JP2002541837A

JP2002541837A - 融合遺伝子のヒト相同体

Info

Publication number: JP2002541837A
Application number: JP2000612431A
Authority: JP
Inventors: モスカ，モニカ; イサツチ，アントネツラ
Original assignee: フアルマシア・エ・アツプジヨン・エツセ・ピー・アー
Priority date: 1999-04-16
Filing date: 2000-03-29
Publication date: 2002-12-10
Also published as: WO2000063352A3; US20060084600A1; AU4540400A; EP1171580A2; WO2000063352A2; GB9908798D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、フューズドと称される蛋白質−セリン／トレオニンキナーゼのヒト相同体である新規分子、特に核酸配列とそれがコードするポリペプチドに関する。本発明の分子は、ヘッジホッグ−パッチト（ＨＨ−ＰＴＣＨ）経路におけるシグナル伝達に関与する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、新規分子、特に「フューズド（Ｆｕｓｅｄ）」と称される蛋白質−
セリン／トレオニンキナーゼのヒト相同体である核酸配列及びそれがコードする
ポリペプチドに関する。本発明の分子は、ヘッジホッグ−パッチト（Ｈｅｄｇｅ
ｈｏｇ−Ｐａｔｃｈｅｄ）（ＨＨ−ＰＴＣＨ）経路におけるシグナルの伝達に関
与する。

【０００２】（発明の背景）ヘッジホッグ−パッチト（ＨＨ−ＰＴＣＨ）シグナル伝達経路は、胚発生の間
に細胞運命、パタリング（ｐａｔｔｅｒｉｎｇ）及び分化を決定する上で重要な
役割を果たす、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのヘッジホッ
グ−パッチト（ＨＨ−ＰＴＣ）経路と機能的に相同である。

【０００３】進化はヘッジホッグ−パッチトシグナル伝達に関与する遺伝子数の多様化をも
たらし、脊椎動物においては、発生を調節するヘッジホッグ遺伝子の３つの主要
なファミリーが同定された：インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）、デザートヘ
ッジホッグ（Ｄｈｈ）及びソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）である。

【０００４】ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）経路は脊椎動物の胚形成の際の四肢の前／後
パタリングを調整し、その遺伝子発現は、硬節及び真皮筋節の先祖である体節パ
タリングの制御に関わる。

【０００５】さらに、ソニックヘッジホッグの発現は、腹神経管におけるニューロンの発生
を指令し、中枢神経系においては中脳ドパミン作用性（ＤＡ）ニューロンの分化
を誘導する。

【０００６】インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）は、発育中の軟骨要素において発現され
、間接的に前肥大性軟骨細胞を増殖状態に保持する；デザートヘッジホッグ（Ｄ
ｈｈ）はセルトーリ細胞前駆体において発現され、興味深いことに成体期におい
ても精巣で発現し続ける。

【０００７】組織分化におけるＨＨ−ＰＴＣＨ経路の重要な役割は、パッチト（ｐｔｃ）遺
伝子の突然変異がショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）胚の分節の極性を
破壊すること、また一方パッチト欠損マウス（ｐｔｃｈ）が多数の発生欠陥によ
り出生前に死亡するという所見によって確認されている。

【０００８】パッチト（ＰＴＣ）蛋白質は、膜貫通蛋白質、スムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅ
ｎｅｄ）（ＳＭＯ）の構成的リプレッサーとして働く膜貫通レセプタである。

【０００９】そのリガンドであるヘッジホッグ（ＨＨ）と結合したとき、ＰＴＣ蛋白質はコ
ンフォメーション変化を受け、それによってＳＭＯへの負の調節を解除して、核
にシグナルを伝達することを可能にし、核において特異的転写因子を活性化する
。ＰＴＣは構成的リプレッサーのように機能し、ｐｔｃ遺伝子の突然変異は、ｐ
ｔｃそれ自体のようなＨＨ調節される遺伝子の転写への負のフィードバックルー
プの解除をもたらすと推論できる。

【００１０】当然ながら、ショウジョウバエｐｔｃ突然変異体細胞では、ＨＨ調節遺伝子が
過剰発現される。

【００１１】実際に、ショウジョウバエにおいて、蛋白質−セリン／トレオニンキナーゼ、
フューズド（ＦＵ）（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃＸ８０４６８）、フューズドの
サプレッサー（ＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆＦｕｓｅｄ）（ＳＵ（ＦＵ））と
称される未知の生化学的機能を持つ蛋白質、キネシン運動蛋白質Ｃｏｓｔａｌ２
（ＣＯＳ２）の遠い関連物質、亜鉛転写因子Ｃｉのような、細胞内シグナルの伝
達に関わるいくつかの蛋白質が同定されてはいるが、パッチト経路は大部分が不
明である。

【００１２】ＳＵ（ＦＵ）はＦＵとＣｉ間のブリッジとして働き、そのトリマー複合体はＳ
Ｕ（ＦＵ）の蛋白質分解性開裂を妨げるが、他方でセリン／トレオニンキナーゼ
ＦＵの活性化は、そのＰＥＳＴ配列（プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セ
リン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）に富む配列）のリン酸化を通してＳＵ（ＦＵ）
の分解の引き金となる。

【００１３】ＰＴＣのヒト相同体が単離され（ＰＴＣＨ１）（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．ら
（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：１６６８−１６７１）、最近になってＰ
ＴＣＨ２レセプタをコードする異なるスプライシング形態が同定された。ｐｔｃ
ｈ２発現のアップレギュレーションは不活性ＰＴＣＨ１蛋白質を相殺することが
できないので、２つのパッチトレセプタ（ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２）は異なる機
能を持つと思われる。さらに、マウス胚において、ｐｔｃｈ１とｐｔｃｈ２の発
現パターンは完全にはオーバーラップしない（ＣａｒｐｅｎｔｅｒＤ．ら（１
９９８）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９５：１３６３０−１３６３４及びＺａｐｈｉｒｏｐ
ｏｐｕｌｏｓＰ．ら（１９９９）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５９：７８７−７９２）
。

【００１４】成人組織におけるＰｔｃｈ経路の役割はまだほとんど理解されていないが、遺
伝学的試験は、ｐｔｃｈ１遺伝子の生殖細胞系突然変異及び／または欠失が母斑
性基底細胞癌症候群（ＮＢＣＣＳ）に関与するという証拠を提供した（Ｈｅｉｄ
ｉＨａｈｎら（１９９６）Ｃｅｌｌ８５：８１４−８５１）。

【００１５】ＮＢＣＣＳは、皮膚の基底細胞癌（ＢＣＣ）及び髄芽腫の素因を与える常染色
体性優性疾患である。ＮＢＣＣＳ患者は、卵巣線維腫、髄膜腫、線維肉腫、横紋
筋肉腫、及び主として四肢と体軸骨格に影響を及ぼす一連の発生異常の高い危険
性を有する。

【００１６】ｐｔｃｈ１遺伝子の突然変異はそのまま直ちにＮＢＣＣＳ疾患に結びつき、癌
への強い素因を特徴とするので、この証拠は、ｐｔｃｈ１の負のフィードバック
ループの解除が腫瘍発現において基礎的な役割を果たすという結論を指し示す。
実際に、家族性と散発性の両方のＢＣＣの腫瘍細胞において、ｐｔｃｈ１（Ｕｎ
ｄｅｎら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（１９９７）、５７：２３３６−２３４０）
やｇｌｉ１（Ｄａｈｍａｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７），３６９：８７６−
８８１）のようなＳｈｈによって制御される遺伝子は転写的に抑制解除される。

