は、しばしば、該病原体内の特異的対応「無毒性（アビルレンス）
」産物を認識する耐性遺伝子（Ｒ−遺伝子）により媒介される（Ｇｒｅｅｎｂｅ
ｒｇ，１９９７）。病原体の攻撃の局所認識は、サリチル酸（ＳＡ）を含む伝達
可能なシグナルを介して遠隔組織に伝達されて、遺伝子発現を更に活性化し、全
身性獲得耐性（ＳＡＲ；Ｒｙａｌｓら，１９９６；Ｓｔｉｃｈｅｒら，１９９７
）として公知の状態を調整する。ついで、耐性は、病原体の攻撃領域付近で局所
獲得耐性として発現されうる又は誘発シグナルおよび植物種に応じて全身的に誘
導されうることが判明した。したがって、該全身性および局所性応答は、獲得耐
性（ＡＲ）と総称される。ＡＲの確立は植物の強力な防御線である。なぜなら、
それは、それがなければ疾患を引き起こすであろうウイルス、細菌および真菌の
攻撃に対する広域スペクトル耐性をもたらしうるからである（Ｃａｍｅｒｏｎら
，１９９４；Ｇｏｒｌａｃｈら，１９９６；Ｒｙａｌｓら，１９９６）。該ＡＲ
応答は、感染特異的（ＰＲ）タンパク質をコードする１組の遺伝子の転写活性化
を誘発する。これらには、ヒドロラーゼ、細胞壁強化タンパク質、酸化的バース
トに関与するタンパク質（それらの組合せは耐性の増強を促進すると考えられて
いる）が含まれる（Ｓｔｉｃｈｅｒら，１９９７）。

【０００７】 生化学的および遺伝的分析は、獲得耐性に関連した遺伝子および分子シグナル
を既に同定している。Ｎｐｒ１／Ｎｉｍ１遺伝子は、広域スペクトルの真菌およ
び細菌病原体に対するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＡＲ防御に
おける重要な調節的役割を果たす（Ｃａｏら，１９９４；Ｃａｏら，１９９７;
Ｄｅｌａｎｅｙ，１９９５;Ｒｙａｌｓら，１９９７;ＷＯ ９８／０６７４８；
ＷＯ ９４／１６０７７；ＷＯ ９８／２６０８２）。突然変異体ｎｐｒ１植物
は、無毒性病原体の攻撃の後、正常なＨＲを誘導し、ＳＡを蓄積するが、それら
はＰＲタンパク質を蓄積せずＡＲ応答を活性化しない。このことは、このタンパ
ク質が、サリチル酸より下流の経路において機能することを示唆している（Ｃａ
ｏら，１９９４；Ｃａｏら，１９９７;Ｄｅｌａｎｅｙら，１９９５）。Ｎｐｒ
１タンパク質の特徴は、転写調節体としての役割を示唆しており、タンパク質−
タンパク質相互作用に伴われるアンキリンリピートなどのモチーフ；核局在化シ
グナル；推定リン酸化部位；および哺乳類系における転写調節因子であるＩＦκ
Ｂに対する相同性を含む（Ｃａｏら，１９９７；Ｒｙａｌｓら，１９９７）。活
性化Ｎｐｒ１の核転位が示されており、このことは、転写調節におけるその考え
られうる役割を補強するものである（ＷＯ ９８／０６７４８）。双子葉植物に
おけるＮｐｒ１の中心的重要性は更に、真菌および細菌の両方の病原体に対する
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉ）の耐病性の増強を招いた該クロー
ン化遺伝子のトランスジェニック過剰発現により立証された（Ｃａｏら，１９９
８；ＷＯ ９８／０６７４８）。

【０００８】 膨大なＡＲ研究は双子葉植物における経路を明らかにしたが、コムギ、イネ、
オオムギなどの単子葉植物は、病原体の攻撃を防御する誘導可能な経路を有する
（ＨｗａｎｇおよびＨｅｉｔｅｆｕｓｓ，１９８２；Ｋｍｅｃｌら，１９９５；
Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒら，１９８９；ＳｍｉｔｈおよびＭｅｔｒａｕｘ，１９９１
）。獲得耐性は、無毒性病原体の攻撃（Ｍａｎａｎｄｈａｒら，１９９８；Ｓｃ
ｈａｆｆｒａｔｈら，１９９７）、病原体のエリシターの暴露（Ｊｉｎら，１９
９７；Ｓｃｈａｆｆｒａｔｈら，１９９５；Ｗａｓｐｉら，１９９８）、および
化学処理、例えばＳＡまたはＳＡ類似体（例えば２，６−ジクロロイソニコチン
酸（ＩＮＡ）またはベンゾ（１，２，３）チオジアゾール−７−カルボチオ酸Ｓ
−メチルエステル（ＢＴＨ））の適用などを含む種々の外部刺激により調整され
うる（Ｇｏｒｌａｃｈら，１９９６；Ｋｅｓｓｍａｎら，１９９４；Ｋｏｇｅｌ
ら，１９９４；Ｍａｎａｎｄｈａｒら，１９９８；Ｓｃｈａｆｆｒａｔｈ，１９
９７；Ｗａｔａｎａｂｅら，１９７９）。単子葉および双子葉植物における同一
クラスの活性化化合物によるＡＲ経路の誘導能を仮定すれば、シグナリング経路
の部分的保存が存在する可能性がある。なぜなら、ＰＲ遺伝子のサブセットがど
ちらのグループにおいても誘導されるらしいからである（Ｍｏｒｒｉｓら，１９
９８）。しかし、研究は、新規クラスのＰＲ遺伝子に関連づけられる新たな経路
を示すＡＲの誘導物質に関する単子葉植物における顕著な相違をも指摘している
（Ｇｏｒｌａｃｈら，１９９６；Ｓｃｈａｆｆｒａｔｈら，１９９７）。単子葉
植物においては、誘導される獲得耐性は広域スペクトルのものであり、病原体種
には無関係に真菌および細菌有害生物にまで及び、活性化された耐性は数週間か
ら数ヶ月持続する。したがって、単子葉植物におけるＡＲ経路の操作は、耐性の
遺伝的起源が存在しない病原体に対する耐性を促進しうる。

【０００９】 したがって、コムギ、イネなどの単子葉作物から疾患の防御において中心的な
役割を果たす遺伝子を同定することが必要とされている。トランスジェニック植
物におけるこれらの遺伝子の過剰発現は、ある微生物病原体に対する耐病性のレ
ベルを増強すると予想される。したがって、Ｎｐｈ１と称される、イネから単離
された遺伝子、およびＮｐｈ２と称されるコムギから単離された遺伝子は、ＡＲ
を刺激することが知られている化学エリシターにより誘導される。したがって、
ＡＲの活性化およびＮｐｈ１およびＮｐｈ２の発現の誘導は、生物寄生性（ｂｉ
ｏｔｒｏｐｈｉｃ）病原体に対してコムギおよびイネを防御すると予想される。
Ｎｐｈ１およびＮｐｈ２のトランスジェニック過剰発現は、病原体の攻撃に際し
て、より強力なＡＲを決定して、より有効な疾患防御を促進するはずである。

【００１０】 （発明の概要） 本発明は、植物の獲得耐性（ＡＲ）経路における鍵となる調節遺伝子の知見お
よび用途に関する。Ｎｐｈ１およびＮｐｈ２と称されるそれぞれイネおよびコム
ギからの遺伝子を単離し特徴づけた。本発明の特定の実施形態においては、Ｎｐ
ｈ１およびＮｐｈ２との同一性を共有する遺伝子は、植物の獲得耐性経路の鍵と
なる調節体である。過剰発現は、真菌、細菌およびウイルス病原体を含む（これ
らに限定されるものではない）多種多様な病原体に対する増強された耐病性を有
するトランスジェニック植物を与える。

【００１１】 １つの態様においては、本発明は、イネ（配列番号１）およびコムギ（配列番
号５および６）における獲得耐性を促進しうる新規核酸配列を提供する。

【００１２】 もう１つの態様においては、本発明は、ａ）配列番号４、１０または１１のタ
ンパク質配列をコードするそれぞれ配列番号１、５または６のヌクレオチド配列
；ｂ）遺伝暗号の縮重により、配列番号１、５または６のヌクレオチド配列にコ
ードされるそれぞれ配列番号４、１０または１１のタンパク質配列をコードする
ヌクレオチド配列；ならびにａ）およびｂ）に記載の任意のヌクレオチド配列に
ハイブリダイズするヌクレオチド配列よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列
である又はそれに相補的である単離されたＤＮＡ分子を提供する。

【００１３】 さらにもう１つの態様において、本発明は、配列番号４、１０または１１の少
なくとも１５アミノ酸の連続的アミノ酸配列を含む獲得耐性遺伝子ポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列を提供する。

【００１４】 さらにもう１つの態様において、本発明は、イネ（配列番号４）およびコムギ
（配列番号１０および１１）における獲得耐性を促進しうる新規タンパク質配列
を提供する。

【００１５】 さらにもう１つの態様において、本発明は、該植物の獲得耐性を増強するのに
十分な量で配列番号１、５または６のヌクレオチド配列を植物に付与することに
よる、植物病原体の防除方法を開示する。

【００１６】 本発明のもう１つの実施形態においては、種々の病原体に対する獲得耐性を促
進する核酸配列を含む植物細胞またはトランスジェニック植物、および同様に該
核酸配列を含むそのような植物からの種子または子孫を提供する。

【００１７】 （図面の簡単な記載） 図１は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびニコチアナ・グル
チノサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９
９８）由来のＮｐｒ１双子葉植物ホモログに関する推定アミノ酸配列ならびにト
ウモロコシ（Ｃｏｒｎ）クローン７００２１４８７２配列（配列番号１７）のア
ライメントを示す。

【００１８】 図２は、プラスミドｐＭＯＮ３８２０１を示す。

【００１９】 図３は、ＩＮＡでの化学処理によるイネ（ｃｖ．Ｍ２０２）におけるＡＲの誘
導、およびイネいもち病菌（マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ
ｇｒｉｓｅａ））に対する防御を示す。図３ａは、未処理対照葉の外観であり
、図３ｂは、０．５ｍＭ ＩＮＡで処理された葉の外観である。どちらの葉も、
処理の３日後にマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅ
ａ）で攻撃し、７日後に評価（写真撮影）した。

【００２０】 図４は、ＩＮＡ処理後およびイネいもち病菌（マグナポルセ・グリセア（Ｍａ
ｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ））での攻撃後の、ノーザンブロット分析に
よるイネＮｐｈ１の誘導パターンを示す。

【００２１】 図５は、ＩＮＡ処理後のコムギ（ｃｖ．ＴＡＭ１０７）におけるＡＲの誘導、
およびウドンコ病菌（エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉ
ｎｉｓ）ｆ ｓｐホルデイ（ｈｏｒｄｅｉ））に対する防御を示す。５ａ）は、
低い倍率の模擬噴霧対照を示し、５ｂ）は、より高い倍率の、より小さな選択領
域を示す。５ｃ）は、２００ｐｐｍのＩＮＡを噴霧した葉の一部の低い倍率の外
観を示し、５ｄ）は、より高い倍率の、同じ葉の、より小さな領域を示す。

【００２２】 図６は、ＩＮＡ処理後のコムギにおけるコムギＮｐｈ２遺伝子発現の誘導プロ
フィールのノーザンブロット分析を示す。ノーザンブロットをトウモロコシＥＳ
Ｔ ７００２１４８７２ Ｎｐｒ１ホモログでプローブした。各レーンに０．５
μｇのコムギｍＲＮＡをローディングした。レーン１：時間「０」の植物；レー
ン２：２４時間の時点のＩＮＡ処理植物；レーン３：４８時間の時点のＩＮＡ処
理植物；レーン４：７２時間の時点のＩＮＡ処理植物；レーン５：９６時間の時
点のＩＮＡ処理植物。

【００２３】 図７は、品種ＴＡＭ１０７におけるコムギＮｐｈ２の発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｌ）発現パターンのノーザンブロット分析を示す。ノーザンブロットを
０．７ｋｂのコムギＮｐｈ２ ＰＣＲ断片でプローブした。各レーンに１５μｇ
のコムギ（ｃｖ．Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）ｍＲＮＡをローディングした。レーン１：
根組織；レーン２：子葉鞘；レーン３：葉基；レーン４：葉断片１；レーン５：
葉断片２；レーン６：葉断片３；レーン７：葉断片４；レーン８：葉断片５（葉
の先端）。

【００２４】 図８は、内因性イネ５’リーダー配列と共にイネＮｐｈ１ ｃＤＮＡを含有す
る、イネの形質転換のためのｐＭＯＮ３０６４３バイナリープラスミドを示す。
該バイナリーコスミドベクターのＴ−ＤＮＡ構造は、ＬＢ＝左境界；ＲＢ＝右境
界；Ｐ−ｅ３５Ｓ＝カリフラワーモザイクウイルスの強化３５Ｓプロモーター；
Ｋａｎ＝Ｔｎ５ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩのコード領域；Ｎｏ
ｓ３’＝ノパリンシンターゼ遺伝子の終結配列を含む。

【００２５】 図９は、イネ５’リーダー配列を欠き該推定コード領域に対応するイネＮｐｈ
１ ｃＤＮＡを含有する、イネの形質転換のためのｐＭＯＮ３０６４０バイナリ
ープラスミドを示す。

【００２６】 図１０は、使用する推定コード領域に対応するコムギＮｐｈ２−１ ｃＤＮＡ
を含有する、イネの形質転換のためのｐＭＯＮ３０６３７バイナリープラスミド
を示す。

【００２７】 図１１は、内因性イネ５’リーダー配列を含有するイネＮｐｈ１ ｃＤＮＡを
含有する、イネの粒子射撃形質転換に使用するｐＭＯＮ３０６４５プラスミドを
示す。

【００２８】 図１２は、該推定コード領域に対応するコムギＮｐｈ２−１ ｃＤＮＡを含有
する、イネの粒子射撃形質転換に使用するｐＭＯＮ３０６４４プラスミドを示す
。

【００２９】 図１３は、コムギＮｐｈ２−１コード配列を含有する、コムギの形質転換のた
めのｐＭＯＮ３０６３５プラスミドを示す。

【００３０】 （配列表中の配列の簡単な説明） 配列番号１：推定コード領域のイネＮｐｈ１ ｃＤＮＡ配列。 配列番号２：５’および３’ＵＴＲを含むイネＮｐｈ１ ｃＤＮＡ完全長配列。 配列番号３：ＰＣＲ増幅から回収されたイネＮｐｈ１断片。 配列番号４：イネＮｐｈ１推定タンパク質配列。 配列番号５：推定コード領域のコムギＮｐｈ２−１ ｃＤＮＡ配列。 配列番号６：推定コード領域のコムギＮｐｈ２−２ ｃＤＮＡ配列。 配列番号７：５’および３’ＵＴＲを含むコムギＮｐｈ２−１ ｃＤＮＡ完全長
配列。 配列番号８：５’および３’ＵＴＲを含むコムギＮｐｈ２−２ ｃＤＮＡ完全長
配列。 配列番号９：ＰＣＲ増幅から回収されたコムギＮｐｈ２断片。 配列番号１０：コムギＮｐｈ２−１推定タンパク質配列。 配列番号１１：コムギＮｐｈ２−２推定タンパク質配列。 配列番号１２：ドメイン１：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ
１タンパク質（ａａ２７０−２７７）に対応する。 配列番号１３：ドメイン２：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ
１タンパク質（ａａ５０１−５０７）に対応する。 配列番号１４：単子葉植物熱増幅に使用するＯＢ０９プライマー。 配列番号１５：単子葉植物熱増幅に使用するＯＢ１１プライマー。 配列番号１６：トウモロコシクローン７００２１４８７２のヌクレオチド配列。 配列番号１７：トウモロコシクローン７００２１４８７２の推定アミノ酸配列。 配列番号１８：トウモロコシクローン７００１０２８１９のヌクレオチド配列。 配列番号１９：トウモロコシクローン７００１０２８１９の推定アミノ酸配列。 配列番号２０：トウモロコシコンティグＣＰＲ９５１．ＦＬＲのヌクレオチド配
列。 配列番号２１：トウモロコシコンティグＣＰＲ９５１．ＦＬＲの推定アミノ酸配
列。 配列番号２２：ＯＢ−０１プライマー。 配列番号２３：ＯＢ−０２プライマー。 配列番号２４：ＯＢ−１８プライマー。 配列番号２５：ＯＢ−１９プライマー。 配列番号２６：ＯＢ−２８プライマー。 配列番号２７：ＯＢ−２９プライマー。 配列番号２８：ＯＢ−３８プライマー。 配列番号２９：ＯＢ−３９プライマー。 配列番号３０：ＯＢ−６１プライマー。 配列番号３１：ＯＢ−６２プライマー。 配列番号３２：ＯＢ−６３プライマー。 配列番号３３：ＯＢ−６４プライマー。 配列番号３４：イネＮｃｏ１プライマー。 配列番号３５：ＮＳ−１０プライマー。 配列番号３６：抗体の産生に使用したトマトＮｐｒ１ホモログタンパク質配列。

【００３１】 （発明の詳細な記載） 定義 以下の用語に与えられた範囲を含む本明細書および特許請求の範囲が明瞭に一
貫して理解されるよう、以下の定義を記載する。

【００３２】 イネ由来の獲得耐性遺伝子（Ｎｐｒ１ ｈｏｍｏｌｏｇ １）は、以下、Ｎｐ
ｈ１（配列番号２）と称される。また、Ｎｐｈ１はＮｐｏ１（Ｎｐｒ１ ｈｏｍ
ｏｌｏｇ ｏｒｙｚａｅ １）と等価である。

【００３３】 コムギ由来の獲得耐性遺伝子（Ｎｐｒ１ ｈｏｍｏｌｏｇ ２）は、以下、Ｎ
ｐｈ２−１（配列番号７）およびＮｐｈ２−２（配列番号８）と称される。また
、Ｎｐｈ２−１およびＮｐｈ２−２は、それぞれＮｐｗ１およびＮｐｗ２（Ｎｐ
ｒ１ ｈｏｍｏｌｏｇ ｗｈｅａｔ １および２）と等価である。

【００３４】 トウモロコシ由来の獲得耐性遺伝子の部分配列（配列番号２０）は、Ｎｐｃ１
（Ｎｐｒ１ ｈｏｍｏｌｏｇ ｃｏｒｎ １）と等価である。

【００３５】 「獲得耐性」は、ある種の化合物（アクチベーター）で処理された又は不適合
性病原体で攻撃された植物における誘導可能な活性化防御メカニズムを意味する
。このように獲得された耐性は、広域スペクトルの種々の病原体による後続の感
染に対して植物を防御する。

【００３６】 「抗原エピトープ」は、該抗原エピトープと反応性の抗体の産生をもたらす免
疫応答を惹起しうる分子、タンパク質または核酸の任意の分離したセグメントを
意味する。

【００３７】 「コード配列」および「オープンリーディングフレーム」は、タンパク質、ポ
リペプチドまたはペプチド配列の連続した核酸トリプレットの領域を意味する。

【００３８】 「耐病性」は、植物病原体にさらされた後、耐病性を示さない感受性植物の場
合より少数の疾患徴候を現す植物の能力を意味する。耐病性は、疾患に対する完
全な耐性、および徴候の減弱、より長い生存期間または他の疾患パラメーター（
例えば、より高い収量）として現れる種々の程度の耐性を含む。

【００３９】 「相同（ホモログ）」は、配列同一性において７０％以上であることである。
該プローブ配列に非常に密接に関連した配列の有意な相同性は、該プローブに６
８℃で一晩（少なくとも１６時間）ハイブリダイズさせ、ストリンジェントな条
件（６８℃、０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳでの最終洗浄）で洗浄した配列
に関するものである。５０℃で２×ＳＳＣ中の最終洗浄は、該プローブに対して
約７５％の相同性を有する配列の同定を可能にする。しかし、ストリンジェンシ
ーと配列相同性との間の厳密な関係は、塩基組成、プローブの長さ、および相同
領域の長さに左右される（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ，１９８５）。好ま
しくは、該ハイブリダイゼーション条件は、ＴＭ値が３５℃〜４５℃であるハイ
ブリダイゼーションを意味する。最も好ましくは、有意な相同性は、ストリンジ
ェントな条件下で参照配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列に関するものである
。

【００４０】 「ハイブリダイゼーション」は、塩基の対合を介して相補鎖と結合する核酸鎖
の能力を意味する。ハイブリダイゼーションは、それらの２つの核酸鎖中の相補
的配列が互いに結合する際に生じる。

