JP2002541840A - 電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβサブユニットタンパク質の新規ファミリー、それらをコードする核酸、およびその治療的または診断的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβサブユニットタンパク質の新規ファミリー、特に、その密接な構造的関係の点から、まとめてβ３と同定したヒトおよびラットのβサブユニットに関する。本発明はまた、β３サブユニットポリペプチドまたはその断片の使用、並びに、治療、診断およびスクリーニング目的における、それをコードする核酸の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、電位ゲート性（電位依存性）ナトリウムチャネル（ｖｏｌｔａｇｅ
−ｇａｔｅｄ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ）由来のβサブユニットタンパク
質の新規ファミリー、特にヒトおよびラットのβサブユニットに関する。

【０００２】 本発明はまた、β３サブユニットのポリペプチドまたはその断片の使用、並び
に、治療目的、診断目的およびスクリーニング目的における、それをコードする
核酸の使用に関する。

【０００３】 （発明の背景） ナトリウムチャネルは、生理学において中心的な役割を果たす。それらは、細
胞および細胞ネットワークを通じて迅速に脱分極インパルスを伝達し、それによ
り、認知から歩行運動までのより高度なプロセスの協調が可能となる。イオン透
過性および電位感作は、主に、ナトリウムチャネルのαサブユニットにより決定
される。なぜならαサブユニットが孔を形成するからである。ナトリウムチャネ
ルをコードする少なくとも２つの主要なクラスおよび少なくとも８つの遺伝子が
ある。

【０００４】 電位依存性Ｎａ⁺チャネル（ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎａ⁺ ｃ
ｈａｎｎｅｌ）は、長年、抗不整脈および局所麻酔薬のターゲットとして認識さ
れてきた。１９８０年中頃以来、Ｎａ⁺チャネルは、フェニトイン、カルバマゼ
ピン、およびラモトリジンのものと類似した薬理プロフィルを有する、抗痙攣薬
の主要なターゲットとして広く受け入れられるようになった。

【０００５】 イオンチャネル機能の変化は、様々な家族性筋肉疾患の重要な病態生理学的機
序である。Ｎａ⁺チャネル変異は、いくつかの骨格筋緊張および麻痺に特徴的な
異常な興奮性、並びに、遺伝性心不整脈である第３染色体と連鎖したＱＴ延長症
候群の基礎をなす。一般に、これらの変異によりＮａ⁺チャネルは不活性化でき
なくなり、骨格筋における反復活動電位発火（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｃｔｉ
ｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｉｒｉｎｇ：筋緊張（ｍｙｏｔｏｎｉａ））また
は電気的沈黙（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｓｉｌｅｎｃｅ）（弛緩性麻痺（ｆｌａ
ｃｃｉｄ ｐａｒａｌｙｓｉｓ））を生じさせる。心臓のＮａ⁺チャネルの類似
の欠陥により、心臓における活動電位延長（ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ）および反復電気活性（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅ
ｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の素因が生じ、多形性心室頻拍（ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）に至
る。

【０００６】 ナトリウムチャネル機能のさらなる決定因子は、補助的β１サブユニットおよ
び補助的２サブユニットの存在または非存在である。これらは、Ｎａ⁺チャネル
機能の重要な調節因子である。生化学的研究により、最初に、脳内のＮａ⁺チャ
ネルに関連した２つの別個のサブユニット（β１およびβ２）の存在が判明した
。αサブユニットまたはβサブユニットに指向された抗体は、１α：１β１：１
β２のサブユニットの化学量論で全脳のＮａ⁺チャネル複合体を免疫沈降するよ
うであった。β１サブユニットは非共有結合的に会合しているが、β２はαサブ
ユニットにジスルフィド結合により連結している。β１およびβ２サブユニット
はクローン化されており、推定一次構造により、それらはそれぞれ２３ｋＤａお
よび２１ｋＤａの分子量の関連性のないタンパク質であることが示される。サブ
ユニットの予測された膜貫通トポロジーは類似し、各々、小カルボキシ末端細胞
質ドメイン、１つの膜を横切るセグメント、および、Ｎ連結グリコシル化用の数
個の共通配列部位を有する大アミノ末端細胞外ドメインを含む。

【０００７】 アフリカツメガエル卵母細胞における神経サブユニットとβ２の発現は、電流
増幅を増加させ、開口を調節し、膜電気容量を増加させた。卵母細胞における、
β１サブユニットと、神経サブユニットまたは骨格筋サブユニットの共発現もま
た、チャネル機能に対して明確な効果を生じた。電流密度が増加し、活性化およ
び不活性化開口が加速され、定常状態の不活性化曲線が過分極方向にシフトした
。β１サブユニットをコードするｍＲＮＡは、広く発現されているようであり、
明らかに神経および骨格筋Ｎａ⁺チャネルの重要な成分を形成する。近年、β１
サブユニットは、神経毒および局所麻酔薬と、ラットの脳のαナトリウムチャネ
ルの相互作用を修飾することが確立された。

【０００８】 近年まで、βサブユニットと表現型の関連は知られていなかった。しかし、β
１サブユニット遺伝子ＳＣＮＩＢの変異は、熱性発作および全身癲癇に関連して
いることが示された。

【０００９】 全ての既知のＮａ⁺チャネルのサブユニットは、グリコシル化により修飾され
る。β１サブユニット、β２サブユニットおよび脳サブユニットおよび筋肉サブ
ユニットは重度にグリコシル化され、質量の４０％までが炭水化物である。これ
に対し、心臓サブユニットは、僅か５重量％の糖を含む。シアル酸は、Ｎａ⁺チ
ャネルのＮ−連結炭水化物の顕著な成分である。このような高度に荷電された炭
水化物の添加は、チャネルタンパク質の表面荷電の変化により、電位依存性開口
（ｖｏｌｔａｇｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｇａｔｉｎｇ）に対して予測
可能な効果を及ぼす。発現された骨格筋チャネルからシアル酸を除去するノイラ
ミニダーゼ処理により、脱分極による定常状態不活性化のシフトが生じる。また
、共翻訳グリコシル化は、ニューロン細胞およびシュワン細胞でのＮａ⁺チャネ
ルの細胞表面発現の維持に必須であることが示された。ツニカマイシンによるグ
リコシル化阻害により、神経芽細胞腫細胞上のＳＴＸ結合部位数を可逆的に減少
する。ツニカマイシンはまた、動悸、β２サブユニットの硫酸化およびジスルフ
ィド付着を阻害し、機能的Ｎａ⁺チャネルの会合を防ぐ。

【００１０】 電位ゲート性ナトリウムチャネル（ｖｏｌｔａｇｅ ｇａｔｅｄ ｓｏｄｉｕ
ｍ ｃｈａｎｎｅｌ）の調節は、β１サブユニットを介していると考えられてい
た。しかし、ヒトおよびラットでのこれらのサブユニットの分布解析により、非
対称的分布が示される。これは、電位ゲート性ナトリウムチャネルに正しい機能
を付与するのに、どのような他の機序が使用されているかに関する疑問を提示す
る。

【００１１】 本発明者は、少なくとも部分的に、この矛盾を説明できる、別個の第二の補助
調節細部ユニットβ３を発見した。

【００１２】 （発明の要約） 本発明は、電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３サブユニットをコード
する精製または単離された核酸またはそれに相補的な配列に関する。

【００１３】 本発明はまた、β３サブユニットポリペプチドまたはそのペプチド断片、並び
に、かかるβ３サブユニットポリペプチドまたはそのペプチド断片に対して特異
的に指向された抗体に関する。

【００１４】 β３サブユニットをコードする核酸またはそれに相補的な配列に特異的にハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、並びに、前記プ
ライマーおよびプローブを使用したＤＮＡ増幅および検出法も、本発明の一部で
ある。

【００１５】 本発明のさらなる目的は、本明細書に記載の核酸配列のいずれかを含む組換え
ベクター、および特に、本発明のβ３サブユニットをコードする核酸配列を含む
組換えベクターからなり、本発明はまた、前記核酸配列または組換えベクターを
含む宿主細胞およびトランスジェニックな非ヒトの哺乳動物も包含する。

【００１６】 本発明はまた、ナトリウムチャネルのアゴニスト分子（作動体分子）およびア
ンタゴニスト分子（拮抗体）または物質をスクリーニングする方法、並びに、特
にアンチセンス技術を介した、ゲノムにおけるβ３サブユニット核酸配列の選択
的添加または除去を含む遺伝子療法にも関する。

【００１７】 本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドまたは抗体を用いたβ３サブユニ
ットの発現の解析による、電位ゲート性ナトリウムチャネルの機能不全を含む疾
患状態の診断法に関する。β３サブユニットの関与する容態は、疼痛、癲癇、卒
中、虚血および心疾患を含む。さらに、ヒトのβ３遺伝子は第１１ｑ２３．３染
色体に位置づけられた。β２遺伝子および、Ｖ型Ｉｇドメインを含むヒトのＮ−
ＣＡＭ遺伝子も、この領域近くに局在している（Ｅｕｂａｎｋｓ，Ｊら、１９９
７＆Ｎｇｕｙｅｎ，Ｃら、１９８６）。第１１ｑ２３．３染色体に位置する疾患
は、ヤコブセン症候群、家族性非クロム親和性傍神経節腫、ＰＴＳ欠乏に因るフ
ェニルケトン尿症およびシャルコー−マリー−トゥース病を含む。それ故、β３
発現の調節の特徴づけは、これらの疾患の診断に有用であり得る。

【００１８】 本発明は、本明細書において、後に、より詳細に記載し、以下の図面により説
明する。

【００１９】 （発明の詳細な説明） 本発明者は、電位ゲート性ナトリウムチャネルの少なくとも１つのαサブユニ
ットと共同して、活性ナトリウムチャネルを形成する、βサブユニットタンパク
質の新規ファミリーを発見した。この新規βサブユニットファミリーはβ３と命
名され、本明細書で後に記載する配列内の高い相同性などの、共通した構造配列
特徴を介して同定できる。

【００２０】 本発明者は、電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３サブユニットをコー
ドする新規核酸配列を発見した。本発明者らは、このβ３サブユニットが、生物
学的に機能的であり、β３サブユニットと、電位ゲート性ナトリウムチャネル由
来のα２サブユニットの共発現は、α２サブユニットのみの発現と比べて、チャ
ネルの不活性化速度を有意に増加することを示した。さらに、本発明のβ３サブ
ユニットとα２サブユニットの共発現は、α２サブユニットのみの発現と比べて
、ナトリウムチャネルの不活性化からの回復速度を増加させる。

【００２１】 本発明者は、従って、本発明のβ３サブユニットは、電位ゲート性ナトリウム
チャネルにより誘導されるナトリウム電流の調節に関与することを実証した。彼
らはまた、本発明のβ３サブユニットは、電位ゲート性ナトリウムチャネルの活
性をアップレギュレートまたはダウンレギュレートできる薬物、特に、疼痛、癲
癇（典型的には熱性発作および全身癲癇）、卒中、虚血、心疾患、ヤコブセン症
候群、家族性非クロム親和性傍神経節腫、ＰＴＳ欠乏に因るフェニルケトン尿症
およびシャルコー−マリー−トゥース病の予防または処置に設計された薬物の価
値あるターゲットであり得ることを決定した。それ故、適切なβ３の調節が、か
かる疾患の処置に考慮され得る。

【００２２】 本発明の別の態様において、β３サブユニットをコードする核酸を使用して、
インビトロおよびインビボの両方でβ３サブユニットの機能的発現を妨害でき、
従って、上記に示した疾患の処置に有用であり得る、ポリヌクレオチドを設計し
得る。

【００２３】 β３をコードするヌクレオチド配列 本発明の第一の目的は、電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３サブユニ
ットをコードする精製または単離された核酸、またはそれに相補的な配列からな
る。β３サブユニットをコードする好ましい核酸は、ラットおよびヒトの脳から
単離されたもの、好ましくは配列番号３および配列番号４のものを含む。

【００２４】 野生型ＰＣ１２および変異型ＰＣ１２細胞系由来の全ｍＲＮＡを使用して、本
発明者は、ラットのβ３サブユニットをコードするｃＤＮＡを単離した。ラット
のβ３サブユニットｃＤＮＡ配列情報から、本発明者はまた、ヒトのβ３サブユ
ニットをコードするヒトのｃＤＮＡを単離およびクローニングした。

【００２５】 図１に示したように、ラットおよびヒトのβ３サブユニットのコード配列（Ｏ
ＲＦ）は、高度に相同性であり、全長６４８ヌクレオチド中に僅か７０個の非同
一ヌクレオチドがある（２つのコード配列間において８９％より大きいヌクレオ
チドの同一性を有する）。従って、本発明者は、他の哺乳動物種のβ３をコード
する核酸も、対応するラットおよびヒトのヌクレオチド配列と強いヌクレオチド
の同一性を共有すると考える。

【００２６】 結果として、本発明のさらなる目的は、配列番号３のヌクレオチド配列または
それに相補的な配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９
８％、最も好ましくは９９％のヌクレオチドの同一性を有する精製または単離さ
れた核酸からなる。

【００２７】 本発明はまた、ラットの脳に存在する電位ゲート性チャネル由来のβ３サブユ
ニットのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする配列を含む精製
または単離された核酸に関し、かかる配列は、配列番号３のヌクレオチド配列の
３６３位に位置するヌクレオチドで始まり、１０１０位に位置するヌクレオチド
で終わるポリヌクレオチドと、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ま
しくは９８％、最も好ましくは９９％を有する。

【００２８】 本発明はまた、配列番号４のヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列と少
なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％、最も好ましくは９
９％のヌクレオチドの同一性を有する精製または単離された核酸に関する。

【００２９】 本発明はまた、ヒトの脳に存在する電位ゲート性チャネルのβ３サブユニット
のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする配列を含む精製または
単離された核酸に関し、かかる配列は、配列番号４のヌクレオチド配列の３７６
位に位置するヌクレオチドで始まり、１０２３位に位置するヌクレオチドで終わ
るポリヌクレオチドと少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９
８％、最も好ましくは９９％のヌクレオチドの同一性を有する。

【００３０】 本発明の別の目的は、配列番号１のアミノ酸配列のラットのポリペプチドまた
はそのペプチド断片またはそれに相補的な配列と少なくとも８０％、好ましくは
９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９８％のアミノ酸の同一性を有
するポリペプチドをコードする精製または単離された核酸からなる。

【００３１】 本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列のヒトのポリペプチドまたはその
ペプチド断片またはそれに相補的な配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％
、より好ましくは９５％、最も好ましくは９８％のアミノ酸の同一性を有するポ
リペプチドをコードする精製または単離された核酸に関する。

【００３２】 「単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」なる語は、物質がその最初の環境（例えば、天
然に存在する場合には天然環境）から取り出されることを必要とする。例えば、
生きている動物に存在する天然ポリヌクレオチドまたは天然ペプチドは単離され
ていないが、天然系の共存物質のいくつかまたは全てから分離した同ポリヌクレ
オチドまたはペプチドは単離されている。

【００３３】 かかるポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／または、かか
るポリヌクレオチドまたはペプチドは組成物の一部であり得、依然として、ベク
ターまたは組成物はその天然環境の一部ではないという点で単離されている。

【００３４】 「精製（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」なる語は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ
、相対的定義として捉えられる。

【００３５】 少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、より好ましくは４桁または５桁
の程度までの、出発物質または天然物質の精製が特に考えられる。

【００３６】 本明細書全体を通じて、「ヌクレオチド配列」なる表現は、ポリヌクレオチド
または核酸を区別せずに示すために使用し得る。より正確には、「ヌクレオチド
配列」なる表現は、核酸物質それ自体を包含し、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ分子
を生化学的に特徴づける配列情報（すなわち、４つの塩基文字間で選択された文
字の連続）に限定されない。