【００１７】それ故、正常な成人組織及びＢＣＣ以外のヒト癌の主要形態におけるＳＨＨ−
ＰＴＣＨシグナル伝達経路の機能を検討することは極めて重要である。

【００１８】この目標を達成するためには、シグナルの伝達に関わる遺伝子のヒト相同体を
単離し、配列決定する必要がある。

【００１９】遺伝分析は、ＨＨ活性の結果としてのセリン／トレオニンキナーゼフューズド
（ＦＵ）の活性化を示唆している。これらの結果は、ＨＨによって開始されるシ
グナル伝達事象の際にＦＵがリン酸化されることを示す生化学的証拠と一致する
。

【００２０】分節極性遺伝子フューズド（ＦＵ）の突然変異はショウジョウバエ胚表現型の
変化と著明に相関するので、フューズド（ｈＦＵ）がヒト腫瘍の発現においても
鍵となる機能を果たす可能性は極めて高い。それ故、Ｓｈｈによって誘導される
遺伝子発現の調節においてｈＦＵキナーゼが果たす役割について情報を得るため
には、フューズドのヒト相同体（ｈＦＵ）を単離する必要がある。

【００２１】本発明は、フューズド蛋白質の２つの新規ヒト相同体の特性指摘とそれらをコ
ードする核酸配列を提供することによってこの目標を達成した。

【００２２】（発明の開示) 最初の局面では、本発明は、フューズド蛋白質（ｈＦＵ）のヒト相同体をコ
ードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【００２３】もう１つの局面では、本発明のポリヌクレオチドは発現ベクター中に含まれる
。

【００２４】本発明はさらに、この発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供す
る。

【００２５】さらなる局面では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされ
る単離され、精製された組換えｈＦＵ蛋白質を提供する。

【００２６】さらに、本発明は、その配列が本発明のポリヌクレオチドから誘導される核酸
プローブを提供する；これらのプローブは、例えば組織や細胞においてｈＦＵの
生合成を検出し、測定するための研究ツールとしてならびに診断方法において使
用できる。

【００２７】従って、組織及び細胞におけるｈＦＵの存在と量を検出するための診断方法を
提供することが本発明の１つの目的である。

【００２８】本発明はまた、ｈＦＵと相互作用することができる化合物を同定するためのス
クリーニング方法を含む。かかるスクリーニング法は、当業者に既知のどのよう
な形態もとりうる。

【００２９】当該スクリーニング法によって同定される、ｈＦＵの生物活性を変化させるこ
とができる化合物を提供することが本発明のさらなる目的である。

【００３０】ｈＦＵ中に存在するエピトープに対する抗体ならびにかかる抗体を産生する細
胞を提供することは本発明のさらにもう１つの目的である。

【００３１】さらなる目的においては、本発明は、組換え酵素のＰＣＲ増幅、クローニング
、発現及び精製を含む、ｈＦＵの発現のための組換えプロセスを含む。

【００３２】定義ここで使用するとき、次の語は下記に定義する意味を持つ。

【００３３】小文字のヒトフューズドの略語（ｈｆｕ）は遺伝子、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは
核酸配列を指し、大文字版（ｈＦＵ）は蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、オリ
ゴペプチドまたはアミノ酸配列を指す。

【００３４】ここで使用するとき、ヌクレオチド配列についての「類似体」の語は、保存的
な差異だけを持ち、本発明のｈＦＵ相同体の従来の特性と活性を保持する類似ポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。

【００３５】「ストリンジェント条件」の語は、プローブがその標的配列にハイブリダイズ
するが、他の配列にはハイブリダイズしない条件に関する。ストリンジェント条
件は、配列に依存し、異なる環境において相違する。より長い配列は特異的によ
り高い温度でハイブリダイズする。一般に、ストリンジェント条件は、規定され
たイオン強度とｐＨで特定配列に関して融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなる
ように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で
標的配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度
下で）である。（標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡状態で
プローブの５０％が占有される。）典型的には、ストリンジェント条件は、ｐＨ
７．０−８．３で塩濃度が約１．０ＭＮａイオン未満、典型的には約０．０１
−１．０ＭＮａイオン（または他の塩）であり、温度は短いプローブ（例えば
１０−５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、より長いプローブに
ついては少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェント条件は
また、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても実現しうる。

【００３６】「相同ヌクレオチド配列」は、本発明の中で開示される配列の対応する領域に
関して、コードされるポリペプチドの少なくとも１つの機能的ドメインにおいて
、ヌクレオチドレベルで約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましく
は約８０％以上の相同性によって特徴づけられる配列である。相同ヌクレオチド
配列は、下記に述べるＤＮＡ配列によってコードされるｈＦＵ蛋白質のアイソフ
ォームをコードする配列を含む。そのようなアイソフォームは、例えば代替的ス
プライシングの結果として、あるいは他の遺伝子によってコードされる故に、同
じ生物の異なる組織で発現されうる。相同ヌクレオチド配列はまた、何らかの起
源種のｈＦＵ蛋白質をコードする配列でもある。好ましくはヌクレオチド配列は
哺乳類由来の酵素をコードする。

【００３７】「オリゴヌクレオチド」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用す
るのに十分な数の塩基を含む長さのヌクレオチド残基鎖である。この短い配列は
、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列に基づき（あるいはゲノムまたはｃＤＮＡ配列から
デザインされ）、個々の細胞または組織における同一、類似または相補的ＤＮＡ
またはＲＮＡを増幅する、確認するまたはその存在を明らかにするために使用さ
れる。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０個のヌクレオチドから約５０個
にも及ぶヌクレオチド、好ましくは約１５〜３０個のヌクレオチドを持つＤＮＡ
配列の部分を含む。それらは化学合成され、プローブとして使用することができ
る。

【００３８】「プローブ」は、用途に応じて様々な長さ、好ましくは少なくとも約１０個か
ら約６，０００個のヌクレオチドまでの長さの核酸配列である。それらは、同一
、類似または相補的な核酸配列の検出において使用される。より長いプローブは
通常天然または組換えソースから得られ、高度に特異性であり、オリゴマーより
もはるかにゆっくりとハイブリダイズする。一本鎖または二本鎖であり、ＰＣＲ
、膜ベースのハイブリダイゼーションまたはＥＬＩＳＡ様テクノロジーにおいて
特異性を持つように慎重にデザインされる。

【００３９】アミノ酸の「挿入」、「置換」または「欠失」は、アミノ酸配列に対するまた
はアミノ酸配列内での変化である。個々のアミノ酸配列において許容されるバリ
エーションは、合成によりペプチドを生成することによって、あるいは組換えＤ
ＮＡ手法を用いてｈＦＵ配列におけるヌクレオチドの挿入、欠失または置換を体
系的に実施することによって、実験的に決定できる。

