JP2002514064A - Ｋ−ＡＴＰチャンネルに作用する蛋白質ｐ５６の新規配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトｐ５６蛋白質の全長配列（ｐ５６−１）、関連相同物（ｐ５６−２）およびこれらの蛋白質をコードする核酸を記載する。当該配列は、チャート１、２、３および４ならびに出願の配列表に提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｋ−ＡＴＰチャンネルに作用する蛋白質ｐ５６の新規配列 発明の分野 本発明は、カリウムチャンネルおよびｐ５６蛋白質に関する。 情報の開示 本発明は、ＷＯ９６/１６０８８として１９９６年５月３０日に公開されたＰ ＣＴ/ＵＳ９５/１４１２４、とりわけ第１頁に示された開示をここに出典明示し て本明細書の一部とみなす。さらに、本発明の詳細な記載中の文献は、情報の開 示の一部として考えられるべきである。 背景 ＷＯ９６/１６０８８として１９９６年５月３０日に公開されたＰＣＴ/ＵＳ９ ５/１４１２４、とりわけ第１〜５頁に示された背景をここに出典明示して本明 細書の一部とみなす。 Ｋ−ＡＴＰチャンネルを選択的に開閉するであろう選択的薬剤の同定に有用で ある蛋白質、ｐ５６の単離および同定は、ＷＯ９６/１６０８８として１９９６ 年５月３０日に公開されたＰＣＴ/ＵＳ９５/１４１２４に記載されている。この 中で、ｐ５６の全長アミノ酸配列およびｐ５６をコードする核酸配列が記載され ている。また、異なるｐ５６蛋白質であるｐ５６−２についてのアミノ酸配列お よびそれをコードするコーディングＤＮＡも記載されている。 発明の概要 本発明は、ヒトｐ５６蛋白質（ｐ５６−１）、関連した相同物（ｐ５６−２） およびこれらの蛋白質をコードする核酸の全長配列を記載する。当該配列をチャ ート１、２、３および４、ならびに出願の配列表に提供する。本明細書に開示さ れた２種のユニークなｐ５６ＤＮＡ配列および蛋白質がある。第１のｐ５６配列 であるｐ５６−１について、ｐ５６の蛋白質の全アミノ酸配列をチャート１に提 供し、ｐ５６をコードするＤＮＡをチャート２に提供する。第２の配列であるｐ ５６−２につ いて、ＤＮＡおよびアミノ酸をチャート３および４に開示する。同等物および明 白な相同物を開示する。また、ＷＯ９６/１６０８８として１９９６年５月３０ 日に公開されたＰＣＴ/ＵＳ９５/１４１２４に対する引用文献によって、当該配 列のクローニングおよび他の有用なベクターを開示し、ここに出典明示して本明 細書の一部とみなす。 本発明のさらなる記載および好ましい具体例の記載 ＷＯ９６/１６０８８として１９９６年５月３０日に公開されたＰＣＴ/ＵＳ９ ５/１４１２４に含まれた全文書、とりわけ６〜１１頁をここに出典明示して本 明細書の一部とみなす。 発明の有用性 本発明の有用性は、ＷＯ９６/１６０８８として１９９６年５月３０日に公開 されたＰＣＴ/ＵＳ９５/１４１２４、とりわけ１１〜１２頁に現れる開示によっ て開示され支持され、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす。 発明の詳細な記載 本発明の詳細な記載は、ＷＯ９６/１６０８８として１９９６年５月３０日に 公開されたＰＣＴ/ＵＳ９５/１４１２４、とりわけ１２頁３３〜３５行〜２０頁 を参照して見出すことができ、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす。当 該ＰＣＴ/ＷＯ公開に加えて、さらに以下の所見および資料が本発明を開示する 。 Ｉ型ＡＴＰ−感受性Ｋチャンネル（Ｉ_K-ATP）は、先ず心筋（１）において記 載され、続いて骨格筋（２）、血管平滑筋（３）および膵臓のβ−細胞（４−６ ）に特徴付けされてきている。これらのＩ型チャンネルは、細胞内ＡＴＰのマイ クロモーラー濃度で阻害され、電位およびＣａ²⁺に対して感受性がない（７）。 β−細胞Ｉ_K-ATPチャンネルは、機能の点で最もよく理解されており、インスリ ンの放出を制御する代謝性センサーとして働く。