【００３７】 本明細書で同義語として使用したように、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」
、および「ポリヌクレオチド」なる語は、一本鎖または二本鎖の１つ以上のヌク
レオチドのＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む。

【００３８】 当業者により理解されるその一般的意味に加えて、「ヌクレオチド」なる語は
また、少なくとも以下の修飾の１つを含む修飾ヌクレオチドを包含するように本
明細書で使用される。（ａ）代替的な連結基、（ｂ）プリン類似形、（ｃ）ピリ
ミジン類似形、または（ｄ）類似の糖。類似の連結基、プリン、ピリミジン、お
よび糖の例については、例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／０４０６４号参照。

【００３９】 本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、組換え、またはその組合せを含む、
任意の既知の方法により、並びに、当分野で既知の任意の精製法により調製し得
る。

【００４０】 β３ヌクレオチド断片および分析（アッセイ） 本発明はまた、増幅または検出目的の核酸プライマーまたはプローブとして、
または、対応する遺伝子の発現を調節できるアンチセンスヌクレオチドとして、
このβ３サブユニットのペプチド断片、好ましくは生物学的に活性なペプチド断
片を発現するのに有用であり得る、本明細書に記載の電位ゲート性ナトリウムチ
ャネルのβ３サブユニットをコードする核酸のポリヌクレオチド断片を包含する
。

【００４１】 結果として、本発明はまた、本明細書に記載の電位ゲート性ナトリウムチャネ
ル由来のβ３サブユニットをコードする核酸の少なくとも１０個連続したヌクレ
オチド、好ましくは配列番号３または４またはそれに相補的な配列のヌクレオチ
ド配列のいずれか１つの少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む、精製ま
たは単離ポリヌクレオチドに関する。

【００４２】 好ましいポリヌクレオチドは、配列番号５〜３２および配列番号４６および配
列番号４７から選択されたペプチドをコードするものを含む。他の好ましいポリ
ヌクレオチドは、配列番号３５〜４３のものを含む。

【００４３】 上記の核酸は、約１０、１２、１５、１８または２０から、約２５、３５、４
０、５０、７０、８０、１００、２５０、５００または１０００のヌクレオチド
までの長さの範囲の連続的距離からなるか、または、１０、１２、１５、１８、
２０、２５、３５、４０、５０、１００、２００、２５０、５００または１００
０のヌクレオチド長と明記される。

【００４４】 これらの核酸は、サンプル中の、電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３
サブユニットをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１コピーの存在、より
特定すると、配列番号３または４のヌクレオチド配列、またはそれに相補的な配
列またはその断片または変異体の少なくとも１コピーの存在を検出するためのプ
ローブとして有用である。それらはまた、本発明の選択したペプチドを発現する
のに使用できる。

【００４５】 本発明の核酸プローブはまた、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９７／０５２７７号（この
全内容を引用することによって本明細書の一部をなすものとする）に記載のよう
に、β３サブユニットの発現レベルおよびパターンの解析に使用し得る。

【００４６】 β３サブユニット発現の定量的解析はまた、分析（アッセイ）、すなわち、本
発明に記載の複数の核酸プローブが上に結合した基質を使用して実施し得、これ
らのプローブは、無作為に基質上に分布しているか、または一次、二次または多
次元配置に従って配置する。かかる分析（アッセイ）は、さらに、β３サブユニ
ットＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばα２、β１またはβ２ナトリウムチャネルサブ
ユニットＲＮＡまたはＤＮＡ配列に特異的なプローブとハイブリダイズしない核
酸プローブを含み得る。適切な技術は、例えば、Ｓｃｈｅｎａら（１９９５；１
９９６）、およびまたＳｏｓｎｏｗｓｋｙら（１９９７）（この開示は引用する
ことによって本明細書の一部をなすものとする）により記載のものである。

【００４７】 本発明はさらに、電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３サブユニットま
たはそれに相補的な配列をコードする核酸と、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下でハイブリダイズする精製または単離された核酸に関する。

【００４８】 例示的具体例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以
下のように定義できる。

【００４９】 ハイブリダイゼーションステップは、６５℃で、６×ＳＳＣ緩衝液、５×デン
ハード液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡの存在下で
実施する。

【００５０】 ハイブリダイゼーションステップに４回の洗浄ステップが続き、 ・５分間の間に、好ましくは６５℃で、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ緩衝
液中において２回洗浄する。 ・３０分間の間に、好ましくは６５℃で、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ緩
衝液中において１回洗浄する。 ・１０分間の間に、好ましくは３５℃で、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤ
Ｓ緩衝液中において１回洗浄する。 上記に定義したハイブリダイゼーション条件は、約２０ヌクレオチド長の核酸に
適し、これらの条件はまた、当分野で公知の技術、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（
１９８９）の記載の技術に従って、より短いまたは長い核酸にも適用し得ると理
解する。

【００５１】 特定のセットの分析（アッセイ）条件下でのプローブの適切な長さは、当業者
により経験的に決定され得る。プローブは、適切な配列のクローニングおよび制
限、および、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）のホスホジエステル法、Ｂｒｏｗｎら
（１９７９）のホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）のジエチ
ルホスホルアミジト法、および出願番号ＥＰ０７０７７９２に記載の固相支持体
法などの方法による直接的化学合成を含む任意の適切な方法により調製できる。
全てのこれらの文書の開示物は、本明細書に引用することによって本明細書の一
部をなすものとする。

【００５２】 本発明の任意の核酸を、所望であれば、分光的、光化学的、生化学的、免疫化
学的、または化学的手段により検出可能な標識を取込むことにより標識できる。

【００５３】 例えば、有用な標識は、放射性物質（³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ、¹²⁵Ｉ）、蛍光ダイ（
５−ブロモデスオキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、
ジゴキシゲニン）またはビオチンを含む。核酸断片の非放射性標識の例は、仏国
特許番号ＦＲ７８１０９７５号に、またはＵｒｄｅａら（１９８８）またはＳａ
ｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら（１９８８）により記載されている。

【００５４】 有利には、本発明に記載のプローブは、シグナル増幅を可能とするような構造
および特徴を有し得、かかる構造特徴は、例えば、Ｕｒｄｅａら（１９９１）に
記載のような分枝ＤＮＡプローブである。

【００５５】 本発明の任意の核酸プローブは、簡便に、固相支持体に固定できる。固相支持
体は当業者に公知であり、反応トレイのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビー
ズ、磁気ビーズ、ニトロセルロース片、メンブラン、微粒子、例えばラテックス
粒子、ヒツジ赤血球、デュラサイトおよびその他を含む。

【００５６】 本発明の核酸および特に上記のヌクレオチドプローブは、よって、固相支持体
に、個々に、または、１つの固相支持体に少なくとも２、５、８、１０、１２、
１５、２０または２５個の本発明の別個の核酸の群で、付着または固定できる。

【００５７】 本発明の核酸プローブを固定した支持体の特定の具体例において、かかる支持
体はまた、他の固定プローブ、好ましくは、電位ゲート性ナトリウムチャネル由
来のサブユニットをコードする核酸、またはその変異体、またはそれに相補的な
配列、より好ましくは、電位ゲート性ナトリウムチャネルのαサブユニット、最
も好ましくはα２サブユニットをコードする核酸と特異的にハイブリダイズする
プローブを含み得る。

【００５８】 本発明はまた、配列番号３および４の配列のいずれか１つに含まれるヌクレオ
チド配列を含む核酸プローブ、並びに、少なくとも１つのヌクレオチド置換が、
このプローブと、検出する配列番号３および４のいずれか１つに含まれる相補的
ヌクレオチド配列の間に、ミスマッチを創製するように作成された上記に引用し
た好ましいポリヌクレオチドを包含する。適切なハイブリダイゼーション条件下
で、このプローブは、配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配列のいずれ
か１つまたはその断片またはそれに相補的な配列ともはやハイブリダイズしない
が、これらのプローブに含まれるポリヌクレオチドに正確に相補的であるヌクレ
オチド配列とのみハイブリダイズする。

【００５９】 本発明の核酸プローブのこの特定の具体例により、電位ゲート性ナトリウムチ
ャネルのβ３サブユニットをコードする核酸配列内の、より特定すると、ヒトま
たはラット由来のβ３サブユニット電位ゲート性ナトリウムチャネルをコードす
る核酸中の、より好ましくは配列番号３および４の配列のいずれか１つの核酸、
またはそれに相補的な配列中の、ヌクレオチド多形の検出が可能となり得る。

【００６０】 かかるプローブにより、当業者は、本発明のβ３サブユニットをコードする核
酸、より好ましくはラットまたはヒト由来のβ３サブユニットをコードする核酸
、最も好ましくは配列番号３および配列番号４のいずれか１つの核酸に生じた変
異を検出することができる。

【００６１】 本発明はまた、サンプル中の、電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３サ
ブユニットをコードする核酸、その断片または変異体またはそれに相補的な配列
の存在を検出する方法に関し、前記方法は、以下のステップを含む。

【００６２】 ａ）電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３サブユニットをコードする核
酸、またはその断片、変異体、またはそれに相補的な配列に含まれるヌクレオチ
ド配列とハイブリダイズできる、本発明に記載の１つの核酸プローブまたは複数
の核酸プローブを、分析（アッセイ）するサンプルと接触させ、 ｂ）サンプル中で１つのプローブまたは複数のプローブと核酸の間に形成された
ハイブリッド複合体（ｈｙｂｒｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘ）を検出する。

【００６３】 第一の好ましい具体例において、検出する電位ゲート性ナトリウムチャネル由
来のβ３サブユニットをコードする核酸は、好ましくは、ラットまたはヒトのβ
３サブユニット、より好ましくは配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配
列からなる群から選択された核酸である。

【００６４】 この検出法の第二の好ましい具体例において、１つの核酸プローブまたは複数
の核酸プローブを、検出可能な分子によって標識する。

【００６５】 前記方法の第三の好ましい具体例において、１つの核酸プローブまたは複数の
核酸プローブを、基質上に固定する。

【００６６】 前記方法の第四の好ましい具体例において、サンプルに含まれる核酸は、当業
者には公知の任意の慣用的な手順により、ステップ（ａ）の前にハイブリダイゼ
ーションにかけることができるようになる。

【００６７】 本発明はさらに、サンプル中の、電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３
サブユニットをコードする核酸、その断片または変異体、またはそれに相補的な
配列の存在を検出するキットに関し、前記キットは、 （ａ）上記の１つの核酸プローブまたは複数の核酸プローブと、 （ｂ）任意選択的に、ハイブリダイゼーション反応の実施に必要な試薬とを含む
。

【００６８】 検出キットの第一の好ましい具体例において、検出する核酸は、ヒトまたはラ
ットのβ３サブユニットをコードし、好ましくは、配列番号３および配列番号４
のヌクレオチド配列のいずれか１つ、その断片または変異体、またはそれに相補
的な配列からなる。

【００６９】 検出キットの第二の好ましい具体例において、１つの核酸プローブまたは複数
の核酸プローブが、検出可能な分子によって標識されている。

【００７０】 検出キットの第三の好ましい具体例において、１つの核酸プローブまたは複数
の核酸プローブが基質上に固定されている。

【００７１】 本発明はまた、本明細書に記載のストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下で、本発明の電位ゲート性ナトリウムチャネルのβ３サブユニットをコー
ドする核酸、好ましくはラットまたはヒトのβ３サブユニット、より好ましくは
配列番号３および配列番号４からなる群から選択されたヌクレオチド配列とハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドプライマーに関する。

【００７２】 説明的な例として、本発明に記載のプライマーは、配列番号３３、配列番号３
４、配列番号３５、配列番号４２および配列番号４３のヌクレオチド配列からな
る群から選択されたポリヌクレオチドを含み得るか、またはそれからなり得る。
例えば、配列番号３３および配列番号３４のヌクレオチド配列をそれぞれ含む、
またはそれからなる、一対のプライマーの使用により、当業者は、本発明のヒト
のβ３サブユニットまたはラットのβ３サブユニットをコードする全核酸配列を
増幅できる。

【００７３】 本発明に記載のプライマーの特定の具体例において、配列番号３または配列番
号４のヌクレオチド配列のいずれか１つまたはそれに相補的な配列に含まれるタ
ーゲット配列に正確に相補的ではない３'末端ヌクレオチドを含み得る。

【００７４】 本発明に記載のプライマーの特定の具体例によると、プライマーのハイブリダ
イゼーションが可能となり、よってさらなる伸長が可能となるように選択した３
'末端ヌクレオチドを含み、本発明のβ３サブユニットの変異体が、増幅するタ
ーゲット配列を含むサンプルに存在する場合にのみ、この変異対β３サブユニッ
ト核酸配列はゲノム多形に対応する。特に、この特定の具体例に包含される好ま
しいプライマーは、次いで、本発明のβ３サブユニットのある変異体と、より好
ましくは、電位ゲート性ナトリウムチャネルの機能不全、より好ましくは疼痛、
癲癇、卒中および虚血、心疾患、ヤコブソン症候群、家族性非クロム親和性傍神
経節腫、ＰＴＳ欠乏に因るフェニルケトン尿症およびシャルコー−マリー−トゥ
ース病により引き起こされた、検出可能な表現型との連関が示されている、本発
明のβサブユニットと専らハイブリダイズする。

【００７５】 β３ポリペプチド 本発明の別の目的は、電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３サブユニッ
トのアミノ酸配列を含む精製または単離ポリペプチド、またはそのペプチド断片
または変異体からなる。

【００７６】 第一の具体例において、ポリペプチドは、ラットの脳に存在する電位ゲート性
ナトリウムチャネル由来のβ３サブユニットのアミノ酸配列、またはそのペプチ
ド断片または変異体を含む。特に好ましいポリペプチドは、配列番号１のポリペ
プチドである。

【００７７】 第二の好ましい具体例において、ポリペプチドは、ヒトの脳に存在する電位ゲ
ート性ナトリウムチャネルのβ３サブユニットのアミノ酸配列、またはそのペプ
チド断片または変異体を含む。特に好ましいポリペプチドは、配列番号２のポリ
ペプチドである。

【００７８】 図４に示したように、ラットおよびヒトのβ３サブユニットのアミノ酸配列は
、非常に強い配列類似性を有し、シグナル配列を含めた場合、全長１９１アミノ
酸中に僅か３個の非同一アミノ酸がある（２つのポリペプチド間のアミノ酸の同
一性＞９８％）。２つのポリペプチド間の配列類似性は、シグナルペプチドの２
４アミノ酸配列が解析に含まれない場合にはさらに高い（＞９９％のアミノ酸の
同一性）。従って、本発明者はまた、他の哺乳動物種のβ３ポリペプチドは、対
応するラットおよびヒトのアミノ酸配列と強いアミノ酸の同一性を共有すると考
える。

【００７９】 従って、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはそのペプチド断片と少な
くとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９
％のアミノ酸の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。

【００８０】 また、配列番号２のアミノ酸配列またはそのペプチド断片と少なくとも９０％
、好ましくは９５％、より好ましくは９８％、最も好ましくは９９％のアミノ酸
の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドも本発明の範囲内に含まれる
。

【００８１】 β３ペプチド断片 本発明はまた、例えば診断およびリガンドスクリーニング適用に有用であり得
るβ３ポリペプチドの特定の断片に関する。

【００８２】 特に、目的の好ましいβ３断片は、β３タンパク質のアミノ酸配列の解析から
選択された。図４は、目的の重要な領域を示す、β３アミノ酸配列に関する注釈
を含み、図５は、β３の３次元構造を示す。