【００４１】 「過敏性反応」（ＨＲ）は、病原体に対する１つの植物防御である。それは、
活性化酸素種の生成、抗微生物性化合物の産生および宿主細胞壁の強化と相関す
る感染部位付近の急速な細胞壊死を含む。与えられた宿主上でＨＲを惹起する病
原体は、その宿主に対して無毒性であり、該宿主は耐性であり、該植物−病原体
相互作用は不適合性である。

【００４２】 「同一」なヌクレオチドまたはタンパク質配列は、デフォルトパラメーターを
使用してＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．
，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＢｅｓｔＦｉｔまたはＧＡＰなどのプログラム
を使用して判定される。

【００４３】 「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を意味す
る。

【００４４】 「植物」は、本明細書においては広義に用いられ、分化した植物、および適当
な条件下で成熟植物に発生しうる未分化の植物体、例えば、プロトプラスト、植
物細胞、種子、小植物など、それらの子孫、およびそれらの一部、例えば、挿木
およびそのような植物の果実を意味する。

【００４５】 「表現型」は、遺伝子型と環境との相互作用から生じた生物により示される形
質を意味する。

【００４６】 「ポリアデニル化シグナル」または「ポリＡシグナル」は、コード領域から転
写されたｍＲＮＡの３’末端へのアデニル酸ヌクレオチドの付加を促進する、該
コード領域の３’側に位置する核酸配列を意味する。

【００４７】 「プロモーター」または「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリメラーゼの認識
部位を又は正しい部位における転写の開始に必要な他の因子を提供することによ
りメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の産生を制御することによりコード配列の
発現を制御する、通常はコード配列の上流（５’側）に見出される核酸配列を意
味する。

【００４８】 「組換え核酸ベクター」は、ゲノムへの組込み又は自律的複製が可能な、任意
の起源に由来するプラスミド、コスミド、ウイルス、自律的に複製する配列、フ
ァージ、または直鎖状もしくは環状の一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲ
ＮＡヌクレオチドセグメントなどの任意の因子を意味し、それは、機能的に作動
的な様態で１以上の核酸配列が連結した核酸分子を含む。そのような組換え核酸
構築物またはベクターは、５’調節配列またはプロモーター領域、および選択さ
れた遺伝子産物のＤＮＡ配列を、該ＤＮＡ配列が機能的ｍＲＮＡに転写され次い
でポリペプチドまたはタンパク質に翻訳される様態で、細胞内に導入しうる。組
換え核酸構築物または組換えベクターは、関心のある特定のＲＮＡの翻訳を抑制
するためにアンチセンスＲＮＡを発現しうるように構築することができる。

【００４９】 「再生」は、植物を植物細胞（例えば、植物プロトプラストまたは外植片）か
ら成長させる過程を意味する。

【００５０】 「耐性遺伝子」は、最終的にいずれかの病原体または昆虫に対する植物防御応
答を該植物とその特定の病原体または昆虫との接触時に導くシグナル伝達経路の
誘導に直接的または間接的に関与するタンパク質をコードする核酸単離体である
。耐性遺伝子産物は、エリシターと称される病原体シグナル分子に応答して活性
化される。

【００５１】 「選択マーカー」は、発現されると、該核酸配列を含有する細胞の同定を容易
にする表現型を付与する核酸配列を意味する。選択マーカーは、毒性化学物質に
対する耐性（例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、グリフォセート耐
性）を付与するもの、栄養欠損（例えば、ウラシル、ヒスチジン、ロイシン）を
相補するもの、または視覚的に区別される特性（例えば、変色または蛍光）を付
与するものを含む。

【００５２】 「構造遺伝子」は、あるポリペプチドを産生するよう発現される遺伝子を意味
する。

【００５３】 「構造コード配列」は、該構造コード配列がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ
）に転写され次いで該ｍＲＮＡが所望のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク
質産物に翻訳された後に細胞により産生されるペプチド、ポリペプチドまたはタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列を意味する。

【００５４】 「転写」は、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡコピーを産生する過程を意味する。

【００５５】 「形質転換」は、外因性核酸配列（例えば、ベクター、組換え核酸分子）を、
その外因性核酸が染色体内に組込まれる又は自律的に複製されうる細胞またはプ
ロトプラスト内に導入する過程を意味する。

【００５６】 「トランスジェニック」は、外因性核酸配列が組込まれた生物に関するもので
ある。

【００５７】 「ベクター」は、外因性ＤＮＡを宿主生物内に運搬するプラスミド、コスミド
、バクテリオファージまたはウイルスを意味する。

【００５８】 本発明は、植物における獲得耐性遺伝子、およびその使用方法に関する。特に
、本発明は、植物における獲得耐性遺伝子を活性化する遺伝子をコードする新規
核酸配列、獲得耐性遺伝子を含有する形質転換宿主細胞およびトランスジェニッ
ク植物、ならびに植物における病原体に対する耐性を付与するための使用方法を
開示する。また、該形質転換宿主細胞およびトランスジェニック植物の製造方法
も開示する。

【００５９】 核酸配列 本発明はまた、配列番号１に対して少なくとも約７０％、より好ましくは、配
列番号１に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同
一である、最も好ましくは配列番号１である核酸配列を含む核酸配列に関する。

【００６０】 あるいは、該核酸配列は、好ましくは、配列番号５に対して少なくとも約７０
％同一である、より好ましくは、配列番号５に対して少なくとも約７５％、８０
％、８５％、９０％または９５％同一である、最も好ましくは、配列番号５であ
る。

【００６１】 あるいは、該核酸配列は、好ましくは、配列番号６に対して少なくとも約７０
％同一である、より好ましくは、配列番号６に対して少なくとも約７５％、８０
％、８５％、９０％または９５％同一である、最も好ましくは、配列番号６であ
る。

【００６２】 該構造核酸配列は、種々の種の植物、動物、細菌および真菌から得る（すなわ
ち、クローン化または単離する）ことができ、本発明において使用することがで
きる。好ましくは、該構造核酸配列は、植物、真菌または細菌由来である、また
は化学的に合成されたものである。

【００６３】 核酸のハイブリダイゼーション 該核酸配列は更に、それが相補的配列にハイブリダイズする能力により同定す
ることができる。核酸のハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ操作の当業者によく
知られた技術である。与えられた核酸対のハイブリダイゼーション特性は、それ
らの類似性または同一性の指標となる。

【００６４】 標的配列に対して、より低い配列同一性を有する配列を選択するためには、低
いストリンジェンシーの条件を用いることができる。約２０℃〜約５５℃の範囲
の温度で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍ塩化ナトリウムなどの条件を用いることが望
ましいかもしれない。

【００６５】 開示されている配列に対して、より高い同一性を有する配列を選択するために
は、高いストリンジェンシーの条件を用いることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら
，１９８９）。

【００６６】 該高ストリンジェンシー条件は、典型的には、約５０℃〜約７０℃で数時間〜
一晩のインキュベーションによる、約２×〜約１０×ＳＳＣ（蒸留水中に３Ｍ塩
化ナトリウムおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含有する２０
×ＳＳＣストックから希釈されたもの）、２．５×〜約５×デンハルト液（蒸留
水中に１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、１％（ｗ／ｖ）フィコールおよび１
％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドンを含有する５０×ストック溶液から希釈され
たもの）、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ魚類精子ＤＮＡおよび約０．
０２％（ｗ／ｖ）〜約０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中の核酸ハイブリダイゼーショ
ンを含む。該高ストリンジェンシー条件は、好ましくは、５５℃で数時間のイン
キュベーションによる、６×ＳＳＣ、５×デンハルト液、１００ｍｇ／ｍＬ魚類
精子ＤＮＡおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳにより提供される。

【００６７】 一般には、該ハイブリダイゼーション後に、いくつかの洗浄工程を行なう。該
洗浄組成物は、一般には、約２０℃〜約７０℃での１５分間のインキュベーショ
ンに付される０．５×〜約１０×ＳＳＣ、および０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．
５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む。好ましくは、該核酸セグメントは、６５℃で０．
１×ＳＳＣ中で少なくとも１回洗浄した後にもハイブリダイズしたままである。

【００６８】 該核酸配列は、好ましくは、低い又は高いストリンジェンシーの条件下で配列
番号１またはその相補体にハイブリダイズする。あるいは、該核酸配列は、好ま
しくは、低い又は高いストリンジェンシーの条件下で配列番号５またはその相補
体にハイブリダイズする。あるいは、該核酸配列は、好ましくは、低い又は高い
ストリンジェンシーの条件下で配列番号６またはその相補体にハイブリダイズす
る。

【００６９】 タンパク質配列 本発明は、好ましくは、配列番号４に対して少なくとも約７０％、より好まし
くは、配列番号４に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％または
９５％同一である、最も好ましくは配列番号４であるタンパク質配列に関する。

【００７０】 あるいは、該タンパク質配列は、好ましくは、配列番号１０に対して少なくと
も約７０％、より好ましくは、配列番号１０に対して少なくとも約７５％、８０
％、８５％、９０％または９５％同一である、最も好ましくは配列番号１０であ
る。

【００７１】 あるいは、該タンパク質配列は、好ましくは、配列番号１１に対して少なくと
も約７０％、より好ましくは、配列番号１１に対して少なくとも約７５％、８０
％、８５％、９０％または９５％同一である、最も好ましくは配列番号１１であ
る。

【００７２】 配列番号４、１０または１１のタンパク質の研究および適用を更に補助するた
めに、抗体を製造することができる。これらの抗体は、抗原エピトープを提供す
るタンパク質の任意の部分に対して産生させることができる。該抗体はポリクロ
ーナルまたはモノクローナルでありうる。そのような抗体は、好ましくは、配列
番号４、１０または１１と免疫反応性である。

【００７３】 配列番号４、１０または１１に対して少なくとも約７０％〜１００％同一であ
るタンパク質は、好ましくは、そのような抗体と反応性である。

【００７４】 該抗体は、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫ブロット、ウエスタンブ
ロット、免疫蛍光、免疫沈降または適当な他の任意の技術により配列番号４、１
０または１１の存在を検出するために使用することができる。さらに、配列番号
４、１０または１１を検出するために前記の抗体を使用するこれらの技術の１以
上を含むキットを設計することができる。

【００７５】 コドン使用頻度 遺伝暗号の縮重のため、ある特定のアミノ酸に対して、種々のヌクレオチドコ
ドンが用いられうる。宿主細胞は、しばしば、コドン使用頻度の好ましいパター
ンを示す（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，１９９０）。核酸配列は、好ましくは、その特
定の宿主細胞のコドン使用頻度パターンを利用するよう構築する。これは、一般
には、形質転換宿主細胞における該核酸配列の発現を増強する。本明細書に開示
する核酸配列は、好ましくは、細菌、真菌および植物宿主細胞に関する最適なコ
ドン使用頻度を利用する。

【００７６】 獲得耐性に関するタンパク質をコードする核酸配列の修飾 獲得耐性タンパク質をコードする核酸配列における変異は、本明細書に開示す
る配列と比較して同等または優れた獲得耐性特性を示す突然変異獲得耐性タンパ
ク質配列を与えうる。突然変異は、欠失、挿入、トランケート化、置換、融合、
サブユニット配列のシャフリングなどを含む。

【００７７】 核酸配列に対する突然変異は、特異的またはランダムに導入することができ、
それらのどちらの方法も、分子生物学の当業者によく知られている。典型的には
、核酸配列内の特定の位置に突然変異を導入するためにオリゴヌクレオチドを使
用する無数の部位特異的突然変異誘発技術が存在する。具体例には、一本鎖レス
キュー（Ｋｕｎｋｅｌ，１９８５）、ユニーク部位の除去（ＤｅｎｇおよびＮｉ
ｃｋｌｏｆｆ，１９９２）、ニック保護（Ｖａｎｄｅｙａｒら，１９８８）およ
びＰＣＲ（Ｃｏｓｔａら，１９９６）が含まれる。ランダムまたは非特異的突然
変異は、ニトロソグアニジン（Ｃｅｒｄａ−Ｏｌｍｅｄｏら，１９６８；Ｇｕｅ
ｒｏｌａら，１９７１）、２−アミノプリン（ＲｏｇａｎおよびＢｅｓｓｍａｎ
，１９７０）などの化学物質により（一般的総説としては、Ｓｉｎｇｅｒおよび
Ｋｕｓｍｉｅｒｅｋ，１９８２を参照されたい）または突然変異誘発株による継
代（Ｇｒｅｅｎｅｒら，１９９７）などの生物学的方法により作製することがで
きる。

【００７８】 該修飾は、該アミノ酸配列内の保存的または非保存的変化をもたらしうる。保
存的変化は、該タンパク質の最終的なアミノ酸配列を改変しない該核酸配列内の
付加、欠失、置換などから生じる。非保存的変化は、アミノ酸配列の改変をもた
らす付加、欠失および置換を含む。

【００７９】 前記の改変を行なうための追加的な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５）；
Ｂａｕｅｒら（１９８５）；Ｃｒａｉｋ（１９８５）；Ｆｒｉｔｓ Ｅｃｋｓｔ
ｅｉｎら（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；Ｓｍｉｔｈら（１９
８１）；Ｏｓｕｎａら（１９９４）；およびＷａｌｄｅｒら（１９８６）に記載
されている。

【００８０】 修飾および変化は、本発明のタンパク質、およびそれをコードし、所望の耐性
特性を有するタンパク質をコードする機能的分子を尚も与える核酸セグメントの
配列内に施すことができる。以下は、等価体または恐らくは改善された２世代分
子を作製するためのタンパク質のアミノ酸配列の変化に基づく考察である。アミ
ノ酸の変化は、当技術分野で公知の標準的なコドン表に従い該核酸配列のコドン
を変化させることにより達成されうる。

【００８１】 タンパク質配列内のアミノ酸は、容易に認識される酵素活性の喪失を伴うこと
なく、ある種の他のアミノ酸で置換することができる。したがって、開示されて
いるタンパク質配列のペプチド配列またはそれらの対応する核酸配列内に、容易
に認識される生物活性の喪失を伴うことなく、種々の変化を施すことができると
意図される。

【００８２】 そのような変化を施す場合には、アミノ酸の疎水親水指数を考慮することがで
きる。あるタンパク質に相互作用性生物学的機能を付与する際の疎水親水アミノ
酸指数の重要性は、当技術分野において一般に理解されている（Ｋｙｔｅおよび
Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対疎水親水特性は、得られるタ
ンパク質の二次構造に寄与し、そしてそれは該タンパク質と他の分子（例えば、
酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を決定すると一般
に認められている。

【００８３】 各アミノ酸に、その疎水性および荷電特性に基づき疎水親水指数（ｈｙｄｒｏ
ｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）が割り当てられている。これらは、イソロイシン（
＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（
＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；ア
ラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン
（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン
（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸／グルタミン／アスパラ
ギン酸／アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（
−４．５）である。

【００８４】 ある種のアミノ酸は、類似した疎水親水指数または数値を有する他のアミノ酸
で置換されても、類似した生物活性を有するタンパク質を尚も与えうる、すなわ
ち、生物学的に機能的なタンパク質を尚も与えうることが、当技術分野において
公知である。そのような変化を施す際には、疎水親水指数が±２以内のアミノ酸
の置換が好ましく、±１以内のものがより好ましく、±０．５以内のものが最も
好ましい。

【００８５】 また、類似したアミノ酸の置換は、親水性に基づいて有効に行われると、当技
術分野において理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（Ｈｏｐｐ，
Ｔ．Ｐ．，１９８５年１１月１９日付け発行）は、隣接アミノ酸の親水性により
支配される、タンパク質の最大局所平均親水性が、該タンパク質の生物学的特性
と相関すると記載している。以下の親水性の数値が、アミノ酸に割り当てられて
いる：アルギニン／リシン（＋３．０）；アスパラギン酸／グルタミン酸（＋３
．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン／グルタミン（＋０．２）；グ
リシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン
／ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）
；バリン（−１．５）；ロイシン／イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２
．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。

【００８６】 アミノ酸は、類似した親水性の数値を有する別のアミノ酸で置換されても、類
似した生物活性を有するタンパク質を尚も与えうる、すなわち、生物学的に機能
的なタンパク質を尚も与えうると理解される。そのような変化を施す際には、疎
水親水指数が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものがより好ま
しく、±０．５以内のものが最も好ましい。

【００８７】 したがって、前記で大まかに説明したとおり、アミノ酸の置換は、アミノ酸側
鎖置換基の相対類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに
基づく。前記の種々の特性を考慮した典型的な置換が当業者によく知られており
、それらには、アルギニンおよびリシン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；
セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロ
イシンおよびイソロイシンが含まれる。有利とは予想されない変化もまた、これ
らが機能的獲得耐性タンパク質を与える場合には利用されうる。

【００８８】 組換えベクター 組換えベクターを製造するためには、前記の任意の構造核酸配列を使用するこ
とができる。該組換えベクターは、典型的には、５’から３’の配向で、構造核
酸配列の転写を指令するプロモーター、構造核酸配列、３’転写ターミネーター
および３’ポリアデニル化シグナルを含む。該組換えベクターは更に、非翻訳配
列、輸送およびターゲッティング配列、選択マーカー、エンハンサーまたはオペ
レーターを含みうる。

【００８９】 組換えベクターを製造するための手段は当技術分野においてよく知られている
。植物の形質転換に特に適した組換えベクターの製造方法は、米国特許第４，９
７１，９０８号、第４，９４０，８３５号、第４，７６９，０６１号および第４
，７５７，０１１号に記載されている。これらのタイプのベクターは、Ｒｏｄｒ
ｉｇｕｅｚら，１９８８、Ｇｌｉｃｋら，１９９３にも概説されている。

【００９０】 高等植物内での核酸の発現に有用な典型的なベクターは、当技術分野において
よく知られており、それらには、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘発性（Ｔｉ）プラ
スミド由来のベクター（Ｒｏｇｅｒｓら，１９８７）が含まれる。ｐＣａＭＶＣ
Ｎ導入対照ベクターを含む、植物の形質転換に有用な他の組換えベクターも記載
されている（Ｆｒｏｍｍら，１９８５）。

【００９１】 プロモーター 適当なプロモーターの選択は、それを使用することになる宿主細胞のタイプに
左右される。細菌、酵母および植物において機能するプロモーターはすべて、当
技術分野において十分に教示されている。

【００９２】 また、該プロモーターは、それが与える転写調節に基づいて選択することがで
きる。そのような調節には、転写活性の増強、誘導能、組織特異性および発生段
階特異性が含まれうる。植物に関しては、ウイルスまたは合成由来であり、構成
的に活性であり、時間的に調節され空間的に調節される誘導可能なプロモーター
が記載されている（Ｐｏｓｚｋｏｗｓｋｉら，１９８９；Ｏｄｅｌｌら，１９８
５；Ｃｈａｕら，１９８９）。

【００９３】 しばしば使用される構成的プロモーターには、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター
（Ｏｄｅｌｌ，１９８５）、強化ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサ
モザイクウイルス（Ｆｉｇｗｏｒｔ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＦＭＶ）プ
ロモーター（Ｒｉｃｈｉｎｓら，１９８７）、強化ＦＭＶプロモーター、マノピ
ンシンターゼ（ｍａｓ）プロモーター、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモー
ターおよびオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）プロモーターが含まれる。

【００９４】 有用な誘導性プロモーターには、サリチル酸またはポリアクリル酸（ＰＲ−１
，Ｗｉｌｌｉａｍｓら，１９９２）、またはＳＡ類似体、例えば２，６−ジクロ
ロイソニコチン酸（ＩＮＡ）もしくはベンゾ（１，２，３）チオジアゾール−７
−カルボチオ酸Ｓ−メチルエステル（ＢＴＨ）（Ｇｏｒｌａｃｈら，１９９６；
Ｋｅｓｓｍａｎら，１９９４）により誘導されるプロモーター、毒性緩和剤（置
換ベンゼンスルホンアミド除草剤、ＨｅｒｓｈｅｙおよびＳｔｏｎｅｒ，１９９
１）の適用により誘導されるプロモーター、熱ショックプロモーター（Ｏｕ−Ｌ
ｅｅ，１９８６；Ａｉｎｌｅｙら，１９９０）、ホウレンソウ硝酸レダクターゼ
配列由来の硝酸誘導性プロモーター（Ｂａｃｋら，１９９１）、ホルモン誘導性
プロモーター（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら，１９９０；Ｋａｒ
ｅｓら，１９９０）、ＷＣＩ−３プロモーター、ならびにＬＨＣＰファミリーお
よびＲｕＢＰカルボキシラーゼの小サブユニットに伴う光誘導性プロモーター（
Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒら，１９８９；Ｆｅｉｎｂａｕｍら，１９９１；Ｗｅｉｓ
ｓｈａａｒら，１９９１；ＬａｍおよびＣｈｕａら，１９９０；Ｃａｓｔｒｅｓ
ａｎａら，１９８８；Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔら，１９８９）が含まれる
。

