JP2002541777A - 原発性ｈｉｖ−１分離株のｇｐ１４０断片の発現 - Google Patents
原発性ｈｉｖ−１分離株のｇｐ１４０断片の発現Info
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Abstract
(57)【要約】
宿主内でタンパク質を発現させるためのプロモーターの制御下で、ＨIＶ-１の原発性分離株、ＢＸ０８のgp１４０タンパク質をコード化する遺伝子を含む、宿主に免疫応答を引き起こすためのベクターであり、具体的にはプラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８、pＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８８である。ＢＸ０８に含有される、マウスおよびヒトのＭＨＣクラス１拘束型結合モチーフを同定する。
Description
【０００１】 (発明の分野) 本発明は、免疫学の分野、特にＨIＶワクチンの技術に関し、詳細には、原発
性ヒト免疫不全ウイルス・タイプ１(ＨIＶ-１)分離株のエンベロープ遺伝子、gp
１４０の細胞外断片の発現に関する。
性ヒト免疫不全ウイルス・タイプ１(ＨIＶ-１)分離株のエンベロープ遺伝子、gp
１４０の細胞外断片の発現に関する。
【０００２】 (関連出願の参照) この出願は、１９９９年２月２４日に出願された同時係属の米国特許出願第０
９/２５６,１９４号の、一部継続出願である。
９/２５６,１９４号の、一部継続出願である。
【０００３】 (発明の背景) 後天性免疫不全症候群(ＡIＤＳ)は、ヒト免疫不全ウイルス(ＨIＶ)に感染した
結果引き起こされる疾患である。現在、ＨIＶ感染からヒト集団を保護すること
ができる有効なワクチンはなく、したがって、効き目のあるＨIＶワクチンとそ
れを投与するためのプロトコルの開発が緊急に必要である。以前は、化学療法に
よって徹底的に不活性化されたＨIＶ-１粒子、ＨIＶ-１のエンベロープ遺伝子(g
p１４０)全体をコード化するワクシニアベクター、および精製された組換え遺伝
子gp１２０が、候補ＨIＶワクチンとして評価されていた。不活性化されたＨIＶ
-１ウイルス製剤によって、Ｔ細胞で媒介される遅延型過敏症(ＤＴＨ)反応が人
体に引き起こされ、ワクシニア/gp１６０およびgp１２０組換えワクチン候補に
よってウイルス中和抗体が生じるが、これらの免疫原の中で、効き目のあるヒト
ＨIＶワクチンであることを示すものはない(参考文献１、この明細書全体を通し
、本発明が関係する現況技術についてより十分に述べるために、括弧内の様々な
参考文献を参照する。各引用に関する完全な書誌情報を、本明細書の終わりに提
供する。これにより、これらの参考文献の開示を参照により本発明の開示に組み
入れる。)。ＨIＶワクチン技術に対する本発明者の関心は、免疫原性で費用効果
の高いＨIＶ-１ ＤＮＡワクチンを開発することであり、それらを単独でまたは
他の形態のＨIＶ-１ワクチン候補と共に使用することによって、ＨIＶ-１に対し
てより有効な免疫反応が生じることになると考えることである。
結果引き起こされる疾患である。現在、ＨIＶ感染からヒト集団を保護すること
ができる有効なワクチンはなく、したがって、効き目のあるＨIＶワクチンとそ
れを投与するためのプロトコルの開発が緊急に必要である。以前は、化学療法に
よって徹底的に不活性化されたＨIＶ-１粒子、ＨIＶ-１のエンベロープ遺伝子(g
p１４０)全体をコード化するワクシニアベクター、および精製された組換え遺伝
子gp１２０が、候補ＨIＶワクチンとして評価されていた。不活性化されたＨIＶ
-１ウイルス製剤によって、Ｔ細胞で媒介される遅延型過敏症(ＤＴＨ)反応が人
体に引き起こされ、ワクシニア/gp１６０およびgp１２０組換えワクチン候補に
よってウイルス中和抗体が生じるが、これらの免疫原の中で、効き目のあるヒト
ＨIＶワクチンであることを示すものはない(参考文献１、この明細書全体を通し
、本発明が関係する現況技術についてより十分に述べるために、括弧内の様々な
参考文献を参照する。各引用に関する完全な書誌情報を、本明細書の終わりに提
供する。これにより、これらの参考文献の開示を参照により本発明の開示に組み
入れる。)。ＨIＶワクチン技術に対する本発明者の関心は、免疫原性で費用効果
の高いＨIＶ-１ ＤＮＡワクチンを開発することであり、それらを単独でまたは
他の形態のＨIＶ-１ワクチン候補と共に使用することによって、ＨIＶ-１に対し
てより有効な免疫反応が生じることになると考えることである。
【０００４】 以前より、本願の譲受人に譲渡された付与済みの欧州特許第４７０,９８０号
および米国特許第５,６３９,８５４号であってそれらの開示が参照により本明細
書に組み込まれている上記特許には、とりわけＨIＶ-１のコアタンパク質、p２
４ＥのＴ細胞エピトープの同定および特徴付けが記載されている。さらに、本願
の譲受人に譲渡された付与済みの米国特許第５,７４９,７６９号および第５,７
９５,９５５号であってそれらの開示が参照により組み込まれている上記特許に
は、ＨIＶ-１のエンベロープまたはコアタンパク質の異なるＢ細胞エピトープの
アミノ酸配列に結合したp２４Ｅを含む免疫原性合成ＨIＶ-１キメラペプチドを
構築する際に、Ｔ細胞エピトープを使用することが記載されている。
および米国特許第５,６３９,８５４号であってそれらの開示が参照により本明細
書に組み込まれている上記特許には、とりわけＨIＶ-１のコアタンパク質、p２
４ＥのＴ細胞エピトープの同定および特徴付けが記載されている。さらに、本願
の譲受人に譲渡された付与済みの米国特許第５,７４９,７６９号および第５,７
９５,９５５号であってそれらの開示が参照により組み込まれている上記特許に
は、ＨIＶ-１のエンベロープまたはコアタンパク質の異なるＢ細胞エピトープの
アミノ酸配列に結合したp２４Ｅを含む免疫原性合成ＨIＶ-１キメラペプチドを
構築する際に、Ｔ細胞エピトープを使用することが記載されている。
【０００５】 (発明の概要) 現在、細胞媒介性免疫(ＣＭI)を引き起こすことが可能なＨIＶ ＤＮＡベース
の免疫原の設計および構築に力が注がれている。この明細書では、本発明者は原
発性ＨIＶ-１分離株、ＨIＶ-１(ＢＸ０８)に発現した細胞外エンベロープ断片、
gp１４０に関心を向けたが、その理由は、このタンパク質がマウスとヒトの両方
の主要組織適合複合体(ＭＨＣ)クラス１対立遺伝子に拘束されたモチーフに富ん
でいるからである。
の免疫原の設計および構築に力が注がれている。この明細書では、本発明者は原
発性ＨIＶ-１分離株、ＨIＶ-１(ＢＸ０８)に発現した細胞外エンベロープ断片、
gp１４０に関心を向けたが、その理由は、このタンパク質がマウスとヒトの両方
の主要組織適合複合体(ＭＨＣ)クラス１対立遺伝子に拘束されたモチーフに富ん
でいるからである。
【０００６】 gp１４０タンパク質を発現する適切に構築された免疫原を用いた免疫化によっ
て、クラス１結合能力を有するペプチドが発生し、その結果、ウイルス感染した
細胞を殺すことが可能なＨIＶ-１特異ＣＴＬを誘発させて、感染を制限すること
が可能になる。
て、クラス１結合能力を有するペプチドが発生し、その結果、ウイルス感染した
細胞を殺すことが可能なＨIＶ-１特異ＣＴＬを誘発させて、感染を制限すること
が可能になる。
【０００７】 本発明者により記述される本発明とは、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８で示され
ＣＭＶプロモーターの制御下でgp１４０を発現するプラスミドが、異なるＨ-２d クラス１遺伝子産物に拘束されたgp１４０タンパク質の複数のエピトープに対す
るＣＴＬ応答を引き起こす際にＢＡＬＢ/cマウスで免疫原性であったということ
を、本発明者が見出したことである。また、セムリキ森林熱ウイルス(ＳＦＶ)ベ
クターをベースとするプラスミド、すなわちpＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭ
Ｐ８８も、ＣＭＶプロモーターの制御下でgp１４０遺伝子を必要とし、同様に免
疫原性であることがわかった。
ＣＭＶプロモーターの制御下でgp１４０を発現するプラスミドが、異なるＨ-２d クラス１遺伝子産物に拘束されたgp１４０タンパク質の複数のエピトープに対す
るＣＴＬ応答を引き起こす際にＢＡＬＢ/cマウスで免疫原性であったということ
を、本発明者が見出したことである。また、セムリキ森林熱ウイルス(ＳＦＶ)ベ
クターをベースとするプラスミド、すなわちpＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭ
Ｐ８８も、ＣＭＶプロモーターの制御下でgp１４０遺伝子を必要とし、同様に免
疫原性であることがわかった。
【０００８】 したがって本発明の一態様では、宿主生物体に遺伝子産物を発現させるための
プロモーターの制御下で、原発性ＨIＶ-１分離株のgp１４０の細胞外断片をコー
ド化する遺伝子、好ましくはＢＸ０８を含むベクターが提供され、それによって
細胞傷害性Ｔ細胞応答が引き起こされる。
プロモーターの制御下で、原発性ＨIＶ-１分離株のgp１４０の細胞外断片をコー
ド化する遺伝子、好ましくはＢＸ０８を含むベクターが提供され、それによって
細胞傷害性Ｔ細胞応答が引き起こされる。
【０００９】 プロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーターであることが好ましい。
ベクターは、好ましくは図１に示すように、プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ
０８の明らかにされた特徴を有するプラスミドベクターでよい。ベクターは、好
ましくはプラスミドpＭＰ８８、pＭＰ８４、またはpＭＰ８３の明らかにされた
特徴を有するプラスミドベクターでもよい。
ベクターは、好ましくは図１に示すように、プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ
０８の明らかにされた特徴を有するプラスミドベクターでよい。ベクターは、好
ましくはプラスミドpＭＰ８８、pＭＰ８４、またはpＭＰ８３の明らかにされた
特徴を有するプラスミドベクターでもよい。
【００１０】 本発明はさらに、ベクターを含有する免疫原性組成物、ならびに本明細書で提
供される免疫原性組成物を宿主に投与することによって宿主内でＨIＶ-１に細胞
傷害性Ｔ細胞応答を発生させる方法を含む。このような免疫原性組成物は、適切
な担体を用いて筋肉内免疫化用に処方することができ、または金の粒子を用いて
遺伝子ガンデリバリー(gene gun delivery)用に処方することができる。
供される免疫原性組成物を宿主に投与することによって宿主内でＨIＶ-１に細胞
傷害性Ｔ細胞応答を発生させる方法を含む。このような免疫原性組成物は、適切
な担体を用いて筋肉内免疫化用に処方することができ、または金の粒子を用いて
遺伝子ガンデリバリー(gene gun delivery)用に処方することができる。
【００１１】 本発明は、宿主内でＨIＶ-１に細胞傷害性Ｔ細胞応答を発生させるための免疫
原として使用するときのベクターにも及び、宿主内でＨIＶ-１に細胞傷害性Ｔ細
胞応答を発生させるための免疫原を製造する際の、ベクターの使用法にも及ぶ。
原として使用するときのベクターにも及び、宿主内でＨIＶ-１に細胞傷害性Ｔ細
胞応答を発生させるための免疫原を製造する際の、ベクターの使用法にも及ぶ。
【００１２】 本発明はさらに、以下に述べるある新規なペプチドよび核酸分子を含む。
【００１３】 (発明の詳細な説明) ＤＮＡ免疫原は、問題の遺伝子をプラズミド発現ベクターに分子クローニング
するために、組換えＤＮＡの技術を使用して構築される。ＤＮＡベースの免疫原
を用いたワクチン接種に関する独自の特徴とは、破壊された細胞全体および処方
されたサブユニット免疫原の使用を必要とする他の形態のワクチン接種であって
研究が行われたケース(参考文献２)の大部分でＭＨＣクラス２拘束型免疫調節応
答を引き起こし易い傾向があるワクチン接種に比べ、このＤＮＡベースの免疫原
の細胞内産物はいったん細胞内に送達されるとＭＨＣクラス１拘束型細胞傷害性
Ｔ細胞を誘発するのに好ましいものになることである。したがって本明細書では
、ウイルスやある特定の腫瘍などの細胞内生物体に対する細胞エフェクター応答
の誘発を最適化するために、ＤＮＡ技術を使用して、ワクチン接種を目的とした
裸のＤＮＡ免疫原を構築することが好都合である。ＤＮＡワクチンがもたらすそ
の他の利点には、(i)それらの産生が容易であること、および(ii)広い温度範囲
にわたって安定であることが含まれる。
するために、組換えＤＮＡの技術を使用して構築される。ＤＮＡベースの免疫原
を用いたワクチン接種に関する独自の特徴とは、破壊された細胞全体および処方
されたサブユニット免疫原の使用を必要とする他の形態のワクチン接種であって
研究が行われたケース(参考文献２)の大部分でＭＨＣクラス２拘束型免疫調節応
答を引き起こし易い傾向があるワクチン接種に比べ、このＤＮＡベースの免疫原
の細胞内産物はいったん細胞内に送達されるとＭＨＣクラス１拘束型細胞傷害性
Ｔ細胞を誘発するのに好ましいものになることである。したがって本明細書では
、ウイルスやある特定の腫瘍などの細胞内生物体に対する細胞エフェクター応答
の誘発を最適化するために、ＤＮＡ技術を使用して、ワクチン接種を目的とした
裸のＤＮＡ免疫原を構築することが好都合である。ＤＮＡワクチンがもたらすそ
の他の利点には、(i)それらの産生が容易であること、および(ii)広い温度範囲
にわたって安定であることが含まれる。
【００１４】 マウスおよびヒトのＣＴＬ抗原決定基を予測するために最近使用されてきた一
般的なモデルは、未変性タンパク質分子の一次配列からのそれぞれのＭＨＣクラ
ス１分子に関する結合モチーフの確認を含んでいた(参考文献３〜５を参照)。し
たがって、Ｈ-２Ｄd遺伝子産物のペプチド結合溝に結合し入り込むのに最も好都
合なモチーフは、通常、８〜１０個のアミノ酸の長さであることが提案されてい
る。大部分のケースでは、これらのペプチドはアミノ(Ｎ-)末端に近い２位およ
び３位にグリシンおよびプロリン(ＧＰ)といったアンカー残基を含有し、カルボ
キシ(Ｃ-)末端にロイシンまたはフェニルアラニンといったアンカー残基を含有
することがわかっており、これらは膜結合Ｈ-２Ｄd分子のペプチド結合溝のそれ
ぞれの「ポケット」との相互作用に役立つものである。Ｈ-２dハプロタイプのそ
の他のクラス１対立遺伝子Ｋdに限定されるモチーフは、２位にチロシンを含有
することが報告され、Ｃ末端ではイソロイシン、バリン、またはロイシンである
可能性があった。ヒトＭＨＣクラス１分子、ＨＬＡ-Ａ０２０１から単離された
ペプチドの研究によれば、大部分のケースにおいて、アンカー残基は２位でロイ
シンまたはメチオニンであり、Ｃ末端ではバリンまたはロイシンであることが、
同様に明らかになった。
般的なモデルは、未変性タンパク質分子の一次配列からのそれぞれのＭＨＣクラ
ス１分子に関する結合モチーフの確認を含んでいた(参考文献３〜５を参照)。し
たがって、Ｈ-２Ｄd遺伝子産物のペプチド結合溝に結合し入り込むのに最も好都
合なモチーフは、通常、８〜１０個のアミノ酸の長さであることが提案されてい
る。大部分のケースでは、これらのペプチドはアミノ(Ｎ-)末端に近い２位およ
び３位にグリシンおよびプロリン(ＧＰ)といったアンカー残基を含有し、カルボ
キシ(Ｃ-)末端にロイシンまたはフェニルアラニンといったアンカー残基を含有
することがわかっており、これらは膜結合Ｈ-２Ｄd分子のペプチド結合溝のそれ
ぞれの「ポケット」との相互作用に役立つものである。Ｈ-２dハプロタイプのそ
の他のクラス１対立遺伝子Ｋdに限定されるモチーフは、２位にチロシンを含有
することが報告され、Ｃ末端ではイソロイシン、バリン、またはロイシンである
可能性があった。ヒトＭＨＣクラス１分子、ＨＬＡ-Ａ０２０１から単離された
ペプチドの研究によれば、大部分のケースにおいて、アンカー残基は２位でロイ