【００８３】 β３は、最初に、１つの膜を横切る配列と、線形細胞外Ｎ末端ドメインを形成
する。アミノ酸１〜２４として図４に示したβ３タンパク質配列のこの部分の２
４Ｎ末端アミノ酸は、シグナル配列の典型的な特徴である陽性残基の後に疎水性
領域を含む。可能性ある切断部位の位置を図４に示し、３位のシステインの存在
により支持される。本発明者は、β３シグナル配列および切断配列は、β３の輸
送に重要な役割を果たし、それ故、治療薬の開発および検出の重要なターゲット
であり得ると考える。これらの配列は、それ故、本発明の範囲内に該当する。

【００８４】 全体的β３または部分的β３のヒトまたはラットのシグナル配列および切断配
列をコードする好ましいペプチドは、配列番号５および配列番号６のペプチドを
含み、これは全シグナル配列および切断配列を含む（図４のラットおよびヒトの
β３配列のアミノ酸１〜２４）。他の好ましいペプチドは、配列番号７および配
列番号８のペプチド（図４のラットおよびヒトのβ３配列のアミノ酸６〜２４）
、配列番号９および配列番号１０のペプチド（図４のラットおよびヒトのβ３配
列のアミノ酸１３〜２４）、配列番号１１および配列番号１２のペプチド（図４
のラットおよびヒトのβ３配列のアミノ酸３〜１７）、配列番号１３および配列
番号１４のペプチド（図４のラットおよびヒトのβ３配列のアミノ酸１〜５）、
および配列番号１５および配列番号１６のペプチド（図４のラットおよびヒトの
β３配列のアミノ酸１〜１１）を含む。

【００８５】 図４のアミノ酸１〜１３５を含む、β３の細胞外ドメインの中心部分の３次元
構造を図５に示す。それは、初期モデルとして、ミエリンＰ₀の細胞外ドメイン
の構造を使用して決定された。任意の特定の理論で固めたくはないが、本発明者
は、β１、β２およびβ３の細胞外ドメインは、Ｖ型Ｉｇフォールディングを採
用するタンパク質に相同性を示すので、このモデルはβ３構造の比較的正確な決
定を提供し得ると考える。ミエリンＰ₀のＶ型Ｉｇフォールディングは、１０個
のβ−ストランド（Ａ、Ａ'、Ｂ、Ｃ、Ｃ'、Ｃ''、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧで表され
る標識）を含み、これは対面して２つの逆平行シート（ａｎｔｉ−ｐａｒａｌｌ
ｅｌ ｓｈｅｅｔ）を形成している。β３タンパク質の対応するβ鎖を図５に示
す。本発明者は、これらの各々の鎖は、β３活性または検出に有意な衝撃を及ぼ
し、従って本発明の範囲内に該当すると考える。

【００８６】 ミエリンＰ₀モデルは、最初に、β３のＣ２１〜９６およびＣ２〜２４位のジ
スルフィド結合を予測する。前者は、全てのＶ型Ｉｇドメインに保存され、β１
でのその破壊は遺伝性癲癇症候群を引き起こすので、構造的に重要のようである
。後者は、Ｉｇドメインの奇異な特徴であるが、β１におけるその可能性ある保
存により、機能的重要性が示唆される（図５）。例えば、αサブユニット結合に
関与する領域であるＡ鎖を安定化するのに役立ち得る。Ａ、Ａ'およびＧβ鎖の
アミノ酸は、αサブユニットと界面を形成する。β１において、アスパラギン酸
残基（Ｄ５）は、ＡおよびＡ'鎖を分離する。このアスパラギン酸は、グルタミ
ン酸残基Ｅ４およびＥ８によりどちらかの側にフランキングされる（図５）。以
前に、これらの酸性残基を中性アミノ酸で同時に交換すると、チャネルの迅速な
開口モードを促進するのにより効果が低いタンパク質が形成されたことが示され
た。β３において、全Ａ／Ａ'面は、１つの例外を除いて保存されている。β１
の残基Ｄ６は、β３のプロリンと交換する（図４および５）。プロリンは、β鎖
を破壊する傾向があり、領域の総コンフォメーションは保存されているが、陰電
位はあまり顕著ではない。本発明者は、この差異は、β３は迅速な開口モードを
、β１よりも低い効率で支持し得、それによりαサブユニット開口をよりゆっく
りと不活性化することを示唆し得ると考える。従って、本発明者は、β３／αサ
ブユニット界面を形成するアミノ酸は、ナトリウムチャネルの調節に重要な役割
を果たすと考える。

【００８７】 電位ゲート性ナトリウムチャネルの他のサブユニットとの相互作用、好ましく
は電位ゲート性ナトリウムチャネルのαサブユニットとの共有結合的または非共
有結合的相互作用に関与するもの。かかるポリペプチドの相互作用領域は、当業
者に公知の慣用的な技術、例えば、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（１９８９）に
よりおよび米国特許第５，６６７，９７３号並びに米国特許第５，２８３，１７
３号およびＣａｔｔｅｒａｌｌら（１９９８）（これらの刊行物の専門的教義は
本明細書に引用することによって本明細書の一部をなすものとする）に記載の二
重ハイブリッド分析（アッセイ）などにより決定し得る。本発明に従って実施し
得る他の二重ハイブリッド分析（アッセイ）は、Ｙｏｕｎｇら（１９９８）（こ
の開示も本明細書に引用することによって本明細書の一部をなすものとする）に
より記載されている。本発明のβ３サブユニットタンパク質の生物活性に関与す
る、生物学的に関連したペプチド断片またはアミノ酸の同定に有用な他の技術は
、Ｐａｔｔｏｎら（１９９２）（この開示を本明細書に引用することによって本
明細書の一部をなすものとする）により記載されている。

【００８８】 本発明の範囲内に該当する好ましいペプチドは、αサブユニットと、ラットま
たはヒトのβ３サブユニットの間の界面を含む全てのペプチドを含む。ラットお
よびヒトのβ３タンパク質のβ３／αサブユニット界面のβ鎖Ａ、Ａ'およびＧ
をコードする好ましいペプチドは、配列番号２２および配列番号２３である（図
４のラットおよびヒトのβ３配列のアミノ酸２４〜１３５）。Ａ、Ａ'β鎖をコ
ードする他の好ましいペプチドは、配列番号１７および配列番号１８のペプチド
（図４のラットおよびヒトのβ３配列のアミノ酸２４〜１５）、配列番号１９の
ペプチド（図４のヒトのβ３配列のアミノ酸２）、配列番号２０および配列番号
２１のペプチド（図４のラットおよびヒトのβ３配列のアミノ酸７〜１０）であ
る。β鎖Ｇをコードする他の好ましいペプチドは、配列番号２４（図４のヒトの
β３配列のアミノ酸１１３〜１２２）および配列番号３０（図４のヒトのβ３配
列のアミノ酸１２３〜１３５）である。

【００８９】 またモデルにより、β鎖Ｂ'−Ｃ、Ｃ'−Ｃ''、Ｄ−ＥおよびＦ−Ｇを接続して
いるアミノ酸は、細胞表面の外に向かって配向し、一方、β鎖Ａ'−Ｂ、Ｃ''−
ＤおよびＥ−Ｆを接続しているアミノ酸は細胞表面に向かって配向し、Ｃ−Ｃ''
を接続しているアミノ酸については、それらは細胞表面にほぼ平行して配向して
いる。４つのＮ連結グリコシル化部位により、翻訳後修飾の有意な可能性が示唆
される（図５）。

【００９０】 本発明の範囲内に該当する好ましいペプチドは、β３サブユニットの近づける
表面を含む、全てのこのようなポリペプチドを含む。これらは、β鎖Ｂ'−Ｃを
接続しているポリペプチド配列番号２５（図４のヒトのβ３配列のアミノ酸２４
〜３６）、β鎖Ｃ'−Ｃ''を接続している配列番号２６のポリペプチド（図４の
ヒトのβ３配列のアミノ酸５１〜６０）、β鎖Ｄ−Ｅを接続している配列番号２
７のポリペプチド（図４のヒトのβ３配列のアミノ酸７０〜８１）、β鎖Ｆ−Ｇ
を接続している配列番号２８のポリペプチド（図４のヒトのβ３配列のアミノ酸
９９〜１１２）、およびβ鎖Ｃ−Ｃ'を接続している配列番号４６のポリペプチ
ド（図４のヒトのβ３配列のアミノ酸４３〜５０）を含む。

【００９１】 そのＣ末端部分において、β３ポリペプチドは、強いαヘリックス傾向を有す
る疎水性領域を含む（１３６〜１５７残基、図４参照）。この領域は、膜貫通ド
メインの特性を有し、β１で比較的よく保存されている。β３の細胞質ドメイン
は、配列ＹＬＡＩを含む。このモチーフの位置および配列は、クラスリン覆膜く
ぼみにより認識される内在化シグナルの共通配列に適合する。本発明者は、この
領域の全体的な構造的構成により、細胞区画間のナトリウムチャネルの移動にお
ける、このクラスのβサブユニットの可能性ある役割を示唆すると考える。それ
故、Ｃ末端位は、治療薬の開発または検出の別のターゲット領域を示し得る。本
発明の範囲内に該当する好ましいペプチドは、ヒトのおよびラットのβ３内部移
行シグナルを含む、全てのペプチドを含む。これらは、配列番号３１および配列
番号４７（図４のラットおよびヒトのβ３配列のアミノ酸１５８〜１９１）およ
び配列番号３２（図４のヒトのβ３配列のアミノ酸１７３〜１７９）を含む。

【００９２】 さらに好ましいβ３サブユニットペプチド断片は、電位ゲート性ナトリウムチ
ャネルの正常な機能を阻害または遮断する抗体の産生を誘起するものである。か
かる機能の阻害または遮断は、本明細書の実施例６および７に記載の方法により
測定し得る。

【００９３】 上記で定義したような他の好ましいペプチド断片は、配列番号１または配列番
号２のアミノ酸配列のいずれか１つの少なくとも１０個連続したアミノ酸、好ま
しくは少なくとも１２または１５、より好ましくは少なくとも２０、最も好まし
くは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列のいずれか１つの少なくとも
２５個の連続したアミノ酸を有する。

【００９４】 本発明はまた、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列のいずれか１つの
β３サブユニットポリペプチドに関して、１つのアミノ酸の、１、２、３、４、
５、１０、２０、２５、３０、３５、４０の置換、付加、または欠失の範囲のア
ミノ酸変化を含む、βサブユニット、またはそのペプチド断片に関する。

【００９５】 本発明に記載のポリペプチドのアミノ酸におけるアミノ酸置換の場合、１つま
たは数個の連続的または非連続的アミノ酸を、「等価」アミノ酸により置換する
。「等価」アミノ酸なる語は、本明細書で、配列番号１および２のアミノ酸配列
のβ３サブユニットポリペプチドに対して産生された抗体への、対応するペプチ
ドの結合特性を減少させることなく、天然タンパク質構造に属するアミノ酸の１
つに置換し得る任意のアミノ酸を表わすために使用し得る。別の言葉で言えば、
「等価」アミノ酸は、天然β３サブユニットタンパク質のアミノ酸配列と比較し
て、修飾された配列を有するポリペプチドの産生または合成を可能とするもので
あり、前記修飾ポリペプチドは、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列の
β３サブユニットタンパク質に対して生じた抗体に結合できる、および／または
、親ポリペプチドを認識する抗体を誘導できる。

【００９６】 別に、包含されるアミノ酸変化は、得られる修飾ポリペプチドの生物活性を消
失させないものである。修飾ポリペプチドの生物活性は、例えば、明細書の実施
例６および実施例７に記載のように評価し得る。

【００９７】 これらの等価アミノ酸は、置換する元のアミノ酸との構造的相同性により、そ
の正味の電荷のまたはその疎水性の類似性により、および任意選択的に親ペプチ
ドとその修飾対応物の間の交差免疫原性の結果により決定し得る。

【００９８】 １つまたは数個の「等価」アミノ酸を含むペプチドは、リガンド結合分析（ア
ッセイ）またはエリザ分析（アッセイ）により評価できるように、親タンパク質
の生物ターゲットにその特異性および親和性特性を保持していなければならない
。

【００９９】 特定のクラスに属するアミノ酸の例は、酸性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩
基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、非極性アミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ）または非荷電極性アミノ酸
（Ｇｌｙ、Ｓｅｕ、Ｔｈｒ、ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）を含む。

【０１００】 好ましくは、本発明のβ３サブユニットポリペプチド、またはそのペプチド断
片におけるアミノ酸の置換は、特定のクラスのアミノ酸の、同じクラスに属する
別のアミノ酸による置換からなる。

【０１０１】 本発明に記載の等価アミノ酸により、Ｌ形の残基の、Ｄ形の残基による置換、
または、グルタミン酸（Ｅ）残基のピログルタミン酸化合物による置換も考えら
れる。Ｄ形の少なくとも１つの残基を含むペプチドの合成は、例えば、Ｋｏｃｈ
（１９７７）により記載されている。

【０１０２】 本発明に記載の目的の修飾ペプチドの特定の具体例は、タンパク質分解に耐性
のペプチド分子を含むがこれに限定されない。これは、−ＣＯＮＨ−ペプチド結
合が修飾され、（ＣＨ₂ＮＨ）還元結合、（ＮＨＣＯ）逆配列結合、（ＣＨ₂−Ｏ
）メチレン−オキシ結合、（ＣＨ₂Ｓ）チオメチレン結合、（ＣＨ₂ＣＨ₂）炭素
結合、（ＣＯ−ＮＨ₂）セトメチレン結合、（ＣＨ₀Ｈ−ＣＨ₂）ヒドロキシエチ
レン結合）、（Ｎ−Ｎ）結合、Ｅ−アルセン結合またはまた−ＣＨ＝ＣＨ−結合
により置換されたペプチドである。

【０１０３】 本発明はまた、少なくとも１つのペプチド結合が上記のように修飾された、β
３サブユニットポリペプチドまたはその断片を包含する。

【０１０４】 本発明に記載のポリペプチドはまた、均一な溶液中または固相中で、慣用的な
化学合成法により調製し得る。かかる化学的ポリペプチド合成技術の例示的具体
例として、Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌ（１９７４）の記載した均一溶液技術を列挙し
得る。

【０１０５】 従って、目的のβ３サブユニットポリペプチド、またはその断片は、取込む様
々なアミノ酸残基の連続的カップリングにより（液相中でＮ末端からＣ末端に、
または固相中でＣ末端からＮ末端に）液相または固相中の化学合成により調製し
得、ここでのＮ末端および反応側鎖は、慣用的な基により前以て遮断する。

【０１０６】 固相合成では、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６５ａ；１９６５ｂ）の記載した
技術を特に使用し得る。

【０１０７】 本発明のβ３サブユニットポリペプチドおよび目的のそのペプチド断片は、抗
体の調製に使用できる。

【０１０８】 β３をコードする核酸の増幅 本発明の別の目的は、電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３サブユニッ
トをコードする核酸の増幅法からなり、前記方法は、 （ａ）ターゲットβ３サブユニット核酸、その断片または変異体、またはそれに
相補的な配列を含むことが疑われる試験サンプルを、増幅するβ３サブユニット
核酸領域のいずれかの側に位置する一対の増幅プライマーを含む増幅反応試薬と
接触させ、そして （ｂ）任意選択的に、増幅産物を検出するステップを含む、前記方法。

【０１０９】 上記の方法の第一の好ましい具体例において、核酸は、ヒトまたはラットのβ
３サブユニット、より好ましくは配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列の
いずれか１つのβ３サブユニットをコードする。

【０１１０】 上記の方法の第二の好ましい具体例において、プライマーは、配列番号３３、
配列番号３４および配列番号３６〜４１のヌクレオチド配列のいずれか１つを含
むか、またはそれからなる。

【０１１１】 上記の増幅法の第三の好ましい具体例において、増幅産物は、増幅領域に相補
的な配列を有する標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出する
。