【００９５】 組織特異的であり発生的に調節される有用なプロモーターの具体例には、β−
コングリシニン７Ｓプロモーター（Ｄｏｙｌｅら，１９８６；Ｓｌｉｇｈｔｏｎ
およびＢｅａｃｈｙ，１９８７）、および種子特異的プロモーター（Ｋｎｕｔｚ
ｏｎら，１９９２；Ｂｕｓｔｏｓら，１９９１；ＬａｍおよびＣｈｕａ，１９９
１；Ｓｔａｙｔｏｎら，１９９１）が含まれる。種子プラスチドにおける優先的
発現に有用な植物機能的プロモーターには、植物貯蔵タンパク質に由来するもの
、または脂肪種子における脂肪酸生合成に関与するタンパク質に由来するものが
含まれる。そのようなプロモーターの具体例には、ナピンなどの配列からの５’
調節領域（Ｋｒｉｄｌら，１９９１）、ファゼオリン、ゼイン、ダイズトリプシ
ンインヒビター、ＡＣＰ、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼおよびオレオシ
ン（ｏｌｅｏｓｉｎ）が含まれる。種子特異的調節は、ＥＰ ０ ２５５ ３７
８で考察されている。

【００９６】 また、適当なプロモーターは、病原体の感染に対する植物防御応答中に誘導さ
れうる。典型的には、病原体の感染は、該感染植物による多数の感染特異的（Ｐ
Ｒ）タンパク質の誘導を誘発する（Ｂｏｗｌｅｓ，１９９０；Ｂｏｌら，１９９
０；Ｇｏｒｌａｃｈら，１９９６；Ｌｉｎｔｈｏｒｓｔ，１９９１）。そのよう
なＰＲ配列は、フェニルプロパノイド代謝に関与する酵素（例えば、フェニルア
ラニンアンモニアリアーゼ、カルコンシンターゼ）、植物細胞壁を修飾するタン
パク質（例えば、ヒドロキシプロリンに富む糖タンパク質、グリシンに富むタン
パク質、ペルオキシダーゼ）、真菌細胞壁を分解する酵素（例えば、キチナーゼ
、グルカナーゼ）、タウマチン様タンパク質、リポキシゲナーゼ、システインプ
ロテアーゼ、または未知機能を有するタンパク質をコードしうる。遺伝子Ｐｉｒ
７ｂ（Ｗａｓｐｉら，１９９８）、Ｒｉｒ１ａ（Ｍａｕｃｈら，１９９８）、Ｒ
ｉｒ１ｂ（Ｍａｕｃｈら，１９９８）およびＷＩＲ１ａ（Ｂｕｌｌら，１９９２
）由来のプロモーターは、本発明において有用でありうる。

【００９７】 これらのＰＲ配列のプロモーターは入手可能であり、本発明において使用する
ことが可能である。これらのＰＲプロモーターの単離は、ジャガイモ植物（Ｆｒ
ｉｔｚｅｍｅｉｅｒら，１９８７；Ｃｕｙｐｅｒｓら，１９８８；Ｌｏｇｅｍａ
ｎｎら，１９８９；Ｍａｔｔｏｎら，１９８９；Ｓｃｈｒｏｄｅｒら，１９９２
）、タバコ植物（Ｍａｒｔｉｎｉら，１９９３）およびアスパラガス植物（Ｗａ
ｒｎｅｒら，１９９４）からのものが報告されている。

【００９８】 転写活性を増強するために（Ｃｏｍａｉ，Ｌ．およびＭｏｒａｎ，Ｐ．Ｍ．，
１９９２年４月２１日付け発行の米国特許第５，１０６，７３９号）または所望
の転写活性と組織特異性とを組合せるために、プロモーターハイブリッドも構築
することができる。

【００９９】 本発明において特に有用なプロモーターには、アグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘発
性プラスミド上に保持されているノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、マンノピンシ
ンターゼ（ｍａｓ）およびオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）プロモーター；カリ
フラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓプロモーター；強化
ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５
Ｓプロモーター；強化ＦＭＶ ３５Ｓプロモーター；リブロース−１，５−ビス
リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）由来の光誘導
性プロモーター；タバコ由来のＥＩＦ−４Ａプロモーター（Ｍａｎｄｅｌら，１
９９５）；４ＡＳＩプロモーター；ＲＢ７プロモーター；シロイヌナズナ（Ａｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＡｔＥＦ１プロモーター；ｈｓｐ９０プロモーター
；トウモロコシショ糖シンターゼ１（ＹａｎｇおよびＲｕｓｓｅｌｌ，１９９０
）；トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１（Ｖｏｇｅｌら，１９８９）；
トウモロコシ集光性複合体（Ｓｉｍｐｓｏｎ，１９８６）；トウモロコシ熱ショ
ックタンパク質（Ｏｄｅｌｌら，１９８５）；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓ）由来のキチナーゼプロモーター（Ｓａｍａｃら，１９９１）；ブロッ
コリー由来のＬＴＰ（脂質輸送タンパク質（Ｌｉｐｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ））プロモーター（Ｐｙｅｅら，１９９５）；ペチュニアカルコン
イソメラーゼ（Ｖａｎ Ｔｕｎｅｎら，１９８８）；ビーングリシンリッチタン
パク質１（Ｋｅｌｌｅｒら，１９８９）；ジャガイモパタチン（ｐａｔａｔｉｎ
）（Ｗｅｎｚｌｅｒら，１９８９）；トウモロコシ由来のユビキチンプロモータ
ー（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９２）；ｈｓｐ９０プロモーター（Ｍａｒ
ｒｓら，１９９３；Ｙａｂｅら，１９９４）；サトウキビバドナウイルスプロモ
ーター；イネＲＣ２プロモーター；およびイネ由来のアクチンプロモター（Ｍｃ
Ｅｌｒｏｙら，１９９０）が含まれる。これらのすべてのプロモーターは、植物
において発現されている種々のタイプのＤＮＡ構築物を作製するために使用され
ている。これに関しては、例えば、米国特許第５，０３４，３２２号を参照され
たい。

【０１００】 構造核酸配列 該構造核酸配列は、好ましくは、配列番号４に対して少なくとも約７０％同一
であるタンパク質をコードし、より好ましくは、配列番号４に対して少なくとも
約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるタンパク質をコード
し、最も好ましくは、配列番号４をコードする。

【０１０１】 あるいは、該構造核酸配列は、好ましくは、配列番号１０に対して少なくとも
約７０％同一であるタンパク質をコードし、より好ましくは、配列番号１０に対
して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるタン
パク質をコードし、最も好ましくは、配列番号１０をコードする。

【０１０２】 あるいは、該構造核酸配列は、好ましくは、配列番号１１に対して少なくとも
約７０％同一であるタンパク質をコードし、より好ましくは、配列番号１１に対
して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるタン
パク質をコードし、最も好ましくは、配列番号１１をコードする。

【０１０３】 あるいは、該核酸配列は、好ましくは、配列番号１に対して少なくとも約７０
％同一であり、より好ましくは、配列番号１に対して少なくとも約７５％、８０
％、８５％、９０％または９５％同一であり、最も好ましくは配列番号１である
。

【０１０４】 あるいは、該核酸配列は、好ましくは、配列番号５に対して少なくとも約７０
％同一であり、より好ましくは、配列番号５に対して少なくとも約７５％、８０
％、８５％、９０％または９５％同一であり、最も好ましくは配列番号５である
。

【０１０５】 あるいは、該核酸配列は、好ましくは、配列番号６に対して少なくとも約７０
％同一であり、より好ましくは、配列番号６に対して少なくとも約７５％、８０
％、８５％、９０％または９５％同一であり、最も好ましくは配列番号６である
。

【０１０６】 該構造核酸配列は更に、それが相補的配列にハイブリダイズする能力により同
定することができる。核酸のハイブリダイゼーションのための種々の条件が、当
技術分野において十分に教示されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９；Ａｕ
ｓｕｂｅｌら，１９９５）。該構造核酸配列は、好ましくは、低い又は高いスト
リンジェンシーの条件下、配列番号１またはその相補体にハイブリダイズする。
あるいは、該構造核酸配列は、好ましくは、低い又は高いストリンジェンシーの
条件下、配列番号５またはその相補体にハイブリダイズする。あるいは、該構造
核酸配列は、好ましくは、低い又は高いストリンジェンシーの条件下、配列番号
６またはその相補体にハイブリダイズする。

【０１０７】 該組換えベクターは更に、輸送ペプチドをコードする核酸配列を含みうる。こ
のペプチドは、細胞外腔または該細胞の内部または外部の何らかの他の区画へタ
ンパク質を導くのに有用でありうる。

【０１０８】 該構造核酸配列は、種々の種の植物、動物、細菌および真菌から得る（すなわ
ち、クローン化または単離する）ことができ、本発明において使用することがで
きる。好ましくは、該構造核酸配列は、植物、真菌または細菌由来であるか又は
化学合成されたものである。

【０１０９】 該組換えベクターの他の要素 ３’非翻訳領域は、典型的には、転写終結シグナルと、該ｍＲＮＡの３’末端
へのアデニル酸ヌクレオチドの付加を引き起こすように植物において機能するポ
リアデニル化シグナルとを提供する。これらは、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）
コード配列、ダイズ７Ｓ貯蔵タンパク質コード配列およびエンドウｓｓＲＵＢＩ
ＳＣＯ Ｅ９コード配列の３’領域から又はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミド（Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆら，米国
特許第５，５００，３６５号）から得ることができる。

【０１１０】 該組換えベクターは更に、選択マーカーを含みうる。該選択マーカーとして働
く核酸配列は、ある細胞において、該マーカーを含有しない細胞から該細胞を同
定するのを促進する細胞内表現型を与えるように機能する。有用な選択マーカー
には、ＧＵＳ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、抗生物質耐性配列および除草剤
（例えば、グリフォセート）耐性配列が含まれる。該選択マーカーは、好ましく
は、カナマイシン、ハイグロマイシンまたは除草剤耐性マーカーである。

【０１１１】 典型的には、ポリアデニル化部位の数百塩基対下流に位置する核酸配列が、転
写を終結させるように働く。これらの領域は、転写されたｍＲＮＡの効率的なポ
リアデニル化に要求される。

【０１１２】 翻訳エンハンサーはまた、該組換えベクターの一部として組込まれうる。した
がって、該組換えベクターは、好ましくは、該核酸配列の発現を増強するように
働く１以上の５’非翻訳リーダー配列を含有しうる。そのようなエンハンサー配
列は、得られたｍＲＮＡの翻訳効率を増強または改変するために望ましいかもし
れない。

【０１１３】 プローブおよびプライマー 相補的核酸配列に特異的にハイブリダイズしうる短い核酸配列を製造し本発明
において使用することができる。これらの短い核酸分子は、与えられたサンプル
中の相補的配列の存在を同定するためのプローブとして使用することができる。
したがって、ある特定の核酸配列の小さな部分に相補的な核酸プローブを構築す
ることにより、その配列の存在を評価することができる。これらのプローブの使
用は、ある特定の核酸配列（例えば、獲得耐性遺伝子をコードする核酸配列）を
含有するトランスジェニック植物の同定を著しく促進しうる。該プローブはまた
、獲得耐性遺伝子をコードする追加的な配列に関してｃＤＮＡまたはゲノムライ
ブラリーをスクリーニングするために使用することができる。

【０１１４】 あるいは、その短い核酸配列を、ＰＣＲ技術を用いて相補的核酸配列を増幅ま
たは突然変異させるためのオリゴヌクレオチドプライマーとして使用することが
できる。これらのプライマーはまた、関連相補的配列（例えば、他の種からの関
連核酸配列）の増幅を促進しうる。

【０１１５】 該プライマーまたはプローブは、一般には、同定し又は増幅し又は突然変異さ
せようとする核酸配列の一部に相補的である。該プライマーまたはプローブは、
その相補体と安定かつ配列特異的な二本鎖分子を形成するのに十分な長さを有す
るべきである。該プライマーまたはプローブは、好ましくは、約１０〜約２００
ヌクレオチド長、より好ましくは、約１０〜約１００ヌクレオチド長、より一層
好ましくは、約１０〜約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは、約１４〜約３０
ヌクレオチド長である。

【０１１６】 該プライマーまたはプローブは、直接的化学合成により、またはＰＣＲにより
（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号）、またはよ
り大きな核酸分子から該核酸特異的断片を切り出すことにより製造することがで
きる。

【０１１７】 トランスジェニック植物および形質転換宿主細胞 本発明はまた、５’から３’の配向で、構造核酸配列の転写を指令するプロモ
ーター、構造核酸配列、３’転写ターミネーターおよび３’ポリアデニル化シグ
ナルを含むトランスジェニック植物および形質転換宿主細胞に関する。

【０１１８】 該プロモーターは、種子選択的、組織選択的、構成的または誘導性でありうる
。そのようなプロモーターには、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシ
ンターゼ（ＯＣＳ）、マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）、カリフラワーモザイク
ウイルス１９Ｓおよび３５Ｓ（ＣａＭＶ１９Ｓ，ＣａＭ３５Ｓ）、強化ＣａＭＶ
（ｅＣａＭＶ）、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（ｓｓＲＵＢ
ＩＳＣＯ）、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）、強化ＦＭＶ、ＣａＭＶ
由来ＡＳ４、タバコＲＢ７、タバコＥＩＦ−４、レクチンタンパク質（Ｌｅ１）
、４ＡＳＩ、ＲＢ７、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡｔＥＦ１、
ｈｓｐ９０、イネＲＣ２プロモーター、ならびにサトウキビバドナウイルスプロ
モーターが含まれる。

【０１１９】 該構造核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも約７０％同一であるタンパ
ク質をコードし、より好ましくは、配列番号４に対して少なくとも約７５％、８
０％、８５％、９０％または９５％同一であるタンパク質をコードし、最も好ま
しくは、配列番号４をコードする。

【０１２０】 あるいは、該構造核酸配列は、配列番号１０に対して少なくとも約７０％同一
であるタンパク質をコードし、より好ましくは、配列番号１０に対して少なくと
も約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるタンパク質をコー
ドし、最も好ましくは、配列番号１０をコードする。

【０１２１】 あるいは、該構造核酸配列は、配列番号１１に対して少なくとも約７０％同一
であるタンパク質をコードし、より好ましくは、配列番号１１に対して少なくと
も約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるタンパク質をコー
ドし、最も好ましくは、配列番号１１をコードする。

【０１２２】 あるいは、該構造核酸配列は、好ましくは、配列番号１に対して少なくとも約
７０％同一であり、より好ましくは、配列番号１に対して少なくとも約７５％、
８０％、８５％、９０％または９５％同一であり、最も好ましくは配列番号１で
ある。

【０１２３】 あるいは、該構造核酸配列は、好ましくは、配列番号５に対して少なくとも約
７０％同一であり、より好ましくは、配列番号５に対して少なくとも約７５％、
８０％、８５％、９０％または９５％同一であり、最も好ましくは配列番号５で
ある。

【０１２４】 あるいは、該構造核酸配列は、好ましくは、配列番号６に対して少なくとも約
７０％同一であり、より好ましくは、配列番号６に対して少なくとも約７５％、
８０％、８５％、９０％または９５％同一であり、最も好ましくは配列番号６で
ある。

【０１２５】 該構造核酸配列は更に、それが相補的配列にハイブリダイズする能力により同
定することができる。核酸のハイブリダイゼーションのための種々の条件が、当
技術分野において十分に教示されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９；Ａｕ
ｓｕｂｅｌら，１９９５）。該構造核酸配列は、好ましくは、低い又は高いスト
リンジェンシーの条件下、配列番号１またはその相補体にハイブリダイズする。
あるいは、該構造核酸配列は、好ましくは、低い又は高いストリンジェンシーの
条件下、配列番号５またはその相補体にハイブリダイズする。あるいは、該構造
核酸配列は、好ましくは、低い又は高いストリンジェンシーの条件下、配列番号
６またはその相補体にハイブリダイズする。

【０１２６】 該形質転換宿主細胞は、一般には、本発明に適した任意の細胞でありうる。該
形質転換宿主細胞は、好ましくは、原核細胞、例えば細菌細胞、より好ましくは
、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター（Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｙｒｉｌｌｕｍ）、ク
ラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）またはリゾバクテリウム（
Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞である。該形質転換宿主細胞は、好ましく
は、真核細胞であり、より好ましくは、植物、酵母または真菌細胞である。酵母
細胞を形質転換のために選択する場合には、それは、好ましくは、サッカロミセ
ス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾ
サッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂ
ｅ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。植
物細胞を形質転換のために選択する場合には、それは、形質転換されうる任意の
タイプのものでありうる。好ましくは、それは、作物栽培学的、園芸的、観賞的
、経済的または商業的価値を有するもの、より好ましくは、アカシア、アルファ
ルファ、アネス（ａｎｅｔｈ）、リンゴ、アプリコット、アーティチョーク、キ
バナスズシロ、アスパラガス、アボガド、バナナ、オオムギ、豆、ビート、クロ
イチゴ、ブルーベリー、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、カノラ、カンタ
ルーペ、ニンジン、キャッサバ、ヒマ、カリフラワー、セロリ、サクランボ、チ
コリ、コリアンダー、柑橘類、クレメンタイン、クローバー、ココナッツ、コー
ヒー、トウモロコシ、綿、キュウリ、ベイマツ、ナス、エンダイブ、キクヂシャ
、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、ニンニク、ヒョウタン、ブドウ、グレープ
フルーツ、ハネーデューメロン、クズイモ、キーウィフルーツ、レタス、リーキ
、レモン、ライム、テーダマツ、アマの種子、マンゴー、メロン、キノコ、ネク
タリン、ナッツ、オートムギ、ギネアアブラヤシ、アブラナ、オクラ、オリーブ
、タマネギ、オレンジ、観賞植物、ヤシ、パパヤ、パセリ、パースニップ、エン
ドウ、モモ、ラッカセイ、セイヨウナシ、コショウ、カキ、マツ、パイナップル
、プランテーン、プラム、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、
ラジアータパイン（ｒａｄｉａｔａ ｐｉｎｅ）、ラディッキオ（ｒａｄｉｃｃ
ｈｉｏ）、ダイコン、セイヨウアブラナ、ラズベリー、イネ、ライムギ、モロコ
シ、サザンパイン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｐｉｎｅ）、ダイズ、ホウレンソウ、カ
ボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ
、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、トリチカレ、芝生、カブ、蔓植物、スイ
カ、コムギ、ヤムイモおよびズッキーニの細胞である。

【０１２７】 ついで、当業者が利用可能な通常の技術を用いて、トランスジェニック植物を
、好ましくは、該形質転換細胞から再生させる。得られたトランスジェニック植
物は、好ましくは、病原体の感染に対して、同じ種の非トランスジェニック植物
より耐性である。

【０１２８】 獲得耐性遺伝子を含有する形質転換宿主細胞の製造方法 本発明は更に、５’から３’の配向で、構造核酸配列の転写を指令するプロモ
ーター、構造核酸配列、３’転写ターミネーターおよび３’ポリアデニル化シグ
ナルを含む形質転換宿主細胞の製造方法に関する。

【０１２９】 該方法は、一般には、適当な宿主細胞を選択し、該宿主細胞を組換えベクター
で形質転換し、該形質転換宿主細胞を得る工程を含む（Ｎｅｗｅｌｌら，１９９
１）。宿主細胞内に核酸を導入するための多数の方法が存在する。適当な方法に
は、細菌感染（例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））
、バイナリー細菌人工染色体ベクター、ＤＮＡの直接的運搬（例えば、ＰＥＧ媒
介形質転換、乾燥／抑制−媒介ＤＮＡ取込み、エレクトロポレーション、炭化ケ
イ素繊維との攪拌、およびＤＮＡ被覆粒子の加速などを介したもの）が含まれる
（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら，１９９１において概説されている）。