β−細胞のグルコール刺激の結 果、解糖を介して細胞内ＡＴＰ/ＡＤＰ比が増大し、ＡＴＰの増大はチャンネル 伝導性を阻害する。Ｉ_K-ATPチャンネルは、β−細胞の静止膜電位を支配するの で、チャンネル伝導性阻害の結果、脱分極が起こり、これは電圧−依存的Ｃａ²⁺ チャンネルを活性化し、細胞内Ｃａ²⁺の結果としての増加はインスリン放出をト リガーする。スルホニル尿 素［Ｉ_K-ATPブロッカー］またはジアゾキシド［Ｉ_K-ATPオープナー］のような薬 理学的薬剤は、それぞれ、インスリン放出を刺激または阻害する（８）。心筋お よび骨格筋において、Ｉ_K-ATPチャンネルは細胞代謝および電気的活性を一緒に して、類似した機能を発揮する。これらのチャンネルは、静止状態下で低い開口 確率を有し、虚血性傷害および/または運動のいずれかに応答しての細胞内ＡＴ Ｐ/ＡＤＰ比の下降によって活性化される（２、９）。 Ｉ_K-ATPチャンネルの活性は、広範囲のさまざまな構造的に異なった薬理学的 薬剤によって調節することができるので、Ｉ_K-ATPチャンネルは、カリウムチャ ンネルの中でもユニークである（１０−１５）。これらは、チャンネルブロッカ ー(例えば、スルホニル尿素、グアニジンおよびシアノグアニジン)およびチャン ネルオープナー(例えば、ジアゾキシド、ビナシジル（ｐｉｎａｃｉｄｉｌ）、 クロマカリム(ｃｈｒｏｍａｋａｌｉｍ)および硫酸ミノキシジル)の両チャンネ ルブロッカーを含む。この豊富な薬理学は、抗糖尿剤（スルホニル尿素ブロッカ ー）、利尿剤（グアニジンおよびシアノグアニジンブロッカー）、抗高血圧剤（ ピナシジルおよび硫酸ミノキシジルのようなオープナー）および育毛を促進する 薬剤（硫酸ミノキシジル）のごとき治療介入についての多くの機会に転換する。 種々の細胞型において、Ｉ_K-ATPチャンネルの活性を修飾する薬剤の化学的クラ ス間で構造的相違点を仮定すれば、これらのチャンネルの構造は複雑であるらし い。Ｉ_K-ATPチャンネルが代謝に細胞興奮性を連結するにおいて演じる重要な役 割と結び付くこの多様性は、Ｉ_K-ATPチャンネル活性の組織選択的モジュレータ ーがさらにヒト疾患の治療技術について機会を提供できるという望みを提供する 。 機能的Ｉ_K-ATPチャンネルを形成するために必要な最小の構造構成要素の解明 は、２つの異なる努力、いわゆる内方整流カリウムチャンネルまたは高親和性ス ルホニル尿素受容体のいずれかのクローニングおよび特徴付けの結果であった( １６、１７)。内方整流カリウムチャンネル遺伝子族の最初の２つのメンバーは 、発現クローニングパラダイムを用いて単離され（１８，１９）、現在まで、こ のクラスにおいて、相同物クローニングの努力が１３の区別される遺伝子すべて を定義した。ヒト胚腎細胞においてＫ_ir６.１と言われる内方整流の異種発現は 、天然のＩ_K-ATPチャ ンネルの性質のいくつかを示すチャンネルの合成に導く（１６）。次のクローニ ング研究は、Ｋ_ir６.２と言われるＫ_ir６族の第２のメンバーを定義した（１９ ，２１−２２）。高親和性スルホニル受容体の分子的同定は、高親和性スルホニ ル尿素結合を担うポリペプチドに「タグを付する」スルホニル尿素光プローブの使 用によって促進された。［³Ｈ］−グリブリド（２３−２５）、［¹²⁵Ｉ］−グリ ブリドアナログ（２６−２８）、またはグリブリドの［¹²⁵Ｉ］/アジドアナログ （２９、３０）のいずれかを用いて、複数の研究グループが、β細胞および脳に おいて高親和性１４０〜１５０ｋＤａスルホニル尿素結合蛋白質を同定した。β 細胞系からの光標識された１４０ｋＤａスルホニル尿素受容体の精製に続き、蛋 白質微細配列解析およびｃＤＮＡクローニングの結果、高親和性スルホニル尿素 受容体［ＳＵＲ−１］が分子的に定義された（１７）。続くクローニング努力の 結果、ＳＵＲ−２と呼ばれるＳＵＲ−１のパラログ（ｐａｒａｌｏｇ）が同定さ れた（３１−３３）。ＳＵＲ−１およびＳＵＲ−２の一次元構造は、ＡＢＣカセ ット輸送蛋白質に似ており、ＳＵＲ−１またはＳＵＲ−２のいずれかの異種発現 は、機能的Ｉ_K-ATPチャンネルの合成に導かない。