JP2002541065A - タンパク質−タンパク質相互作用を調節するための方法および組成物 - Google Patents

タンパク質−タンパク質相互作用を調節するための方法および組成物

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ホスホセリンおよびホスホスレオニン結合モジュールとしてのWWドメインの方法および組成物に関する。本発明のWWドメイン含有ポリペプチドは、例えば、細胞生育の調節、神経退行性疾患の処置；WWドメイン含有ポリペプチドとリン酸化リガンドの間の相互作用を調節する物質のスクリーニング；医薬標的化媒体として；タンパク質分解の指示に；および異常WWドメイン含有ぽりぺプチドまたはそのリガンドにより特徴付けられるある疾患または状態の処置に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 (技術背景) 生物のホメオスタシスはタンパク質相互作用モジュールと、細胞増殖、細胞死
およびタンパク質分解のような生物学的プロセスのための細胞シグナル伝達経路
を活性化および不活性化するためのリガンドの間の相互作用に依存する。タンパ
ク質相互作用モジュールは、標的タンパク質またはその基質に密接した位置酵素
における特異的配列に結合したアミノ酸の保存領域である。例えば、srcホモロ
ジードメイン２(SH２)は標的細胞のホスホチロシン残基に結合し、レセプター活
性化およびレセプター−リガンド結合をメディエートする(Pawson, T., et al.,
Science 278:2075 (1997))。例は、約４０アミノ酸残基の、３重鎖βシートに
おける二つの不変のトリプトファン(W)を伴う、高度に保存された領域であるWW
ドメインである(Sudol, M. Prog. Biophys. Mol. Biol. 65:113 (1996); Rotin,
D. Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:115 (1998))。あるポリペプチドの
WWドメインは、プロリンリッチ配列に結合することによりタンパク質−タンパク
質相互作用に関与しており、そのリガンドの多くがプロリンリッチ配列を含まな
い(Sudol, M. Prog. Biophys. Mol. Biol. 65:113 (1996); Staub, O. et al. S
tructure 4:495 (1996), Rotin, D., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 228:115
(1998))。したがって、WWドメイン含有タンパク質の、生理学的プロセスにおけ
る細胞シグナル伝達事象のメディエートにおける役割は知られていない。しかし
、細胞性プロセスにおいて重要である可能性のために、プロテイン−プロテイン
相互作用および細胞シグナル伝達におけるWWドメインの役割の明確な理解の解明
は重要である。
【０００２】 (発明の要約) 本発明は、WWドメインがホスホセリンまたはホスホスレオニン結合モジュール
であるという発見に基づく。本明細書で更に記載するように、本発明はまたWWド
メインそれ自体がリン酸化され、WWドメインポリペプチドのリン酸化／脱リン酸
化が、WWドメインポリペプチドとそのリン酸化リガンドとの間の相互作用を調節
するという発見に基づく。この発見の結果として、方法および組成物が、タンパ
ク質−タンパク質相互作用、例えば、シグナル伝達または調節ポリペプチドとそ
のリン酸化リガンドの間の相互作用を調節するために利用可能となる。
【０００３】 本発明は、WWドメイン含有ポリペプチドのリン酸化リガンドへの結合を調節す
ることを含む、タンパク質−タンパク質相互作用の調節法に関する。具体的な態
様において、WWドメインポリペプチドはリン酸化リガンドの調節ドメインと相互
作用する。他の態様において、WWドメイン含有ポリペプチドとリン酸化リガンド
の間の結合相互作用を阻害する。更に別の態様において、WWドメイン含有ポリペ
プチドとリン酸化リガンドの結合相互作用を促進する。本明細書で使用する限り
、リン酸化リガンドは、WWドメイン含有ポリペプチドに結合するホスホセリンま
たはホスホスレオニンを含む分子(例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模
倣または小有機分子)である。例えば、本発明に特に包含されるリガンドは、タ
ウタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、Cdc25C、Cdc27、Plk1、NIMA、Myt
1、Rab4、Weel、Mos、Sox3、Xbr-lb、MP75(E-MAP-115)、MP110(Cdc5)、MP68およ
びMP30を含む。本発明に特に包含されるWWドメイン含有ポリペプチドは、Pin1、
NEDD4、YAP、FE65、フォーミン結合タンパク質、ジストロフィン、ウトロピン、
Ess1p/Ptflp、Rsp5、Pub1、Dodo、Msb1、ORF1、YKB2、DP71、C38D4.5、P9659.21
、Yo61、Yfx1、ZK1248.15、KO15c11、CD45AP、FBP11、FBP21、FBP23、FBP28およ
びFBP30を含む。
【０００４】 また本発明に包含されるのは、WWドメインを模倣する分子であり、本明細書で
WWドメイン模倣分子または偽WWドメイン分子と呼ぶ。このような分子は本明細書
に記載のWWドメインと構造類似性を有するか、またはコンセンサス配列LxxGWtx6 Gtx(Y/F)(Y/F)h(N/D)Hx(T/S)tT(T/S)tWxtPt(配列番号４０)(その教示を本明細書
にその全体を引用して包含させるRotin, D., Curr Top. Microbiol. Immunol. 2
28:115-133 (1998)に記載のように、x＝任意のアミノ酸、t＝ターンライクまた
は極性残基、およびh＝疎水性アミノ酸)を含む。例えば、WWドメインはコンセン
サス配列LPxGWExxxxxxxGxxYYxNHxTxWxxP(配列番号４１)(x＝任意のアミノ酸)を
含むことができる。WWドメイン模倣分子は、アミノ酸配列、ペプチド、ペプチド
模倣物またはポリペプチドである。WWドメイン模倣分子はホスホセリン／ホスホ
スレオニンリガンドと相互作用でき、またはそれらと結合でき、したがってリン
酸化リガンドの活性を調節する。
【０００５】 また本発明に包含されるのはリン酸化リガンド配列であり、本明細書ではリン
酸化リガンド模倣物、リン酸化偽リガンドと呼ぶ。リン酸化リガンド模倣物は、
ホスホセリンまたはホスホスレオニン残基(複数もある)を含み、リガンドがWWド
メイン含有ポリペプチドと相互作用するか、それと結合する、したがってWWドメ
イン含有ポリペプチドの活性を調節するように十分な長さであり、十分なアミノ
酸同一性を共有するアミノ酸配列、ペプチド、ペプチド模倣物またはポリペプチ
ドである。
【０００６】 WWドメインに対するリン酸化リガンドまたはリガンド模倣物、またはWWドメイ
ン含有ポリペプチドの活性を調節する方法は、リガンドと相互作用するWWドメイ
ンまたはWWドメイン模倣物の提供を含み、リン酸化リガンド、リガンド模倣物、
WWドメインポリペプチドまたはWWドメイン模倣物の活性が調節(例えば、阻害ま
たは促進)される。活性は、リガンドとWWドメインの間の結合活性；WWドメイン
ポリペプチドの酵素的／調節活性、またはそれらの両方であり得る。具体的な態
様において、リガンドは、WWドメインまたはWWドメイン含有ポリペプチドと相互
作用(例えば結合)する。例えば、Pin1のプロリル−ペプチジルcis-transイソメ
ラーゼ活性またはNedd4のユビキチンリガーゼ活性は、WWドメインのリン酸化リ
ガンドへの続く結合を増加できる。
【０００７】 他の態様において、本発明は、WWドメイン含有ポリペプチドの有糸分裂調節タ
ンパク質への結合を含む、細胞生育の調節に関する。具体的態様において、WWド
メイン含有ポリペプチドはPin1である。
【０００８】 本発明の他の態様は、WWドメインのPin1の有糸分裂調節タンパク質への結合の
メディエートを含む、細胞生育の調節に関する。WWドメインはリン酸化リガンド
(例えば、NIMA)に結合でき、細胞増殖をもたらす。細胞増殖は、WWドメインのリ
ン酸化状態の調節により調節できる。WWドメインのPin1の脱リン酸化は、WWドメ
インのリン酸化リガンドへの結合を導き、細胞増殖をもたらす。同様に、WWドメ
インのリン酸化はリン酸化リガンドへの結合を阻害し、細胞死をもたらす。
【０００９】 本発明はまたWWドメインと中枢(例えば、脳および脊髄)および末梢神経系、お
よび中枢または末梢神経系に付随する細胞(例えば、骨格筋)の細胞内のリガンド
(例えば、ニューロン、膠細胞、シュワン細胞)の相互作用の調節による、神経退
行性疾患の調節法を包含する。WWドメインと中枢神経細胞標的の間の相互作用は
、例えば、神経細胞死(例えば、アポトーシス、壊死)の妨害、または神経機能の
回復により、神経退行を阻害、中止、予防または回復できる。
【００１０】 本発明の更なる態様は、リガンドのWWドメインへの結合のメディエートを含む
、WWドメイン含有ポリペプチドのリガンドのリン酸化機能の調節法を包含する。
特に本発明により包含されるのは、微小管結合を導くWWドメインのタウへの結合
がタウの微小管への結合をもたらす、Pin1のWWドメインのタウのリン酸化スレオ
ニン２３１への結合の促進を含む、アルツハイマー病における過リン酸化タウタ
ンパク質の活性の調節法である。他の本発明の方法は、ジストロフィンのWWドメ
インとリン酸化リガンドの間の相互作用の調節法に関する。
【００１１】 本発明は更にWWドメイン含有ポリペプチドとリガンドの相互作用を調節する物
質の同定法を含み、リガンドはホスホセリンまたはスレオニンリガンドであり、
WWドメイン含有ポリペプチドを１個以上の試験物質と接触させる；試験物質とWW
ドメイン含有ポリペプチドを相互作用に適当な条件下に維持する；そして試験物
質をWWドメイン含有ポリペプチドの間の相互作用を測定する段階を含み、ここで
相互作用が、試験物質がWWドメイン含有ポリペプチドとリガンドの間の相互作用
の調節をすることを示す。他の態様において、試験物質により調節されるWWドメ
インとリガンドの間の相互作用は結合相互作用である。他の態様において、相互
作用は酵素活性、特にPin1のプロリル−ペプチジルcis-transイソメラーゼ活性
またはNedd4のユビキチンリガーゼ活性である。WWドメインとリガンドの間の結
合相互作用または酵素活性は、試験物質の存在により増加または減少され得る。
このように、試験物質は、WWドメインとリガンドの間の相互作用のアンタゴニス
トまたはアゴニストであり得る。
【００１２】 本発明はまた、WWドメインに少なくとも一つの変異を含むWWドメイン含有ポリ
ペプチドの変異体を提供する。変異WWドメイン含有ポリペプチドがリガンドに結
合する能力は変わる。一つの態様において、結合能は促進される。他の態様にお
いて、結合能は減少される。変異WWドメイン含有ポリペプチドは、また変えられ
た酵素的、触媒的または調節的活性を有し得る。一つの態様において、WWドメイ
ン含有ポリペプチドの酵素的活性は促進される。他の態様において、酵素活性は
減少する。変異体は、Pin1の２３位のチロシン、３４位のトリプトファン、１４
位のアルギニン、１６位のセリン、１８位のセリン、または他のWWドメイン含有
タンパク質の対応する位置からなる群から選択される、アミノ酸の修飾を含む。
修飾アミノ酸は、アルギニン、グルタミン酸またはフェニルアラニンからなる群
から選択されるアミノ酸で置換される。
【００１３】 本発明はまた、WWドメインポリペプチドのセリン残基のリン酸化を調節するこ
とを含む、タンパク質分子の調節法に関する。特に、WWドメイン含有ポリペプチ
ドはユビキチンリガーゼNedd4である。一つの態様において、セリン残基のリン
酸化はWWドメイン含有ポリペプチドとリガンドの結合を導き、ポリペプチド分解
を開始する。他の態様において、WWドメイン含有ポリペプチドのセリン残基の脱
リン酸化は、WWドメイン含有ポリペプチドとリガンドの結合を防止し、したがっ
てポリペプチド分解を防止する。本発明の方法によるタンパク質分解の調節は、
細胞生育の調節をもたらすことができる。更に別の態様において、タンパク質分
解の調節は細胞生育の調節を導く。特に、ユビキチン経路によるCdc25分解の阻
害は、細胞死をもたらす。
【００１４】 本発明の更に別の態様において、哺乳類にリガンドの調節に有効な一定量のWW
ドメインが乳ポリペプチドを挿入し、それにより状態を軽減することを含む、状
態がWWドメイン含有ポリペプチドに対するリガンドの変化に由来し、リガンドが
ホスホセリンまたはホスホスレオニンリガンドである、哺乳類におけるWWドメイ
ン含有ポリペプチドメディエート状態の処置法に関する。
【００１５】 他の態様において、本発明は、哺乳類に状態を軽減する有効な一定量のWWドメ
イン含有ポリペプチドを挿入することを含む、状態がWWドメイン含有ポリペプチ
ドの変化によりもたらされ、WWドメインに対するリガンドがホスホセリンまたは
ホスホスレオニンを含む、哺乳類におけるWWドメイン含有ポリペプチドメディエ
ート状態の処置法に関する。
【００１６】 本発明は更に、医薬とWWドメイン含有ポリペプチドまたはフラグメントを適当
な条件下で合わせ、複合体を形成させる；そして複合体を哺乳類に投与し、複合
体とリン酸化リガンドが相互作用しそれにより状態が軽減することを含む、状態
がWWドメイン含有ポリペプチドに対するリン酸化リガンドの変化によりもたらさ
れる、哺乳類の状態を処置するための医薬の送達法に関する。
【００１７】 本明細書に記載の本発明は、シグナル伝達または調節タンパク質とそのリン酸
化リガンドの間の結合相互作用のような、タンパク質−タンパク質相互作用を調
節するための組成物および方法を提供する。本方法は、WWドメイン含有ペプチド
とそのリン酸化リガンドの間の相互作用の阻害または促進を可能にする。本明細
書に記載の方法は、細胞生育の調節；細胞分解に関するタンパク質の標的化；ア
ルツハイマー病、拳闘家痴呆、ダウン症、パーキンソン病、ピック病のような神
経退行性において、タウが微小管に結合し、微小管結合を促進または回復させる
機能の回復；WWドメイン含有ポリペプチドとそのリン酸化リガンドの相互作用を
変える物質の同定；および哺乳類における疾患を処置するための、医薬のWWドメ
イン含有ポリペプチドのリガンドへの標的化に有用であり得る。本方法は、ホス
ホセリン／ホスホスレオニン結合モジュール(WWドメイン含有ポリペプチド)とそ
の細胞性リガンドの相互作用への接近の手段を提供する。
【００１８】 (図面の簡単な説明) 図１は、Pin1 WWドメインのリンタンパク質(pSer)への、リンペプチドによる
が、しかし非リン酸化(Ser)またはプロリンリッチ(Pro)ペプチドによるものでは
ない結合の競合のグラフ的提示である。 図２は、選択WWドメインのアミノ酸配列アラインメントである。Pin1／ヒト(
配列番号１)；Ess1/S.c.(配列番号２)；Nedd4/マウス(配列番号３)；Dmd/ヒト(
配列番号４)；FbpII/マウス(配列番号５)；FE65/ラット(配列番号６)およびYap/
マウス８配列番号７)。頭部および底部の線は、そのままのPin1のX線構造要素、
および単離YAP WWドメインにおけるNMR構造要素を各々示す。黒色囲中の白文字
は、変異がリンタンパク質との相互作用に影響するPin1WWドメインにおける残基
を定義する。白色囲中の黒文字は、変異が検出可能に影響しない残基を定義する
。配列上の数はヒトPin1配列を参照する。