【０１１２】 本発明はまた、試験サンプル中の、電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ
３サブユニットをコードする核酸、その断片または変異体、またはそれに相補的
な配列を増幅するキットに関し、前記キットは、 （ａ）増幅するβ３サブユニット核酸領域のいずれかの側に位置する一対のオリ
ゴヌクレオチドプライマーと、 （ｂ）任意選択的に、増幅反応の実施に必要な試薬を含む。

【０１１３】 上記のキットの第一の好ましい具体例において、核酸は、ヒトまたはラットの
β３サブユニット、より好ましくは配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列
のいずれか１つのβ３サブユニットをコードする。

【０１１４】 上記の増幅キットの第二の好ましい具体例において、増幅産物は、増幅領域に
相補的な配列を有する標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出
される。

【０１１５】 上記の増幅キットの第三の具体例において、増幅プライマーは、配列番号３３
、配列番号３４および配列番号３６〜４１のヌクレオチド配列から選択される。

【０１１６】 アンチセンス核酸および遺伝子療法 本発明のさらなる目的は、本発明に記載のβ３サブユニット遺伝子の発現を阻
害または消失するアンチセンス核酸からなる。本発明に記載のアンチセンス核酸
の好ましい使用法は、Ｓｃｚａｋｉｅｌら（１９９５）の記載した手順である。

【０１１７】 好ましくは、アンチセンス核酸は、本発明のβ３サブユニットタンパク質、好
ましくはヒトまたはラットのβ３サブユニット、より好ましくは配列番号１およ
び配列番号２のアミノ酸配列のいずれか１つのβ３サブユニット、最も好ましく
は配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配列からなる群から選択された核
酸の５'末端に相補的な１５〜２００ｂｐ長のポリヌクレオチドの中から選択さ
れる。

【０１１８】 本発明に記載の好ましいアンチセンス核酸は、翻訳開始コドンＡＴＧを含むβ
３サブユニットのヒトまたはラットのｍＲＮＡの配列に相補的である。しかし、
アンチセンス核酸はまた、３'または５'の非翻訳領域の配列にも相補的であり得
る。

【０１１９】 本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖の所望のβ３サブユニットの発現を阻害
するに十分な安定性を有する細胞内二本鎖の形成を可能とするに十分な長さおよ
び融解温度を有するべきである。遺伝子療法に使用するに適したアンチセンス核
酸の設計戦略は、Ｇｒｅｅｎら（１９８６）およびＩｚａｎｔおよびＷｅｉｎｔ
ｒａｕｂ（１９８４）（その開示は本明細書に引用することによって本明細書の
一部をなすものとする）に開示されている。

【０１２０】 別の適切なアンチセンス戦略は、本明細書に引用することによって本明細書の
一部をなすものとする、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２３０２６号、ＷＯ９５／０
４１４１号、ＷＯ９２／１８５２２号および欧州特許出願番号ＥＰ０５７２２８
７Ａ２号にＲｏｓｓｉら（１９９１）により記載されたものである。

【０１２１】 本発明に記載の好ましいアンチセンス核酸配列は、配列番号３５のヌクレオチ
ド配列である。

【０１２２】 本発明に記載のアンチセンス核酸を設計するために、当業者はまた、Ｚｈｉｑ
ｉａｎｇ Ｚｈａｎｇら（１９９８）の刊行物の教示により誘導され得、この開
示は引用することによって本明細書の一部をなすものとする。

【０１２３】 任意の特定の理論に固めたくはないが、本発明者は、β３サブユニットを含む
ナトリウムチャネルの修飾が興奮性を変化し得る１つの方法は以下の機序であろ
うと考える。ナトリウム電流の崩壊は、少なくとも２つの指数により適合できる
。これらの２つの電流の主要な成分は、β３サブユニットの共発現により有意に
短縮される。これは、β３サブユニットが正の方向に電位活性化曲線をシフトさ
せ、膜電位のより迅速な再分極を可能とするためである。従って、事象の数の増
加または軸索を下る情報の移行が起こる。ニューロンに発現された高密度のナト
リウムチャネルにより、活動電位の伝導が全細胞表面で起こることが可能となる
。膜から一過性にナトリウムチャネルを除去することにより、脱分極入力に対す
る神経終末の獲得機能を変化させる可逆的方法が得られ得る。

【０１２４】 結果として、本発明者は、例えばアンチセンス戦略を介した、本発明のβ３サ
ブユニットの発現の阻害は、β３サブユニットが一部をなす電位ゲート性ナトリ
ウムチャネルの発現および／または表面発現に影響を及ぼし得、結果として、全
電位ゲート性ナトリウムチャネルの発現および生物活性に影響を及ぼし得ると考
える。かかる電位ゲート性ナトリウムチャネル阻害は、癲癇、痛覚過敏および心
臓血管疾患のような疾患の予防または治癒に有用であり得る。

【０１２５】 さらに、ナトリウムチャネルの不活性化の増加により、神経興奮性に対する減
衰効果が得られる。

【０１２６】 さらに、β３サブユニットは、α孔に堅く結合し、複合体を適切な場所に輸送
するにはβ３サブユニットが必要であることが示唆される。従って、β３−α複
合体の修飾、好ましくは阻害は、細胞内部位への捕獲を増加するのに、または、
αおよびβの、終末末端試薬への輸送を減少するのに使用し得る。これにより興
奮性は減少する。なぜなら、脱分極中の電流密度は活動電位の伝播を維持するの
に不十分であるからである。

【０１２７】 さらに、β３サブユニットの発現の変化は、損傷領域のナトリウムチャネル機
能の崩壊を引き起こす。

【０１２８】 本発明の別の目的は、ベクター送達系により完全に機能する遺伝子の挿入によ
る、遺伝子療法におけるβ３サブユニットまたはその生物学的に活性なペプチド
断片をコードする核酸の使用であり、これにより傷害領域は修復される。本発明
のβ３サブユニットタンパク質をコードする核酸の発現に影響を及ぼすために、
これらの核酸を細胞に送達しなければならない。この送達は、細胞系を形質転換
する実験手順のようなインビトロで、または、ある疾患状態、特に電位ゲート性
ナトリウムチャネルの機能不全に関連した疾患状態、より特定すると、疼痛、癲
癇、卒中、虚血、痛覚過敏、心血管疾患およびヤコブソン症候群、家族性非クロ
ム親和性傍神経節腫、ＰＴＳ欠乏に因るフェニルケトン尿症およびシャルコー−
マリー−トゥース病などの疾患状態の処置のようなインビボまたは生体外で達成
し得る。

【０１２９】 １つの機序は、ウイルス感染であり、ここでは、発現したい核酸を、感染性ウ
イルス粒子に封入する。ポリヌクレオチドを培養哺乳動物細胞に導入する数個の
非ウイルス法も本発明により考えられ、リン酸カルシウム沈降法：Ｇｒａｈａｍ
ら（１９７３）；Ｃｈｅｎら（１９８７）、ＤＥＡＥ−デキストランＧｏｐａｌ
：（１９８５）、電気穿孔法：Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら（１９８６）；Ｐｏｔｔｅ
ｒら（１９８４）、直接的マイクロインジェクション：Ｈａｒｌａｎｄら（１９
８５）およびＤＮＡ添加リポソーム：Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８２）；Ｆｒａｌ
ｅｙら（１９７９）を含むがこれに限定されない。

【０１３０】 一旦、発現したい核酸が細胞に送達されると、レシピエント細胞のゲノムに安
定に組込まれ得る。この組込みは、相同的組換え（遺伝子置換）により正しい位
置および配向であり得るか、または、無作為で非特異的位置であり得る。またさ
らなる具体例において、核酸は、細胞に、ＤＮＡの別々のエピソームセグメント
として維持され得る。かかる核酸セグメントまたはエピソームは、宿主細胞周期
に独立的にまたはそれと同期に、維持および複製を可能とするに十分な配列をコ
ードする。適切な遺伝子ターゲッティング技術は、Ｒｕｓｓｅｌ（１９９８）に
記載され、その開示は引用することによって本明細書の一部をなすものとする。

【０１３１】 インビボで核酸を脊椎動物の細胞内部に送達する方法の１つの具体的な具体例
は、生理学的に許容される担体および目的のポリペプチドを作動可能にコードし
ている裸ポリヌクレオチド（ｎａｋｅｄ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含
む調製物を、細胞を含む組織の間質空間に導入するステップを含み、ここで、裸
ポリヌクレオチドは、細胞内部に取込まれ、生理学的効果を及ぼす。

【０１３２】 裸ポリヌクレオチドを含むインビトロおよびインビボで使用するための組成物
は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９０／１１０９２号（Ｖｉｃａｌ Ｉｎｃ．）、並びに
、Ｔａｃｓｏｎら（１９９６）およびＨｕｙｇｅｎら（１９９６）（その開示は
引用することによって本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。

【０１３３】 本発明の別の目的は、β３サブユニットタンパク質またはその生物学的に活性
なペプチド断片をインビボで産生するための組成物からなる。かかる組成物は、
このポリペプチドを作動可能にコードし、組織に導入して、組織の細胞に、機能
的β３サブユニットタンパク質またはそのペプチド断片を発現させ、よって機能
的電位ゲート性ナトリウムチャネルを発現させるのに適した、裸ポリヌクレオチ
ドを溶液中に生理学的に許容される担体中に含み得る。

【０１３４】 所望の宿主生物に注射するベクターの量は、注射部位により変更する。目安の
用量として、動物生体、好ましくは哺乳動物生体、好ましくはヒトの生体に、０
．１ないし１００μｇのベクターを注射する。

【０１３５】 本発明の遺伝子療法の別の具体例において、β３サブユニットタンパク質また
はその生物学的に活性なペプチド断片を作動可能に発現する核酸を、インビトロ
で宿主細胞に、好ましくは処置する動物から前以て収集しておいた宿主細胞に、
より好ましくは体細胞、例えば筋肉細胞または神経細胞に導入し得る。次のステ
ップで、β３サブユニットタンパク質またはその目的のペプチド断片をコードす
る核酸で形質転換しておいた細胞を、動物生体に再導入して、生体内に局所的ま
たは全身的に組換えタンパク質を送達する。

【０１３６】 それ故、本発明はまた、１つまたは数個の生理学的に許容される担体、例えば
当業者に公知の担体と組合せた、本明細書に記載の核酸群から選択された核酸を
含む組成物に関する。

【０１３７】 組換え発現ベクター 本発明はまた、本明細書に記載の核酸のいずれか１つを含む組換えベクターの
ファミリーを包含する。従って、本発明はさらに、以下からなる群から選択され
た核酸を含む組換えベクターに関する。

【０１３８】 （ａ）電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３サブユニット、好ましくは
ヒトまたはラットのβ３サブユニット、より好ましくは配列番号１および配列番
号２のアミノ酸配列またはそれに相補的な配列からなる群から選択されたポリペ
プチドと少なくとも８０％のアミノ酸の同一性を有する、精製または単離された
核酸と、 （ｂ）配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配列またはそれに相補的な
配列からなる群から選択されたポリヌクレオチドと少なくとも９０％のヌクレオ
チドの同一性を有する精製または単離された核酸と、 （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載の核酸またはそれに相補的な配列の少なくと
も１０個連続したヌクレオチドを含む精製または単離ポリヌクレオチドと、およ
び （ｄ）配列番号５〜３２および配列番号４６および４７に対応するβ３のペプ
チド断片の１つをコードするポリヌクレオチドとからなる群から選択された精製
または単離ポリヌクレオチド。

【０１３９】 第一の好ましい具体例において、本発明の組換えベクターは、適切な宿主細胞
で本発明のβ３サブユニットをコードする核酸から得られた挿入ポリヌクレオチ
ドを増幅するために使用され、このポリヌクレオチドは、組換えベクターが複製
する毎に増幅される。

【０１４０】 本発明に記載の組換えベクターの第二の好ましい具体例は、本発明のβ３サブ
ユニットをコードする核酸、好ましくはヒトまたはラットのβ３サブユニットを
コードする核酸、より好ましくは配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列か
らなる群から選択されたポリペプチドをコードする核酸、最も好ましくは配列番
号３および配列番号４のヌクレオチド配列からなる群から選択された核酸を含む
発現ベクターからなる。

【０１４１】 本明細書に明記したβ３サブユニットのペプチド断片をコードする核酸を含む
組換え発現ベクターも本発明の一部である。

【０１４２】 ある具体例内で、発現ベクターを使用して、本発明のβ３サブユニットまたは
そのペプチド断片を発現でき、これは次いで精製でき、例えば免疫原として使用
して、前記β３サブユニットタンパク質またはそのペプチド断片に対して指向さ
れた特異的抗体を産生できる。

【０１４３】 別の具体例において、発現ベクターは、トランスジェニック動物を作成するた
めに、また遺伝子療法のために、特にアンチセンス療法のために使用する。

【０１４４】 発現は、適切なシグナルがベクターに提供され、前記シグナルは、宿主細胞で
目的の遺伝子の発現を駆動する、ウイルスおよび哺乳動物の両方の起源の、エン
ハンサー／プロモーターなどの様々な調節エレメントを含む。本発明の発現ベク
ターの調節配列は、目的のβ３サブユニットタンパク質またはそのペプチド断片
をコードする核酸に作動可能に連結している。

【０１４５】 本明細書に使用したような「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅ
ｄ）」なる語は、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの連結を意味
する。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に
影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結している。

【０１４６】 より正確には、２つのＤＮＡ分子（例えば、プロモーター領域を含むポリヌク
レオチドおよび所望のポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリヌ
クレオチド）は、２つのポリヌクレオチド間の連結の性質が、（１）フレームシ
フト変異を導入しない、または（２）プロモーターを含むポリヌクレオチドが、
コードポリヌクレオチドの転写を指令する能力を妨害しなければ、「作動可能に
連結」していると言う。

【０１４７】 一般に、組換え発現ベクターは、複製起点、宿主細胞の形質転換を可能とする
、適切なマーカー、および下流構造配列の転写を指令する高度に発現された遺伝
子から得られたプロモーターを含む。異種構造配列は、翻訳、開始および終結配
列、および好ましくは翻訳タンパク質配列を細胞質周辺腔または細胞外媒体に指
令できるリーダー配列と適切なフレーム内で会合している。

【０１４８】 ベクターが哺乳動物宿主細胞で所望の配列をトランスフェクトおよび発現する
のに適した特定の具体例において、好ましいベクターは、所望の宿主由来の複製
起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、およびまた任意の必要なリボソ
ーム結合部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列、および任意選択的に５'−
フランキング非転写配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。

【０１４９】 ＳＶ４０ウイルスゲノム、例えばＳＶ４０起源から得られたＤＮＡ配列、初期
プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化部位を使用して、必要な非
転写ゲノムエレメントを提供し得る。

【０１５０】 本発明の組換え発現ベクターの別の具体例において、５'−フランキング非転
写配列は、以下からなる群から選択されたポリヌクレオチドを含み得る。

【０１５１】 （１）配列番号３のヌクレオチド配列の１位のヌクレオチドで始まり、３６２
位のヌクレオチドで終わる核酸と、 （２）配列番号４の１位のヌクレオチドで始まり、３７５位のヌクレオチドで
終わる核酸。

【０１５２】 さらに、本発明の組換え発現ベクターはまた、コード配列（ＯＲＦ）の３'末
端に位置する非転写ポリヌクレオチドを含み、この３'−ＵＴＲポリヌクレオチ
ドは、対応するｍＲＮＡの安定化に、または、この３'−ＵＴＲがエンハンサー
エレメントなどの調節シグナルエレメントを有する場合、ベクター挿入断片の発
現速度の増加に有用である。

【０１５３】 好ましい３'−ＵＴＲ配列は、配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配
列に含まれる３'−ＵＴＲからなる群から選択される。