【００４０】本出願において我々はＢＬＡＳＴアルゴリズムを援用する。ＢＬＡＳＴアルゴ
リズムは配列の類似性を決定するのに適しており、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９
０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に述べられている。ＢＬＡ
ＳＴ分析を実施するためのソフトウエアはｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔ
ｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公に入手でき
る。このアルゴリズムは、最初に、データベースの配列中の同じ長さのワードと
整列したときある正数の閾値スコアＴに適合するまたはそれを満たす、問い合わ
せ配列の中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアの配列対（
ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは近接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌら、前出）。これらの近接ワードのヒットがそれらを含むＨＳＰを見
つけ出すための検索を開始する基礎となる。ワードのヒットを、累積整列スコア
を高めることができるかぎり、各々の配列に沿って両側に延長していく。次の場
合には各方向のワードヒットの延長を停止する：累積整列スコアが最大達成値か
らＸ量だけ減少する；１またはそれ以上の負のスコア残基整列の蓄積により、累
積スコアがゼロまたはそれ以下になる；あるいはいずれかの配列が末端に達する
。ＢｌａｓｔアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ及びＸは整列の感受性と速度を決
定する。Ｂｌａｓｔプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ
６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９
２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５−１０
９１９参照）整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖
の比較を初期値（ｄｅｆａｕｌｔｓ）として使用する。

【００４１】ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計分析を行う；例えば、
ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５７８７参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによ
って提供される類似性の１つの測定値は最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔｓｕｍ
ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドま
たはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、被
験核酸と融合核酸の比較において最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未
満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であれば
、核酸は融合遺伝子またはｃＤＮＡに類似するとみなされる。

【００４２】（発明の詳細な説明）ここに開示され、特許請求される本発明のために、下記のようにみなされるも
のとする。

【００４３】アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に、左から右に示す。アミノ基と
カルボキシ基は配列中には示さない。

【００４４】ヌクレオチド配列は、一本鎖だけによって、５’から３’方向に、左から右に
示す。

【００４５】ヌクレオチドとアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されているよう
に、若しくは（アミノ酸に関して）３文字コードによって示す。

【００４６】１つの局面では、本発明は、フューズド蛋白質（ｈＦＵ）の２つの新規ヒト相
同体をコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明
のポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号：５のセンス配列及び配列番号：７のセンス配列；（ｂ）（ａ）の配列に相補的な配列；（ｃ）（ａ）の配列によってコードされるポリペプチドをコードする配列；（ｄ）ストリンジェント条件下で（ａ）及び（ｂ）の配列にハイブリダイズす
る類似配列；及び（ｅ）（ａ）の配列に相同であり、ｈＦＵ活性を持つポリペプチドをコードす
る配列から成る群から選択される配列を含む、単離された一本鎖または二本鎖ポリヌ
クレオチドである。

【００４７】好ましいポリヌクレオチドはＤＮＡ分子である。もう１つ別の実施態様では、
ポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。

【００４８】配列番号：５のヌクレオチド配列は、ｈＦＵ相同体の１つをコードする遺伝子
のセンス鎖のｃＤＮＡ配列であり、センス鎖（上部に示されている）とその相補
鎖の両方を表すことが意図されている。配列番号：７のヌクレオチド配列は、も
う１つ別のｈＦＵ相同体をコードする遺伝子のセンス鎖のｃＤＮＡ配列であり、
センス鎖（上部に示されている）とその相補鎖の両方を表すことが意図されてい
る。

【００４９】本発明はまた、ストリンジェント条件下で上述したＤＮＡ配列にハイブリダイ
ズする類似ＤＮＡ配列も考慮している。また、上述したＤＮＡ配列の天然に生じ
る対立遺伝子変種及び突然変異も、それらの変種及び突然変異が発現時にヒトｈ
ＦＵ相同体をコードするかぎり、本発明において考慮される。さらに本発明は、
発現時に、ｈＦＵ活性を持つポリペプチドをコードする相同ＤＮＡ配列を考慮す
る（上記の定義参照）。

【００５０】当業者において既知のように、遺伝子コードの縮退により、上述したｈｆｕ遺
伝子によってコードされるものと同じポリペプチドをコードすることができる数
多くのＤＮＡ及びＲＮＡ分子が存在する。本発明は、それ故、発現されたとき、
配列番号：６及び配列番号：８のポリペプチドをコードするそれらの他のＤＮＡ
及びＲＮＡ分子を考慮する。

【００５１】ｈｆｕ遺伝子によってコードされるアミノ酸残基配列が同定されており、各々
のアミノ酸残基に関するすべてのトリプレットコドンがわかっているので、その
ようなすべてのコードＲＮＡ及びＤＮＡ配列を記述することが可能である。単に
特定アミノ酸に関する１個のコドンの変化によって特徴づけられる、ここで特定
して開示するもの以外のＤＮＡ及びＲＮＡ分子は本発明の範囲内である。

【００５２】アミノ酸及びそれらの代表的略語、記号及びコドンの一覧を下記の表に示す。

【００５３】

【表１】

【００５４】当業者において既知であるように、コドンはｍＲＮＡ分子におけるヌクレオチ
ドのトリプレット配列を構成し、それ自体は、チミジン（Ｔ）（ＤＮＡ分子中に
存在する）塩基に代わるウラシル塩基（Ｕ）によって特徴づけられる。

【００５５】ポリヌクレオチド内の同じアミノ酸残基に関するコドンの単純な変化は、コー
ドされるポリペプチドの構造を変化させない。

【００５６】配列番号：５及び配列番号：７によってコードされるｈＦＵ相同体は本発明の
好ましい実施態様を構成する。しかし、本発明が、ここで開示されるヌクレオチ
ド配列によってコードされる蛋白質と相同であり、基本的に同じ生物学的特性を
持つ蛋白質を包含することは明白である。この定義は、ここで開示する２つのｈ
ＦＵ相同体のアイソフォーム及び天然の対立遺伝子変異体を含むことが意図され
ている。これらの変異体形態は、例えば同じ由来生物の異なる組織における代替
的スプライシングまたは区別的発現から生じうる。変異体形態は、例えばアミノ
酸の挿入、欠失または置換によって特徴づけることができる。これに関して、配
列番号：６または８と少なくとも約８０％の配列相同性、好ましくは約９０％の
配列相同性、より好ましくは約９５％の配列相同性、最も好ましくは約９８％の
配列相同性を持つアミノ酸配列を含む変異体形態は、本発明に含まれるものと考
えられる。

【００５７】本発明において開示される配列情報の知識から、当業者は、当業者に既知であ
り、例えばＭａｎｉａｔｉｓら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ）、
第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）が開示する様々な手段を通して、種
々のソース（すなわち種々の組織または種々の生物）から本発明の蛋白質をコー
ドするＤＮＡ配列を同定し、入手することができる。

【００５８】例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、ここで提供するｈｆｕ遺伝子の
配列情報から作製されるオリゴヌクレオチドプローブでｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまた
はゲノムＤＮＡをスクリーニングすることによって入手しうる。プローブは、既
知の手順に従って蛍光基、放射性原子または化学発光基のような検出可能な原子
団で標識し、例えばＭａｎｉａｔｉｓら、分子クローニング：実験室マニュアル
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕ
ａｌ）、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に述べられているような従
来のハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用できる。プローブは、例えば
組織及び細胞におけるｈＦＵ生合成を検出し、測定するための診断方法において
もう１つの有用な適用が見出される。

【００５９】その他において、ｈｆｕ遺伝子の配列は、ここで提供する配列から作製される
ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）手法を使用して回収することができる。Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８
３，１９５号及びＭｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，２０２号参照。ＰＣＲ
反応は、配列が事前に精製されておらず、特定サンプル中に１コピーだけしか存
在しないときでも特定核酸配列の濃度を選択的に高める方法を提供する。かかる
方法は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを増幅するために使用できる。この方法の本
質は、所望する核酸分子の鋳型依存性の、ポリメラーゼを介した複製のためのプ
ライマーとして働く２つのオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。