【００１９】 図３は、YEPベクターにおいてPin1またはその変異cDNAで置換された、十分に
機能化されたPTF１ゲノムフラグメントを記載する。HAタグをN末端に添加し、タ
ンパク質発現を検出した。 図４Aは、Pin1抗体(Pin1 Ab)を使用した酵素結合免疫収着検定法により検出し
たPin1のタウペプチドへの結合親和性のグラフ的提示である。 図４Bは、Pin1とリン酸化(pT231)または非リン酸化(T231)タウペプチドの結合
親和性のグラフ的提示である。
【００２０】 図５Aは、タウ誘導チューブリン結合に影響するPin1の無能のグラフ的提示で
ある。 図５Bは、リン酸化タウ(pTau)の、Pin1Y２３A変異体存在下ではなく、Pin1存
在下での、微小管結合の能力のグラフ的提示である。 図６は、６番目のアミノ酸から始まるPin1のWWドメイン／ヒト(配列番号３３)
；ESS1/9C(配列番号３４)；Yap/ヒト(配列番号３５)；Nedd4/マウス(配列番号３
６)；RSPS/9C(配列番号３７)；Dmd/ヒト(配列番号３８)；FE65/ラット(配列番号
３９)およびコンセンサス(配列番号４２)のアミノ酸配列を示す。 図７は、リン酸化リガンドの調節ドメインとの相互作用による、タンパク質−
タンパク質相互作用のWWドメイン調節を記載する。
【００２１】 (発明の詳細な記載) 本発明は、WWドメインが、セリンまたはスレオニンリンタンパク質、ポリペプ
チドまたはペプチドに、ホスフェート依存的方法で高い親和性で結合するという
発見に関する。本発明のWWドメイン含有セリンまたはスレオニンリン酸化結合ポ
リペプチドは、リガンドに結合したとき、リガンドの脱リン酸化を阻害する。WW
ドメイン含有ポリペプチドのリガンドへの結合は、WWドメイン含有ポリペプチド
、リガンド、または両方の活性を変えることができる。
【００２２】 本明細書で使用する“WWドメイン含有ポリペプチド”なる用語は、リン酸化リ
ガンドに結合するタンパク質(本明細書ではまたポリペプチドとも言う)を意味す
る。例えば本発明により包含されるWWドメイン含有ポリペプチドは、Pin1、Nedd
4、YAP、FE65、フォーミン結合タンパク質、ジストロフィン、ウトロピン、Ess1
p/Ptflp、Rsp5、Pub1、Dodo、Msb1、ORF1、YKB2、DP71、C38D4.5、P9659.21、Yo
61、Yfx1、ZK1248.15、KO15c11、CD45AP、FBP11、FBP21、FBP23、FBP28およびFB
P30を含む(Rotin, D. Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:115 (1998))。こ
れらのWWドメイン含有タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関するデ
ータベースアクセッションナンバーは、既知である(Rotin, D. Curr. Topics Mi
crobiol. Immunol. 228:115 (1998))。発見されるであろう任意のWWドメイン含
有タンパク質が本発明の範囲内であることは理解される。
【００２３】 本明細書で使用する用語としての“WWドメイン含有ポリペプチド”は、またPi
n1、Nedd4、YAP、FE65、フォーミン結合タンパク質、ジストロフィン、ウトロピ
ン、Ess1p/Ptflp、Rsp5、Pub1、Dodo、Msb1、ORF1、YKB2、DP71、C38D4.5、P965
9.21、Yo61、Yfx1、ZK1248.15、KO15c11、CD45AP、FBP11、FBP21、FBP23、FBP28
およびFBP30のような既知のWWドメイン含有ポリペプチドと同一のアミノ酸配列
を含む、WWドメインと配列および構造同一性を示すポリペプチドを含み得る。(
図６)(例えば、それらの教示の全体を本明細書に包含させる、Hunter, T., et a
l., WO97/17986 (1997); Rotin, D. Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:11
5 (1998)参照)。配列同一性は、例えば、Basic Local Alignment Search Tool (
BLAST)(Altshul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))およびFA
STA(Pearson, W. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444-2448 (
1988))アルゴリズムを含む、当分野で既知のデータベースサーチストラテジーを
使用して決定できる。一つの態様において、BLASTパラメーターは、それらが、
対応する既知のWWドメイン配列と少なくとも約６０％配列同一性、好ましくは少
なくとも約７０％配列を有する配列を産生するように設定する。他の対応におい
て、配列同一性パーセントは、少なくとも約８５％、さらに別の態様において少
なくとも約９５％である。このような分子はまた本明細書ではWWドメイン模倣分
子と呼び、約４０アミノ酸残基の、３重鎖βシートにおける二つの不変のトリプ
トファン(W)を伴う、高度に保存された領域により特徴付けられている(Sudol, M
. Prog. Biophys. Mol. Biol. 65:113 (1996); Rotin, D. Curr. Topics Microb
iol. Immunol. 228:115 (1998))。このように、WWドメイン模倣分子は本明細書
に記載のWWドメインと構造類似性を有するか、またはまたはコンセンサス配列Lx
xGWtx6Gtx(Y/F)(Y/F)h(N/D)Hx(T/S)tT(T/S)tWxtPt(配列番号４０)(その教示を本
明細書にその全体を引用して包含させるRotin, D., Curr Top. Microbiol. Immu
nol. 228:115-133 (1998)に記載のように、x＝任意のアミノ酸、t＝ターンライ
クまたは極性残基、およびh＝疎水性アミノ酸)を含む。例えば、WWドメインはコ
ンセンサス配列LPxGWExxxxxxxGxxYYxNHxTxTxxP(配列番号４０)(x＝任意のアミノ
酸)を含むことができる(図６)。WWドメイン模倣分子は、約３８−４０アミノ酸
長であり得るか、それらは３８−４０アミノ酸長より短いことがあり得る。WWド
メイン模倣分子は、ホスホセリン／ホスホスレオニンリガンドと相互作用でき、
またはそれらと結合でき、したがって、リン酸化リガンドの活性を調節する。
【００２４】 本明細書に記載の分子のWWドメインまたはWWドメイン含有ポリペプチド機能的
相当物が、本発明の範囲内であるとまた考える。本明細書に記載の“機能的相当
物”なるフレーズは、本明細書に記載のWWドメインまたはWWドメイン含有ポリペ
プチド(Pin1、Nedd4のような)の相互作用(例えば、結合、酵素活性)を模倣する
、または、例えば、Pin1またはNedd4のようなWWドメイン含有ポリペプチドとヌ
クレオチドまたはアミノ酸同一性を示す任意の分子(例えば、ポリペプチドおよ
びポリペプチドをコードする核酸配列)を意味する。Pin1のヌクレオチドおよび
導き出されるアミノ酸は既知である(その教示を全体を本明細書に包含させるHun
ter, T., et al., WO97/17986 (1997)参照)。
【００２５】 本発明は、WWドメイン含有ポリペプチドとリン酸化リガンドの結合の調節を含
む、タンパク質−タンパク質相互作用のメディエートする方法に関する。例えば
、WWドメイン含有タンパク質(例えば、Pin1、Nedd4)はリン酸化リガンド(例えば
、Cdc25c、NIMA、タウ、Weel、Myt１)を、リン酸化リガンドの調節ドメインと相
互作用することにより調節(例えば結合)できる(図７参照)。リン酸化リガンドの
“調節ドメイン”は、有糸分裂および／または細胞死(例えば、アポトーシス)の
間の細胞性または生理学的プロセスの間の変化(例えば、リン酸化および／また
は脱リン酸化状態における変化)に付されるリン酸化リガンドのドメインである
。したがって、リン酸化リガンドの“調節ドメイン”は、これらの変化(例えば
、リン酸化)に付されるアミノ酸、またはアミノ酸をコードする核酸を意味する
。リン酸化リガンドの調節ドメインは、リン酸化リガンドのアミノ末端またはカ
ルボキシ末端であり得る。
【００２６】 調節ドメインにおける変化は、リン酸化リガンドの触媒的ドメインを調節でき
る(例えば、Kumagai et al., Science 273:1377-1380; Lewin, B. "Genes VI) O
xford University Press, New York (1997); Izumi, T. et al., Mol. Biol. Ce
ll 6:215 (1995); Ye, X. S. et al., EMBO J. 14:986 (1995); Lu, et al., EM
BO J. 13:2103-2113 (1994); Lester, L. B., Recent Prog. Horm Res. 52:409-
429 (1997)参照)。リン酸化リガンドの触媒的ドメインは、リン酸化リガンドの
活性(例えば、キナーゼ活性のような酵素活性および／または標的分子または基
質の結合の部位のような結合活性)を担っている、または担うことになるリン酸
化リガンドのドメインを意味する。したがって、リン酸化リガンドの“触媒的ド
メイン”はまたリン酸化リガンドの触媒的活性を担うアミノ酸またはアミノ酸を
コードする核酸も意味する。リン酸化リガンドの触媒的ドメインは、リン酸化リ
ガンドのアミノ末端またはカルボキシ末端であり得る。
【００２７】 リン酸化リガンドの“ドメイン”(例えば、調節または触媒的)は、例えば、調
節ドメインまたは触媒的ドメインに関して上記のような、特徴的な物理的、構造
的(例えば、アミノ酸、核酸)または機能的(例えば、結合、リン酸化)特性を有す
るリン酸化リガンドの領域である。本明細書で使用するための、リガンド、およ
びそれらの調節および触媒的ドメインの核酸およびアミノ酸配列は、例えば、Ge
nBankまたはEMBLのような公的にアクセスできるデータベースにおいて、当業者
により容易に確認できる(例えば、Kumagai et al., Science 273:1377-1380 (19
96); Izumi, T. et al., Mol. Biol. Cell 6:215 (1995); Ye, X. S. et al., E
MBO J. 14:986 (1995); Lu, et al., EMBO J. 13:2103-2113 (1994); Lester, L
. B., Recent Prog. Horm Res. 52:409-429 (1997)参照)。リガンドは、ホスホ
セリン、ホスホスレオニン、またはホスホセリンとホスホスレオニン残基の両方
を含むタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。
リガンドは、WW含有ポリペプチドの天然リガンド、またはリガンド模倣物であり
得る。天然リガンドは、WWドメインに結合することが既知のリン酸化リガンドを
言及すると意味する。例えば、Cds25cはPin1のWWドメインに対する天然リガンド
である。リン酸化リガンド模倣物は、合成または天然有機産物であり、WWドメイ
ン含有ポリペプチドの天然リガンドと構造的類似性を共有し、WWドメイン含有ポ
リペプチドと相互作用し、したがってWWドメイン含有ポリペプチドの活性を調節
する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはペプチド模倣物である。リン
酸化セリンまたはスレオニン残基に隣接したプロリン残基を有する天然リガンド
またはリガンド模倣物は、WWドメインに結合できる。その教示の全体を本明細書
に包含させる、Nguyan, J. T. et al., Science 282:の207-211(1998)の方法に
したがって、天然リガンド中のプロリン残基は、非天然N−置換残基で置換され
得、結合親和性が促進されたリガンド模倣物を産生する。
【００２８】 WWドメイン含有ポリペプチドとリン酸化リガンドの間の相互作用は、WWドメイ
ンとリン酸化リガンドの間の相互作用(例えば結合)の増加により、またはWWドメ
インとリン酸化リガンドの間の相互作用(例えば結合)の阻害により調節できる。
例えば、Pin1と有糸分裂リンタンパク質の間の結合相互作用は、リン酸化リガン
ド模倣物により完全に阻害できる。例えば、Pin1の場合、リン酸化ペプチドPint
ideは、Pin1のWWドメインに対する天然リガンドの結合と競合するリガンド模倣
物である(実施例４参照)。競合阻害は、WWドメイン含有ポリペプチドが、その天
然リガンドと相互作用するのを競合、変更、または防止するリン酸化リガンド模
倣物の能力である。本明細書で定義のように、WWドメインまたはWWドメイン含有
ポリペプチドに関して活性を言及する場合、結合活性(例えば、リガンドと相互
作用する能力)または酵素的(例えば、ホスホセリン／スレオニン−プロリン結合
を異性体化する能力またはリガーゼ活性)活性または両方である。WWドメインま
たはWWドメイン含有ポリペプチドの酵素的、触媒的、または調節活性は、リガン
ドまたはWWドメイン含有ポリペプチドの活性を制御できる。例えば、Pin1のWWド
メインのホスホセリン残基への、PintideまたはCdc25のような有糸分裂細胞抽出
物タンパク質への結合は、Pin1のペプチジルプロピルcis-transイソメラーゼ活
性(例えば、調節活性)の増加を導く。リンタンパク質またはリンペプチド特性お
よびWWドメインのリガンドへの結合の親和性は、当分野で既知の結合および調節
アッセイを使用して決定でき、インビボ活性は実施例１−１０に記載のように測
定できる。例えば、Pin1のインビトロ調節活性は、その教示を本明細書に引用し
て包含させるLu et al., U.S. Serial No. 60/058,164 (1997)に記載のように測
定できる。
【００２９】 本明細書に記載のリガンドの活性は、WWドメインへの結合に続いて調節できる
。リガンドの調節は、タンパク質−タンパク質相互作用を調節し、例えば、細胞
シグナル伝達経路の活性化または不活性化をもたらす。細胞シグナル伝達経路の
活性化または不活性化は、リガンドの生理学的機能の回復を導き得る。特に、Pi
n1のWWドメインは、過リン酸化タウと相互作用でき、それにより、神経退行性疾
患におけるPinの微小管機能および結合を回復させる。タウタンパク質は、アル
ツハイマー病、大脳皮質基底核変性症、拳闘家痴呆、ダウン症、前頭側頭型痴呆
および第１７染色体に関連したパーキンソン病、混乱を伴うプリオン病、進行性
核上麻痺、亜急性硬化性汎脳炎を含むいくつかの神経退行性疾患と関連する(Spi
llantini, M. G., et al., TINS 21:428-432 (1998))。本発明の方法は、これら
の神経退行性疾患の処置に使用できる。具体的に、アルツハイマー病において、
Pin1のWWドメインの、タウのリン酸化スレオニン２３１への結合が、Pin1がリン
酸化タウの機能(例えば、微小管に結合し、微小管結合を促進する)を十分に回復
させることを可能にする(実施例１１)。Pin1のWWドメインはまたアミロイド前駆
体タンパク質のスレオニン６６８に結合し、アミロイド前駆体タンパク質に付随
した神経退行性疾患疾患の処置に使用できる。WWドメイン含有ポリペプチドのWW
ドメインはまたホスホセリンまたはホスホスレオニンリガンドと相互作用(例え
ば結合)し、それによりWWドメインポリペプチドの立体配置または活性を変える
