JP2002541810A - 新規リポキシゲナーゼタンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規クラスの哺乳動物リポキシゲナーゼタンパク質のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を報告する。新規リポキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドはヒトジーントラップクローンおよびヒトcDNAライブラリーから得られたものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】１．序 本発明は、リポキシゲナーゼとの配列類似性を有するタンパク質をコードする
新規のヒトポリヌクレオチドの発見、同定および特徴付けに関するものである。
本発明は、開示したポリヌクレオチド、宿主細胞発現系、コードされるタンパク
質、融合タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、コードされるタンパク質お
よびペプチドに対する抗体、開示した遺伝子を欠失しているかまたは過剰に発現
する遺伝子操作により作製された動物、該タンパク質のアンタゴニストおよびア
ゴニスト、ならびに、診断、薬物のスクリーニング、臨床試験のモニタリング、
または生理的障害もしくは行動障害の治療に使用できる、開示したポリヌクレオ
チドによりコードされるタンパク質の発現または活性をモジュレートする他の化
合物を包含する。

【０００２】２．発明の背景 リポキシゲナーゼは基質としての脂質の酸化を媒介する酵素である。そのよう
な酵素として、リポキシゲナーゼはロイコトリエンの合成に関与している。リポ
キシゲナーゼはさまざまな生物学的プロセスに影響を与えており、とりわけ、強
力な走化因子、および炎症や平滑筋収縮などのメディエーターとして働くことが
できる。したがって、リポキシゲナーゼは各種の生物学的経路および状態を調節
するための重要な標的となる。

【０００３】３．発明の概要 本発明は、新規のヒトリポキシゲナーゼタンパク質をコードするヌクレオチド
、ならびに該タンパク質の対応するアミノ酸配列の発見、同定および特徴付けに
関する。本明細書において初めて開示される新規のヒトタンパク質(novel human
protein: NHP)は、動物および植物のリポキシゲナーゼタンパク質との構造類似
性を有する。そのような構造のものとして、新規遺伝子は、広範囲の門および種
を越えた、ある範囲の相同体およびオーソログ体を含めてリポキシゲナーゼタン
パク質の新しいクラスを表している。

【０００４】 本発明は、(a) 配列番号２、４、６、８、10、12、14、16、18、20、22、24、
26、または28を含むポリペプチド；(b) 配列番号２、４、６、８、10、12、14、
16、18、20、22、24、26、または28の相同変異体および対立遺伝子変異体；(c)
配列番号２、４、６、８、10、12、14、16、18、20、22、24、26、または28の任
意のサイズ（例えば、４アミノ酸から配列番号２、４、６、８、10、12、14、16
、18、20、22、24、26、または28のポリペプチドの全長未満まで）で、その間の
任意のアミノ酸数の断片；(d) 配列番号２、４、６、８、10、12、14、16、18、
20、22、24、26、または28の、機能性ドメイン（例えば、触媒ドメイン、シグナ
ル配列、リガンド結合ドメイン、調節ドメインなど）に対応する断片；(e) (a)
〜(d)のいずれか１つのポリペプチド配列を含む融合タンパク質；(f) 欠失突然
変異体、挿入突然変異体、置換突然変異体、および前記ドメインの少なくとも１
つの全部または一部が欠失されているか変化している突然変異ポリペプチド（例
えば、基質特異性が変化した活性部位をもつ突然変異体）を含むがこれらに限ら
ない、(a)〜(d)のいずれか１つのポリペプチド配列を含む突然変異ポリペプチド
（遺伝子操作により作製された突然変異体および天然に存在する突然変異体を含
む）；を含むものである。

【０００５】 本発明はさらに、(g) 配列番号１、３、５、７、９、11、13、15、17、19、21
、23、25、27、または29を含むポリヌクレオチド；(h) 上記の(a)〜(f)に記載の
ポリペプチドを含むがこれらに限らない、本発明のポリペプチドのいずれか１つ
をコードするポリヌクレオチド；(i) 低度、中程度または高度にストリンジェン
トな条件下で、上記の(g)および／または(h)に記載のポリヌクレオチドに対して
相補的な第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレ
オチド；(j) 上記の(g)〜(i)に記載のポリヌクレオチドのセグメントに対応し、
２ヌクレオチドから全長未満のポリヌクレオチドまでの任意のサイズで、その間
の任意の長さを有するオリゴヌクレオチド；を含むものである。

【０００６】 いくつかの実施形態において、本明細書に開示される新規のヒト核酸配列は、
長さが711、489、556、334、615、460、291、69、139、195、110、867、645、お
よび771アミノ酸のタンパク質／オープンリーディングフレーム(ORF)をコードし
ている（それぞれ、配列番号２、４、６、８、10、12、14、16、18、20、22、24
、26、および28を参照されたい）。

【０００７】 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれか１
つに対する抗体を含むものである。また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド
および／またはポリペプチドのいずれか１つを含むおよび／または発現するよう
に遺伝子操作された宿主細胞を包含する。

【０００８】 本発明はまた、開示したNHPのアゴニストおよびアンタゴニストを含み、例え
ば、小分子、大分子、突然変異NHP、または天然NHPと競合するその一部分、およ
び抗体がある。本発明はさらに、開示したNHP遺伝子の発現を抑制するために使
用できるヌクレオチド配列（例えば、アンチセンスおよびリボザイムオリゴヌク
レオチドおよび／またはポリヌクレオチド、ならびに遺伝子または調節配列置換
構築物）、または開示したNHP遺伝子の発現を促進するために使用できるヌクレ
オチド配列（例えば、開示した遺伝子を強力なプロモーター系の制御下に置いた
発現構築物）、ならびにNHPトランスジーンを発現するトランスジェニック動物
または機能性NHPを発現しない「ノックアウト」（条件付きであり得る）を包含
する。

【０００９】 さらに、本発明は、開示したNHPおよび／またはNHP産物、またはそれを発現し
ている細胞の精製された調製物を利用する、NHP発現および／またはNHP産物活性
をモジュレートする（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用す
る）化合物の同定方法に関する。そのような化合物は生物学的障害または平衡異
常と関連した多様な症状のいずれかを治療するための治療薬として使用すること
ができる。

【００１０】４．配列表および図面の説明 配列表は、開示したNHPポリヌクレオチドによりコードされる14のリポキシゲ
ナーゼ様ORFの配列（配列番号１、３、５、７、９、11、13、15、17、19、21、2
3、25、27、および29）、ならびにそれらによりコードされるアミノ酸配列（配
列番号２、４、６、８、10、12、14、16、18、20、22、24、26、および28）を提
供する。

【００１１】５．詳細な説明 リポキシゲナーゼは脂質を酸化または酸素添加してロイコトリエンを生成する
。合成されるロイコトリエンに応じて、さまざまな生物学的機能が影響される。
典型的には、ロイコトリエンがコグネイト受容体に結合して、生物学的作用（例
えば、シグナル伝達など）を誘導する。リポキシゲナーゼ活性を妨げると、最終
的に、ロイコトリエン生成と下流のロイコトリエン介在プロセスが生じる。これ
とは別に、リポキシゲナーゼ活性をin vivoで促進させると、対応する生物学的
プロセスの作用／活性レベルが高まることがある。動物と植物のどちらにも種々
の細胞および組織において多様なリポキシゲナーゼ活性が認められる。リポキシ
ゲナーゼの主要な３つのタイプとして、5-、12-および15-リポキシゲナーゼがあ
り、それぞれのタイプのリポキシゲナーゼはそれらが発現される組織または細胞
に応じて特別な形態をとることができる。

【００１２】 5-、12-および15-リポキシゲナーゼ、ならびにそれらが生成するロイコトリエ
ンはいろいろな疾患および障害に関係している。ロイコトリエンが炎症反応をモ
ジュレートし得ることを考えると、それらは喘息、眼の疾患、アナフィラキシー
、肺疾患、血液疾患、感染症、肉芽腫症、膿瘍、膵炎、前立腺炎、肝炎、アテロ
ーム性動脈硬化症、心臓病、移植片拒絶反応、血栓症、再狭窄、潰瘍、腎臓病、
高血圧症、皮膚病、痙攣、自己免疫疾患（狼瘡、強皮症、クローン病、慢性関節
リウマチなど）、肉芽腫症、高増殖性疾患、癌、吐気、頭痛、転移、炎症性腸疾
患、アレルギー、癌、関節炎、湿疹、メラノーマ、紅斑、アクネ、乾癬、帯状疱
疹、感染症、および糖尿病を含むがこれらに限らない広範囲の哺乳動物疾患と関
連している。したがって、本発明の一つの実施形態は、開示した１以上のリポキ
シゲナーゼ様遺伝子、タンパク質、またはその新規な一部分を使用することを含
む、１以上の上記疾患および障害の治療に有用な化合物を同定するための方法で
ある。

【００１３】 リポキシゲナーゼの生物学的重要性を考えて、該タンパク質をコードする遺伝
子（およびそれによりコードされるタンパク質ならびにその阻害剤）は科学的／
商業的探索が熱心に行なわれてきた（例えば、米国特許第5,036,105号、第5,162
,365号、第5,504,097号、第5,066,679号、第5,830,453号、第4,761,403号、第5,
589,506号、第5,026,729号、および第5,861,268号を参照のこと。これら全ての
特許を参考として本明細書中に含めるものとする）。

【００１４】 ここに開示したNHPは以前に開示されたヒトリポキシゲナーゼと顕著な類似性
を有する。RT-PCRを用いた発現実験により、NHP転写産物は特に神経組織（すな
わち、脳、脊髄など）、皮膚、精巣、前立腺、副腎、子宮頸部、唾液腺、膵臓、
心臓、リンパ球様細胞（リンパ節、脾臓、胸腺）、および乳腺において検出され
る。ノーザン分析からは、主要なシグナルが精巣に認められ、さらに、それほど
顕著ではないものの、より長い転写産物が精巣、リンパ節、および脊髄において
検出できる。NHPコード領域の全長cDNA（5'および3'延長部を含む）をヒト脳cDN
Aライブラリー(Edge BioSystems, Gaithersburg, MD)から単離して、その配列（
配列番号29）を決定した。開示したNHPの可能性のあるマウス・オーソログ体は
主として皮膚において発現されている(Kinzigら, 1999, Genomics 58:158-164)
。

【００１５】 本発明は、開示したNHPヌクレオチド、NHPおよびペプチド、ならびにNHPに結
合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体またはその結合フラグメント、ドメ
イン、もしくは融合タンパク質、あるいはそれから誘導される抗イディオタイプ
変異体、結合活性もしくは発現を阻害する他のアンタゴニスト、またはNHP活性
を活性化するかもしくはNHP発現を促進するアゴニストを、疾患の診断および／
または治療において使用することを包含する。

【００１６】 特に、以下の小節に記載する本発明は、NHPの機能性ドメインに対応するNHPポ
リペプチドもしくはペプチド、突然変異型、切断型もしくは欠失型のNHP（例え
ば、１以上の機能性ドメインまたはその一部を欠失しているNHP）、NHP融合タン
パク質（例えば、免疫グロブリンの定常領域、すなわちIgFc、のような無関係の
タンパク質またはペプチドに融合されたNHPまたはNHPの機能性ドメイン）、その
ような産物をコードするヌクレオチド配列、およびそのようなNHP産物を産生す
ることができる宿主細胞発現系を包含する。

【００１７】 本発明はまた、抗体および抗イディオタイプ抗体（Fabフラグメントを含む）
、NHPのアンタゴニストおよびアゴニスト、ならびにNHP遺伝子の発現を抑制する
化合物もしくはヌクレオチド構築物（転写因子インヒビター、アンチセンスおよ
びリボザイム分子、または遺伝子もしくは調節配列置換構築物）、またはNHPの
発現を促進する化合物もしくはヌクレオチド構築物（例えば、NHPコード配列が
プロモーターやプロモーター／エンハンサーなどの発現制御エレメントと機能的
に結合されている発現構築物）を包含する。さらに、本発明は、NHP（またはそ
の突然変異体）を発現するように、または内因性NHP遺伝子の動物相同体の発現
を抑制するつまり「ノックアウト」するように遺伝子操作された宿主細胞および
動物に関する。

【００１８】 NHPまたはペプチド、NHP融合タンパク質、NHPヌクレオチド配列、抗体、アン
タゴニストおよびアゴニストは、疾患の診断のために突然変異NHPまたは不適切
に発現されたNHPを検出するのに有用でありうる。NHPタンパク質またはペプチド
、NHP融合タンパク質、NHPヌクレオチド配列、宿主細胞発現系、抗体、アンタゴ
ニスト、アゴニスト、ならびに遺伝子操作した細胞および動物は、体内のNHPの
正常機能を乱す症候的または表現型的症状を治療するのに有効な薬物のスクリー
ニング（またはコンビナトリアルライブラリーのハイスループットスクリーニン
グ）に使用することができる。

【００１９】 遺伝子操作した宿主細胞および／または動物の使用は、そのような系がNHPと
相互作用する化合物の同定を可能にするだけでなく、NHPの生物学的重要性に関
する情報をも提供するという点で有利である。

【００２０】 最後に、NHP産物（特に、NHPに対応するペプチドのような可溶性誘導体）、お
よびNHP融合タンパク質産物（例えば、NHP-Ig融合タンパク質、すなわちNHPまた
はNHPドメインとIgFcとの融合体）、抗体および抗イディオタイプ抗体（Fabフラ
グメントを含む）、アンタゴニストまたはアゴニスト（NHP関連ロイコトリエン
経路の下流標的に作用しうるシグナル伝達をモジュレートする化合物を含む）は
、疾患または障害を直接治療するために使用することができる。