【０１５４】 従って、本発明のさらなる目的は、以下からなる群から選択された３'−ＵＴ
Ｒ核酸からなる。

【０１５５】 （１）配列番号３のヌクレオチド配列の１０１１位のヌクレオチドで始まり、
２２２０位のヌクレオチドで終わる核酸； （２）配列番号４の１０２４位のヌクレオチドで始まり、１２６１位のヌクレ
オチドで終わる核酸。

【０１５６】 本発明に記載の発現ベクターに使用される適切なプロモーター領域は、異種核
酸を発現する宿主細胞を考慮して選択する。

【０１５７】 適切なプロモーターは、発現を制御する核酸に関して異種であっても、または
別に発現するコード配列を含む天然ポリヌクレオチドに内因性であってもよい。

【０１５８】 さらに、プロモーターは、一般に、構成物のプロモーター／コード配列を挿入
する組換えベクター配列に関して異種である。

【０１５９】 好ましい細菌プロモーターは、ＬａｃＩ、ＬａｃＺ、Ｔ３またはＴ７バクテリ
オファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐプロモ
ーター（ＥＰ００３６７７６）、ポリヘドリンプロモーター、またはバキュロウ
イルス由来のｐ１０タンパク質プロモーター（キットノバゲン；Ｓｍｉｔｈら（
１９８３）；Ｏ'Ｒｅｉｌｌｙら（１９９２）である。

【０１６０】 形質転換宿主細胞の選択のために本発明の発現組換えベクターに含まれる好ま
しい選択マーカー遺伝子は、好ましくは、真核細胞培養液ではデヒドロ葉酸レダ
クターゼまたはネオマイシン耐性、Ｓ．セレビジアエではＴＲＰ１、Ｅ．ｃｏｌ
ｉではテトラサイクリン、リファンピシンまたはアンピシリン耐性、または、マ
イコバクテリアではレバムサッカラーゼであり、この後者のマーカーは陰性選択
マーカーである。

【０１６１】 本発明の好ましい細菌ベクターを、限定的な例ではなく、説明として本明細書
に以後列挙する。

【０１６２】 ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＤ１０、ファージ
スクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ｐ．ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＮＨ８Ａ、ｐ
ＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＫＫ２
２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（ファルマシア）；ｐ
ＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（ファルマシア）；ｐＱ
Ｅ−３０（ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ）。

【０１６３】 本発明の好ましいバクテリオファージ組換えベクターは、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ
Ｎ．Ｌ．（１９９２；１９９４）の記載したようなＰ１バクテリオファージベク
ターである。

【０１６４】 本発明のβ３サブユニットポリペプチドまたはその断片の発現に適切なベクタ
ーは、昆虫細胞および昆虫細胞系で増殖できるバキュロウイルスベクターである
。具体的な適切な宿主ベクター系は、ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒ
ｄａから得られたＳＦ９細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７１１）のトランスフェ
クトに使用したｐＶＬ１３９２／１３９３バキュロウイルス導入ベクター（ファ
ーミンゲン）である。

【０１６５】 本発明の組換え発現ベクターは、ＦｅｌｄｍａｎおよびＳｔｅｉｇ（１９９６
）またはＯｈｎｏら（１９９４）に記載のものなどのアデノウイルスから得られ
得る。

【０１６６】 本発明のこの特定の具体例に記載の別の好ましい組換えアデノウイルスは、ヒ
トアデノウイルスの２型または５型（Ａｄ２またはＡｄ５）または動物起源のア
デノウイルス（仏国特許出願番号ＦＲ９３０５９５４号）である。

【０１６７】 本発明のインビトロまたはインビボでのレトロウイルスの遺伝子送達ベヒクル
の調製または作成に特に好ましいレトロウイルスは、ミンク細胞病巣誘導ウイル
ス、ネズミ肉腫ウイルス、およびＲｏｓｓ肉腫ウイルスからなる群から選択され
るレトロウイルスを含む。他の好ましいレトロウイルスベクターは、Ｒｏｔｈら
（１９９６）、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２５２３４号、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０６
９２０号、およびまたＲｏｕｘら（１９８９）、Ｊｕｌａｎら（１９９２）およ
びＮａｄａら（１９９１）に記載のものである。

【０１６８】 さらに、本発明により考えられる別のウイルスベクター系は、Ｆｌｏｔｔｅら
（１９９２）、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら
（１９９６）の記載したものなどのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）からなる。

【０１６９】 従って、本発明のさらなる目的は、電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ
３サブユニットをコードする核酸またはそのペプチド断片またはその変異体を含
む組換え発現ベクターからなり、ここで、前記核酸はプロモーター配列に作動可
能に連結している。

【０１７０】 好ましい具体例において、この核酸は、ラットまたはヒトのβ３サブユニット
、好ましくは配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列のいずれか１つのβ３
サブユニット、またはその変異体またはペプチド断片をコードする。好ましい断
片は、配列番号５から３２および配列番号４６および４７の断片を含む。最も好
ましい具体例において、この核酸は、配列番号３および配列番号４のヌクレオチ
ド配列のいずれか１つを含む。

【０１７１】 β３を発現する宿主細胞 本明細書に記載の核酸の１つを用いて、または本明細書に記載の組換えベクタ
ー、特に組換え発現ベクターの１つを用いて形質転換またはトランスフェクトし
ておいた宿主細胞も、本発明の一部である。

【０１７２】 上記したものの１つなどの組換えベクターで形質転換（原核細胞）またはトラ
ンスフェクト（真核細胞）した宿主細胞も含まれる。本発明の発現ベクターのレ
シピエントとして使用する好ましい宿主細胞は、以下である。

【０１７３】 （ａ）原核宿主細胞：Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（すなわちＤＨ５−
α株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍおよびシュードモナス、ストレプトミセスおよびスタフィロコ
ッカスのような種由来の株； （ｂ）真核宿主細胞：ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２；番号ＣＣＬ２．１
；番号ＣＣＬ２．２）、Ｃｖ１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞（
ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０；番号ＣＲＬ１６５１）、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ
番号ＣＲＬ１７１１）、Ｃ１２７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１８０４）、３Ｔ
３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６３６１）、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−
６１）、ヒトの腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ番号４５５０４；番号ＣＲＬ−１５７
３）、ＢＨＫ（ＥＣＡＣＣ番号８４１００５０１；番号８４１１１３０１）、Ｐ
Ｃ１２（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７２１）、ＮＴ２、ＳＨＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ番
号ＣＲＬ−２２６６）、ＮＧ１０８（ＥＣＡＣＣ番号８８１１２３０２）および
Ｆ１１、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−ＨＴＢ−１１）、ＳＫ−Ｎ−Ｂ
Ｅ（２）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２２７１）、ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣ番号ＣＣ
Ｌ−１２７）。本発明の遺伝子を発現できる好ましい系は、ＣＯＳ細胞、３Ｔ３
細胞、ＨｅＬａ細胞、２９２細胞およびＣＨＯ細胞などの細胞系である。β３の
効率的な発現に好ましい系は、ＣＨＯ細胞系の使用を含む。遺伝子は、天然ＣＨ
Ｏの内因性プロモーターにより発現しても、または外来性プロモーターにより発
現してもよい。適切な外来性プロモーターは、ＳＶ４０またはＣＭＶ、またはお
そらく真核生物プロモーター、例えばテトラサイクリンプロモーターなどを含む
。好ましいプロモーターはＣＭＶである。

【０１７４】 上記の宿主細胞の特定の具体例において、これらの宿主細胞はまた、別の電位
ゲート性ナトリウムチャネルサブユニット、好ましくはα型のサブユニット、よ
り好ましくは実施例４に記載したようなα２型のサブユニットの発現を可能とす
る、ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを用いてトランスフェクトまたは形
質転換した。適切な共発現手順はまた、Ｍａｋｉｅｌｓｋｉら（１９９６）およ
びＱｕら（１９９５）に記載され、この開示は引用することによって本明細書の
一部をなすものとする。

【０１７５】 本発明はまた、本明細書に記載のβ３サブユニットポリペプチドまたはペプチ
ドの１つおよび特に配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる群から
選択されたポリペプチドを産生する方法に関し、前記方法は、以下のステップを
含む。

【０１７６】 （ａ）所望のβ３サブユニットポリペプチドまたはそのペプチド断片をコード
する核酸を適切なベクターに挿入し、 （ｂ）適切な培養培地で、ステップ（ａ）の組換えベクターで以前に形質転換ま
たはトランスフェクトしておいた宿主細胞を培養し、 （ｃ）かくしてならした培養培地を収集するか、例えば、または超音波処理によ
りまたは浸透圧ショックにより宿主細胞を溶解し、 （ｄ）前記培養培地から、または、得られた宿主細胞溶解液のペレットから、か
くして産生された目的のβ３サブユニットポリペプチドを分離または精製する。

【０１７７】 上記の方法の第一の好ましい具体例において、適切なベクターに挿入する核酸
は、一対のプライマーを使用して、増幅反応を以前に受けている。

【０１７８】 かかる増幅反応に使用される好ましいプライマーは、配列番号３３および配列
番号３４のヌクレオチド配列のプライマーである。

【０１７９】 上記の方法の第二の好ましい具体例において、かくして産生されたポリペプチ
ドを、例えば、β３サブユニットポリペプチドまたはそのペプチド断片に指向さ
れたポリクローナルまたはモノクローナル抗体を予め固定しているイムノアフィ
ニティクロマトグラフィーカラム上への結合により、さらに特徴づける。

【０１８０】 本発明に記載の組換えβ３サブユニットタンパク質またはそのペプチド断片の
精製は、ニッケルまたは銅アフィニティクロマトグラフィーカラムへの通過によ
り実施し得る。

【０１８１】 別の具体例において、かくして得られたβ３サブユニットポリペプチドまたは
ペプチド断片は、Ｒｏｕｇｅｏｔら（１９９４）により記載されたように、例え
ば、高速液体クロマトグラフィー、例えば逆相および／または陽イオン交換ＨＰ
ＬＣにより精製し得る。

【０１８２】 この種類のペプチドまたはタンパク質精製が好ましい理由は、溶出サンプル中
に形成される副生成物がないことであり、これにより、得られた精製タンパク質
またはペプチドはより治療使用に適したものとなる。

【０１８３】 β３に対する抗体 ポリクローナル抗体は、哺乳動物、特にマウスまたはウサギを、免疫アジュバ
ントと合わせた本発明に記載のポリペプチドまたはペプチドを用いて免疫化し、
次いで、抗原として使用するポリペプチドを予め固定しておいたアフィニティク
ロマトグラフィーカラムに免疫化動物の血清に含まれる特異的抗体を精製するこ
とにより調製し得る。

【０１８４】 モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）に
より記載された技法に従ってハイブリドーマから調製し得る。

【０１８５】 本発明はまた、トリオーマ技法によりおよびＫｏｚｂｏｒら（１９８３）の記
載したようなヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技法により産生された抗体に関する。

【０１８６】 本発明の抗体はまた、キメラ単鎖Ｆｖ抗体断片を含む（米国特許第４，９４６
，７７８号；Ｍａｒｔｉｎｅａｕら（１９９８）、ファージディスプレイライブ
ラリーから得られた抗体断片Ｒｉｄｄｅｒら（１９９５）およびヒト化抗体（Ｌ
ｅｇｅｒら（１９９７））。

【０１８７】 いずれかのプロトコルに従って得られた抗体調製物は、生物学的サンプル中の
抗原を有する物質の存在を決定するための定量的免疫分析（アッセイ）に有用で
ある。抗体はまた、電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３サブユニットの
生物活性を阻害する目的の治療組成物に使用し得る。

【０１８８】 結果として、本発明はまた、サンプル中の、電位ゲート性チャネル由来のβ３
サブユニットの存在を特異的に検出する方法にも関し、前記方法は、以下のステ
ップを含む。

【０１８９】 （ａ）分析（アッセイ）するサンプルを、βサブユニットタンパク質またはそ
のペプチド断片に対して指向された抗体と接触させ； （ｂ）形成された抗原−抗体複合体を検出する。

【０１９０】 本発明はまた、サンプル中の、β３サブユニットポリペプチドまたはその断片
の存在をインビトロで検出するキットに関し、前記キットは、β３サブユニット
ポリペプチドまたはそのペプチド断片に対して指向された抗体を含む。

【０１９１】 好ましい具体例において、キットはさらに、形成された抗原−抗体複合体の検
出を可能とする試薬を含み、前記試薬は、任意選択的に標識を有するか、または
特に上記の抗体がそれ自体標識されていない場合、標識試薬によりそれ自体を認
識できる。

【０１９２】 本発明の抗体はまた、脳電位ゲート性ナトリウムチャネルの生物活性を遮断で
きる治療剤として有用である。

【０１９３】 従って、本発明の別の目的は、当業者に公知の担体などの、１つまたは数個の
生理学的に許容される担体と組合せた、本明細書に定義した抗体を含む組成物か
らなる。

【０１９４】 β３リガンドのスクリーニング 本発明はまた、本発明のβ３サブユニットを含む電位ゲート性ナトリウムチャ
ネルの生物活性を調節できる、リガンド物質または分子をスクリーニングする方
法に関する。

【０１９５】 β３またはその断片の産生 β３タンパク質またはその断片は、組換え技術、細胞系または化学合成を使用
して調製できる。β３サブユニットまたはその断片の組換え技術および化学合成
により、β３サブユニットまたはその断片の認識タグ、切断部位および修飾など
の特徴を含めるような、β３サブユニットをコードする遺伝子の修飾ができる。
効率的なポリペプチド産生のために、組換え発現系により、β３ポリペプチドが
、発現され、機能的な形で細胞表面に輸送されることが可能となる、またはβ３
サブユニット断片（これは精製できる）の産生が可能となるべきである。好まし
い細胞系は、β３サブユニットまたはその断片の高レベルの発現が可能となるも
のである。かかる細胞系は、Ｃｈｏ細胞およびＣｏｓ細胞などの共通の哺乳動物
細胞系、またはＰＣ１２などのより特殊な神経細胞系を含む。しかし、昆虫細胞
、両生類細胞、例えば卵母細胞、酵母および原核細胞系、例えばＥ．ｃｏｌｉな
どの組換えタンパク質産生に一般に使用される他の細胞型も考えることができる
。

【０１９６】 β３サブユニットまたはその断片は、精製タンパク質として、ファージディス
プレイに記載のものなどのタンパク質キメラとして、細胞膜（脂質または界面活
性剤）調製物としてリガンドスクリーンに、または無傷細胞に使用できる。

【０１９７】 β３サブユニットまたはその断片は、機能的スクリーン形式またはリガンド結
合スクリーン形式に使用できる。両方のスクリーニング形式の例は以下に提供す
る。

【０１９８】 機能的スクリーニング法 機能的スクリーンの第一の具体例は、以下のステップを含む。

【０１９９】 （ａ）電位ゲート性ナトリウムチャネルのβ３サブユニットまたはその断片お
よび機能的αサブユニット、好ましくはα２サブユニット、またはその断片を共
発現している組換え宿主細胞を得て、 （ｂ）前記組換え宿主細胞を、試験する物質または分子と接触させ、そして （ｃ）試験する物質または分子と接触させた組換え宿主細胞内の電気的パラメー
タを、電位固定技術或いは電位感受性蛍光ダイによる膜電位の測定により測定す
る。