シンまたはメチオニンであり、Ｃ末端ではバリンまたはロイシンであることが、
同様に明らかになった。
【００１５】 含有されるマウスとヒトのＭＨＣクラス１拘束型結合モチーフの数を決定する
ために、ＣＴＬ誘発免疫原としてＨIＶ-１(ＢＸ０８)gp１４０が適切かどうかを
予測アルゴリズムによって評価した。結合モチーフのアミノ酸配列と、それらを
表すペプチドの名称を、以下の表１に示す。このようなペプチドは新規であり、
本明細書で特許請求する。異なるＨ-２d拘束型クラス１対立遺伝子、すなわちＤ d およびＫdに対して結合モチーフが存在することにより、原発性分離株ＢＸ０８
のＨIＶ-１のgp１４０を発現させて以下の実施例で記述するように構築されたプ
ラスミド、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８、pＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８
８の免疫原性をＨ-２dハプロタイプの近交系マウス系統ＢＡＬＢ/cで研究するこ
とが可能になる。プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８の要素および拘束部位
を、図１に示す。プラスミドpＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８８の構築に
ついて、以下の実施例５で述べる。プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８、pＭ
Ｐ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８８のgp１４０オープン・リーディング・フレ
ームのヌクレオチド配列(配列番号１)および推論されるアミノ酸配列(配列番号
２)を図２に示すが、これらは独自の配列と考えられ、それらの補体と共に本明
細書で特許請求する。
ために、ＣＴＬ誘発免疫原としてＨIＶ-１(ＢＸ０８)gp１４０が適切かどうかを
予測アルゴリズムによって評価した。結合モチーフのアミノ酸配列と、それらを
表すペプチドの名称を、以下の表１に示す。このようなペプチドは新規であり、
本明細書で特許請求する。異なるＨ-２d拘束型クラス１対立遺伝子、すなわちＤ d およびＫdに対して結合モチーフが存在することにより、原発性分離株ＢＸ０８
のＨIＶ-１のgp１４０を発現させて以下の実施例で記述するように構築されたプ
ラスミド、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８、pＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８
８の免疫原性をＨ-２dハプロタイプの近交系マウス系統ＢＡＬＢ/cで研究するこ
とが可能になる。プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８の要素および拘束部位
を、図１に示す。プラスミドpＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８８の構築に
ついて、以下の実施例５で述べる。プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８、pＭ
Ｐ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８８のgp１４０オープン・リーディング・フレ
ームのヌクレオチド配列(配列番号１)および推論されるアミノ酸配列(配列番号
２)を図２に示すが、これらは独自の配列と考えられ、それらの補体と共に本明
細書で特許請求する。
【００１６】 表１に見られるヒトＭＨＣクラス１対立遺伝子、ＨＬＡ-Ａ０２０１に対する
いくつかの結合モチーフの位置は、プラズミドが、適切な免疫化レジメンの下で
、対象であるヒトのこのクラス１分子についてこれらのエピトープを対象とする
ＣＴＬ応答を引き起こす可能性があることを、暗に示していた。
いくつかの結合モチーフの位置は、プラズミドが、適切な免疫化レジメンの下で
、対象であるヒトのこのクラス１分子についてこれらのエピトープを対象とする
ＣＴＬ応答を引き起こす可能性があることを、暗に示していた。
【００１７】 プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８の免疫原性についてＢＡＬＢ/cマウス
で研究した。筋肉内経路を使用して１回の用量あたり１００.０μgでプラスミド
を注射した３種類の研究結果を図３に示す。ペプチド、すなわちＣＬＰ-５０１
およびＣＬＰ-５０４(配列番号３,５)をそれぞれ含有するＤdおよびＫd拘束型モ
チーフを用いて個々にパルス化した照射型自家ＬＰＳブラストによりプラスミド
免疫化動物の脾臓細胞をin vitroで再刺激すると、ＣＴＬが発生し、それぞれ
のペプチドと共に存在するＰ８１５標的を死滅させることがわかった(図３Ａお
よび図３Ｂ)。表１に、ペプチドのアミノ酸配列を示す。エフェクタと標的(Ｅ:
Ｔ)の比が同じであるときの応答の大きさを比較することにより、ＣＬＰ-５０１
ペプチドに対するＤd-拘束型応答は免疫優性であり、ＣＬＰ-５０４ペプチドに
対するＫd-拘束型応答は亜優性であることが明らかになった。エフェクターの増
大につながるin vitro再刺激は特異的であったが、その理由は、照射されたＬ
ＰＳブラストのみ(ペプチドで処理していないもの)を同じ数だけ追加しても、試
験が行われる特異標的のいずれも死滅させることが可能な集団培養では、エフェ
クターが全く発生しないからである。gp１４０を挿入していないpＣＭＶベクタ
ーを注射したマウス対照群だけが、ＣＴＬの２つの副集団のいずれも発生させな
いということが発見され、したがってプラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８は
確かに免疫原性であることが確認された。
で研究した。筋肉内経路を使用して１回の用量あたり１００.０μgでプラスミド
を注射した３種類の研究結果を図３に示す。ペプチド、すなわちＣＬＰ-５０１
およびＣＬＰ-５０４(配列番号３,５)をそれぞれ含有するＤdおよびＫd拘束型モ
チーフを用いて個々にパルス化した照射型自家ＬＰＳブラストによりプラスミド
免疫化動物の脾臓細胞をin vitroで再刺激すると、ＣＴＬが発生し、それぞれ
のペプチドと共に存在するＰ８１５標的を死滅させることがわかった(図３Ａお
よび図３Ｂ)。表１に、ペプチドのアミノ酸配列を示す。エフェクタと標的(Ｅ:
Ｔ)の比が同じであるときの応答の大きさを比較することにより、ＣＬＰ-５０１
ペプチドに対するＤd-拘束型応答は免疫優性であり、ＣＬＰ-５０４ペプチドに
対するＫd-拘束型応答は亜優性であることが明らかになった。エフェクターの増
大につながるin vitro再刺激は特異的であったが、その理由は、照射されたＬ
ＰＳブラストのみ(ペプチドで処理していないもの)を同じ数だけ追加しても、試
験が行われる特異標的のいずれも死滅させることが可能な集団培養では、エフェ
クターが全く発生しないからである。gp１４０を挿入していないpＣＭＶベクタ
ーを注射したマウス対照群だけが、ＣＴＬの２つの副集団のいずれも発生させな
いということが発見され、したがってプラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８は
確かに免疫原性であることが確認された。
【００１８】 pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８プラスミドは、遺伝子ガンデリバリー(gene gun d
elivery)された場合、同様に免疫原性であることがわかった。図４に示す結果に
よれば、プラスミド０.７μgの用量で２回注射をして上述のin vitro再刺激と
同じ条件を使用した場合、ＣＬＰ-５０１およびＣＬＰ-５０４を認識するＣＴＬ
が検出されたが(図４Ａおよび４Ｂ)、ベクターpＣＭＶが与えられた動物群のみ
にエフェクター応答が生じなかったことが示されている(図４Ｃ)。
elivery)された場合、同様に免疫原性であることがわかった。図４に示す結果に
よれば、プラスミド０.７μgの用量で２回注射をして上述のin vitro再刺激と
同じ条件を使用した場合、ＣＬＰ-５０１およびＣＬＰ-５０４を認識するＣＴＬ
が検出されたが(図４Ａおよび４Ｂ)、ベクターpＣＭＶが与えられた動物群のみ
にエフェクター応答が生じなかったことが示されている(図４Ｃ)。
【００１９】 プラスミドpＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８８の免疫原性について別々
に調査を行ったが、この場合上述の手順に従って、ＤＮＡを３つの異なる用量レ
ベルで、すなわち１.０μg、１０.０μg、および１００.０μgをＢＡＬＢ/cマウ
スに筋肉送達し、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８と比較した。得られた結果を以下
の表IIおよび表IIIに記載する。ＣＴＬの活性化は、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８
の場合よりも著しく低い用量のアルファウイルスベクターで実現される。
に調査を行ったが、この場合上述の手順に従って、ＤＮＡを３つの異なる用量レ
ベルで、すなわち１.０μg、１０.０μg、および１００.０μgをＢＡＬＢ/cマウ
スに筋肉送達し、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８と比較した。得られた結果を以下
の表IIおよび表IIIに記載する。ＣＴＬの活性化は、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８
の場合よりも著しく低い用量のアルファウイルスベクターで実現される。
【００２０】 本発明の様々な実施形態は、ＨIＶ感染のワクチン接種、診断、および治療の
分野における多くの適用例を有することが、当業者に明らかに理解される。その
ような用法の別の非限定的な考察を、以下にさらに提示する。
分野における多くの適用例を有することが、当業者に明らかに理解される。その
ような用法の別の非限定的な考察を、以下にさらに提示する。
【００２１】 ＤＮＡベクターを含有する、ワクチンを含む免疫原性組成物は、ポリヌクレオ
チドを投与するために、注射可能なものとして、生理学的に許容される溶液また
はエマルジョンに調製することができる。以下により詳細に述べるように、ＤＮ
Ａベクターは、核酸リポソームとして(例えばＷＯ９３/２４６４０に記載されて
いる)レシチンリポソームや当技術分野で知られているその他のリポソームなど
のリポソームに関連付けられる可能性があり、またはＤＮＡベクターはアジュバ
ントに関連付けられる可能性がある。
チドを投与するために、注射可能なものとして、生理学的に許容される溶液また
はエマルジョンに調製することができる。以下により詳細に述べるように、ＤＮ
Ａベクターは、核酸リポソームとして(例えばＷＯ９３/２４６４０に記載されて
いる)レシチンリポソームや当技術分野で知られているその他のリポソームなど
のリポソームに関連付けられる可能性があり、またはＤＮＡベクターはアジュバ
ントに関連付けられる可能性がある。
【００２２】 カチオン性脂質を含むリポソームは、自然発生的にかつ迅速に、ＤＮＡやＲＮ
Ａなどのポリアニオンと相互に作用し、その結果、ポリヌクレオチドを最大１０
０％捕捉するリポソーム/核酸複合体になる。さらに、ポリカチオン性複合体は
細胞膜と融合し、その結果、リソソーム区画の分解酵素をバイパスするポリヌク
レオチドの細胞内送達が得られる。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４/２７４３５
は、カチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含む遺伝子免疫化用の組成物につ
いて記述している。
Ａなどのポリアニオンと相互に作用し、その結果、ポリヌクレオチドを最大１０
０％捕捉するリポソーム/核酸複合体になる。さらに、ポリカチオン性複合体は
細胞膜と融合し、その結果、リソソーム区画の分解酵素をバイパスするポリヌク
レオチドの細胞内送達が得られる。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４/２７４３５
は、カチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含む遺伝子免疫化用の組成物につ
いて記述している。
【００２３】 カルシウムイオンやウイルスタンパク、その他のトランスフェクション促進剤
など、核酸の細胞取込みを助ける薬剤は、ベクターと共に使用することが有利で
あると考えられる。
など、核酸の細胞取込みを助ける薬剤は、ベクターと共に使用することが有利で
あると考えられる。
【００２４】 ポリヌクレオチド免疫原性製剤は、生分解性の持効性粒子を含むマイクロカプ
セルとして処方することもできる。このため米国特許第５,１５１,２６４号は、
Ｂio Ｖecteurs Ｓupra Ｍoleculaires(ＢＶＳＭ)と呼ばれているリン脂質/
糖脂質/多糖類の性質の特定の担体について記述している。粒状の担体は、その
複数層の１つが生物学的に活性である様々な分子を輸送しようとするものである
。
セルとして処方することもできる。このため米国特許第５,１５１,２６４号は、
Ｂio Ｖecteurs Ｓupra Ｍoleculaires(ＢＶＳＭ)と呼ばれているリン脂質/
糖脂質/多糖類の性質の特定の担体について記述している。粒状の担体は、その
複数層の１つが生物学的に活性である様々な分子を輸送しようとするものである
。
【００２５】 米国特許第５,０７５,１０９号は、抗原であるトリニトロフェニル化キーホー
ルリンペットヘモシニアンとブドウ球菌エンテロトキシンＢを５０:５０でポリ(
ＤＬ-ラクチド-コ-グリコライド)にカプセル化することについて記述している。
カプセル化用のその他のポリマーは、ポリ(グリコライド)やポリ(ＤＬ-ラクチド
-コ-グリコライド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリ(ラクチド
-コ-カプロラクトン)、ポリ(エステルアミド)、ポリオルトエステル、ポリ(８-
ヒドロキシ酪酸)、ポリ無水物などが提案されている。
ルリンペットヘモシニアンとブドウ球菌エンテロトキシンＢを５０:５０でポリ(
ＤＬ-ラクチド-コ-グリコライド)にカプセル化することについて記述している。
カプセル化用のその他のポリマーは、ポリ(グリコライド)やポリ(ＤＬ-ラクチド
-コ-グリコライド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリ(ラクチド
-コ-カプロラクトン)、ポリ(エステルアミド)、ポリオルトエステル、ポリ(８-
ヒドロキシ酪酸)、ポリ無水物などが提案されている。
【００２６】 公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９１/０６２８２は、複数の生体接着性のマイクロ
スフェアおよび抗原を含む送達賦形剤について記述している。マイクロスフェア
は、デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲン、またはアルブミンのもの
である。この送達賦形剤は、特に鼻粘膜全体にわたってワクチンを取り込もうと
するものである。送達賦形剤は、追加として吸収エンハンサーを含有することが
できる。
スフェアおよび抗原を含む送達賦形剤について記述している。マイクロスフェア
は、デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲン、またはアルブミンのもの
である。この送達賦形剤は、特に鼻粘膜全体にわたってワクチンを取り込もうと
するものである。送達賦形剤は、追加として吸収エンハンサーを含有することが
できる。
【００２７】 本発明の特定の実施形態では、ベクターを標的とする標的分子と共に、ベクタ