【００２１】 そのようなNHP産物をコードするヌクレオチド構築物は宿主細胞に送達され、
その後該細胞はin vivoでNHP産物を発現する。これらの遺伝子操作された細胞は
体内で「バイオリアクター」として働き、生体にNHP、NHPペプチドまたはNHP融
合タンパク質を連続的に供給し続ける。また、機能性NHPまたは突然変異NHPをコ
ードするヌクレオチド構築物、ならびにアンチセンスおよびリボザイム分子は、
NHP発現をモジュレートするための「遺伝子治療」法においても使用することが
できる。したがって、本発明は生物学的障害を治療するための医薬組成物および
方法をも包含する。

【００２２】 本発明のさまざまな態様について、以下の小節で詳しく説明する。

【００２３】5.1. NHPポリヌクレオチド 開示したNHPに対応するcDNA配列（配列番号１、３、５、７、９、11、13、15
、17、19、21、23、25、27、および29）および推定上のアミノ酸配列（配列番号
２、４、６、８、10、12、14、16、18、20、22、24、26、および28）を配列表に
示す。NHP ORFは、ヒトジーントラップ配列タグより作製したプローブおよび／
またはプライマーを用いて、ヒト精巣および脳のcDNAライブラリーから得られた
。

【００２４】 本発明のNHP配列には、(a) 配列表に示したヒトDNA配列が含まれ、さらに高度
にストリンジェントな条件（例えば、フィルターに結合したDNAへの、0.5M NaHP
O₄、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA中65℃でのハイブリダイゼーシ
ョン、および0.1xSSC/0.1% SDS中68℃での洗浄；Ausubel F.M.ら編, 1989, Curr
ent Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates,
Inc., and John Wiley & sons, Inc., New York, p.2.10.3）下で配列表に示し
たDNA配列の相補体にハイブリダイズし、かつ機能的に等価の遺伝子産物をコー
ドする、連続した機能性NHPをコードするあらゆるヌクレオチド配列が含まれる
。さらに、中程度にストリンジェントな条件（例えば、0.2xSSC/0.1% SDS中42℃
にて洗浄；Ausubelら, 1989, 前掲）下で配列表に示したアミノ酸配列をコード
しかつ発現するDNA配列の相補体にハイブリダイズし、しかも機能的に等価のNHP
産物をコードするあらゆるヌクレオチド配列が含まれる。NHPの機能的等価物と
しては、他の生物種に存在する天然のNHPと、天然のものまたは遺伝子操作した
ものに関わりなく突然変異NHPとが含まれる。本発明はまた、開示した配列の縮
重変異体を含む。

【００２５】 本発明はまた、開示したNHPヌクレオチド配列にハイブリダイズする（それゆ
えに、該ヌクレオチド配列の相補体である）核酸分子、好ましくはDNA分子を含
む。そのようなハイブリダイゼーション条件は、上記した高度のまたはそれほど
高度でないストリンジェント条件でありうる。核酸分子がデオキシオリゴヌクレ
オチド（DNAオリゴ）である場合、そのような分子（特に、本配列表に最初に開
示した配列の連続した領域を含む、長さが約16〜100塩基、約20〜80塩基、もし
くは約34〜45塩基のもの、またはそこに示されるサイズを任意に変更もしくは組
合せたもの）をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と共に用いて、ライブラリーのスク
リーニング、クローンの単離、クローニング用および配列決定用の鋳型の作製な
どを行なうことができる。

【００２６】 あるいはまた、オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして
単独でまたはチップ形式で使用することができる。例えば、開示したNHP配列の
全部または一部を表すために、一連の開示したNHPオリゴヌクレオチド配列また
はその相補体が用いられる。典型的には、約16〜40（またはこの範囲のいずれか
の整数）ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが互いと部分的に重複していても
、かつ／また、重複しないオリゴヌクレオチドを用いてNHP配列を表してもよい
。したがって、開示したNHPポリヌクレオチド配列は、典型的には、本配列表に
最初に開示される少なくとも18ヌクレオチド長、好ましくは約25ヌクレオチド長
の少なくとも約２または３個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含むだろう。そ
のようなオリゴヌクレオチド配列は配列表に示した配列内に存在する任意のヌク
レオチドで始まり、開示した配列と向かい合ったセンス（5'から3'）方向または
アンチセンス方向のいずれかで進行する。オリゴヌクレオチドプローブに関して
、高度にストリンジェントな条件とは、例えば、6xSSC/0.05% ピロリン酸ナトリ
ウム中37℃（14塩基のオリゴの場合）、48℃（17塩基のオリゴの場合）、55℃（
20塩基のオリゴの場合）、および60℃（23塩基のオリゴの場合）で洗浄すること
である。これらの核酸分子はNHP遺伝子のアンチセンス分子をコードするか、ま
たは該分子として作用することができ、例えば、NHP遺伝子の調節において（NHP
遺伝子の核酸配列の増幅反応においてアンチセンスプライマーとして）有用であ
る。NHP遺伝子の調節に関して、そのような技術は生物学的機能を調節するため
に用いられる。例えば、リポキシゲナーゼmRNAは、赤血球細胞において転写産物
の3'非翻訳領域(UTR)中の分化制御エレメントにより翻訳的に「抑制」(silenced
)され得ることが報告されている(Ostareckら, 1997, Cell, 89:597-606)。さら
に、そのような配列はリボザイムおよび／または三重らせん配列の一部として使
用することができ、またNHP遺伝子の調節にも有用である。

【００２７】 リポキシゲナーゼのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修
飾塩基部分を含んでいてもよく、かかる修飾塩基は、5-フルオロウラシル、5-ブ
ロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサン
チン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カル
ボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル
ウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-
イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチル
グアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチル
シトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5
-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メ
トキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソ
ペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン(wybutoxos
ine)、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウ
ラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オ
キシ酢酸メチルエステル、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カル
ボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンを含む（が、こ
れらに限らない）群から選択される。

【００２８】 また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖部分を含
んでいてもよく、かかる修飾糖はアラビノース、2-フルオロアラビノース、キシ
リロース、およびヘキソースを含む（が、これらに限らない）群から選択される
。

【００２９】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくと
も１個の修飾ホスフェート骨格を含んでいてもよく、かかる修飾ホスフェートは
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホス
ホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホ
トリエステル、およびそのホルムアセタールまたは類似体からなる群より選択さ
れる。

【００３０】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα-アノマ
ーオリゴヌクレオチドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは相補的RNAと特
定の二本鎖ハイブリッドを形成し、該ハイブリッドでは、通常のβ-ユニットと
は逆に、鎖が互いに平行になる(Gautierら, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6
641)。該オリゴヌクレオチドは2'-O-メチルリボヌクレオチド(Inoueら, 1987, N
ucl. Acids Res. 15:6131-6148)、またはキメラRNA-DNA類似体(Inoueら, 1987,
FEBS Lett. 215:327-330)である。

【００３１】 本発明のオリゴヌクレオチドは当技術分野で公知の標準方法により合成するこ
とができ、例えば、自動DNA合成機（Biosearch社、Applied Biosystems社などか
ら販売されているもの）を使って合成する。例として、ホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドは、Steinら(1988, Nucl. Acids Res. 16:3209)の方法で合成で
き、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、CPG(controlled pore glass)ポ
リマー支持体(Sarinら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451)
などを使って調製できる。

【００３２】 低いストリンジェント条件は、当業者によく知られているが、ライブラリーお
よび標識配列の起源となる特定の生物に応じて予測可能に変化する。そのような
条件に関する指針については、例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning,
A Laboratory Manual (およびその定期的最新版), Cold Spring Harbor Press,
N.Y.; およびAusubelら, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Gr
een Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.を参照されたい。

【００３３】 あるいは、適切に標識したNHPヌクレオチドプローブを用いて、適度にストリ
ンジェントな条件によりまたはPCRによりヒトゲノムライブラリーをスクリーニ
ングすることができる。ヒトゲノムクローンの同定および特徴付けは、多型を同
定し、所定の遺伝子座／対立遺伝子のゲノム構造を決定し、診断試験をデザイン
するのに役立つ。例えば、ヒト遺伝子のイントロン／エキソン境界に隣接した領
域に由来する配列を用いて、エキソン、イントロン、スプライス部位（例えば、
スプライス受容および／または供与部位）などにある突然変異を検出するための
増幅アッセイで使用するプライマーを設計し、診断やファーマコゲノミクス(pha
rmacogenomics)において利用することができる。

【００３４】 さらに、本明細書に開示したNHP産物内のアミノ酸配列に基づいて設計された
２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いてPCRを行なうことによ
り、関心のある生物の核酸からNHP遺伝子相同体を単離することができる。この
反応のための鋳型は全RNAでも、mRNAでも、かつ／また、NHP遺伝子の対立遺伝子
を発現することが知られたまたは予想された、例えばヒトまたは非ヒト細胞系も
しくは組織（例：絨毛膜）から調製したmRNAの逆転写により得られるcDNAでもよ
い。

【００３５】 増幅された配列が目的のNHP遺伝子の配列に相当することを確かめるために、P
CR産物のサブクローニングと配列決定を行なう。次に、PCR断片を用いて、さま
ざまな方法により全長cDNAクローンを単離することができる。例えば、増幅断片
を標識し、これを用いてバクテリオファージcDNAライブラリーのようなcDNAライ
ブラリーをスクリーニングする。あるいはまた、標識断片を用いて、ゲノムライ
ブラリーのスクリーニングによりゲノムクローンを単離することもできる。

【００３６】 PCR法は全長cDNA配列を単離するにも使用できる。例えば、適当な細胞または
組織の供給源（すなわち、NHP遺伝子を発現することが知られたまたは予想され
た細胞または組織、例えば、皮膚、精巣、脳組織など）から標準的な手法に従っ
てRNAを単離する。このRNAに対して、第一鎖合成を開始させるために増幅断片の
最も5'末端側に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、逆転写(RT)反
応を実施する。次に、得られたRNA/DNAハイブリッドを標準的なターミナルトラ
ンスフェラーゼ反応により「テイル付加」し(tailed)、ハイブリッドをRNアーゼ
Hで消化し、その後相補的プライマーを用いて第二鎖合成を開始させる。こうし
て、増幅断片の上流のcDNA配列を容易に単離することができる。利用可能なクロ
ーニング戦略の総説については、例えば、Sambrookら, 1989(前掲)を参照された
い。

【００３７】 突然変異NHP遺伝子のcDNAは、例えばPCRを使って、単離することができる。こ
の場合、第一cDNA鎖を合成するには、突然変異NHP対立遺伝子をもつと推定され
る個体において発現されることが知られたまたは予想された組織から単離したmR
NAに、オリゴdTオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、逆転写酵素を使って
新たな鎖を伸長させる。次に、cDNAの第二鎖を、正常遺伝子の5'末端に特異的に
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使って合成する。これら２つのプライ
マーを用いてPCRにより産物を増幅し、場合により適当なベクターにクローニン
グし、当業者には公知の方法でDNA配列解析にかける。突然変異NHP対立遺伝子の
DNA配列を、正常なNHP対立遺伝子のDNA配列と比較することにより、突然変異NHP
遺伝子産物の機能の低下または変化に起因する突然変異を確認することができる
。

【００３８】 あるいはまた、突然変異NHP対立遺伝子をもつと予想されたまたは知られた個
体からのDNAを用いてゲノムライブラリーを構築するか、突然変異NHP対立遺伝子
を発現することが知られたまたは予想された組織からのRNAを用いてcDNAライブ
ラリーを構築する。次に、正常なNHP遺伝子またはその適当な断片を標識し、プ
ローブとして使用して、そのようなライブラリー中の対応する突然変異NHP対立
遺伝子を同定する。その後、突然変異NHP遺伝子配列を含むクローンを精製し、
当業者には公知の方法により配列解析にかける。

【００３９】 さらに、例えば、突然変異NHP対立遺伝子をもつと予想されたまたは知られた
個体において該突然変異対立遺伝子を発現することが分かっているまたは疑われ
る組織より単離されたRNAから合成したcDNAを用いて、発現ライブラリーを構築
することができる。この方法では、以下の第5.3節に記載するように、推定上の
突然変異組織により作られる遺伝子産物を発現させ、正常NHP産物に対する抗体
と共に標準的な抗体スクリーニング法を用いてスクリーニングする（スクリーニ
ング法に関しては、例えば、Harlow, E. および Lane 編, 1988, "Antibodies:
A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor を参
照されたい）。

【００４０】 さらに、スクリーニングは、AP-NHPまたはNHP-AP融合タンパク質のような標識
したNHP融合タンパク質を用いてスクリーニングすることで達成される。NHP突然
変異が（例えば、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異の結果として）機能
の変化した遺伝子産物を発現する場合は、NHPに対する抗体のポリクローナルセ
ットが突然変異NHP遺伝子産物とも交差反応すると考えられる。そのような標識
抗体との反応により検出されたライブラリークローンを精製して、当業者には公
知の方法により配列解析を行なうことができる。

【００４１】 NHP関連配列（ヌクレオチドとアミノ酸の両方）の追加のスクリーニング法は
、開示した配列およびその誘導体を記憶させ、検索し、分析する電子的方法を含
む。したがって、本発明の更なる実施形態は、配列表に最初に開示した配列のあ
らゆる連続したストレッチの表示を含むコンピュータ読取可能電子データ記憶媒
体、または該媒体を組み込んだシステムを含む。

【００４２】 本発明はまた、突然変異NHP、NHPのペプチド断片、切断型NHP、およびNHP融合
タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。これらには、限定するも
のではないが、以下の第5.2節に記載する突然変異NHP；NHPの１以上のドメイン
またはこれらのドメインの一部に対応するポリペプチドまたはペプチド；１以上
のドメインが欠失された切断型NHP、または非機能性の切断型NHP；をコードする
ヌクレオチド配列が含まれる。融合タンパク質をコードするヌクレオチドとして
は、全長NHP配列、切断型NHP、または無関係のタンパク質もしくはペプチドに融
合されたNHPのペプチド断片をコードするヌクレオチド、例えば、血流中の融合
タンパク質（例えば、NHP-Ig）の安定性および半減期を増加するIg Fcドメイン
に、またはマーカーとして使用できる蛍光タンパク質または発光タンパク質のよ
うな酵素に融合されたNHPドメインが挙げられるが、これらに限らない。