【０１３０】 ＤＮＡを細胞内に導入するための技術は当業者によく知られている。これらの
方法は、一般には、以下の４つの範疇に分類することができる：（１）化学的方
法（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，１９７３；Ｚａｔｌｏｕｋａｌ
ら，１９９２）；（２）物理的方法、例えば、マイクロインジェクション（Ｃａ
ｐｅｃｃｈｉ，１９８０）、エレクトロポレーション（ＷｏｎｇおよびＮｅｕｍ
ａｎｎ，１９８２；Ｆｒｏｍｍら，１９８５；米国特許第５，３８４，２５３号
）および粒子加速（ＪｏｈｎｓｔｏｎおよびＴａｎｇ，１９９４；Ｆｙｎａｎら
，１９９３）；（３）ウイルスベクター（Ｃｌａｐｐ，１９９３；Ｌｕら，１９
９３；ＥｇｌｉｔｉｓおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９８８）；および（４）受容
体媒介メカニズム（Ｃｕｒｉｅｌら，１９９２；Ｗａｇｎｅｒら，１９９２）。

【０１３１】 あるいは、植物の生殖器官を直接注入することにより、核酸を花粉内に導入す
ることができる（Ｚｈｏｕら，１９８３；Ｈｅｓｓ，１９８７；Ｌｕｏら，１９
８８；Ｐｅｎａら，１９８７）。該核酸は、未成熟胚内にも導入することができ
る（Ｎｅｕｈａｕｓら，１９８７）。

【０１３２】 該宿主細胞を形質転換するために使用する組換えベクターは、典型的には、５
’から３’の配向で、構造核酸配列の転写を指令するプロモーター、構造核酸配
列、３’転写ターミネーターおよび３’ポリアデニル化シグナルを含む。該組換
えベクターは更に、非翻訳配列、輸送およびターゲッティング配列、選択マーカ
ー、エンハンサーまたはオペレーターを含みうる。

【０１３３】 獲得耐性遺伝子を含有するトランスジェニック植物の製造方法 本発明は更に、病原体に対して、同じ種の非トランスジェニック植物より耐性
であるトランスジェニック植物の製造方法であって、適当な植物を選択し、該植
物を組換えベクターで形質転換し、該形質転換宿主細胞を得ることを含んでなる
製造方法に関する。

【０１３４】 該組換えベクターは、典型的には、５’から３’の配向で、構造核酸配列の転
写を指令するプロモーター、構造核酸配列、３’転写ターミネーターおよび３’
ポリアデニル化シグナルを含む。該組換えベクターは更に、非翻訳配列、輸送お
よびターゲッティング配列、選択マーカー、エンハンサーまたはオペレーターを
含みうる。

【０１３５】 形質転換植物プロトプラストまたは外植片からの植物の再生、発生および栽培
は、当技術分野において十分に教示されている（ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅ
ｉｓｓｂａｃｈ，１９８８；Ｈｏｒｓｃｈら，１９８５）。この方法においては
、形質転換体を、一般には、うまく形質転換された細胞に関して選択し植物シュ
ートの再生を誘導する培地の存在下で培養する（Ｆｒａｌｅｙら，１９８３）。
これらのシュートは、典型的には、２〜４ヵ月以内に得られる。

【０１３６】 ついで該シュートを、細菌の増殖を防ぐための抗生物質と選択剤とを含有する
適当な根誘導培地に移す。該シュートの多くは、根を発生させるであろう。つい
でこれらを土壌または他の培地に移植して、根を継続的に発生させる。前記の方
法は、一般には、使用する個々の植物株に応じて様々なものとなろう。

【０１３７】 好ましくは、再生されたトランスジェニック植物を自家受粉させて、ホモ接合
トランスジェニック植物を得る。あるいは、再生されたトランスジェニック植物
から得られた花粉を、非トランスジェニック植物、好ましくは、作物栽培学的に
重要な種の同系繁殖系と交配させることができる。逆に、再生されたトランスジ
ェニック植物を受粉させるために、非トランスジェニック植物からの花粉を使用
することができる。

【０１３８】 該トランスジェニック植物は、該獲得耐性タンパク質をコードする核酸配列を
、その子孫に伝達しうる。該トランスジェニック植物は、好ましくは、該獲得耐
性タンパク質をコードする核酸に関してホモ接合であり、有性生殖の結果として
その配列をその子孫に伝達する。子孫は、該トランスジェニック植物により産生
された種子から成長しうる。ついでこれらの追加的植物を自己受粉させて、植物
の真の育種系を得ることができる。

【０１３９】 これらの植物からの子孫を、とりわけ、遺伝子発現および耐病性（例えば、獲
得耐性の誘導）に関して評価する。該遺伝子発現は、ウエスタンブロット法、ノ
ーザンブロット法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡなどのいくつかの一般的な方法によ
り検出することができる。耐病性は、一般には、一定範囲の環境条件下、圃場、
温室または生育箱において試験する。

【０１４０】 （実施例） 以下の実施例により本発明を更に例示する。それらは、決して特許請求の範囲
の範囲および定義を限定するものと解釈されるべきではない。

【０１４１】 実施例１：イネおよびコムギからの獲得耐性遺伝子の同定 単子葉植物ホモログを同定するために、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ）Ｎｐｒ１遺伝子配列（Ｃａｏら，１９９７）を使用して、トウモロコシＥ
ＳＴ（Ｉｎｃｙｔｅ）データベースを検索した。該検索は、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのソフト
ウェアで行なった。この検索は、Ｎｐｒ１に対して弱いＤＮＡ相同性（推定Ｎｐ
ｒ１タンパク質に対してアミノ酸レベルで２５〜４６％の同一性）を有する１９
個のＥＳＴを与えた。クラスター分析は、２つのクラスターのＥＳＴが２つのト
ウモロコシクローン（すなわち、４個のＥＳＴに対応するクローン７００２１４
８７２、および３個のＥＳＴに対応するクローン７００１０２８１９）により代
表されることを示した。トウモロコシクローン７００２１４８７２の完全長配列
決定は、それが３８１アミノ酸のタンパク質（配列番号１７）を潜在的にコード
する１３８５ｂｐのｃＤＮＡインサート（配列番号１６）を含有することを示し
た。クローン７００２１４８７２からの推定タンパク質は、アンキリンリピート
ドメインと該タンパク質のＣ末端半分とに及ぶアミノ酸２２０からＣ末端までに
かけて、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ１タンパク質と整列
する。このクローンは、トウモロコシ鞘組織から得られたライブラリーＳＡＴＭ
ＯＮ０１６（１９９８年５月１５日付けで米国特許出願第６０／０８５，５３３
号として出願されている）から誘導した。

【０１４２】 トウモロコシクローン７００１０２８１９は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ１のＣ末端と整列する１２６アミノ酸のポリペプチド（配列
番号１９）を潜在的にコードする、より小さな６４０ｂｐのｃＤＮＡインサート
（配列番号１８）を含有しており、トウモロコシクローン７００２１４８７２の
推定タンパク質配列を証明した。４０９アミノ酸のトウモロコシタンパク質（配
列番号２１）を潜在的にコードする、すべてのトウモロコシｃＤＮＡ ＣＰＲ９
５１ ＦＬ（配列番号２０）に関する２２３５ｂｐのコンティグの集合は、鍵と
なる単子葉植物特異的ドメインを証明した。

【０１４３】 トウモロコシクローン７００２１４８７２と分岐双子葉植物Ｎｐｒ１ホモログ
［すなわち、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびエヌ・グルチノ
ーサ（Ｎ．Ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）］（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９８）とのアライ
メント（図１）は、高度に保存された２つの領域［すなわち、シロイヌナズナ（
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ１のアミノ酸２７０〜２７７位に対応するアミ
ノ酸ＨＲＡＬＤＳＤＤを有するドメイン１（配列番号１２）、およびシロイヌナ
ズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ１のアミノ酸５０１〜５０７位に対応す
るアミノ酸ＥＬＧＲＲＹＦを有するドメイン２（配列番号１３）］を同定した。
これらの領域を使用して、変性プライマーＯＢ０９：５’−ＣＡＹ ＡＲＩ Ｇ
ＣＩ ＹＴＩ ＧＡＹ ＷＳＩ ＧＡＹ ＧＡ−３’（配列番号１４）およびＯ
Ｂ１１：５’ＲＡＡ ＲＷＡ ＩＣＫ ＩＹＫ ＩＣＣ ＩＡＲ ＹＴＣ−３’
（配列番号１５）（Ｙ＝Ｃ，Ｔ；Ｒ＝Ａ，Ｇ；Ｉ＝イノシン；Ｗ＝Ａ，Ｔ；Ｓ＝
Ｇ，Ｃ；Ｋ＝Ｇ，Ｔ）を設計した。

【０１４４】 単子葉植物由来の獲得耐性配列を増幅するために、プライマーＯＢ０９および
ＯＢ１１を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった。ＭｇＣｌ_２濃
度およびプライマーアニーリングの温度に関して、条件を最適化した。４４℃の
アニーリング温度で２．５〜３．０ｍＭのＭｇＣｌ_２濃度が、強力な再現可能な
ＰＣＲ増幅産物を与えた（９４℃で５分間／９４℃で１分間／４４℃で４５秒間
／７２℃で１分間／７２℃で１０分間の３５サイクルのＰＣＲ）。これらの条件
下、イネ（ｃｖ．Ｍ２０２）、コムギ（ｃｖ．Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）、オオムギ（
ｃｖ．Ｐｅｒｒｙ）およびトウモロコシ（ｃｖ．Ｂ−７３）のゲノムＤＮＡの増
幅は、約１．５ｋｂおよび０．７ｋｂの２つの断片を与えた。種々の組織由来の
イネ（ｃｖ．Ｍ２０２）、コムギ（ｃｖ．Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）、オオムギ（ｃｖ
．Ｐｅｒｒｙ）のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにおけるＯＢ０９−ＯＢ１１プライマー
の使用は、約０．７ｋｂのサイズのバンドを与えた。ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）
試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ，ＭＤ）を製造業者の説明に従い使用して、全ＲＮＡを精製した。Ｐｏｌ
ｙＡＴｒａｃｔ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＶ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、精製されたポリＡ＋ｍＲＮＡを
、これらの種々の起源から回収した。該逆転写反応では、製造業者（Ｃｌｏｎｅ
Ｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により推奨されている条件下、ｃＤＮＡ
を作製するために、アンカープライマーと共に４μＬのポリＡ＋ｍＲＮＡを鋳型
として使用した。得られたｃＤＮＡ産物を、ＯＢ０９−ＯＢ１１プライマーを使
用してＰＣＲに付した（９４℃で５分間／９４℃で１分間／４５℃で４５秒間／
７２℃で１分間／７２℃で１０分間の３５サイクルのＰＣＲ）。これらの実験か
らのＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、増幅断片を該ゲル（
Ｑｉａｅｘ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）から該製造業者の
説明（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従い溶出し、ＰＣＲ産物の直
接的クローニングを受け入れるｐＭＯＮ３８２０１（図２）内にクローニングし
、該インサートを配列決定分析（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｄｙｅ Ｔｅ
ｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に付した。

【０１４５】 この戦略を用いることにより、本発明者らは、イネおよびコムギの獲得耐性経
路において機能すると考えられる遺伝子の断片をクローニングすることができた
。これらのホモログはＮｐｈと称され、該イネ遺伝子はＮｐｈ１と称され、コム
ギ遺伝子はＮｐｈ２と称される。

【０１４６】 イネＮｐｈ１断片を、黄化イネ組織および若い緑色葉組織から、前記のＲＴ−
ＰＣＲにより単離した。ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を製造業者の
説明に従い使用して、全ＲＮＡを精製した。ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ ｍＲＮＡ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＶを製造業者のプロトコール（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従い使用して、ポリＡ＋ＲＮＡを回収した。
逆転写反応では、０．５μｇの精製されたポリＡ＋ＲＮＡを鋳型として使用し、
該製造業者（ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により推奨され
ている条件下でＤＴアンカープライマーを使用して、該ｃＤＮＡを得た。ついで
、得られたｃＤＮＡ産物の４μＬを、ＯＢ０９−ＯＢ１１プライマーを使用して
ＰＣＲ増幅した。両方の組織に由来する０．７ｋｂの増幅産物を、別々に処理し
た。最終的なＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、該アガロー
スゲル（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から精製し、ｐＭＯＮ３８２
０１内に直接的にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌細胞（ＤＨ５α
；ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）内に形質転換した。該インサートの完全長配列決
定（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌ
ｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）は、トウモロコシクロ
ーン７００２１４８７２に対する強い相同性を証明した。６個のインサートを分
析したところ、それらは同一の７０５ｂｐの断片（配列番号３）を共有すること
が判明した。

【０１４７】 また、コムギＮｐｈ２断片をＲＴ−ＰＣＲにより回収した。ＴＲＩＺＯＬ（登
録商標）試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を製造業者の説明に従い使用して、コムギ（
ｃｖ．Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）からの２週齢の緑色葉組織から全ＲＮＡを単離した。
ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＶ（
Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ポリＡ＋ＲＮＡを回収し
た。逆転写反応では、０．５μｇの精製されたポリＡ＋ＲＮＡを鋳型として使用
し、該製造業者（ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により推奨
されている条件下でＤＴアンカープライマーを使用して、該ｃＤＮＡを得た。つ
いで、得られたｃＤＮＡ産物（４μＬ）を、ＯＢ０９−ＯＢ１１プライマーを使
用してＰＣＲ増幅した。最終的な０．７ｋｂの増幅産物を、アガロースゲル精製
し（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、ｐＭＯＮ３８２０１内にクロー
ニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌細胞（ＤＨ５α；ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌ
ｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，
ＭＤ）内に形質転換した。正に荷電したナイロンメンブレン（ＨＹＢＯＮＤ Ｎ
＋；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔ
ｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）上に該細菌ＤＮＡをトランスファーし、トウモロ
コシクローン７００２１４８７２を使用して現像されるランダムプライム化^３２ Ｐ標識プローブでプローブすることにより、細菌コロニーをスクリーニングした
。陽性ハイブリダイズクローンを配列決定分析（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標
）Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｐｅｒ
ｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に付した。３個のインサートの完全長配列決定は、トウモ
ロコシクローン７００２１４８７２（配列番号１６）に対して強い相同性を有す
る同一の７０６ｂｐの断片（配列番号９）を示した。

【０１４８】 実施例２：イネからのＮｐｈ１遺伝子のクローニング イネからの完全長Ｎｐｈ１遺伝子のクローニングは、該クローン化０．７ｋｂ
イネＰＣＲ断片（配列番号３）をプローブとして使用することにより促進された
。具体的には、該ＰＣＲ産物からの４７１ｂｐの内部ＰｓｔＩ断片を使用して、
黄化イネ実生（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｉｎｄｉｃａ ｖａｒ．ＩＲ３
６；ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から作製されたλｇｔ１
１ ５’ＳＴＲＥＴＣＨ−ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。Ｙ１０
９０Ｒ−細菌宿主細胞（ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）を使用して、バクテリオファージ
をＮＺＹ培地上にプレーティングした。正に荷電したナイロンメンブレン（ＨＹ
ＢＯＮＤ Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に該ファージ
ＤＮＡをトランスファーすることにより、約２×１０^６個の独立したプラークを
スクリーニングした。該イネＰＣＲ産物からの内部ＰｓｔＩ断片を、^３２Ｐラン
ダムプライミングによりプローブとして調製し、それを使用して、Ｒａｐｉｄ
Ｈｙｂバッファー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）中での６２
℃で一晩のハイブリダイゼーションにより該ライブラリーをスクリーニングした
。該フィルターを、２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（１０分間／室温）で１回、
および１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（４０分間／６５℃）で１回洗浄した。オ
ートラジオグラフィー後、７７個の陽性ハイブリダイズプラークを同定した。フ
ァージＤＮＡを１５個のプラークから単離し、λｇｔ１１フォワードおよびλｇ
ｔ１１リバースプライマーを使用するＰＣＲ（９４℃で５分間／９４℃で１分間
／５５℃で１分間／７２℃で１．５分間／７２℃で１０分間の３５サイクルのＰ
ＣＲ）により該インサートＤＮＡを増幅した。増幅された２つの最大インサート
は２．３ｋｂのサイズを有していた。これらの２つの最大インサートからのＰＣ
Ｒ産物をアガロースゲル電気泳動し、該ゲルから精製し、ベクターｐＧＥＭ−Ｔ
（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングし、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）細菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内に形質転換
した。配列決定分析は、両方のクローンがヌクレオチドレベルで同一であること
を示した（配列番号１）。

【０１４９】 イネＮｐｈ１の完全長ｃＤＮＡは、推定される最初のＡＴＧの上流の５’非翻
訳領域の６１８ヌクレオチドと推定終結コドン以降の３’非翻訳領域の３２２ヌ
クレオチドとを含む２３６８ヌクレオチドのインサートを含有していた（配列番
号２）。該推定Ｎｐｈ１コード領域は、１４２８ヌクレオチド（配列番号１）に
伸長し、４７５アミノ酸長のポリペプチド（配列番号４）を潜在的にコードする
。イネＮｐｈ１ ｃＤＮＡ（配列番号１）は、部分トウモロコシクローン７００
２１４８７２（配列番号１６）に対しては７９．３％のヌクレオチド同一性を共
有するが、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ１ ｃＤＮＡ（Ｃ
ａｏら，１９９７）に対しては５２．９％の同一性しか共有しない。推定アミノ
酸レベルでは、イネＮｐｈ１（配列番号１）は部分トウモロコシクローン７００
２１４８７２（配列番号１７）に対しては８２．４％同一であるが、シロイヌナ
ズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ１（Ｃａｏら，１９９７）に対しては４
１％のアミノ酸同一性しか共有しない。該イネＮｐｈ１およびシロイヌナズナ（
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ１タンパク質配列のアライメントは、４個のギ
ャップの導入を必要とする。該イネＮｐｈ１タンパク質配列は、５’末端におい
て、該シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ１タンパク質配列より
１１３アミノ酸短い。表１に、該イネＮｐｈ１、コムギＮｐｈ１−２、トウモロ
コシクローン７００２１４８７２およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ）Ｎｐｒ１のヌクレオチドおよび推定タンパク質配列の同一性（％）を要約す
る。

【０１５０】

【表１】

【０１５１】 実施例３：コムギＮｐｈ２−１およびＮｐｈ２−２遺伝子の単離 コムギＮｐｈ２遺伝子を単離するために、周囲光中で成長した１３日齢のティ
ー・アエスチブム（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ）（ｖａｒ．ＴＡＭ １０７）出芽後
実生からの市販のコムギ５’−ＳＴＲＥＴＣＨ−ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングした（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。プライマーＯ
Ｂ０１（配列番号２２）およびＯＢ０２（配列番号２３）を使用するコムギＮｐ
ｈ２ ＰＣＲ断片（配列番号９）のＰＣＲ増幅により、および遺伝子特異的プラ
イマーＯＢ１８（配列番号２４）およびＯＢ１９（配列番号２５）を使用して増
幅されたトウモロコシクローン７００２１４８７２の１．３８ｋｂのインサート
（配列番号１６）のＰＣＲ増幅により、スクリーニングプローブを調製した。増
幅されたコムギおよびトウモロコシＰＣＲ断片をアガロースゲル精製し、^３２Ｐ
ランダムプライミングを用いて標識した。１：２の濃度比のコムギプローブ：ト
ウモロコシプローブをライブラリースクリーニングにおいて使用した。

【０１５２】 該ライブラリーを含有するバクテリオファージを、Ｙ１０９０Ｒ−細菌宿主細
胞（ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）を使用してＮＺＹ培地上にプレーティングした。正に
荷電したナイロンメンブレン（ＨＹＢＯＮＤ Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に該ファージＤＮＡをトランスファーし、１００μｇ／ｍ
ｌ魚類精子ＤＮＡを含有するＲａｐｉｄ−Ｈｙｂバッファー（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）中、該混合プローブと共に該フィルターを６０℃
で一晩インキュベートすることにより、約２×１０^６個の独立したプラークをス
クリーニングした。フィルターを、２×ＳＳＣ（１０分間／室温）で１回、６０
℃（２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ）で２回、および６０℃（１×ＳＳＣ／０．
１％ ＳＤＳ）で１回洗浄し、オートラジオグラフィーに付した。４５個の同定
された陽性ファージのうちの２個が約２．４ｋｂのインサートを含有することが
判明した。これらのクローンからファージＤＮＡを単離し、該インサートを、独
立して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＥｃｏＲＩ部位内にサブクローニングした。完全長
配列分析は、どちらのクローンもコムギＮｐｈ−２ホモログ配列をコードしてい
ることを証明した。コムギクローン１は、Ｎｐｈ２−１と称される６０７アミノ
酸の推定タンパク質（配列番号１０）を特定する１８２４ｂｐの潜在的コード領
域（配列番号５）を有する２４２０ｂｐのインサート（配列番号７）を含有して
いた。コムギクローン２は、Ｎｐｈ２−２と称される６０９アミノ酸のタンパク
質（配列番号１１）をコードする予想される１８３０ｂｐのオープンリーディン
グフレーム（配列番号６）を有する２１２０ｂｐのサイズのインサート（配列番
号８）有していた。