【０２００】 測定する第一に好ましい電気的パラメータは不活性化電位である。

【０２０１】 測定する第二に好ましい電気的パラメータは不活性化時間である。

【０２０２】 測定する第三に好ましい電気的パラメータはナトリウムチャネルの回復速度で
ある。

【０２０３】 膜電位の測定は、電位感受性ダイの有用性を記載する、以下の参考文献に記載
の技術の１つを使用して実施できる。Ｂｉｏｐｈｙｓ−Ｊ．１９８９年１２月；
５６（６）：１０５３〜６９；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８９年５月３０日
；２８（１１）：４５３６〜９、Ｃｈｅｍ−Ｂｉｏｌ．１９９７年４月；４（４
）：２６９〜７７、Ｂｉｏｐｈｙｓ−Ｊ．１９９５年１０月：６９（４）：１２
７２〜８０。全てのこれらの刊行物を引用することによって本明細書の一部をな
すものとする。

【０２０４】 機能的スクリーニング法の別の具体例は、以下のステップを含む。

【０２０５】 （ａ）電位ゲート性ナトリウムチャネルのβサブユニットまたはその断片およ
び機能的αサブユニット、好ましくはα２サブユニットまたはその断片を共発現
している組換え宿主細胞を得て （ｂ）前記組換え宿主細胞を、試験する物質または分子と接触させ、そして （ｃ）試験する物質または分子と接触させた組換え宿主細胞内のナトリウム流束
の変化を、ＳＢＦＩなどのナトリウム感受性ダイによるナトリウム流束測定技術
により測定することを含む。

【０２０６】 測定する第一に好ましいパラメータは、細胞内のナトリウム濃度の増加である
。

【０２０７】 測定する第二に好ましいパラメータは、細胞内のナトリウム濃度の減少である
。

【０２０８】 測定する第三の好ましいパラメータは、ナトリウムチャネルの回復速度である
。

【０２０９】 細胞内ナトリウム濃度の変化の測定は、ナトリウム感受性ダイの有用性を記載
した、以下の参考文献に記載の技術の１つを使用して実施できる。Ｗｉｔｋｏｗ
ｓｋｉらＮａｔｕｒｅ１９９８、３９２、７８、Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉｅｎｃｅ１９９８、７１、１１２、Ｍｉｔｔｍａｎｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐ
ｈｙｓｉｏｌ１９９７、７８、１１８８およびＤａｖｉｄら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．１９９７、２９５。全てのこれらの刊行物を引用することによって本明細書
の一部をなすものとする。

【０２１０】 機能的スクリーニング方法のさらなる具体例は、以下のステップを含む。

【０２１１】 （ａ）電位ゲート性ナトリウムチャネルの機能的αサブユニット、好ましくは
α２サブユニット、またはその断片を発現している組換え宿主細胞を得、 （ｂ）前記組換え宿主細胞を、試験する物質または分子およびβサブユニットの
断片、好ましくは少なくとも膜貫通ドメインを除去しておいたβ３サブユニット
の断片と接触させ、そして （ｃ）試験する物質または分子と接触させた組換え宿主細胞内の電気的パラメー
タを、電位固定技術或いは上記に類似した様式で電位感受性蛍光ダイによる膜電
位の測定により測定する。

【０２１２】 機能的スクリーニング法の別の具体例は、以下のステップを含む。

【０２１３】 （ａ）電位ゲート性ナトリウムチャネルの機能的αサブユニット、好ましくは
α２サブユニットまたはその断片を発現している組換え宿主細胞を得、 （ｂ）前記組換え宿主細胞を、試験する物質または分子およびβ３サブユニット
の断片、好ましくは少なくとも膜貫通ドメインを除去しておいたβ３サブユニッ
トの断片と接触させ、そして （ｃ）試験する物質または分子と接触させた組換え宿主細胞内のナトリウム流束
の変化を、上記に類似した様式でＳＢＦＩなどのナトリウム感受性ダイによるナ
トリウム流束測定技術により測定する。

【０２１４】 リガンド結合スクリーニング法 リガンド結合スクリーンの典型的な具体例は、以下のステップを含む。

【０２１５】 （ａ）リガンドを、β３サブユニットまたはその断片と接触させる。 β３ポリペプチドは、無傷細胞、膜調製物または精製ポリペプチドの一部であ
り得る。リガンドは、ペプチド／タンパク質／抗体または化学的実体であり得る
。リガンドが有さなければならない基本的な特性は、リガンドが、β３アミノ酸
配列により決定される結合部位を認識しそれに結合しなければならないことであ
る。任意選択的に、過剰の非β３結合リガンドを分離により除去できる。分離は
、洗浄／ろ過または遠心分離（β３タンパク質をペレット化する）の形で実施で
きる。この後者の場合、次いで、上清を除去し、β３を緩衝液に再懸濁できる。

【０２１６】 （ｂ）リガンドおよびβ３タンパク質またはその断片を含む培地を、β３基質 と接触させ、結合の生じることを可能とする。

【０２１７】 基質の特性は、それが検出可能であり定量可能であることでなければならない
。これを達成するために、基質は、発色団または放射能、蛍光、リン光、酵素的
または抗体標識できる。基質が直接検出できない場合、上記の技術を使用し得る
二次検出による検出および定量が可能でなければならない。任意選択的に、非結
合基質を、上記のように混合物から除去できる。

【０２１８】 （ｃ）基質結合の測定 リガンドの結合は、基質とβ３結合部位の相互作用を修飾し、基質の結合部位
への親和性を減少させる。結合する基質の理論的最大量に比べた、観察された結
合した基質の量の間の差異は、基質結合部位に結合したリガンドの量および親和
性の反映である。基質の検出機序は、その特性により決定される。

【０２１９】 別に、β３サブユニットまたはその断片に結合したリガンドの量は、クロマト
グラフィーと質量分析の組合せにより決定できる。β３サブユニットまたはその
断片に結合したリガンドの量はまた、リガンドまたは基質のβ３への結合時の、
質量変化の直接的測定により決定できる。これはＢｉｏｃｏｒｅ（アマシャムフ
ァルマシア）などの技術を用いて達成し得る。別に、β３サブユニットまたはそ
の断片、基質またはリガンドは、蛍光標識でき、β３とリガンドの会合は、蛍光
エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の変化により追跡できる。

【０２２０】 上記の方法の第一の好ましい具体例において、目的の物質または分子を、活動
電位、不活性化時間、またはナトリウムチャネルの回復速度の変化を誘導するも
のから選択される。

【０２２１】 好ましい分子または物質は、試験する物質または分子の非存在下で実施した同
じ測定に比べて、不活性化電位の減少を誘導する、および／または不活性化速度
の減少を誘導する、および／または、不活性化からの回復速度を減少するもので
ある。

【０２２２】 上記の方法に従って分析（アッセイ）し得る方法は、電位依存性チャネル遮断
剤、テトロドトキシン、リドカイン、フェニトイン、カルバマゼピン、ラモトリ
ジン、ゾニサミド、リルゾール、リファリジン、ラリトリン、フルナリジン、ベ
ラパミルおよびカルベジロールを含むがこれに限定されない。

【０２２３】 上記の方法に従って分析（アッセイ）し得る他の物質は、フェニルアセトアミ
ドファミリーの６−ヨードアミロライド由来の分子である。

【０２２４】 ナトリウムチャネル開口剤もまた、例えばカルサトリンまたはＢＤＦ−９１４
８（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ）などの、良好な候補分子を示し得る。

【０２２５】 ＣＮＳ−５１６１（ケンブリッジニューロサイエンシーズ）などの神経障害疼
痛または片頭痛に対して活性な治療分子も使用し得る。

【０２２６】 本発明はまた、β３サブユニットを含む電位ゲート性ナトリウムチャネルの生
物活性を調節できる物質または分子をスクリーニングするためのキットにも関す
る。

【０２２７】 第一の具体例において、キットは、β３サブユニットまたはその断片およびα
サブユニット、好ましくはα２サブユニットまたはその断片を共発現している組
換え宿主細胞を含む。

【０２２８】 第二の具体例において、キットは、機能的αサブユニット、好ましくはα２サ
ブユニット、またはその断片、およびβ３サブユニットの断片、好ましくは少な
くとも膜貫通ドメインを除去しておいた断片を発現している組換え宿主細胞を含
む。

【０２２９】 第三の具体例において、キットは、β３サブユニットまたはその断片および適
切なβ３基質を含む。

【０２３０】

【実施例】

実施例１：ラット由来のナトリウムチャネルβ３サブユニットをコードするｃ ＤＮＡの単離およびクローニング 多くのその神経内分泌特性を消失したラットのクロム親和性細胞腫細胞系ＰＣ
１２の変異体が研究されている。正常なＰＣ１２細胞に発現されたｍＲＮＡに対
応するが変異体には欠失しているｃＤＮＡを単離するサブトラクティブクローニ
ングを、新規神経内分泌特異的転写物を同定しつつ単離した。

【０２３１】 全ＲＮＡを、野生型ＰＣ１２および変異細胞系から、Ｃｈｏｍｃｚｎｓｋｉお
よびＳａａｔｃｈｉ（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａａｃｈｉ、１９８７）
の記載のように調製した。ポリＡ（＋）ＲＮＡを、オリゴｄＴセルロースカラム
クロマトグラフィー（ファルマシアＵＫ）により全ＲＮＡから精製した（Ａｖｉ
ｖおよびＬａｄｅｒ１９７２）。各細胞系からのｍＲＮＡの収率を、ＰＣＲ選択
技術を使用してサブトラクティブハイブリダイゼーションを用いて続ける前に分
光学的に計算した（クロンテック、米国、Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏら１９９６）。
野生型細胞で異なって発現された遺伝子から得られた増幅ｃＤＮＡ断片を、ｐＴ
Ａｄｖプラスミド（クロンテック）にサブクローニングし（Ｍｅａｄら１９９４
）、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬＩブルー株（Ｂｕｌｌｏｃｋら１９８７）に形質転換して
、ｃＤＮＡ断片ライブラリーを創製した。無作為に拾ったサブクローンからのプ
ラスミドミニプレップを、自動ＤＮＡシークエンスにかけ、ＤＮＡデータベース
サーチを通してスクリーニングした。

【０２３２】 ラットのβ３の全長コード配列を、ＰＣＲ選択により単離した部分クローンを
用いて、ラットの脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより単離した。λ
Ｚａｐのラットの脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｈｏｒｔら１９８８）を、Ｅ．ｃ
ｏｌｉｃ６００ｈｆｌ株（Ｈｕｙｎｈら１９８５）に播き、ファージプラークを
、ＰＣＲ選択クローンから得られた４００ｂｐの³²Ｐ標識ＸｂａＩ−ＳａｃＩ．
ｃＤＮＡ断片を用いてスクリーニングした。約２５０，０００個のプラークの中
から、１つの陽性ファージクローンを、Ｅ．ｃｏｌｉＥＸＯＲＰ、ＸＬＯＬＲ系
を使用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｋｍ２８８プラスミドでプラスミドレス
キューにより単離した（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ＆Ｓｈｏｒｔ１９９４）。ｋｍ
２８８中のｃＤＮＡ挿入断片の両鎖を、Ｍ１３プライマーおよび内部配列特異的
プライマーを使用して両鎖上で自動ＤＮＡシークエンスにかけた。得られた正核
酸配列を本明細書では配列番号３と称する。

【０２３３】 実施例２：ヒト由来のナトリウムチャネルβ３サブユニットをコードするｃＤ ＮＡの単離およびクローニング 新規ラットのβ３サブユニットのヒト相同体を、ストラタジーンから得られた
ヒト線条体λＺＡＰ ＩＩｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。ラット
のβ３オープンリーディングフレームをコードする全ヌクレオチド配列をＰＣＲ
により増幅した。これは、２０ｍｅｒオリゴヌクレオチド：配列番号３３ ５'
−ＡＴＧＣＣＴＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡＴＴＧＣ−３'（ラットのβ３配列の
３６２〜３８３ｂｐ）を正プライマーとして、そして配列番号３４ ５'−ＴＴ
ＡＴＴＣＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＡＣＣＡ−３'（ラットのβ３配列の１００７〜
１０２６ｂｐ）を逆プライマーとして使用して実施した。

【０２３４】 産生された二本鎖ＰＣＲ産物を、［α³²Ｐ］ｄＡＴＰおよび［α³²Ｐ］ｄＣＴ
Ｐを用いたニックトランスレーションにより放射標識し、これを使用して、２５
％ホルムアミドを含む標準的なハイブリダイゼーション緩衝液中のニトロセルロ
ースフィルターに結合した１０⁶個の一次プラークをプローブした。陽性ハイブ
リダイゼーションを生じる１つのプラークを単離し、挿入断片ｃＤＮＡをＡＢＩ
３１０ＤＮＡ解析器でシークエンスした。得られた正核酸配列は配列番号４と称
する。

【０２３５】 実施例３：ポリメラーゼ連鎖反応による組織発現 全ＲＮＡを、成体ラットの組織およびＰＣ１２細胞から調製し、ＤＮＡアーゼ
Ｉで処理して、ゲノム混入を除去し、製造業者の薦めに従ってアンカーオリゴｄ
Ｔプライマーと共にＭＭＬＶ逆転写酵素を使用して逆転写した。約０．５および
５ｎｇのｃＤＮＡを、別々に、ラットのβ１（寄託番号ｍ９１８０８）、ラット
のβ３（寄託番号ＡＪ２４３３９５）、および、類似の量のｃＤＮＡが各反応に
使用されたことを確認するために、ラットのα−チューブリン（寄託番号Ｖ０１
２２６）に特異的なプライマーを使用してＰＣＲ増幅にかけた。使用したプライ
マーは、各βサブユニットの３'非翻訳領域の独特な配列に対応するように選択
した。

【０２３６】 β１正プライマー（ヌクレオチド１１０３〜１１２０）配列番号３６ ５'ＧＧＴＧＡＡＧＣＡＡＴＡＴＧＧＣＣＧ３'、 逆プライマー（ヌクレオチド１３１７〜１３００）配列番号３７ ５'ＡＧＡＴＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣ３'、 β３正プライマー（ヌクレオチド１９４２〜１９６１）配列番号３８ ５'ＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＣＣＡＣＡＧＡＴ３'、 逆プライマー（ヌクレオチド２２０９〜２１９０）配列番号３９ ５'ＣＣＴＧＧＧＧＧＡＣＴＴＴＡＣＡＡＡＣＡ３'、 α−チューブリン正プライマー（ヌクレオチド２９８〜３１６）配列番号４０ ５'ＣＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＧＴＧＡＧＧ３'、 逆プライマー（ヌクレオチド４６９〜４４８）配列番号４１ ５'ＴＴＴＧＡＣＡＴＧＡＴＡＣＡＧＧＧＡＣＴＧＣ３'。ＰＣＲは、増幅反応液
が０．１２５μｌのＴａｑｓｔａｒｔ抗体（クロンテック）を含む以外は、上記
の通りに実施した。ｃＤＮＡを欠失した対照増幅も含めた。増幅後、産物を、２
．５％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムを使用して可視化した（図２
）。

【０２３７】 実施例４：β３サブユニットの分布のインサイツハイブリダイゼーション研究 全脳を成体（１５０〜２００ｇ）ウィスターラットから解剖し、ドライアイス
上で凍結させた。１０μｍの低温槽切片を、ポリ−ｌ−リジン覆膜スライドに解
凍してのせ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中４％パラホルムアルデヒドで固定し、脱水
し、ハイブリダイゼーションまでエタノール下で保存した。解析に使用したアン
チセンスオリゴヌクレオチドの配列および位置は以下の通りであった。

【０２３８】 ラットのβ１（ヌクレオチド１２９６〜１２５２）配列番号４２ ５'ＧＣＴＴＧＡＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣ
ＡＧＴＡＧＴＧＧＧＣ３'、 ラットのβ３（ヌクレオチド３８９〜３４５）配列番号３５ ５'ＧＧＧＧＡＡＧＣＡＡＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＣＡＧＧＣＡＴＣＴＴＴＴＣ
ＣＡＣＣＧＴＡＡＧＣＧ３'、 ラットのαＩＩＡ（ヌクレオチド１６５９〜１６１５）配列番号４３ ５'ＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＣＡＧＣＧＧＧＧＣＡＧＧＣＧＧＧＡ
ＴＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣ３'。