あるいは、Ｋ_ir６.１/ＳＵＲ −２またはＫ_ir６.２/ＳＵＲ−１組合わせの共発現は、天然のＩ_K-ATPチャンネ ルの多くの電気生理学的および薬理学的特徴を示す機能的Ｉ_K-ATPチャンネルの 再構成に導く（３１−３３）。 シアノグアニジン結合蛋白質の同定用の並列的戦略は、アジド光プローブ［³ Ｈ］−ブローブ１の合成および特徴付けで開始された。この光プローブの価値は 、比較的低い特異的活性によって低下するので、第２世代のシアノグアニジンア ナログである［¹²⁵Ｉ］−プローブ２が調製され、特徴付けられた。無傷のラッ ト大動脈平滑筋細胞（Ａ１０）の¹²⁵Ｉ−プローブ２での光標識は、相同物の競 合によって示される高親和性（ｐ５６）および低親和性（ｐ４７）を共に同定し た。Ａ１０細胞からの¹²⁵Ｉ−ｐ５６の精製および蛋白質微小配列解析は，¹²⁵Ｉ −ｐ５６のＮＨ₂末端から誘導されたユニークな１２個のアミノ酸残基配列タグ を同定し、この同定は、この配列タグを認識する抗ペプチド抗体の調製および特 徴付けによって実証された。このアミノ酸配列タグを用いて、発現された配列タ グ（ＥＳＴ）データベースを調べ、ｐ５６配列のヒトオルソログ（ｏｒｔｈｏｌ ｏｇ）を潜在的にコードす るＥＳＴクローンを同定した。多重ＥＳＴクローンの完全な配列解析は、ラット ｐ５６のヒトオルソログをコードする全長ｃＤＮＡを明らかとした。ヒトｐ５６ の全長配列および配列解析でのＥＳＴデータベースの次の調査は、ｐ５６−２と 言われる第２の全長ヒトｃＤＮＡｐ５６パラログを明らかとした。ヒトｐ５６− １およびｐ５６−２は、発現のそれらの組織分布、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのそれら のグリコシル化およびＣＯＳ細胞における一過性発現に続いて¹²⁵Ｉ−プローブ ２を再構成するそれらの能力を測定することによって特徴付けした。 前記番号による文献をここに報告し、出典明示して本明細書の一部とみなす。 ＰＣＴ/ＵＳ９５/１４１２４において記載された手法によって、ＮＨ２−末端 ア ミノ酸配列を確立し、次いで種々のデータベースおよびＤＮＡライブラリーを肯 定的結果なしに繰り返して検索した。最後に、多数の検索後、ＷＯ９６/１６０ ８８として１９９６年５月３０日に公開されたＰＣＴ/ＵＳ９５/１４１２４に開 示されたｐ５６−１ ＮＨ２−末端アミノ酸配列（ＥＰＲＡＰＰＥＫＩＡＩＧＡ Ｇ）は、そのＰＣＴ公開において開示された当該配列に有意な一致を示すヒト発 現配列タグ（ＥＳＴ）の発見に導いた。番号５６−１として確認されるこの配列 を含むクローンは、種々のデータベースおよびＤＮＡライブラリーを検索するこ とによって得られ、完全なＤＮＡ配列を決定した。 クローン５６−１は、期待されたｐ５６の近くで、５２ｋＤａの成熟蛋白質に ついて予測されたＭｒを有する５０５個アミノ酸のポリペプチドをコードする１ ５１５ｂｐのオープンリーディングフレームを含むものであった。予測された配 列は、シグナルペプチドを含むのに続き、ＷＯ９６/１６０８８として１９９６ 年５月３０日に公開されたＰＣＴ/ＵＳ９５/１４１２４に開示されたラットｐ５ ６ＮＨ２−末端配列と１１/１４の正確な一致を示す成熟ＮＨ２−末端を含むも のであった。 また、ｐ５６が糖蛋白質であることを示すラットｐ５６についての生化学的デ ータと矛盾がなく、クローン５６−１についての予測されたポリペプチドは、Ａ ｓｎにリンクしたグリコシル化用の３つの標準的な受容部位を含むものであった 。予測されたアミノ酸配列は、既知配列と有意な相同性を有しない。 クローン５６−１から予測されたアミノ酸を種々の二次構造予測アルゴリズム を用いて解析した。ロスマンホルードがＮＨ２末端近くで検出され、この蛋白質 がＡＴＰのようなヌクレオチドに結合するらしいことが示された。ラットｐ５６ に対する生化学的データとは対照的に、予測された膜貫通セグメントは、ＣＯＯ Ｈ-末端付近に小胞体滞留シグナル（ＫＴＥＬ-対-標準的ＫＤＥＬ）が記録され る以外は検出されなかった。