【００４３】 本発明はまた、(a) 前記NHPコード配列および／またはそれらの相補体（すな
わち、アンチセンス）のいずれかを含むDNAベクター、(b) コード配列の発現を
指令する調節エレメントと機能的に連結された前記NHPコード配列のいずれかを
含むDNA発現ベクター、(c) 宿主細胞におけるコード配列の発現を指令する調節
エレメントと機能的に連結された前記NHPコード配列のいずれかを含む遺伝子操
作された宿主細胞、および(d) 外因的に導入された調節エレメントの制御（すな
わち、遺伝子活性化）下で内因性NHP遺伝子を発現する遺伝子操作された宿主細
胞を包含する。本明細書中で用いる調節エレメントには、誘導および非誘導プロ
モーター、エンハンサー、オペレーター、および発現を調節する当業者に公知の
他のエレメントが含まれ、これらに限定されない。そのような調節エレメントと
しては、サイトメガロウイルスのhCMV前初期遺伝子、調節可能なウイルスプロモ
ーター（特に、レトロウイルスのLTRプロモーター）、SV40アデノウイルスの初
期または後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、ファージλの主要な
オペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホス
ホグリセリン酸キナーゼ(PGK)のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモータ
ー、および酵母のα接合因子のプロモーターが挙げられるが、これらに限らない
。

【００４４】5.2. NHPポリペプチド NHP、NHPのポリペプチド、ペプチド断片、突然変異型、切断型、もしくは欠失
型のNHP、および／またはNHP融合タンパク質はいろいろな用途のために製造され
る。かかる用途としては、抗体の作製、診断アッセイ用の試薬、NHPに関連した
他の細胞遺伝子産物の同定、精神的、生物学的または医学的障害および疾患の治
療処置に有用な薬剤として使用できる化合物のスクリーニングアッセイにおける
試薬があるが、これらに限らない。

【００４５】 配列表には開示したNHP遺伝子によりコードされるアミノ酸配列が示される。N
HPは翻訳開始部位と一致するDNA配列との関係でイニシエーター・メチオニンを
有する。ここに示した配列データは、NHPの別の形態（例えば、選択的スプライ
シングから生じる変異体、プロモーターなど）が存在しうる（組織特異的であっ
てもなくてもよい）ことを示している。

【００４６】 本発明のNHPアミノ酸配列は配列表に示したアミノ酸配列ならびにその類似体
および誘導体を含む。さらに、他の生物種からの対応するNHP相同体も本発明に
含まれる。実際、配列表に示したアミノ酸配列の全部またはいずれかの新規部分
をコードする新規ポリヌクレオチド配列がどれも本発明の範囲内に含まれるのと
同様に、上記の第5.1節に記載したNHPヌクレオチド配列によりコードされるNHP
タンパク質はどれも本発明の範囲内に含まれる。遺伝子コードの縮重性について
はよく知られており、したがって、配列表に示した各アミノ酸は公知の核酸「ト
リプレット」コドン、多くの場合には、アミノ酸をコードしうるコドンを包括的
に代表するものである。こうして、本明細書中で意図される配列表に示したアミ
ノ酸配列は、遺伝子コードと合わせて考えるとき（例えば、参考として本明細書
に組み込まれる"Molecular Cell Biology", 1986, J. Darnellら編, Scientific
American Books, New York, NY の109頁の表4-1を参照のこと）、そのようなア
ミノ酸配列をコードしうる核酸配列の種々の順列・組合せをすべて包括的に代表
するものである。

【００４７】 本発明はまた、いくつかの判断基準のどれかによって判定したとき、第5.1節
に記載したヌクレオチド配列によりコードされるNHPと機能的に等しいタンパク
質を包含する。かかる判断基準としては、リポキシゲナーゼ活性を媒介する能力
、同一のまたは相補的なロイコトリエン経路をもたらす能力、細胞代謝（例えば
、イオンフラックス、チロシンのリン酸化など）、またはNHP等価物を適切な細
胞型で同様に発現させるまたは突然変異させる場合の表現型の変化（例えば、生
化学的、生物物理的、または明白な表現型の改善、予防または遅延）が含まれる
が、これらに限らない。そのような機能的に等価のNHPタンパク質には、第5.1節
に記載したNHPヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列内にサイレン
トな変化をもたらす（それゆえに、機能的に等価の遺伝子産物をもたらす）アミ
ノ酸残基の付加または置換を有するものが含まれるが、これらに限らない。アミ
ノ酸の置換は、関係するアミノ酸残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、
および／または両親媒性に基づいて行なわれる。例えば、非極性（疎水性）アミ
ノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルア
ラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、
グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、および
グルタミンが含まれ、正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシ
ン、およびヒスチジンが含まれ；そして、負に荷電した（酸性）アミノ酸には、
アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。

【００４８】 NHP DNAに対して（当業者に公知のランダム突然変異誘発法を用いて）ランダ
ム突然変異を起こし、得られた突然変異NHPの活性を試験することもできるが、
（当業者に公知の部位特異的突然変異誘発法を用いて）NHPコード配列の部位特
異的突然変異を起こさせて、機能の増加（例えば、より高いリポキシゲナーゼ活
性）、機能の低下、および／または生理学的半減期の増加を示す突然変異NHPを
作製することができる。そのような分析の一つの出発点は、異なる生物種間で保
存されているアミノ酸配列モチーフを同定することを目的として、開示したヒト
配列と、例えば他の哺乳動物由来の、対応する遺伝子／タンパク質配列とのアラ
イメントを行なうことである。機能、シグナル伝達能、またはその両方を変える
ために、いろいろな位置で非保存的変化を導入することができる。また、機能の
変更を望む場合は、保存された領域（すなわち、同一のアミノ酸）の欠失または
非保存的変化を導入することができる。

【００４９】 所定の宿主細胞における発現、スケールアップなどにうまく適合するNHPを得
るために、NHPコード配列に対して他の突然変異を起こさせることもできる。例
えば、ジスルフィド橋を除くためにシステイン残基を欠失するか、他のアミノ酸
で置換することができる。また、例えば、高グリコシル化することが知られてい
る酵母宿主から容易に回収および精製される均質な産物の発現を達成するために
、N-結合グリコシル化部位を変更または除去することができる。そのためには、
グリコシル化認識配列(N-X-SまたはN-X-T)のいずれか１つまたはそれ以上の第１
または第３アミノ酸位置の一方または両方での種々のアミノ酸置換、および／ま
たはグリコシル化認識配列のいずれか１つまたはそれ以上の第２位置でのアミノ
酸欠失が変更したトリペプチド配列でのNHPのグリコシル化を防止するだろう（
例えば、Miyajimaら, 1986, EMBO J. 5(6):1193-1197を参照されたい）。

【００５０】 さらに、NHPの１以上のドメインに対応するペプチド、切断型または欠失型のN
HP、ならびに全長NHP、NHPペプチドまたは切断型NHPが関係のないタンパク質に
融合されている融合タンパク質は本発明の範囲内であり、ここに開示したNHPヌ
クレオチドおよびNHPアミノ酸配列に基づいて設計することができる。そのよう
な融合タンパク質としては、NHPタンパク質またはペプチドを安定化してin vivo
半減期を長引かせるIgFc融合体；融合タンパク質を細胞膜に固着させる任意のア
ミノ酸配列への融合体；マーカー機能を提供する酵素、蛍光タンパク質または発
光タンパク質への融合体が挙げられるが、これらに限らない。

【００５１】 NHPおよびペプチドは化学的に合成することができる（例えば、Creighton, 19
83, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N
.Y.を参照）が、NHPから誘導される大きいポリペプチドおよび全長NHPは、NHP遺
伝子配列および／またはコード配列を含む核酸を発現させるための当分野で公知
の技術を用いて組換えDNA法により製造することが有利である。そのような方法
を用いて、第5.1節に記載したNHPヌクレオチド配列および適切な転写・翻訳調節
シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。こうした方法として、例
えば、in vitro組換えDNA法、合成法、およびin vivo遺伝子組換えが挙げられる
。例えば、Sambrookら, 1989 (前掲) およびAusubelら, 1989 (前掲) に記載さ
れる技法を参照されたい。例えば、組換えリポキシゲナーゼは（バキュロウイル
スを用いて）昆虫細胞でうまく生産され、ニッケルアフィニティークロマトグラ
フィーを使って精製された。あるいは、NHPヌクレオチド配列によりコードされ
る転写産物の全部または一部に対応するRNAは、例えば合成機を使って、化学合
成することもできる。例えば、参考としてその全体を本明細書に組み入れる"Oli
gonucleotide Synthesis", 1984, Gait, M.J.編, IRL Press, Oxford に記載さ
れる技法を参照されたい。

【００５２】 本発明のNHPヌクレオチド配列を発現させるために、いろいろな宿主−発現ベ
クター系を利用することができる。NHPペプチドまたはポリペプチドが可溶性の
誘導体である場合、そのペプチドまたはポリペプチドは培養物から、あるいはNH
Pペプチドまたはポリペプチドが分泌されない場合は宿主細胞から、そしてNHPペ
プチドまたはポリペプチドが細胞から分泌されるように遺伝子操作されている場
合には培地から回収することができる。しかし、そのような発現系には、NHPま
たはその機能性等価物をin situで、すなわち細胞膜に固着された状態で、発現
する遺伝子操作された宿主細胞も含まれる。ある研究により、１つのタイプの15
S-リポキシゲナーゼタンパク質の大部分は典型的には可溶性細胞質画分中に見い
だされるが、大部分のリポキシゲナーゼ活性は膜画分中に認められることが示さ
れた。

【００５３】 そのような発現系からのNHPの精製または濃縮は、適当な界面活性剤と脂質ミ
セルと当業者に公知の方法を用いて実施することができる。しかしながら、NHP
の構造的および機能的特性を保持することのみならず、例えば薬物スクリーニン
グアッセイにおいて、生物学的活性を評価することが重要である場合には、遺伝
子操作された宿主細胞それ自体を使用してもよい。

【００５４】 本発明の目的のために使用できる発現系は、NHPヌクレオチド配列を含む組換
えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形
質転換された細菌（例えば、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis)）；NHPヌ
クレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、
サッカロミセス(Saccharomyces)、ピキア(Pichia)）；NHPヌクレオチド配列を含
む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫
細胞系；NHPヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カ
リフラワーモザイクウイルス、CaMV; タバコモザイクウイルス、TMV）を感染さ
せた、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転
換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば
、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルス由来のプロモータ
ー（例えば、アデノウイルスの後期プロモーター、ワクシニアウイルスの7.5Kプ
ロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、COS
、CHO、BHK、293、3T3）があるが、これらに限らない。

【００５５】 細胞系においては、発現されるNHP産物の意図した用途に応じて、いくつかの
発現ベクターを選択することが有利である。例えば、NHP活性を抑制または促進
する分子を同定するために、NHPを含む医薬組成物を調製するために、またはNHP
に対する抗体を生起させるために、そのようなタンパク質を大量に生産しようと
する場合は、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベル発現を指令するベ
クターが望ましい。かかるベクターとして、融合タンパク質が産生されるように
、NHPコード配列がlacZコード領域と読み枠を合わせてベクター内に個々に連結
される大腸菌発現ベクターpUR278 (Rutherら, 1983, EMBO J. 2:1791)；pINベク
ター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke &
Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509)などが挙げられるが、これら
に限らない。pGEXベクターも外来性のポリペプチドをグルタチオンS-トランスフ
ェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させるために使用することができ
る。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン-アガロ
ースビーズへの吸着と、これに続く遊離のグルタチオンの存在下での溶出により
、溶解した細胞から簡単に精製される。pGEXベクターはトロンビンまたは第Xa因
子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計されているため、クローン化された標
的遺伝子産物をGST部分から解離させることができる。

【００５６】 昆虫細胞系においては、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)
が外来遺伝子の発現ベクターとして用いられる。このウイルスはSpodoptera fru
giperda細胞内で増殖する。NHP遺伝子のコード配列を該ウイルスの非必須領域（
例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローン化し、AcNPVプロモーター（例
えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。NHP遺伝子の
コード配列がうまく挿入されると、ポリヘドリン遺伝子の不活性化が生じ、非内
蔵組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされたタンパク
質性外被を欠くウイルス）が産生される。その後、これらの組換えウイルスをSp
odoptera frugiperda細胞に感染させると、そこで挿入遺伝子が発現される（例
えば、Smithら, 1983, J. Virol. 46:584; Smith, 米国特許第4,215,051号を参
照されたい）。

【００５７】 哺乳動物宿主細胞においては、いくつかのウイルス系発現ベクターが利用され
る。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合は、目的のNHPヌクレオチ
ド配列をアデノウイルスの転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーターと三
部分リーダー配列に連結する。次に、このキメラ遺伝子をin vitroまたはin viv
o組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域
（例えば、領域E1またはE3）に挿入すると、感染細胞内で生存でき、かつNHP産
物を発現する能力がある組換えウイルスが得られる（例えば、Logan & Shenk, 1
984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照されたい）。挿入したNH
Pヌクレオチド配列の効率のよい翻訳には、特異的な開始シグナルも必要とされ
る。こうしたシグナルにはATG開始コドンと隣接配列が含まれる。全NHP遺伝子ま
たはcDNAをそれ自身の開始コドンと隣接配列と共に適切な発現ベクターに挿入す
る場合には、追加の翻訳調節シグナルを全く必要としない。しかし、NHPコード
配列の一部分のみを挿入する場合は、おそらくATG開始コドンを含む外因性の翻
訳調節シグナルを供給しなければならない。さらに、挿入物全体の翻訳を確実な
ものとするには、開始コドンを目的のコード配列の読み枠に合わせて配置する必
要がある。これらの外因性翻訳調節シグナルと開始コドンは、天然と合成の両方
の、さまざまな起源に由来するものでありうる。適切な転写エンハンサーエレメ
ント、転写ターミネーターなどを含めることによって発現効率を高めることがで
きる（Bittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544を参照されたい）。