【０１５３】 Ｎｐｈ２−１とＮｐｈ２−２との対アライメントは、推定タンパク質配列間で
９８％の同一性を示した。コムギＮｐｈ２−１およびＮｐｈ２−２は、約７９％
の同一性を共有するヌクレオチドおよび推定タンパク質配列を有するトウモロコ
シクローン７００２１４８７２に最も類似している。該コムギＮｐｈ２−１／Ｎ
ｐｈ２−２配列は、イネＮｐｈ１に対して約８２％のヌクレオチド同一性を共有
し、約８３％の推定タンパク質配列同一性を共有する。コムギＮｐｈ２−１とシ
ロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ１との比較は、それぞれ４９％
および３９％の低レベルの共有ヌクレオチドおよび推定タンパク質同一性を示し
ている。コムギＮｐｈ２−１とシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐ
ｒ１タンパク質配列とのアラインメントは、デフォルトＧＡＰパラメーター（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ）を用いて、１４個のギャップの導入を必要とする。コムギＮｐｈ２−１ホ
モログの推定アミノ酸配列とシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ
１、トウモロコシクローン７００２１４８７２およびイネＮｐｈ１との複数アラ
イメントは、Ｎｐｈ２−１が、該タンパク質のアンキリンリピートおよびＣ末端
部分の領域において有意な配列相同性を共有するが、独特（ユニーク）なＮ末端
配列を含有しないことを示した。コムギＮｐｈ２−１／２−２配列の推定開始コ
ドンは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ１と比較してＮｐｈ
２−１／２−２のＮ末端に追加的な２５アミノ酸を、およびイネＮｐｈ１と比較
して該Ｎ末端における追加的な１３７アミノ酸を付加した。

【０１５４】 実施例４：単子葉植物におけるＮｐｈ１およびＮｐｈ２のサザンブロット分析 単子葉植物種におけるＮｐｈホモログの遺伝子コピー数を、サザンブロット分
析における単子葉植物特異的プローブを使用して調べた。Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；３０サイクルのＰＣＲ：９４℃で
５分間／９４℃で１分間／５５℃で１分間／７２℃で１．５分間／サイクル３０
における７２℃で１０分間）中のクローン化コムギＮｐｈ２−１ ｃＤＮＡ（配
列番号７）を、ＫＳおよびＳＫプライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏ
ｌｌａ，ＣＡ）を使用して増幅して、Ｎｐｈ２プローブを作製した。コムギ（ｃ
ｖ．Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）、オオムギ（ｃｖ．Ｐｅｒｒｙ）、トウモロコシ（ｃｖ
．Ｂ−７３）およびイネ（ｃｖ．Ｍ２０２）から単離したゲノムＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩまたはＨｉｎＤＩＩＩ制限酵素で消化し、断片をアガロースゲル上で分離し
、ＨＹＢＯＮＤ Ｎ＋ナイロンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）にトラ
ンスファーし、^３２Ｐランダムプライミングにより調製されたコムギＮｐｈ２−
１プローブと共にインキュベートした。１００μｇ／ｍＬ魚類精子ＤＮＡを含有
するＲａｉｄ−Ｈｙｂバッファー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を使用して、サ
ザンハイブリダイゼーションを６５℃で一晩行なった。フィルターを２×ＳＳＣ
／０．１％ ＳＤＳ（６５℃，２０分間）で2回、および０．５×ＳＳＣ／０．
１％ ＳＤＳ（６５℃，２０分間）で２回洗浄した。ハイブリダイズしているバ
ンドをオートラジオグラフィーにより検出した。

【０１５５】 単純なパターンのハイブリダイゼーションが見出され、これらの単子葉植物種
のそれぞれにおいて僅か１個または２個のバンドが検出された。イネ、トウモロ
コシ、オオムギおよびコムギにおいては、ハイブリダイゼーションのパターンは
、単一の関連遺伝子の存在と符合し、このことは、Ｎｐｈ２に関連した遺伝子が
大きな遺伝子ファミリーの一部ではないらしいことを示唆している。イネと比較
して、コムギおよびオオムギのハイブリダイゼーションシグナルは、より強力で
あるらしかったが、これは恐らく、該コムギおよびオオムギ遺伝子に対する該コ
ムギプローブの強い相同性によるものであろう。また、コムギの場合には、より
強力な該ハイブリダイゼーションシグナルはまた、六倍体コムギゲノムにおいて
表される同一遺伝子の複数のコピーに部分的に起因しているかもしれない。

【０１５６】 実施例５：コムギゲノム上のコムギＮｐｈ２ホモログの帰属 コムギゲノム中の第３染色体上のコムギＮｐｈ２遺伝子の位置は、Ｃｈｉｎｅ
ｓｅ Ｓｐｒｉｎｇ零染色体−四染色体系統（Ｓｅａｒｓ，１９６６）を使用し
て決定された。正倍数体親系統を、３組の染色体のそれぞれ１つにおける零染色
体である系統と比較した。全ゲノムＤＮＡを異数体の集合から単離し、Ｎｐｈ２
ハイブリダイズバンドの改変に関してサザンブロットにより分析した。ゲノムＤ
ＮＡをコムギ零染色体−四染色体系統から抽出し、ＥｃｏＲＩを使用して消化し
、アガロースゲル上で分離し、断片をナイロンメンブレン（ＨＹＢＯＮＤ Ｎ＋
，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）にトランスファーした。該Ｎ
ｐｈ２遺伝子の０．７ｋｂのコムギＰＣＲ産物（ＯＢ０１／ＯＢ０２プライマー
を使用する実施例３に記載のとおり）を、^３２Ｐランダムプライミングにより調
製し、プローブとして使用した。ハイブリダイゼーションを、１００μｇ／ｍＬ
魚類精子ＤＮＡを含有するＲａｉｄ−Ｈｙｂバッファー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌ
ｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）中、６５℃で一晩行なった。フィルターを６５℃で、
２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で２０分間で２回、１×ＳＳＣ／０．１％ Ｓ
ＤＳ中で２０分間で２回、および０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で２０分
間で２回洗浄した。ハイブリダイズしたメンブレンのオートラジオグラフィーは
、コムギ染色体の相同群３上のＮｐｈ２−ハイブリダイズ断片の存在、およびそ
れに対応する、零染色体３Ａ（Ｎ３ＤＴ３Ａ）、３Ｂ（Ｎ３ＢＴ３Ａ）または３
Ｄ（Ｎ３ＡＴ３Ｂ）異数体系統におけるバンドの不存在を示した。

【０１５７】 作物栽培学的に重要な多数の形質は、単子葉植物種における第３群相同染色体
上に位置している。耐性遺伝子Ｌｒ２４、Ｌｒ２７、Ｌｒ３２、Ｓｒ３５は、コ
ムギ第３群染色体の遺伝地図上に位置づけられた。植物の高さ（ｄｅｎｓｏ）、
出穂期および穀粒収量に関する量的表現形質を支配する座位（ＱＴＬ）は、オオ
ムギ染色体３Ｈに位置づけられた。単子葉種間の比較染色体マッピングは、該マ
ーカーの同一直線上の配置が関連植物種内の相同群の染色体間で一致することを
示した。したがって、本発明者らは、コムギ染色体３群からの単離されたＮｐｈ
２遺伝子が、オオムギ染色体３Ｈ上に位置づけられた作物栽培学的に重要な形質
と連鎖している可能性があると推測している。

【０１５８】 実施例６：Ｎｐｒ１ホモログに対する抗生物質の製造および使用 双子葉植物Ｎｐｒ１および単子葉植物Ｎｐｈ−１およびＮｐｈ−２相同タンパ
ク質の蓄積を追跡するために、本発明者らは、広い種の交差反応性を有するポリ
クローナル抗体を作製した。ポリクローナル抗体は、以下のとおりにトマトＮｐ
ｒ１（Ｄｕｋｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＸ．Ｄｏｎｇ博士との協同）の部分配
列の融合タンパク質に対して産生させた。該トマトＮｐｒ１ホモログのＨｉｎｄ
ＩＩＩ Ｃ−末端断片（１８０ａａ；Ｇｌｕ３９８−終結５７７［配列番号３６
］）をｐＲＳＥＴＢベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓ
ｂａｄ，ＣＡ）のＨｉｎＤＩＩＩ部位内にクローニングして、２５．６ｋＤａの
推定分子量を有する２２６アミノ酸のポリヒスチジン融合タンパク質を作製した
。増殖培地に１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、細胞を３７℃で更に２時間培養すること
により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（株ＢＬ２１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒ
ｌｓｂａｄ，ＣＡ）におけるタンパク質の過剰発現を誘導した。細胞を遠心分離
により回収し、室温で１時間、８Ｍ尿素、０．１Ｍ リン酸Ｎａ、０．０１０Ｍ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて該ペレットを細胞溶解した。Ｎｉ−
ＴＦＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から構成される平衡化ア
フィニティーカラムに、抽出物を結合させた。該カラムを該結合バッファーで洗
浄し、溶出バッファー（８Ｍ尿素、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ６．８、
１００ｍＭ ＥＤＴＡ）で処理した。溶出したポリヒスチジン融合タンパク質を
ＰＢＳバッファーに対して一晩（４℃）透析し、ウサギにおけるポリクローナル
抗体の産生のための免疫原として使用した（２００μｇの初回免疫／１００μｇ
の第１追加抗原刺激／５０μｇの後続の免疫）。

【０１５９】 免疫したウサギ（Ｐｏｃｏｎｏ Ｒａｂｂｉｔ Ｆａｒｍ ａｎｄ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄｅｓｉｓ，ＰＡ）から回収した抗血清を１
：５，０００の希釈度で使用し、該標的融合タンパク質を発現する大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）から回収されたタンパク質および全植物抽出物に対するウエスタンブ
ロット分析により評価した。ウエスタン分析およびＥＬＩＳＡ測定のための植物
抽出物は、以下のとおりに回収した。約１００ｍｇの新鮮な組織を、ミクロフュ
ージ乳棒を使用してドライアイス上で微細粉末に粉砕し、バッファー［０．０５
Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．２），０．０５Ｍ ＮａＦ，０．１５０Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，０．５％ ＮＰ−４０，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１ｍＭプロテアーゼインヒビ
ターカクテル（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）］中、４℃で３０〜６０
分間抽出した。該抽出物をペレット化し（１０，０００ｇ／１０分間／４℃）、
上清を回収し、タンパク質濃度を測定した（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９５）。ウ
エスタン分析では、一定範囲の全抽出タンパク質を試験し（２０〜１００μｇ／
レーン）、ＥＬＩＳＡでは、典型的には５０〜１００μｇ／ウェルをアッセイし
た。

【０１６０】 ウエスタン分析は、ＥＣＬウエスタンブロッティング分析系（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）とハイブリダイズタンパク質を可視化するため
のｘ線フィルム露光とを用いるＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５）に記載されている
標準的なプロトコールに従うものであった。全タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥサンプルバッファー中で可溶化し、８〜１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル
上で分離した。分離したタンパク質を、１０％（ｖ／ｖ）メタノールを含有する
０．０２５Ｍ Ｔｒｓ−Ｃｌ、０．１９２Ｍグリシン（ｐＨ８．３）中、ニトロ
セルロースメンブレン（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＡ ８５，０．４５μｍ；Ｍｉｄｗ
ｅｓｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｖａｌｌｅｙ Ｐａｒｋ，ＭＯ）上に１００ボ
ルトでエレクトロトランスファーした。ウエスタンブロットを、０．０５％ Ｔ
ｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳバッファー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中で５分間洗浄し、
ＰＢＳＴ ＋ ５％（ｗ／ｖ）Ｃａｒｎａｔｉｏｎ脱脂乾燥乳（Ｎｅｓｔｌｅ
Ｆｏｏｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ）中で室温で１時間または
４℃で一晩ブロッキングした。ついでブロットをＰＢＳＴで洗浄（３×１０分間
／室温）し、一次抗体溶液（ＰＢＳＴ中の１：５，０００の抗血清）で室温で１
時間攻撃した。一次抗体のインキュベーションの後、ブロットを洗浄し（３×５
分間／ＰＢＳＴ）、二次抗体（ＰＢＳＴ中の抗ウサギＩｇＧ共役ホースラディッ
シュペルオキシダーゼ）と共に１時間／室温でインキュベートした。ブロットを
洗浄し（３×５分間 ＰＢＳＴ／１×５分間 ＰＢＳ）、ＥＣＬキットを製造業
者の説明（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に従い使用して、認
識されたバンドを可視化した。

【０１６１】 精製された融合タンパク質を使用する力価測定実験は、この抗血清が、ウエス
タンブロット分析において１０〜２０ｎｇ／レーンのレベルで該融合タンパク質
を標的としうることを示した。多種多様な単子葉植物および双子葉植物種からの
抽出物をアッセイした。いずれの場合においても、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ１のおよその分子量に対応する約６５〜６６ｋＤａの内因
性植物タンパク質が認識された。この抗血清は、イネ、コムギ、ダイズ、ジャガ
イモ、タバコおよびトマト由来のタンパク質抽出物中の単一のバンドを認識する
。該タンパク質抽出物は未誘導植物から単離された。このことは、これらのタン
パク質が、調べた全ての種において構成的に存在することを示唆している。

【０１６２】 これらのポリクローナル抗体は、種々の条件下でのＮｐｈ１およびＮｐｈ２タ
ンパク質の発現および蓄積のモニターを可能にした。ＥＬＩＳＡプロトコールは
、抗体およびタンパク質標的に応じて最適な分解能に関して改変されうる。双子
葉植物および単子葉植物サンプルのＥＬＩＳＡでは、本発明者らは、マイクロタ
イターアッセイプレートを、コーティングバッファー（１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３ ，３５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３，ｐＨ９．３）中で１：１０００で希釈された抗血清
で４℃で一晩コートした。ウェルを洗浄し（３×３分間／ＰＢＳＴ）、抽出され
たサンプルを、オボアルブミン（０．２％ ｗ／ｖ；ＰＢＳＴＯ）を含有するＰ
ＢＳＴ中で適当な濃度に希釈し、４℃で一晩結合させた。該ウェルを洗浄し（３
×３分間／ＰＢＳＴ）、２００μＬのアルカリホスファターゼ共役体（ＰＢＳＴ
Ｏ中で１：２，０００で希釈されたもの）をウェルごとに加え、インキュベート
（４時間／３７℃）した。ウェルをＰＢＳＴで洗浄し、新たに調製されたホスフ
ァターゼ基質（９７ｍＬのジエタノールアミン／８００ｍＬのＨ_２Ｏ）を加え、
光学濃度を４０５ｎｍでモニターした。精製された融合タンパク質を濃度標準と
して用いた。

【０１６３】 ＥＬＩＳＡ試験は、獲得耐性の化学的または病原体誘導後に双子葉植物および
単子葉植物に関して最適化されており、したがって、本発明者らは、対応遺伝子
の増強された転写と相関するタンパク質蓄積を確認している。本発明者らは、こ
れらの抗体が、未誘導条件下および獲得耐性を誘導しうる条件下でのトランスジ
ェニック植物におけるＮｐｈ１およびＮｐｈ２−１／２−２タンパク質の過剰発
現の測定に役立つようになると予想している。

【０１６４】 実施例７：イネにおける獲得耐性の誘導は、Ｎｐｈ１の発現を増強し、マグナ
ポルセ・グリセア真菌に対する耐性を付与する Ｎｐｈ１の発現がイネにおけるＡＲの活性化と協同して調節されるのか否かを
調べるために、本発明者らは、ＡＲの化学誘導物質を同定し、この誘導物質での
イネ植物の処理がＮｐｈ１の転写レベルを増強するのか否かを判定した。十分に
研究されているＡＲアクチベーターであるジクロロ−２，６−イソニコチン酸（
ＩＮＡ）（Ｒｙａｌｓら，１９９６）を、イネにおいてＮｐｈ１の転写を誘導し
ＡＲを調整するその効力に関して試験した。１４日齢のイネ植物（ｃｖ．Ｍ２０
２）を、温室条件下で成長させ、それに２０％アセトン／８０％水（ｖ／ｖ）＋
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）中の０．５ｍＭ ＩＮＡを噴霧して、これ
を処理植物とした。模擬処理植物には、アセトン／水／Ｔｗｅｅｎ２０溶液だけ
を噴霧した。処理の３日後、イネいもち病の原因因子である生物寄生性（ｂｉｏ
ｔｒｏｐｈｉｃ）病原体マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇ
ｒｉｓｅａ）を植物に接種した。新鮮に単離され水およびＴｗｅｅｎ２０（０．
０２５％ ｖ／ｖ）に懸濁されたマグナポルセ・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）
胞子（胞子３〜５×１０^４個／ｍＬ）を、Ｄｅｖｉｌｂｉｓｓハンドヘルド噴霧
器を使用して処理植物の葉上に均一に噴霧した。植物を、暗所中、２４℃、湿度
１００％の条件下で２４時間インキュベートした。ついで植物を１２時間の明／
暗サイクルの生育箱内に移し、疾患徴候を７日間にわたりモニターした。

【０１６５】 第５日までに、該対照植物においては、イネいもち病に典型的な大きく広がる
病斑として現れた強いイネいもち病徴候が明らかとなった。しかし、ＩＮＡで予
め処理された植物は、該病原体に対して強い耐性を示し、小さな壊死斑点または
細胞死が接種葉上で明らかであるに過ぎなかった（図３）。ＩＮＡ処理植物上で
は、疾患徴候または真菌胞子形成は認められなかった。この結果は、（１）イネ
における化学誘導ＡＲが病原体耐性を促進すること、および（２）イネ品種Ｍ２
０２における誘導されたＡＲがイネいもち病菌を予防することを示している。

【０１６６】 ＮｐｈＩ遺伝子の活性化に対するＩＮＡ処理の影響を、ＩＮＡで処理された及
び処理されていないイネ葉（ｃｖ．Ｍ２０２）のノーザンブロット分析により評
価した。ＡＲの発現前（処理の０時間後）および処理後に時間間隔をおいて、Ｔ
ＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）を使用して、全ＲＮＡをＩＮＡ処理葉組織から単離した。全ＲＮＡを
、変性アガロースゲル電気泳動（２０μｇ／レーン）により分離し、ＨＹＢＯＮ
Ｄ Ｎ＋メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）にトラン
スファーした。アガロースゲル精製され^３２Ｐランダムプライミングの使用によ
り調製されたＰＣＲ ＮｐｈＩ遺伝子の内部０．４７ｋｂ ＰｓｔＩ ＤＮＡ断
片（配列番号３）を使用して、該イネＮｐｈＩプローブを作製した。フィルター
を、放射能標識されたイネＮｐｈＩ ＤＮＡプローブを伴う２０ｍＬのＲａｐｉ
ｄ−Ｈｙｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で６２℃で一晩ハ
イブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、フィルターを室温で１回（２
×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ、１０分間）、および６５℃で２回（１×ＳＳＣ／
０．１％ ＳＤＳ、２０分間）洗浄し、オートラジオグラフィーに付した。

【０１６７】 本発明者らは、ＩＮＡの噴霧が２倍〜３倍のＮｐｈ１転写産物の蓄積を誘導し
、ピーク発現がＩＮＡ処理の３日後に生じることを見出した（図４）。該実験の
最終時点である第５日まで、Ｎｐｈ１転写は高いままであった。イネＮｐｈ１に
関する未誘導対照より約３倍高い最大誘導レベルは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂ
ｉｄｉｏｐｓｉｓ）Ｎｐｒ１（Ｃａｏら，１９９８）に関して報告されている転
写レベルの誘導に匹敵する。また、同じノーザンブロット実験では、前記の接種
条件を用いてマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ
）病原体で攻撃されたイネ（ｃｖ．Ｍ２０２）におけるＮｐｈ１の一時的な発現
を調べた。既に詳しく記載されているとおりに、組織を集め、全ＲＮＡを調製し
、ノーザンブロット分析を行なった。病原体の攻撃は、Ｎｐｈ１の発現を一過性
にアップレギュレーションしたに過ぎなかった。感染の１日後、病原体で誘導さ
れたＮｐｈ１転写は、ＩＮＡ処理で誘導されるレベルにまで増強されたが、第３
日までに、病原体で攻撃された植物におけるＮｐｈ１発現は、未誘導対照のレベ
ルにまで戻った。これとは対照的に、ＩＮＡで誘導された植物は、処理の少なく
とも５日後まで持続的に高レベルのＮｐｈ１発現を示し、このことは、持続的に
高レベルのＮｐｈ１が獲得耐性の促進を補助し、いもち病感染を予防しうること
を示唆している。