また、電位-開閉Ｋ⁺チャンネルのＰ（細孔）−領域 に類似するβ-ターン-β膜会合モチーフが検出された。このポリペプチドは、他 のＫ−チャンネル細孔−形成ポリペプチド（例えば、Kir６.１または６.２）と 会合し、Ｋチャンネル活性を調節することもできるらしい。Inagaki,N.,Tsuura, Y.,Namba,N.,Masuda,K.,Gonoi,T.,Horie,M.,Seino,Y.,Mizuta,M．およびSeino,S ."Cloning and functional characterization of a novel ATP-sensitive potassium chann el ubiquitously expressed in rat tissues,induding pancreatic islets,pitu itary,skeletal musde and heart"J.Biol.Chem.270:5691-5694(1995)．および． Inagaki,N.,Gonoi,T.,Clement,J.P.，Namba,N.,Inazawa,J.,Gonzalez,G.,Aguila r-Bryan,L.,Seino,S．およびBryan,J."Reconstitution of I_K-ATP:an inward re ctifier subunit plus the sulfonylurea receptor"Science 270:1166-170(1995 )参照。両文献は、とりわけ機能的チャンネルシステムを記載し、出典明示して 本明細書の一部とみなす。 本明細書に開示された配列情報を用いて、当業者は、既知のＰＣＴ技術を使用 して、本明細書に記載された所望の配列を有するおよび/または発現するクロー ンを創製、形成または生成することができるはずである。また、当該配列は、生 物学的に有効な化合物の検出用のスクリーニングおよびアッセイに用いることも できる。さらに、ベクター、プラスミド、細胞のこれらのタイプ用の手順および 例、スクリーニングおよびアッセイの記載は、１９９６年９月９日に出願された シリアル番号第０８/７０９，９２３号のケース６００１.ＮＣＰに見出すことが でき、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす。特に、アッセイにおいてク ローンを調製および使用するための手順に関係する第１６頁は、特に重要であり 、出典明示して本明細書の一部とみなす。さらに、同様に、これらのタイプのベ クター、プラスミド、細胞のための手順および例、スクリーニングおよびアッセ イの記載が、１９９４年９月１日に公開されたＰＣＴ/ＵＳ９４/０１２１０、Ｗ Ｏ９４/１９４６４に見出すことができ、ここに出典明示して本明細書の一部と みなす。特に、アッセイにおいてクローンを調製および使用するための手順に関 係する頁が特に重要であり、出典明示して本明細書の一部とみなす。 第２のｐ５６配列は、以下の手法に従って発見された。種々のデータベースを 、ＦＡＳＴＡ検索ツールを用いてヒトｐ５６のアミノ酸配列につき調べた。また 、既知ＥＳＴがｐ５６に一致するかを同定することに加えて、ｐ５６と約３８〜 ４８％の同一性を占める３種のＥＳＴも計算された［４４７２１０、２６０７５ ７１および２６６３５５１］。これら３種のクローンについての５'ＥＳＴ配列 の解読の配 列をｐ５６配列と並べてみると、ＥＳＴ配列が重なり、クローン２６０７５７１ が最も全長であるらしいことはありそうにないことが示された。これらのクロー ンを得、クローン２６０７５７１を完全に配列決定した。このクローンは、ヒト ｐ５６と４１％の同一性を示す１４８２ｂｐのオープンリーディングフレームが 完全な２.６ｋｂインサートを含んだ。両予測アミノ酸配列に共通したモチーフ は、（１）シグナル配列、（２）ロスマンホールド、（３）Ａｓｎリンクしたグ リコシル化用の標準的受容部位［ｐ５６−１において３個およびｐ５６−２にお いて６個］および（４）ＣＯＯＨ−末端［ＫＴＥＬ］でのＥＲ滞留シグナルを含 む。 