【００５８】 さらに、宿主細胞株としては、挿入された配列の発現をモジュレートするもの
、または特定の望ましい形で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングするものを
選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾（例えばグリコシル化
）およびプロセッシング（例えば切断）は、該タンパク質の機能にとって重要な
ものであり得る。それぞれに異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の
翻訳後プロセッシングおよび修飾のための特徴的且つ特異的なメカニズムを有す
る。発現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを行うために
、適当な細胞系または宿主系を選択することができる。そのために、一次転写物
の適切なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細
胞機構を持つ真核生物宿主細胞を用いることができる。このような哺乳動物宿主
細胞には、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38、および特にヒ
ト細胞系が含まれるが、これらに限定されない。

【００５９】 組換えタンパク質の長期間にわたる高収率産生のためには、安定な発現が好ま
しい。例えば、上記記載のNHP配列を安定に発現する細胞系を遺伝子操作により
作製することができる。ウイルス複製起源を含む発現ベクターを用いるのではな
く、宿主細胞を、適当な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサ
ー配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位等）により制御されるDNAおよび選
択マーカーを用いて形質転換することができる。外来DNAの導入後、遺伝子操作
した細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させてから、選択培地に切り替えること
ができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、その選択に対する耐性を付与
し、該プラスミドを細胞の染色体中に安定に組み込ませて、該細胞にフォーカス
を形成させる。次にこのフォーカスをクローニングし、細胞系へと増殖させるこ
とができる。この方法は、NHP産物を発現する細胞系を遺伝子操作により作製す
るために有利に使用することができる。このように遺伝子操作された細胞系は、
NHP産物の内因性の活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評価にお
いて特に有用であり得る。

【００６０】 多くの選択系を用いることができる。例えば単純ヘルペスウイルスのチミジン
キナーゼ（Wiglerら, 1997, Cell 11:223）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 48: 2026）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy
ら, 1980, Cell 22: 817）の遺伝子（これらはそれぞれ、tk^-、hgprt^-またはapr
t^-細胞において用いることができる）が挙げられるが、これらに限定されない。
また、代謝拮抗物質耐性を以下の遺伝子の選択のベースとして用いることができ
る：メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（Wiglerら, 1980, Natl. Ac
ad. Sci. USA 77:3567; O’Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:152
7）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt（Mulligan & Berg, 1981, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072）；アミノグリコシドG-418に対する耐性
を付与するneo（Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1）；およびハ
イグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Santerreら, 1984, Gene 30:147
）。

【００６１】 あるいは、発現される融合タンパク質に対して特異的な抗体を用いることによ
って、どのような融合タンパク質も容易に精製することができる。例えば、Jank
nechtらにより記載された系は、ヒト細胞系中で発現された非変性融合タンパク
質の容易な精製を可能とする（Janknechtら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 88: 8972-8976）。この系では、目的の遺伝子を、その遺伝子のオープンリー
ディングフレームが６個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳上融合
されるように、ワクシニア組換えプラスミド中にサブクローニングする。組換え
ワクシニアウイルスを感染させた細胞からの抽出物を、Ni²⁺-ニトリロ酢酸-アガ
ロースカラムに載せ、ヒスチジンのタグを付けたタンパク質を、イミダゾール含
有バッファーで選択的に溶出する。

【００６２】 NHP産物は、トランスジェニック動物中で発現させることもできる。虫、マウ
ス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロブタ、トリ、ヤギおよび非ヒ
ト霊長類（例えばヒヒ、サルおよびチンパンジーなど）を含むがこれらに限らな
い任意の種の動物を用いて、NHPトランスジェニック動物を作製してもよい。

【００６３】 当分野で公知である任意の技法を用いて、NHPトランスジーンを動物の体内に
導入し、トランスジェニック動物の創始者系列を作製することができる。このよ
うな技法には、前核微量注入法（Hoppe, P.C.およびWagner, T.E., 1989, 米国
特許第4,873,191号）、生殖系へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（Van der Put
tenら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152）、胚性幹細胞中に
おける遺伝子ターゲッティング（Thompsonら, 1989, Cell 56:313-321）、胚の
エレクトロポレーション（Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1803-1814）および
精子媒介性遺伝子導入（Lavitranoら, 1989, Cell 57: 717-723）等が含まれる
が、これらに限定されない。このような技法の概説については、Gordon, 1989,
Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229（本明細書中に全て参考
として組込まれる）を参照されたい。

【００６４】 本発明は、全細胞中にNHPトランスジーンを担持するトランスジェニック動物
だけでなく、全部ではなく一部の細胞中にトランスジーンを担持する動物（即ち
モザイク動物または体細胞トランスジェニック動物）も提供する。トランスジー
ンは、単一のトランスジーンとして、またはコンカテマー（例えば頭-頭タンデ
ムまたは頭-尾タンデム）として組み込むことができる。また、トランスジーン
は、例えばLaskoら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236の教示
に従って、特定の細胞型の中に選択的に導入して活性化させることもできる。こ
のような細胞型特異的活性化に必要な調節配列は、対象とする特定の細胞型によ
り決まっており、当業者には自明である。

【００６５】 NHP遺伝子トランスジーンを内在性NHP遺伝子の染色体部位の中に組み込みたい
場合は、遺伝子ターゲッティングが好ましい。簡単に述べると、このような技法
を用いる場合、染色体配列との相同組換えによって内在性NHP遺伝子のヌクレオ
チド配列中に組み込んでその機能を破壊する（即ち「ノックアウト動物」）ため
に、該内在性NHP遺伝子に相同な幾つかのヌクレオチド配列を含むベクターを設
計する。

【００６６】 また、トランスジーンを特定の細胞型の中に選択的に導入して、例えばGuら,
1994, Science, 265: 103-106の教示に従ってその細胞型の中でのみ内在性NHP遺
伝子を不活性化させることもできる。このような細胞型特異的不活性化に必要な
調節配列は、対象とする特定の細胞型によって決まっており、当業者には自明で
ある。

【００６７】 トランスジェニック動物を作製したら、標準的な技法を用いて組換えNHP遺伝
子の発現を分析することができる。最初のスクリーニングは、トランスジーンの
組込みが起こったか否かを評価するために動物組織を分析するためのサザンブロ
ット分析またはPCR技法によって行うことができる。また、その動物に由来する
組織サンプルのノーザンブロット分析、in situハイブリダイゼーション分析お
よびRT-PCR等の技法（ただしこれらに限定されない）を用いて、トランスジェニ
ック動物の組織中のトランスジーンのmRNA発現のレベルを評価することもできる
。また、NHPトランスジーン産物に対して特異的な抗体を用いて、NHP遺伝子を発
現する組織のサンプルを免疫細胞化学的に評価することもできる。

【００６８】5.3. NHPに対する抗体 NHPの１以上のエピトープ、NHPの保存的変異体のエピトープ、またはNHPのペ
プチド断片のエピトープを特異的に認識する抗体も、本発明に含まれる。このよ
うな抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAbs）、ヒト化もし
くはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F（ab’）₂フラグメント、Fab
発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Id）
抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これ
らに限定されない。

【００６９】 本発明の抗体は、例えば生物学的サンプル中のNHPの検出に使用することがで
き、従って、異常な量のNHPについて患者を検査することができる診断法または
予後判定法の一部として用いることができる。このような抗体は、例えばNHP遺
伝子産物の発現および/または活性に及ぼす試験化合物の影響の評価について以
下に記載する第5.5節に記載する化合物スクリーニング法と一緒に用いることも
できる。さらに、このような抗体は、例えば正常なおよび/または遺伝子操作し
たNHP発現細胞をこれらを患者に導入する前に評価するための遺伝子治療と一緒
に使用することができる。このような抗体はさらに、異常なNHP活性を阻害する
ための方法として使用することができる。従って、このような抗体、そのドメイ
ンまたはこれに由来するペプチドは、治療法の一部として使用することができる
。

【００７０】 抗体を産生するために、様々な宿主動物を、NHP、NHPペプチド（例えばNHPの
機能的ドメインに対応するもの）、切断型NHPポリペプチド（１以上のドメイン
が欠失したNHP）、NHPの機能的等価物、またはNHPの突然変異体を注入すること
によって、免疫することができる。このような宿主動物としては、ウサギ、マウ
ス、ヤギおよびラット等幾つかが挙げられる（ただしこれらに限定されない）。
免疫学的応答を増大させるために、宿主動物の種に応じて様々なアジュバントを
用いることができる。このようなアジュバントには、フロインドの（完全および
不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン
などの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性
乳剤、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBC
G（bacille Calmette-Guerin）やCorynebacterium parvumなどの潜在的に有用な
ヒトアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。ポリクローナル抗体は
、免疫した動物の血清に由来する抗体分子の不均一集団である。

【００７１】 特定の抗原に対する抗体の均一集団であるモノクローナル抗体は、培養中の連
続細胞系によって抗体分子を産生させる任意の技法によって得ることができる。
これらには、KohlerおよびMilsteinのハイブリドーマ技法（1975, Nature 256:4
95-497；および米国特許第4,376,110号）、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法（Kosb
orら, 1983, Immunology Today 4:72; Coleら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 80:2026-2030）およびEBV-ハイブリドーマ技法（Coleら, 1985, Monoclonal
Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）が含まれる
がこれらに限定されない。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含む
任意のイムノグロブリンクラスまたはそのサブクラスのものであってよい。本発
明のmAbを産生するハイブリドーマは、in vitroまたはin vivoで培養することが
できる。高力価のmAbのin vivo産生が現在好適な産生方法である。

【００７２】 さらに、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子に由来する遺伝子を、適当
な生物学的活性を有するヒト抗体分子に由来する遺伝子と接合することによる「
キメラ抗体」の産生のために開発された技法（Morrisonら, 1984, Proc. Natl.
Acad. Sci. 81:6851-6855；Neubergerら, 1984, Nature, 312:604-608；Takeda
ら, 1985, Nature, 314:452-454）を用いることができる。キメラ抗体とは、そ
れぞれに異なる部分が異なる動物種に由来している分子、例えば、マウスmAbに
由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する分子である。

【００７３】 あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載された技法（米国特許第4,946,778
号；Bird, 1988, Science 242:423-426；Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 85:5879-5883；およびWardら, 1989, Nature 334: 544-546）を、NHP遺
伝子産物に対する一本鎖抗体を産生するために応用することができる。一本鎖抗
体は、Fv領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントをアミノ酸橋によって
連結して一本鎖ポリペプチドとすることによって形成される。

【００７４】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技法によって作製す
ることができる。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消
化によって生成されるF(ab’)₂フラグメント、およびF(ab’)₂フラグメントのジ
スルフィド橋を還元することによって生成されるFabフラグメントが含まれるが
、これらに限定されない。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルFab
フラグメントの迅速且つ簡単な同定を可能とするために、Fab発現ライブラリー
を構築することができる（Huseら, 1989, Science, 246:1275-1281）。

【００７５】 次に、NHPに対する抗体を利用して、当業者に周知である技法を用いて所与のN
HPを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を作製することができる（例えばGreens
pan & Bona, 1993, FASEB J 7(5):437-444；およびNissinoff, 1991,J. Immunol
. 147(8):2429-2438を参照されたい）。例えば、NHPドメインに結合してそのコ
グネイト受容体へのNHPの結合を競合的に阻害する抗体を用いて、NHPを「模倣」
するがゆえに受容体に結合してこれを活性化または中和する抗イディオタイプを
作製することができる。このような抗イディオタイプ抗体、またはこのような抗
イディオタイプのFabフラグメントは、NHPシグナル伝達経路に影響を与える治療
的レジメにおいて用いることができる。

【００７６】5.4. NHPに関連する異常の診断 NHP機能に関連する障害の診断的および予後的評価、ならびにこのような障害
の疾病素質を有する被験者の同定のために、様々な方法を用いることができる。

【００７７】 このような方法は、例えば、第5.1節で記載したNHPヌクレオチド配列および第
5.3節で記載したNHP抗体等の試薬を利用することができる。特に、このような試
薬は、例えば（1）NHP遺伝子突然変異の存在の検出、または所与の表現型に関連
するNHP mRNAの過剰発現または過小発現の検出、（2）所与の表現型に関連する
過剰量のまたは過小量のNHP遺伝子産物の検出、ならびに（3）NHPにより媒介さ
れる任意の潜在的なシグナル伝達経路、代謝経路または異化経路における混乱ま
たは異常の検出に使用することができる。

【００７８】 本明細書中に記載される方法を実施するには、例えば、臨床現場等において炎
症性障害を示す患者を診断するために便利に用いることができる、本明細書中に
記載の少なくとも１つの特異的NHPヌクレオチド配列またはNHP抗体試薬を含む予
めパッケージングされた診断キットを用いる。

【００７９】 NHP突然変異の検出のためには、ゲノム核酸の出発源としてどのような有核細
胞を使用してもよい。NHP遺伝子発現またはNHP遺伝子産物の検出のためには、NH
P遺伝子を発現しているあらゆる細胞型または組織（例えば皮膚、精巣、または
脳細胞など）を用いることができる。

【００８０】 核酸ベースの検出法について、以下第5.4.1節で記載する。ペプチド検出法に
ついては、以下の第5.4.2節で記載する。

【００８１】5.4.1. NHPポリヌクレオチドの検出 NHP遺伝子における突然変異は、多くの技法を用いて検出することができる。
任意の有核細胞に由来する核酸を、このようなアッセイ法の出発点として使用す
ることができ、これは、当業者に周知である標準的な核酸調製手順に従って単離
することができる。