【０２３９】 オリゴヌクレオチドを、［³⁵Ｓ］ｄＡＴＰ（アメルシャムファルマシア：１０
００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用いて、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼ（ロッシェモレキュラーバイオケミカルズ、参考文献、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．
Ｒ．ら１９８９）により３'末端標識し、ハイブリダイゼーション緩衝液の４０
０，０００ｃｐｍ／１００μｌの濃度でハイブリダイゼーションに使用した。ハ
イブリダイゼーションの特異性を確認するために、１００倍過剰の非標識オリゴ
ヌクレオチドを、放射標識プローブに加えて、ハイブリダイゼーション緩衝液に
加えた。スライドを風乾させ、一晩４２℃で、５０％ホルムアミド、１０％硫酸
デキストラン、５０ｍＭ ＤＴＴ、１×デンハード液、０．５ｍｇ／ｍｌの変性
サケ精子ＤＮＡおよび０．５ｍｇ／ｍｌのポリアデニル酸（全てシグマ、Ｐｏｏ
ｌｅ、英国）を含む１５０μｌの緩衝液中でハイブリダイズさせた。切片を、１
×ＳＳＣで５５℃で３０分間洗浄し、１×ＳＳＣで濯ぎ、０．１×ＳＳＣで脱水
し、コダックバイオマックスＴＭ ＭＲＸ線フィルム（アマシャムファルマシア
）に１０日間並べた。

【０２４０】 切片を観察し、図３に添付したカメラ付きＰｏｌｙｖａｒ顕微鏡（Ｒｅｉｃｈ
ｅｒｔ−Ｊｕｎｇ）を使用して写真を撮影した。

【０２４１】 配列番号３５に示した配列は、ＦＡＳＴＡサーチ（ＮＣＢＩ）により確認され
たターゲット配列に独特な、インサイツハイブリダイゼーション実験に使用され
たアンチセンス放射標識オリゴヌクレオチドプローブである。これにより、表１
に示した詳細な分布を決定し、分布の変化を検出することが可能となる。成体ラ
ットの脳切片上のｍＲＮＡ（エマルションに浸した切片およびオートラジオグラ
フ）を相対光学密度（ＲＯＤ）について評価した。＋＋＋＋＋＋、＋＋＋＋＋、
は非常に豊富を意味し、＋＋＋＋は豊富を意味し、＋＋＋は中程度を意味し、＋
＋、＋は低いを意味し、１／２はバックグラウンドよりほんの上であり、０は検
出不可能を意味する。ｎ＝３〜６。ＶＢＤ−対角帯の垂直肢の核、ＶＴＡ−腹側
被蓋野、ＡＰＴＤ−前視蓋前核（背部）、ＤｐＭｅ−深中脳核。

【０２４２】

【表１】

【０２４３】 実施例５：β３サブユニットの細胞外ドメインの配列比較および３次元モデリ ング ラットおよびヒトβ３のアミノ酸配列を、ラットのβ１（スイスプロットＱ０
０９５４）（Ｉｓｏｍ，Ｌ．Ｌ１９９２）の配列、およびラットミエリンＰ₀（
スイスプロットＰ０６９０７）（Ｌｅｍｋｅ Ｇ．＆Ａｘｅｌ，Ｒ１９８５）の
細胞外ドメインと共にアラインさせた。マルチプルアラインメントを、ＣＬＵＳ
ＴＡＬＷ（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ１９９６）を用いて作成し、ＡＬＳＣＲＩＰ
Ｔ（Ｂａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．１９９３）（図４）を用いてフォーマットした。配
列ナンバリングは、成熟タンパク質の予測Ｎ末端から開始し、ラットのβ３をベ
ースとする。ラットのβ３とのアミノ酸の同一性を影で示す。推定シグナル配列
および内部移行シグナルに下線をし、標識する。推定膜貫通ドメイン（ＴＭ）を
四角で囲む。β１のαサブユニット結合部位の一部として以前に同定された、３
つの陰性荷電アミノ酸残基を四角で囲む。不変残基およびＩｇＶドメインに特徴
的なアミノ酸の位置を、ミエリンＰ₀の配列の下に示す。ｈ、疎水性；１、脂肪
性；％、中性または疎水性；＋、塩基性；＝、疎水性またはＳｅｒ、Ｔｈｒ；＃
、ＧｌｙまたはＡｌａ（稀にＡｓｐ）（１７）。β３をモデリングするのに使用
したミエリンＰ₀（Ｓｈａｐｉｒｏ、Ｌ１９９６）の結晶構造の二次構造エレメ
ントも示す。矢印、β鎖；円筒、α−または３₁₀−ヘリックス。

【０２４４】 ラットのβ３の成熟細胞外ドメイン（残基１〜１２３）の３次元構造のモデル
。モデルは、ＭＯＤＥＬＬＥＲ（Ｓａｌｉ，Ａ＆Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．１
９９３）を用いて、ラットのミエリンＰ₀（ＰＤＶ１ｎｅｕ）（Ｓｈａｐｉｒｏ
，Ｌ１９９６）の結晶構造を鋳型として使用して作成し、アラインメントを（図
５）に示す。図５は、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｐ．Ｊ．１９９１
）およびＲＡＳＴＥＲ３Ｄ（Ｍｅｒｒｉｔ，Ｅ＆Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．１９９４）
を用いて描いた。推定αサブユニット結合部位の酸性残基の側鎖を、ボールと棒
の表示で示す。２つの予測ジスルフィド結合を黒で標識する。Ｎ−連結グリコシ
ル化部位（ＮＸＴおよびＮＸＳ）（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ＆Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，
Ｓ１９８５）をアステリスクで示す。Ｆ鎖上の可能性あるグリコシル化部位（Ｎ
９７）は観察者とは離れて向き、紙の平面の下にある。

【０２４５】 注記：このモデルでは、Ｂ鎖は、それぞれＢおよびＢ'と標識した２部に分解
する。この二次構造割当ては、ＰＤＦエントリー１ｎｅｕについてＫａｂｓｃｈ
＆Ｓａｎｄｅｒ（１９８３）の定義に基づき、最初の論文（Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｌ
１９９６）に記載の割当てとは異なる。

【０２４６】 実施例６：組換え系におけるβ３サブユニットの機能的発現 ラットの脳ＩＩＡ型αサブユニットおよびラットのβ３サブユニットのキャッ
プｃＲＮＡを、インビトロで、転写ｃＤＮＡから転写した（Ｐｒｏｍｅｇａ、サ
ウサンプトン、英国）。ｐＢＳＫβ３を、ＮｏｔＩで線形化し、Ｔ７ポリメラー
ゼで転写し、一方、ＺＥＭＲＶＳＰ６−２５８０α２は、ＣｌａＩで線形化し、
ＳＰ６ポリメラーゼで転写した。アフリカツメガエルを、０．３％（ｗ／ｖ）３
−アミノ安息香酸（シグマ、プール、英国）中への浸漬により麻酔し、卵巣葉を
取り出した。卵母細胞を、Ｃａ²⁺非含有溶液中（８２．５ｍＭ ＮａＣｌ、２．
５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．６）０．
３％（ｗ／ｖ）コラゲナーゼ（シグマ、プール、英国）を使用して解離した。調
製した卵母細胞に、水に溶かした５０ｎｌのｃＲＮＡをマイクロインジェクトし
た。卵母細胞を１８℃でＮＤ９６（９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１．
８ｍＭ ＣａＣｌ₂、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．６）中
でインキュベートした。２電極電位固定記録を、Ｃｌａｍｐｅｘソフトウェア（
ｖ６、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、米国）を積載したＤｉｇｉｄ
ａｔａ１２００Ａ／ＤにインターフェースしたＧｅｎｅ Ｃｌａｍｐ５００増幅
器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、米国）を使用して、ｃＲＮＡの
マイクロインジェクションの３〜６日後に実施した。卵母細胞を、ＮＤ９６で連
続的に還流し、３Ｍ ＫＣｌで充填した微小電極は０．５〜２ＭΩの抵抗を有し
た。電流を、１０ｋＨｚでサンプルをとり、２ｋＨｚでろ過した。データをＣｌ
ａｍｐｆｉｔ（ｖ６、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、米国）および
Ｐｒｉｓｍ（ｖ２、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ、米国）を使用
して解析した。

【０２４７】 内向きＮａ⁺電流は、５ｍＶ脱分極パルスを、−１００ｍＶの保持電位から、
−８０ｍＶから＋３０ｍＶに適用することにより誘起した。ＩＩＡαサブユニッ
トのみを発現している卵母細胞から記録したＮａ⁺電流。−１０ｍＶでの不活性
化は、二重指数関数に最善に適合し、ここで、τ₁＝２±０．３ｍｓであり、τ₂ ＝１２．７±２．４ｍｓ（ｎ＝４）である。ｂ．ＩＩＡαおよびβ₁サブユニッ
トを共発現している卵母細胞から記録したＮａ⁺電流。不活性化は、二重指数関
数に最善に適合し、ここで、−１０ｍＶ（ｎ＝４）で、τ₁＝１．３±０．３ｍ
ｓであり、τ₂＝２２．７±７．７ｍｓである。ｃ．ＩＩＡαおよびβ₃サブユニ
ットを共発現している卵母細胞から記録したＮａ⁺電流。不活性化は、二重指数
関数に最善に適合し、ここで、−１０ｍＶ（ｎ＝４）で、τ₁＝１±０．１ｍｓ
であり、τ₂＝２３．８±６．３ｍｓである。

【０２４８】 α２およびβ３を共発現している卵母細胞から記録したＮａ⁺電流の定常状態
不活性化曲線と、｝α２のみを発現している卵母細胞との比較。データを、ボル
ツマン関数、ｇ／ｇ_max＝Ｊ／｛１＋ｅｘｐ［（Ｖ−Ｖ_1/2）／ｋ］｝に適合させ
、ここで、Ｖ_1/2は中点であり、ｋは傾斜因子である。α２＋β３については、
Ｖ_1/2＝−４９．４ｍＶ、ｋ＝１０．１ｍＶであり、α２については、Ｖ_1/2＝−
４１．３ｍＶ、ｋ＝９．１ｍＶである。β３とα２の共発現により、定常状態不
活性化曲線の過分極が引き起こされる。

【０２４９】 α２およびβ３を共発現している卵母細胞から記録したＮａ⁺電流の不活性化
からの回復速度と、α２のみを発現している卵母細胞との比較。データを、二重
指数関数に適合させた。α２＋β３については、τ１＝１．９ｍｓ、τ２＝１９
８ｍｓであり、α２については、τ１＝３．８ｍｓ、τ２＝２６４ｍｓである。
β３とα２の共発現は、不活性化からの回復速度を増加させる。

【０２５０】 同じ手順を使用して、ヒト形のβ３を発現し、ＩＩＡα型との共発現の効果を
測定した。ＩＩＡα型のみでは、不活性化は、二重指数関数と最善に適合し、こ
こで、τ₁＝１．７８±０．４ｍｓおよびτ₂＝１３±１．２５ｍｓ（ｎ＝４）で
ある。ＩＩＡα型およびヒトのβ３については、不活性化は、二重指数関数と最
善に適合し、ここで、τ₁＝１±０．１ｍｓであり、τ₂＝９．１±１．４ｍｓで
あり、ｔ１／（ｔ１＋ｔ２）＝０．７２＋０．０３である。

【０２５１】 この方法は、図６に示したナトリウムチャネル複合体の機能の変化を検出する
技術である。

【０２５２】 実施例７：組換え系でのβ３サブユニットの機能的発現 ラットの脳αＩＩＡサブユニットおよびラットのβ１−またはβ３−サブユニ
ットのキャップｃＲＮＡを、インビトロで、線形ｃＤＮＡ（プロメガ）から転写
した。アフリカツメガエルを、０．３％（ｗ／ｖ）３−アミノ安息香酸（シグマ
）への浸漬により麻酔し、卵巣葉を取り出した。卵母細胞を、Ｃａ²⁺非含有溶液
（８２．５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．６）中０．３％（ｗ／ｖ）コラゲナーゼ（シグマ）を使
用して解離した。調製した卵母細胞に、水に溶かした５０ｎｌのｃＲＮＡ（０．
２〜１ｎｇのαｃＲＮＡ、１０ｎｇのβ１またはβ３ｃＲＮＡ）をマイクロイン
ジェクトした。ｃＲＮＡ濃度を、ＵＶ分光法およびアガロースゲル電気泳動によ
り推定した。卵母細胞を１８℃でＮＤ９６（９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣ
ｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ₂、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７
．６）中でインキュベートした。２電極電位固定記録を、Ｃｌａｍｐｅｘソフト
ウェア（バージョン６、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を積載したＤｉｇ
ｉｄａｔａ１２００Ａ／ＤにインターフェースしたＧｅｎｅ Ｃｌａｍｐ５００
増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フォスターシティー、ＣＡ、米国
）を使用して、ｃＲＮＡのマイクロインジェクションの３〜６日後に実施した。
卵母細胞を、ＮＤ９６を用いて連続的に還流した。３Ｍ ＫＣｌで充填した微小
電極は０．５〜２ＭΩの抵抗を有した。電流を、１０ｋＨｚでサンプルをとり、
２ｋＨｚでろ過した。データをＣＬＡＭＰＦＩＴ（バージョン６、Ａｘｏｎ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびＯＲＩＧＩＮ（バージョン５、Ｍｉｃｒｏｃａｌ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ノーサンプトン、ＭＡ）を使用して解析した。指数関数を
、ＣＬＡＭＰＦＩＴの単純な適合アルゴリズムを使用してデータに適合させた。

【０２５３】 （ａ）ラットのαＩＩＡ、ラットのαＩＩＡ＋ラットのβ１およびラットのα
ＩＩＡ＋ラットのβ３サブユニットを発現している卵母細胞から記録したＮａ⁺
電流。内向きＮａ⁺電流は、５ｍＶ増分の脱分極パルスを、−１００ｍＶの保持
電位から、−８０ｍＶから＋３０ｍＶに適用することにより誘起した。パルスの
持続は５０ｍｓであった。

【０２５４】 （ｂ）ラットのαＩＩＡ、ラットのαＩＩＡ＋ラットのβ１およびラットのα
ＩＩＡ＋ラットのβ３サブユニットを発現している卵母細胞からの基準化Ｎａ⁺
電流。電位パルスにより−１０ｍＶまで誘起された電流を、ピーク増幅に基準化
した。−１０ｍＶでのＮａ⁺電流の不活性化を、二重指数崩壊と適合させた。Ｉ
＝Ａ１ｅｘｐ（−ｔ／τ１）＋Ａ２ｅｘｐ（−ｔ／τ２）＋Ｃ、ここでのＡ１お
よびＡ２は、速いおよび遅い成分の相対増幅であり、τ１およびτ２は不活性化
時間定数であり、Ｃは定常状態の漸近線であった。適合パラメータについては表
２参照。

【０２５５】 （ｃ）β１またはβ３と共発現したαＩＩＡの不活性化からの回復。回復パル
スプロトコルは、−１０ｍＶまでの１ｓの不活性化パルス、次いで、さらに長い
期間（１〜１０００ｍｓ）の−１００ｍＶまでの調整パルス、次いで−１０ｍＶ
までの試験パルスであった。点を、１から２０ｍｓまでの１ｍｓ毎に、次いで５
０から１０００ｍｓまでの５０ｍｓ毎にサンプルを採取した。試験パルス中に測
定したピーク電流増幅を、不活性化パルス中に誘起されたピーク電流に基準化し
、調整パルス持続期間の関数としてプロットした。αＩＩＡ、αＩＩＡ＋β１：
αＩＩＡ＋β３：データを二重指数式と適合させた。Ｉ＝１−［Ａ１ｅｘｐ（−
ｔ／τ１）＋Ａ２ｅｘｐ（−ｔ／τ２）］、ここでの、Ａ１およびＡ２は、回復
の相対増幅であり、τ１およびτ２は回復時間定数である。適合パラメータにつ
いては表２参照。