ーを、免疫系の細胞を含む選択された細胞に送達することができる。
ーを、免疫系の細胞を含む選択された細胞に送達することができる。
【００２８】 ベクターは、様々な手順によって宿主に送達することができ、例えばＴang他(
参考文献６)は、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)をコード化するＤＮＡで被覆された
金の極小の弾丸をマウスの皮膚に導入し、それによって、マウス中に抗ＢＧＨ抗
体を産生することを開示しており、一方、Ｆurth他(参考文献７)は、ジェット式
注射器を使用して、生きている動物の皮膚、筋肉、脂肪、および乳房組織をトラ
ンスフェクションできることを示した。
参考文献６)は、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)をコード化するＤＮＡで被覆された
金の極小の弾丸をマウスの皮膚に導入し、それによって、マウス中に抗ＢＧＨ抗
体を産生することを開示しており、一方、Ｆurth他(参考文献７)は、ジェット式
注射器を使用して、生きている動物の皮膚、筋肉、脂肪、および乳房組織をトラ
ンスフェクションできることを示した。
【００２９】 生物寄託 本明細書に記載され参照される、一次分離株のgp１４０の細胞外断片をコーデ
ィングする核酸を含有するある特定のベクター、ならびに前駆アルファウイルス
ベクターを、ブダペスト条約に基づいてこの出願を提出する前に、１０８０１
Ｕniversity Ｂoulevard、Ｍanassas、Ｖirginia ２０１１０-２２０９、ＵＳ
Ａに位置するＡｍerica Ｔype Ｃulture Ｃollection(ＡＴＣＣ)に寄託した
。寄託したベクターのサンプルは、米国特許出願に基づいて特許を付与すること
によって一般に入手できるようになり、かつ寄託菌に課されまたは加えられた全
ての制約が取り除かれることになる。さらに、寄託機関は、生存しているサンプ
ルを分配することができない場合に寄託菌を取り替えることになる。寄託された
実施形態は本発明の単なる例示を意図するものであるので、本明細書に記述され
特許請求される本発明の範囲は、寄託された生体物質によって限定されない。本
出願に記載される均等なまたは類似の抗原をコード化する核酸を含有する任意の
均等なまたは類似のベクターは、本発明の範囲内に含まれる。
ィングする核酸を含有するある特定のベクター、ならびに前駆アルファウイルス
ベクターを、ブダペスト条約に基づいてこの出願を提出する前に、１０８０１
Ｕniversity Ｂoulevard、Ｍanassas、Ｖirginia ２０１１０-２２０９、ＵＳ
Ａに位置するＡｍerica Ｔype Ｃulture Ｃollection(ＡＴＣＣ)に寄託した
。寄託したベクターのサンプルは、米国特許出願に基づいて特許を付与すること
によって一般に入手できるようになり、かつ寄託菌に課されまたは加えられた全
ての制約が取り除かれることになる。さらに、寄託機関は、生存しているサンプ
ルを分配することができない場合に寄託菌を取り替えることになる。寄託された
実施形態は本発明の単なる例示を意図するものであるので、本明細書に記述され
特許請求される本発明の範囲は、寄託された生体物質によって限定されない。本
出願に記載される均等なまたは類似の抗原をコード化する核酸を含有する任意の
均等なまたは類似のベクターは、本発明の範囲内に含まれる。
【００３０】 寄託概要 プラスミド ＡＴＣＣ 寄託日 pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８ ２０３８３９ １９９９年３月９日 pＭＰ４２ ２０３８３９ １９９８年１１月１２日 pＭＰ７６ ２０３８３９ １９９８年１１月１２日 実施例 上記開示は本発明について一般的に述べている。以下の特定の実施例を参照す
ることによって、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、単な
る例示を目的として記述し、本発明を限定しようとするものではない。状況が手
段を提示しまたは提供することができるので、均等物の形態および置換したもの
の変更が企図される。本明細書では特定の用語を使用したが、そのような用語は
説明を目的とするものであり、限定目的とするものではない。
ることによって、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、単な
る例示を目的として記述し、本発明を限定しようとするものではない。状況が手
段を提示しまたは提供することができるので、均等物の形態および置換したもの
の変更が企図される。本明細書では特定の用語を使用したが、そのような用語は
説明を目的とするものであり、限定目的とするものではない。
【００３１】 この開示の中に明確に記述されていないプラスミド構築、ペプチド合成、細胞
培養、ＣＴＬアッセイ、およびその他の試験手順の方法は科学文献に詳細に報告
されており、当業者の範囲内に十分に包含される。
培養、ＣＴＬアッセイ、およびその他の試験手順の方法は科学文献に詳細に報告
されており、当業者の範囲内に十分に包含される。
【００３２】 実施例１ この実施例は、プラスミド、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８の構築について例示
する。
する。
【００３３】 プラスミド、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８は、様々な供給源からの配列セグメ
ントを含有し、その構成要素を図１に示す。プラスミドのgp１４０オープン・リ
ーディング・フレームのヌクレオチド(配列番号１)および導き出されたアミノ酸
配列(配列番号２)を図２に示す。
ントを含有し、その構成要素を図１に示す。プラスミドのgp１４０オープン・リ
ーディング・フレームのヌクレオチド(配列番号１)および導き出されたアミノ酸
配列(配列番号２)を図２に示す。
【００３４】 原核ベクターpＢluescript ＳＫ(Ｓtratagene)はプラスミドpＣＭＶ.gp１４
０.ＢＸ０８の骨格であり、ＡｍpRをＫanR遺伝子に代え、f１およびＬacＺ領域
の欠失によって修飾した。所望の修飾を実現するため、ＡｍpR、fl由来物、Ｌac
Ｚを含有するpＢluescript ＳＫのＡhdl(nukureochido２,０４１)とＳacl(ヌク
レオチド７５９)の間の配列を、欠失させた。ＫanR遺伝子を含有するプラスミド
pＵＣ-４Ｋ(Ｐharｍacia)からの１.２kb Ｐstl断片は、そのトランスクリプシ
ョンに対して反時計回りの方向にpＢluescript ＳＫのＡhdl部位に鈍端連結さ
れた。ヒトサイトメガロウイルスのすぐ上流の遺伝子プロモーター、エンハンサ
ー、およびイントロンＡ配列(ＣＭＶ)を含有する１.６kb Ｓspl/Ｐstl ＤＮＡ
断面は、ＣＭＶプロモーターからの転写が時計回りの方向に進むように、ＫanR
遺伝子のその他の端部に連結された。翻訳開始配列と、ヒト組織プラスミノーゲ
ン活性体シグナルペプチド(ＴＰＡ)をコード化する配列とを含有する合成オリゴ
ヌクレオチドセグメントを使用して、ＣＭＶプロモーターと、原発性分離株ＨI
Ｖ-１ＢＸ０８のgp１４０をコード化する配列を結合した。gp１４０配列は、ア
ミノ酸３３と、gp４１の膜内外ドメインの前で終わる６６６との間のエンベロー
プタンパク質の一部をコード化する(図２参照)。翻訳終止コドンは、gp１４０コ
ーディング配列の端部に配置した。gp１４０コーディング領域の次には、pＲＣ/
ＣＭＶ(Invitrogen)からＰＣＲ増幅させたウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)ポリアデニ
ル化シグナル配列を含有する０.２kb断片がある。ＳＶ４０ポリアデニル化シグ
ナルからの残遺８０bpＤＮＡセグメントは、ＤＮＡ操作が原因となって、pＢlue
script ＳＫのＢＧＨポリＡ配列とＳacl部位の間に残ったが、これはこのプラ
スミドでは作用しない。
０.ＢＸ０８の骨格であり、ＡｍpRをＫanR遺伝子に代え、f１およびＬacＺ領域
の欠失によって修飾した。所望の修飾を実現するため、ＡｍpR、fl由来物、Ｌac
Ｚを含有するpＢluescript ＳＫのＡhdl(nukureochido２,０４１)とＳacl(ヌク
レオチド７５９)の間の配列を、欠失させた。ＫanR遺伝子を含有するプラスミド
pＵＣ-４Ｋ(Ｐharｍacia)からの１.２kb Ｐstl断片は、そのトランスクリプシ
ョンに対して反時計回りの方向にpＢluescript ＳＫのＡhdl部位に鈍端連結さ
れた。ヒトサイトメガロウイルスのすぐ上流の遺伝子プロモーター、エンハンサ
ー、およびイントロンＡ配列(ＣＭＶ)を含有する１.６kb Ｓspl/Ｐstl ＤＮＡ
断面は、ＣＭＶプロモーターからの転写が時計回りの方向に進むように、ＫanR
遺伝子のその他の端部に連結された。翻訳開始配列と、ヒト組織プラスミノーゲ
ン活性体シグナルペプチド(ＴＰＡ)をコード化する配列とを含有する合成オリゴ
ヌクレオチドセグメントを使用して、ＣＭＶプロモーターと、原発性分離株ＨI
Ｖ-１ＢＸ０８のgp１４０をコード化する配列を結合した。gp１４０配列は、ア
ミノ酸３３と、gp４１の膜内外ドメインの前で終わる６６６との間のエンベロー
プタンパク質の一部をコード化する(図２参照)。翻訳終止コドンは、gp１４０コ
ーディング配列の端部に配置した。gp１４０コーディング領域の次には、pＲＣ/
ＣＭＶ(Invitrogen)からＰＣＲ増幅させたウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)ポリアデニ
ル化シグナル配列を含有する０.２kb断片がある。ＳＶ４０ポリアデニル化シグ
ナルからの残遺８０bpＤＮＡセグメントは、ＤＮＡ操作が原因となって、pＢlue
script ＳＫのＢＧＨポリＡ配列とＳacl部位の間に残ったが、これはこのプラ
スミドでは作用しない。
【００３５】 pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８構成を、製造業者の忠告に従ってＨＢ１０１コン
ピテント細胞に導入した(ＧibcoＢＲＬ)。正確な分子クローンを、制限および配
列決定によって同定し、それらのgp１４０の発現を一時トランスフェクションで
試験し、その後、ウェスタン・ブロット分析にかけた。
ピテント細胞に導入した(ＧibcoＢＲＬ)。正確な分子クローンを、制限および配
列決定によって同定し、それらのgp１４０の発現を一時トランスフェクションで
試験し、その後、ウェスタン・ブロット分析にかけた。
【００３６】 免疫化に使用される全てのＤＮＡは、ＥndoＦree Ｐlasｍid Ｋit(Ｑiagen)
を使用して調製した。マウスの筋肉内免疫化では、１００μgのpＣＭＶ.gp１４
０.ＢＸ０８を１００μlのＰＢＳに溶かしたものを、４週間間隔で前脛骨筋に注
射した。遺伝子ガン免疫化(gene gun iｍｍunization)は、Ｈelios Ｇene Ｇu
n Ｓysteｍ(Ｂiorad)を用いて行った。カートリッジは、製造業者の忠告に従っ
て準備した。具体的には、各カートリッジに０.７μgのＤＮＡと０.５gの金が入
るように作製した。免疫化は、各動物に対し、２個のカートリッジを剃毛した腹
部領域上に装着し、４週間間隔で実施した。
を使用して調製した。マウスの筋肉内免疫化では、１００μgのpＣＭＶ.gp１４
０.ＢＸ０８を１００μlのＰＢＳに溶かしたものを、４週間間隔で前脛骨筋に注
射した。遺伝子ガン免疫化(gene gun iｍｍunization)は、Ｈelios Ｇene Ｇu
n Ｓysteｍ(Ｂiorad)を用いて行った。カートリッジは、製造業者の忠告に従っ
て準備した。具体的には、各カートリッジに０.７μgのＤＮＡと０.５gの金が入
るように作製した。免疫化は、各動物に対し、２個のカートリッジを剃毛した腹
部領域上に装着し、４週間間隔で実施した。
【００３７】 実施例２ この実施例は、ペプチドの合成について例示する。
【００３８】 ペプチドＣＬＰ-５０１およびＣＬＰ-５０４の固相ペプチド合成は、製造業者
の標準のプロトコルに従ってＡＢI ４３０Ａ自動化ペプチド合成器で実行した
。このペプチドは、チオクレソール、アニソール、および硫化メチルの存在下、
液体フッ化水素を用いた処理によって固体支持体から切断された。未処理の産物
をトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)で抽出し、ジエチルエーテルで沈澱させた。
の標準のプロトコルに従ってＡＢI ４３０Ａ自動化ペプチド合成器で実行した
。このペプチドは、チオクレソール、アニソール、および硫化メチルの存在下、
液体フッ化水素を用いた処理によって固体支持体から切断された。未処理の産物
をトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)で抽出し、ジエチルエーテルで沈澱させた。
【００３９】 これらのペプチドのアミノ酸配列を表Iに示す。
【００４０】 実施例３ この実施例は、ＣＬＴを再刺激しかつ拡張し、それらのエフェクター機能のア
ッセイを行うための、in vitro細胞培養プロトコルについて例示する。
ッセイを行うための、in vitro細胞培養プロトコルについて例示する。
【００４１】 筋肉内経路または遺伝子ガンデリバリー(gene gun delivery)法を使用して実
施例１で述べたように調製し処方したプラスミド、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８
を注射したＢＡＬＢ/cマウスの脾臓を、最終追加免疫注射の１０〜１１日後に取
り出した。３.０×１０7個の脾臓細胞を、３７℃で５時間試験ペプチドでパルス
化しかつ３０００radで照射された１.３×１０7個の自家ＬＰＳブラストと共に
、２５cｍ2組織培養フラスコ内の１０.０ｍlの完全培地(１０.０％の５６℃熱不
活性化ウシ血清と、培地１ｍl当たりペニシリンＧナトリウム１２０.０単位と、
培地１ｍl当たり硫酸ストレプトマイシン１２０.０μgと、培地１ｍl当たりＬグ
ルタミン０.３５ｍgが補われたＲＰＭI １６４０)で共存培養した。これらの培
養を、ＣＯ２インキュベータ内に何日か３７℃で保持し、次いで応答細胞を、以
下の標準のin vitro ４時間ＣＴＬアッセイでペプチドパルス化Ｐ８１５標的
細胞に対して試験をした。
施例１で述べたように調製し処方したプラスミド、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８
を注射したＢＡＬＢ/cマウスの脾臓を、最終追加免疫注射の１０〜１１日後に取
り出した。３.０×１０7個の脾臓細胞を、３７℃で５時間試験ペプチドでパルス
化しかつ３０００radで照射された１.３×１０7個の自家ＬＰＳブラストと共に
、２５cｍ2組織培養フラスコ内の１０.０ｍlの完全培地(１０.０％の５６℃熱不
活性化ウシ血清と、培地１ｍl当たりペニシリンＧナトリウム１２０.０単位と、
培地１ｍl当たり硫酸ストレプトマイシン１２０.０μgと、培地１ｍl当たりＬグ
ルタミン０.３５ｍgが補われたＲＰＭI １６４０)で共存培養した。これらの培
養を、ＣＯ２インキュベータ内に何日か３７℃で保持し、次いで応答細胞を、以
下の標準のin vitro ４時間ＣＴＬアッセイでペプチドパルス化Ｐ８１５標的
細胞に対して試験をした。
【００４２】 応答細胞を７日間の培養から収集し、ウシ血清が追加されていないＲＰＭI
１６４０培地で１回洗浄した。３〜５×１０6個のＰ８１５細胞を、２６℃の水
浴内で、指定されたペプチド１００μgで一晩インキュベートすることにより、
陽性標的を生成した。次いで標的細胞を、同じ試験のペプチド２５.０μgの存在
下、この標的細胞１×１０6個当たり２５０.０uＣiの51Ｃrにより２６℃で６０
〜７５分間標識した。完全培地で２回洗浄して過剰な51Ｃrを除去した後、底部
がＶ字形の９６個のウェルを有する組織培養プレートの１つのウェル当たり２.