【００８２】 DNAを生物学的サンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおい
て用いて、点突然変異、挿入、欠失および染色体再配列等のNHP遺伝子構造に関
係する異常を検出することができる。このようなアッセイには、サザン分析、一
本鎖立体配置多型分析（SSCP）およびPCR分析が含まれるが、これらに限定され
ない。

【００８３】 NHP遺伝子特異的突然変異を検出するためのこのような診断方法は、サンプル
から得た（例えば患者サンプルまたは適当な細胞源に由来する）組換えDNA分子
、クローン化遺伝子またはこれらの縮重変異体を含む核酸を、例えば第5.1節で
記載した、組換えDNA分子、クローン化遺伝子またはこれらの縮重変異体を含む
１以上の標識した核酸試薬に、これらの試薬を所与のNHP遺伝子内の相補配列に
特異的にアニーリングさせるのに好都合な条件下で接触させて、インキュベート
することを含み得る。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは、少なくとも15〜
30ヌクレオチドである。インキュベートした後、核酸-NHPハイブリッドから、ア
ニーリングされていない全ての核酸を除去する。次に、ハイブリダイズした核酸
が存在する場合は、このような分子の存在を検出する。かかる検出スキームを用
いて、対象の細胞型または組織に由来する核酸を、固相支持体（膜など）、また
は例えばマイクロタイタープレートやポリスチレンビーズ等のプラスチック表面
に固定化することができる。この場合には、インキュベートを行った後に、第5.
1節に記載したタイプのアニーリングされていない標識核酸試薬が簡単に除去さ
れる。残りのアニーリングされた標識NHP核酸試薬の検出は、当業者に周知の標
準的な技法を用いて行う。該核酸試薬がアニーリングされたNHP遺伝子配列を、
正常なNHP遺伝子配列から予想されるアニーリングパターンと比較して、NHP遺伝
子突然変異が存在するか否かを決定することができる。

【００８４】 患者サンプルまたは他の適当な細胞源においてNHP遺伝子特異的核酸分子を検
出するための他の診断方法は、例えばPCR（Mullis, K.B., 1987、米国特許第4,6
83,202号に記載された実験的実施形態）によるこれらの増幅、続いて行われる、
当業者に周知の技法を用いた増幅分子の検出を含み得る。得られた増幅配列を、
増幅される核酸がNHP遺伝子の正常なコピーのみを含む場合に予想されるものと
比較して、NHP遺伝子の突然変異が存在するか否かを決定することができる。

【００８５】 さらに、周知の遺伝子型分類（genotyping）法を行って、NHP遺伝子突然変異
を保有する個体を同定することができる。このような技法は、例えば、使用する
特定の制限酵素の認識部位のうちの１つに配列変化を含む制限断片長多型（RFLP
）の使用を含む。

【００８６】 さらに、NHP遺伝子突然変異の同定に使用できる改良されたDNA多型分析方法は
、制限酵素部位間の様々な数の短いタンデム反復DNA配列の存在を利用したもの
が記載されている。例えば、Weber（米国特許第5,075,217号、本明細書中に参考
として全て組み込まれる）は、（dC-dA）n-（dG-dT）nの短いタンデム反復配列
のブロックにおける長さ多型に基づくDNAマーカーを記載している。（dC-dA）n-
（dG-dT）nブロックの平均隔離距離は、30,000〜60,000bpであると推定される。
非常に狭い間隔で配置されたマーカーは、高頻度の共遺伝（co-inheritance）を
示し、遺伝子突然変異（例えば所与のNHP遺伝子内の突然変異）の同定ならびにN
HP突然変異に関連する疾患および障害の診断において非常に有用である。

【００８７】 また、Caskeyら（米国特許第5,364,759号、本明細書中に参考として全て組み
込まれる）は、短いトリ-およびテトラ-ヌクレオチド反復配列を検出するための
DNAプロファイリングアッセイについて記載している。このプロセスは、目的のD
NA（例えばNHP遺伝子等）を抽出し、抽出したDNAを増幅し、反復配列を標識して
個体のDNAの遺伝子型のマップを作成することを含む。

【００８８】 本発明の他の実施形態は、NHPまたはNHP変異体と疾患との関連性を同定するこ
とを含む。このような関連性を用いて、NHP変異体を保有する個体、または所与
の病気（例えば皮膚病、ぜん息、IBD等）に相関するNHP発現プロファイルを示す
個体を同定することができる。単一ヌクレオチド多型（SNP）、コーディングSNP
（cSNP）等を用いてこのような遺伝子診断が確立されたら、その患者にとって適
切な治療レジメを設定することができる。

【００８９】 また、NHP遺伝子発現のレベルは、NHP転写を検出および測定することでアッセ
イしうる。例えば、NHP遺伝子を発現することが分かっているまたは疑われる細
胞型もしくは組織（例えば皮膚、精巣、または脳など）に由来するRNAを単離し
、上述したようにハイブリダイゼーションまたはPCR技法を用いて検査すること
ができる。単離細胞は、細胞培養または患者から得ることができる。培養から得
た細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子治療技術の一部として使用する細胞を評価
するうえで、あるいはNHP遺伝子の発現に及ぼす化合物の影響を試験するために
、必要なステップである。このような分析により、NHP遺伝子発現の活性化や不
活化を含めて、NHP遺伝子の発現パターンの定量的および定性的側面が明らかに
なるであろう。このようなスクリーニングアッセイを行う好適な方法は、開示し
た配列を、配列の大きなアレイ（すなわちマイクロチップアレイなど）の一部と
して用いる。

【００９０】 このような検出スキームの１つの実施形態においては、cDNAを、目的のRNAか
ら（例えばRNA分子からcDNAへの逆転写などによって）合成する。次にこのcDNA
内の配列を、PCR増幅反応等の核酸増幅反応の鋳型として用いる。この方法の逆
転写および核酸増幅ステップにおいて合成開始試薬として用いられる核酸試薬（
例えばプライマー）は、第5.1節に記載したNHP核酸試薬の中から選択される。こ
のような核酸試薬の好適な長さは、少なくとも9〜30ヌクレオチドである。増幅
された産物を検出するために、放射能もしくは非放射能で標識したヌクレオチド
を用いて核酸増幅を行うことができる。あるいは、十分に増幅された産物が、標
準的なエチジウムブロミド染色により、他の適切な核酸染色法を用いることによ
り、または配列決定を行なうことにより可視化されるようにしてもよい。

【００９１】 さらに、核酸精製を必要としないように、NHP遺伝子発現アッセイを「in situ
」で、すなわち生検または切除術により得た患者の組織の（固定および/または
冷凍した）組織切片に対して直接、行うことが可能である。第5.1節に記載した
ような核酸試薬は、in situ手法のためのプローブおよび/またはプライマーとし
て使用することができる（例えばNuovo, G.J., 1992, “PCR In Situ Hybridiza
tion: Protocols And Applications”, Raven Press, NYを参照されたい）。

【００９２】 あるいは、十分な量の適当な細胞を得ることができる場合には、標準的なノー
ザン分析を行って、NHP遺伝子のmRNAの発現レベルを調べることができる。

【００９３】5.4.2. NHPポリペプチドの検出 また、野生型もしくは突然変異型のNHP産物、あるいはこれらの保存的変異体
またはペプチド断片に対する抗体（上記第5.3節に記載）を、本明細書中に記載
した診断および予後判定に使用することができる。このような診断方法は、NHP
遺伝子発現レベルの異常、あるいはNHPの構造および/または時間的な位置、組織
、細胞もしくは細胞下の位置における異常を検出するために使用することができ
、該方法は、in vivoまたはin vitroにおいて（例えば生検組織等に対して）行
うことができる。

【００９４】 例えば、NHPのエピトープに対する抗体をin vivoで使用して、体内のNHPの発
現パターンおよびレベルを検出することができる。このような抗体は、X線、CAT
スキャン、またはMRIなどの方法を用いて体内で発現されるNHPへの結合を可視化
するために、例えば放射線不透過性化合物または他の適当な化合物で標識して、
被験者に注入することができる。この目的のためには、血液脳関門の通過を促進
し、脳内で発現されるNHPの標識付けを可能とするために、標識された抗体フラ
グメント（例えば抗原結合領域の最小部分を含むFabまたは一本鎖抗体等）が好
適である。

【００９５】 さらに、その存在を検出することができる任意のNHP融合タンパク質またはNHP
コンジュゲートタンパク質を投与することができる。例えば、標識抗体について
上記のように、放射線不透過化合物または他の適当な化合物で標識したNHP融合
もしくはコンジュゲートタンパク質を投与し、in vivoで可視化することができ
る。さらに、このようなNHP融合タンパク質（例えばAP-NHPまたはNHP-AP）は、i
n vitro診断手法に用いることができる。

【００９６】 あるいは、上記のようなイムノアッセイまたは融合タンパク質検出アッセイを
生検および剖検サンプルに対してin vitroで使用することで、NHPの発現パター
ンの評価を可能とすることができる。このようなアッセイは、NHPドメイン限定
する抗体の使用に限られることなく、NHPの任意のドメインのエピトープに対す
る抗体の使用を含み得る。これらの標識された抗体の各々または全てを使用すれ
ば、NHPの翻訳および細胞表面への細胞内輸送についての有用な情報が得られ、
プロセッシングの欠損を同定することができる。

【００９７】 分析する組織または細胞型には、一般には、NHP遺伝子を発現することが分か
っているものまたはその疑いのあるもの（例えば上皮細胞、脳細胞など）が含ま
れる。本明細書中で使用されるタンパク質単離方法は、例えば、HarlowおよびLa
ne（Harlow, E.およびLane, D., 1988, “Antibodies: A Laboratory Manual”,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）に記
載されているようなもの（本明細書中に参考として全て組み込まれる）であって
もよい。単離細胞は、細胞培養物または患者から得ることができる。培養物から
得た細胞の分析は、細胞に基づく遺伝子治療技術の一部として、またはNHP遺伝
子の発現に及ぼす化合物の影響を調べるために使用することができ、細胞の評価
における重要なステップである。

【００９８】 例えば、本発明において有用な抗体または抗体のフラグメント（例えば上記第
5.3節に記載したものなど）は、NHP産物またはその保存された変異体もしくはそ
のペプチド断片の存在を定量的または定性的に検出するために使用することがで
きる。これは、例えば、光学顕微鏡法、フローサイトメトリー、または蛍光定量
検出法と組み合せて、蛍光標識した抗体（この節の以下の記載を参照されたい）
を用いた免疫蛍光技法によって行うことができる。このような技法は、このよう
なNHP産物が細胞表面上に少なくとも一過的には存在する場合に特に好適である
。

【００９９】 さらに、本発明に有用な抗体（もしくはそのフラグメント）、またはNHP融合
もしくはコンジュゲートタンパク質は、NHP遺伝子産物またはその保存された変
異体もしくはペプチド断片のin situ検出のために、あるいはNHPの結合を分析す
る（標識したNHP融合タンパク質の場合）ために、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡法
または非免疫学的アッセイなどにおいて、組織学的に利用することができる。

【０１００】 in situ検出は、患者から組織学的試料を採取し、これに本発明の標識抗体ま
たは融合タンパク質を加えることによって行うことができる。抗体（もしくはそ
のフラグメント）または融合タンパク質は、好ましくは、標識抗体（またはフラ
グメント）を生物学的サンプルに重層することによって適用する。このような手
法を用いることにより、NHP産物、保存された変異体もしくはペプチド断片、ま
たはNHP結合の存在のみならず、検査する組織中のNHPの分布を測定することも可
能である。当業者であれば、本発明を用いてこのようなin situ検出を達成する
ために様々な組織学的方法（例えば染色法など）のうち任意のものを改良できる
ことが容易に分かるであろう。

【０１０１】 NHP産物またはその保存された変異体もしくはそのペプチド断片のイムノアッ
セイおよび非免疫学的アッセイは、典型的には、生物学的液体、組織抽出物、回
収した新鮮な細胞、または細胞培養でインキュベートした細胞の溶解物等のサン
プルを、NHP産物またはその保存された変異体もしくはそのペプチド断片を同定
できる、検出可能なように標識された抗体の存在下でインキュベートし、当分野
で周知の数多くの技法のいずれかによって結合した抗体を検出することを含む。
あるいは、標識抗体は、NHPに直接もしくは間接的に付着した抗原性のあるタグ
に対するものであってもよい。

【０１０２】 生物学的サンプルを、ニトロセルロース等の固相支持体または担体、あるいは
細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化することができる他の固相支
持体に接触させてこれに固定化することができる。次にこの支持体を適当な緩衝
液で洗浄した後、検出可能なように標識したNHP抗体またはNHP受容体融合タンパ
ク質で処理することができる。次に、この固相支持体に上記緩衝液で二度目の洗
浄を行い、結合していない抗体または融合タンパク質を除去する。次に、固相支
持体に結合した標識の量を従来の手段によって検出することができる。

【０１０３】 「固相支持体または担体」とは、抗原または抗体を結合することができる任意
の支持体を意味する。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポ
リプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然のま
たは改変されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が含ま
れる。本発明の目的のためには、担体の性質は、ある程度可溶性または不溶性の
どちらかでよい。支持体物質は、結合した分子が抗原または抗体に結合すること
ができるものであれば、事実上あらゆる可能な構造的立体配置を有することがで
きる。従って支持体の立体配置は、ビーズのように球状であっても、または試験
管の内側表面やロッドの外側表面のように円筒形であってもよい。あるいは、そ
の表面はシートや試験用ストリップ等のように平坦であってもよい。好適な支持
体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者であれば、抗体または抗
原を結合するのに適した多くの他の担体を知っているであろうし、また、日常的
な実験を用いてこれを確認することができるであろう。