【００６０】多様な代替的クローニング及びインビトロでの増幅方法が当業者に既知である
。これらの手法の例は、例えばＢｅｒｇｅｒとＫｉｍｍｅｌ、分子クローニング
手法の手引き（ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５２
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒ
ｇｅｒ）の中に認められる。

【００６１】ｈＦＵ相同体をコードするＤＮＡ配列を複製するために、これが適切なベクタ
ーにクローニングされるに違いない。ベクターは複製可能なＤＮＡ構築物である
。

【００６２】ベクターは、ここでは、ｈｆｕ相同体をコードするＤＮＡを増幅するため及び
／または本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを発現するために使用される。発現
ベクターは、本発明の蛋白質の１つをコードするＤＮＡ配列が、適当な宿主にお
いて２つのｈＦＵ相同体の１つの発現を生じさせることができる適当な制御配列
に作動可能に連結されている、複製可能なＤＮＡ構築物である。ＤＮＡ領域は、
それらが互いに機能的に関係するとき、作動可能に連結される。例えば：プロモ
ーターは、それが配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結され
る。増幅ベクターは発現制御ドメインを必要としない。通常は、複製の起点によ
って与えられる宿主において複製する能力及び形質転換体の認識を容易にする選
択遺伝子が必要とされるすべてである。

【００６３】本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、ライゲーションのための平滑末端
または粘着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適宜に粘着末端の
充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び適切
なリガーゼによるライゲーションを含めて、従来の手法に従ってベクターＤＮＡ
で組換えることができる。そのような操作のための手法は、Ｍａｎｉａｔｉｓら
、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ
：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ）、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ
（１９８９）に開示されており、当業者において既知である。

【００６４】発現ベクターを適当な宿主細胞に導入したとき、クローン化された配列の発現
が起こる。原核生物発現ベクターを用いる場合には、適当な宿主細胞は、クロー
ン化配列を発現することができる原核細胞、例えば大腸菌であろう。同様に、真
核生物発現ベクターを使用する場合には、適当な宿主細胞は、クローン化配列を
発現することができる真核細胞であろう。酵母宿主、例えばビール酵母菌（Ｓ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）も使用できる。その代わりに昆虫細胞も使用しうるが、
その場合にはバキュロウイルスベクター系が適当と考えられる。もう１つの代替
的宿主は哺乳類細胞系統、例えばＣＯＳ−１細胞である。

【００６５】制御配列を発現ベクターに導入する必要性は、選択する宿主と選択する形質転
換法に依存して異なる。一般に、制御配列は転写プロモーター、転写を制御する
ための任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合をコードする配
列、及び転写と翻訳の終了を制御する配列を含む。本発明を実施するために有用
なベクターは、プラスミド、ウイルス（ファージを含む）、レトロウイルス、及
び組み込み可能なＤＮＡ断片（すなわち相同的組換えによって宿主ゲノムに組み
込むことができる断片）を含む。ベクターは宿主ゲノムとは独立して複製し、機
能するか、若しくは一部の場合には、ゲノム自体に組み込まれることもある。

【００６６】発現ベクターは、宿主生物によって認識されるプロモーターを含まねばならな
い。本発明のプロモーター配列は原核性、真核性またはウイルス性でありうる。
適当な原核配列の例は、バクテリオファージラムダのＰ_Ｒ及びＰ_Ｌプロモーター
（バクテリオファージラムダ（ＴｈｅｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＬａｍｂ
ｄａ）、Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ａ．Ｄ．編集、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９７３）；
ラムダＩＩ（ＬａｍｂｄａＩＩ）、Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｒ．Ｗ．編集、Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ，ＮＹ（１９８０））；大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック、及びｌ
ａｃＺプロモーター、ならびにＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ
．ら、Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４−３１０（１９８１）を含む。

【００６７】シャイン−ダルガーノ配列に関するかぎり、適当な調節配列の好ましい例は、
ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子及びバクテリオファージラムダの遺伝子
ｃＩＩのシャイン−ダルガーノによって代表される。シャイン−ダルガーノ配列
は、ｈＦＵ相同体をコードするＤＮＡがそのすぐ後に続くと考えられ、本発明の
成熟蛋白質の発現をもたらす。

【００６８】その代わりに、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの前に、キャリアペプチド
配列をコードするＤＮＡ配列が先行することもある。この場合、ｈＦＵ相同体の
１つのＮ末端がキャリアペプチドに融合されている融合蛋白が産生され、これは
蛋白の発現レベルと細胞内での安定性を高めるのに役立ち、精製の簡単な手段を
提供すると考えられる。好ましいキャリアペプチドは、例えばＩｇＧ結合セファ
ロースでのアフィニティークロマトグラフィーによって容易に均質に精製される
、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１つまたはそれ以上を含む。その代わり
に、多くのベクターは標的蛋白質のＮ末端またはＣ末端で発現されうる一連のヒ
スチジン残基を担うという利点を持つ。それ故、対象とする蛋白質は金属キレー
ト化クロマトグラフィーによって回収することができる。エンテロキナーゼ、第
Ｘ因子、プロコラゲナーゼまたはトロンビンのような蛋白質分解酵素の認識部位
をコードするＤＮＡ配列は、融合蛋白質を開裂して本発明の成熟蛋白質を得るこ
とができるように、ｈＦＵ相同体をコードする配列のすぐ前に先行する。

【００６９】さらに、適当な発現ベクターは、形質転換した宿主細胞をスクリーニングする
ことができる適切なマーカーを含む。選択した宿主の形質転換は、当業者に既知
であり、Ｍａｎｉａｔｉｓら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ）、第
２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に述べられている様々な手法のいずれ
か１つを用いて実施される。

【００７０】本発明のさらにもう１つの実施態様は、上記発現ベクターで形質転換した、適
切な培養条件下で本発明の蛋白質を産生することができる原核宿主細胞である。

【００７１】さらに、多細胞生物から誘導した細胞の培養は、ｈＦＵ相同体の合成にとって
望ましい宿主である。原則的には、昆虫及び哺乳類細胞を含めて、脊椎動物また
は無脊椎動物培養のどちらからでも、どのような真核細胞培養も機能しうる。細
胞培養におけるそのような細胞の増殖は常套的手法となっている。組織培養（Ｔ
ｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅと
Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ編集（１９７３）参照。有用な宿主細胞系統の例は、ＨｅＬ
ａ細胞、ＣＨＯ及びＣＯＳ細胞系統である。脊椎動物及び無脊椎動物細胞を形質
転換する際に使用される発現ベクターにおける転写及び翻訳調節配列は、しばし
ばウイルスソースから提供され、例えば一般的に使用されるプロモーターはアデ
ノウイルス２、ポリオーマ及びＳＶ４０から誘導される。例えば米国特許第４，
５９９，３０８号参照。

【００７２】複製起点は、外因性起点を含むようにベクターを構築するか、または宿主細胞
の染色体複製機序によって提供されうる。ベクターを宿主細胞の染色体に組み込
む場合には、後者で十分であると考えられる。

【００７３】ウイルス複製起点を含むベクターを使用するのではなく、選択可能なマーカー
とｈＦＵ相同体をコードするＤＮＡの同時形質転換法によって哺乳類細胞を形質
転換することができる。適当なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｄ
ＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである。米国特許第４，３９９，２１６号参照
。