ｐ５６−１の生化学的性質の比較−Ａ１０細胞からの¹²⁵Ｉ−ｐ５６−１の生 化学的特徴付けは、Ｎ−グリカナーゼで脱グリコシル化して５２ｋＤａ形態を生 じさせることができるトリトンＸ−１００可溶性５６ｋＤａ糖蛋白質を明らかと した。これらのデータは、ｃＤＮＡ配列および配列中のＡｓｎリンクしたグリコ シル化用の標準的受容部位の存在から予測されたヒトｐ５６−１のＭｒと一致す る。ｐ５６−１についてこれらの生化学的パラメーターを実験的に確立し、ｐ５ ６−２のグリコシル化パターンを調べるために、両ポリペプチドをｉｎ ｖｉｔ ｒｏ翻訳によって調製した。各発現プラスミドをＮｏｔＩでの消化によって線状 化し、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼを用いてキャップ付きｃＲＮＡを合成した。次 いで、これらのｃＲＮＡを使用して、ウサギ網状赤血球溶解物±イヌ膵臓ミクロ ソームを用いて³⁵Ｓ−メチオニン標識蛋白質の合成を指示した。放射性標識蛋白 質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、乾燥ゲルのフルオログラフィーによって 視覚化した。ｐ５６−１およびｐ５６−２は、それぞれ、５２ｋＤａおよび５０ ｋＤａの非グリコシル化Ｍｒ値を有する。また、イヌ膵臓ミクロソームの存在に おいて、ｐ５６−１へのＡｓｎリンクしたオリゴ糖の付加を示す、５６ｋＤａを 含めた高Ｍｒ値を有する多重バンドが検出された。５６−１とは対照的に、５６ −２は、これらの条件下でグリコシル化されるようではなかった。 ヒト５６−１および５６−２の発現の組織分布:ノーザン解析および転写体イ メージングの比較５６−１および５６−２転写産物の発現パターンは、古典的な ノーザンブロット解析およびＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴ検索の両方を用い て決定 された。ノーザンブロット解析では、種々の末梢組織および種々の脳領域から単 離されたポリＡ⁺−ＲＮＡを変性条件下の電気泳動によって分画し、ナイロン膜 上に提示した。次いで、ヒト５６−１およびヒト５６−２のいずれかから調製し た³²Ｐ標識したコーディング配列ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせることに よって、ブロットを視覚化した。ｐ５６−１プローブは、骨格筋中で最高レベル で発現し、心臓および膵臓中でより低レベルで検出された６.０ｋｂ転写産物を 視覚化した。また、これらの条件下で、小さいシグナルが脳、胎盤および肝臓に おいて検出されたが、肺または腎臓のいずれにも転写産物は検出されなかった。 あるいは、ＢＬＡＳＴ検索は、完全なｐ５６−ＩＤＮＡ配列での調査に一致する １１個の異なる組織に由来する２０種のＥＳＴを明らかにした。これらは、次の ＥＳＴを含んだ：胸部からの５種（４正常/１腫瘍）、前立腺からの３種（１正 常/２腫瘍）、脳からの２種、結腸腫瘍からの２種、腎からの２種、および胃、 子宮、下垂体、鼻ポリープ、甲状腺および単核細胞からの１種のＥＳＴ。 ヒトｐ５６−２プローブは、心臓、脳、膵臓、胎盤において高レベルで発現し た２.８ｋｂ転写物を視覚化した。ｐ５６−２についてのシグナルは、これらの 条件下で肺、肝臓、骨格筋または腎臓において観察されなかった。ｐ５６−２転 写産物は、扁桃において最高レベルで、海馬、尾状核、脳梁、黒質および視床腹 側部核（ｓｕｂｔｈａｌａｍｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ）において低レベルで、脳領 域において広範囲に発現した。２０種のＥＳＴがｐ５６−２調査配列と一致し、 これらは、膵臓からの３種、肺腫瘍からの３種、滑膜からの２種、白血球からの ２種、海馬からの２種、および心臓、腎臓、膀胱、小腸、副腎、肺、胸部、前立 腺および鼻ポリープからの１種のＥＳＴを含む１３種の異なる組織に由来した。 