。例えば、Pin1のプロリル−ペプチジルcis-transイソメラーゼ活性は、Cdc25c
のようなリン酸化リガンドの結合の結果として変わる(例えば増加する)。このよ
うに、WWドメイン含有ポリペプチドの活性はリン酸化リガンドと相互作用(例え
ば結合)した後、変わる(例えば増加または減少する)ことができる。
【００３０】 本発明は更にPin1のWWドメインの、NIMAまたはCdc25のような有糸分裂調節タ
ンパク質への結合のメディエートによる、細胞増殖の調製法に関する。“有糸分
裂調節タンパク質”なる用語は、CdC25、NIMA、Myt1、Cdc27、Weel、Sox3、Plk1
、Rab4、Xbr-1b、MP75、MP110、M68またはMP30のような、細胞分割をもたらす経
路の調節に関与する、タンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質またはポリ
ペプチドのフラグメント(例えば、対応するタンパク質またはポリペプチドより
少ない、少なくとも１アミノ酸)を意味する。
【００３１】 Pin1のWWドメインの、有糸分裂調節タンパク質への結合は、Pin1のWWドメイン
におけるセリン残基のリン酸化状態の調節によりメディエートできる。特に、Pi
n1のWWドメインの１６位のセリン残基は脱リン酸化またはリン酸化され、細胞生
育および細胞死を各々もたらす。細胞生育(また本明細書では細胞増殖とも呼ぶ)
は、細胞数の増加を導く。細胞死は、アポトーシスのような計画的細胞死または
、壊死のような非計画的細胞死であり得る。細胞生育および細胞死を評価する方
法は、当業者に既知である。
【００３２】 本発明はまた、WWドメイン標的タンパク質のリン酸化状態を変えることを含む
、タンパク質分解の調節法に関する。特に、WWドメイン含有ポリペプチドはNedd
4であり、Nedd4リガンドは、例えば、Cdc25C、アミノ酸ペルメラーゼ、RNAポリ
メラーゼIIの大サブユニットおよびMiloride感受性上皮Naチャンネル(EnaC)であ
る。リガンドがリン酸化されているとき、Nedd4のWWドメインはリガンドに結合
し、リガンドを、ユビキチン経路を介したタンパク質分解の標的とする。WWドメ
インの脱リン酸化は、Nedd4のリガンドとの相互作用を防止する。このような機
構はCdc25のような有糸分裂アクティベーターの調節、すなわち細胞生育の調節
に重要であり得る。例えば、Nedd4のWWドメインとCdc25の間の相互作用の、Nedd
4を、Cdc25のタンパク質分解の標的から防止することにより調節し、細胞死をも
たらす。
【００３３】 本発明にまた含まれるのは、変えられた結合または触媒的活性を有するWWドメ
イン含有ポリペプチドの変異体である。本発明の変異体は、例えば、ホスホセリ
ンおよびホスホスレオニンのWWドメインへの結合が関与するタンパク質−タンパ
ク質相互作用の機構の更なる理解に使用できる。本明細書で使用する“変異体”
なる用語は、WWドメインまたはWWドメイン含有ポリペプチドをコードする修飾核
酸配列を意味する。例えば、変異体は、WWドメインをコードする１個またはそれ
以上のヌクレオチドの点変異または付加、欠失、挿入および／または置換、また
は任意のそれらの組合わせの結果として産生されるポリペプチドであり得る。修
飾は、例えば、保存的または非保存的、天然または非天然であり得る。本発明は
また変異WWドメイン含有ホスホセリンまたはホスホスレオニン結合ポリペプチド
をコードする核酸構築物、およびそれらのコード化ポリペプチドも含む。変異を
挿入する技術は十分確立されている。例示的プロトコールは、“Current Protoc
ols in Molecular Biology”, Ausbel, et al., John & Wiley & Co. (1998)に
見られる。
【００３４】 本明細書で使用する限り、変異体はまた変異核酸によりコードされるポリペプ
チドを意味する。即ち、“変異体”なる用語はまた、野生型(天然に存在する)ポ
リペプチド由来の１個またはそれ以上のアミノ酸残基が修飾されているポリペプ
チドを意味する。好ましい態様において、変異体はポリペプチドのWWドメインの
変異により産生される。
【００３５】 一つの態様において、変異はPin1で成される。他の態様において、変異はNedd
4に成される。具体的な態様において、本明細書に記載のように、Pin1のアミノW
Wドメインは、変えられた結合または調節活性をもたらす変異を有する。例えば
、本態様において、Pin1S１６A変異体は、Pin1のWWドメインの１６位のセリン(S
)のアラニン残基へのPin1S１６A変異体を作るための置換による点変異によりも
たらされるPin1の変異体である。野生型Pin1において、リガンドのプロリン環は
、WWドメインのチロシン２３とトリプトファン３４の間の芳香族環の間の疎水性
クレバスに位置し、一方リガンドのホスホセリン残基は、WWドメインのセリン１
６とチロシン２３の間の裂け目にフィットする(Macias, M. J., et al., Nature
382:646 (1996); Ranganathan, R., et al., Cell 89:875 (1997))。リガンド
のホスフェート部分は、チロシン２３ヒドロキシルプロトンの水素結合距離内に
方向付けされる。
【００３６】 Pin1のWWドメインのチロシン２３(Pin1Y２３A)またはトリプトファン３４(Pin
1W３４A)の一アラニン点変異は、Pin1がリンペプチドに高親和性で結合する能力
を完全になくし、一方１６位のセリン残基の一グルタミン酸点変異(Pin1S１６E)
は、Pin1の調節またはイソメラーゼ活性を無くす。このようにWWドメインの異な
るアミノ酸残基は、WWドメイン含有ポリペプチドの異なる活性(例えば、リガン
ドへの結合または酵素活性)をメディエートできる。
【００３７】 WWドメイン含有ポリペプチド変異体は、１６位のセリン、または１４位のアル
ギニン、または２３位のチロシン、または３４位のトリプトファン、またはこれ
らの任意の組合わせからなる群から選択される、１個以上のアミノ酸残基の変異
により作ることができる。
【００３８】 アミノ酸のアラインのための既知の技術を使用して、Pin1に関して本明細書で
記載した変異に適当なアミノ酸残基は、Nedd4、YAP、FE65、フォーミン結合タン
パク質、ジストロフィン、ウトロピン、Ess1p/Ptflp、Rsp5、Pub1、Dodo、Msb1
、ORF1、YKB2、DP71、C38D4.5、P9659.21、Yo61、Yfx1、ZK1248.15、KO15c11、C
D45AP、FBP11、FBP21、FBP23、FBP28およびFBP30のような、他のWWドメイン含有
ポリペプチドでも決定できる(Rotin, D. Curr. Topics Microbiol. Immunol. 22
8:115 (1998))。これらのWWドメイン含有タンパク質のヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列のデータベースアクセッションナンバーは既知である(Rotin, D. Curr.
Topics Microbiol. Immunol. 228:115 (1998))。WWドメイン含有ポリペプチド
をコードする核酸配列は変異できる；標準実験条件下で発現される変異核酸構築
物は既知である；および得られる変異ポリペプチドは、本明細書に記載のように
結合または酵素的活性または両方を評価する。適当なアミノ酸残基は、慣用の当
分野で既知の方法を使用して、Pin1に関して記載のように置換できる(例えば、S
hen, M., et al., Genes & Dev 12:706 (1998)参照)。
【００３９】 リガンドのWWドメイン含有ポリペプチドへの結合を評価するための技術は当分
野で既知である。例示的方法は、その教示を引用して本明細書に包含させるLu e
t al., U.S. Serial No. 60/058,164 (1997)に記載される。
【００４０】 WWドメイン含有ポリペプチドは、特に、WWドメインまたはWWドメイン含有ポリ
ペプチドをインビトロ結合アッセイ、インビボ処理および、WWドメイン含有ポリ
ペプチドまたはリガンドの活性を変える試験物質のインビトロスクリーニングに
用いるとき、好ましくは、使用前に実質的に精製される。実質的に純粋(例えば
、約９９重量％、または均一まで)であるWWドメイン含有ポリペプチドを使用す
るのが好ましい。
【００４１】 WWドメイン含有ポリペプチドは、標準技術を使用した活性に関してスクリーニ
ングできる。リガンドによる結合および活性化の前および後に、酵素活性、例え
ば、プロリル−ペプチジルcis-transイソメラーゼ活性に関してWWドメインポリ
ペプチドをスクリーニングするために、ホスホセリンまたはホスホスレオニンペ
プチドの存在下または非存在下で放射標識基質基質でインビトロアッセイする。
WWドメイン含有ポリペプチドおよび変異体の効果は、実施例８に記載のような慣
用の形質転換法を用いてインビボで評価できる。
【００４２】 WWドメイン含有ポリペプチドのリガンドとの相互作用の、WWドメイン含有ポリ
ペプチドまたはリガンドにおける効果を試験できる。例えば、イソメラーゼ活性
、リガーゼ活性、細胞増殖、細胞死または、神経微細繊維のような細胞性標的と
の関連のような特異的生理活性。これらの生理学的活性を評価するプロトコール
は当業者に既知である(例えば、それらの教示を引用して本明細書に包含させるL
u et al., U.S. Serial No. 60/058,164 (1997); Lu, K. P. et al., Nature 38
0:544 (1996)参照)。
【００４３】 本発明はまた、WWドメイン含有ポリペプチドと１個以上の試験物質を接触させ
る；試験物質とWWドメイン含有ポリペプチドを相互作用に適した条件下に維持す
る；そして試験物質とWWドメイン含有ポリペプチドの間の相互作用を測定する段
階を含む、WWドメイン含有ポリペプチドとリン酸化リガンドの相互作用を調節す
る物質の同定法を提供する。試験物質とWWドメイン含有ポリペプチドの間の相互
作用は、試験物質がWWドメイン含有ポリペプチドとリガンドの間の相互作用を調
節することを示す。相互作用は、試験物質の存在下および非存在下に測定できる
。本発明の方法により同定された試験物質は、変えられたWWドメイン含有ポリペ
プチド／リガンド相互作用によりもたらされる状態の疾患の処置に使用できる。
【００４４】 活性に関する“調節”、もしくは“変えられた活性”または“変えられた相互
作用”なる用語は、本明細書では試験物質の非存在下と異なるリガンドまたはWW
ドメインの活性と定義する。
【００４５】 試験物質(例えば、阻害剤または刺激剤)をWWドメインポリペプチドに、WWドメ
インとリガンドの組合わせの形成に適した立体配置の維持に適当な条件下での、
リガンドの添加の前または後にWWドメインポリペプチドに添加できる。緩衝液ま
たは媒体、濃度および温度要求のような、試験物質を評価するための実験的条件
は、最初に、実施例１−１１に記載のものと同等にできる。当業者は、試験物質
の生化学的性質に依存して、どのように実験条件を変えるかは経験的に決定でき
る。試験物質を評価できる濃度は、天然リガンドがWWドメイン含有ポリペプチド
に結合するのに用いる濃度と同等か、多いかまたは少ないことがあり得る。
【００４６】 本発明のWWドメイン含有ポリペプチドまたはリガンドの活性を変える物質は、
例えば、プロリル−ペプチジルcis-transイソメラーゼまたはユビキチンリガー
ゼ活性の、刺激剤／促進剤(例えばアゴニスト)または阻害剤(例えばアンタゴニ
スト)であり得る。物質は、ポリペプチド(翻訳後修飾されたポリペプチドを含む
)、ペプチド、または小分子(炭水化物、ステロイド、脂質、他の有機分子、アニ
オンまたはカチオンを含む)であり得る。
【００４７】 本明細書で使用する“阻害剤”なる用語は、リガンドと相互作用するWWドメイ
ン含有ペプチド、またはWWドメイン活性またはリガンド活性、または任意のそれ
らの組合わせを遮断、減少、拮抗、妨害、限定、低下、縮小または干渉する、ま
たは、別にそして付加的に、WWドメインポリペプチドとリガンドの結合を妨害し
または妨げ、それによりWWドメインまたはリガンドが作用するのを防止する物質
を意味する。例示の目的で、Pin1の阻害剤はPin1がリン酸化する、またはホスホ
セリン／ホスホスレオニン−プロリン結合を異性化する能力を減少できる。
【００４８】 本明細書で使用する“刺激剤”または促進剤なる用語は、WWドメインとリガン
ドの間の相互作用をアゴナイズ、増加、促進、増大、増強または強くする、また
は、別にそして付加的に、WWドメインポリペプチドとリガンドの結合の作用を模
倣または促進し、それによりWWドメインポリペプチドまたはリガンドを活性化す
る物質を意味する。Pin1の場合、刺激性活性を有する物質は、ペプチジルプロリ
ルイソメラーゼ活性を増加できるか、またはPin1のリン酸化リガンドへの結合親
和性を、刺激性物質の非存在下で観察されるよりも増加させることができる。同
様に、Nedd4リガーゼ活性の刺激剤は、ユビキチン経路を介したタンパク質分解
の目的のポリペプチドの標的化の増大をもたらすことができる。
【００４９】 本発明のWWドメイン含有ポリペプチドまたはリガンドの阻害剤または促進剤／
増強剤は、WWドメインのそのリガンドとの相互作用、またはWWドメインまたはリ
ガンドの活性または構造に結合または干渉する(阻害剤)または促進する(刺激剤)
任意の分子を含むことができる。本発明に包含されるのは、リガンドまたはWWド
メインの構造および立体配置を模倣する阻害分子である。WWドメイン含有ポリペ
プチドまたはリガンドの阻害剤または刺激剤は、天然に存在するか、当分野の技
術者に既知の標準研究室法を使用して合成できる。
【００５０】 本発明の他の態様は、医薬をWWドメインと会合させ、“医薬／WWドメイン”複
合体を形成させ、“医薬／WWドメイン”複合体を哺乳類に投与し、“医薬／WWド
メイン”複合体がインビボでリン酸化リガンドと相互作用し、それにより病気を
軽減させることによる、哺乳類における病気を処置するための医薬の標的化に関
する。処置する病気は、WWドメイン含有ポリペプチドのためのリガンドであるリ
ン酸化リガンドの変化に由来する。
【００５１】 本発明は、更に、WWドメインと相互作用する医薬を設計することによる、WWド
メインとリン酸化リガンドの相互作用の調節に関する。医薬は、個体に投与した
ときWWドメインと結合し、それによりインビボでWWドメインとそのリン酸化リガ
ンドの間の相互作用を調節する。
【００５２】 WWドメイン含有ポリペプチドのフラグメントが本発明の方法で使用できること
も考えられる。本明細書で使用する限り、WWドメイン含有ポリペプチドの“フラ
グメント”はリン酸化リガンドに結合でき、タンパク質−タンパク質相互作用を
メディエートするWWドメインの任意の部分を意味する。例えば、WWドメイン含有
リガンドの単離WWドメインは、フラグメントと見なされる。
【００５３】 本発明の一つの態様において、WWドメイン含有ポリペプチド、リガンドまたは
試験物質は、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含む化合物である。本
発明のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、天然に存在するアミノ酸(
例えばL−アミノ酸)、非天然アミノ酸(D−アミノ酸)および、本明細書でペプチ
ドアナログ、誘導体または模倣物と呼ぶ、阻害剤または刺激剤ペプチドを生理学
的および生化学的に模倣する小分子を含む(Saragovi, H. U. et al., BioTechno