５×１０3個の標的と異なる数の応答細胞とを、３７℃のＣＯ２インキュベータ
内で４時間インキュベートした。次いで各マイクロアッセイ培養からの上澄みの
半分の量を除去し、放射活性を計数した。結果は、以下の方程式を使用して計算
された％で表した。
１６４０培地で１回洗浄した。３〜５×１０6個のＰ８１５細胞を、２６℃の水
浴内で、指定されたペプチド１００μgで一晩インキュベートすることにより、
陽性標的を生成した。次いで標的細胞を、同じ試験のペプチド２５.０μgの存在
下、この標的細胞１×１０6個当たり２５０.０uＣiの51Ｃrにより２６℃で６０
〜７５分間標識した。完全培地で２回洗浄して過剰な51Ｃrを除去した後、底部
がＶ字形の９６個のウェルを有する組織培養プレートの１つのウェル当たり２.
５×１０3個の標的と異なる数の応答細胞とを、３７℃のＣＯ２インキュベータ
内で４時間インキュベートした。次いで各マイクロアッセイ培養からの上澄みの
半分の量を除去し、放射活性を計数した。結果は、以下の方程式を使用して計算
された％で表した。
【００４３】 溶解％＝(実験サンプルの、cpｍを単位とする自発溶解-標識済み標的細胞単独
の、cpｍを単位とする自発溶解)を(標的細胞単独の、cpｍを単位とする全溶解-
標的細胞単独の、cpｍを単位とする自発溶解)で割った商×１００。
の、cpｍを単位とする自発溶解)を(標的細胞単独の、cpｍを単位とする全溶解-
標的細胞単独の、cpｍを単位とする自発溶解)で割った商×１００。
【００４４】 筋肉注射を使用して得られた結果を図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃに示し、一方、
遺伝子ガンデリバリー(gene gun delivery)を使用して得られた結果を図４Ａ、
４Ｂ、および４Ｃに示す。
遺伝子ガンデリバリー(gene gun delivery)を使用して得られた結果を図４Ａ、
４Ｂ、および４Ｃに示す。
【００４５】 実施例４ この実施例は、アルファウイルス発現ベクターpＭＰ８３、pＭＰ８４、および
pＭＰ８８の構成について例示する。
pＭＰ８８の構成について例示する。
【００４６】 実施例１で述べたように調製したＤＮＡベクターpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８
を、拘束型エンドヌクレアーゼＮbeIおよびＢaｍＨIで消化して、ＨIＶ-１gp１
４０配列を放出した。ＮbeI/ＢaｍＨI断片をゲル精製し、以下のアニールされた
オリゴヌクレオチドから作製した合成オリゴヌクレオチドリンカーに連結した。
を、拘束型エンドヌクレアーゼＮbeIおよびＢaｍＨIで消化して、ＨIＶ-１gp１
４０配列を放出した。ＮbeI/ＢaｍＨI断片をゲル精製し、以下のアニールされた
オリゴヌクレオチドから作製した合成オリゴヌクレオチドリンカーに連結した。
【００４７】 オリゴ１-ＴＰＡ-１ ５′-ＴＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＣＡ ＡＴＧ
ＡＡＧ ＡＧＡ ＧＧＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ
ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＧＴＴ ＴＣＧ Ｇ-３′(
配列番号１６) オリゴ２-ＴＰＡ-２ ５′-ＣＴＡ ＧＴＣ ＧＡＡ ＡＣＧ ＡＡＧ ＡＣＴ ＧＣＴ ＣＣＡ
ＣＡＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＣＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＧＣ ＣＣＴ
ＣＴＣ ＴＴＣ ＡＴＴ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ
ＧＡ-３′(配列番号１７) この連結により、ＴＰＡシグナル配列が回復した。得られた断片をＢaｍＨIで
拘束し、得られたＢaｍＨI断片をゲル精製した。ＢaｍＨI断片のヌクレオチド配
列を図５に示す(配列番号１５)。
ＡＡＧ ＡＧＡ ＧＧＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ
ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＧＴＴ ＴＣＧ Ｇ-３′(
配列番号１６) オリゴ２-ＴＰＡ-２ ５′-ＣＴＡ ＧＴＣ ＧＡＡ ＡＣＧ ＡＡＧ ＡＣＴ ＧＣＴ ＣＣＡ
ＣＡＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＣＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＧＣ ＣＣＴ
ＣＴＣ ＴＴＣ ＡＴＴ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ
ＧＡ-３′(配列番号１７) この連結により、ＴＰＡシグナル配列が回復した。得られた断片をＢaｍＨIで
拘束し、得られたＢaｍＨI断片をゲル精製した。ＢaｍＨI断片のヌクレオチド配
列を図５に示す(配列番号１５)。
【００４８】 ＤＮＡ配列を確認した後、ＢaｍＨI断片をpＵＣ１９ベクターから切り離し、
ＢaｍＨI拘束型プラスミドpＭＰ４２、pＭＰ７４、およびpＭＰ７６に連結して
、プラスミドpＭＰ８８、pＭＰ８４、およびpＭＰ８３をそれぞれ作製した。
ＢaｍＨI拘束型プラスミドpＭＰ４２、pＭＰ７４、およびpＭＰ７６に連結して
、プラスミドpＭＰ８８、pＭＰ８４、およびpＭＰ８３をそれぞれ作製した。
【００４９】 ＳＦＶレプリコンを含有するプラスミドpＭＰ４２は、本願の出願人に譲渡さ
れかつその開示を参照により本明細書に組み込むＷＯ９９/２５８５８(１０３８
-８６４)に記載されており、ＡＴＣＣに寄託した(２０３４６１)。pＭＰ４２の
構成を、ＷＯ９９/２５８５８の図２Ａおよび２Ｂに示す。
れかつその開示を参照により本明細書に組み込むＷＯ９９/２５８５８(１０３８
-８６４)に記載されており、ＡＴＣＣに寄託した(２０３４６１)。pＭＰ４２の
構成を、ＷＯ９９/２５８５８の図２Ａおよび２Ｂに示す。
【００５０】 ＳＦＶレプリコンを含有するプラスミドpＭＰ７６は、本願の出願人に譲渡さ
れかつその開示を参照により本明細書に組み込むＷＯ９９/２５８５９(１０３８
-８６２)に記載されており、ＡＴＣＣに寄託した(２０３４６２)。pＭＰ７６の
構成を、ＷＯ９９/２５８５９の図８Ａ〜８Ｄに示す。
れかつその開示を参照により本明細書に組み込むＷＯ９９/２５８５９(１０３８
-８６２)に記載されており、ＡＴＣＣに寄託した(２０３４６２)。pＭＰ７６の
構成を、ＷＯ９９/２５８５９の図８Ａ〜８Ｄに示す。
【００５１】 ＳＦＶレプリコンを含有するプラスミドpＭＰ７４は、ＳＦＶレプリコンへの
ウサギβ-グロブリンイントロンII挿入が不足していること以外、pＭＰ７６と同
一である。このプラスミドは、ＷＯ９９/２５８５９の図８Ａ〜８Ｄに示される
スキームに適切な修飾を行うことによって構築することができる。
ウサギβ-グロブリンイントロンII挿入が不足していること以外、pＭＰ７６と同
一である。このプラスミドは、ＷＯ９９/２５８５９の図８Ａ〜８Ｄに示される
スキームに適切な修飾を行うことによって構築することができる。
【００５２】 実施例５ この実施例は、アルファウイルスベクターを使用した免疫化の結果を示す。
【００５３】 実施例４で述べたように調製した組換えアルファウイルスベクターpＭＰ８８
、pＭＰ８４、およびpＭＰ８３を、実施例１で述べたように調製したプラスミド
pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８とのＢＡＬＢ/cマウスにおける免疫原性比較研究で
使用したが、この場合、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８を使用したマウスの筋肉内
免疫化のための実施例１の手順のアウトラインと、実施例３のＣＴＬアッセイと
に従い、陰性対照としては未修飾のpＭＰ７６およびpＣＭＶを使用した。得られ
た結果を以下の表IIに示す。
、pＭＰ８４、およびpＭＰ８３を、実施例１で述べたように調製したプラスミド
pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８とのＢＡＬＢ/cマウスにおける免疫原性比較研究で
使用したが、この場合、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８を使用したマウスの筋肉内
免疫化のための実施例１の手順のアウトラインと、実施例３のＣＴＬアッセイと
に従い、陰性対照としては未修飾のpＭＰ７６およびpＣＭＶを使用した。得られ
た結果を以下の表IIに示す。
【００５４】 アルファウイルス構成と実施例１のＤＮＡ構成との比較分析によれば、ＣＴＬ
アッセイで同様の結果が示された。予想通り、ＨIＶ-１ ＢＸ０８からのgp１４
０を含有しない負の対照ベクターは、ＣＴＬアッセイで特異的な溶解を示さなか
った。３種のアルファウイルスレプリコン、pＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭ
８８の全ては、ベクターpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８で見られたような特異的な
溶解を示した。２つのタイプのベクターの相違点は、同じ応答を引き起こすのに
必要な核酸を免疫化する量であった。アルファウイルスベクターpＭＰ８３およ
びpＭＰ８８の用量が１μgであるとき、１００μgという非常に高い用量のpＣＭ
Ｖ.gp１４０.ＢＸ０８と同等の応答を示した。
アッセイで同様の結果が示された。予想通り、ＨIＶ-１ ＢＸ０８からのgp１４
０を含有しない負の対照ベクターは、ＣＴＬアッセイで特異的な溶解を示さなか
った。３種のアルファウイルスレプリコン、pＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭ
８８の全ては、ベクターpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８で見られたような特異的な
溶解を示した。２つのタイプのベクターの相違点は、同じ応答を引き起こすのに
必要な核酸を免疫化する量であった。アルファウイルスベクターpＭＰ８３およ
びpＭＰ８８の用量が１μgであるとき、１００μgという非常に高い用量のpＣＭ
Ｖ.gp１４０.ＢＸ０８と同等の応答を示した。
【００５５】 これらの結果を、インターフェロンγ(IＦＮ-γ)アッセイからのベクターで確
認し、その結果を表IIIに示す。このアッセイは、ＣＴＬの活性化を示す脾臓細
胞から分泌されたIＦＮ-γを測定するものとして周知である。この場合でも、ア
ルファウイルスベクターは、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８ベクターよりも約１０
０分の１程度に低い用量で同等の活性化を示した。これらの結果全体は、原発性
分離株ＢＸ０８からgp１４０配列を発現する核酸ベクターでの免疫化によってＭ
ＨＣクラス１拘束型細胞傷害性Ｔ細胞が発生し、使用されるアルファウイルス発
現系は、より低い用量で約１００倍も効果的であったことを示している。
認し、その結果を表IIIに示す。このアッセイは、ＣＴＬの活性化を示す脾臓細
胞から分泌されたIＦＮ-γを測定するものとして周知である。この場合でも、ア
ルファウイルスベクターは、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８ベクターよりも約１０
０分の１程度に低い用量で同等の活性化を示した。これらの結果全体は、原発性
分離株ＢＸ０８からgp１４０配列を発現する核酸ベクターでの免疫化によってＭ
ＨＣクラス１拘束型細胞傷害性Ｔ細胞が発生し、使用されるアルファウイルス発
現系は、より低い用量で約１００倍も効果的であったことを示している。
【００５６】 (開示の概要) この開示をまとめると、本発明は、in vitroおよびin vivoで原発性ＨIＶ-
１分離株ＢＸ０８のgp１４０タンパク質を発現する新規なプラスミドを提供し、
かつ動物にＭＨＣクラス１拘束型細胞傷害性Ｔ細胞を発生させる。本発明の範囲
内で修正を加えることが可能である。
１分離株ＢＸ０８のgp１４０タンパク質を発現する新規なプラスミドを提供し、
かつ動物にＭＨＣクラス１拘束型細胞傷害性Ｔ細胞を発生させる。本発明の範囲
内で修正を加えることが可能である。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８の要素の詳細を示す図である。
【図２】 プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８のgp１４０オープン・リーディング・
フレームのヌクレオチド(配列番号１)および推論されるアミノ酸配列(配列番号
２)を示す図である。
フレームのヌクレオチド(配列番号１)および推論されるアミノ酸配列(配列番号
２)を示す図である。
【図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃ】 ＢＡＬＢ/cマウスにプラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８を筋肉内注射する
ことによって引き起こされる、エフェクター応答を示す図である。
ことによって引き起こされる、エフェクター応答を示す図である。
【図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃ】 ＢＡＬＢ/cマウスにプラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８を遺伝子ガンデリ
バリー(gene gun delivery)することによって引き起こされる、エフェクター応
答を示す図である。
バリー(gene gun delivery)することによって引き起こされる、エフェクター応
答を示す図である。
【図５】 アルファウイルス発現ベクターのＢaｍＨI部位に組み入れるためのＨIＶ-１、
gp１４０ヌクレオチド配列を含有するＢaｍＨI断片(配列番号１５)のヌクレオチ
ド配列を示す図である。
gp１４０ヌクレオチド配列を含有するＢaｍＨI断片(配列番号１５)のヌクレオチ
ド配列を示す図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年３月１３日（２００１．３．１３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１６】 (a)配列番号１を有するヌクレオチド配列またはその相補
的配列と、 (b)配列番号２を有するgp１４０タンパク質をコード化するヌクレオチド配列
またはその相補的配列と、 (c)配列番号１５を有するヌクレオチド配列またはその相補的配列と からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する核酸分子。
的配列と、 (b)配列番号２を有するgp１４０タンパク質をコード化するヌクレオチド配列
またはその相補的配列と、 (c)配列番号１５を有するヌクレオチド配列またはその相補的配列と からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する核酸分子。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年８月２４日（２００１．８．２４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１２】 (a)配列番号１を有するヌクレオチド配列またはその相補
的配列と、 (b)配列番号２を有するgp１４０タンパク質をコード化するヌクレオチド配列
またはその相補的配列と、 (c)配列番号１５を有するヌクレオチド配列またはその相補的配列と からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する核酸分子。