【０１０４】 所与の多数のNHP抗体またはNHPリガンド融合タンパク質の結合活性は、周知の
方法に従って測定することができる。当業者であれば、日常的な実験を用いて、
各測定のための効果的且つ最適なアッセイ条件を決定することができるであろう
。

【０１０５】 抗体に関して、NHP抗体を検出可能なように標識できる方法の１つは、NHP抗体
を酵素に結合させることにより、それを酵素イムノアッセイ（EIA）に使用する
ことである（Voller, A., 「酵素結合免疫吸着アッセイ（The Enzyme Linked Im
munosorbent Assay）(ELISA)」 1978, Diagnostic Horizons 2:1-7, (Microbiol
ogical Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD); Voller, Aら,
1978, J. Clin. Pathol. 31:507-520; Butler, J.E., 1981, Meth. Enzymol. 7
3:482-523; Maggio, E.(編), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Rat
on, FL.; Ishikawa, E.ら（編）, 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, To
kyo）。該抗体に結合する酵素は、適当な基質（好ましくは発色性基質）に反応
し、例えば分光測定法、蛍光定量法、または目視観察手段によって検出すること
ができる化学的成分を生成する。抗体を検出可能なように標識するために使用す
ることができる酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ
、δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセ
ロホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨ
ウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グル
コースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、
カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよび
アセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。検出は、そ
の酵素の発色性基質を用いる比色法によって行うことができる。また検出は、基
質の酵素反応の程度を、同様に調製した標準物の反応の程度と目視観察によって
比較することによって行うこともできる。

【０１０６】 また検出は、他の種々のイムノアッセイのいずれかを用いて行うこともできる
。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識することによって、ラジオ
イムノアッセイ（RIA）を用いてNHPを検出することが可能である（例えばWeintr
aub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Rad
ioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986（本明細書
中に参考として組み込まれる）を参照されたい）。放射性同位体は、γカウンタ
ーもしくはシンチレーションカウンターを用いる方法などによって、またはオー
トラジオグラフィーによって、検出することができる。

【０１０７】 また、蛍光化合物で抗体を標識することも可能である。蛍光標識した抗体を適
当な波長の光に当てれば、抗体の存在を蛍光によって検出することができる。最
も一般的に用いられている蛍光標識用化合物としては、フルオレセイン、イソチ
オシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシ
アニン、o-フタルアルデヒド、およびフルオレサミンが挙げられる。

【０１０８】 また、¹⁵²Euなどの蛍光発光金属またはランタニド系の他の物質を用いて抗体
を検出可能なように標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリア
ミン五酢酸（DTPA）やエチレンジアミン四酢酸（EDTA）等のような金属キレート
剤を用いて抗体に結合させることができる。

【０１０９】 また抗体は、化学発光化合物に結合させることによって検出可能なように標識
することもできる。そして、化学発光物質でタグを付けた抗体の存在を、化学反
応過程の際に生じる発光の存在を検出することによって測定する。特に有用な化
学発光標識用化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、テロマティッ
ク（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩お
よびシュウ酸エステルが挙げられる。

【０１１０】 同様に、生物発光化合物を用いて本発明の抗体を標識してもよい。生物発光と
は、生物系において見られる化学発光のタイプであって、触媒タンパク質によっ
て化学発光反応の効率が増大するものである。生物発光タンパク質の存在は、発
光の存在を検出することによって測定される。標識のための重要な生物発光化合
物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。

【０１１１】5.5. NHPの発現または活性をモジュレートする化合物のスクリーニングアッセ
イ 以下のアッセイは、NHPと相互作用する（例えばこれに結合する）化合物、NHP
活性を阻害する化合物、NHP遺伝子発現の活性をモジュレートする（すなわちNHP
遺伝子発現のレベルをモジュレートする）化合物、または体内のNHPレベルをモ
ジュレートする化合物を同定するために設計される。さらにアッセイは、NHP遺
伝子調節配列（例えばプロモーター配列）に結合してその結果NHP遺伝子発現を
モジュレートすることができる化合物を同定するために用いることができる。例
えば、Platt, K.A., 1994, J. Biol. Chem. 269:28558-28562（本明細書中に参
考として全て組み込まれる）を参照されたい。

【０１１２】 本発明に従ってスクリーニングすることができる化合物としては、ペプチド、
抗体およびそのフラグメント、ならびにNHPに結合してリポキシゲナーゼ活性を
阻害、妨害または促進する他の有機化合物（例えばペプチド模擬物）が挙げられ
るが、これらに限定されない。

【０１１３】 このような化合物には、例えば可溶性ペプチド（ランダムペプチドライブラリ
ー（例えばLam, K.S.ら, 1991, Nature 354:82-84; Houghten, R.ら, 1991, Nat
ure 354:84-86を参照されたい）およびD-および/またはL-立体配置アミノ酸から
なるコンビナトリアル化学法により得た分子ライブラリーのメンバーを含むがこ
れらに限定されない）等のペプチド、ホスホペプチド（ランダムにもしくは一部
が縮重した指定的ホスホペプチドライブラリー（directed phosphopeptide libr
aries）のメンバーを含むがこれらに限定されない；例えばSongyang, Z.ら, 199
3, Cell 72:767-778を参照されたい）、抗体（ポリクローナル、モノクローナル
、ヒト化、抗イデオタイプ、キメラまたは一本鎖抗体、ならびにFab、F(ab’)₂
およびFAb発現ライブラリーフラグメント、ならびにそのエピトープ結合フラグ
メントを含むがこれらに限定されない）、ならびに有機もしくは無機の小型分子
が含まれるが、これらに限定されない。

【０１１４】 本発明に従ってスクリーニングすることができる他の化合物には、血液脳関門
を通過し、適当な細胞内（例えば脈絡叢、下垂体、視床下部等）に入り、NHP遺
伝子またはNHPが媒介する経路に関与する他の遺伝子の発現に影響を及ぼしうる
（例えば遺伝子発現または翻訳に関与する調節領域または転写因子と相互作用す
ることによる）小型有機分子、あるいはNHPが媒介するロイコトリエンの合成、
分解、炎症、または代謝の経路に影響を及ぼす化合物が含まれるが、これらに限
定されない。

【０１１５】 コンピュータによるモデリングおよび検索の技術は、NHPの発現または活性を
モジュレートすることができる化合物の同定、または既に同定されたこのような
化合物の改良を可能とする。このような化合物または組成物を同定すれば、活性
部位または領域が同定される。このような活性部位は、典型的には、リガンドま
たは基質結合部位である。この活性部位は、当分野で公知の方法を用いて（例え
ばペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、または関連する
化合物もしくは組成物とその天然リガンドとの複合体の研究から）同定すること
ができる。後者の場合、化学的方法またはX線結晶学的方法を用いて、複合体化
リガンドが認められるその因子上の場所を見い出すことによって、活性部位を見
つけることができる。

【０１１６】 次に、活性部位の三次元幾何学的構造を決定する。これは、完全な分子構造を
決定することができるX線結晶学等の既知の方法によって行うことができる。一
方、固相もしくは液相NMRを用いて、特定の分子の距離を測定することができる
。構造決定の他の任意の実験的方法を用いて、部分的もしくは完全な幾何学的構
造を得ることができる。幾何学的構造は、複合体化リガンド（天然もしくは人工
的なもの）を用いて決定することができ、これは、決定した活性部位構造の正確
性を増大させ得る。

【０１１７】 不完全なまたは精度が不充分な構造が決定される場合には、コンピュータに基
づく計数的モデリング法を用いて、その構造を完全なものとするか、またはその
精度を向上させることができる。任意の認知されているモデリング方法を用いて
よい。例えば、タンパク質もしくは核酸等の特定の生体高分子に特定したパラメ
ータ化モデル、分子運動（molecular motion）の計算に基づく分子動態モデル、
サーマルアンサンブル（thermal ensembles）に基づく統計力学モデル、または
組合せモデルが挙げられる。ほとんどのタイプのモデルでは、構成原子と構成基
との間の力を示す標準的な分子力場が必要であり、物理化学において公知である
力場から選択することができる。不完全もしくは精度の低い実験的構造は、これ
らのモデリング方法によって計算された完全な構造およびより正確な構造に対し
て制約的なものとして役立つ。

【０１１８】 最後に、モデリングまたは組合せにより実験的に活性部位（または結合部位）
の構造を測定した後、候補モジュレート化合物を、化合物およびこれらの分子構
造についての情報を含むデータベースで検索することによって、同定することが
できる。このような検索は、決定された活性部位構造と一致し且つ該活性部位を
規定する基と相互作用する構造を有する化合物を探し出す。このような検索は手
作業によって行うことができるが、好ましくはコンピュータを用いて行われる。
この検索から見つけ出されたこれらの化合物は、潜在的なNHPモジュレート化合
物である。

【０１１９】 あるいは、これらの方法を用いて、既知のモジュレート化合物またはリガンド
から改良されたモジュレート化合物を同定することができる。既知の化合物の組
成を改変し、改変の構造的な影響を、新しい組成に適用させた上記の実験的およ
びコンピュータモデリング方法を用いて決定することができる。次に、改変され
た構造をその化合物の活性部位構造と比較し、フィットするか否か、または相互
作用が改善されるか否かを決定する。このように、特異性もしくは活性が改良さ
れた改変モジュレート化合物またはリガンドを得るために、組成の体系的な変更
（例えば側鎖の基を変えることによる変更など）を、迅速に評価することができ
る。

【０１２０】 NHPの活性部位（または結合部位）の同定に基づいてモジュレート化合物、な
らびに関連するシグナル伝達および転写因子を同定するために有用な他の実験的
およびコンピュータモデリング法は、当業者には自明である。

【０１２１】 分子モデリングシステムの例としては、CHARMmおよびQUANTAプログラム（Poly
gen Corporation, Waltham, MA）が挙げられる。CHARMmは、エネルギーの最小化
と分子動力学計算（molecular dynamics function）を行う。QUANTAは、分子構
造の構築、グラフィック・モデリングおよび分析を行う。QUANTAは、分子同士の
相互作用による構築、修飾、可視化、および性質の分析を可能にする。

【０１２２】 多くの文献が、特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリン
グについて概説している。例えば、Rotivinenら, 1988, Acta Pharmaceutical F
ennica 97: 159-166; Ripka, New Scientist 54-57（June 16, 1988）; McKinal
y およびRossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29:111-122; Perr
yおよびDavies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Dr
ug Design pp.189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); LewisおよびDean, 1989 Pr
oc. R. Soc. Lond. 236:125-140および141-162;ならびに核酸成分のモデル受容
体に関しては、Askewら, 1989, J.Am. Chem. Soc. 111:1082-1090がある。化学
物質をスクリーニングしてグラフィックで示す他のコンピュータプログラムは、
BioDesign, Inc.（Pasadena, CA.）、Allelix, Inc.（Mississauga, Ontario, C
anada）およびHypercube, Inc. (Cambridge, Ontario)等の企業から市販されて
いる。これらは主に、特定のタンパク質に対して特異的な薬物に適用するために
設計されているが、DNAまたはRNAの領域を特定すれば、その領域に対して特異的
な薬物の設計に適用することができる。

【０１２３】 結合を変更することができる化合物の設計および産生に関して上記に記載した
が、既知の化合物（天然産物または合成化学物質を含む）およびタンパク質等の
生物学的に活性な物質のライブラリーを、インヒビターまたはアクチベーターで
ある化合物についてスクリーニングすることも可能である。

【０１２４】 また、細胞に基づく系を用いて、NHPに結合する（またはこれを模倣する）化
合物を同定すること、および生細胞中でこのような結合に関連して変更された活
性を評価することもできる。このようなアッセイにとって特に興味深い手段の１
つは、詳しくは米国特許第5,625,048号（本明細書中に参考として組み込まれる
）に記載されているグリーン蛍光タンパク質である。このような細胞アッセイで
使用することができる細胞には、白血球、白血球由来細胞系、リンパ球、幹細胞
（胚幹細胞を含む）等が含まれるが、これらに限定されない。さらに、目的の機
能的NHPを発現させて、検査するリガンドもしくは天然リガンドによる活性化に
対して、化学的変化もしくは表現型の変化または他の宿主細胞遺伝子の誘導によ
って測定されるような応答を起こすように遺伝子操作された発現宿主細胞（例え
ばB95細胞、COS細胞、CHO細胞、OMK細胞、繊維芽細胞、Sf9細胞等）を、アッセ
イの指標として用いることができる。

【０１２５】 本明細書中に記載したようなアッセイによって同定した化合物は、例えばNHP
産物の生物学的機能を明らかにするために有用であり得る。このような化合物を
、種々の生理学的または精神的障害を治療するための治療に有効な用量で患者に
投与することができる。治療に有効な用量とは、任意の生物学的症状の改善、防
止、予防または変調をもたらすのに十分な化合物の量をいう。

【０１２６】 このような化合物の毒性および治療的効能は、細胞培養または実験動物におけ
る標準的な薬学的手法、例えばLD₅₀（その集団の50％が死亡する量）およびED₅₀ （その集団の50％において治療的に有効な用量）を決定する手法等によって決定
することができる。毒性と治療的効果との用量比は治療指標であり、比LD₅₀/ED_{5 0} で表すことができる。大きな治療指標を示す化合物が好ましい。毒性のある副
作用を示す化合物を用いてもよいが、このような化合物を罹患組織部位に送達す
る送達系を設計するためには、非感染細胞に与え得るダメージを最小限にとどめ
て副作用を低減するための注意が必要である。

【０１２７】 細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータを、ヒトにおいて使用する投
与量範囲の定式化に使用することができる。このような化合物の投与量は、好ま
しくは、毒性が非常に少ないか、または全く無い、ED₅₀を包含する循環血中濃度
の範囲内である。投与量は、使用する剤形および使用する投与経路によって該範
囲内で決めることができる。本発明の方法で使用される任意の化合物について、
治療に有効な用量は、まず、細胞培養アッセイから見積もることができる。細胞
培養で測定したIC₅₀（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃
度）を含む循環血漿濃度を達成する用量は、動物モデルにおいて定式化すること
ができる。このような情報を用いて、ヒトにおいて有効な用量をより正確に決定
することができる。例えば高速液体クロマトグラフィーによって、血漿中のレベ
ルを測定することができる。