logy, 10:773-778 (1992))。本発明のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド
は、直鎖造または環状立体配置であり得る。
【００５４】 本発明のWWドメイン、リガンドまたは試験物質は、標準固相法を含む、当分野
の技術者に既知の標準研究室法を使用して合成できる。天然に存在するアミノ酸
のポリペプチドを含む分子はまた、当分野で既知の組換えDNA法、続くリン酸化
、または他の翻訳後修飾により製造できる。
【００５５】 本発明のWWドメイン、リガンドおよび試験物質は、２０種の天然に存在するア
ミノ酸または他の合成アミノ酸を含み得る。本発明に包含される合成アミノ酸は
、例えば、ナフチルアラニン、L−ヒドロキシプロピルグリシン、L−３,４−ジ
ヒドロキシフェニルアラニル、L−α−ヒドロキシリジルおよびD−α−メチルア
ラニル、L−α−メチルアラニルのようなα−アミノ酸、β−アラニンのような
β−アミノ酸およびイソキノリルを含む。
【００５６】 D−アミノ酸および他の非天然存在合成アミノ酸をまた本発明のWWドメイン、
リガンドまたは試験物質に包含できる。このような他の非天然存在合成アミノ酸
は、２０種の遺伝子がコードするアミノ酸(または任意のLまたはDアミノ酸)の天
然に存在する側鎖が、他の側鎖、例えば、アルキル、低級アルキル、環状４−、
５−、６−から７−員アルキル、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ(低級
アルキル)、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびその低級エステル
誘導体、および４−、５−、６−から７−員へテロ環でのような基で置換された
ものを含む。
【００５７】 本明細書で使用する限り、“低級アルキル”は１個から６個の炭素原子を有す
る直鎖または分枝鎖アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチルなど
を意味する。“低級アルコキシ”は、１個から６個の炭素原子を有する直鎖およ
び分枝鎖アルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ等を意味する。
【００５８】 環状基は、飽和または不飽和であり、不飽和である場合、芳香族または非芳香
族であり得る。ヘテロ環式基は、典型的に、１個以上の窒素、酸素および／また
は硫黄ヘテロ原子を含み、例えば、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イ
ミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、モルホリニル
(例えばモルホリノ)、オキサゾリル、ピペラジニル(例えば１−ピペラジニル)、
ピペリジル(例えば１−ピペリジル、ピペラジノ)、ピラニル、ピラジニル、ぴr
ぞり地にる、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピラダジニル、ピリジル、ピリミジニ
ル、ピロリジニル(例えば、１−ピロリジニル)、ピロリにル、ピロリル、チアジ
アゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル(例えばチオホルホリノ)お
よびトリアゾリルである。ヘテロ環基は、置換または非置換であり得る。基が置
換されている場合、置換基はアルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、または置
換または非置換フェニルであり得る(その教示を本明細書に引用して包含させるU
.S. Patent No. 5,654,276およびU.S. Patent No. 5,643,873参照)。
【００５９】 本明細書でペプチド模倣物と呼ぶ、上記WWドメイン、リガンドおよび試験物質
(例えば阻害剤または刺激剤)の生理学的活性誘導体またはアナログは、当業者に
既知の技術により設計および製造できる(例えば、その教示を本明細書に引用し
て包含させるU.S. Patent Nos. 4,612,132; 5,643,873および5,6545276参照)。
これらの模倣物は、例えば、特異的WWドメイン配列、または既知のリガンドに基
づき、WWドメインまたはリガンドの空間における相対的位置を維持し得る。これ
らのペプチド模倣物は、対応するWWドメイン含有ポリペプチドリガンドまたは試
験物質の生理学的活性と同等な、生理学的活性(例えば、プロリル−ペプチジルc
is-transイソメラーゼ、ユビキチンリガーゼまたは微小管結合活性)を有するが
、１個以上の以下の特性：溶解性、安定性ならびに加水分解およびタンパク質分
解に対する感受性に関して、対応するペプチドを超える“生理学的利点”を有す
る。
【００６０】 ペプチド模倣物を製造する方法は、N末端アミノ基、C末端カルボキシル基の修
飾、および／またはペプチドのアミノ結合の非アミノ結合への変化を含む。２個
以上のこのような修飾を一つのペプチド模倣阻害剤に組合わせ得る。ペプチド模
倣物を産生するためのペプチドの修飾は、その教示を本明細書に引用して包含さ
せるU.S. Patent Nos. 5,643,873および5,654,276に記載されている。
【００６１】 本発明のWWドメイン、リガンドまたは試験物質がアミノ酸を含む場合、ペプチ
ドはまた環状タンパク質、ペプチドおよび環状ペプチド模倣物であり得る。この
ような環状ペプチドは、既知の研究技術を使用して産生できる(例えば、その教
示を引用して全体を本明細書に包含させるU.S. Patent No. 5,654,276参照)。
【００６２】 本明細書に記載のように阻害剤または刺激剤として同定された試験物質は、イ
ンビトロで細胞サイクル調節、有糸分裂事象、タンパク質分解および神経退行性
疾患の研究のためにインビトロで使用できる。例えば、本発明のWWドメインは、
特異的リンタンパク質と相互作用させ、細胞サイクルおよびアポトーシスにおけ
る効果を評価することにより、哺乳類細胞における有糸分裂事象および計画的細
胞死の評価に使用できる。説明の目的で、Pin1のWWドメインは、リン酸化タウタ
ンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質に結合でき、細胞死(例えばアポト
ーシス)を妨げることにより、アルツハイマーにおける神経機能を回復させ、ま
たは神経生存を促進する。
【００６３】 本発明は、WWドメインとリガンドの相互作用を調節することを含み、該リガン
ドがホスホセリンまたはホスホスレオニンを含む、WWドメイン含有ポリペプチド
またはそれらのリガンドの活性の調節法を提供する。リガンドは、WWドメインま
たはWWドメイン含有ポリペプチドと相互作用する任意の分子(例えばポリペプチ
ド、ペプチド模倣物または小有機分子)を意味する。結合を検出する方法は、例
えば、標識化(例えば蛍光、ビオチン、放射活性、発光)活性化WWドメインまたは
リガンドの使用および、固相プレートアッセイ；免疫沈降；ウェスタンブロッテ
ィング、および蛍光アニオストロピー(aniostropy)アッセイのような検出法を含
むことができる。このような方法は十分確立され、当分野の通常の技術者の技術
的知識の範囲内である。
【００６４】 本明細書で動態したようなWWドメインリガンド相互作用を変える(例えば阻害
または刺激)物質の同定は、発癌を導く明確な経路において、および新規、特異
的およびより有効な処置レジメの開発に重要であり得る。
【００６５】 あるドメイン含有ポリペプチドは、シグナル伝達経路の形質転換に重要な役割
を担い、例えば、細胞分裂およびアポトーシス(例えばPin1)、およびタンパク質
分解(例えばNedd4)をメディエートする。本発明のWWドメインおよび変異体、お
よびそれらの活性を変える物質は、転移癌における細胞拡散のような事象の評価
、干渉および処置に使用できることが本発明の更なる態様である。
【００６６】 他の例として、Pin1が有糸分裂の重要なレギュレーターであるため(Lu, K. P.
et al., U.S. Serial No. 60/058,164 (1997); Shen, M., et al., Genes 6 De
velopment 12:706-720 (1998))、およびWWドメインの活性を変える(例えば阻害)
物質を、胚発育のような細胞分裂のある態様の機構の識別に使用できる。WWドメ
イン含有ポリペプチドおよびそれらのリガンドに対する基質、およびそれらを変
える物質の同定は、細胞サイクル事象の研究に有用であり得る。
【００６７】 本発明のWWドメインとリガンドの間の相互作用の阻害剤または刺激剤は、真核
生物生育の干渉および哺乳類の過形成および新生物疾患の処置に使用できる。本
明細書で定義のように、哺乳類は齧歯類(ラット、マウスまたはモルモットのよ
うな)、飼養化動物(イヌまたはネコのような)、反芻動物(ウマ、ウシのような)
および霊長類(サルまたはヒトのような)を含む。例えば、ある細胞シグナル伝達
経路を減ずる、Pin1のWWドメインのリン酸化は、白血病のような疾患の処置のた
めの抗新生物治療に有用であり得る。ある新生物は、WWドメインの野生型または
変異体により相殺または中和でき、それにより非制御細胞性生育または経路を止
めるか制御する、細胞性エフェクターのリン酸化における増加に寄与している。
【００６８】 新生物および過増殖性疾患は、悪性腫瘍、乾癬、レチノーシス(retinosis)、
プラーク形成によりもたらされるアテローム性動脈硬化、白血病および良性腫瘍
生育の全ての形を含む。例えば、このような疾患はリンパ腫、乳頭腫(papilomas
)、肺線維症および慢性関節リウマチを含む。
【００６９】 本発明の方法は、神経機能の回復または神経細胞死の防止、および疾患症状の
軽減のための、神経退行性疾患におけるタンパク質−タンパク質相互作用の調節
に使用できる。本発明の方法により処置できる神経退行性疾患は、アルツハイマ
ー病、多発性硬化症、筋ジストロフィー大脳皮質基底核変性症、拳闘家痴呆、ダ
ウン症、前頭側頭型痴呆および第１７染色体に関連したパーキンソン病、筋強直
性ジストロフィー、ニーマン・ピック病、グアムのパーキンソン−痴呆複合、ピ
ック病、大脳後パーキンソン病、混乱を伴うプリオン病、進行性核上麻痺、亜急
性硬化性汎脳炎を含む(Spillantini, M. G., et al., TINS 21:428-432 (1998))
。例として、Pin1のWWドメインはリン酸化タウタンパク質またはアミロイド前駆
体タンパク質に結合し、神経細胞機能を回復し、アポトーシスを防止し、または
両方を行う。
【００７０】 上記WWドメイン、リガンド、試験物質、医薬／WWドメイン複合体およびWWドメ
インと相互作用するように設計された医薬の生理学的に活性な誘導体、アナログ
または模倣物は、有効性分としての有効な量のWWドメイン、リガンド、医薬／ド
メイン複合体、または医薬と共に組成物中に製剤できる。このような組成物は薬
学的に許容できる担体を含み、本明細書で医薬組成物と呼ぶ。本発明の阻害剤ま
たは刺激剤組成物は、静脈内、非経腸的、経口的、経鼻的に、吸入により、イン
プラントにより、または坐薬により投与できる。投与の形態は、好ましくは標的
細胞の位置にである。阻害剤または刺激剤組成物は、１回量、または長期間にわ
たり、所望の効果を付与するのに充分な量の阻害剤のレベルを達成する１回以上
の量で投与できる。
【００７１】 適当な医薬担体は、滅菌水、塩溶液(リンゲル液のような)、アルコール、ポリ
エチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロースまたは澱粉のような炭
水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、粘性パラフィン、脂肪酸エ
ステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を含むが、これ
らに限定されない。医薬製剤は、滅菌され、所望により賦形剤、例えば、活性化
合物と有害に反応しない滑沢剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、影響する
浸透圧調製用塩、緩衝液、色素および／または芳香物質等と混合できる。それら
はまた、望ましい場合、他の物質、例えば酵素阻害剤と組合わせ、代謝的分解を
減少させることができる。
【００７２】 非経腸投与のために、特に好ましいのは注射用、滅菌水溶液、好ましくは油性
または水性溶液、ならびに懸濁液、乳化剤、またはインプラントであり、坐薬を
含む。アンプルが簡便な単位投与量である。
【００７３】 具体的な例の場合の阻害剤または刺激剤の実際の有効な量は、例えば、用いる
具体的な阻害化合物、製剤する特定の組成物、投与形態および、患者の年齢、体
重および状態に依存することは認められる。本明細書で使用する限り、阻害剤の
有効量は、目的のホスファターゼのホスファターゼ活性を阻害し、それにより標
的細胞生育を阻害し、例えば、標的細胞死をもたらす阻害剤の量である。特定の
患者に対する量は、慣用の考察を使用して、当業者が決定できる(例えば、適当
な慣用の薬理学的プロトコールの手段により)。
【００７４】 本発明は更に、哺乳類に、哺乳類のWWドメインまたはリガンド活性を調節する
のに有効な量の物質を挿入し、それにより状態を軽減することを含む、哺乳類に
おけるWWドメイン含有ポリペプチドメディエート状態の処置法に関し、該状態は
WWドメインまたはWWドメインリガンドの変化によりもたらされる。WWドメインま
たはリガンド活性の調節は、上方調節(例えば、リガーゼまたはPPIase活性の増
加または増大)または下方調節(例えば、リガーゼまたはPPIaseの減少または阻害
)であり得る。
【００７５】 本発明のWWドメイン、WWドメイン含有タンパク質(例えばPin1、Nedd4)、変異
体または医薬は、標的細胞に本明細書に記載のWWドメインまたは変異体、または
活性化ホスファターゼをコードする核酸配列をインビトロまたはインビボで送達
することを含み、挿入したWWドメインまたは変異体の量は、哺乳類の標的細胞内
で、WWドメインとそのリガンドの間の相互作用を有効に変える、哺乳類における
WWドメインメディエート病気または疾患の処置に使用でき、該病気はWWドメイン
またはそのリガンド活性の変化によりもたされる。“WWドメインポリペプチドメ
ディエート疾患または病気”なるフレーズは、例えば、WWドメインの不適当な細
胞性レベルまたは活性により、WWドメインまたはそのリガンドの内因性活性が十
分に調節されていない、または、別におよび付加的に、WWドメインリガンドのレ
ベルまたは活性が、内因性WWドメインのキャパシティーを越え、活性の繊細なバ
ランスが乱された細胞をもたらす、細胞性プロセスを意味することを意図する。
例えば、Pin1のWWドメイン、Pin1タンパク質、Pin1模倣物、WWドメイン、または
WWドメイン模倣物は、アルツハイマー病におけるタウのような、タンパク質の過
リン酸化により発生する状態の調節に使用できる。したがって、本発明のWWドメ
インは、リガンドの活性の減少または促進に、実験的にまたは治療的に使用でき
る。WWドメインメディエート疾患または病気は、例えば、新生物性疾患または細
胞死のような非制御細胞生育または増殖であり得る。
【００７６】 本発明のWWドメインは、WWドメインベクターをコードする１個以上の核酸配列
を含むベクターの使用により、細胞に送達できる。本明細書で使用するベクター
は、ウイルスおよび非ウイルスベクターを含み得る。非ウイルスベクターの例は
、脂質またはリポソームである(その教示を本明細書に引用して包含させるU.S.