【０２５６】 （ｄ）β１またはβ３と共発現したαＩＩＡの電位依存性不活性化。２ステッ
ププロトコルを、５ｍＶ増加分で、−１１０ｍＶから＋１０ｍＶの５００ｍｓの
期間の調整パルスを使用して、次いで−１０ｍＶまでの試験パルスを使用して適
用した。試験パルスにより誘起されるピーク電流増幅は、最大ピーク電流増幅に
基準化し、調整パルス電位の関数としてプロット化した。データは、２状態ボル
ツマン式：ｇ＝１／［１＋ｅｘｐ｛（Ｖ−Ｖ_1/2）／ｋ｝］を用いて適合させ、
ここでのｇはコンダクタンスであり、Ｖ_1/2は最大の半分の不活性化の電位であ
り、ｋは傾斜因子である。適合パラメータについては表２参照。

【０２５７】

【表２】

【０２５８】 ［文献］ ＊ Alting-Mees MA and Short J.M. 1994, Strategies 7 70-72 (E. coli XPORT
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【０２５９】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトおよびラットのβ３サブユニットコード配列の配列アラインメント。 上の列：ヒトのβ３サブユニットのコード配列 中間の列：ラットのβ３サブユニットのコード配列 下の列：ヒトおよびラットのβ３サブユニットの両方に共通なヌクレオチドを
含む共通配列

【図２】 ポリメラーゼ連鎖反応によるラットにおけるβ３およびβ１サブユニットの組
織での発現。

【図３】 成体ラットの脳におけるナトリウムチャネルサブユニットのインサイツでの分
布。特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いたインサイツハイブリダイゼーシ
ョンにより判明した、ラットのαＩＩＡ（ａ、ｂ、ｃ）；ラットのβ１（ｄ、ｅ
、ｆ）およびラットのβ３（ｇ、ｈ、ｉ）ｍＲＮＡ転写物の分布を示す、ラット
の脳（同じ動物から採取）の別々の矢状切片のＸ線オートラジオグラフ。１００
倍過剰の非標識プローブを用いた対照反応を、αＩＩＡ（ｃ）；β１（ｆ）およ
びβ３（ｉ）について示す。スライドを１０日間Ｘ線フィルムに露光した。暗い
領域は、高い発現レベルを示す。Ｃｂ、小脳；Ｃｔｘ、皮質；Ｃｐ、尾状核被殻
。

【図４】 ヒトおよびラットのβ３、ラットのβ１サブユニットおよびラットのミエリン
Ｐ０タンパク質のアミノ酸配列アラインメント。 １列目：ラットのβ３のアミノ酸配列 ２列目：ヒトのβ３のアミノ酸配列 ３列目：ラットのβ１のアミノ酸配列 ４列目：ラットのミエリンＰ０のアミノ酸配列

【図５】 β３サブユニットの細胞外ドメインの３次元構造。

【図６】 ＩＩＡαサブユニット単独、またはＩＩＡαおよびβ１またはβ３サブユニッ
トを発現している卵母細胞のＮａ⁺電流曲線。内向きＮａ⁺電流は、５ｍＶ脱分極
パルスを、−１００ｍＶの保持電位から、−８０ｍＶから＋３０ｍＶまで適用す
ることにより誘起した。ａ．ＩＩＡαサブユニットのみを発現している卵母細胞
から記録したＮａ⁺電流。−１０ｍＶでの不活性化は、二重指数関数に最善に適
合し、ここで、τ₁＝２±０．３ｍｓであり、τ₂＝１２．７±２．４ｍｓ（ｎ＝
４）である。ｂ．ＩＩＡαおよびβ₁サブユニットを共発現している卵母細胞か
ら記録したＮａ⁺電流。不活性化は、二重指数関数に最善に適合し、ここで、−
１０ｍＶ（ｎ＝４）で、τ₁＝１．３±０．３ｍｓであり、τ₂＝２２．７±７．
７ｍｓである。ｃ．ＩＩＡ₂αおよびβ₃サブユニットを共発現している卵母細胞
から記録したＮａ⁺電流。不活性化は、二重指数関数に最善に適合し、ここで、
−１０ｍＶ（ｎ＝４）で、τ₁＝１±０．１ｍｓであり、τ₂＝２３．８±６．３
ｍｓである。

【図７】 ＩＩＡαサブユニットのみ、またはＩＩＡαおよびβ１またはβ３サブユニッ
トを発現している卵母細胞のＮａ⁺電流曲線。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/04 Ａ６１Ｐ 25/28 ４Ｃ０８４ 25/20 43/00 １０７ ４Ｈ０４５ 25/28 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０７ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 33/58 Ａ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ 33/58 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ディクソン，アリステア イギリス国、シービー１ ２エルエル ケ ンブリッジシャー、ケンブリッジ、グウィ ダー・ストリート 108 (72)発明者 ジャクソン，アントニー イギリス国、シービー４ ２エイダブリュ ー ケンブリッジシャー、ケンブリッジ、 リーズ・アヴェニュー ６ (72)発明者 モーガン，ケヴィン イギリス国、シービー１ ５ジェイエイチ ケンブリッジシャー、ケンブリッジ、グ レイト・ウィルブラハム、トフト・レイン 30 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 4B024 AA01 AA11 BA21 BA63 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 4B063 QA01 QQ08 QQ43 QR32 QR55 QR62 QS25 QS34 4B064 AG01 AG20 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA02 BA08 BA17 BA18 BA19 BA20 BA21 BA22 BA23 CA53 CA56 CA59 DC50 NA14 ZA032 ZA052 ZA082 ZA362 ZB222 4H045 AA10 AA20 BA10 DA50 EA22 FA74

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３サブユニットま
   たはそれに相補的な配列をコードする精製または単離された核酸。
2. 【請求項２】 ラットの脳に存在する電位ゲート性ナトリウムチャネル由来
   のβ３サブユニット、またはそれに相補的な配列をコードする請求項１に記載の
   核酸。
3. 【請求項３】 ヒトの脳の中に存在する電位ゲート性ナトリウムチャネル由
   来のβ３サブユニット、またはそれに相補的な配列をコードする請求項１に記載
   の核酸。
4. 【請求項４】 配列番号１のアミノ酸配列のβ３サブユニットポリペプチド
   と、またはそのペプチド断片、またはそれに相補的な配列に対して、少なくとも
   ８０％のアミノ酸の同一性を有するポリペプチドをコードする請求項１に記載の
   精製または単離された核酸。
5. 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸配列のβ３サブユニットのポリペプチ
   ド、またはそれに相補的な配列に対して、少なくとも８０％のアミノ酸の同一性
   を有するポリペプチドをコードする請求項１に記載の精製または単離された核酸
   。
6. 【請求項６】 配列番号３のヌクレオチド配列、またはそれに相補的な配列
   に対して、少なくとも９０％のヌクレオチドの同一性を有する請求項１に記載の
   精製または単離された核酸。
7. 【請求項７】 配列番号３のヌクレオチド配列の３６３位に位置するヌクレ
   オチドにおいて始まり、１０１０位において位置するヌクレオチドにおいて終わ
   る配列に対して、少なくとも９０％のヌクレオチドの同一性を有するポリヌクレ
   オチドを含む請求項１に記載の精製または単離された核酸。
8. 【請求項８】 配列番号３のヌクレオチド配列の１位に位置するヌクレオチ
   ドにおいて始まり、３６２位において位置するヌクレオチドにおいて終わる配列
   を含む請求項１に記載の精製または単離された核酸。
9. 【請求項９】 配列番号３のヌクレオチド配列の１０１１位において位置す
   るヌクレオチドにおいて始まり、２２２０位において位置するヌクレオチドにお
   いて終わる配列を含む請求項１に記載の精製または単離された核酸。
10. 【請求項１０】 配列番号４のヌクレオチド配列と、またはそれに相補的な
    配列に対して、少なくとも９０％のヌクレオチドの同一性を有する請求項１に記
    載の精製または単離された核酸。
11. 【請求項１１】 配列番号４のヌクレオチド配列の３７６位において位置す
    るヌクレオチドにおいて始まり、１０２３位のヌクレオチドにおいて終わる配列
    に対して少なくとも９０％のヌクレオチドの同一性を有するポリヌクレオチドを
    含む請求項１に記載の精製または単離された核酸。
12. 【請求項１２】 配列番号４の１位に位置するヌクレオチドにおいて始まり
    、３７５位に位置するヌクレオチドにおいて終わる配列を含む請求項１に記載の
    精製または単離された核酸。
13. 【請求項１３】 配列番号４のヌクレオチド配列の１０２４位に位置するヌ
    クレオチドにおいて始まり、１２６１位において位置するヌクレオチドにおいて
    終わる配列を含む請求項１に記載の精製または単離された核酸。
14. 【請求項１４】 電位ゲート性ナトリウムチャネルのβ３サブユニットをコ
    ードする核酸の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む精製または単離さ
    れたポリヌクレオチド。
15. 【請求項１５】 配列番号３のヌクレオチド配列の少なくとも１０個連続し
    たヌクレオチド、またはそれに相補的な配列を含む、請求項１４に記載の精製ま
    たは単離された核酸。
16. 【請求項１６】 配列番号４のヌクレオチド配列の少なくとも１０個連続し
    たヌクレオチド、またはそれに相補的な配列を含む、請求項１４に記載の精製ま
    たは単離された核酸。
17. 【請求項１７】 配列番号５〜３２、または配列番号４６、または配列番号
    ４７のペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号３５〜４３とからな
    る一群から選択される請求項１４に記載の精製または単離された核酸。
18. 【請求項１８】 ａ）ターゲットされたβ３サブユニット核酸またはその断
    片を含むことが疑われる試験サンプルを、請求項１〜１７のいずれか一項に記載
    の核酸にハイブリダイズできる一対の増幅プライマーを含む増幅反応試薬と接触
    させるステップと、 ｂ）任意選択的に、増幅産物を検出するステップと を含むβ３サブユニット核酸を増幅する方法。
19. 【請求項１９】 前記増幅プライマーは、それぞれ配列番号３３および配列
    番号３５のヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 ａ）請求項１〜１７のいずれか一項に記載のβサブユニッ
    ト核酸にハイブリダイズできる一対の増幅プライマーと、 ｂ）任意選択的に、増幅反応を実施するのに必要な試薬と を含む、βサブユニットヌクレオチド配列を増幅するためのキット。
21. 【請求項２１】 ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
    、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸に含まれるヌクレオチド配列にハ
    イブリダイズできる１つの核酸プローブまたは複数の核酸プローブを、分析する
    サンプルと接触させるステップと、 ｂ）サンプル中において、１つのプローブまたは複数のプローブと、核酸との
    間に形成されたハイブリッド複合体を検出するステップと を含む、サンプル中の請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸を含むポリ
    ヌクレオチドの存在を検出する方法。
22. 【請求項２２】 １つの核酸プローブまたは複数の核酸プローブが、基質上
    に固定されていることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 １つの核酸プローブまたは複数の核酸プローブが、検出可
    能な分子によって標識されていることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
24. 【請求項２４】 ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に
    おいて、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸に含まれるヌクレオチド配
    列に対して、ハイブリダイズできる、１つの核酸プローブまたは複数の核酸プロ
    ーブと、 ｂ）任意選択的に、ハイブリダイゼーション反応の実施に必要な試薬を含む、
    請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸を含むポリヌクレオチドの存在を検
    出するためのキット。
25. 【請求項２５】 １つの核酸プローブまたは複数の核酸プローブが、基質上
    に固定されていることを特徴とする請求項２４に記載のキット。
26. 【請求項２６】 １つの核酸プローブまたは複数の核酸プローブが、検出可
    能な分子によって標識されていることを特徴とする請求項２４に記載のキット。
27. 【請求項２７】 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸を含む組換え
    ベクター。
28. 【請求項２８】 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸を含む組換え
    宿主細胞。
29. 【請求項２９】 ａ）適切な培養培地中において、請求項１〜７、１０、１
    １および１４〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによって、以前に
    形質転換またはトランスフェクトしておいた宿主細胞を培養するステップと、 ｂ）ならした培養培地を収集するステップか、例えば、または超音波処理によ
    りまたは浸透圧ショックにより宿主細胞を溶解するステップと、 ｃ）前記培養培地から、または、得られた細胞溶解液のペレットから、かくし
    て産生された目的のポリペプチドを分離または精製するステップと を含む請求項１〜７、１０、１１および、１４〜１７のいずれか一項に記載の
    核酸によりコードされるポリペプチドを産生する方法。
30. 【請求項３０】 電位ゲート性ナトリウムチャネル由来のβ３サブユニット
    、またはそのペプチド断片のアミノ酸配列を含む精製または単離ポリペプチド。
31. 【請求項３１】 ラットの脳に存在する電位ゲート性ナトリウムチャネル由
    来のβ３サブユニット、またはそのペプチド断片のアミノ酸配列を含む請求項３
    ０に記載のポリペプチド。
32. 【請求項３２】 ヒトの脳中に存在する電位ゲート性ナトリウムチャネル由
    来のβ３サブユニット、またはそのペプチド断片のアミノ酸配列を含む請求項３
    ０に記載のポリペプチド。
33. 【請求項３３】 配列番号１またはそのペプチド断片のアミノ酸配列に対し
    て、少なくとも９０％のアミノ酸の同一性を有するアミノ酸配列を含む精製また
    は単離ポリペプチド。
34. 【請求項３４】 配列番号２またはそのペプチド断片のアミノ酸配列に対し
    て、少なくとも９０％のアミノ酸の同一性を有するアミノ酸配列を含む精製また
    は単離ポリペプチド。
35. 【請求項３５】 請求項１〜７、１０、１１、１４〜１７のいずれか一項に
    記載の核酸によりコードされる精製または単離ポリペプチド。
36. 【請求項３６】 配列番号５〜３２のポリペプチドと、配列番号４６のポリ
    ペプチドと、配列番号４７のポリペプチドとからなる一群から選択される精製ま
    たは単離ポリペプチド。
37. 【請求項３７】 （ａ）電位ゲート性ナトリウムチャネルのβ３サブユニッ
    トまたはその断片、および機能的αサブユニットまたはその特性、好ましくはα
    ２サブユニットまたはその断片を共発現している組換え宿主細胞を得るステップ
    と、 （ｂ）上記組換え宿主細胞を、試験する物質または分子と接触させるステップ
    と、 （ｃ）試験する物質または分子と接触させた組換え宿主細胞内の電気的パラメ
    ータを、電圧固定技術または電圧感受性蛍光ダイによる膜電位の測定により、測
    定するステップと を含む、β３サブユニットを含む電位ゲート性ナトリウムチャネルの生物活性
    を調節できるリガンド物質または分子をスクリーニングする方法。
38. 【請求項３８】 （ａ）リガンドを、β３サブユニットまたはその断片と接
    触させるステップと、 （ｂ）上記リガンドおよびβ３タンパク質またはその断片を含む培地を、β３
    基質と接触させ、該β３タンパク質またはその断片への該基質の可能性ある結合
    が起こることを可能とするステップと、 （ｃ）上記基質の、上記β３タンパク質またはその断片に対する、最終的な結
    合を測定するステップと を含むβ３サブユニットを含む電位ゲート性ナトリウムチャネルの生物活性を
    調節できるリガンド物質または分子をスクリーニングする方法。