【０１２８】 本発明に従って使用される医薬組成物は、１以上の生理学的に許容される担体
または賦形剤を用いて従来の方法で製剤化することができる。従って、該化合物
ならびにこれらの生理学的に許容される塩および溶媒化合物は、吸入もしくは吹
送（口もしくは鼻を介して）もしくは経口、口腔内、非経口、頭蓋内、クモ膜下
、表皮（スキンクリーム、軟膏など）または直腸内投与用に製剤化することがで
きる。

【０１２９】 経口投与の場合、医薬組成物は、結合剤（例えば予めゼラチン化したトウモロ
コシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス等）、充填剤（例えばラクトース、微晶性セルロースまたはリン酸水素カルシ
ウム等）、潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ等）、崩
壊剤（例えばジャガイモ澱粉または澱粉グリコール酸ナトリウム（sodium starc
h glycolate）等）、または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム等）等の製
薬上許容される賦形剤を用いて従来法によって調製される、錠剤またはカプセル
形状等のものであってもよい。錠剤は、当分野で周知の方法によってコーティン
グすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば溶液、シロップまたは
懸濁液の形態のものであってもよい。あるいは、このような調製物は、服用前に
水または他の適当なビヒクルを用いて構成されるための乾燥製品であってもよい
。このような液体調製物は、懸濁剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース
誘導体または水素化食用脂肪等）、乳化剤（例えばレシチンまたはアラビアゴム
等）、非水系ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール
または植物性油等）、および保存剤（例えばメチルもしくはプロピル-p-ヒドロ
キシベンゾエートまたはソルビン酸等）などの製薬上許容される添加物を用いて
従来法によって調製することができる。また該調製物は、緩衝化塩、香料、着色
剤および甘味料を適宜含んでいても良い。

【０１３０】 経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出を行うように好適に製剤化され
得る。

【０１３１】 口腔内投与用には、組成物は、従来法で製剤化した錠剤またはトローチ剤の形
態のものであってもよい。

【０１３２】 吸入投与用には、本発明に従って使用する化合物は、適当な噴霧剤（例えばジ
クロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロ
エタン、二酸化炭素または他の適当な気体）を含む圧縮パックまたは噴霧器から
のエアロゾルスプレーの形態で送達されるのが便利である。圧縮タイプのエアロ
ゾルの場合、投薬単位は、計量した量を送達するためのバルブを設けることによ
って、決定することができる。例えば吸入器または吹送器に用いるためのゼラチ
ン等のカプセルまたはカートリッジに、該化合物とラクトースや澱粉などの適当
な粉末基剤との粉末混合物を含ませて製剤化することができる。

【０１３３】 該化合物は、注射による（例えば大量注射や連続注入等による）非経口投与用
に製剤化することができる。注射用の製剤は、ユニット剤形として、例えば保存
剤を入れたアンプル中または複数回分の用量が入った容器中に入れて提供するこ
とができる。該組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマ
ルジョンのような形態のものであってよく、懸濁剤、安定化剤および/または分
散剤等の製剤化剤を含み得る。あるいは、活性成分は、服用前に発熱性物質を含
まない滅菌水などの適切なビヒクルを用いた構成用の粉末形態であってもよい。

【０１３４】 また該化合物は、例えばココアバターまたは他のグリセリド等の従来の坐剤基
剤を含む坐剤や保持浣腸剤等の直腸用組成物として製剤化することもできる。

【０１３５】 先に記載された製剤以外に、化合物は、デポー製剤として製剤化することもで
きる。このような長時間作用する製剤は、（例えば皮下または筋肉内）移植によ
って、または筋肉内注射によって投与することができる。従って、例えば化合物
は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば許容可能な油中のエマルジ
ョンなど）、またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性塩等の難溶性誘導
体として製剤化することができる。

【０１３６】 組成物は、望ましければ、活性成分を含む１以上のユニット剤形を含み得るパ
ックまたはディスペンサー器具に入れて提供することができる。パックは、例え
ば金属製またはプラスチック製の箔（例えばブリスターパック等）を含んでなっ
ていてもよい。パックもしくはディスペンサー器具には、投薬説明書を添付して
も良い。

【０１３７】5.5.1. NHPに結合する化合物についてのin vitroスクリーニングアッセイ in vitro系は、NHPと相互作用する（例えばこれに結合する）ことができる化
合物を同定するために設計することができる。同定された化合物は、例えば野生
型および/または突然変異型のNHP産物の活性をモジュレートするのに有用であり
うる；NHPの生物学的機能をはっきりさせるのに有用でありうる；正常なNHP相互
作用を破壊する化合物を同定するためのスクリーニングにおいて利用できる；あ
るいはそれ自体がこのような相互作用を破壊または活性化し得る。

【０１３８】 NHPに結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、NHPと試
験化合物との反応混合物を、これら２つの成分が相互作用および結合することが
可能である十分な条件下および時間で調製することにより複合体を形成させる工
程を含む。この複合体は、この反応混合物中で除去および/または検出すること
ができる。使用されるNHP種は、スクリーニングアッセイの目的によって異なり
得る。例えば、NHPと直接相互作用する化合物を探し出す場合、全長NHP、該NHP
に対応するペプチド、またはNHPを含む融合タンパク質を用いることができる。

【０１３９】 スクリーニングアッセイは、様々な方法で実施することができる。例えば、こ
のようなアッセイを実施するための１つの方法は、NHP、NHPから得たポリペプチ
ド、ペプチドもしくは融合タンパク質、または試験物質を固相上に固定し、反応
の最後に固相上に固定されたNHP-試験化合物複合体を検出することを含み得る。
このような方法の１つの実施形態では、NHP反応物を固体表面上に固定し、固定
されていない試験化合物を直接もしくは間接的に標識することができる。

【０１４０】 実施に際し、固相としてマイクロタイタープレートを用いるのが便利でありう
る。固定成分は、非共有結合または共有結合によって固定化することができる。
非共有結合は、固体表面をタンパク質の溶液でコーティングし、これを乾燥させ
ることによって簡単に行うことができる。あるいは、固定しようとするタンパク
質に対して特異的な固定化された抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を用い
て、該タンパク質を固体表面上に固定することができる。該表面は、前もって作
製して保管しておくことができる。

【０１４１】 アッセイを実施するために、固定成分を含むコーティング表面に非固定化成分
を加える。反応が完了した後、固体表面上に形成された複合体が固定化されたま
ま残るような条件下で未反応成分を（例えば洗浄によって）除去する。固体表面
上に固定された複合体の検出は、多数の方法によって行うことができる。前もっ
て固定化されなかった成分が事前に標識されている場合、表面上に固定化標識が
検出されれば、複合体が形成されたことを示す。前もって固定化されなかった成
分が事前に標識されていない場合、間接的な標識を用いて、（例えば前もって固
定化されなかった成分に対して特異的な標識抗体を用いて）表面上に固定された
複合体を検出することができる（この場合、抗体は直接標識されても、標識され
た抗Ig抗体によって間接的に標識されてもよい）。

【０１４２】 あるいは、反応を液相で実施し、反応産物を未反応成分から分離し、および複
合体を検出することができる。例えばその溶液中で形成された複合体を固定する
ために、NHPタンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質、ま
たは試験化合物に対して特異的な固定化抗体、および固定された複合体を検出す
るために可能性のある複合体の他の成分に特異的な標識抗体を用いることができ
る。

【０１４３】 あるいは、細胞ベースのアッセイを用いて、NHPと相互作用する化合物を同定
することができる。このために、NHPを発現する細胞系、または（例えば適当に
遺伝子工学的に操作されたNHP DNAでのトランスフェクションまたは形質導入な
どによって）NHPを発現するように遺伝子工学的に操作された細胞系（例えばCOS
細胞、CHO細胞、繊維芽細胞等）を使用することができる。例えば宿主細胞によ
って発現されたNHPと試験化合物との相互作用は、NHPを発現しない細胞との比較
によって決定することができる。

【０１４４】5.5.2. NHPに結合する細胞内タンパク質のアッセイ NHPと直接または間接的に相互作用する膜タンパク質または細胞内タンパク質
を同定するために、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するのに適した任意
の方法を用いることができる。直接的な相互作用の場合、使用することができる
伝統的な方法には、細胞溶解物中のNHPと相互作用するタンパク質を同定するた
め、細胞溶解物もしくは細胞溶解物から得たタンパク質およびNHPを用いた同時
免疫沈降法、架橋、および勾配もしくはクロマトグラフィーカラムによる同時精
製が含まれるが、これらに限定されない。これらのアッセイでは、NHP成分は全
長NHP、NHPの可溶性誘導体、NHPペプチドまたはNHP融合タンパク質であってもよ
い。いったん単離したら、このような細胞内タンパク質を同定し、次に、標準的
な技法と共に使用してそれと相互作用するタンパク質を同定することができる。
例えば、NHPと相互作用する細胞内タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部
は、当技術分野で公知の技法（例えばエドマン分解法等）を用いて確認すること
ができる（例えばCreighton, 1983,「Proteins: Structures and Molecular Pri
nciples」, W.H. Freeman & Co., N.Y., pp.34-49を参照されたい）。得られた
アミノ酸配列を、このような細胞内タンパク質をコードする遺伝子配列のスクリ
ーニングに用いることができるオリゴヌクレオチド混合物の生成のためのガイド
として使用してもよい。スクリーニングは、例えば標準的なハイブリダイゼーシ
ョンまたはPCR技法によって行うことができる。オリゴヌクレオチド混合物の生
成技法およびスクリーニングは周知である（例えばAusubel（前掲）およびPCR P
rotocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innis, M.ら編, Acad
emic Press, Inc., New Yorkを参照されたい）。

【０１４５】 さらに、NHPに相互作用する膜貫通タンパク質または細胞内タンパク質をコー
ドする遺伝子を同時に同定する方法を用いることができる。これらの方法として
は、例えば、λgt11ライブラリーの抗体プロービングのための周知技法に類似し
た方法での発現ライブラリーのプロービングであって、標識したNHPタンパク質
、もしくはNHPポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質（例えば、マー
カー（例えば酵素、蛍光体、発光タンパク質または染料など）またはIg-Fcドメ
インに融合させたNHPポリペプチドまたはNHPドメイン等）を用いるものが挙げら
れる。

【０１４６】 in vivoでタンパク質相互作用を検出する１つの方法である2-ハイブリッドシ
ステムについては、以下に例を挙げて詳細に記載する。ただし以下の例に限定さ
れない。このシステムの１つのバージョンは既に記載されており（Chienら, 199
1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582）、Clontech(Palo Alto, CA)よ
り市販されている。

【０１４７】 まとめると、以下のシステムを用いて、2-ハイブリッドタンパク質をコードす
るプラスミドを構築する。一方のプラスミドは、NHPまたはこれから得られるNHP
ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列
に融合された転写アクチベータータンパク質のDNA結合ドメインをコードするヌ
クレオチドからなり、他方のプラスミドは、このプラスミド中にcDNAライブラリ
ーの一部として組換えされた未知のタンパク質をコードするcDNAに融合された転
写アクチベータータンパク質の活性化ドメインをコードするヌクレオチドからな
る。DNA結合ドメイン融合プラスミドおよびcDNAライブラリーは、その調節領域
が転写アクチベーターの結合部位を含むレポーター遺伝子（例えばHBSやlacZ等
）を含む酵母株サッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）中に
形質転換される。どちらかのハイブリッドタンパク質のみでは、レポーター遺伝
子の転写を活性化することができない。例えば、DNA結合ドメインハイブリッド
は、活性化機能を提供しないので転写を活性化できない。また、活性化ドメイン
ハイブリッドは、アクチベーターの結合部位に局在化できないので転写を活性化
できない。2-ハイブリッドタンパク質の相互作用は機能的アクチベータータンパ
ク質を再構成し、レポーター遺伝子の発現をもたらす。これは、レポーター遺伝
子産物のアッセイにより検出される。

【０１４８】 2-ハイブリッドシステムまたは関連する方法論を用いて、「バイト（bait）」
遺伝子産物と相互作用するタンパク質について活性化ドメインライブラリーをス
クリーニングすることができる。限定するわけではないが、例として、NHPをバ
イト産物として用いることができる。活性化ドメインをコードするDNAに全ゲノ
ム配列またはcDNA配列を融合させる。このライブラリー、およびDNA結合ドメイ
ンに融合されたバイトNHP遺伝子産物のハイブリッドをコードするプラスミドを
、酵母レポーター株の中に同時形質転換し、得られた形質転換体を、レポーター
遺伝子を発現するものについてスクリーニングする。例えば限定するわけではな
いが、NHPのオープンリーディングフレーム（またはNHPのドメイン）などのバイ
トNHP遺伝子配列を、これがGAL4タンパク質のDNA結合ドメインをコードするDNA
に翻訳上融合されるようにベクターの中にクローニングすることができる。これ
らのコロニーを精製し、レポーター遺伝子発現に関与するライブラリープラスミ
ドを単離する。次にDNA配列決定分析を用いて、該ライブラリープラスミドによ
りコードされるタンパク質を同定する。