Patent No. 5,676,954)。あるいは、DNAを細胞に、例えば、(Tyan, E. F., et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90:11478-11482 (1993))に記載のように、
遺伝子銃を介して挿入できる。核酸配列をウイルスベクターのゲノムに包含させ
得る。インビトロで、本明細書に記載のWWドメイン、またはWWドメインをコード
する核酸配列を含むウイルスベクターを細胞と接触させ、感染を起し得る。次い
で、細胞を、例えば、インビトロでの非制限的細胞生育の試験のために、使用し
、または治療的使用のために患者にインプラントし得る。細胞は、造血細胞のよ
うな移動性、または固体腫瘍または繊維芽細胞のような非移動性であり得る。細
胞は、患者(例えば、血液、骨髄)から得た生物学的サンプルに存在し得、アルツ
ハイマー病または筋ジストロフィーのような疾患の処置に使用し、または細胞培
養から得、細胞増殖、細胞死またはタンパク質分解経路のインビボおよびインビ
トロシステムでの解析に使用する。WWドメインまたはWWドメインをコードする核
酸配列とウイルスベクターを接触させた後、当分野で行われている既知の方法に
したがって、サンプルを細胞または患者に戻すかまたは再適用できる。患者また
は実験動物モデル(例えば、ラット、マウス、サル、チンパンジー)への送達の場
合、このような処置法は、ある場合、エキソビボ処置または治療と呼ばれる。し
ばしば、細胞を患者または動物から標的とし、本発明の活性化変異体を含むウイ
ルスベクターと接触させた後、患者または動物に戻す。エキソビボ遺伝子治療は
、例えば、Kasid, et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA 87:473 (1990); Rosenb
erg, et al., New Engl. J. Med. 323:570 (1990); Williams, et al., Nature
310476 (1984); Dick, et al., Cell 42:71 (1985); Keller, et al., Nature 3
18:149 (1985)およびAnderson, et al. U.S. Patent No. 5,399,346 (1994)に記
載されている。
【００７７】 細胞をインビトロで接触させる場合、WWドメインの核酸配列を含むウイルスベ
クターを包含する細胞を患者または実験動物モデルに送達のためにインプラント
でき、または細胞生育、細胞死、タンパク質処理、および神経調節のある態様の
ような、WWドメイン含有ポリペプチドによりメディエートされる細胞性事象の研
究のために、インビトロ実験で使用できる。
【００７８】 本発明のWWドメインホスフェートまたはWWドメインをコードする単離核酸配列
を含むウイルスベクターを患者または実験動物に送達する場合、投与の形態は好
ましくは処置する細胞の局所である。したがって、投与は経鼻(例えばADAを発現
するベクターの投与のように)、経口(例えば、嚢胞性繊維症トランスメンブラン
コンダクタンスレギュレーター(CFTR))または注入(例えば、腫瘍への自殺遺伝子
を発現するベクターの投与のような)であり得る。他の投与の形態(例えば、非経
腸、粘膜、全身、インプラントまたは腹腔内)は当分野で一般的に既知である。
物質は、好ましくは、食塩水、滅菌水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウ
ム溶液のような薬学的に許容される担体中で投与できる。
【００７９】 一般に、治療的および実験的に使用できるウイルスベクターは、当分野で既知
である。例は、Srivastava, A., U.S. Patent No. 5,252,479 (1993); Anderson
, W. F., et al., U.S. Patent No. 5,399,346 (1994); Ausubel et al., "Curr
ent Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc. (1998)によ
り記載されたベクターを含む。核酸の細胞への送達に適したウイルスベクターは
、例えば、複製欠失レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えば
、アデノ随伴ウイルス)およびコロナウイルスを含む。レトロウイルスの例は、
鳥類白血病−肉腫、哺乳類C型、B型ウイルス、レンチウイルスを含む(Coffin, J
. M., "Retroviridae: The Viruses and Their Replication", In: Fundamental
Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Lippincott-Raven Publish
ers編, Philadelphia, PA, (1996))。ウイルスベクターは、既知の機構により細
胞に感染し、それにより活性化変異タンパク質チロシンホスファターゼまたは活
性化ホスファターゼをコードする核酸を送達する。感染の機構はウイルスベクタ
ーと標的細胞に依存する。例えば、HeLa細胞のアデノウイルス感染は、ウイルス
表面レセプターへの結合、続くレセプターメディエートエンドサイトーシスおよ
び染色体該複製により起こる(Horwitz, M. S., "Adenoviruses" In: Fundamenta
l Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Lippincott-Raven Publis
hers編, Philadelphia, PA, (1996))。
【００８０】 本発明は、ホスホセリンまたはホスホスレオニン結合モジュールとしてのWWド
メインの新規機能を記載する。例えば、WWドメインはPin1と定義された有糸分裂
と特異的タンパク質、およびタウおよびアミロイド前駆体タンパク質のような神
経タンパク質との間のリン酸化依存的相互作用をメディエートする。これらの相
互作用は、細胞内のPin1有糸分裂機能に必須であり、Pin1のリン酸化により高度
に制御される。このように、WWドメインは必須有糸分裂PPIase Pin1の機能の調
節において重要な役割を担う。
【００８１】 しばしば、PSET配列(Pro、Glu、SerおよびThrに富む)上のセリンリン酸化は、
種々のタンパク質のユビキチン化の時期を制御し、ユビキチンタンパク質リガー
ゼは基質認識を担う(Rechsteiner, M. et al., TIBS 21:267-271 (1996); Clurm
an, B. E. et al., Genes Dev 10:1979-1990 (1996); Won, K. A. et al., EMBO
J 16:3797-3804 (1997); Verma, I.M., et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 94
:11758-11760 (1997))。リガーゼNedd4は、リン酸化依存的方法でユビキチン結
合タンパク質基質であることが示されている。例えば、出芽酵母Nedd4ホモログR
SP5によるウラシルパーミアーゼのユビキチン化は、PEST配列のリン酸化に依存
し、分裂酵母ホモログPub1によるCdc25のユビキチン化は、有糸分裂細胞で起こ
り、Cdc25は激しくリン酸化されている(Hein, C. et al., Mol. Micro 1877-87
(1995), Galan, J. et al., EMBO J 16:5847-5854 (1997); Marchal, C. et al.
Mol Cell Biol 18:314-321 (1998); Nefsky, B. et al., EMBO J 15:1301 (199
6))。
【００８２】 本発明は、Cdc25のリン酸化形が、Nedd4 WWドメインと特異的に相互作用でき
ることを示す。これらの結果は、綿引TにリガーゼのWWドメインがpSer含有配列
に結合し、リガーゼの触媒的ドメインを標的とし、基質をリン酸化してタンパク
質分解を開始させる、新規ユビキチン化機構を証明する。この機構は、有糸分裂
の後期の段階でCdc25Cの分解に使用できる(Hein, C. et al., Mol. Micro 18:77
-87 (1995); Galan, J. et al., EMBO J 16:5847-5854 (1997); Marchal, C. et
al. Mol. Cell Biol 18:314-321 (1998); Nefsky, B. et al., EMBO J 15:1301
(1996))。３つの哺乳類Nedd4様遺伝子が同定されており、各々４つのWWドメイ
ンを含む(Rotin, D. Curr Top. Microbiol. Immunol 228:115 (1998); Pirezzi,
G. et al., J. Biol. Chem. 272:14611 (1997))。pSer配列に対するNedd4 WWド
メインの親和性はPin1 WWドメインよりも高くないが、複数WWドメインが、リガ
ーゼのリン酸化基質に対する親和性を増加させおよび／または酵素を基質の範囲
と相互作用させる。
【００８３】 NMRおよびX線構造分析は、WWドメインの全体的構造は、WWドメインは単離ドメ
インとして発現され、または天然ポリペプチドに存在しても殆ど同一であること
を示し(Macias, M. J. et al., Nature 382:646 (1996); Ranganathan, K. et a
l., Cell 89:875 (1997))、WWドメイン結合配列が同定されている、即ち、PPLP
およびPPXYモチーフであることを示唆する(Rotin, D. Curr. Top Microbiol. Im
munol 228:115 (1998); Bedford, M. T. et al., EMBO J 16:2376 (1997))。
【００８４】 本発明は、WWドメインが非常に制御された新規pSer結合モジュールであること
を示す。Pin1のWWドメインのアミノ酸Tyr23およびTrp34は、ホスホセリンまたは
ホスホスレオニン結合に重要であり、Ser16は触媒的活性の調節に重要である。
トリプトファン残基はしばしばpSerのホスフェート基との相互作用のメディエー
トに使用される(Copley, R. R. et al., J. Mol. Biol. 242:321 (1994))。例え
ば、pKID/KIX複合体のNMR構造において、相互作用はpKID中のpSerのホスフェー
ト部分とKIXにおけるTyr残基の間の水素結合相互作用により安定化される(Radha
rkrisham, I. et al., Cell 91:741 (1997))。更に、本発明は、Pin1のWWドメイ
ンのリガンドへの結合、およびLysではなくTyrと類推されるもののAla置換は、p
KIDとKIXの間の相互作用を、LysとpSerの近接にもかかわらず妨害することを示
す。したがって、Pin1 WWドメインとリンタンパク質の間の相互作用は、Tyr23の
ヒドロシル基とpSerのホスフェートの間の水素結合相互作用により安定化され、
これらの相互作用は、陰性に荷電したホスフェート基、およびTyr23側鎖との水
素結合相互作用のため、Ser16のリン酸化により妨害されるようである。
【００８５】 Pin1 WWドメインの結合および調節に重要な３つのアミノ酸残基(Ser16；Tyr23
；Tyr24)は、ジストロフィンにおけるもののような、他のWWドメインのサブセッ
トにも見られる(Rotin, D., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 228:115 (1998))
。ジストロフィンは、DuchenneおよびDecker筋ジストロフィーを担う遺伝子のタ
ンパク質生産物である。Pin1と同様に、ジストロフィンはまた膜タンパク質のグ
ループに付随する(Bonneman, C. G. et al., Curr. Opin. Pediatr. 8:569); Wi
nder, S. J., J. Muscle Res. Cell. Motil 18:617 (1997))。リン酸化は、ジス
トロフィン複合体の形成を調節することが示唆されている(Lunse, M. et al., B
iochem J. 293:243 (1993); Shemanko, C. S. et al. Mol. Bell Biochem 152:6
3 (1995))。
【００８６】 PPIaseはPro残基の前のペプチド結合に対する回転を触媒し、それにより基質
の立体配置を調節する(Dolinski, K. et al., Proc. Natl. Acad sci: USA 94:1
3093 (1997))。Pin1は、リン酸化Ser／The-Proペプチド結合の異性体化およびリ
ンタンパク質の調節された活性に必要である、独得なPPIaseである(Schutkowski
, M. et al., Biochemistry 37:5566 (1998); Shen, M. et al. Genes & Develo
pment 12:706 (1998))。PPIase陰性変異体残基は、Pin1のリンタンパク質に対す
る親和性を減少させ、PPIase活性がリンタンパク質結合に影響できることを示す
。本発明は、PPIaseドメイン単独がリンペプチドに結合でき、またpSer/Thr-Pro
特異的PPIaseをインビトロで示すことを示す。これらの結果は、更なるターゲテ
ィング機能がPPIaseドメインの特異性の付与に必要であることを示す。興味深い
ことに、WWドメインはリンペプチドにより高い親和性を示し、直接有糸分裂リン
タンパク質と相互作用する。更に、リンタンパク質に結合する能力を妨害された
WWドメイン点変異は、細胞内のPin1機能を無くす。これらの結果は、pSer-Proモ
チーフにより、WWドメインがターゲティングドメインとして機能し、酵素と基質
の間の有効な相互作用を可能にすることを示す。
【００８７】 Pin1結合タンパク質(MPM-2抗原)の共通特性は、有糸分裂中の、調節ドメイン
において密集している複数Ser/Thr残基におけるリン酸化である(Izumi, T. et a
l., Mol. Biol. Cell 6:215 (1995); Kumagai, A. et al., Science 273:1377 (
1996); Ye, X. S. et al., EMBO J 14:986 (1995))。複数部位上でのリン酸化は
、活性に、または機能を妨害するための複数リン酸化部位の変異のために必要で
ある。例えば、Pin1により機能が制御されるCdc25CおよびNIMAにおける複数リン
酸化事象は、それらの有糸分裂機能に重要である(Izumi, T. et al., Mol. Biol
. Cell 6:215 (1995); Kumagai, A. et al., Science 273:1377 (1996); Ye, X.
S. et al., EMBO J 14:986 (1995))。これらの結果は、複数リン酸化事象がPin
1標的タンパク質の機能の調節に必要であることを示す。これらの複数リン酸化
事象が“全か無かの”活性にどのように調和するのか殆ど知られていない。
【００８８】 SH2ドメインは非レセプターチロシンキナーゼによる受動的リン酸化の産生に
重要であることは証明されている(Songyang, Z. et al., Nature 373:536 (1995
); Mayer, B. J. et al., Curr Biol. 5:296 (1995))。WWドメインは、複数部位
で有糸分裂キナーゼによりリン酸化されているタンパク質の前進的異性体化を促
進できる。前進的異性体化は、Pin1の高親和性WWドメインの、基質タンパク質上
のSerリン酸化部位への結合により引金を引かれる。結合したら、高局所濃度が
、低親和性触媒的PPIaseドメインに立体的に接近可能な全ての部位の異性体化を
駆動する。これは、有糸分裂リンタンパク質の調和した“全か無か”の活性、続
く連続有糸分裂事象を産生する手段を提供する。
【００８９】 以下の実施例は本発明の説明の目的で提供し、本発明の範囲を限定するものと
解釈してはならない。本明細書に引用した全ての引用文献の教示は、引用して本
明細書に包含させる。
【００９０】 実施例１ リン酸化リガンドと相互作用するWWドメイン Pin1 WWドメイン WWドメイン、PPIaseドメインまたは全Pin1タンパク質を含むGST融合タンパク
質を調製し、中間期(G１／S拘束、コントロール)または分裂(M相)HeLa細胞抽出
物と、既知の方法を使用してインキュベートした(Lu, K. P., et al., Nature 3
80:544 (1996); (Shen, M., et al., Genes & Devl. 12:706 (1998))。簡単に、
Hela細胞をG1/S境界または有糸分裂で、各々チミジンおよびアフィジコリンまた
はノコダゾールと１６時間インキュベーションすることにより拘束した。細胞を
融解し、上清をGST-1Pin1；Pin1のGST−WWドメイン；Pin1のGST-PPIaseドメイン
；またはコントロールGSTを含む１０μlのアガロースビーズと２時間、４℃でイ
ンキュベートした。リン酸化沈殿タンパク質を、先に記載のように１％トリトン
X−１００含有緩衝液で５回洗浄し、その後MPM-2抗体を使用した免疫ブロッティ
ング分析に付した(Yaffe, M. B. et al., Science 278:1957 (1997); Schukowsk
i, et al., Biochemistry 37:5566 (1998); Shen, M. et al., Genes & Dev 12:
706 (1998))。MPM-2はcdc25のようなPin1結合タンパク質を含む有糸分裂リンタ
ンパク質のサブセットを認識する。
【００９１】 強い結合の指標である強いシグナルが、全Pin1タンパク質またはそのWWドメイ
ンとインキュベートした有糸分裂Hela細胞抽出物からの抽出物で検出されたが、
有糸分裂抽出物をPPIaseドメインとインキュベートしたときは、検出されなかっ
た。これらのデータは、Pin1のWWドメインがPin1のリン酸化リガンドへの結合を
担うことを示す。特異的結合は、WWドメイン PPIaseドメインまたは全Pin1タン
パク質とインキュベートした中間期抽出物で観察されなかった。同様な結果が、
酵母Pin1ホモログであるEss1/Ptf1由来の単離WWドメインでも得られた。対照的
に、特異的結合が、Pin1の単離PPIaseドメインで観察されず、またはコントロー
ルGSTを中間期または有糸分裂HeLa抽出物のいずれかとインキュベートしたとき
観察されなかった。これらの結果は、触媒的PPIaseドメインではなくWWドメイン
が、Pin1のリンタンパク質結合を担い、その特性はヒト(Pin1)および酵母(Ess1/
Ptf1)で高度に保存されていることを示す。
【００９２】 NEDD WWドメイン NEDD4は酵母ホモログRsp5であり、Pub1は３個または４個のWWドメインを含む
ユビキチンタンパク質リガーゼである(Rotin, D. Curr. Top Microbil.. 228:11
5-133 (1998))。リンタンパク質ウラシルパーミアーゼであるNedd4酵母ホモログ
ユビキチネートおよび、典型的Proリッチモチーフを含まないCdc25C(Hein, C.,
et al., Mol. Micro. 18:77-87 (1995))(Rotin, D. Curr. Top Microbil.. 228:
115-133 (1998))。Pin1 WWドメインと対照的に、Nedd4 WWドメイン−２は、HeLa
細胞抽出物とのGSTプルダウン実験においてわずかなMPM-2抗原にしか結合しなか
った。他のリンタンパク質との相互作用を検出するために、Nedd4 WWドメイン−
１および−２を使用して、３２Pまたは３５S標識細胞融解物と結合させた。HeLa
細胞を、記載のように、一晩３２Pオルトホスフェートまたは３５SMetで標識し
た(Lu, K. P., et al., J. Biol Chem. 268:8769 (1993))。細胞を、ホスファタ
ーゼ阻害剤有りまたは無しの融解緩衝液に融解した(４０mMリン酸グリセロール
、５０mM NaF、１０mM NaVO４および２μMオカダ酸)(Shen, M. et al., Genes
& Dev. 12:706 (1998))。脱リン酸化実験のために、先に記載のように、３個の
Serホスファターゼ’(CIP、PP1およびPP2A)を融解物に３０分、３０℃で、ホス
ファターゼ阻害剤の非存在下または存在下添加した(Lu, K. P., et al., J. Bio
l. Chem 268:8769 (1993))。
【００９３】 コントロールGSTは、数個のマイナー標識したタンパク質にした結合せず、一
方Nedd4 WWドメインは標識融解物からのタンパク質の同様にサブセットに結合し
た。細胞融解物をSerホスファターゼと前処理したとき、WWドメインが殆どの細
胞性タンパク質に結合する能力は、約１０倍減少した。結合は、リン酸阻害剤を
包含させた場合、コントロールで観察されるもののほぼ半分まで回復した。同様
の結果が、Pin1またはジストロフィンWWドメインとの間で観察されたが、リンタ
ンパク質の異なるサブセットでは観察されなかった。これらの結果は、異なるWW
ドメインがリン酸化依存的方法で、異なるリンタンパク質のサブセットと相互作
用することを示す。
【００９４】 Nedd4 WWドメインが、リン酸化依存的方法で特異的リンタンパク質に結合する
ことを確認するために、Nedd4 WWドメインとCdc25Cの間の相互作用を試験した。
種々の程度で、全ての３個のNedd4 WWドメインは、HeLa Cdc25Cおよびインビト
ロ合成Xenopus Cdc25Cの両方の有糸分裂リン酸化形に結合したが、中間期リン酸
化形には結合しなかった。ペプチド結合アッセイは、Nedd4 WWドメイン−２がま
た有意なリン酸化依存的親和性を、PintideおよびCdc25Cペプチドの両方に向か
って示すことを示した(表１)。リンペプチドのKd値はまた、Nedd4 WWドメイン結
合部位として考えられるProリッチペプチドよりも低かった(表１) (Chen, H. I.
, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7819 (1995); Staub, O., et al.,
EMBO J. 15:2371 (1996), Bedford, M. J., et al., EMBO J., 16:2376 (1997))
。これらの結果は、Pin1 WWドメインと同様に、Nedd4 WWドメインもpSer含有配
列を結合することを証明する。
【表１】 ペプチドのN末端をフルオレッセインで標識し、TLCで精製した。GST−WWドメイ
ンおよびコントロールGSTの異なる濃度を標識ペプチドとインキュベートし(WFYp
SPELE、配列番号８；WFYSPFLE、配列番号９；EQPLpTPVTDL、配列番号１０；WQPL
TPVTDL、配列番号１１、およびPIGTPPPNYD、配列番号１２)、乾燥含量を蛍光ア
ニオストロピーアッセイにより測定した。各値は３つの別々の実験の平均を示す
。結合は、GSTと使用した全てのペプチドの間で検出されなかった。N.B.、結合
が検出されない；＊GST−WWドメインと膜上に固定したペプチドとのインキュベ
ート、続くGST抗体を使用した免疫ブロッティング分析で結合が検出されない；
†、WWドメインを本アッセイで使用できる最高濃度である１００μM使用したと
きでさえ、結合がプラトーに達しなかったため、概算したKd；‡YapWWドメイン
と種々のProリッチペプチドの間の相互作用に関して先に報告されたKd(Macias,
M. J., et al., Nature 382:646 (1996), Ranganathan, K. P., et al., Cell 8
9:875 (1997))。
【００９５】 実施例２ リガンドのリン酸化に依存したWWドメイン結合およびリン酸化リガンドの脱リン
酸化からの保護 Pin1のWWドメインと特異的リン酸化リガンドの間の相互作用を試験した。リン
酸化依存的相互作用を検出するために、Cdc25C、Plk1およびPin1リンが℃をイン
ビトロ転写および３５SMetの存在下での翻訳により合成し、Xenopus中間期また
は有糸分裂抽出物とインキュベートし、続いてウシ腸ホスファターゼで処理した
(M＋CIP)。タンパク質複合体をSDSゲルで、直接(インプット)、または最初にN末
端WWドメイン(アミノ酸１−５４)またはC末端PPIaseドメイン(アミノ酸４７−１
６３)または全Pin1タンパク質でのGSTプルダウンに付して分離した(Shen, M. et
al., Genes & Dev 12:706 (1998))。標識タンパク質−GSTビーズ複合体を徹底
的に洗浄し、結合タンパク質を、標準法を使用してSDS−PAGEおよびオートラジ
オグラフィーで分析した。
【００９６】 WWドメイン結合がその標的の脱リン酸化を保護するかを測定するために、３５ S標識(His)０エピトープ標識Cdc25Cを有し分裂抽出物によりリン酸化し、GST融
合タンパク質ビーズまたはNi−NTAビーズにより沈殿させた。単離したCdc25Cを
、次いでコントロール緩衝液またはCIPとインキュベートし、続いてSDS含有ゲル
およびオートラジオグラフィーで分離した。
【００９７】 Pin1の単離WWドメインおよびPin1は、有糸分裂細胞抽出物においてリン酸化Cd
c25Cに結合したが、中間期抽出物では結合しなかった。WWドメインは、有糸分裂
リン酸化Cdc25Cが、結合前にウシ腸ホスファターゼ(CTP)により脱リン酸化され
た場合、Cdc25Cに結合しなかった。有糸分裂リン酸化Cdc25CをPin1またはそのWW
ドメイン含有GSTビーズを使用して沈殿させたとき、CIPはCdc25Cの脱リン酸化に
失敗した。対照的に、CIPは、N末端Hisタグに対して、Ni−NTAビーズにより沈殿
させた場合、殆ど完全にCdc25Cを脱リン酸化できた。同様の結果が、他のPin1結
合タンパク質Plk1でも得られた。これらの結果は、WWドメイン結合が標的タンパ
ク質のリン酸化に依存し、タンパク質リガンドに結合したとき、WWドメインは標
的タンパク質を脱リン酸化から保護することを証明する。
【００９８】 実施例３ ペプチドスキャンによる、Cdc25CにおけるPin1 WWドメイン結合部位の同定 Cdc25Cにおけるタンパク質配列に対応する１０アミノ酸重複を有する１３アミ
ノ酸のアレイを合成し、そのC末端をβ−Ala残基およびデカエチレングリコール
を介してセルロースマトリックスに結合させた(Rudiger et al., (EMBO J., 16:
1501 (1997))。合計２７０個の１３アミノ酸ペプチド配列を分析した。
【００９９】 １−１５５位は、リン酸化形の全ての保存Ser/Thr-Proモチーフを伴うヒトCdc
25Cの完全ペプチドスキャンを示し、一方１５６−２７０位はSer/Thr-Proモチー
フを含むCdc25Cの領域をカバーする、非リン酸化ペプチドスキャンを示す。Rudi
ger et al.(EMBO J., 16:1501 (1997))に記載のように、ペプチド結合セルロー
ス膜をPin1またはGST−Pin1 WWドメインとインキュベートし、洗浄し、続いて抗
Pin1抗体または抗GST抗体を使用して免疫ブロッティングした。同様の結果が、P
in1またはPin1 WWドメインで得られた。高親和性Pin1 WWドメイン結合部位は、C
dc25C中のリン酸化Trh48およびリン酸化Thr67に位置しており、それらはCdc25C
の調節ドメインにおける必須調節リン酸化部位である。
【０１００】 実施例４ リガンドへのWWドメイン結合は、リン酸化ペプチドにより阻害される リンペプチドがWWドメインへの結合に関してリンタンパク質と競合する能力を
試験するために、Pin1結合リンペプチドPintide(WFYpSPRLKK、配列番号１３)(Lu
, K. P. et al., U.S. Serial No. 60/058,164 (1997))を競合アッセイで使用し
た。Pintideの非リン酸化相同物(WFYSPRLKK、配列番号１４)（C−Pintide)をコ
ントロールとして使用した。
【０１０１】 Pin1またはそのWWドメインを種々の濃度(０、２５、５０、１２５、２５０、
５００μM)のPintideまたはコントロールペプチド(C−Pintide)と、有糸分裂抽
出物とのインキュベーション前にインキュベートしたとき、リンタンパク質結合
活性は、Pintideにより濃度依存的方法で有意に減少されるが、非リン酸化ペプ
チドではされなかった(図１)。
【０１０２】 PintideはPin1およびそのWWドメインがリンペプチドMPM２抗原と結合するのを
、同様の親和性で防止した(Pin1＋pSer；WW＋Pser;図１)。有意な競合が５０μM
で検出され、完全な競合が２５０−５００μMで観察された(図１)。PintideとWW
ドメインリンペプチド結合の間の競合は、プロリンリッチペプチド(WW＋Pro 図
１)または非リン酸化ペプチド(Pin1＋Ser；WW＋Ser；図１)で観察されなかった
。これらの結果は、Pintideのような小ホスホセリン含有ペプチドが、プロリン
リッチではなくリンタンパク質と、Pin1またはそのWWドメインへの結合において
、リン酸化依存的方法で競合できることを証明する。
【０１０３】 実施例５ WWドメインは高親和性でリンペプチドと結合する Pin1およびそのWWまたはPPIaseドメインのリンペプチドに対する親和性を測定
するために、ペプチドをフルオレッセインで標識し、Pin1とのそれらの相互作用
を定量的蛍光アニソトロフィー(anisotrophy)を使用して測定した。非特異的標
識を防止するために、Pintideアナログ(WFYpSPFLE、配列番号８)を使用し、それ
は、その教示を本明細書に引用してその全体を包含させる(Lu, K. P., et al.,
U.S. Serial No. 60/058,164 (1997))に記載のようにペプチドライブラリースク
リーニングに基づいて、Pin1に高親和性で結合する。
【０１０４】 Pintideおよびその非リン酸化相同物を合成し、確立された方法を使用して、G
ST−Pin1またはPin1のGST−WWドメインと、結合緩衝液中でインキュベートした(
Shen, M. et al., Genes & Dev 12:706 (1998))。１時間のインキュベーション
後、有し分裂HeLa細胞抽出物を添加し、GSTプルダウン実験に付し、続いてMPM-2
抗体を使用した免疫ブロッティング分析に付した。半定量的データを得るために
、免疫ブロットのフィルムを、主要Pin1結合タンパク質である５５Kdaの領域で
スキャンし、データをImageQuan(ScanJetII CX)を使用して分析した。ペプチド
結合定数を蛍光分極アッセイを使用して測定した(Jiskoot, W. et al., Anal Bi
ochem 196:421 (1991))。ペプチドをFluorescein Amine Labeling Lit(Pan Vera
Corp.)を使用してN末端でフルオレッセイン標識し、製造者の指示にしたがって
TLCで精製した。非特異的標識を防止するために、Pintideアナログ(WFYpSPFLE、
配列番号８)および非リン酸化コントロールを使用した。種々の濃度のPin1およ
び変異タンパク質を０.１μMの標識ペプチドと、５０mM HEPES、pH７.４、１０
０mM NaCl、２％グリセロール含有結合緩衝液中でインキュベートした。蛍光分
極値を、Pan Vera Beacon 2000システムを、製造者により記載のように使用して
得た。
【０１０５】 PintideとPPIaseドメインまたは非リン酸化コントロールペプチドとPin1、そ
のWWドメインまたはPPIaseドメインの間で結合は検出されなかった。Pin1および
そのWWドメインはPintideと結合した(表１および２)。Nedd4のWWドメインは低親
和性でPintideと結合し(Kd＝１０μm)、非リン酸化中枢ペプチドと結合しなかっ
た。
【０１０６】
【表２】 ペプチド(WFYpSPFLE、配列番号８；WFYSPFLE、配列番号９)のN末端をフルオレセ
イン−C６−アミンラベルキットでラベルし、TLC(Pan Vera)によって精製した。
示したような様々な濃度のタンパク質およびコントロールGSTをラベルしたペプ
チドとインキュベートし、結合を蛍光アニソトロピーアッセイ(fluorescence an
iostropy assay)によって測定した。それぞれの値を３回の独立的な実験の平均
として表す。Pin1および非リン酸化ペプチドの間またはGSTおよびいずれのペプ
チドの間にも結合は検出されなかった。＊、N末端タグはこれらのタンパク質か
らトロンビンによって切断された。N.D.、検出せず。
【０１０７】 Pin1は高(Kd＝１.２μM)および低(Kd＝１１.０μM)親和性を有するPintideに
ついての２個の結合部位を示す(表２)。単離されたWWドメインは高親和性結合部
位(Kd＝１.２μM)を含み、PPIaseドメインは低親和性(Kd＝１５.０μM)結合部位
を含んでいた。これらの結果は、WWドメインおよびPPIaseドメインの両方がリン
ペプチドを結合できるが；WWドメインの結合親和性がPPIaseドメインの結合親和
性(Kd＝１５.０μM)より有意により高い(Kd＝１.２μM)ことを示している。これ
らのデータは、WWドメインが高親和性でリンペプチド、特に、特定の有糸分裂性
リンタンパク質のセットに結合することを示している。WWドメインに結合したと
きに、WWドメインおよび標的リンタンパク質の間の相互作用はホスホセリン残基
によってメディエートされ、リガンドの脱リン酸化を保護する。従って、Pin1 W
Wドメインはホスホセリン結合モジュールである。
【０１０８】 実施例６ WWドメイン変異体はリンタンパク質結合に影響を及ぼす WWドメイン結合特異性の構造的基礎を決定するために、部位特異的変異誘発、
続いて分子モデリングをPin1結晶構造に基づいて実施した(Macias, M. J. et al
., Nature 382: 646(1996); Ranganathan, R. et al., Cell 89: 875(1997))。P
in1のWWドメインではなく、PPIaseドメインは、活性部位に保存された塩基性区
画を有し、ホスセリンの認識にとって重要である(Yaffe, M. B. et al., Scienc
e 278: 1957(1997); Schutkowski, M. et al., Biochemistry 37: 5566(1998))
。WWドメインは、疎水性のクレフトを有する。分子の表面の疎水性パッチはタン
パク質タンパク質相互作用表面をしばしば示唆している(Janin, J. et al., J.