【００７４】本発明に従ったｈＦＵ相同体は、これに対する抗体を惹起するための抗原とし
て使用することができる。その結果として、本発明はまた、本発明に従った蛋白
質に特異的に結合する抗体を包含する。そのような抗体は免疫測定法のため、例
えばペプチドまたはポリペプチドの分離のために有用である。

【００７５】本発明に従った抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり、天然に生
じる（完全長）形態及び組換え形態の両方で、個体、対立遺伝子、株または種変
異体、あるいはその断片を含む。さらに、本発明の蛋白質に対する抗体は、本発
明の蛋白質の天然の形状または変性形状のいずれかに対して惹起される。抗イデ
ィオタイプ抗体も生成することができる。抗体を作製する多くの方法が当業者に
既知である。モノクローナル抗体を調製する手法については、例えばＳｔｉｉｔ
ｅｓら（編集）、基礎及び臨床免疫学（ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（第４版）、ＬａｎｇｅＭｅｄｉｃａｌＰｕｂｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ，ＬｏｓＡｌｔｏｓ，ＣＡ、及びここで引用する参考文献参
照。ファージまたは同様のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択に関す
る手法は、例えばＨｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−
１２８１参照。

【００７６】本発明に従ったｈＦＵ相同体は製薬製剤として使用しうる。従って、本発明は
、治療によってヒトまたは動物の身体を処置する方法において使用するための本
発明に従ったｈＦＵ相同体または抗体、ならびに基底細胞癌の治療において使用
するための薬剤の製造における上記分子の使用に関する。本発明はまた、製薬上
許容される担体と共に本発明に従った分子を含む製薬製剤に関する。ヒトまたは
動物の身体の治療方法において使用される分子は、上述したｈＦＵ相同体または
抗体ならびにそれを使用する上述したスクリーニング方法において同定される新
規物質のいずれか１つでありうる。

【００７７】もう１つの局面では、本発明は、ｈＦＵキナーゼ活性を選択的に阻害する作用
物質をスクリーニングするための方法を特徴とする。かかる方法は、潜在的な作
用物質を、ｈＦＵキナーゼ活性を阻害するが別のキナーゼの活性は阻害しない能
力に関して検定することを含む。

【００７８】スクリーニングする作用物質は、細胞外、細胞内、生物学的または化学的由来
でありうる。そのような試験において使用するｈＦＵ相同体は、溶液中に遊離し
ているか、アガロースまたはプラスチックビーズ、マイクロタイターウエル、ナ
イロンまたはニトロセルロースのような保持体に結合しているか、細胞表面上に
存在するか、または細胞内に位置しうる。例えば、ｈＦＵと試験する作用物質間
の複合体の形成を測定することができる。その代わりに、試験する作用物質によ
って生じる、ｈＦＵとその基質間の複合体形成の低下を調べることもできる。

【００７９】本発明はまた、化合物を本発明のｈＦＵ相同体と接触させ、化合物とｈＦＵ相
同体間の複合体の存在に関して検定することを含む、ｈＦＵシグナル伝達に影響
を及ぼしうる化合物についてスクリーニングするための方法を提供する。そのよ
うなアッセイにおいては、ｈＦＵ相同体は典型的には標識される。適当なインキ
ュベーション後、遊離ｈＦＵ相同体を結合形態で存在するものから分離すると、
遊離または非複合標識の量が、特定化合物がｈＦＵに結合する能力の測定値とな
る。

【００８０】ここで述べるスクリーニング方法を通して同定される化合物は本発明の範囲内
である。そのような化合物は、好ましくは低分子量のペプチドまたは非ペプチド
性分子である。そのサイズが小さいため、それらは医薬上の目的に適切に使用さ
れる。

【００８１】薬剤スクリーニングのためのもう１つの手法は、ｈＦＵ相同体に対して適切な
結合親和性を持つ化合物の高流量スクリーニングを提供する。簡単に述べると、
多数の異なる小ペプチド被験化合物を固体基質上で合成する。ペプチド被験化合
物をｈＦＵ相同体と反応させ、洗浄する。その後当業者において既知の方法によ
って結合ｈＦＵ相同体を検出する。

【００８２】本発明のｈＦＵ相同体はまた、被験化合物がｈＦＵ相同体とその基質間での複
合体の形成を阻害する能力を検定するためにも使用しうる。

【００８３】このアプローチを用いる１つの方法は、ｈＦＵ基質を保持体に結合し、その後
被験化合物の存在下で、かかる基質をｈＦＵ蛋白質またはリン酸化ドメインのよ
うな生物学的に活性なその断片と共にインキュベーションすることを含む。次い
で基質とｈＦＵ相同体間の複合体の形成を測定する。

【００８４】この種の典型的試験では、９６穴マイクロタイタープレートをｈＦＵ基質で被
覆し、プラスチック製シンチレーターフィルムを充填し、ｈＦＵ酵素、^３２Ｐ
γ−ＡＴＰ及び種々の濃度の被験化合物と共にインキュベーションする。放射標
識リン酸部分がｈＦＵキナーゼによって基質被覆したウエルに移される；プレー
トを洗浄した後、シンチレーションカウンターで発光を直接測定することができ
る。発光がないことは、ｈＦＵ相同体への被験化合物の有効な結合を示す。

【００８５】もう１つのプロトコールは、ストレプタビジン被覆プレート上に捕獲されたビ
オチニル化基質の使用に基づき、これをｈＦＵ酵素、ＡＴＰ及び種々の濃度の被
験化合物と共にインキュベーションする。プレートをインキュベーションして洗
浄し、抗ホスホチロシンＨＲＰ（ホースラディシュペルオキシダーゼ）複合抗体
でリン酸化ペプチド濃度を測定して、化合物の阻害活性を検出する。

【００８６】また、ｈＦＵの酵素的に産生されるＡＤＰと組合せて、乳酸デヒドロゲナーゼ
及びピルビン酸塩によるＮＡＤＨの酸化を原因とする、３４０ｎｍでの吸光度の
低下を分光光度計でモニターすることにより、ｈＦＵキナーゼ活性の阻害を間接
的に測定することもできる。

【００８７】上述した薬剤スクリーニング手法において使用するために、精製ｈＦＵを直接
プレートに被覆することもできる。さらに、非中和抗体を使用して蛋白質を捕獲
し、それを保持体に固定することができる。

【００８８】本発明はまた、ｈＦＵに結合することができる中和抗体が、ｈＦＵ相同体への
結合に関して被験化合物と特異的に競合する、競合的スクリーニングアッセイの
使用を考慮している。このように、抗体を使用して、１個またはそれ以上の抗原
決定基を共有するペプチドの存在を検出することができる。それ故、本発明は、
ｈＦＵ相同体に結合することができる中和抗体がｈＦＵ相同体への結合に関して
被験化合物と特異的に競合するスクリーニングアッセイを提供することを含む、
ｈＦＵ相同体と１個またはそれ以上の抗原決定基を共有する化合物についてスク
リーニングするための方法を提供する。