的配列と、 (b)配列番号２を有するgp１４０タンパク質をコード化するヌクレオチド配列
またはその相補的配列と、 (c)配列番号１５を有するヌクレオチド配列またはその相補的配列と からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する核酸分子。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年９月７日（２００１．９．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 (発明の分野) 本発明は、免疫学の分野、特にＨIＶワクチンの技術に関し、詳細には、原発
性ヒト免疫不全ウイルス・タイプ１(ＨIＶ-１)分離株のエンベロープ遺伝子、gp
１４０の細胞外断片の発現に関する。
性ヒト免疫不全ウイルス・タイプ１(ＨIＶ-１)分離株のエンベロープ遺伝子、gp
１４０の細胞外断片の発現に関する。
【０００２】 (関連出願の参照) この出願は、１９９９年２月２４日に出願された同時係属の米国特許出願第０
９/２５６,１９４号の、一部継続出願である。
９/２５６,１９４号の、一部継続出願である。
【０００３】 (発明の背景) 後天性免疫不全症候群(ＡIＤＳ)は、ヒト免疫不全ウイルス(ＨIＶ)に感染した
結果引き起こされる疾患である。現在、ＨIＶ感染からヒト集団を保護すること
ができる有効なワクチンはなく、したがって、効き目のあるＨIＶワクチンとそ
れを投与するためのプロトコルの開発が緊急に必要である。以前は、化学療法に
よって徹底的に不活性化されたＨIＶ-１粒子、ＨIＶ-１のエンベロープ遺伝子(g
p１４０)全体をコード化するワクシニアベクター、および精製された組換え遺伝
子gp１２０が、候補ＨIＶワクチンとして評価されていた。不活性化されたＨIＶ
-１ウイルス製剤によって、Ｔ細胞で媒介される遅延型過敏症(ＤＴＨ)反応が人
体に引き起こされ、ワクシニア/gp１６０およびgp１２０組換えワクチン候補に
よってウイルス中和抗体が生じるが、これらの免疫原の中で、効き目のあるヒト
ＨIＶワクチンであることを示すものはない(参考文献１、この明細書全体を通し
、本発明が関係する現況技術についてより十分に述べるために、括弧内の様々な
参考文献を参照する。各引用に関する完全な書誌情報を、本明細書の終わりに提
供する。これにより、これらの参考文献の開示を参照により本発明の開示に組み
入れる。)。ＨIＶワクチン技術に対する本発明者の関心は、免疫原性で費用効果
の高いＨIＶ-１ ＤＮＡワクチンを開発することであり、それらを単独でまたは
他の形態のＨIＶ-１ワクチン候補と共に使用することによって、ＨIＶ-１に対し
てより有効な免疫反応が生じることになると考えることである。
結果引き起こされる疾患である。現在、ＨIＶ感染からヒト集団を保護すること
ができる有効なワクチンはなく、したがって、効き目のあるＨIＶワクチンとそ
れを投与するためのプロトコルの開発が緊急に必要である。以前は、化学療法に
よって徹底的に不活性化されたＨIＶ-１粒子、ＨIＶ-１のエンベロープ遺伝子(g
p１４０)全体をコード化するワクシニアベクター、および精製された組換え遺伝
子gp１２０が、候補ＨIＶワクチンとして評価されていた。不活性化されたＨIＶ
-１ウイルス製剤によって、Ｔ細胞で媒介される遅延型過敏症(ＤＴＨ)反応が人
体に引き起こされ、ワクシニア/gp１６０およびgp１２０組換えワクチン候補に
よってウイルス中和抗体が生じるが、これらの免疫原の中で、効き目のあるヒト
ＨIＶワクチンであることを示すものはない(参考文献１、この明細書全体を通し
、本発明が関係する現況技術についてより十分に述べるために、括弧内の様々な
参考文献を参照する。各引用に関する完全な書誌情報を、本明細書の終わりに提
供する。これにより、これらの参考文献の開示を参照により本発明の開示に組み
入れる。)。ＨIＶワクチン技術に対する本発明者の関心は、免疫原性で費用効果
の高いＨIＶ-１ ＤＮＡワクチンを開発することであり、それらを単独でまたは
他の形態のＨIＶ-１ワクチン候補と共に使用することによって、ＨIＶ-１に対し
てより有効な免疫反応が生じることになると考えることである。
【０００４】 以前より、本願の譲受人に譲渡された付与済みの欧州特許第４７０,９８０号
および米国特許第５,６３９,８５４号であってそれらの開示が参照により本明細
書に組み込まれている上記特許には、とりわけＨIＶ-１のコアタンパク質、p２
４ＥのＴ細胞エピトープの同定および特徴付けが記載されている。さらに、本願
の譲受人に譲渡された付与済みの米国特許第５,７４９,７６９号および第５,７
９５,９５５号であってそれらの開示が参照により組み込まれている上記特許に
は、ＨIＶ-１のエンベロープまたはコアタンパク質の異なるＢ細胞エピトープの
アミノ酸配列に結合したp２４Ｅを含む免疫原性合成ＨIＶ-１キメラペプチドを
構築する際に、Ｔ細胞エピトープを使用することが記載されている。
および米国特許第５,６３９,８５４号であってそれらの開示が参照により本明細
書に組み込まれている上記特許には、とりわけＨIＶ-１のコアタンパク質、p２
４ＥのＴ細胞エピトープの同定および特徴付けが記載されている。さらに、本願
の譲受人に譲渡された付与済みの米国特許第５,７４９,７６９号および第５,７
９５,９５５号であってそれらの開示が参照により組み込まれている上記特許に
は、ＨIＶ-１のエンベロープまたはコアタンパク質の異なるＢ細胞エピトープの
アミノ酸配列に結合したp２４Ｅを含む免疫原性合成ＨIＶ-１キメラペプチドを
構築する際に、Ｔ細胞エピトープを使用することが記載されている。
【０００５】 (発明の概要) 現在、細胞媒介性免疫(ＣＭI)を引き起こすことが可能なＨIＶ ＤＮＡベース
の免疫原の設計および構築に力が注がれている。この明細書では、本発明者は原
発性ＨIＶ-１分離株、ＨIＶ-１(ＢＸ０８)に発現した細胞外エンベロープ断片、
gp１４０に関心を向けたが、その理由は、このタンパク質がマウスとヒトの両方
の主要組織適合複合体(ＭＨＣ)クラス１対立遺伝子に拘束されたモチーフに富ん
でいるからである。
の免疫原の設計および構築に力が注がれている。この明細書では、本発明者は原
発性ＨIＶ-１分離株、ＨIＶ-１(ＢＸ０８)に発現した細胞外エンベロープ断片、
gp１４０に関心を向けたが、その理由は、このタンパク質がマウスとヒトの両方
の主要組織適合複合体(ＭＨＣ)クラス１対立遺伝子に拘束されたモチーフに富ん
でいるからである。
【０００６】 gp１４０タンパク質を発現する適切に構築された免疫原を用いた免疫化によっ
て、クラス１結合能力を有するペプチドが発生し、その結果、ウイルス感染した
細胞を殺すことが可能なＨIＶ-１特異ＣＴＬを誘発させて、感染を制限すること
が可能になる。
て、クラス１結合能力を有するペプチドが発生し、その結果、ウイルス感染した
細胞を殺すことが可能なＨIＶ-１特異ＣＴＬを誘発させて、感染を制限すること
が可能になる。
【０００７】 本発明者により記述される本発明とは、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８で示され
ＣＭＶプロモーターの制御下でgp１４０を発現するプラスミドが、異なるＨ-２d クラス１遺伝子産物に拘束されたgp１４０タンパク質の複数のエピトープに対す
るＣＴＬ応答を引き起こす際にＢＡＬＢ/cマウスで免疫原性であったということ
を、本発明者が見出したことである。また、セムリキ森林熱ウイルス(ＳＦＶ)ベ
クターをベースとするプラスミド、すなわちpＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭ
Ｐ８８も、ＣＭＶプロモーターの制御下でgp１４０遺伝子を必要とし、同様に免
疫原性であることがわかった。
ＣＭＶプロモーターの制御下でgp１４０を発現するプラスミドが、異なるＨ-２d クラス１遺伝子産物に拘束されたgp１４０タンパク質の複数のエピトープに対す
るＣＴＬ応答を引き起こす際にＢＡＬＢ/cマウスで免疫原性であったということ
を、本発明者が見出したことである。また、セムリキ森林熱ウイルス(ＳＦＶ)ベ
クターをベースとするプラスミド、すなわちpＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭ
Ｐ８８も、ＣＭＶプロモーターの制御下でgp１４０遺伝子を必要とし、同様に免
疫原性であることがわかった。
【０００８】 したがって本発明の一態様では、宿主生物体に遺伝子産物を発現させるための
プロモーターの制御下で、原発性ＨIＶ-１分離株のgp１４０の細胞外断片をコー
ド化する遺伝子、好ましくはＢＸ０８を含むベクターが提供され、それによって
細胞傷害性Ｔ細胞応答が引き起こされる。
プロモーターの制御下で、原発性ＨIＶ-１分離株のgp１４０の細胞外断片をコー
ド化する遺伝子、好ましくはＢＸ０８を含むベクターが提供され、それによって
細胞傷害性Ｔ細胞応答が引き起こされる。
【０００９】 プロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーターであることが好ましい。
ベクターは、好ましくは図１に示すように、プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ
０８の明らかにされた特徴を有するプラスミドベクターでよい。ベクターは、好
ましくはプラスミドpＭＰ８８、pＭＰ８４、またはpＭＰ８３の明らかにされた
特徴を有するプラスミドベクターでもよい。
ベクターは、好ましくは図１に示すように、プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ
０８の明らかにされた特徴を有するプラスミドベクターでよい。ベクターは、好
ましくはプラスミドpＭＰ８８、pＭＰ８４、またはpＭＰ８３の明らかにされた
特徴を有するプラスミドベクターでもよい。
【００１０】 本発明はさらに、ベクターを含有する免疫原性組成物、ならびに本明細書で提
供される免疫原性組成物を宿主に投与することによって宿主内でＨIＶ-１に細胞
傷害性Ｔ細胞応答を発生させる方法を含む。このような免疫原性組成物は、適切
な担体を用いて筋肉内免疫化用に処方することができ、または金の粒子を用いて
遺伝子ガンデリバリー(gene gun delivery)用に処方することができる。
供される免疫原性組成物を宿主に投与することによって宿主内でＨIＶ-１に細胞
傷害性Ｔ細胞応答を発生させる方法を含む。このような免疫原性組成物は、適切
な担体を用いて筋肉内免疫化用に処方することができ、または金の粒子を用いて
遺伝子ガンデリバリー(gene gun delivery)用に処方することができる。
【００１１】 本発明は、宿主内でＨIＶ-１に細胞傷害性Ｔ細胞応答を発生させるための免疫
原として使用するときのベクターにも及び、宿主内でＨIＶ-１に細胞傷害性Ｔ細
胞応答を発生させるための免疫原を製造する際の、ベクターの使用法にも及ぶ。
原として使用するときのベクターにも及び、宿主内でＨIＶ-１に細胞傷害性Ｔ細
胞応答を発生させるための免疫原を製造する際の、ベクターの使用法にも及ぶ。
【００１２】 本発明はさらに、以下に述べるある新規なペプチドよび核酸分子を含む。
【００１３】 (発明の詳細な説明) ＤＮＡ免疫原は、問題の遺伝子をプラズミド発現ベクターに分子クローニング
するために、組換えＤＮＡの技術を使用して構築される。ＤＮＡベースの免疫原
を用いたワクチン接種に関する独自の特徴とは、破壊された細胞全体および処方
されたサブユニット免疫原の使用を必要とする他の形態のワクチン接種であって
研究が行われたケース(参考文献２)の大部分でＭＨＣクラス２拘束型免疫調節応
答を引き起こし易い傾向があるワクチン接種に比べ、このＤＮＡベースの免疫原
の細胞内産物はいったん細胞内に送達されるとＭＨＣクラス１拘束型細胞傷害性
Ｔ細胞を誘発するのに好ましいものになることである。したがって本明細書では
、ウイルスやある特定の腫瘍などの細胞内生物体に対する細胞エフェクター応答
の誘発を最適化するために、ＤＮＡ技術を使用して、ワクチン接種を目的とした
裸のＤＮＡ免疫原を構築することが好都合である。ＤＮＡワクチンがもたらすそ
の他の利点には、(i)それらの産生が容易であること、および(ii)広い温度範囲
にわたって安定であることが含まれる。
するために、組換えＤＮＡの技術を使用して構築される。ＤＮＡベースの免疫原
を用いたワクチン接種に関する独自の特徴とは、破壊された細胞全体および処方
されたサブユニット免疫原の使用を必要とする他の形態のワクチン接種であって
研究が行われたケース(参考文献２)の大部分でＭＨＣクラス２拘束型免疫調節応
答を引き起こし易い傾向があるワクチン接種に比べ、このＤＮＡベースの免疫原
の細胞内産物はいったん細胞内に送達されるとＭＨＣクラス１拘束型細胞傷害性
Ｔ細胞を誘発するのに好ましいものになることである。したがって本明細書では
、ウイルスやある特定の腫瘍などの細胞内生物体に対する細胞エフェクター応答
の誘発を最適化するために、ＤＮＡ技術を使用して、ワクチン接種を目的とした
裸のＤＮＡ免疫原を構築することが好都合である。ＤＮＡワクチンがもたらすそ
の他の利点には、(i)それらの産生が容易であること、および(ii)広い温度範囲
にわたって安定であることが含まれる。
【００１４】 マウスおよびヒトのＣＴＬ抗原決定基を予測するために最近使用されてきた一
般的なモデルは、未変性タンパク質分子の一次配列からのそれぞれのＭＨＣクラ
ス１分子に関する結合モチーフの確認を含んでいた(参考文献３〜５を参照)。し
たがって、Ｈ-２Ｄd遺伝子産物のペプチド結合溝に結合し入り込むのに最も好都
合なモチーフは、通常、８〜１０個のアミノ酸の長さであることが提案されてい
る。大部分のケースでは、これらのペプチドはアミノ(Ｎ-)末端に近い２位およ
び３位にグリシンおよびプロリン(ＧＰ)といったアンカー残基を含有し、カルボ
キシ(Ｃ-)末端にロイシンまたはフェニルアラニンといったアンカー残基を含有
することがわかっており、これらは膜結合Ｈ-２Ｄd分子のペプチド結合溝のそれ
ぞれの「ポケット」との相互作用に役立つものである。Ｈ-２dハプロタイプのそ
の他のクラス１対立遺伝子Ｋdに限定されるモチーフは、２位にチロシンを含有
することが報告され、Ｃ末端ではイソロイシン、バリン、またはロイシンである
可能性があった。ヒトＭＨＣクラス１分子、ＨＬＡ-Ａ０２０１から単離された
ペプチドの研究によれば、大部分のケースにおいて、アンカー残基は２位でロイ
シンまたはメチオニンであり、Ｃ末端ではバリンまたはロイシンであることが、
同様に明らかになった。
般的なモデルは、未変性タンパク質分子の一次配列からのそれぞれのＭＨＣクラ
ス１分子に関する結合モチーフの確認を含んでいた(参考文献３〜５を参照)。し
たがって、Ｈ-２Ｄd遺伝子産物のペプチド結合溝に結合し入り込むのに最も好都
合なモチーフは、通常、８〜１０個のアミノ酸の長さであることが提案されてい
る。大部分のケースでは、これらのペプチドはアミノ(Ｎ-)末端に近い２位およ
び３位にグリシンおよびプロリン(ＧＰ)といったアンカー残基を含有し、カルボ
キシ(Ｃ-)末端にロイシンまたはフェニルアラニンといったアンカー残基を含有
することがわかっており、これらは膜結合Ｈ-２Ｄd分子のペプチド結合溝のそれ
ぞれの「ポケット」との相互作用に役立つものである。Ｈ-２dハプロタイプのそ
の他のクラス１対立遺伝子Ｋdに限定されるモチーフは、２位にチロシンを含有
することが報告され、Ｃ末端ではイソロイシン、バリン、またはロイシンである
可能性があった。ヒトＭＨＣクラス１分子、ＨＬＡ-Ａ０２０１から単離された
ペプチドの研究によれば、大部分のケースにおいて、アンカー残基は２位でロイ
シンまたはメチオニンであり、Ｃ末端ではバリンまたはロイシンであることが、
同様に明らかになった。
【００１５】 含有されるマウスとヒトのＭＨＣクラス１拘束型結合モチーフの数を決定する
ために、ＣＴＬ誘発免疫原としてＨIＶ-１(ＢＸ０８)gp１４０が適切かどうかを
予測アルゴリズムによって評価した。結合モチーフのアミノ酸配列と、それらを
表すペプチドの名称を、以下の表１に示す。このようなペプチドは新規であり、
本明細書で特許請求する。異なるＨ-２d拘束型クラス１対立遺伝子、すなわちＤ d およびＫdに対して結合モチーフが存在することにより、原発性分離株ＢＸ０８