Biol. Chem. 265: 16027(1990); Clackson, T. et al., Science 267:383(1995)
; Young, L. et al., Protein Sci. 3:717(1994))。Pin1のWWドメインにおける
疎水性クラスターは、PEG分子を封さし、それは、それぞれ逆平行βシートの３
個の異なる鎖に位置するSer−１６、Tyr−２３およびTrp−３４と密な接触を形
成する(図２)(Macias, M. J. et al., Nature 382: 646(1996); Ranganathan, R
. et al., Cell 89:875(1997))。
【０１０９】 タンパク質のホスフェート結合部位を統計的に分析することによって、TyrはA
rgに次いで２番目にホスフェートに結合する性向を有すると評価される(Copley,
R. R. et al., J. Mol. Biol. 242: 321(1994))。従って、Tyr−２３は、WWド
メインがホスホセリンに結合するために重要であるようである。これが正しいか
試験するために、標準的なPCR突然変異誘発法(Shen, M., et al., Genes & Dev.
12: 706(1998))を用いて、Tyr−２３およびTrp−３４、並びにArg−１４(該構
造のTyr−２３に接近した残基である)において、Pin1のWWドメインを変異させた
。Pin1変異体をPCR突然変異誘発法(Shen, M., et al., Genes & Dev. 12: 706(1
998))を使用して生成した。Pin1および様々な変異体を含むGSTおよび(His)６融
合タンパク質を生成し、トロンビンを用いてタグを切断した(Shen, M. et al.,
Genes & Dev 12: 706(1998))。変異したPin1タンパク質を、それらのリンタンパ
ク質およびペプチドに結合する能力について試験した(表２、３および４)。
【０１１０】 Arg−１４のAlaによる置換(Pin1R１４A)は、WWドメインがリンペプチドまたは
リンタンパク質を結合することにおいて、有意な変化を引き起こさないようであ
り、このことは、Pin1におけるArg−１４の間の静電気的な相互作用が結合にと
って不可欠ではないことを指摘している(表２および３)。これに対して、Tyr−
２３(Pin1Y２３A)またはTrp−３４(Pin1W３４A)のいずれかの単一Ala点変異によ
って、Pin1はリンタンパク質またはリンペプチドを高親和性で結合する能力が完
全になくなった。単離したPPIaseドメインについても同様である(表２、３およ
び４)。これらのデータは、Tyr−２３およびTrp−３４がWWドメインのpSer結合
活性にとって重要なアミノ酸であることを指摘している。
【０１１１】
【表３】
【０１１２】 様々な濃度の様々なPin1タンパク質をフルオレセインラベルしたPintideとイン
キュベートし、結合定数を蛍光アニソトロフィーアッセイ(fluorescence aniost
rophy assay)によって測定した。各値は３回の独立的な実験の平均を表す。Pin1
変異体はWWドメインにおける高親和性pSer結合部位のKdのみに影響を与え、PPIa
seドメインにおける低親和性pSer結合部位に影響を与えなかった。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】 Pin1およびPin1変異体タンパク質を発現させGST融合タンパク質として精製した
。リンタンパク質結合活性を、GST融合タンパク質を有糸分裂エキストラクトと
インキュベートし、続いて、MPM2抗体を使用するイムノブロッティング分析を実
施することによってアッセイした。＋、結合は検出された；、結合は検出されな
かった。PPIase活性をペプチド基質を使用してアッセイし(Schutkowski, M., et
al., Biochemistry 37: 5566(1998))、そして１００％と定義される野生型タン
パク質の活性に対する相対値で表した。Pin1およびその変異体のインビボ機能を
、温度感受性ptf１酵母変異体をレスキューすることによってアッセイした。
【０１１５】 CREBのリン酸化されたKIDドメインおよびコアクチベーターCBPのKIXドメイン
の間のチロシンメディエートリン酸化依存性相互作用が、報告されている(Radha
krishnan, I. et al., Cell 91: 741-752(1997))。 pSer−ProジペプチドをPEG分子の替わりにWWドメインの疎水性クラスターに入
るように設計した。コンピューターの助けによる、Ranganathan et al.,(Cell 8
9:875(1997))によって報告されたPin構造の共縦座標に基づく分子モデル化を、S
GI Indigo IIワークステーションにおいてQUANTAを使用して実施した。pSer−Pr
oジペプチドのWWドメインの疎水性クレフトへの配置を、疎水性、水素結合およ
びファンデルワールスによる相互作用によって決定した。疎水性のクレフトのPr
o環部位は、Tyr−２３およびTrp−３４の芳香環の間に積み重ねられ、一方、pSe
rは、Ser−１６およびTyr−２３の間の空間に適合し、Tyr−２３ヒドロキシルプ
ロトンの水素結合距離内にあるホスフェート部分を有する。
【０１１６】 実施例７ Pin1リン酸化はインビボで調節される Pin1リンタンパク質結合活性がPin1リン酸化によって調節されているか決定す
るために、Pin1変異体を、疎水性クレフトを形成していると予測されるWWドメイ
ンの領域に構築した。例えば、pSer結合ポケットにおけるSer−１６がリン酸化
されたならば、負に荷電した残基を結合ポケットに導入することができ、ホスフ
ェート基がTyr−２３の側鎖との水素結合相互作用を形成することができる。Ser
−１６のリン酸化は、Pin1 WWドメインがそのリガンドと相互作用するのを防止
し得る。この仮説を試験するために、実験を実施して、Pin1がリンタンパク質で
あるかおよびPin1リン酸化がインビボでの細胞周期の間に調節されるか決定した
。
【０１１７】 インビボのPin1のリン酸化を検出するために、３２Pオルトホスフェート(１０
μCi／ml)の存在下、HeLa細胞をG１／S境界でまたは有糸分裂で停止させた(Shen
,M. et al., Genes & Dev 12:706(1998))。細胞をRIPAバッファー中で溶解させ
、Pin1特異的抗体を使用する免疫沈降、続いて修飾したSDS含有ゲル上の分離に
付した。Pin1のリン酸化状態の変化を指摘する、細胞周期中のPin1の分子量の変
動を検出するために、HeLa細胞を様々な時期についてG１／S停止から開放し、細
胞周期をFACSによって分析し、RIPAバッファー中に調製した総溶解物を、前記の
Pin1抗体を使用するイムノブロッティング分析に付した(Shen, M. et al., Gene
s & Dev 12:706(1998))。
【０１１８】 インビボの３２Pラベルの実験によれば、細胞がG１／S境界で停止したとき、S
DSゲル上で単一のゆっくり移動する種類のものをおもに示し、Pin1が過リン酸化
された(hyperphosphorylated)ことをを示している。細胞が有糸分裂で停止され
たとき、Pin1は脱リン酸化した。これは、SDSゲル上で急速に移動するPin1の低
分子量の種類のものの出現によって指摘される。細胞周期中のPin1脱リン酸化の
動態をさらに決定するために、HeLa細胞溶解物を、G１／S停止からの開放の後の
様々な時期に収集し、実施例２に記載のように、高分解能SDS−PAGE、続いてPin
1抗体を使用するイムノブロッティング分析に付した。前記のように(Shen, M. e
t al., Genes & Dev 12: 706(1998))、総Pin1レベルは、細胞周期中に変動しな
かった。しかし、Pin1の２個の異なる分子量形態が検出された。より急速に移動
する、Pin1の低分子量形態は、細胞周期依存性であり、細胞が有糸分裂を進行し
ているときまたはノコダゾールによって有糸分裂で停止したときにのみ現れた。
これらの動態データは、Pin1のリンタンパク質を結合する能力と強く相関してい
た(Shen, M et al., Genes & Dev 12: 706(1998))。これらの結果は、Pin1の急
速に移動する種類のものの出現がPin1の脱リン酸化した形態であり、Pin1が細胞
周期調節された方法によってリン酸化されることを示している。リン酸化は、Pi
n1のホスホセリンリガンドとの相互作用を防止する。
【０１１９】 実施例８ WWドメインのリン酸化はリガンドとの相互作用を防止する Pin1リン酸化がPin1のリガンドへの結合に及ぼす影響を試験するために、Pin1
およびPin1変異体タンパク質をPKAおよびPKCの触媒的サブユニット(α、βおよ
びγの混合物、UBI)と、５００μMコールドATPを含むキナーゼ反応バッファー中
で３０℃で１５分間インキュベートした(Lu, K. P.et al., Anal. Biochem. 196
:421(1991))。反応をSDSサンプルバッファーを添加することによって停止させ、
反応産物をSDSゲル上で分離し、続いてオートラジオグラフィーに付した。Pin1
タンパク質を単離、使用して前記のようにHeLa細胞由来の有糸分裂エキストラク
トからのMPM−２抗原を結合させた(Shen, M., et al., Genes & Dev 12: 706(19
98))。実験をPKAおよびPKC、カゼインキナーゼ、サイクリンB／Cdc２およびSRPK
１キナーゼでも実施した。
【０１２０】 キナーゼはPin1およびそのWWドメインを容易にリン酸化した。PKCではなくPKA
によるリン酸化が、Pin1およびMPM2抗原の間またはWWドメインおよびMPM2抗原の
間の相互作用を完全になくしたことがより重要である。Pin1のSer１６がPKAコン
センサスリン酸化部位(KRXS)に位置するので、このことは、特に重要である(Pea
rson, R.B.et al., Methods in Enzymol. 200: 62-81(1991))。これらの結果は
、Pin1のWWドメインのリン酸化によって、Pin1がリン酸化されたリガンドと相互
作用するのを防止することができることを指摘している。
【０１２１】 Pin1 WWドメインにおける調節リン酸化部位を正確に指摘するために、Ser−１
６をリン酸化可能なアミノ酸残基であるGluに変異させた。得られた変異体(Pin1 S１６E )タンパク質は、有糸分裂のリンタンパク質を結合しなかった。さらに、P
in1S１６Eにおいて、ホスホセリンペプチドについての高親和性結合部位は検出
されなかった(表２、３および４)。これらの結果は、S16E変異によってPin1 WW
ドメインがそのリガンドを結合する能力が完全になくなったことを指摘している
。このことはPKAリン酸化にも当てはまる。コントロールとして、近傍のSer残基
、Ser１８をGluに変異させた(Pin1S１８E)。このPin1S１８E変異は、Pin1がリン
タンパク質またはPintideペプチドに結合する能力に影響を及ぼさなかった(表２
、３および４)。これらの結果は、Ser１６がPin1およびリンタンパク質の間の相
互作用を調節する重要なリン酸化部位であることを指摘している。
【０１２２】 リンペプチド分析によって検出されたように、複数の部位においてPKAはPin1
をリン酸化したので、さらなる実験を実施して、Ser−１６がリンタンパク質結
合を調節する重要なリン酸化部位であるか否か決定した。Ser−１６を非リン酸
化可能アミノ酸残基であるAlaで置換し、変異体タンパク質を使用してMPM−２抗
原およびPintideアナログを結合させた。野生型Pin1と同様に、Pin1S１６A変異
体はすべてのPin1リガンドおよびPintideペプチドと相互作用した(表２、３およ
び４)。このことは、AlaがSer−１６と置換することができ、結合のための空間
的な要求を満たしていることを指摘している。変異体タンパク質はPKAによって
リン酸化できたにもかかわらず、Pin1S１６Aのリンタンパク質またはPintideア
ナログとの相互作用はPKAリン酸化によって影響を受けなかったことがより重要
である(表２、３および４)。これらの結果は、Ser−１６におけるリン酸化がPin
1およびリンタンパク質の間の相互作用を調節するために必要かつ十分であるこ
とを確認している。従って、Pin1およびそのリガンドの間の相互作用は、緊密に
制御されており、リガンドのリン酸化およびそのWWドメインのpSer結合ポケット
の脱リン酸化に依存している。
【０１２３】 実施例９ Pin1のWWドメインのリンタンパク質結合活性はPin1のインビボの機能に不可欠で
ある インビトロのPin1結合特異性を付与することにおいて、WWドメインが不可欠な
役割を有すると仮定すれば、このドメインはインビボで重要であるか否かは重要
な問題である。この問題と取り組むために、PIN１酵母ホモログ、ESS１／PTF１
を使用する実験を実施した。ESS／PTF１は細胞成長に不可欠であり、酵母細胞に
トランスフェクトさせたとき、ヒトのPin1はこの不可欠な機能を実現することが
できる(Lu, K. P. et al., Nature 380: 544(1996); Hanes, S. D. et al., Yea
st 5: 55(1989); Hani, J. et al., FEBS Lett. 365: 198(1995))。温度感受性p
tf１変異体株、YPM2を、制限的な温度(３０℃)でではなく許容される温度(２３
℃)で成長させる(Hanes, S. D. et al., Yeast 5: 55(1989); Hani, J. et al.,
FEBS Lett. 365: 198(1995))。この表現型は１.５kbのPTF１ゲノムフラグメン
トによって完全にレスキューされ、プロモーターおよび３'プロセッシング配列
をも含んでいる(図３)。すべてのヒトのPin1タンパク質が通常の調節の下で生理
的レベルで発現したことを確認するために、Yepベクター(Yepvector)の十分に機
能的なESS１／PTF１遺伝子のコード配列をヒトのPIN１(またはPin1変異体)cDNA
のコード配列と置換し(図３)、温度感受性ptf１株に形質転換させた。形質転換
体を最少培地マイナスLeu上で許容される温度(２３℃)で選抜し、タンパク質発
現を、N末端に挿入したHAエピトープタグについて特異的な１２CA５モノクロー
ナル抗体を使用するイムノブロッティング分析によって検出した。HAタグはPin1
機能に影響を及ぼさない(Lu, K. P. et al., Nature 380: 544(1996))。類似レ
ベルのPin1およびPin1変異体を発現しているこれらの株を、許容されるおよび許
容されない温度で成長させた。少なくとも３−４系統を各構築物について試験し
、同様な結果であった。
【０１２４】 YPM2細胞に形質転換させたとき、ヒトのPin1は温度感受性表現型を十分に補足
した。このことは、内生プロモーターの下で発現したとき、ヒトのPin1が十分に
機能し得ることを指摘している。WWドメインはPin1がその本質的な機能を働かせ
るのに重要であるか否か決定するために、Pin1のWWドメインおよびPPIaseドメイ
ンを、全長タンパク質に類似のレベルにそれぞれ発現させた(表４)。これら結果
は、WWドメインがインビボで不可欠であることを指摘している。この観察結果を
さらに確認するために、様々なWWドメイン点変異体を、同じ発現ベクターを使用
してYPM2株に導入し、細胞において野生型タンパク質のものと類似のレベルで発
現させた。リンタンパク質に結合することのできたWWドメイン変異体は、ptf１
表現型をレスキューした(表４)。しかし、S16E、Y23A、W34Aを含むPin1変異は、
WWドメインおよびリンタンパク質の間の相互作用を崩壊させ、Pin1の細胞成長を
補助する能力をなくさせた。これらの結果は、WWドメインのリンタンパク質結合
活性が、インビボのPin1のプロピルペプチジルcis-transイソメラーゼ活性にと
って不可欠であることを示している
【０１２５】 実施例１０ PIN1 WWドメインおよびリン酸化したタウおよびアミロイド前駆体タンパク質ペ
プチドの相互作用 Pin1およびタウタンパク質(有糸分裂においておよびアルツハイマー病におい
て高度にリン酸化している)の間の相互作用を試験した。Pin1はリン酸化したタ
ウに結合し、アルツハイマー病を有する患者の脳切片におけるペアとなったらせ
ん状フィラメントにおいてタウと共局在した(colocalized)。タウまたはアミロ
イドタンパク質におけるPin1結合部位をマップするために、Pin1またはWWドメイ
ン変異体を、タウまたはアミロイドタンパク質由来のリン酸化した(pT、pS)また
は非リン酸化(S、T)ペプチドとインキュベートし、続いて、ELISAアッセイによ
ってペプチドの結合を測定した。Pin1は、高親和性で(Kd＝２５nM)、リン酸化し
たThr−２３１タウペプチドのみに結合し、相互作用は、Pin1 WWドメインによっ
てPin1Y２３AではなくPin1R１４Aとしてメディエートされた 表５; 図４B。リ
ン酸化したThr−２３１はタウタンパク質の調節ドメインにある。Pin1 WWドメイ
ンも、リン酸化したThr−６６８アミロイド前駆体タンパク質ペプチドを特異的
に結合する(表５)。
【０１２６】 より低い親和性結合定数をELISAアッセイで取得し、蛍光アニソトロピーアッ
セイ(fluorescence aniostropy assay)と比較した。これは以下の理由：１)ペプ
チドはELISAアッセイにおいて同じ方向に配向するが、アニソトロフィーアッセ
イ(aniostrophy assay)ではそうではない；２)ELISAアッセイはアニソトロフィ
ーアッセイよりより敏感である；および／または３)異なるペプチドは異なる親
和性を有することのためであろう。いずれの場合も、Pin1 WWドメインは、Pin1
およびタウまたはアミロイドタンパク質の間の特異的相互作用をメディエートす
る。
【０１２７】
【表５】
【０１２８】 実施例１１ Pin1のWWドメインによるアルツハイマーリン酸化タウの機能回復 アルツハイマー病の神経病理学的証明は、神経原線維濃縮体であり、その主な
要素は、微小管結合タンパク質タウから構成される対合へリックスフィラメント
(PHF)である(Lee, V.M. Curr Opin Neurobiol 5: 663-668 (1995); Mandelkow,
E. et al., Neurobiol Aging 16: 347-354 (1995); Kosik, K.S. et al., Ann N
Y Acad Sci 777: 114-120 (1996); Spillantini, M.G. and Goedert, M. Trends
Neurosci 21: 428-433 (1998)およびIqbal, K. et al., J Neural Transm Supp
l 53: 169-180 (1998))。タウは、PHF中で高リン酸化されており(Lee, V.M. et
al., Science 251: 675-678 (1991); Goedert, M. et al., Neuron 8: 159-168
(1992); Greenberg, S.G. et al., J Biol Chem 267: 564-569 (1992))、タウの
リン酸化は、微小管結合能および微小管アセンブリ促進能の喪失の原因となる(B
ramblett, G.T. et al., Neuron 10: 1089-1099 (1993); Yoshida, H. and Ihar
a, Y. J Neurochem 61: 1183-1186 (1993); Iqbal, K. et al., FEBS Lett 349:
104-108 (1994))。リン酸化タウの機能回復は、アルツハイマー病のPHF形成を
予防し、回復する。
【０１２９】 プロリンの前にあるセリンまたはスレオニン(Ser／Thr−Pro)のリン酸化は、
プロリル異性化率を変化させ、プロリルイソメラーゼPin1の結合部位を作成する
(Lu, K.P. et al., Nature 380: 544-547 (1996); Yaffe, M.B. et al., Scienc
e 278 1957-1960 (1997); Shen, M. et al., Genes Dev 12: 706-720 (1998); S
chutkowski, M. et al., Biochemistry 37: 5566-5575 (1998); Crenshaw, D.G.