【００８９】本発明の精製ｈＦＵ相同体は、相互作用性のシグナル伝達経路蛋白質の同定、
特性指摘及び精製のための研究ツールである。当業者において既知の様々な方法
によって適切な標識をｈＦＵに組み込み、ｈＦＵを使用して相互作用分子を捕獲
する。例えば、標識ｈＦＵ分子を蛋白質、膜及び細胞溶解後に得られるすべての
細胞小器官と共にインキュベーションし、さらに密度勾配での遠心分離によって
分画して、非結合分子を除去し、ｈＦＵ複合体を定量する。種々の濃度のｈＦＵ
を用いて得られたデータを使用して、ｈＦＵの数、親和性、及びシグナル伝達複
合体との結合に関する数値を計算する。

【００９０】アフィニティー精製がこの目的に特に適することは立証しうる。この手法を用
いて、ｈＦＵをクロマトグラフィーカラムに共有結合する。細胞とその膜を抽出
し、ｈＦＵを取り除いて、種々のｈＦＵ不含のサブ成分をカラムに通過させる。
分子はそれらのｈＦＵ親和性によってカラムに結合する。ｈＦＵ複合体をカラム
から回収し、分離して、回収した分子を蛋白質のＮ末端配列決定に供する。次に
このアミノ酸配列を使用して、捕獲された分子を同定するか、または適切なｃＤ
ＮＡライブラリーからその遺伝子をクローニングするために縮退オリゴマーを設
計する。

【００９１】その代わりに、本発明のｈＦＵ相同体と同様の特性を示すが、より小さく、ヒ
トまたは動物の身体においてｈＦＵよりも長い半減期を示す化合物が同定できる
。有機化合物を設計するときには、本発明に従った分子を「リード」化合物とし
て使用する。既知の製薬上活性な化合物のミメティックの設計は、そのような「
リード」化合物に基づく薬剤開発における既知のアプローチである。ミメティッ
クの設計、合成及び試験は、一般に標的特性に関して数多くの分子をランダムに
スクリーニングすることを避けるために使用される。さらに、本発明のＤＮＡに
よってコードされる演繹アミノ酸配列の分析から導かれる構造データは、より特
異的であり、それ故より高い薬理学的潜在能を持つ新しい薬剤をデザインするた
めに有用である。

【００９２】本発明のＤＮＡ配列を入手可能なすべてのデータベースに存在する配列と比較
すると、ショウジョウバエの融合ｃＤＮＡと有意の相同性を示した。そこでコン
ピュータモデリングを使用して、ショウジョウバエフューズド蛋白質の入手可能
な情報に基づき、本発明の蛋白質の推定三次構造を開発することができた。この
アプローチは、ｈＦＵ相同体の予測される構造に基づいて新規酵素阻害因子を設
計するのに役立つであろう。

【００９３】特定実施態様では、本発明に従ったスクリーニング方法によって同定される新
規分子は低分子量の有機分子であり、その場合、錠剤のような経口摂取用の製薬
製剤が調製できる。

【００９４】本発明に従った製薬製剤は、しかしながら、いかなる投与経路用にも調製でき
、例えば経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内または腹腔内投与用に調
製できる。担体または他の成分の性質は個々の投与経路に依存するであろう。（
これに関する手法とプロトコールの例は、中でも特に、レミントンの製薬科学（
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ）、
第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ（編集）、１９８０に認められる。）これらの低分子量化合物の用量は、治療する疾患の状態または条件、ヒトまた
は動物の体重や条件のような他の臨床的因子、及び化合物の投与経路に依存する
であろう。ヒトまたは動物を治療するためには、約０．５ｍｇ／Ｋｇ体重から５
００ｍｇ／Ｋｇ体重の化合物を投与することができる。

【００９５】本発明の化合物及び方法は、基底細胞癌のような、あらゆる種類の母斑性基底
細胞癌症候群関連障害及び／または疾患を治療し、治癒するため、あるいは予防
するために好都合に使用される。１つの特定実施態様では、本発明の分子は遺伝
子治療において使用される。遺伝子治療の方法の総説に関しては、例えばＡｎｄ
ｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３参照。

【００９６】本発明のさらなる有益な使用は、身体におけるパッチトレセプタのシグナル伝
達を調節する方法を開発することであり、それ故本発明はまた、基底細胞癌に罹
患しているヒトまたは動物患者を治療する方法ならびにそのような状態を予防す
る方法に関する。

【００９７】本発明のクローン化遺伝子及びそれから誘導されるオリゴヌクレオチドは、あ
る種の疾患に結びつく制限酵素断片長の多型性（ＲＦＬＰ）をスクリーニングす
るために有用である。

【００９８】ｈＦＵ相同体をコードする本発明のＤＮＡ配列から誘導されるオリゴヌクレオ
チドは、種々の組織におけるフューズド遺伝子発現をプローブするための診断ツ
ールとして有用である。例えば、この酵素の天然の発現またはそれに関連する病
的状態を検討するための従来のオートラジオグラフィー手法により、検出可能な
基を担うオリゴヌクレオチドプローブで組織をインシトゥでプローブすることが
できる。

【００９９】本発明を下記の実施例においてより詳細に説明する。これらの実施例は本発明
の例示を意図するものであり、その限定とみなされるべきではない。

【０１００】添付の図面において：図１は本発明の核酸分子の図式的例示であり、下記の実施例１において詳しく
説明する。ＡＴＧとＴＧＡにより、それぞれ開始コドンと停止コドンを示した。
白または黒のデルタ（△）記号は核酸配列の欠失を示す。配列番号３の図の左端
の白い箱はクローンＮ２５１５６６２の５’非翻訳領域を示す；斜線の箱は３’
非翻訳領域を示す；黒い箱はキナーゼドメインを示し、格子の箱はコード配列の
残りの部分を示す。

【０１０１】実施例１この実施例はｈｆｕＤＮＡ配列の分離を報告する。

【０１０２】ショウジョウバエフューズド蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａ
ｎｋＡｃｃＸ８０４６８）を使用してｔｈｅＩｎｃｙｔｅＬｉｆｅＳｅ
ｑ^Ｒデータベースを詳細に検索し、２つの異なるクローン、肝組織ｃＤＮＡライ
ブラリー（ＬＩＶＲＴＵＴＯ４）からのもの（Ｎ２５１５６６２）及び乳房組
織ｃＤＮＡライブラリー（ＢＲＳＴＮＯＴ１８）からの２番目のクローン（Ｎ
３１６８３５４）を同定した。

【０１０３】２つのクローンの部分配列だけがｔｈｅＩｎｃｙｔｅＬｉｆｅＳｅｑ^Ｒデータベースから提供され、これらの２つの短い配列をＢＬＡＳＴアルゴリズム
を使用してショウジョウバエ融合配列に整列した。クローンＮ２５１５６６２
に関連する、２７４塩基対（ｂｐ）長の部分配列（配列番号：１）を、ショウジ
ョウバエフューズドコード配列（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃＸ８０４６８）と
共に整列し６５％の同一性スコアを得た。

【０１０４】クローンＮ３１６８３５４からの２５１ｂｐ長の第二の部分配列（配列番号
：２）は、ショウジョウバエフューズドコード配列と共に整列し４４％の同一性
スコアを得た。クローンＮ２５１５６６２からのｃＤＮＡを分離し、２本の鎖
を自動シーケンサーにかけ、４８４５ｂｐ長の完全長配列（配列番号：３）を得
た。同様に、クローンＮ３１６８３５４から分離したｃＤＮＡのコード鎖と相
補鎖の両方を完全に配列決定して、４２３７ｂｐ長の完全長配列（配列番号：４
）を得た。配列番号：３と配列番号：４を図１に示す。