のＨIＶ-１のgp１４０を発現させて以下の実施例で記述するように構築されたプ
ラスミド、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８、pＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８
８の免疫原性をＨ-２dハプロタイプの近交系マウス系統ＢＡＬＢ/cで研究するこ
とが可能になる。プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８の要素および拘束部位
を、図１に示す。プラスミドpＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８８の構築に
ついて、以下の実施例５で述べる。プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８、pＭ
Ｐ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８８のgp１４０オープン・リーディング・フレ
ームのヌクレオチド配列(配列番号１)および推論されるアミノ酸配列(配列番号
２)を図２に示すが、これらは独自の配列と考えられ、それらの補体と共に本明
細書で特許請求する。
ために、ＣＴＬ誘発免疫原としてＨIＶ-１(ＢＸ０８)gp１４０が適切かどうかを
予測アルゴリズムによって評価した。結合モチーフのアミノ酸配列と、それらを
表すペプチドの名称を、以下の表１に示す。このようなペプチドは新規であり、
本明細書で特許請求する。異なるＨ-２d拘束型クラス１対立遺伝子、すなわちＤ d およびＫdに対して結合モチーフが存在することにより、原発性分離株ＢＸ０８
のＨIＶ-１のgp１４０を発現させて以下の実施例で記述するように構築されたプ
ラスミド、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８、pＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８
８の免疫原性をＨ-２dハプロタイプの近交系マウス系統ＢＡＬＢ/cで研究するこ
とが可能になる。プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８の要素および拘束部位
を、図１に示す。プラスミドpＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８８の構築に
ついて、以下の実施例５で述べる。プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８、pＭ
Ｐ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８８のgp１４０オープン・リーディング・フレ
ームのヌクレオチド配列(配列番号１)および推論されるアミノ酸配列(配列番号
２)を図２に示すが、これらは独自の配列と考えられ、それらの補体と共に本明
細書で特許請求する。
【００１６】 表１に見られるヒトＭＨＣクラス１対立遺伝子、ＨＬＡ-Ａ０２０１に対する
いくつかの結合モチーフの位置は、プラズミドが、適切な免疫化レジメンの下で
、対象であるヒトのこのクラス１分子についてこれらのエピトープを対象とする
ＣＴＬ応答を引き起こす可能性があることを、暗に示していた。
いくつかの結合モチーフの位置は、プラズミドが、適切な免疫化レジメンの下で
、対象であるヒトのこのクラス１分子についてこれらのエピトープを対象とする
ＣＴＬ応答を引き起こす可能性があることを、暗に示していた。
【００１７】 プラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８の免疫原性についてＢＡＬＢ/cマウス
で研究した。筋肉内経路を使用して１回の用量あたり１００.０μgでプラスミド
を注射した３種類の研究結果を図３に示す。ペプチド、すなわちＣＬＰ-５０１
およびＣＬＰ-５０４(配列番号３,５)をそれぞれ含有するＤdおよびＫd拘束型モ
チーフを用いて個々にパルス化した照射型自家ＬＰＳブラストによりプラスミド
免疫化動物の脾臓細胞をin vitroで再刺激すると、ＣＴＬが発生し、それぞれ
のペプチドと共に存在するＰ８１５標的を死滅させることがわかった(図３Ａお
よび図３Ｂ)。表１に、ペプチドのアミノ酸配列を示す。エフェクタと標的(Ｅ:
Ｔ)の比が同じであるときの応答の大きさを比較することにより、ＣＬＰ-５０１
ペプチドに対するＤd-拘束型応答は免疫優性であり、ＣＬＰ-５０４ペプチドに
対するＫd-拘束型応答は亜優性であることが明らかになった。エフェクターの増
大につながるin vitro再刺激は特異的であったが、その理由は、照射されたＬ
ＰＳブラストのみ(ペプチドで処理していないもの)を同じ数だけ追加しても、試
験が行われる特異標的のいずれも死滅させることが可能な集団培養では、エフェ
クターが全く発生しないからである。gp１４０を挿入していないpＣＭＶベクタ
ーを注射したマウス対照群だけが、ＣＴＬの２つの副集団のいずれも発生させな
いということが発見され、したがってプラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８は
確かに免疫原性であることが確認された。
で研究した。筋肉内経路を使用して１回の用量あたり１００.０μgでプラスミド
を注射した３種類の研究結果を図３に示す。ペプチド、すなわちＣＬＰ-５０１
およびＣＬＰ-５０４(配列番号３,５)をそれぞれ含有するＤdおよびＫd拘束型モ
チーフを用いて個々にパルス化した照射型自家ＬＰＳブラストによりプラスミド
免疫化動物の脾臓細胞をin vitroで再刺激すると、ＣＴＬが発生し、それぞれ
のペプチドと共に存在するＰ８１５標的を死滅させることがわかった(図３Ａお
よび図３Ｂ)。表１に、ペプチドのアミノ酸配列を示す。エフェクタと標的(Ｅ:
Ｔ)の比が同じであるときの応答の大きさを比較することにより、ＣＬＰ-５０１
ペプチドに対するＤd-拘束型応答は免疫優性であり、ＣＬＰ-５０４ペプチドに
対するＫd-拘束型応答は亜優性であることが明らかになった。エフェクターの増
大につながるin vitro再刺激は特異的であったが、その理由は、照射されたＬ
ＰＳブラストのみ(ペプチドで処理していないもの)を同じ数だけ追加しても、試
験が行われる特異標的のいずれも死滅させることが可能な集団培養では、エフェ
クターが全く発生しないからである。gp１４０を挿入していないpＣＭＶベクタ
ーを注射したマウス対照群だけが、ＣＴＬの２つの副集団のいずれも発生させな
いということが発見され、したがってプラスミドpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８は
確かに免疫原性であることが確認された。
【００１８】 pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８プラスミドは、遺伝子ガンデリバリー(gene gun d
elivery)された場合、同様に免疫原性であることがわかった。図４に示す結果に
よれば、プラスミド０.７μgの用量で２回注射をして上述のin vitro再刺激と
同じ条件を使用した場合、ＣＬＰ-５０１およびＣＬＰ-５０４を認識するＣＴＬ
が検出されたが(図４Ａおよび４Ｂ)、ベクターpＣＭＶが与えられた動物群のみ
にエフェクター応答が生じなかったことが示されている(図４Ｃ)。
elivery)された場合、同様に免疫原性であることがわかった。図４に示す結果に
よれば、プラスミド０.７μgの用量で２回注射をして上述のin vitro再刺激と
同じ条件を使用した場合、ＣＬＰ-５０１およびＣＬＰ-５０４を認識するＣＴＬ
が検出されたが(図４Ａおよび４Ｂ)、ベクターpＣＭＶが与えられた動物群のみ
にエフェクター応答が生じなかったことが示されている(図４Ｃ)。
【００１９】 プラスミドpＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭＰ８８の免疫原性について別々
に調査を行ったが、この場合上述の手順に従って、ＤＮＡを３つの異なる用量レ
ベルで、すなわち１.０μg、１０.０μg、および１００.０μgをＢＡＬＢ/cマウ
スに筋肉送達し、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８と比較した。得られた結果を以下
の表IIおよび表IIIに記載する。ＣＴＬの活性化は、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８
の場合よりも著しく低い用量のアルファウイルスベクターで実現される。
に調査を行ったが、この場合上述の手順に従って、ＤＮＡを３つの異なる用量レ
ベルで、すなわち１.０μg、１０.０μg、および１００.０μgをＢＡＬＢ/cマウ
スに筋肉送達し、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８と比較した。得られた結果を以下
の表IIおよび表IIIに記載する。ＣＴＬの活性化は、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８
の場合よりも著しく低い用量のアルファウイルスベクターで実現される。
【００２０】 本発明の様々な実施形態は、ＨIＶ感染のワクチン接種、診断、および治療の
分野における多くの適用例を有することが、当業者に明らかに理解される。その
ような用法の別の非限定的な考察を、以下にさらに提示する。
分野における多くの適用例を有することが、当業者に明らかに理解される。その
ような用法の別の非限定的な考察を、以下にさらに提示する。
【００２１】 ＤＮＡベクターを含有する、ワクチンを含む免疫原性組成物は、ポリヌクレオ
チドを投与するために、注射可能なものとして、生理学的に許容される溶液また
はエマルジョンに調製することができる。以下により詳細に述べるように、ＤＮ
Ａベクターは、核酸リポソームとして(例えばＷＯ９３/２４６４０に記載されて
いる)レシチンリポソームや当技術分野で知られているその他のリポソームなど
のリポソームに関連付けられる可能性があり、またはＤＮＡベクターはアジュバ
ントに関連付けられる可能性がある。
チドを投与するために、注射可能なものとして、生理学的に許容される溶液また
はエマルジョンに調製することができる。以下により詳細に述べるように、ＤＮ
Ａベクターは、核酸リポソームとして(例えばＷＯ９３/２４６４０に記載されて
いる)レシチンリポソームや当技術分野で知られているその他のリポソームなど
のリポソームに関連付けられる可能性があり、またはＤＮＡベクターはアジュバ
ントに関連付けられる可能性がある。
【００２２】 カチオン性脂質を含むリポソームは、自然発生的にかつ迅速に、ＤＮＡやＲＮ
Ａなどのポリアニオンと相互に作用し、その結果、ポリヌクレオチドを最大１０
０％捕捉するリポソーム/核酸複合体になる。さらに、ポリカチオン性複合体は
細胞膜と融合し、その結果、リソソーム区画の分解酵素をバイパスするポリヌク
レオチドの細胞内送達が得られる。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４/２７４３５
は、カチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含む遺伝子免疫化用の組成物につ
いて記述している。
Ａなどのポリアニオンと相互に作用し、その結果、ポリヌクレオチドを最大１０
０％捕捉するリポソーム/核酸複合体になる。さらに、ポリカチオン性複合体は
細胞膜と融合し、その結果、リソソーム区画の分解酵素をバイパスするポリヌク
レオチドの細胞内送達が得られる。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４/２７４３５
は、カチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含む遺伝子免疫化用の組成物につ
いて記述している。
【００２３】 カルシウムイオンやウイルスタンパク、その他のトランスフェクション促進剤
など、核酸の細胞取込みを助ける薬剤は、ベクターと共に使用することが有利で
あると考えられる。
など、核酸の細胞取込みを助ける薬剤は、ベクターと共に使用することが有利で
あると考えられる。
【００２４】 ポリヌクレオチド免疫原性製剤は、生分解性の持効性粒子を含むマイクロカプ
セルとして処方することもできる。このため米国特許第５,１５１,２６４号は、
Ｂio Ｖecteurs Ｓupra Ｍoleculaires(ＢＶＳＭ)と呼ばれているリン脂質/
糖脂質/多糖類の性質の特定の担体について記述している。粒状の担体は、その
複数層の１つが生物学的に活性である様々な分子を輸送しようとするものである
。
セルとして処方することもできる。このため米国特許第５,１５１,２６４号は、
Ｂio Ｖecteurs Ｓupra Ｍoleculaires(ＢＶＳＭ)と呼ばれているリン脂質/
糖脂質/多糖類の性質の特定の担体について記述している。粒状の担体は、その
複数層の１つが生物学的に活性である様々な分子を輸送しようとするものである
。
【００２５】 米国特許第５,０７５,１０９号は、抗原であるトリニトロフェニル化キーホー
ルリンペットヘモシニアンとブドウ球菌エンテロトキシンＢを５０:５０でポリ(
ＤＬ-ラクチド-コ-グリコライド)にカプセル化することについて記述している。
カプセル化用のその他のポリマーは、ポリ(グリコライド)やポリ(ＤＬ-ラクチド
-コ-グリコライド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリ(ラクチド
-コ-カプロラクトン)、ポリ(エステルアミド)、ポリオルトエステル、ポリ(８-
ヒドロキシ酪酸)、ポリ無水物などが提案されている。
ルリンペットヘモシニアンとブドウ球菌エンテロトキシンＢを５０:５０でポリ(
ＤＬ-ラクチド-コ-グリコライド)にカプセル化することについて記述している。
カプセル化用のその他のポリマーは、ポリ(グリコライド)やポリ(ＤＬ-ラクチド
-コ-グリコライド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリ(ラクチド
-コ-カプロラクトン)、ポリ(エステルアミド)、ポリオルトエステル、ポリ(８-
ヒドロキシ酪酸)、ポリ無水物などが提案されている。
【００２６】 公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９１/０６２８２は、複数の生体接着性のマイクロ
スフェアおよび抗原を含む送達賦形剤について記述している。マイクロスフェア
は、デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲン、またはアルブミンのもの
である。この送達賦形剤は、特に鼻粘膜全体にわたってワクチンを取り込もうと
するものである。送達賦形剤は、追加として吸収エンハンサーを含有することが
できる。
スフェアおよび抗原を含む送達賦形剤について記述している。マイクロスフェア
は、デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲン、またはアルブミンのもの
である。この送達賦形剤は、特に鼻粘膜全体にわたってワクチンを取り込もうと
するものである。送達賦形剤は、追加として吸収エンハンサーを含有することが
できる。
【００２７】 本発明の特定の実施形態では、ベクターを標的とする標的分子と共に、ベクタ
ーを、免疫系の細胞を含む選択された細胞に送達することができる。
ーを、免疫系の細胞を含む選択された細胞に送達することができる。
【００２８】 ベクターは、様々な手順によって宿主に送達することができ、例えばＴang他(
参考文献６)は、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)をコード化するＤＮＡで被覆された
金の極小の弾丸をマウスの皮膚に導入し、それによって、マウス中に抗ＢＧＨ抗
体を産生することを開示しており、一方、Ｆurth他(参考文献７)は、ジェット式