【０１６８】 Ｎｐｈ１タンパク質の蓄積は、Ｎｐｈ１遺伝子の転写の増加と相関する。模擬
処理またはＩＮＡ処理（１２時間および５日間）されたイネ（ｃｖ，Ｍ２０２）
からのタンパク質抽出物を、ＥＬＩＳＡ（実施例６に記載のとおり）により比較
した。ＩＮＡ噴霧の１２時間後には、Ｎｐｈ１タンパク質の増加は検出されなか
った。しかし、ＩＮＡ処理の５日後までに、本発明者らは、Ｎｐｈ１タンパク質
の蓄積における、再現性ある１．７倍の増加を見出した。蓄積タンパク質におけ
るこの増加は、同じ時間経過にわたるＮｐｈ１の転写レベルの増強と良く相関す
る。

【０１６９】 ＩＮＡで処理されたイネ（ｃｖ．Ｍ２０２）を、より長い時間経過にわたりマ
グナポルセ・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）で攻撃することにより、誘導された
ＡＲの寿命をアッセイした。イネ植物の集団に０．５ｍＭ ＩＮＡ［２０％アセ
トン／８０％水（ｖ／ｖ）＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）］を１回噴
霧し、共に処理された及び処理されていない対照である植物の部分集団に、種々
の時点で、前記のとおりにイネいもち菌を感染させた。本発明者らは、化学的に
調整されたＡＲが、１回のＩＮＡ処理後に３０日以上持続することを見出した。
各時点で、該ＩＮＡ処理植物は、イネいもち病感染に対する一貫して高い耐性を
示し、一方、平行対照植物は一様に罹患した。

【０１７０】 本発明者らは、トランスジェニックイネにおけるＮｐｈ１の過剰発現が、Ｎｐ
ｈ１タンパク質の蓄積の増加を促進し、病原体の攻撃に対する、より強力な応答
を可能にし、ついで、トランスジェニック植物における、より有効な長く持続す
る「免疫」期間を促進すると予想している。Ｎｐｈ１をトランスジェニック的に
発現させることにより、本発明者らは、病原体の攻撃後の強力かつ均一なＡＲが
達成されると予想している。本発明者らは、真菌、細菌およびウイルス病原体に
より引き起こされる疾患を含む種々のイネ疾患がＮｐｈ１の過剰発現により克服
されると予想している。植物全体にわたる発現のために構成的プロモーター（例
えば、ｐＦＭＶ、ｐｅ３５Ｓまたはサトウキビバドナウイルスプロモーター）に
より該トランスジーンを駆動することにより、または、該植物の特定領域（例え
ば、根または葉）または特定の細胞型（例えば、表皮、維管束または葉肉細胞）
においてＮｐｈ１発現を駆動するための組織特異的プロモーターを使用すること
により、トランスジェニックＮｐｈ１発現を更に最適化することができる。

【０１７１】 実施例８：コムギＮｐｈ２発現は誘導可能であり発生的に調節される コムギＮｐｈ２遺伝子発現とＡＲとの間の関係を確認するために、本発明者ら
は、コムギ植物をＩＮＡで試験し、うどんこ病およびＮｐｈ２転写をモニターし
た。ＩＮＡでの処理は、一定数のマーカー遺伝子の転写活性化により及び耐病性
の増強により示されるとおり、コムギにおける該ＡＲ経路を活性化することが示
されている（Ｇｏｒｌａｃｈら，１９９６）。温室で成長した１４日齢のコムギ
植物（ｃｖ．ＴＡＭ１０７）に、２０％ アセトン／８０％ 水（ｖ／ｖ）＋０
．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）中の１ｍＭ ＩＮＡ（ジクロロ−２，６−
イソニコチン酸）または該噴霧溶液だけ（模擬処理対照）を噴霧した。処理の５
日後、処理および模擬処理対照植物に、コムギうどんこ病病原体（Ｅｒｙｓｉｐ
ｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ ｓｐ ｈｏｒｄｅｉ）を接種した。うどんこ病の
試験では、既に感染している植物からの分生子を該試験植物の茎葉上に移し、つ
いでそれを該接種植物の生育箱内に維持した。該箱内の条件は、２０℃、１２時
間／１２時間の昼／夜の光周期、３００μＥの光度、８０％の相対湿度で維持し
、毎日２回、植物を地下灌漑に付した。ＩＮＡ処理植物および未処理対照の疾患
徴候を７日後に評価した。

【０１７２】 ＩＮＡを噴霧したコムギ植物は、より少数の真菌増殖病巣を示し、耐性の増強
を示し、反復試験においてコムギうどんこ病が６０％抑制された（図５）。これ
とは対照的に、対照植物は、著しく罹患し、多数の著しい真菌増殖病巣を示した
。これらのデータは、ＩＮＡでのコムギ品種ＴＡＭ１０７の処理が、うどんこ病
に対して有効な獲得耐性を増強することを示している。

【０１７３】 ＩＮＡの取込みおよび下流遺伝子の活性化を分子的に評価するために、ＩＮＡ
で誘導可能（ＷＣＩ−２；Ｇｏｒｌａｃｈら，１９９６）または病原体で誘導可
能（ＷＩＲ−２；Ｋｍｅｃｌら，１９９５）であると確認された２つのコムギ遺
伝子の転写を、コムギ品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅの種々の誘導条件下で評価した。１
４日齢のコムギ植物に、２０％ アセトン／８０％ 水（ｖ／ｖ）＋０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）中の１ｍＭ ＩＮＡを噴霧し又は該噴霧溶液（−Ｉ
ＮＡ）で模擬処理を施し又は前記のとおりにエリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓ
ｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）ｆ ｓｐホルデイ（ｈｏｒｄｅｉ）（うどんこ病
菌）での攻撃を行なった。第３日に葉組織を集め、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試
薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を該製造業者の説明に従い使用して全ＲＮＡを単離した
。１０μｇの全ＲＮＡをアガロースゲル分離し、ＨＹＢＯＮＤ Ｎ＋ナイロン（
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）メンブレンに移した。遺伝子特
異的プライマーＯＢ２８（配列番号２６）およびＯＢ２９（配列番号２７）を使
用するＰＣＲ増幅により、ＷＣＩ−２遺伝子に対するＤＮＡプローブを調製した
。Ｍ１３フォワードおよびリバースプライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用
するＷＩＲ−２ ｃＤＮＡを含有するプラスミドのＰＣＲ増幅により、ＷＩＲ−
２に対するＤＮＡプローブを調製した。どちらの場合においても、以下の条件を
用いてＰＣＲを行なった：９４℃で５分間／９４℃で１分間／４５℃で４５秒間
／７２℃で１分間／７２℃で１０分間（サイクル３５）の３５サイクル。ＰＣＲ
由来のプローブをアガロースゲル精製し、^３２Ｐランダムプライミングにより標
識し、１００μｇ／ｍＬ魚類ＤＮＡを含有する２０ｍＬのＲａｐｉｄ−Ｈｙｂ（
Ａｍｅｒｓｈａｍ）に加え、該フィルターを６０℃で一晩ハイブリダイズさせた
。フィルターを６５℃で２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで２回（各２０分間）、
０．１×ＳＳＣ／０．５％ ＳＤＳで２回（各２０分間）洗浄し、オートラジオ
グラフィーに付した。

【０１７４】 コムギ品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅにおいては、ＷＣＩ−２遺伝子は二重の実験にお
いてＩＮＡにより特異的に誘導され、病原体の攻撃による誘導は検出されない。
該病原体特異的遺伝子ＷＩＲ−２は、このコムギ品種においてはＩＮＡにより若
干誘導されるが、コムギうどんこ病菌（Ｅ．ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ ｓｐ ｈｏ
ｒｄｅｉ）により強力に誘導される。これらの結果は、獲得耐性に関する同定さ
れているマーカーによりモニターされるとおり、Ｂｏｂｗｈｉｔｅコムギにおけ
るＩＮＡ誘導性獲得耐性経路の活性化を裏付けるものである。

【０１７５】 ＩＮＡおよび病原体誘導条件下のコムギＮｐｈ２遺伝子の誘導を試験した（図
６）。前記のとおり、コムギ（ｃｖ．Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）植物に１ｍＭ ＩＮＡ
を噴霧するか又は模擬処理を施した。ＡＲの発現前（処理の０時間後）およびＡ
Ｒの局所発現後（２４時間および７２時間後）、前記のとおりに、全ＲＮＡをＩ
ＮＡ処理葉組織から回収した。ＲＮＡ（１０μｇ）を、変性アガロースゲル電気
泳動により分離し、ＨＹＢＯＮＤ Ｎ＋メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）にトランスファーし、該Ｎｐｈ２プローブでハイブリダイ
ズさせた。ＫＳおよびＳＫプライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；３０サイクルの
ＰＣＲ：９４℃で５分間／９４℃で１分間／５５℃で１分間／７２℃で１．５分
間／７２℃で１０分間（３０サイクル））を使用する元のＮｐｈ２−１ ｃＤＮ
Ａ（配列番号７）のＰＣＲにより、該コムギＮｐｈ２プローブを作製した。該Ｐ
ＣＲ断片をアガロースゲル精製し、^３２Ｐランダムプライミングによりプローブ
用に調製した。ノーザンブロット分析のための条件は前記のとおりであった。

【０１７６】 本発明者らは、第３日までに、ＩＮＡ処理がＮｐｈ２の発現における１．５〜
２倍のアップレギュレーションを引き起こすことを証明した。コムギＮｐｈ２の
時機および誘導は、イネにおけるＮｐｈ１で示されているものに類似している。
これらの結果は、該獲得耐性経路がＢｏｂｗｈｉｔｅ品種において活性化される
らしいことを証明している。しかし、ＢｏｂｗｈｉｔｅのＡＲ応答は、うどんこ
病感染から該植物を有効に防御せず、一方、コムギ品種ＴＡＭ１０７は、うどん
こ病に対する強力な防御を与える非常に有効なＩＮＡ誘導性獲得耐性応答を有す
る。強力な転写活性化および耐病性を示すコムギ品種を同定するために、本発明
者らはこの分析を拡張し、ＩＮＡ誘導性うどんこ病耐性および下流マーカー遺伝
子の活性化を評価しているところである。この研究は、最初は、コムギ品種カン
ズラー（Ｋａｎｚｌｅｒ）、スレジュプナー（Ｓｌｅｊｐｎｅｒ）、リトモ（Ｒ
ｉｔｍｏ）、トレミエ（Ｔｒｅｍｉｅ）リアルト（Ｒｉａｌｔｏ）、ソイッソン
（Ｓｏｉｓｓｏｎ）、ブリガディエル（Ｂｒｉｇａｄｉｅｒ）を含んでいた。

【０１７７】 本発明者らは、該誘導性ＡＲ経路が、同一種内の品種間で異なる強度および有
効性を有している可能性があると予想している。これは、該ＡＲ経路における鍵
調節タンパク質（例えば、Ｎｐｈ２）の有効性によるものであるかもしれない。
コムギ品種ＴＡＭ１０７はＮｐｈ２−１およびＮｐｈ２−２遺伝子の起源であり
、優勢（ｓｕｐｅｒｉｏｒ）なＮｐｈ２対立遺伝子を表しうる。本発明者らは、
より弱い品種（例えば、Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）におけるＴＡＭ１０７ Ｎｐｈ２対
立遺伝子の過剰発現が、トランスジェニック的にＡＲ応答の増強に役立ちうると
予想している。強力なＡＲを有する品種におけるＴＡＭ１０７ Ｎｐｈ２対立遺
伝子の過剰発現は、耐性の増強を招く可能性があり、より強力な応答を引き起こ
し又は病原体防御のスペクトルを広げると考えられる。

【０１７８】 本発明者らは、Ｎｐｈ２に加えて、ストレス適応に関与する遺伝子が、ＡＲ応
答中にアップレギュレーションされうると仮定している。例えば、熱ショックタ
ンパク質ｈｓｐ９０は、細胞ストレス適応に関与することが示されている（Ａｌ
ｉら，１９９８；Ｍａｒｒｓら，１９９３）。この仮定を試験するために、本発
明者らは、前記と同じノーザンブロット分析を行なって、ｈｓｐ９０遺伝子発現
に対するＩＮＡおよび病原体での攻撃の影響および時機を確認した。オオムギｈ
ｓｐ９０に対するプローブをＲＴ−ＰＣＲにより調製した（実施例１を参照され
たい）。オリゴｄＴプライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してオオムギ（
ｃｖ．Ｍｏｒｅｘ）から抽出したポリＡ（２．５μｇ）から、第１鎖ｃＤＮＡを
合成した。約１２５ｎｇの第１鎖ｃＤＮＡを鋳型として使用し、ＯＢ３８（配列
番号２８）およびＯＢ３９（配列番号２９；３５サイクルのＰＣＲ：９４℃で５
分間／９４℃で１分間／４４℃で４５秒間／７２℃で１分間／７２℃で１０分間
）を使用して、病原体により誘導されうるオオムギｈｓｐ９０（ＧｅｎｅＢａｎ
ｋ受託ｘ６７９６０）の４５２ｂｐの断片をＰＣＲ増幅した。該ＰＣＲ断片をｐ
ＭＯＮ３８２０１（図２）内にクローニングし、配列が部分ｈｓｐ９０ ｃＤＮ
Ａであることを確認した（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉ
ｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）
。該ＰＣＲ産物をアガロースゲル精製し、ランダムプライミングにより^３２Ｐ標
識し、プローブとして使用した。Ｎｐｈ２およびＷＣＩ−２の場合と同じノーザ
ンブロットをｈｓｐ９０遺伝子発現に関してプローブした。本発明者らは、Ｎｐ
ｈ２と同じ時機およびパターンで、ＩＮＡ処理後にコムギにおいてｈｓｐ９０が
強力に誘導されることを見出した。このことは、ｈｓｐ９０が、獲得耐性の活性
化に関するもう１つのマーカー遺伝子として働きうることを示している。

【０１７９】 本発明者らは、未誘導条件下の発現のレベルを測定するために、コムギＮｐｈ
２転写の発生パターンを評価した。生育箱条件（１２時間／１２時間の昼／夜サ
イクル）下で成長したコムギ植物（ｃｖ．Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）を、７日後に収穫
した。植物を鉢植え用の養土から取り出し、根を水道水で洗浄し、植物を以下の
サンプルに分けた：根、子葉鞘、葉基。該葉を、葉身の基部より上（子葉鞘より
上＝葉部分１）から葉の先端（葉部分５）までの５つの等しい部分に分けた。全
ＲＮＡ（１０μｇ／レーン）を単離し、０．７ｋｂのＮｐｈ２ ＰＣＲ断片をプ
ローブとして使用して、前記のとおりにノーザンブロット分析を行なった。フィ
ルターを６５℃で一晩ハイブリダイズさせ、室温で１回（２×ＳＳＣ／０．１％
ＳＤＳ、５分間）、６５℃で２回（１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ、２０分間
）、６５℃で１回（０．５×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ）洗浄し、オートラジオ
グラフィーに付した。

【０１８０】 ノーザンブロット分析は、細胞分裂および伸長の領域に相当するコムギ葉の中
央部分においてＮｐｈ２の発現の上昇を示した（図７）。これとは対照的に、該
葉のその他の部分および根におけるＮｐｈ２の発現は低かった。Ｎｐｈ２を全て
の細胞型において広範囲でトランスジェニック的に過剰発現させることにより、
または特定の細胞型または組織に発現を導くことにより、本発明者らは、特定の
クラスの病原体が有効に防除されうると予想している。

【０１８１】 実施例９：単子葉植物Ｎｐｈ遺伝子の同定 強くＩＮＡに応答するＮｐｈ２コムギホモログを発現する植物を同定するため
に、本発明者らは、以下の登録体（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ）のＩＮＡ処理および
未処理植物におけるＮｐｈ２および下流応答遺伝子の両方の発現レベルを比較し
た：ティー・アエスチブム（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ−８）登録体；ティー・ジコ
ックム（Ｔ．ｄｉｃｏｃｃｕｍ）−７登録体；ティー・モノコックム（Ｔ．ｍｏ
ｎｏｃｏｃｃｕｍ）−７登録体；ティー・ドゥルム（Ｔ．ｄｕｒｕｍ）−８登録
体；ティー・タウシイ（Ｔ．ｔａｕｓｃｈｉｉ）−３３登録体。植物を温室内で
成長させ、ＩＮＡで処理し（または模擬処理し）、全ＲＮＡを単離し、Ｎｐｈ２
ＰＣＲ断片、ｈｓｐ９０またはＷＣＩ−２プローブを使用してノーザンブロッ
ト分析を行なった（実施例８に詳しく説明されている）。フィルターを６５℃で
一晩ハイブリダイズさせ、室温で１回（２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ、５分間
）、６５℃で２回（１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ、２０分間）、６５℃で１回
（０．５×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ）洗浄し、ハイブリダイズしているバンド
をオートラジオグラフィーにより可視化した。

【０１８２】 ノーザンブロット分析は、調べた全ての登録体においてＩＮＡ処理後にＮｐｈ
２の誘導が１〜２．５倍アップレギュレーションされることを示した。下流応答
遺伝子に関しては、遺伝子誘導能におけるはるかに大きなばらつきが認められた
。それぞれ熱ショック９０タンパク質ｈｓｐ９０（Ｍａｒｒｓら，１９９３）お
よびリポキシゲナーゼ（ＷＣＩ−２；Ｇｏｒｌａｃｈら，１９９６）をコードす
る最高レベルの２つの下流応答遺伝子が、登録体ＰＩ１５３８７２２（ｃｖ．Ｔ
．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）、ＴＡ５０２３（ｃｖ．Ｔ．ｄｕｒｕｍ）およびＴＡ
１５９９（ｃｖ．Ｔ．ｔａｕｓｃｈｉｉ）において認められた。

【０１８３】 実施例１０：Ｎｐｈ１およびＮｐｈ２での単子葉植物の形質転換 単子葉植物種内へのイネＮｐｈ１およびコムギＮｐｈ２遺伝子の形質転換は、
トランスジェニック植物の発現に適した分子構築物を集合させることにより促進
された。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換のた
めの構築物および粒子射撃形質転換のための構築物の集合を含むいくつかのアプ
ローチを採用した。

【０１８４】 イネアグロバクテリウム形質転換 イネＮｐｈ１およびコムギＮｐｈ２構築物をイネの形質転換のために調製した
。３個の初期構築物をアグロバクテリウム媒介形質転換用に作製し、２個を粒子
射撃用に作製した。５’非翻訳領域を含有するイネＮｐｈ１遺伝子と該バイナリ
ープラスミドとの集合は、以下の工程を含むものであった。Ｎｐｈ１を保持する
プラスミド（実施例２）を制限酵素ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、１．９
ｋｂの断片をゲル精製し、ｐＭＯＮ１９６４８シャトルベクターのＮｃｏＩ／Ｅ
ｃｏＲＩ（平滑）部位内にクローニングした。これは、ＮｏｔＩ制限部位に隣接
する強化３５Ｓプロモーター−ｈｓｐ０イントロン−Ｎｐｈ１ｃＤＮＡ−Ｎｏｓ
３’のカセットを与えた。該カセットをＮｏｔＩ ３．７ｋｂ断片として回収し
、バイナリーｐＭＯＮ１８６３４の対応ＮｏｔＩ部位内にクローニングした。５
’ＵＴＲを含有するＮｐｈ１を保持する最終的なバイナリープラスミドはｐＭＯ
Ｎ３０６４３（図８）である。