【０１４９】 バイトNHP遺伝子産物に相互作用するタンパク質を検出しようとする細胞系のc
DNAライブラリーは、当技術分野で日常的に実施される方法を用いて作製するこ
とができる。本明細書中に記載される特定のシステムによれば、例えば、cDNA断
片を、これらがGAL4の転写活性化ドメインに翻訳上融合されるようにベクター中
に挿入することができる。このライブラリーは、バイトNHP遺伝子-GAL4融合プラ
スミドと一緒に、GAL4活性化配列を含むプロモーターによって駆動されるlacZ遺
伝子を含む酵母株の中に同時形質転換することができる。バイトNHP遺伝子産物
と相互作用する、GAL4転写活性化ドメインに融合されたcDNAがコードするタンパ
ク質は、活性GAL4タンパク質を再構成し、これによって、HIS3遺伝子の発現を駆
動するであろう。HIS3を発現するコロニーは、ヒスチジンを含まない半固体寒天
ベースの培地を含むペトリ皿上でこれらを増殖させることによって検出すること
ができる。次にcDNAをこれらの株から精製し、当技術分野で日常的に実施されて
いる技法を用いてバイトNHP遺伝子と相互作用するタンパク質を産生および単離
するために用いることができる。

【０１５０】5.5.3. NHP/細胞内高分子またはNHP/膜貫通高分子の相互作用を阻害する化合物 のアッセイ NHPと相互作用する高分子は、この説明の目的のために、「結合パートナー」
と呼ぶ。これらの結合パートナーは、NHPが媒介する生物学的経路に関与するよ
うである。従って、体内でNHP活性を調節または促進するのにおよび/またはNHP
活性（またはその欠陥）に関連する障害を制御するのに有用でありうる、このよ
うな結合パートナーの相互作用を阻害または破壊する化合物を同定することが望
ましい。

【０１５１】 NHPまたはNHP受容体（まとめてNHP成分と呼ぶ）とその(1つまたは複数の）結
合パートナーとの相互作用を阻害する化合物を同定するために使用されるアッセ
イシステムの基本原理は、第5.2.1節および第5.5.2節で先に記載したNHP、また
はNHPポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質とその結合パートナーと
を含む反応混合物を、これら２つが相互作用および結合して複合体を形成するこ
とが可能である十分な条件下および時間で調製することを含む。化合物の阻害活
性を試験するために、反応混合物は、試験化合物の存在下および不在下で調製さ
れる。試験化合物は、最初に反応混合物の中に含めても、あるいはNHP成分およ
びその結合パートナーを加えた後に加えても良い。対照反応混合物を、試験化合
物無しで、または偽薬と共にインキュベートする。次に、NHP成分とその結合パ
ートナーとの複合体の形成を検出する。対照反応において複合体が形成され、試
験化合物を含む反応混合物中では形成されないのであれば、その化合物がNHP成
分とその相互作用結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。さらに、
試験化合物および正常なNHPタンパク質を含む反応混合物内での複合体形成を、
試験化合物および突然変異体NHPを含む反応混合物内における複合体形成と比較
することもできる。この比較は、突然変異体もしくは突然変異したNHPの相互作
用を特異的に破壊するが正常なNHPや他のリポキシゲナーゼの相互作用を破壊し
ない化合物を同定したい場合に重要でありうる。

【０１５２】 NHPと結合パートナーとの相互作用を阻害する化合物のアッセイは、不均一も
しくは均一フォーマットで行うことができる。不均一アッセイは、NHP成分また
はその結合パートナーのいずれかを固相上に固定し、反応の最後にこの固相に固
定された複合体を検出することを含む。均一アッセイでは、反応全体は、液相中
で行われる。いずれの方法においても、試験する化合物についての様々な情報を
得るために、反応物の添加順序を変えることができる。例えば、相互作用を競合
により阻害する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を実施することによって
同定することができる。即ち、NHP成分および相互反応する結合パートナーの添
加前またはこれらと同時に反応混合物に試験化合物を加えることによって実施す
ることができる。あるいは、既に形成された複合体を破壊する試験化合物（例え
ばその複合体の1つの成分に取って代わる高い結合定数を有する化合物）は、複
合体が形成された後に反応混合物に該試験化合物を添加することによって試験す
ることができる。様々なフォーマットを以下に簡単に記載する。

【０１５３】 不均一アッセイシステムでは、NHP成分または相互作用結合パートナーのいず
れかを固体表面に固定させ、固定化されない種を直接または間接的に標識する。
実施に際し、マイクロタイタープレートを利用するのが便利である。固定された
種は、非共有結合または共有結合によって固定化されていてもよい。非共有結合
は、固体表面をNHP成分または結合パートナーの溶液でコーティングして乾燥す
ることにより簡単に行うことができる。あるいは、固定しようとする種に対して
特異的な固定化された抗体を用いて、固体表面に該種を固定することができる。
固体表面は、前もって作製して保管しておいてもよい。

【０１５４】 アッセイを実施するために、固定化種のパートナーを試験化合物と共にまたは
試験化合物無しで、コーティングした表面に曝露する。反応が完了したら、未反
応成分を（例えば洗浄により）除去し、形成された複合体を固体表面上に固定さ
せたまま残す。固体表面上に固定された複合体の検出は、多数の方法で行うこと
ができる。非固定化種を前もって標識している場合、表面における固定化された
標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。非固定化種を前もって標識して
いない場合、間接的な標識を用いて（例えば、最初に固定化されなかった種に対
して特異的な標識抗体を用いて）、表面上に固定された複合体を検出することが
できる（同様にこの抗体は、直接標識されていてもよいし、標識された抗Ig抗体
で間接的に標識されてもよい）。反応成分の添加順序に応じて、複合体形成を阻
害するまたは既に形成された複合体を破壊する試験化合物を検出することができ
る。

【０１５５】 あるいは、反応を、試験化合物の存在下または不在下で液相中で実施し、反応
産物を未反応成分から分離し、複合体を検出することができる。これには、例え
ば溶液中で形成された複合体を固定するための結合成分の一方に特異的な固定化
抗体、および固定された複合体を検出するための他方のパートナーに特異的な標
識抗体を用いることができる。この場合も、液相への反応物の添加順序に応じて
、複合体を阻害するまたは既に形成された複合体を破壊する試験化合物を同定す
ることができる。

【０１５６】 本発明の他の実施形態において、均一アッセイを用いることができる。この方
法では、既に形成されたNHP成分と相互作用結合パートナーとの複合体を調製す
る。このとき、NHP成分またはその結合パートナーのいずれかを標識するが、こ
の標識により生成されるシグナルは、複合体の形成によって消失する（例えばRu
bensteinによる、免疫学的アッセイのためにこの方法を利用したU.S. Patent 4,
109,496を参照されたい）。既に形成された複合体からの種の１つと競合しおよ
びこれに取って代わる試験物質を加えると、バックグラウンドを超えるシグナル
が生成されるだろう。このように、NHP/細胞内結合パートナー相互作用を破壊す
る試験物質を同定することができる。

【０１５７】 特定の実施形態において、固定化するためのNHP融合体を調製することができ
る。例えば、pGEX-5X-1等の融合ベクターを用いて、NHPまたはペプチド断片をグ
ルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）遺伝子に、得られる融合タンパク質に
おいてその結合活性が維持されるように融合させることができる。相互作用結合
パートナーを精製し、当技術分野で日常的に実施されている上記第5.3節に記載
した方法を用いて、モノクローナル抗体を作製するために使用することができる
。この抗体を、例えば当技術分野で日常的に実施されている方法によって放射性
同位体¹²⁵Iで標識することができる。不均一アッセイでは、例えばGST-NHP融合
タンパク質をグルタチオン-アガロースビーズに固定することができる。次に、
相互作用結合パートナーを、試験化合物の存在下または不在下で、相互作用およ
び結合を生じさせるような方法で加えることができる。反応期間の最後に、結合
していない材料を洗い流し、標識されたモノクローナル抗体をこの系に加えて、
複合体化成分に結合させることができる。NHP成分と相互作用結合パートナーと
の相互作用は、グルタチオン-アガロースビーズに結合したまま残っている放射
能の量を測定することによって検出することができる。試験化合物によって相互
作用が首尾良く阻害されれば、測定される放射能が減少するだろう。

【０１５８】 あるいは、GST-NHP成分融合タンパク質および相互作用結合パートナーを固体
グルタチオン-アガロースビーズの不在下で液体中で一緒に混合することができ
る。試験化合物は、これらの種を相互作用させている間またはさせた後に加える
ことができる。次に、この混合物をグルタチオン-アガロースビーズに加えるこ
とができ、結合していない材料を洗い流す。この場合も、NHP成分/結合パートナ
ー相互作用の阻害の程度は、標識した抗体を加えて該ビーズに結合した放射能を
測定することによって検出することができる。

【０１５９】 本発明の他の実施形態において、これらの同じ技法は、全長タンパク質の一方
または両方の代わりに、NHP成分および/または相互作用もしくは結合パートナー
（結合パートナーがタンパク質の場合）の結合ドメインに対応するペプチド断片
を用いて、行うことができる。当技術分野で日常的に実施されている任意の数の
方法を用いて、結合部位を同定および単離することができる。これらの方法には
、該タンパク質の１つをコードする遺伝子の突然変異誘発法および同時免疫沈降
アッセイにおける結合の破壊についてのスクリーニング法が含まれるが、これら
に限定されない。次に、複合体中の第２の種をコードする遺伝子における補償的
突然変異（compensatory mutation）を選択することができる。それぞれのタン
パク質をコードする遺伝子の配列決定分析によって、相互作用結合に関与するタ
ンパク質の領域に対応する突然変異が明らかとなるであろう。あるいは、上記方
法を用いて１つのタンパク質を固体表面に固定させ、トリプシンなどのタンパク
質分解酵素で処理したその標識した結合パートナーと相互作用させて、これに結
合させることができる。洗浄後、結合ドメインを含んでなる比較的短い標識した
ペプチドが固相材料に結合したまま残る場合がある。これは、単離され、アミノ
酸配列決定分析によって同定することができる。また、いったん細胞内結合パー
トナーをコードする遺伝子を得た場合には、短い遺伝子セグメントを、該タンパ
ク質のペプチド断片を発現するように遺伝子工学的に操作することができる。次
にこれを、結合活性について試験し、精製または合成することができる。

【０１６０】 例えば、限定するわけではないが、GST-NHP成分融合タンパク質を作製して、
これがグルタチオンアガロースビーズに結合することを可能にすることによって
、NHP成分を上記のように固体材料に固定させることができる。相互作用結合パ
ートナーを、³⁵Sなどの放射性同位体で標識し、トリプシンなどのタンパク質分
解酵素で切断することができる。次に切断産物を固定したGST-NSP成分融合タン
パク質に加えて結合させることができる。未結合ペプチドを洗い流した後、細胞
内結合パートナー結合ドメインを表す標識した結合材料を溶出し、精製し、周知
の方法によってアミノ酸配列について分析することができる。このように同定さ
れたペプチドは、合成により産生したり、または組換えDNA技法を用いて適当な
促進タンパク質（facilitative protein）に融合させることができる。

【０１６１】6.0. 微生物の寄託についての参照 以下のプラスミドは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペ
スト条約およびこれ（ブタペスト条約）に基づく規則の下で、American Type Cu
lture Collection (ATCC)（Manassas, VA, USA）に寄託され、よって、ブタペス
ト条約の規定に従って保管され、利用することができる。このようなプラスミド
の有用性は、特許法に従って政府当局から与えられる権利に違反して本発明を実
施するためのライセンスとして解釈されるべきではない。

【０１６２】 寄託されたプラスミドには以下に示すATCC受託番号が割り当てられた。 プラスミド ATCC番号 LEXENZ17D PTA-503

【０１６３】 本発明は、本明細書に記載された具体的な実施形態によってその範囲が制限さ
れるものではなく、これらの実施形態は、本発明の個々の態様の１つの例として
挙げたものであり、機能的に同等な方法および組成物は、本発明の範囲内に含ま
れる。実際に、本明細書中に示し記載したもの以外にも、本発明の様々な修正は
、これまでの説明および添付の図面から当業者には自明であろう。このような修
正は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。本明細書中に引用した全
ての出版物、特許および特許出願の内容は全て本明細書中に参照として組み込ま
れる。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/02 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 9/02 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ザンブロウィックス，ブライアン アメリカ合衆国 77382 テキサス州，ザ ウッドランズ，ファイアーソーン プレ イス 18 (72)発明者 ネールス，ミッシェル ドイツ連邦共和国 ディー−82131 スト ックドルフ，パウル−ケラー−シュトラー セ ６ (72)発明者 フリードリック，グレン アメリカ合衆国 77004 テキサス州，ヒ ューストン，ハーマン ドライブ 2207， ブレランド アンド ブレランド (72)発明者 サンズ，アーサー，ティー． アメリカ合衆国 77382 テキサス州，ザ ウッドランズ，ブリストル べンド サ ークル 163 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA08 CA04 DA02 GA11 4B050 CC03 DD07 LL01 LL03 4B065 AA91X AA93Y AB01 BA02 CA28 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA30 CA40 DA75 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下のポリヌクレオチド： (a) 配列番号１、３、５、７、９、11、13、15、17、19、21、23、25、27、ま
   たは29を含むポリヌクレオチド； (b) 配列番号２、４、６、８、10、12、14、16、18、20、22、24、26、または
   28を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および (c) 高度にストリンジェントな条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダ
   イズすることができる第１のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって
   、第１のポリヌクレオチドが天然に存在するポリペプチドをコードし、第２のポ
   リヌクレオチドが配列番号１、３、５、７、９、11、13、15、17、19、21、23、
   25、27、または29に対して相補的である、該ポリヌクレオチド； からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のポリヌクレオチドの約16〜40塩基を含む、
   単離されたポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 以下のポリペプチド： (a) 配列番号２、４、６、８、10、12、14、16、18、20、22、24、26、または
   28を含むポリペプチド；および (b) 請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド； からなる群より選択される、単離されたポリペプチド。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のポリペプチドに特異的な抗体。
5. 【請求項５】 遺伝子操作により作製された、請求項１に記載のポリヌクレ
   オチドを含む細胞。
6. 【請求項６】 遺伝子操作により作製された、請求項１に記載のポリヌクレ
   オチドを含むトランスジェニックマウス。