【０１０５】配列番号：３の配列分析から、ＡＴＧ開始コドンは１２６位に位置し、一方１
２６位から８３５位までの配列は欠失したキナーゼドメインをコードする。実際
に、配列番号：３と配列番号：４の整列は、図１において白いデルタ記号で表わ
されている、クローンＮ２５１５６６２の８０９位から８１０位の間の９４ｂ
ｐの欠失を示した。我々はこの欠失領域を配列番号：４の対応する領域（ヌクレ
オチド２４６位からヌクレオチド３４０位まで）で置換し、その結果４７４アミ
ノ酸長の演繹蛋白質（配列番号：６）をコードする１４２５ｂｐの組換えコンセ
ンサス配列（配列番号：５）を得た。図１参照。

【０１０６】この蛋白質は、ショウジョウバエフューズド蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ
Ｘ８０４６８）と３４．６％のアミノ酸同一性スコア、４３．３１％の類似性
スコアを示す；キナーゼドメイン（ａａ１−２６８）内では、同一性スコアは
５１．８６％、類似性スコアは６３．４３％に上昇する。

【０１０７】配列番号：４の配列分析及びクローンＮ２５１５６６２の配列との比較から
、４３８ｂｐ長の、ＡＴＧ開始点及びキナーゼドメインの５’配列コード部分の
欠失が認められた。図１参照。

【０１０８】この欠失領域を配列番号：３の１２６位から５６３位までの対応する領域で置
換し、その結果３９４８ｂｐ長のオープンリーディングフレーム（配列番号：７
）を生じた。図１参照。

【０１０９】新しい推定上のスプライシング変異体を予測される配列番号：５と共に整列し
た。２つのｃＤＮＡ（配列番号：５及び配列番号：７）の整列は、１３７８位か
ら１３７９位の間に配列番号：７における１０３ｂｐの欠失を示した。図１では
欠失領域を黒いデルタ記号で示した。

【０１１０】新しい組換えコンセンサス配列（配列番号：７）の翻訳は、１３１５アミノ酸
長の蛋白質（配列番号：８）を予測する。演繹アミノ酸配列（配列番号：８）を
ショウジョウバエフューズド蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃＸ８０４６８）
と共に整列すると、２６．９８％のアミノ酸同一性スコア、３４．６７％の類似
性スコアを示す；キナーゼドメイン内では同一性は５１．８６％に、類似性は６
３．４３％に上昇する。

【０１１１】実施例２−ノーザンブロット分析フューズド遺伝子の推定上のヒト相同体の発現を検討するため、ノーザンブロ
ット法を実施し、ここで開示するプローブとハイブリダイズした。

【０１１２】センス方向のオリゴヌクレオチド、５’−ＴＣＡＧＧＣＣＴＡＴＡＡＡＣＧＣ
ＡＴＧＧ−３’（配列番号：９）とアンチセンス方向オリゴヌクレオチド、５’
−ＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴ−３’（配列番号：１０）をプライ
マーとして使用して、３’ｃＤＮＡコード配列とＴＧＡコドン後の非翻訳配列の
最初の部分である配列番号：５の一部を増幅した。８６３ｂｐ長の断片を増幅し
、プローブとして使用した。

【０１１３】Ｃｌｏｎｔｅｃｈからの複数の組織ノーザンブロット（ＨｕｍａｎＩＩ＃
７７６７−１Ｈｕｍａｎｆｅｔａｌ＃７７５６−１）をプローブとハイブリ
ダイズした。

【０１１４】５×ＳＳＣ、１×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２
５０ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、４２℃で４時間、プレハイブリダイゼーショ
ンを実施した。約１．５×１０^６ｃｐｍ／ｍｌの標識プローブを加えた同じ混合
物中、４２℃でひと晩ハイブリダイゼーションを実施した。

【０１１５】プローブは、マルチプライムＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によっ
て（^３２Ｐ）ｄＣＴＰで標識し、ＮｉｃｋＣｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）で精製して、ハイブリダイゼーション溶液に加えた。フィルターを０．２×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ中４２℃で数回洗浄した。増感紙を用いて−８０℃でフィ
ルターをＫｏｄａｋＸ−ＡＲフィルム（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋＣｏｍ
ｐａｎｙ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．ＵＳＡ）に露出した。

【０１１６】５．８ｋｂｍＲＮＡが精巣において発現され、胎児肺組織で最も弱いバンド
が検出された。同程度に豊富な約５．８ｋｂと約３ｋｂの２つのバンドが胎児脳
から抽出したｍＲＮＡにおいて検出された。胎児肝において２．４ｋｂｍＲＮ
Ａが有意のレベルで発現され、一方約４：１の相対的量で約５．８ｋｂと２．４
ｋｂの２つのバンドが胎児腎から抽出したｍＲＮＡにおいて検出された。

【０１１７】ヒトＧＡＰＤＨプローブによるフィルターハイブリダイゼーションによってす
べてのレーンの等しい負荷を確認した。

【０１１８】実施例３−ポリメラーゼ連鎖反応２つのヒト配列の整列は、機能的ドメイン外の１０３ｂｐの挿入を特徴とす
る２つの異なるスプライシング変異体を明らかにした；さらに、本発明の２つの
配列は、９４ｂｐ長の欠失がない完全なキナーゼドメインを特徴とする（詳細に
ついては上記参照）。これら２つのスプライシング変異体を確認するため、鋳型
ｃＤＮＡ１ｎｇ（ヒト精巣及び胎児肝のＣｌｏｎｔｅｃｈＱＵＩＣＫ−ＣＬ
ＯＮＥ（商標）ｃＤＮＡ）を２つの異なるＰＣＲ増幅混合物と組み合わせた。
最初のサンプル（ｍｉｘＡ）では、キナーゼドメイン内に欠失のないｈｆｕｃ
ＤＮＡ配列の存在を検出するため、センス方向オリゴヌクレオチド、５’−ＧＴ
ＧＧＡＧＧＡＧＣＧＡＣＣＡＴＡＣＧＡ−３’（配列番号：１１）とアンチセン
ス方向オリゴヌクレオチド、５’−ＣＣＴＴＴＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴ
ＧＧＧ−３’（配列番号：１２）をＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用し
た。上述した条件で増幅を行い、３４３ｂｐと２４９ｂｐ長の２つの特異的増幅
産物が、機能的ドメイン内に９４ｂｐの欠失があるｃＤＮＡ配列と欠失のないｃ
ＤＮＡ配列の存在を確認した。

【０１１９】第二のサンプル（ｍｉｘＢ）では、機能的ドメイン外の１０３ｂｐの挿入を増
幅するため、センス方向オリゴヌクレオチド、５’−ＣＡＧＣＧＣＡＴＣＣＡＧ
ＡＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号：１３）とアンチセンス方向オリゴヌクレオチ
ド、５’−ＣＣＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＡＧＧ−３’（配列番号：１４
）をＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用した（詳細については上記参照）
。上述した条件で増幅を行い、２５３ｂｐと１５０ｂｐ長の２つの特異的増幅産
物が、コードクローンへの１０３ｂｐの挿入の存在を確認した。