【０１８５】 イネＮｃｏＩプライマー（配列番号３４）およびＮＳ−１０プライマー（配列
番号３５）を使用して、５’ＵＴＲを欠くＮｐｈ１のもう１つの形態をｐＧＥＭ
Ｔプラスミド（実施例２）中のＮｐｈ１ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により構築して
、３８６ｂｐ断片を得、それを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａ
ｇｅｎ）を使用して精製した。該ＰＣＲ産物をＮｃｏＩＩ／Ｎａｒ１制限酵素で
消化して８３ｂｐの断片を得、それを使用して、全５’ＵＴＲを欠失させるため
に該プラスミドポリリンカー内のＮｃｏＩ部位を用いてＮｐｈ１完全長ｃＤＮＡ
中のＮｃｏＩ／Ｎａｒ１断片を置換した。該ＰＣＲ修飾は、該推定Ｎｐｈ１コー
ド配列内の最初のメチオニンコドンの直上流に新たなＮｃｏＩ部位を移した。該
修飾Ｎｐｈ１遺伝子を保持するプラスミドをＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶで制限消化し
、１．５ｋｂの断片をアガロースゲル精製し、ｐＭＯＮ１９６４８内にサブクロ
ーニングして（既に記載されているとおりに行なった）、ｐＭＯＮ３０６３９シ
ャトルベクターを作製した。ｅ３５Ｓプロモーター−ｈｓｐ７０イントロン−Ｎ
ｐｈ１（５’ＵＴＲを欠くもの）−Ｎｏｓ３’ターミネーター配列を保持するカ
セットを、ＮｏｔＩ断片として遊離させ、ｐＭＯＮ１８３６４バイナリープラス
ミド（図９）内にサブクローニングした。

【０１８６】 また、コムギＮｐｈ２−１ ｃＤＮＡをイネ形質転換用のバイナリープラスミ
ド内に集合させた。元のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ；実施例３）由来のＮｐｈ２−１遺伝子を単子葉植物のアグロバクテリ
ウム媒介形質転換に適した最終的なバイナリーベクター内にサブクローニングす
るためには、いくつかの工程を要した。該Ｎｐｈ２−１ ｃＤＮＡを、３’およ
び５’末端で修飾して、シャトルベクター内への後のサブクローニングに適した
制限部位を得た。該５’末端における修飾は、ＯＢ−６３（配列番号３２）およ
びＯＢ−６４（配列番号３３）を使用するＮｐｈ２−１ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
により達成され、それにより１７５ｂｐの断片を得、それを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ
ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。該ＰＣＲ産物をＣｌ
ａＩ／Ｎａｒ１制限酵素で消化して８３ｂｐの断片を得、それを使用して、Ｎｐ
ｈ２−１内の内因性ＣｌａＩ／Ｎａｒ１断片を置換した。該ＰＣＲ修飾は、該推
定Ｎｐｈ２−１コード配列の最初のメチオニンコドンの直上流に新たなＮｃｏＩ
部位を導入した。Ｎｐｈ２−１の３’末端における修飾は、ＯＢ−６１（配列番
号３０）およびＯＢ−６２プライマー（配列番号３１）を使用する該Ｎｐｈ２−
１ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により達成された。増幅された２８０ｂｐの断片を前
記のとおりに精製し、制限酵素ＸｂａＩ／ＢｓｍＩで消化して、１７０ｂｐの断
片を得、それを使用して、Ｎｐｈ２−１内の内因性ＸｂａＩ／ＢｓｍＩを置換し
た。この置換は、Ｎｐｈ２−１の３’末端の推定終結コドンの下流に唯一のＥｃ
ｏＲＩ制限部位を導入した。該５’および３’修飾領域全体の配列を確認した（
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）。該修飾コムギＮｐｈ２−
１ ｃＤＮＡを保持するプラスミドをＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩで制限消化して、１
．８ｋｂの断片を遊離させ、それをｐＭＯＮ１９８４６のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ
部位内にサブクローニングして、ｐＭＯＮ３０６３６シャトルベクターを得た。
該強化３５Ｓプロモーター−ｈｓｐ７０イントロン−Ｎｐｈ２−１−Ｎｏｓ３’
カセットを、ＮｏｔＩ消化により該シャトルベクターから遊離させ、ｐＭＯＮ１
８３６４のＮｏｔＩ部位内にクローニングした。Ｎｐｈ２−１を保持する最終的
なバイナリーはｐＭＯＮ３０６３７（図１０）である。

【０１８７】 形質転換の方法 ストック植物および外植片組織： 開花の７〜１１日後にジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）イネ品種Ｍ２０２の未
熟胚を収穫する。逆浸透（ＲＯ）水を含有する容器内に円錐花序を集める。穏和
な界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）の１滴を含有するＲＯ水中で円錐花序を回転さ
せる。ＲＯ水中で３回リンスする。円錐花序を７０％エタノール中で約６０秒間
回転させる。ＲＯ水でリンスする。種皮を除去する。脱皮種子をＲＯ水中に配置
する。無菌容器内に配置し、７０％エタノールで約３０秒間リンスする。エタノ
ールを無菌ピペットで除去する。５０％漂白剤＋１滴のＴｗｅｅｎ２０を加える
。カバーをし、室温で１５０ｒｐｍのシェーカー上に少なくとも３０秒間載せる
。無菌ＲＯ水で６回リンスする。胚を取り出す。

【０１８８】 アグロバクテリウムの培養および接種： バイナリーベクターを保持する武装解除（ｄｉｓａｒｍｅｄ）アグロバクテリ
ウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｃ５８（ＡＢＩ）を全ての実験に使用し
た。アグロバクテリウムの培養をグリセロールストックから又は新鮮にストリー
クされたプレートから開始し、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、５０ｍｇ／Ｌストレ
プトマイシンおよびスペクチノマイシンならびに２５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコ
ールを２００μＭアセトシリンゴン（ＡＳ）と共に含有する液体ＬＢ培地（ｐＨ
７．０）（Ｍｉｌｌｅｒ，１９７２）中、振とう（約１５０ｒｐｍ）しながら２
６〜２８℃で中期対数期（ＯＤ_６６０＝約１〜１．５）まで一晩培養した。該細
胞を４℃、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。２．２ｇ／Ｌ ＭＳ塩、１
ｍＬ／Ｌ ＭＳビタミン（１０００×ストック）、１１５ｍｇ／Ｌプロリン、１
０ｇ／Ｌグルコース、２０ｇ／Ｌショ糖を含有するＭＳＶＩ培地で該ペレットを
リンス／再懸濁させた。細胞を４℃、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。
該アグロバクテリウム細胞を該接種培地（ＭＳＰＬ）に再懸濁させ、ＯＤ_６６０ が１になるように該濃度を調節した。ＭＳＰＬ（ＭＳ塩，２．２ｇ／Ｌ；ＭＳビ
タミン，１ｍＬの１０００×ストック；プロリン，１１５ｍｇ／Ｌ；グルコース
，２６ｇ／Ｌ；ショ糖，６８．５ｇ／Ｌ）をＭＳＰＬ ５ｍｌ当たり１μＬのア
セトシリンゴンと共に、アグロバクテリウムのペレットに加え、それを所望のＯ
Ｄにした。無菌ペトリ皿の内側に、７５〜１００μＬのアグロバクテリウム液滴
を配置した。各液滴内に５個の胚を配置した。室温で１５分間インキュベートし
た。該アグロバクテリウム液滴を除去した。胚を共存培養培地（ＭＳ塩，２．２
ｇ／Ｌ；ＭＳビタミン，１ｍＬの１０００×ストック；チアミンＨＣｌ，０．５
ｍｇ／Ｌ；プロリン，１１５ｍｇ／Ｌ；グルコース，１０ｇ／Ｌ；ショ糖，２０
ｇ／Ｌ；２，４−Ｄ，２ｍｇ／Ｌ；ピクロラム（ｐｉｃｈｌｏｒａｍ）），２．
２ｍｇ／Ｌ；低ＥＥＯアガロース，５．５ｇ／Ｌ；アセトシリンゴン，２００μ
Ｍ；ＡｇＮＯ_３，２０μＭ）上に配置し、２３℃で１〜３日間インキュベートし
た。１日後、４．４ｍｇ／Ｌ ＭＳ塩、１ｍＬ／Ｌ ＭＳビタミン（１０００×
ストック）、１ｍｇ／ＬチアミンＨＣＬ、２０ｇ／Ｌショ糖、５００ｍｇ／Ｌグ
ルタミン、７５０ｍｇ／Ｌ塩化マグネシウム、１００ｍｇ／Ｌカゼイン水解物、
２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ（ｐＨ５．８）、２ｇ／Ｌ フィタゲル（Ｐｈｙｔａｇ
ｅｌ）を含有するディレイ（Ｄｅｌａｙ）培地に胚を移した。高圧滅菌後、２．
２ｍｇ／Ｌピクロラム、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、２０μＭ硝酸銀（２ｍ
ｇ／ｍＬストックの１．７ｍＬ／Ｌ）を加えた。

【０１８９】 選択および再生 暗所中のディレイ（ｄｅｌａｙ）培地上で２４℃で７日後、４０ｍｇ／Ｌ Ｇ
４１８および２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンで補足されたＮＰＴ１（表２）に該
未熟胚を移した。１週間後、該胚を小さな小片に継代培養し、４０ｍｇ／Ｌ Ｇ
４１８および２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンで補足された前再生培地（ＮＰＴ２
）上に配置した。２週間後、２５ｍｇ／Ｌ Ｇ４１８および１００ｍｇ／Ｌカル
ベニシリンで補足されたＮＰＴ３に小片を移し、２４℃でパーシバル（ｐｅｒｃ
ｉｖａｌ）の１６時間の光周期に配置した。２週間後、緑色のシュートが形成し
始めたら、２５ｍｇ／Ｌ Ｇ４１８および１００ｍｇ／Ｌカルベニシリンで補足
されたフィタトレイ（ｐｈｙｔａｔｒａｙ）内のＮＰＴ４にすべての緑色領域を
移した。さらに２〜４週間後、非形質転換植物は矮化し、該フィタトレイの頭部
までは成長しないであろう。該フィタトレイの頭部まで成長し該根上に根毛を有
する植物の集団を維持した。植物を穏やかに分離し、２５ｍｇ／Ｌ Ｇ４１８お
よび１００ｍｇ／Ｌカルベニシリンで補足されたＮＰＴ４フィタトレイに個々の
植物を入れた。植物を、この時点（それが該フィタトレイの頭部に達し、根毛を
有する良好な根系を有する場合）で温室に送ることができる。

【０１９０】

【表２】

【０１９１】 イネの粒子射撃形質転換 ２つの構築物をイネの粒子射撃形質転換用に集合させた。ｅ３５Ｓプロモータ
ー−ｈｓｐ７０イントロン−イネＮｐｈ１ ｃＤＮＡ（５’ＵＴＲを欠くもの）
−Ｎｏｓ ３’ターミネーターを含有するカセットをｐＭＯＮ３０６３９シャト
ルベクターからのＮｏｔＩ断片としてｐＭＯＮ１９５７２のＮｏｔＩ部位内にサ
ブクローニングした。最終的なプラスミドｐＭＯＮ３０６４５（図１１）をＫｐ
ｎＩで制限消化し、精製された６７５４ｂｐの断片をイネ胚の粒子射撃用に使用
した。ｅ３５Ｓプロモーター−ｈｓｐ７０イントロン−コムギＮｐｈ２−１ ｃ
ＤＮＡ−Ｎｏｓ ３’ターミネーターを含有するカセットをｐＭＯＮ３０６３６
からのＮｏｔＩ断片としてｐＭＯＮ１９５７２のＮｏｔＩ部位内にサブクローニ
ングした。最終的なプラスミドｐＭＯＮ３０６４４（図１２）をＰｖｕＩＩで制
限消化し、精製された７４１２ｂｐの断片をイネ胚を射撃するために使用した。

【０１９２】 ビーズ調製工程からＰＥＧを除いたＣｈｒｉｓｔｏｕら（１９９１）の方法を
用いる粒子射撃により、イネを形質転換した。１ｍＭグリフォセートを６週間使
用した以外はＡｂｅｄｉｎｉａら（１９９７）の方法を用いて、選択を行なった
。推定トランスジェニックカルス片を、０．１ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ、０．１ｍｇ／
Ｌゼアチンおよび０．０２ｍＭグリフォセートで補足されたＭＳ培地に移し、光
下で２３℃で３週間培養した。小さな緑色シュートを、１／２ ＭＳ塩、ＭＳビ
タミン、１００ｍｇ Ｍｙｏ−イノシトール、６０ｇｍ／Ｌショ糖、０．５ｍｇ
／Ｌ ＩＢＡおよび０．０２ｍＭグリフォセート（高圧滅菌後に加えられたもの
）を含有する培地に移した。シュートを光下で２３℃で２週間培養した。

【０１９３】 コムギの形質転換 コムギ植物の形質転換のために、前記のｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ内の修飾Ｎｐｈ
２−１ ｃＤＮＡをＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、１．８ｋｂの断片をシャト
ルベクター（ｐＭＯＮ３２６３５）内に対応ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位において
サブクローニングした。これは、ｅ３５Ｓプロモーター−ＣＡＢリーダー−イネ
アクチンイントロン−Ｎｐｈ２−１−コムギｈｓｐ１７ ３’ターミネーターを
含有するカセットを与えた。該全カセットをＮｏｔＩ制限断片として切り出し、
バイナリーベクターｐＭＯＮ４５１１９内の対応するＮｏｔＩ部位内にクローニ
ングした。Ｎｐｈ２−１での単子葉植物のアグロバクテリウム媒介形質転換のた
めの最終的なバイナリー体はｐＭＯＮ３０６３５（図１３）である。

【０１９４】 １．外植片の調製 コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ）ｃｖ Ｂｏｂｗｈｉｔｅ
の未熟胚を、受粉の１３〜１５日後の未熟えい果（コムギ小穂）から単離し、Ｃ
Ｍ４Ｃ（表３）上で３〜４日間培養した。胚形成性カルスを有さない胚をアグロ
バクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）接種用に選択した。

【０１９５】

【表３】

【０１９６】 ２．アグロバクテリウムの培養および接種 バイナリーベクターを保持する武装解除（ｄｉｓａｒｍｅｄ）アグロバクテリ
ウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｃ５８（ＡＢＩ）を全ての実験に使用し
た。アグロバクテリウムの培養をグリセロールストックから又は新鮮にストリー
クされたプレートから開始し、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、５０ｍｇ／Ｌ ス
トレプトマイシンおよびスペクチノマイシンならびに２５ｍｇ／Ｌ クロラムフ
ェニコールを２００μＭ アセトシリンゴン（ＡＳ）と共に含有する液体ＬＢ培
地（ｐＨ７．０）（Ｍｉｌｌｅｒ，１９７２）中、振とう（約１５０ｒｐｍ）し
ながら２６〜２８℃で中期対数期（ＯＤ_６６０＝約１〜１．５）まで一晩培養し
た。該アグロバクテリウム細胞を該接種培地に再懸濁させ、ＯＤ_６６０が１にな
るように該濃度を調節した。ＣＭＣ４Ｃ培地内で培養した未熟胚を、ペトリプレ
ート当たり１０ｍＬまたは細胞培養クラスタープレート当たり５ｍＬの接種培地
を含有する無菌ペトリプレート（１６×２０ｍｍ）または６ウェル細胞培養プレ
ート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ，Ｃａｍｂｒｉｄｅ，ＭＡ）内に移
した。アグロバクテリウム細胞の最終濃度が０．５のＯＤ_６６０となるように又
は幾つかの実験においては０．２５のＯＤ_６６０となるように、等量の該アグロ
バクテリウム細胞懸濁液を加えた。ほとんどの実験においては、プルロニック（
ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８を０．０１％の最終濃度で該接種混合物に加えた。該
アグロバクテリウムと未熟胚（ＩＥ）との比は、約１０ｍＬ：２０〜２００ Ｉ
Ｅであった。接種のための条件は、２３〜２６℃の温度および２５〜３０分間の
持続時間であった。

【０１９７】 ３．共存培養 該接種時間の後、社内の真空装置を使用することにより、残りのアグロバクテ
リウム細胞を該外植片から取り出した。１枚の無菌ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ
）Ｎｏ．１濾紙（該ペトリプレートの大きさに合わせたもの）を６０×１５また
は６０×２０ｍｍペトリ皿のそれぞれに配置した。１７５〜１９０μＬの無菌水
を該濾紙の中央部に配置した。２〜３分後、該接種未熟胚を該プレート内に配置
した。通常、２０〜５０個の外植片を１つのスタック（積み重ね）として分類し
（約１ｃｍのサイズで６０〜８０ｍｇ／スタック）、各プレート上に４〜５個の
スタックを得た。該プレートを直ちにパラフィルム処理し、ついで暗所中、２４
〜２６℃で２〜３日間共存培養した。

【０１９８】 ４．選択および再生 該ディレイ（ｄｅｌａｙ）培地上で２〜３日後、２５ｍｇ／Ｌ Ｇ４１８およ
び５００ｍｇ／Ｌ カルベニシリンで補足されたＣＭ４Ｃに該未熟胚を移した。
２〜３週間後、該胚を、より小さな小片（〜２ｍｍ）に分け、２５ｍｇ／Ｌ Ｇ
４１８および２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリンで補足された第１再生培地ＭＭＳ
．２Ｃ（表２）に継代した。該再生培地に移す際に、各カルス片を更に幾つかの
小片（〜２ｍｍ）に分割した。移して２週間経過後、若いシュートおよび生存可
能なカルス組織を、同じ濃度のＧ４１８およびカルベニシリンを含有する第２再
生培地ＭＭＳ０Ｃ（表２）に移した。より大きな組織片を、既に記載されている
とおりの、より小さな小片に分離した。真の形質転換体であると後に確認された
小植物は、この培地上で著しく成長し強い根系を形成した。１０本の短く強い根
を有する強い根毛または二次根を有する植物を、更なる成長および選択のために
該第２再生培地を含有するＳｕｎｄａｅカップ（Ｓｗｅｅｔｈｅａｒｔ Ｃｕｐ
Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）に移した。該Ｓｕｎｄａｅカップ内
での成長期間中に、非形質転換体のほとんどが枯死するか、またはＧ４１８に対
する感受性の徴候を示した。強い根系を有し著しく成長するＧ４１８に非常に耐
性である植物を、それが該Ｓｕｎｄａｅカップの頭部まで成長する前に土壌に移
した。同一胚に由来する全ての植物を、同一事象からの同胞とみなした。

【０１９９】 ５．該トランスジェニック植物の検出および分析 高輝度放電（ＨＩＤ）Ｓｙｌｖａｎｉａ灯（ＧＴＥ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ
ｒｐ．，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ）により得られる８００ｍｏｌｍ^−２ｓ^{− １} で１６時間の光周期の環境的に制御された生育箱内で、該植物を成長させた。
該昼／夜温度は１８／１６℃であった。該植物のほとんどを土壌に移すためには
、接種から約２．５〜３ヵ月を要し、視覚的に認められる異常は観察されなかっ
た。後記のとおりに、各植物を獲得耐性遺伝子に関して試験する。

【０２００】 実施例１１：Ｎｐｈ２−１トランスジーンを保持するトランスジェニックコム
ギの分析 コムギ品種「Ｂｏｂｗｈｉｔｅ」内へのＮｐｈ２−１（ｐＭＯＮ３０６３５）
のアグロバクテリウム媒介形質転換は、独立した５１個のトランスジェニック系
統を与えた。Ｒ０植物のＲＮＡゲルブロット分析は、一定範囲のトランスジーン
の発現を示し、３６個の系統が、Ｎｐｈ２−１を低レベル（対照植物より低い又
はそれと同様）で発現し、６個の植物は、２〜５倍高い相対転写レベルを含有し
、９個の系統は、未形質転換対照より少なくとも５倍高いレベルを含有していた
。Ｔ−ＤＮＡ座位の数を遺伝的に測定するために、一定範囲の発現レベルを示す
無作為に選択した１３個のＲ０植物を、成熟するまで成長させて、Ｒ１種子を単
離した。Ｒ０植物１個当たり約４０個のＲ１種子が発芽し、３葉段階まで成長し
た。これらのＲ１実生にパラモマイシンを噴霧して、ＮＰＴＩＩ遺伝子の発現に
関してアッセイした。分析した全１４個の事例においては、該Ｒ１系統群におい
てパラモマイシン耐性の３：１（耐性：感受性）の分離が認められ、このことは
、該Ｔ−ＤＮＡが単一座位において組込まれていることを示している。

【０２０１】 前記Ｒ１系統群の９個において、うどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍ
ｉｎｉｓ ｐｖ．ｔｒｉｔｉｃｉ）を使用する接種試験を行なった。各系統群は
、３週段階まで成長した２４個のパラモマイシン耐性Ｒ１植物を含有していた。
これらのトランスジェニック植物および未形質転換対照の両方に、うどんこ病菌
（Ｅ．ｇ．ｔｒｉｔｉｃｉ）を感染させ、それを１１日後に疾患徴候に関して評
価した。この試験においては、該トランスジェニック系統のいずれもが、対照植
物と比較した場合の耐性レベルの増加を示さなかった。実際のところ、９個中７
個の系統が、感受性の若干の増加を示した（Ｐ＜０．０５）。平均では、疾患徴
候の相対感受性は、トランスジェニック系統では対照より約１０％高かった。シ
ロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるＮＰＲ１の場合とは異なり、
Ｎｐｈ２−１の過剰発現はコムギにおける耐病性を促進しないらしい。