アニジンオープナー光プローブでのｐ５６−１の光標識を、ＣＯＳ７細胞中のｐ ５６−１ ｃＤＮＡの一過性異種発現によって再構成した。ヒトｐ５６−１のコ ーディング配列をベクターｐＳＶＬのＳＶ４０の即時型プロモーターの制御下に 置いた。この構造体をカチオン性リボソームを用いてＣＯＳ７細胞に導入し、感 染の４８時間後に、トランスフェクトされた細胞を¹²⁵Ｉで光標識した。野生型 ＣＯＳ７細胞 は、５２ｋＤａバンドの最小光標識を示し、ｐ５６を示さなかった。あるいは、 これらの同一細胞におけるヒトｐ５６−１の一過性発現は、５６ｋＤａのＭｒに て移動するポリペプチドの光標識に導いた。 チャート 以下のチャートは、全長ヒトｐ５６−１およびｐ５６−２蛋白質およびこれら の蛋白質をコードするＤＮＡを開示する。チャート１は、ｐ５６−１蛋白質の全 長についての配列を提供する。チャート１の配列は、シグナルまたはリーダー配 列を含む。また、チャート１の配列は、配列表１にある。チャート２は、ｐ５６ −１蛋白質をコードするｃＤＮＡ残基を提供し、それは非翻訳配列を含む。チャ ート２の全ての配列を配列表２に提供する。 チャート２に示されたｐ５６−１ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ配列の一部として含 まれたポリＡテイルの多くの可能な長さの１つを含む。この全長ｃＤＮＡは、以 下のものを含む：１）５'非翻訳配列（整列位置１〜３９）、２）コーディング 配列（整列位置４０〜１５５４）、３）停止コドン「ＴＧＡ」（整列位置１５５ ５〜１５５７）および４）３'非翻訳配列（ポリＡを含む整列位置１５５５〜１ ７２４）。４０位にてＡＴＧで始まるコーディング配列は、１２３位で終了する シグナル配列で出発し、一方、成熟配列は１２４位で始まる。これらの位置は、 下記のチャート１および２に記載されている。 小胞体に対するリポソームの付着を「シグナル」し、ＥＲの内腔内に新生ポリ ペプチド鎖を押し出すのを助けるＮ末端にて、シグナル配列またはリーダー配列 は、通常約２０〜２５個のアミノ酸の、ここでは２８個のアミノ酸の疎水性領域 である。このシグナル配列はシグナルペプチダーゼによって内腔中で切断される 。非翻訳配列は、ｍＲＮＡ安定性等のごとき重要な調節機能を有し得る。転写後 ポリＡトラックが付加され、その長さは可変でしばしば１０〜２００Ａであり、 本明細書に２７トラックポリＡを示す。 チャート３および４は、ｐ５６−２蛋白質およびそれらの蛋白質をコードする ＤＮＡを開示する。チャート３は、ｐ５６−２蛋白質の全長について配列を提供 する。チャート３の配列は、シグナルまたはリーダー配列を含む。また、チャー ト３の配 列は配列表３にある。チャート４は、ｐ５６−２蛋白質をコードするｃＤＮＡ残 基を提供し、それは非翻訳配列を含む。チャート２の全配列は、配列表４に提供 する。 チャート４に示されたｐ５６−２ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ配列の一部として含 まれる多くの可能な長さのポリＡテイルのうちの１つを含む。この全長ｃＤＮＡ は以下のものを含む：１）５'非翻訳配列（整列位置１〜３５）、２）コーディ ング配列（整列位置３６〜１５１７）、３）停止コドン「ＴＧＡ」（整列位置１ ５１８〜１５２０）および４）３'非翻訳配列（ポリＡを含む整列位置１５１８ 〜２５６７）。３６位にてＡＴＧで開始するコーディング配列は、シグナル配列 で始まる。これらの位置は、下記のチャート３および４に記載されている。 チャート１ − ｐ５６−１蛋白質のアミノ酸配列チャート２ − ｐ５６−１蛋白質のコーディング領域のヌクレオチド配列 チャート３ − ｐ５６−２蛋白質のアミノ酸配列 チャート４ − ｐ５６−２蛋白質のコーディング領域のヌクレオチド配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約５４,０００ないし６０,０００ダルトンの、約５１,０００ダルトンのコ ア蛋白質質量（無糖）を有する糖蛋白質をコードでき、ラットＡ１０細胞から単 離することができ、連続した順番で、チャート２もしくは４または配列表２もし くは４に示されたアミノ酸のうち少なくとも６０、７０、８０、９０、９５また は実質的な部分を含み、かつ、Ｎ-(3-アジド-5-ヨードフェニル)-Ｎ'-シアノ-Ｎ "-(1,1-ジメチルプロピル)-グアニジンまたは実質的に類似のアナログと結合で きる核酸を含む天然のゲノムから分離された核酸組成物。 ２．チャート２または４にリストされた該核酸に対して７０、８０、９０または ９５パーセントの相同性を有する請求項１記載の組成物。 ３．ヒトｐ５６蛋白質をコードする請求項２記載の組成物。 ４．チャート２もしくは４または配列表２もしくは４に開示されたアミノ酸をコ ードする請求項３記載の組成物。 ５．チャート２もしくは４にリストされる、または配列表２もしくは４の核酸に 対して９０パーセントの相同性を有する請求項４記載の核酸組成物。 ６．チャート２もしくは４にリストされる、または配列表２もしくは４の核酸に 対して９５パーセントの相同性を有する請求項５記載の核酸組成物。 ７．チャート２もしくは４にリストされる、または配列表２もしくは４の核酸を 含む請求項４記載の核酸組成物。 ８．１２４位前の配列がいずれの適当な整列配列であってもよく、いずれかの停 止 コドンを含む１５５８位後の配列が、いずれの適当なポリＡ配列および実質的に 同様の配列またはいずれかの配列の１ないし数個のアミノ酸残基を欠失、付加ま たは置換することによって得られた配列であってもよいチャート２にリストされ る、または配列表２のコーディング核酸を含む請求項７記載の核酸組成物。 ９．１２４位にて出発し、１５５８位に至りおよびそれを含み、いずれかの停止 コドンを含むチャート２にリストされるコーディング核酸、および実質的に同様 の配列またはその配列の１ないし数個のアミノ酸を欠失、付加または置換して得 られた配列を含む請求項８記載の核酸組成物。 １０．３６位前の配列がいずれの適当な整列配列であってもよく、いずれかの停 止コドンを含む１５２１位後の配列が、いずれの適当なポリＡ配列および実質的 に同様の配列またはいずれかの配列の１ないし数個のアミノ酸残基を欠失、付加 または置換することによって得られた配列であってもよいチャート４にリストさ れる、または配列表４のコーディング核酸を含む請求項７記載の核酸組成物。 １１．３６位にて出発し、１５２０位に至りおよびそれを含み、いずれかの停止 コドンを含むチャート４にリストされたコーディング核酸、および実質的に同様 の配列またはいずれかの配列の１ないし数個のアミノ酸残基を欠失、付加または 置換することによって得られた配列を含む請求項１０記載の核酸組成物。 １２．約５４,０００ないし６０,０００ダルトンの、約５１,０００ダルトンの コア蛋白質質量(無糖)を有する糖蛋白質を創製し、ラットＡ１０細胞から単離す ることができ、かつＮ-(3-アジド-5-ヨードフェニル)-Ｎ'-シアノ-Ｎ"-(1,1-ジ メチルプロピル)-グアニジンと結合でき、示された順序で、チャート１または３ に示され、配列表１または３に示されたアミノ酸のうち少なくとも５０、６０、 ７０、８０、９０または実質的な部分を含む、実質的に純粋な形態または単離さ れた様式で発現された連続的にリンクしたアミノ酸の蛋白質の組成物。 １３．チャート１または３にリストされた該核酸に対して７０、８０、９０また は９５パーセントの相同性を有する請求項１記載の組成物。 １４．該アミノ酸配列がチャート１もしくは３または配列表１もしくは３のもの と実質的に同様な配列、またはその配列の１ないし数個のアミノ酸残基を欠失、 付加または置換することによって得られた配列である請求項１３記載のアミノ酸 組成物。 １５．該アミノ酸配列がチャート１または配列表１のものと実質的に同様の配列 、またはその配列の１ないし数個のアミノ酸残基を欠失、付加または置換するこ とによって得られた配列である請求項１４記載のアミノ酸組成物。 １６．該アミノ酸配列がチャート３または配列表３のものと実質的に同様な配列 、またはその配列の１ないし数個のアミノ酸残基を欠失、付加または置換するこ とによって得られた配列である請求項１５記載のアミノ酸組成物。 １７．クローニングベクター、シャトルベクターまたは発現ベクターから選択さ れたベクターに組み込まれた前記の請求項１に開示された該ＤＮＡ。 １８．該ベクターがクローニングベクター、シャトルベクターまたは発現ベクタ ーから選択され、ここにこれらのベクターがプラスミドである請求項１７記載の ベクター。 １９．該クローニングベクターまたは該プラスミドが広範囲に入手可能または商 業的に入手可能ないずれかのプラスミドから選択される請求項１８記載のクロー ニングベクター。 ２０．細菌細胞における発現について適合する請求項１８記載のプラスミド。 ２１．哺乳動物細胞における発現について適合する請求項１８記載のプラスミド 。 ２２．酵母細胞における発現について適合する請求項１８記載のプラスミド。 ２３．請求項２０記載の細菌細胞を使用して、ヒトＫ_ATPカリウムチャンネル活 性を変調する化合物についてスクリーニングする方法。 ２４．請求項２１記載の単離された哺乳動物細胞を使用して、ヒトＫ_ATPカリウ ムチャンネル活性を変調する化合物についてスクリーニングする方法。 ２５． ａ）クローン化Ｋ_ATPチャンネル、Kirタイプのチャンネルを含むかかる チャンネルおよびｐ５６−１またはｐ５６−２蛋白質を発現してい る細胞を密集するまで増殖させ、 ｂ）ａ）の細胞を平衡塩溶液で平衡化させ、 ｃ）平衡化細胞のベースライン測定を行い、 ｄ）該細胞に１つの試験化合物または試験化合物のカクテルを添加し、 膜電位の変化を読み、 ｅ）野生型または偽トランスフェクトした対照のＫ_ATPを発現している細 胞を脱分極させて選択性を確立する化合物を試験し、 ｆ）選択的にＫ_ATPチャンネル活性を変調することが示される化合物を選 択することを特徴とする請求項２１記載の方法。 ２６．該Ｋ_irタイプのチャンネルがタイプＫ_ir６.１チャンネルであって、ｐ５ ６蛋白質が、配列表３によって記載されたｐ５６−２および関連する相同物であ る請求項２５記載の方法。 ２７．該Ｋ_irタイプのチャンネルがタイプ_ir６.２チャンネルであって、ｐ５６ 蛋白質が、配列表１によって記載されたｐ５６−２および関連する相同物である 請求項２５記載の方法。 ２８． ａ）９６ウェル・マイクロテスト・プレート中で、ｐ５６−１またはｐ ５６−２蛋白質を含むクローン化Ｋ⁺チャンネルを発現している細胞 を密集するまで増殖させ、 ｂ）２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有するアール平衡塩溶液中で、ａ）の細 胞を５μＭ ＤｉＢＡＣ₄（３）のごとき平衡塩溶液で平衡化させ、 ｃ）平衡化細胞のベースライン測定を行い、 ｄ）該細胞に１つの試験化合物または試験化合物のカクテルを添加し、 膜電位の変化を記録し、 ｅ）野生型または偽トランスフェクトした対照のＫ_ATPを発現している細 胞を脱分極させて選択性を確立する化合物を試験し、 ｆ）選択的にK_ATPチャンネル活性を変調することが示される化合物を選 択することを特徴とずる請求項２１記載の方法。 ２９．請求項２５記載の手順に従って、請求項２２記載の酵母細胞または請求項 ２０記載の細菌細胞のいずれかを使用して、ヒトＫ_ATPカリウムチャンネル活性 を変調する化合物についてスクリーニングする方法。 ３０．配列表１または２に示された配列を有するか、またはｐ５６−１またはｐ ５６−２（配列番号２または４）と命名されたクローンまたはその明白な変種か ら、あるいはその少なくとも約９０パーセントの相同性配列を有する相同物から 選択された相同物から生成されたヒトシアノグアニジン結合蛋白質として哺乳動 物細胞中で機能する請求項１２記載の蛋白質。 ３１．その少なくとも約９５パーセントの相同性配列を有する請求項３０記載の 単離蛋白質。 ３２．実質的にチャート２または配列表２のものと同一の配列を有する請求項３ １記載の単離蛋白質。 ３３．実質的にチャート４または配列表４のものと同一の配列を有する請求項３ ２記載の単離蛋白質。