注射器を使用して、生きている動物の皮膚、筋肉、脂肪、および乳房組織をトラ
ンスフェクションできることを示した。
参考文献６)は、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)をコード化するＤＮＡで被覆された
金の極小の弾丸をマウスの皮膚に導入し、それによって、マウス中に抗ＢＧＨ抗
体を産生することを開示しており、一方、Ｆurth他(参考文献７)は、ジェット式
注射器を使用して、生きている動物の皮膚、筋肉、脂肪、および乳房組織をトラ
ンスフェクションできることを示した。
【００２９】 生物寄託 本明細書に記載され参照される、一次分離株のgp１４０の細胞外断片をコーデ
ィングする核酸を含有するある特定のベクター、ならびに前駆アルファウイルス
ベクターを、ブダペスト条約に基づいてこの出願を提出する前に、１０８０１
Ｕniversity Ｂoulevard、Ｍanassas、Ｖirginia ２０１１０-２２０９、ＵＳ
Ａに位置するＡｍerica Ｔype Ｃulture Ｃollection(ＡＴＣＣ)に寄託した
。寄託したベクターのサンプルは、米国特許出願に基づいて特許を付与すること
によって一般に入手できるようになり、かつ寄託菌に課されまたは加えられた全
ての制約が取り除かれることになる。さらに、寄託機関は、生存しているサンプ
ルを分配することができない場合に寄託菌を取り替えることになる。寄託された
実施形態は本発明の単なる例示を意図するものであるので、本明細書に記述され
特許請求される本発明の範囲は、寄託された生体物質によって限定されない。本
出願に記載される均等なまたは類似の抗原をコード化する核酸を含有する任意の
均等なまたは類似のベクターは、本発明の範囲内に含まれる。
ィングする核酸を含有するある特定のベクター、ならびに前駆アルファウイルス
ベクターを、ブダペスト条約に基づいてこの出願を提出する前に、１０８０１
Ｕniversity Ｂoulevard、Ｍanassas、Ｖirginia ２０１１０-２２０９、ＵＳ
Ａに位置するＡｍerica Ｔype Ｃulture Ｃollection(ＡＴＣＣ)に寄託した
。寄託したベクターのサンプルは、米国特許出願に基づいて特許を付与すること
によって一般に入手できるようになり、かつ寄託菌に課されまたは加えられた全
ての制約が取り除かれることになる。さらに、寄託機関は、生存しているサンプ
ルを分配することができない場合に寄託菌を取り替えることになる。寄託された
実施形態は本発明の単なる例示を意図するものであるので、本明細書に記述され
特許請求される本発明の範囲は、寄託された生体物質によって限定されない。本
出願に記載される均等なまたは類似の抗原をコード化する核酸を含有する任意の
均等なまたは類似のベクターは、本発明の範囲内に含まれる。
【００３０】 寄託概要 プラスミド ＡＴＣＣ 寄託日 pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８ ２０３８３９ １９９９年３月９日 pＭＰ４２ ２０３８３９ １９９８年１１月１２日 pＭＰ７６ ２０３８３９ １９９８年１１月１２日 実施例 上記開示は本発明について一般的に述べている。以下の特定の実施例を参照す
ることによって、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、単な
る例示を目的として記述し、本発明を限定しようとするものではない。状況が手
段を提示しまたは提供することができるので、均等物の形態および置換したもの
の変更が企図される。本明細書では特定の用語を使用したが、そのような用語は
説明を目的とするものであり、限定目的とするものではない。
ることによって、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、単な
る例示を目的として記述し、本発明を限定しようとするものではない。状況が手
段を提示しまたは提供することができるので、均等物の形態および置換したもの
の変更が企図される。本明細書では特定の用語を使用したが、そのような用語は
説明を目的とするものであり、限定目的とするものではない。
【００３１】 この開示の中に明確に記述されていないプラスミド構築、ペプチド合成、細胞
培養、ＣＴＬアッセイ、およびその他の試験手順の方法は科学文献に詳細に報告
されており、当業者の範囲内に十分に包含される。
培養、ＣＴＬアッセイ、およびその他の試験手順の方法は科学文献に詳細に報告
されており、当業者の範囲内に十分に包含される。
【００３２】 実施例１ この実施例は、プラスミド、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８の構築について例示
する。
する。
【００３３】 プラスミド、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８は、様々な供給源からの配列セグメ
ントを含有し、その構成要素を図１に示す。プラスミドのgp１４０オープン・リ
ーディング・フレームのヌクレオチド(配列番号１)および導き出されたアミノ酸
配列(配列番号２)を図２に示す。
ントを含有し、その構成要素を図１に示す。プラスミドのgp１４０オープン・リ
ーディング・フレームのヌクレオチド(配列番号１)および導き出されたアミノ酸
配列(配列番号２)を図２に示す。
【００３４】 原核ベクターpＢluescript ＳＫ(Ｓtratagene)はプラスミドpＣＭＶ.gp１４
０.ＢＸ０８の骨格であり、ＡｍpRをＫanR遺伝子に代え、f１およびＬacＺ領域
の欠失によって修飾した。所望の修飾を実現するため、ＡｍpR、fl由来物、Ｌac
Ｚを含有するpＢluescript ＳＫのＡhdl(nukureochido２,０４１)とＳacl(ヌク
レオチド７５９)の間の配列を、欠失させた。ＫanR遺伝子を含有するプラスミド
pＵＣ-４Ｋ(Ｐharｍacia)からの１.２kb Ｐstl断片は、そのトランスクリプシ
ョンに対して反時計回りの方向にpＢluescript ＳＫのＡhdl部位に鈍端連結さ
れた。ヒトサイトメガロウイルスのすぐ上流の遺伝子プロモーター、エンハンサ
ー、およびイントロンＡ配列(ＣＭＶ)を含有する１.６kb Ｓspl/Ｐstl ＤＮＡ
断面は、ＣＭＶプロモーターからの転写が時計回りの方向に進むように、ＫanR
遺伝子のその他の端部に連結された。翻訳開始配列と、ヒト組織プラスミノーゲ
ン活性体シグナルペプチド(ＴＰＡ)をコード化する配列とを含有する合成オリゴ
ヌクレオチドセグメントを使用して、ＣＭＶプロモーターと、原発性分離株ＨI
Ｖ-１ＢＸ０８のgp１４０をコード化する配列を結合した。gp１４０配列は、ア
ミノ酸３３と、gp４１の膜内外ドメインの前で終わる６６６との間のエンベロー
プタンパク質の一部をコード化する(図２参照)。翻訳終止コドンは、gp１４０コ
ーディング配列の端部に配置した。gp１４０コーディング領域の次には、pＲＣ/
ＣＭＶ(Invitrogen)からＰＣＲ増幅させたウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)ポリアデニ
ル化シグナル配列を含有する０.２kb断片がある。ＳＶ４０ポリアデニル化シグ
ナルからの残遺８０bpＤＮＡセグメントは、ＤＮＡ操作が原因となって、pＢlue
script ＳＫのＢＧＨポリＡ配列とＳacl部位の間に残ったが、これはこのプラ
スミドでは作用しない。
０.ＢＸ０８の骨格であり、ＡｍpRをＫanR遺伝子に代え、f１およびＬacＺ領域
の欠失によって修飾した。所望の修飾を実現するため、ＡｍpR、fl由来物、Ｌac
Ｚを含有するpＢluescript ＳＫのＡhdl(nukureochido２,０４１)とＳacl(ヌク
レオチド７５９)の間の配列を、欠失させた。ＫanR遺伝子を含有するプラスミド
pＵＣ-４Ｋ(Ｐharｍacia)からの１.２kb Ｐstl断片は、そのトランスクリプシ
ョンに対して反時計回りの方向にpＢluescript ＳＫのＡhdl部位に鈍端連結さ
れた。ヒトサイトメガロウイルスのすぐ上流の遺伝子プロモーター、エンハンサ
ー、およびイントロンＡ配列(ＣＭＶ)を含有する１.６kb Ｓspl/Ｐstl ＤＮＡ
断面は、ＣＭＶプロモーターからの転写が時計回りの方向に進むように、ＫanR
遺伝子のその他の端部に連結された。翻訳開始配列と、ヒト組織プラスミノーゲ
ン活性体シグナルペプチド(ＴＰＡ)をコード化する配列とを含有する合成オリゴ
ヌクレオチドセグメントを使用して、ＣＭＶプロモーターと、原発性分離株ＨI
Ｖ-１ＢＸ０８のgp１４０をコード化する配列を結合した。gp１４０配列は、ア
ミノ酸３３と、gp４１の膜内外ドメインの前で終わる６６６との間のエンベロー
プタンパク質の一部をコード化する(図２参照)。翻訳終止コドンは、gp１４０コ
ーディング配列の端部に配置した。gp１４０コーディング領域の次には、pＲＣ/
ＣＭＶ(Invitrogen)からＰＣＲ増幅させたウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)ポリアデニ
ル化シグナル配列を含有する０.２kb断片がある。ＳＶ４０ポリアデニル化シグ
ナルからの残遺８０bpＤＮＡセグメントは、ＤＮＡ操作が原因となって、pＢlue
script ＳＫのＢＧＨポリＡ配列とＳacl部位の間に残ったが、これはこのプラ
スミドでは作用しない。
【００３５】 pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８構成を、製造業者の忠告に従ってＨＢ１０１コン
ピテント細胞に導入した(ＧibcoＢＲＬ)。正確な分子クローンを、制限および配
列決定によって同定し、それらのgp１４０の発現を一時トランスフェクションで
試験し、その後、ウェスタン・ブロット分析にかけた。
ピテント細胞に導入した(ＧibcoＢＲＬ)。正確な分子クローンを、制限および配
列決定によって同定し、それらのgp１４０の発現を一時トランスフェクションで
試験し、その後、ウェスタン・ブロット分析にかけた。
【００３６】 免疫化に使用される全てのＤＮＡは、ＥndoＦree Ｐlasｍid Ｋit(Ｑiagen)
を使用して調製した。マウスの筋肉内免疫化では、１００μgのpＣＭＶ.gp１４
０.ＢＸ０８を１００μlのＰＢＳに溶かしたものを、４週間間隔で前脛骨筋に注
射した。遺伝子ガン免疫化(gene gun iｍｍunization)は、Ｈelios Ｇene Ｇu
n Ｓysteｍ(Ｂiorad)を用いて行った。カートリッジは、製造業者の忠告に従っ
て準備した。具体的には、各カートリッジに０.７μgのＤＮＡと０.５gの金が入
るように作製した。免疫化は、各動物に対し、２個のカートリッジを剃毛した腹
部領域上に装着し、４週間間隔で実施した。
を使用して調製した。マウスの筋肉内免疫化では、１００μgのpＣＭＶ.gp１４
０.ＢＸ０８を１００μlのＰＢＳに溶かしたものを、４週間間隔で前脛骨筋に注
射した。遺伝子ガン免疫化(gene gun iｍｍunization)は、Ｈelios Ｇene Ｇu
n Ｓysteｍ(Ｂiorad)を用いて行った。カートリッジは、製造業者の忠告に従っ
て準備した。具体的には、各カートリッジに０.７μgのＤＮＡと０.５gの金が入
るように作製した。免疫化は、各動物に対し、２個のカートリッジを剃毛した腹
部領域上に装着し、４週間間隔で実施した。
【００３７】 実施例２ この実施例は、ペプチドの合成について例示する。
【００３８】 ペプチドＣＬＰ-５０１およびＣＬＰ-５０４の固相ペプチド合成は、製造業者
の標準のプロトコルに従ってＡＢI ４３０Ａ自動化ペプチド合成器で実行した
。このペプチドは、チオクレソール、アニソール、および硫化メチルの存在下、
液体フッ化水素を用いた処理によって固体支持体から切断された。未処理の産物
をトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)で抽出し、ジエチルエーテルで沈澱させた。
の標準のプロトコルに従ってＡＢI ４３０Ａ自動化ペプチド合成器で実行した
。このペプチドは、チオクレソール、アニソール、および硫化メチルの存在下、
液体フッ化水素を用いた処理によって固体支持体から切断された。未処理の産物
をトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)で抽出し、ジエチルエーテルで沈澱させた。
【００３９】 これらのペプチドのアミノ酸配列を表Iに示す。
【００４０】 実施例３ この実施例は、ＣＬＴを再刺激しかつ拡張し、それらのエフェクター機能のア
ッセイを行うための、in vitro細胞培養プロトコルについて例示する。
ッセイを行うための、in vitro細胞培養プロトコルについて例示する。
【００４１】 筋肉内経路または遺伝子ガンデリバリー(gene gun delivery)法を使用して実
施例１で述べたように調製し処方したプラスミド、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８
を注射したＢＡＬＢ/cマウスの脾臓を、最終追加免疫注射の１０〜１１日後に取
り出した。３.０×１０7個の脾臓細胞を、３７℃で５時間試験ペプチドでパルス
化しかつ３０００radで照射された１.３×１０7個の自家ＬＰＳブラストと共に
、２５cｍ2組織培養フラスコ内の１０.０ｍlの完全培地(１０.０％の５６℃熱不
活性化ウシ血清と、培地１ｍl当たりペニシリンＧナトリウム１２０.０単位と、
培地１ｍl当たり硫酸ストレプトマイシン１２０.０μgと、培地１ｍl当たりＬグ
ルタミン０.３５ｍgが補われたＲＰＭI １６４０)で共存培養した。これらの培
養を、ＣＯ２インキュベータ内に何日か３７℃で保持し、次いで応答細胞を、以
下の標準のin vitro ４時間ＣＴＬアッセイでペプチドパルス化Ｐ８１５標的
細胞に対して試験をした。
施例１で述べたように調製し処方したプラスミド、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８
を注射したＢＡＬＢ/cマウスの脾臓を、最終追加免疫注射の１０〜１１日後に取
り出した。３.０×１０7個の脾臓細胞を、３７℃で５時間試験ペプチドでパルス
化しかつ３０００radで照射された１.３×１０7個の自家ＬＰＳブラストと共に
、２５cｍ2組織培養フラスコ内の１０.０ｍlの完全培地(１０.０％の５６℃熱不
活性化ウシ血清と、培地１ｍl当たりペニシリンＧナトリウム１２０.０単位と、
培地１ｍl当たり硫酸ストレプトマイシン１２０.０μgと、培地１ｍl当たりＬグ
ルタミン０.３５ｍgが補われたＲＰＭI １６４０)で共存培養した。これらの培
養を、ＣＯ２インキュベータ内に何日か３７℃で保持し、次いで応答細胞を、以
下の標準のin vitro ４時間ＣＴＬアッセイでペプチドパルス化Ｐ８１５標的
細胞に対して試験をした。
【００４２】 応答細胞を７日間の培養から収集し、ウシ血清が追加されていないＲＰＭI
１６４０培地で１回洗浄した。３〜５×１０6個のＰ８１５細胞を、２６℃の水
浴内で、指定されたペプチド１００μgで一晩インキュベートすることにより、
陽性標的を生成した。次いで標的細胞を、同じ試験のペプチド２５.０μgの存在
下、この標的細胞１×１０6個当たり２５０.０uＣiの51Ｃrにより２６℃で６０
〜７５分間標識した。完全培地で２回洗浄して過剰な51Ｃrを除去した後、底部
がＶ字形の９６個のウェルを有する組織培養プレートの１つのウェル当たり２.
５×１０3個の標的と異なる数の応答細胞とを、３７℃のＣＯ２インキュベータ
内で４時間インキュベートした。次いで各マイクロアッセイ培養からの上澄みの
半分の量を除去し、放射活性を計数した。結果は、以下の方程式を使用して計算
された％で表した。
１６４０培地で１回洗浄した。３〜５×１０6個のＰ８１５細胞を、２６℃の水
浴内で、指定されたペプチド１００μgで一晩インキュベートすることにより、
陽性標的を生成した。次いで標的細胞を、同じ試験のペプチド２５.０μgの存在
下、この標的細胞１×１０6個当たり２５０.０uＣiの51Ｃrにより２６℃で６０
〜７５分間標識した。完全培地で２回洗浄して過剰な51Ｃrを除去した後、底部
がＶ字形の９６個のウェルを有する組織培養プレートの１つのウェル当たり２.