【０２０２】 ＳＡＲの化学的活性化後にトランスジェニック系統において潜在的に誘導され
る耐性のレベルを測定するために、４個のＲ１集団のそれぞれを、１２個の植物
の２群（一方の群はＩＮＡ処理したもの、もう一方の群は模擬処理したもの）に
分けた。３日後、各亜群を、前記のとおりに、うどんこ病菌（Ｅ．ｇ．ｔｒｉｔ
ｉｃｉ）で疾患に関して試験した。対照である非トランスジェニックＢｏｂｗｈ
ｉｔｅ植物のＩＮＡ処理後、疾患徴候は、模擬処理植物と比較して２５％減少し
た。ＩＮＡ噴霧処理により生じた疾患減少のこのレベルは、本発明者らのアッセ
イ条件において、試験間で一貫している。しかし、ＩＮＡ誘導後のそれらの４個
のトランスジェニック集団のいずれにおいても、有意な徴候減少は観察されなか
った。いずれの場合においても、該処理および模擬処理対照亜集団は病原体耐性
の増強を示さず、疾患の重症度は未処理Ｂｏｂｗｈｉｔｅ対照と比較しうるもの
であった。これらの結果は、Ｎｐｈ２−１を含有するトランスジェニックコムギ
植物が、それらの全身性獲得耐性応答に関して損なわれていることを示している
。

【０２０３】 実施例１２：耐性の増強に関するトランスジェニックイネの分析 実施例１０に記載のとおり、種々のバイナリー構築物をイネ（ｃｖ．Ｍ２０２
）内に導入し、得られたトランスジェニック植物を分析的に及び疾患試験により
分析した（表４）。

【０２０４】

【表４】

【０２０５】 各トランスジェニック集団をＮｐｔＩＩの発現およびＮｐｈ１タンパク質の発
現に関してスクリーニングした（ＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタンブロット
分析）。また、選択したＲ０系統を、Ｎｐｈ１転写産物のレベルの変化に関して
ＲＮＡブロット分析により評価した。低度、中等度および高度に発現する系統の
サブセットに関して、該Ｒ０植物を自家受粉させ、得られたＲ１集団を耐病性、
Ｎｐｈ１転写産物レベルおよびＮｐｈ１タンパク質蓄積に関してアッセイした。

【０２０６】 ｐＭＯＮ３０６４０に関しては、独立した５８個のＲ０系統がアグロバクテリ
ウム形質転換により得られた。植物をＥＬＩＳＡによりスクリーニングして、９
個の高度、８個の中等度および４１個の低度発現系統を得た（高度＝対照より２
．５倍以上高い；中等度＝対照より１．５〜２．５倍高い；低度＝対照の１．０
〜１．５倍）。これらのうちの１９個の系統（６個の高度発現系統、５個の中等
度、および７個の低度発現系統）を自家受粉させ、該Ｒ１集団を、イネいもち病
の原因因子であるマグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓ
ｅａ）に対する耐病性に関してスクリーニングした。試験した１９個の集団のう
ちの１つの系統（１２５３６）だけが、該Ｒ１分離個体のなかで耐性の増強を示
した（耐性６：感受性１４）。該系統１２５３６の耐性応答は、ＩＮＡ誘導耐性
イネの表現型に類似した、病原体の攻撃後の細胞死の非常に小さな斑点として現
れる。壊死の広がりは認められず、植物は依然として健常である。該１２５３６
Ｒ１分離個体のウエスタンブロット分析は、Ｎｐｈ１タンパク質レベルの分離
を示し、交差ハイブリダイズバンドは、対照植物由来の認識タンパク質と同等ま
たはそれより有意に強力であった。ｐＭＯＮ３０６４３では、独立した２２個の
系統が得られ、それらのすべては、低レベルのＮｐｈ１タンパク質蓄積を有する
Ｒ０植物を与えた。ｐＭＯＮ３０６４０構築物とは対照的に、これらの系統は、
タンパク質発現における適度な増強を示したに過ぎず、１５／２２個は対照植物
と同一であり、残りの７／２２個は、対照より１．１倍〜１．４倍高かった。疾
患スクリーニングのために、１６個のＲ０植物を自家受粉させてＲ１集団を得た
。これらの１６個のＲ１集団のうちの５個の系統が、いもち病耐性分離個体を含
有していた。

【０２０７】 また、２つの異なる構築物のうちの１つを使用するＤＮＡパーティクルガン射
撃により、９２個のＲ０イネトランスジェニック系統を作製した。イネ構築物ｐ
ＭＯＮ３０６４４を使用して４８個の系統が得られ、コムギＮｐｈ２−１構築物
ｐＭＯＮ３０６４５を使用して４４個の系統が得られた。ｐＭＯＮ３０６４０と
等価であろうｐＭＯＮ３０６４４構築物からは、本発明者らは、耐性の増強を示
す１０／４４個のＲ０系統を見出している。コムギＮｐｈ２−１遺伝子（ｐＭＯ
Ｎ３０６４５）を保持する４４個の系統のうち、本発明者らは、独立した４個の
耐性系統を同定した。前記のとおり、これらのトランスジェニック体の耐性は、
化学物質ＩＮＡによる誘導の場合と表現型上は類似したものとして現れ、真菌感
染部位における限局した非常に小さな病変として現れる。感受性相互作用におい
て認められる広範に広がる病変とは異なり、これらの壊死斑点のサイズは決して
増加せず、真菌胞子生成は劇的に抑制された。これらの結果は、コムギおよびイ
ネの両方のＮｐｒホモログが、イネにおいて発現されると、ＳＡＲ経路を増強す
ることを示唆している。

【０２０８】 Ｎｐｈ１またはＮｐｈ２−１のトランスジェニック過剰発現は、ＩＮＡ誘導で
認められるものに類似したマグナポルセ・グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）に対す
る強力な耐性を促し、非生物的ストレス（例えば、熱、干ばつ及び寒冷）に対す
るイネの耐性をも改善するはずであり、植物の活力がＮｐｈ１またはＮｐｈ２の
トランスジェニック発現により増強されるであろう。

【０２０９】 本明細書に記載の全ての刊行物および特許出願は、本発明に関連する当業者の
技術水準を示している。すべての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許
出願が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個々に示されているの
と同程度に、参照により本明細書に組み入れられるものとする。

【０２１０】

【表５】

【０２１１】 本発明は例示目的で詳細に記載されているが、そのような詳細な説明は専ら例
示目的にすぎず、特許請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲から
逸脱することなく種々の変更が本発明において当業者により施されうると理解さ
れる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびニコチアナ・グルチノサ（
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９８）由
来のＮｐｒ１双子葉植物ホモログに関する推定アミノ酸配列ならびにトウモロコ
シ（Ｃｏｒｎ）クローン７００２１４８７２配列（配列番号７）のアライメント
を示す。

【図２】 プラスミドｐＭＯＮ３８２０１を示す。

【図３Ａ】 ＩＮＡでの化学処理によるイネ（ｃｖ．Ｍ２０２）におけるＡＲの誘導、およ
びイネいもち病菌（マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉ
ｓｅａ））に対する防御を示し、Ａは、未処理対照葉の外観である。

【図３Ｂ】 ＩＮＡでの化学処理によるイネ（ｃｖ．Ｍ２０２）におけるＡＲの誘導、およ
びイネいもち病菌（マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉ
ｓｅａ））に対する防御を示し、Ｂは、０．５ｍＭ ＩＮＡで処理された葉の外
観である。

【図４】 ＩＮＡ処理後およびイネいもち病菌（マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐ
ｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ））での攻撃後の、ノーザンブロット分析によるイネ
Ｎｐｈ１の誘導パターンを示す。

【図５Ａ】 ＩＮＡ処理後のコムギ（ｃｖ．ＴＡＭ１０７）におけるＡＲの誘導、およびウ
ドンコ病菌（エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）
ｆ ｓｐホルデイ（ｈｏｒｄｅｉ））に対する防御を示し、Ａは低い倍率の模擬
噴霧対照を示す。

【図５Ｂ】 ＩＮＡ処理後のコムギ（ｃｖ．ＴＡＭ１０７）におけるＡＲの誘導、およびウ
ドンコ病菌（エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）
ｆ ｓｐホルデイ（ｈｏｒｄｅｉ））に対する防御を示し、Ｂは、より高い倍率
の、より小さな選択領域を示す。

【図５Ｃ】 ＩＮＡ処理後のコムギ（ｃｖ．ＴＡＭ１０７）におけるＡＲの誘導、およびウ
ドンコ病菌（エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）
ｆ ｓｐホルデイ（ｈｏｒｄｅｉ））に対する防御を示し、Ｃは、２００ｐｐｍ
のＩＮＡを噴霧した葉の一部の低い倍率の外観を示す。

【図５Ｄ】 ＩＮＡ処理後のコムギ（ｃｖ．ＴＡＭ１０７）におけるＡＲの誘導、およびウ
ドンコ病菌（エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）
ｆ ｓｐホルデイ（ｈｏｒｄｅｉ））に対する防御を示し、）Ｄは、より高い倍
率の、同じ葉の、より小さな領域を示す。

【図６】 ＩＮＡ処理後のコムギにおけるコムギＮｐｈ２遺伝子発現の誘導プロフィール
のノーザンブロット分析を示す。ノーザンブロットをトウモロコシＥＳＴ ７０
０２１４８７２ Ｎｐｒ１ホモログでプローブした。各レーンに０．５μｇのコ
ムギｍＲＮＡをローディングした。レーン１：時間「０」の植物；レーン２：２
４時間の時点のＩＮＡ処理植物；レーン３：４８時間の時点のＩＮＡ処理植物；
レーン４：７２時間の時点のＩＮＡ処理植物；レーン５：９６時間の時点のＩＮ
Ａ処理植物。

【図７】 品種ＴＡＭ１０７におけるコムギＮｐｈ２の発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａ
ｌ）発現パターンのノーザンブロット分析を示す。ノーザンブロットを０．７ｋ
ｂのコムギＮｐｈ２ ＰＣＲ断片でプローブした。各レーンに１５μｇのコムギ
（ｃｖ．Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）ｍＲＮＡをローディングした。レーン１：根組織；
レーン２：子葉鞘；レーン３：葉基；レーン４：葉断片１；レーン５：葉断片２
；レーン６：葉断片３；レーン７：葉断片４；レーン８：葉断片５（葉の先端）
。

【図８】 内因性イネ５’リーダー配列と共にイネＮｐｈ１ ｃＤＮＡを含有する、イネ
の形質転換のためのｐＭＯＮ３０６４３バイナリープラスミドを示す。該バイナ
リーコスミドベクターのＴ−ＤＮＡ構造は、ＬＢ＝左境界；ＲＢ＝右境界；Ｐ−
ｅ３５Ｓ＝カリフラワーモザイクウイルスの強化３５Ｓプロモーター；Ｋａｎ＝
Ｔｎ５ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩのコード領域；Ｎｏｓ３’＝
ノパリンシンターゼ遺伝子の終結配列を含む。

【図９】 イネ５’リーダー配列を欠き該推定コード領域に対応するイネＮｐｈ１ ｃＤ
ＮＡを含有する、イネの形質転換のためのｐＭＯＮ３０６４０バイナリープラス
ミドを示す。

【図１０】 使用する推定コード領域に対応するコムギＮｐｈ２−１ ｃＤＮＡを含有する
、イネの形質転換のためのｐＭＯＮ３０６３７バイナリープラスミドを示す。

【図１１】 内因性イネ５’リーダー配列を含有するイネＮｐｈ１ ｃＤＮＡを含有する、
イネの粒子射撃形質転換に使用するｐＭＯＮ３０６４５プラスミドを示す。

【図１２】 該推定コード領域に対応するコムギＮｐｈ２−１ ｃＤＮＡを含有する、イネ
の粒子射撃形質転換に使用するｐＭＯＮ３０６４４プラスミドを示す。

【図１３】 コムギＮｐｈ２−１コード配列を含有する、コムギの形質転換のためのｐＭＯ
Ｎ３０６３５プラスミドを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スリバスターバ，ニーラム アメリカ合衆国、ミシガン・48105、ア ン・アーバー、ヒツコリー・ポイント・ド ライブ・2394 (72)発明者 ソーズ，キヤスリーン・エム アメリカ合衆国、ミズーリ・63017、チエ スタフイールド、リバー・ベンド・ドライ ブ・92 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD17 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 EA04 GA11 HA01 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC20 BA02 CA24 CA53 4H045 AA10 BA10 CA31 CA32 DA86 EA05 FA74

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号４、配列番号１０および配列番号１１よりなる群か
   ら選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列。
2. 【請求項２】 配列番号１の核酸配列またはその相補体またはストリンジェ
   ンシーの高い条件下で配列番号１にハイブリダイズする配列を含む、請求項１記
   載の核酸配列。
3. 【請求項３】 配列番号５の核酸配列またはその相補体またはストリンジェ
   ンシーの高い条件下で配列番号５にハイブリダイズする配列を含む、請求項１記
   載の核酸配列。
4. 【請求項４】 配列番号６の核酸配列またはその相補体またはストリンジェ
   ンシーの高い条件下で配列番号６にハイブリダイズする配列を含む、請求項１記
   載の核酸配列。
5. 【請求項５】 さらにＲＮＡ配列として定義される、請求項１記載の核酸配
   列。
6. 【請求項６】 ａ）配列番号４を含むタンパク質をコードする配列番号１の
   ヌクレオチド配列、 ｂ）遺伝暗号の縮重により、ａ）のヌクレオチド配列にコードされるペプチド
   をコードするヌクレオチド配列、および ｃ）ストリンジェンシーの高い条件下でａ）またはｂ）のいずれかにハイブリ
   ダイズするヌクレオチド配列 よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列である又はそれに相補的である単離さ
   れたＤＮＡ分子。
7. 【請求項７】 ａ）配列番号１０を含むタンパク質をコードする配列番号５
   のヌクレオチド配列、 ｂ）遺伝暗号の縮重により、ａ）のヌクレオチド配列にコードされるタンパク
   質をコードするヌクレオチド配列、および ｃ）ストリンジェンシーの高い条件下でａ）またはｂ）のいずれかにハイブリ
   ダイズするヌクレオチド配列 よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列である又はそれに相補的である単離さ
   れたＤＮＡ分子。
8. 【請求項８】 ａ）配列番号１１を含むタンパク質をコードする配列番号６
   のヌクレオチド配列、 ｂ）遺伝暗号の縮重により、ａ）のヌクレオチド配列にコードされるタンパク
   質をコードするヌクレオチド配列、および ｃ）ストリンジェンシーの高い条件下でａ）またはｂ）のいずれかにハイブリ
   ダイズするヌクレオチド配列 よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列である又はそれに相補的である単離さ
   れたＤＮＡ分子。
9. 【請求項９】 配列番号４、配列番号１０および配列番号１１よりなる群か
   ら選ばれる少なくとも１５アミノ酸の連続的アミノ酸配列を含む獲得耐性ポリペ
   プチドをコードするＤＮＡ配列。
10. 【請求項１０】 さらに組換えベクターとして定義される、請求項９記載の
    ＤＮＡ配列。
11. 【請求項１１】 該ＤＮＡがプロモーターに作動的に連結しており、該プロ
    モーターが該ＤＮＡ配列を発現する、請求項１０記載のＤＮＡ配列。
12. 【請求項１２】 該プロモーターが、ＦＭＶ ３５Ｓプロモーター、強化Ｆ
    ＭＶプロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモ
    ーター、ＥＩＦ−４Ａプロモーター、ＬＴＰプロモーター、アクチンプロモータ
    ー、サトウキビバドナウイルスプロモーター、ｈｓｐ９０プロモーター、β−グ
    ルカナーゼプロモーター、リポキシゲナーゼプロモーターおよびユビキチンプロ
    モーターよりなる群から選ばれる、請求項１１記載のＤＮＡ配列。
13. 【請求項１３】 請求項９記載のＤＮＡ配列を含んでなる組換え宿主細胞。
14. 【請求項１４】 さらに植物細胞として定義される、請求項１３記載の組換
    え宿主細胞。
15. 【請求項１５】 リンゴ、オオムギ、ブロッコリー、キャベツ、カノラ、ニ
    ンジン、柑橘類、トウモロコシ、綿、ニンニク、オートムギ、タマネギ、エンド
    ウ、ラッカセイ、コショウ、ジャガイモ、イネ、ライムギ、モロコシ、ダイズ、
    イチゴ、テンサイ、サトウキビ、トマトおよびコムギよりなる群から選ばれるも
    のとして更に定義される、請求項１４記載の植物細胞。
16. 【請求項１６】 さらにコムギまたはイネ植物細胞として定義される、請求
    項１３記載の組換え宿主細胞。
17. 【請求項１７】 ａ）配列番号１〜２または配列番号５〜８のいずれかのヌ
    クレオチド配列、 ｂ）遺伝暗号の縮重により、配列番号４または配列番号１０〜１１のいずれか
    に含有される単一の連続的ＯＲＦにコードされるタンパク質をコードするヌクレ
    オチド配列、および ｃ）ストリンジェンシーの高い条件下で配列番号２〜３または配列番号５〜８
    のいずれかにハイブリダイズするヌクレオチド配列 よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列である又はそれに相補的である単離さ
    れた核酸配列。
18. 【請求項１８】 請求項６記載のＤＮＡ配列にコードされる単離された獲得
    耐性ポリペプチドであって、該ポリペプチドが配列番号４に記載のアミノ酸配列
    を含むことを特徴とする獲得耐性ポリペプチド。
19. 【請求項１９】 請求項７記載のＤＮＡ配列にコードされる単離された獲得
    耐性ポリペプチドであって、該ポリペプチドが配列番号１０に記載のアミノ酸配
    列を含むことを特徴とする獲得耐性ポリペプチド。
20. 【請求項２０】 請求項８記載のＤＮＡ配列にコードされる単離された獲得
    耐性ポリペプチドであって、該ポリペプチドが配列番号１１に記載のアミノ酸配
    列を含むことを特徴とする獲得耐性ポリペプチド。
21. 【請求項２１】 該ポリペプチドがコムギまたはイネから単離された、請求
    項１８記載のポリペプチド。
22. 【請求項２２】 該ポリペプチドがコムギまたはイネから単離された、請求
    項１９記載のポリペプチド。
23. 【請求項２３】 該ポリペプチドがコムギまたはイネから単離された、請求
    項２０記載のポリペプチド。
24. 【請求項２４】 配列番号４に記載の獲得耐性ポリペプチドをコードするト
    ランスジーンがゲノム内に組込まれたトランスジェニック植物。
25. 【請求項２５】 配列番号１０に記載の獲得耐性ポリペプチドをコードする
    トランスジーンがゲノム内に組込まれたトランスジェニック植物。
26. 【請求項２６】 配列番号１１に記載の獲得耐性ポリペプチドをコードする
    トランスジーンがゲノム内に組込まれたトランスジェニック植物。
27. 【請求項２７】 該ポリペプチドが配列番号１のＤＮＡコード配列にコード
    される、請求項２４記載のトランスジェニック植物。
28. 【請求項２８】 該ポリペプチドが配列番号５のＤＮＡコード配列にコード
    される、請求項２５記載のトランスジェニック植物。
29. 【請求項２９】 該ポリペプチドが配列番号６のＤＮＡコード配列にコード
    される、請求項２６記載のトランスジェニック植物。
30. 【請求項３０】 該トランスジーンを含んでなる請求項２４記載の植物の子
    孫または種子。
31. 【請求項３１】 該トランスジーンを含んでなる請求項２５記載の植物の子
    孫または種子。
32. 【請求項３２】 該トランスジーンを含んでなる請求項２６記載の植物の子
    孫または種子。
33. 【請求項３３】 配列番号４、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸
    よりなる群から選ばれるポリペプチドをコードする核酸配列を植物に付与するこ
    とを含んでなる、植物病原体の防除方法であって、該アミノ酸配列が、該植物に
    おける獲得耐性を増強するのに十分な量で産生されることを特徴とする方法。
34. 【請求項３４】 配列番号４、配列番号１０および配列番号１１に記載のア
    ミノ酸配列よりなる群から選ばれる獲得耐性ポリペプチドを植物に付与すること
    を含んでなる、植物病原体の防除方法であって、該ポリペプチドが、該植物にお
    ける獲得耐性を増強するのに十分な量で産生されることを特徴とする方法。