【０１２０】各々のサンプルについて、鋳型ｃＤＮＡを各特異的プライマー３５ｐｍｏｌ、
１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液５ｍｌ（５００ｍＭＫＣｌ／１００ｍＭＴ
ｒｉｓ×ＨＣｌ、ｐＨ８．３）、２５ｍＭＭｇＣｌ_２４ｍｌ、ｄＮＴＰ溶液
４ｍｌ（２．５ｍＭｄＮＴＰ）及びＴａｑＧｏｌｄＤＮＡポリメラーゼ０
．５ｍｌ（２．５単位）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）と組み合わ
せた。水を加えて反応容量を５０ｍｌにした。

【０１２１】試験管を９５℃で１０分間加熱し、９５℃で１５秒間変性を行い、５５℃で３
０秒間アニーリングして、７２℃で３０秒間重合した。

【０１２２】このサイクルを４０回繰り返した。

【０１２３】２つの異なるＰＣＲ増幅混合物はいずれもスプライシング変異体を増幅した。
より明細には、ｍｉｘＡを使用した増幅産物は、キナーゼドメイン内に９４ｂｐ
の欠失があるｈｆｕｃＤＮＡと欠失のないｈｆｕｃＤＮＡを表わす３４３ｂｐ
と２４９ｂｐ長の２つのバンドであった。他方で、ｍｉｘＢを使用して得られた
増幅産物（２５３ｂｐと１５０ｂｐ長の２つのバンド）は、配列番号：６及び８
によって表わされる蛋白質をコードするＴＧＡトリプレットのあるものとないも
のの２つのｈｆｕｃＤＮＡスプライシング変異体の存在を確認した。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の核酸分子の図式的例示であり、下記の実施例１において詳しく説明す
る。ＡＴＧとＴＧＡにより、それぞれ開始コドンと停止コドンを示した。白また
は黒のデルタ（△）記号は核酸配列の欠失を示す。配列番号３の図の左端の白い
箱はクローンＮ２５１５６６２の５’非翻訳領域を示す；斜線の箱は３’非翻訳
領域を示す；黒い箱はキナーゼドメインを示し、格子の箱はコード配列の残りの
部分を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｃ０８４ 16/18 1/21 ４Ｃ０８５Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/08 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 5/10 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/48 33/50 Ｚ 1/68 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/15 33/577 Ｂ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA78 FB01 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 BA10 BA44 BA80 CA04 CA09 CA20 DA02 DA05 DA12 EA04 GA11 HA13 HA14 4B063 QA01 QA05 QA13 QA17 QA19 QQ21 QQ43 QQ53 QQ61 QQ89 QR07 QR48 QX10 4B064 AG27 CA10 CA20 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA29 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA17 BA01 BA02 CA62 ZB26 4C085 AA14 BB31 EE01 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 DA76 DA89 EA20 EA50 FA71 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号：５のセンス配列及び配列番号：７のセンス
配列；（ｂ）（ａ）の配列に相補的な配列；（ｃ）（ａ）の配列によってコードされるポリペプチドをコードする配列；（ｄ）ストリンジェント条件下で（ａ）及び（ｂ）の配列にハイブリダイズす
る類似配列；及び（ｅ）（ａ）の配列に相同であり、ｈＦＵ活性を持つポリペプチドをコードす
る配列から成る群から選択される配列を含む、単離された一本鎖または二本鎖ポリヌ
クレオチド。
【請求項２】ＤＮＡ分子である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】ＲＮＡ分子である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】ヌクレオチド配列が配列番号：５または配列番号：７である
、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】請求項１〜４のいずれかで定義されるようなポリヌクレオチ
ドを含むベクター。
【請求項６】ベクターがプラスミドである、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】ベクターがウイルスである、請求項５に記載のベクター。
【請求項８】請求項５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項９】細胞が細菌細胞である、請求項８に記載の形質転換宿主細胞
。
【請求項１０】細胞が酵母細胞である、請求項８に記載の形質転換宿主細
胞。
【請求項１１】細胞が昆虫細胞である、請求項８に記載の形質転換宿主細
胞。
【請求項１２】細胞が哺乳類細胞である、請求項８に記載の形質転換宿主
細胞。
【請求項１３】請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドによっ
てコードされる、単離され、精製された蛋白質。
【請求項１４】配列番号：６または８と少なくとも約８０％の配列相同性
、好ましくは約９０％の配列相同性、より好ましくは約９５％の配列相同性、最
も好ましくは約９８％の配列相同性を持つアミノ酸配列を含む、請求項１３に記
載の蛋白質。
【請求項１５】配列番号：６のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の
蛋白質。
【請求項１６】配列番号：８のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の
蛋白質。
【請求項１７】配列番号５または７の少なくとも１０個の隣接ヌクレオチ
ドの配列を含むヌクレオチドプローブ。
【請求項１８】化合物を請求項１３〜１６のいずれかに記載のｈＦＵ相同
体と接触させ；そして化合物とｈＦＵ相同体間の複合体の存在に関して検定することを含む、ｈＦＵシグナル伝達に影響を及ぼしうる化合物についてスクリー
ニングするための方法。
【請求項１９】潜在的作用物質が、ｈＦＵキナーゼ活性を阻害し、他のキ
ナーゼの活性を阻害しない能力に関して検定することを含む、ｈＦＵキナーゼ活
性を選択的に阻害する作用物質についてスクリーニングするための方法。
【請求項２０】ｈＦＵ相同体に結合することができる中和抗体が、ｈＦＵ
相同体への結合に関して被験化合物と特異的に競合するスクリーニングアッセイ
を提供することを含む、請求項１２〜１６のいずれかに記載のｈＦＵ相同体と１
個またはそれ以上の抗原決定基を共有する化合物についてスクリーニングするた
めの方法。
【請求項２１】ｈＦＵ基質を保持体に連結し；被験化合物の存在下でｈＦＵ基質をｈＦＵ相同体またはその生物学的に活性
な断片と共にインキュベーションし；そして基質とｈＦＵ相同体間での複合体の形成を測定することを含む、ｈＦＵ相同体とその基質間での複合体の形成を阻害する被験化合
物の能力を検定するための方法。
【請求項２２】ｈＦＵ相同体が標識されている、請求項１８〜２１のいず
れかに記載の方法。
【請求項２３】請求項１８〜２２のいずれかに記載のスクリーニング方法
を通して同定される化合物。
【請求項２４】請求項１３〜１６のいずれかに記載の蛋白質に特異的に結
合する抗体または抗体断片。
【請求項２５】モノクローナル抗体またはその断片である、請求項２４に
記載の抗体。
【請求項２６】治療によるヒトまたは動物の身体の処置方法における使用
のための、請求項２４または２５に記載の抗体。
【請求項２７】請求項２４または２５に記載の抗体を発現する組換え細胞
。
【請求項２８】治療によるヒトまたは動物の身体の処置方法における使用
のための、請求項１３〜１６及び２３のいずれかに記載の蛋白質または化合物。
【請求項２９】基底細胞癌の治療方法における使用のための、請求項２８
に記載の蛋白質または化合物。
【請求項３０】基底細胞癌の治療において使用するための薬剤の製造にお
ける、請求項１３〜１６及び２３のいずれかに記載の蛋白質または化合物の使用
。
【請求項３１】製薬上許容される担体と共に請求項１３〜１６及び２３の
いずれかに記載の蛋白質または化合物を含む製薬製剤。
【請求項３２】請求項１３〜１６及び２３のいずれかに記載の蛋白質また
は化合物の治療上有効な量を宿主細胞に投与することを含む、基底細胞癌に罹患
している宿主を治療する方法。