５×１０3個の標的と異なる数の応答細胞とを、３７℃のＣＯ２インキュベータ
内で４時間インキュベートした。次いで各マイクロアッセイ培養からの上澄みの
半分の量を除去し、放射活性を計数した。結果は、以下の方程式を使用して計算
された％で表した。
【００４３】 溶解％＝(実験サンプルの、cpｍを単位とする自発溶解-標識済み標的細胞単独
の、cpｍを単位とする自発溶解)を(標的細胞単独の、cpｍを単位とする全溶解-
標的細胞単独の、cpｍを単位とする自発溶解)で割った商×１００。
の、cpｍを単位とする自発溶解)を(標的細胞単独の、cpｍを単位とする全溶解-
標的細胞単独の、cpｍを単位とする自発溶解)で割った商×１００。
【００４４】 筋肉注射を使用して得られた結果を図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃに示し、一方、
遺伝子ガンデリバリー(gene gun delivery)を使用して得られた結果を図４Ａ、
４Ｂ、および４Ｃに示す。
遺伝子ガンデリバリー(gene gun delivery)を使用して得られた結果を図４Ａ、
４Ｂ、および４Ｃに示す。
【００４５】 実施例４ この実施例は、アルファウイルス発現ベクターpＭＰ８３、pＭＰ８４、および
pＭＰ８８の構成について例示する。
pＭＰ８８の構成について例示する。
【００４６】 実施例１で述べたように調製したＤＮＡベクターpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８
を、拘束型エンドヌクレアーゼＮbeIおよびＢaｍＨIで消化して、ＨIＶ-１gp１
４０配列を放出した。ＮbeI/ＢaｍＨI断片をゲル精製し、以下のアニールされた
オリゴヌクレオチドから作製した合成オリゴヌクレオチドリンカーに連結した。
を、拘束型エンドヌクレアーゼＮbeIおよびＢaｍＨIで消化して、ＨIＶ-１gp１
４０配列を放出した。ＮbeI/ＢaｍＨI断片をゲル精製し、以下のアニールされた
オリゴヌクレオチドから作製した合成オリゴヌクレオチドリンカーに連結した。
【００４７】 オリゴ１-ＴＰＡ-１ ５′-ＴＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＣＡ ＡＴＧ
ＡＡＧ ＡＧＡ ＧＧＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ
ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＧＴＴ ＴＣＧ Ｇ-３′(
配列番号１６) オリゴ２-ＴＰＡ-２ ５′-ＣＴＡ ＧＴＣ ＧＡＡ ＡＣＧ ＡＡＧ ＡＣＴ ＧＣＴ ＣＣＡ
ＣＡＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＣＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＧＣ ＣＣＴ
ＣＴＣ ＴＴＣ ＡＴＴ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ
ＧＡ-３′(配列番号１７) この連結により、ＴＰＡシグナル配列が回復した。得られた断片をＢaｍＨIで
拘束し、得られたＢaｍＨI断片をゲル精製した。ＢaｍＨI断片のヌクレオチド配
列を図５に示す(配列番号１５)。
ＡＡＧ ＡＧＡ ＧＧＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ
ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＧＴＴ ＴＣＧ Ｇ-３′(
配列番号１６) オリゴ２-ＴＰＡ-２ ５′-ＣＴＡ ＧＴＣ ＧＡＡ ＡＣＧ ＡＡＧ ＡＣＴ ＧＣＴ ＣＣＡ
ＣＡＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＣＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＧＣ ＣＣＴ
ＣＴＣ ＴＴＣ ＡＴＴ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ
ＧＡ-３′(配列番号１７) この連結により、ＴＰＡシグナル配列が回復した。得られた断片をＢaｍＨIで
拘束し、得られたＢaｍＨI断片をゲル精製した。ＢaｍＨI断片のヌクレオチド配
列を図５に示す(配列番号１５)。
【００４８】 ＤＮＡ配列を確認した後、ＢaｍＨI断片をpＵＣ１９ベクターから切り離し、
ＢaｍＨI拘束型プラスミドpＭＰ４２、pＭＰ７４、およびpＭＰ７６に連結して
、プラスミドpＭＰ８８、pＭＰ８４、およびpＭＰ８３をそれぞれ作製した。
ＢaｍＨI拘束型プラスミドpＭＰ４２、pＭＰ７４、およびpＭＰ７６に連結して
、プラスミドpＭＰ８８、pＭＰ８４、およびpＭＰ８３をそれぞれ作製した。
【００４９】 ＳＦＶレプリコンを含有するプラスミドpＭＰ４２は、本願の出願人に譲渡さ
れかつその開示を参照により本明細書に組み込むＷＯ９９/２５８５８(１０３８
-８６４)に記載されており、ＡＴＣＣに寄託した(２０３４６１)。pＭＰ４２の
構成を、ＷＯ９９/２５８５８の図２Ａおよび２Ｂに示す。
れかつその開示を参照により本明細書に組み込むＷＯ９９/２５８５８(１０３８
-８６４)に記載されており、ＡＴＣＣに寄託した(２０３４６１)。pＭＰ４２の
構成を、ＷＯ９９/２５８５８の図２Ａおよび２Ｂに示す。
【００５０】 ＳＦＶレプリコンを含有するプラスミドpＭＰ７６は、本願の出願人に譲渡さ
れかつその開示を参照により本明細書に組み込むＷＯ９９/２５８５９(１０３８
-８６２)に記載されており、ＡＴＣＣに寄託した(２０３４６２)。pＭＰ７６の
構成を、ＷＯ９９/２５８５９の図８Ａ〜８Ｄに示す。
れかつその開示を参照により本明細書に組み込むＷＯ９９/２５８５９(１０３８
-８６２)に記載されており、ＡＴＣＣに寄託した(２０３４６２)。pＭＰ７６の
構成を、ＷＯ９９/２５８５９の図８Ａ〜８Ｄに示す。
【００５１】 ＳＦＶレプリコンを含有するプラスミドpＭＰ７４は、ＳＦＶレプリコンへの
ウサギβ-グロブリンイントロンII挿入が不足していること以外、pＭＰ７６と同
一である。このプラスミドは、ＷＯ９９/２５８５９の図８Ａ〜８Ｄに示される
スキームに適切な修飾を行うことによって構築することができる。
ウサギβ-グロブリンイントロンII挿入が不足していること以外、pＭＰ７６と同
一である。このプラスミドは、ＷＯ９９/２５８５９の図８Ａ〜８Ｄに示される
スキームに適切な修飾を行うことによって構築することができる。
【００５２】 実施例５ この実施例は、アルファウイルスベクターを使用した免疫化の結果を示す。
【００５３】 実施例４で述べたように調製した組換えアルファウイルスベクターpＭＰ８８
、pＭＰ８４、およびpＭＰ８３を、実施例１で述べたように調製したプラスミド
pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８とのＢＡＬＢ/cマウスにおける免疫原性比較研究で
使用したが、この場合、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８を使用したマウスの筋肉内
免疫化のための実施例１の手順のアウトラインと、実施例３のＣＴＬアッセイと
に従い、陰性対照としては未修飾のpＭＰ７６およびpＣＭＶを使用した。得られ
た結果を以下の表IIに示す。
、pＭＰ８４、およびpＭＰ８３を、実施例１で述べたように調製したプラスミド
pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８とのＢＡＬＢ/cマウスにおける免疫原性比較研究で
使用したが、この場合、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８を使用したマウスの筋肉内
免疫化のための実施例１の手順のアウトラインと、実施例３のＣＴＬアッセイと
に従い、陰性対照としては未修飾のpＭＰ７６およびpＣＭＶを使用した。得られ
た結果を以下の表IIに示す。
【００５４】 アルファウイルス構成と実施例１のＤＮＡ構成との比較分析によれば、ＣＴＬ
アッセイで同様の結果が示された。予想通り、ＨIＶ-１ ＢＸ０８からのgp１４
０を含有しない負の対照ベクターは、ＣＴＬアッセイで特異的な溶解を示さなか
った。３種のアルファウイルスレプリコン、pＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭ
８８の全ては、ベクターpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８で見られたような特異的な
溶解を示した。２つのタイプのベクターの相違点は、同じ応答を引き起こすのに
必要な核酸を免疫化する量であった。アルファウイルスベクターpＭＰ８３およ
びpＭＰ８８の用量が１μgであるとき、１００μgという非常に高い用量のpＣＭ
Ｖ.gp１４０.ＢＸ０８と同等の応答を示した。
アッセイで同様の結果が示された。予想通り、ＨIＶ-１ ＢＸ０８からのgp１４
０を含有しない負の対照ベクターは、ＣＴＬアッセイで特異的な溶解を示さなか
った。３種のアルファウイルスレプリコン、pＭＰ８３、pＭＰ８４、およびpＭ
８８の全ては、ベクターpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８で見られたような特異的な
溶解を示した。２つのタイプのベクターの相違点は、同じ応答を引き起こすのに
必要な核酸を免疫化する量であった。アルファウイルスベクターpＭＰ８３およ
びpＭＰ８８の用量が１μgであるとき、１００μgという非常に高い用量のpＣＭ
Ｖ.gp１４０.ＢＸ０８と同等の応答を示した。
【００５５】 これらの結果を、インターフェロンγ(IＦＮ-γ)アッセイからのベクターで確
認し、その結果を表IIIに示す。このアッセイは、ＣＴＬの活性化を示す脾臓細
胞から分泌されたIＦＮ-γを測定するものとして周知である。この場合でも、ア
ルファウイルスベクターは、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８ベクターよりも約１０
０分の１程度に低い用量で同等の活性化を示した。これらの結果全体は、原発性
分離株ＢＸ０８からgp１４０配列を発現する核酸ベクターでの免疫化によってＭ
ＨＣクラス１拘束型細胞傷害性Ｔ細胞が発生し、使用されるアルファウイルス発
現系は、より低い用量で約１００倍も効果的であったことを示している。
認し、その結果を表IIIに示す。このアッセイは、ＣＴＬの活性化を示す脾臓細
胞から分泌されたIＦＮ-γを測定するものとして周知である。この場合でも、ア
ルファウイルスベクターは、pＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８ベクターよりも約１０
０分の１程度に低い用量で同等の活性化を示した。これらの結果全体は、原発性
分離株ＢＸ０８からgp１４０配列を発現する核酸ベクターでの免疫化によってＭ
ＨＣクラス１拘束型細胞傷害性Ｔ細胞が発生し、使用されるアルファウイルス発
現系は、より低い用量で約１００倍も効果的であったことを示している。
【００５６】 (開示の概要) この開示をまとめると、本発明は、in vitroおよびin vivoで原発性ＨIＶ-
１分離株ＢＸ０８のgp１４０タンパク質を発現する新規なプラスミドを提供し、
かつ動物にＭＨＣクラス１拘束型細胞傷害性Ｔ細胞を発生させる。本発明の範囲
内で修正を加えることが可能である。
１分離株ＢＸ０８のgp１４０タンパク質を発現する新規なプラスミドを提供し、
かつ動物にＭＨＣクラス１拘束型細胞傷害性Ｔ細胞を発生させる。本発明の範囲
内で修正を加えることが可能である。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
【表３】
【００６０】 参考文献
【００６１】
【表４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カオ、シ−シーアン カナダ国 エム９シー ４エックス６ オ ンタリオ州 エトビコーク ザ ウエスト モール 716 アパートメント 408 (72)発明者 パーソン、ロイ カナダ国 エム２エム ４ジェイ４ オン タリオ州 ノース ヨーク ビショップ アヴェニュー ７ ユニット 604 (72)発明者 ロヴィンスキー、ベンジャミン カナダ国 エル４ジェイ ５エイチ６ オ ンタリオ州 ソーンヒル ウィンディング レイン 70 (72)発明者 パーリントン、マーク カナダ国 エル３ゼット １ゼット４ オ ンタリオ州 ブラットフォード マーティ ン ストリート 45 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA35 CA04 DA06 EA04 FA02 HA17 4B065 AA91X AA97Y AB01 CA24 CA45 4H045 AA10 AA30 BA10 CA05 DA86 EA29 EA31 EA53 FA74
Claims (19)
- 【請求項１】 宿主生物体内に遺伝子産物を発現させるためのプロモーター
の制御下で、原発性ＨIＶ-１分離株のgp１４０の細胞外断片をコード化する遺伝
子を含むベクター。 - 【請求項２】 前記原発性ＨIＶ-１分離株がＢＸ０８である請求項１に記載
のベクター。 - 【請求項３】 プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーターである請
求項２に記載のベクター。 - 【請求項４】 図１に示すpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８(ＡＴＣＣ Ｎo.２０
３８３９)の明らかにされた特徴を有する請求項１に記載のベクター。 - 【請求項５】 pＭＰ８３、pＭＰ８４、またはpＭＰ８８の明らかにされた
特徴を有する請求項１に記載のベクター。 - 【請求項６】 宿主生物体内に遺伝子産物を発現させるためのプロモーター
の制御下で原発性ＨIＶ-１分離株のgp１４０の細胞外断片をコード化する遺伝子
を含むベクターを含む免疫原性組成物。 - 【請求項７】 前記原発性ＨIＶ-１分離株がＢＸ０８である請求項６に記載
の免疫原性組成物。 - 【請求項８】 プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーターである請
求項６に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項９】 ベクターがpＣＭＶ.gp１４０.ＢＸ０８である請求項６に記
載の免疫原性組成物。 - 【請求項１０】 ベクターがpＭＰ８３、pＭＰ８４、またはpＭＰ８８であ
る請求項６に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項１１】 医薬品として許容される液体担体を用いて筋肉内免疫化用
に処方された請求項６に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項１２】 金の粒子を用いて遺伝子ガンデリバリー(gene gun delive
ry)用に処方された請求項６に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項１３】 宿主内のＨIＶ-１に細胞傷害性Ｔ細胞応答を発生させる方
法であって、請求項６の免疫原性組成物を宿主に投与することを含む方法。 - 【請求項１４】 宿主内のＨIＶ-１に細胞傷害性Ｔ細胞応答を発生させるた
めの免疫原として使用するときの請求項１に記載のベクター。 - 【請求項１５】 宿主内のＨIＶ-１に細胞傷害性Ｔ細胞応答を発生させるた
めの免疫原の製造における請求項１に記載のベクターの使用法。 - 【請求項１６】 表Iに示す配列番号３〜１４を有する群から選択されるア
ミノ酸配列を有するペプチド。 - 【請求項１７】 配列番号３を有する請求項１６に記載のペプチド。
- 【請求項１８】 配列番号５を有する請求項１６に記載のペプチド。
- 【請求項１９】 (a)配列番号１を有するヌクレオチド配列またはその相補
的配列と、 (b)配列番号２を有するgp１４０タンパク質をコード化するヌクレオチド配列
またはその相補的配列と、 (c)配列番号１５を有するヌクレオチド配列またはその相補的配列と を有する群から選択されたヌクレオチド配列を有する核酸分子。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/256,194 US6395714B1 (en) | 1999-02-24 | 1999-02-24 | Expressing gp140 fragment of primary HIV-1 isolate |
| US09/256,194 | 1999-02-24 | ||
| PCT/CA2000/000190 WO2000050604A1 (en) | 1999-02-24 | 2000-02-24 | Expressing gp140 fragment of primary hiv-1 isolate |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000601168A Pending JP2002541777A (ja) | 1999-02-24 | 2000-02-24 | 原発性ｈｉｖ−１分離株のｇｐ１４０断片の発現 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5976541A (en) * | 1988-01-26 | 1999-11-02 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Potent peptide for stimulation of cytotoxic T lymphocytes specific for the HIV-1 envelope |
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| GB8910145D0 (en) | 1989-05-03 | 1989-06-21 | Connaught Lab | Synthetic peptides for an hiv-1 vaccine |
| GB2237510B (en) | 1989-11-04 | 1993-09-15 | Danbiosyst Uk | Small particle drug compositions for nasal administration |
| CA2134773A1 (en) | 1992-06-04 | 1993-12-09 | Robert J. Debs | Methods and compositions for in vivo gene therapy |
| US20020168374A1 (en) * | 1992-08-07 | 2002-11-14 | Ralph T. Kubo | Hla binding peptides and their uses |
| EP1624068A1 (en) | 1993-06-01 | 2006-02-08 | Life Technologies Inc. | Genetic immunization with cationic lipids |
| US5864027A (en) | 1993-06-07 | 1999-01-26 | Genentech, Inc. | HIV envelope polypeptides |
| BR9406821A (pt) | 1993-06-09 | 1996-03-26 | Connaught Lab | Peptideo sintético composiçao imunogenica kit de diagnostico útil para dectar anticorpos especificos de hiv em amostra de teste kit de diagnostico para detectar antigenos de hiv em amostra de teste codificaçao de molécula de ácido nucléico e anticorpo |
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| US6066716A (en) * | 1996-09-20 | 2000-05-23 | University Of New Mexico | Purified heat shock protein complexes |
| JP2002520000A (ja) * | 1998-05-13 | 2002-07-09 | エピミューン， インコーポレイテッド | 免疫応答を刺激するための発現ベクターおよびそのベクターの使用方法 |
-
1999
- 1999-02-24 US US09/256,194 patent/US6395714B1/en not_active Expired - Fee Related
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