et al., S. Embo J 17. 1315-1327 (1998))。Pinは、特異的にリン酸化Ser／Th
r−Pro結合を異性化し、幾つかの有糸分裂リンタンパク質の機能を調節する(Lu,
K.P. et al., Nature 380: 544-547 (1996); Yaffe, M.B. et al., Science 27
8: 1957-1960 (1997); Shen, M. et al., Genes Dev, 12: 706-720 (1998))。
【０１３０】 以下のデータは、Pin1が特異的にタウ中のリン酸化Thr−Proモチーフに結合す
ることを示す。Pin1は、PHFと共存し同時精製され、可溶性Pin1は、アルツハイ
マ病患者の脳内で有意に減少する。更に、Pin1は、インビトロで微小管と結合し
、微小管アセンブリを促進するリン酸化タウの能力を十分に回復する。そのため
、Pin1は、脱リン酸化なしにリン酸化タウの生物学的活性を回復し得る第一の分
子である。加えて、Pin1の減少は、有糸分裂停止およびアポトーシスを誘導する
ため(Shen, M. et al., Genes Dev. 12. 706-720 (1998))、アルツハイマー病で
のPHF中へのPin1の隔離は、ニューロンの喪失の一因となる。
【０１３１】 Pin1による有糸分裂リンタンパク質への結合および調節 Pin1は、結合し、MPM−２、有糸分裂特異的リン酸化依存モノクローナル抗体(
mAb)によっても認識される保存リン酸化Ser／Thr−Proモチーフとの相互作用に
より有糸分裂リンタンパク質の定義された群の機能を調節する(Yaffe, M.B. et
al., Science 278: 1957-1960 (1997); Shen, M. et al., Genes Dev. 12: 706-
720 (1998))。タウは、有糸分裂の間に複数のSer／Thr−Proモチーフ上でリン酸
化されたMPM−２抗原である(Illenberger, S. et al., Mol Biol Cell 9: 1495-
1512 (1998))。実験を行い、Pin1がタウに結合するかどうか決定した。タウアイ
ソフォームは、インビトロでの転写および３５S−Metの存在下での翻訳によるか
、N末端をHisタグ化したタンパク質として細菌中で産生されるか、何れかにより
合成され、その後、NTA−Niカラムを用い精製された(Yaffe, M.B. et al., Scie
nce 278: 1957-1960 (1997); Shen, M. et al., Genes Dev. 12: 706-720 (1998
))。中間期および有糸分裂に特異的なタウのリン酸化型を生成するため、タウを
Xenopus中間期および有糸分裂抽出物と共に、それぞれインキュベーションした(
Shen, M. et al., Genes Dev. 12: 706-720 (1998))。Cdc2リン酸化タウを調製
するため、精製組換え体タウを、幾つかの実験において、追跡[３２P]−ATPを加
えた５００μM コールドATPを含む緩衝液中、室温で６〜１２時間、精製サイク
リンB／Cdc2(UBI)と共にインキュベーションした(Vincent, I. et al., J Neuro
sci 17: 3588-3598 (1997))。
【０１３２】 Pin1は、中間期Xenopus抽出物と共にインキュベーションしたタウとは結合し
なかったが、有糸分裂抽出物によりリン酸化したタウとは結合した。Pin1とタウ
との間の有糸分裂性の結合は、有糸分裂性リン酸化タウがアルカリホスファター
ゼにより脱リン酸化したとき、破壊される。これらの結果は、Cdc25を含む多く
の他のPin1結合タンパク質で示されているように(Shen, M. et al., Genes Dev.
12: 706-720 (1998))、Pin1は有糸分裂に特異的なおよびリン酸化に依存した方
法においてリン酸化タウに結合することを示す。
【０１３３】 有糸分裂は、Cdc2キナーゼおよびサイクリンBの再発現を含むアルツハイマー
病の脳において異常に活性化される(Vincent, I. et al., J Cell Biol 132: 41
3-425 (1996); Vincent, I. et al., J Neurosci 17: 3588-3598(1997); Nagy,
Z. et al., Acta Neuropathol 94: 6-15 (1997); Nagy, Z. et al., Acta Neuro
pathol (Berl) 93: 294-300 (1997))。有糸分裂細胞におけるタウのリン酸化パ
ターンは、リン酸化部位特異的タウmAbにより検出されるので、アルツハイマー
病(AD)の脳内のものと顕著に類似する(Illenberger, S. et al., Mol Biol Cell
9: 1495-1512 (1998); Vincent, I. et al., J Cell Biol 132: 413-425 (1996
); Vincent, I. et al., J Neurosci 17: 3588-3598 (1997); Kondratick, C.M.
and Vandre, D.D. J Neurochem 67: 2405-2416 (1996); Vincent, I. et al.,
Neurobiol Aging 19: 287-296 (1998); Preuss, U. and Mandelkow, E.M. Eur J
Cell Biol 76: 176-184 (1998))。有糸分裂的にリン酸化されたタウは、CP９、
TG3およびPHF１を含む、AD特異的リン酸化依存タウmAbにより認識される(Illenb
erger, S. et al., Mol Biol Cell 9: 1495-1512 (1998); Vincent, I. et al.,
J Cell Biol 132: 413-425 (1996); Vincent, I. et al., J Neurosci 17: 358
8-3598 (1997)); Kondratick, C.M. and Vandre, D.D. J Neurochem 67: 2405-2
416 (1996), Vincent, I. et al., Neurobiol Aging 19: 287-296 (1998); Preu
ss, U. and Mandelkow, E.M. Eur J Cell Biol 76: 176-184 (1998))。これらの
結果は、タウの通常のSer／Thr−Proモチーフは、通常の有糸分裂細胞において
、およびアルツハイマーの脳においてリン酸化されている。そのため、Pin1は、
結合し、AD中のタウの機能を調節し得る。
【０１３４】 アルツハイマー患者からの脳の抽出物におけるタウとのPin1相互作用 AD脳におけるタウとのPin1相互作用を、GST−Pin1プルダウンアッセイを用い
試験した(Shen, M. et al., Genes Dev. 12: 706-720 (1998))。GSTまたはGST−
Pin1を含むグルタチオンビーズを、通常のもしくはADの脳抽出物と、または精製
PHFと共にインキュベーションし(Vincent, I.J. and Davies, P. Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 89: 2878-2882 (1992))、ビーズと結合したタンパク質を、タウ
のすべての形を認識するCP27を用い免疫ブロッティング分析した。組換え体およ
び変異Pin1タンパク質は、N末端GSTまたはHisタグ融合タンパク質として産生さ
れた(Shen, M. et al., Genes Dev 12: 706-720 (1998))。PHFは、免疫親和性ク
ロマトグラフィーにより精製された(Vincent, I.J. and Davies, P. Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 89: 2878-2882 (1992))。Pin1抗体およびタウmAb(CP27、TG3
、PHF１およびCP９)は、従前に述べられているように使用した(Shen, M. et al.
, Genes Dev. 12: 706-720 (1998); Jicha, G.A. et al., J Neurochem 69: 208
7-2095 (1997))。
【０１３５】 可溶性Pin1のレベルを決定するため、脳組織をスライスし、適当な切片に切断
し、緩衝液A(50mM Hepes, pH 7.4, 150mM NaCl, 10%グリセロール, 1% Triton X
-100, 5mM MgCl2, 1mM EGTA, 1mM DTT, 100mM NaF, 2mM Na3Vo4および種々のプ
ロテアーゼ阻害剤)中にホモジナイズした。そのホモジネートを１００,０００g
、４℃で３０分間遠心分離し、当該上清は、述べられたPin1抗体を用い免疫沈降
法または免疫ブロッティング分析に直接用い(Shen, M. et al., Genes Dev. 12:
706-720 (1998))、アッセイ前に−８０℃でアリコート中に保存した。
【０１３６】 GST−Pin1は、しかし対照GSTではない、AD脳抽出物またはPHF中で存在するタ
ウと結合した。対照的に、Pin1は、年齢に適した通常の脳抽出物においてタウと
結合しなかった。これらの結果は、Pin1はインビトロでAD特異的タウと相互作用
することを示す。Pin1がインビボでADタウと安定して複合体を形成するかどうか
決定するため、PHFを、親和性クロマトグラフィーを用い精製し(Vincent, I.J.
and Davies, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2878-2882 (1992))、SDSサン
プル緩衝液中に溶解し、その後、抗Pin1抗体を用い免疫ブロッティング分析した
。Pin1は、試験した６AD脳のすべてから精製したPHF中で検出された。これらの
結果は、Pin1がPHFと同時精製されることを示す。
【０１３７】 アルツハイマーおよび通常の脳中のPin1の免疫細胞化学的局在 Pin1がPHFに対し特異的親和性を有することを更に確認するため、組換え体Pin
1を脳部分に加え、洗浄し、次いで、結合Pin1を位置特定(localization)するた
めの親和性精製Pin1抗体を用い免疫染色した。外来的に加えたPin1を脳切片にお
いて位置特定するため、５０μm切片を、ホルマリン固定したヒトの脳の前皮質
または海馬から切除し、H２O２で内在性ペルオキシダーゼ活性を阻害し、その後
、０.５μMでPin1とインキュベーションした。当該切片を、GST−Pin1グルタチ
オンビーズを用い精製したmAb TG3または抗Pin1抗体と共にインキュベーション
し、免疫ペルオキシダーゼ染色プロトコールにより視覚化し、内在性Pin1を検出
するため、製造者によって説明されるように、固定化脳部分に抗原回復緩衝液(B
iogenex)中でマイクロ波を最初に照射し、次いで免疫染色法を行った。
【０１３８】 組換え体Pin1を通常またはADの脳部分に加えないと、免疫反応性シグナルは観
察されず、これは、Pin1抗体は内在性Pin1を認識しないことを示す。しかし、Pi
n1を通常およびADの脳部分に加えたならば、劇的に異なる結果が観察された。Pi
n1結合シグナルは通常の脳部分で検出されないが、Pin1結合シグナルは、AD脳部
分のニューロンの細胞質中で検出された。特に、Pin1は、スレオニン−２３１(T
２３１)においてリン酸化されたタウのAD特異的構造を認識するTG3の共免疫染色
により示されたように、神経原線維濃縮体および神経突起に強力に結合した(Jic
ha, G.A. et al., J. Neurochem 69: 2087-2097 (1997))。これらの結果は、外
来性Pin1がニューロンにおいて特異的に神経原線維濃縮体と結合することを示す
。
【０１３９】 Pin1が濃縮体に対し高い親和性を有し、PHFで精製されるなら、Pin1とPHF間の
インビボの関係を試験することは、重要である。この問題に取り組むため、固定
化脳部分を抗原回復法(antigen retrieval procedure)を行った。強力な免疫反
応性を、通常およびADの脳部分においてPi１抗体で観察した。これらのシグナル
がPin1を示すことを確信するため、Pin1特異的抗体を最初にGST−Pin1ビーズを
用い減少させ、次いで免疫染色に使用した。Pin1減少抗体は、通常またはADの脳
部分の何れかとの特異的免疫反応を示さない。顕著に、Pin1局在の異なるパター
ンが通常およびADの脳部分で観察された。Pin1は、通常脳部分のニューロンの核
中およびAD脳部分のニューロン核中に本来的に局在した。これらの結果は、異所
性発現および内在性Pin1の両方が本来的にHeLa細胞の核内に局在するという発見
と一致する(Lu, K.P. et al., Nature 380: 544-547 (1996))。
【０１４０】 しかし、AD脳において、強力なPin1免疫染色は、ニューロンの細胞質中で、特
にTG3によっても認識される濃縮体構造で観察された(Jicha, G.A. et al., J Ne
urochem 69: 2087-2095 (1997))。これらの結果は、外来性および内在性、両方
のPin1が、特に、AD脳中の神経原線維濃縮体に局在することを示す。
【０１４１】 Pin1によるPHFへの結合は、濃縮体においてPin1をトラップし得、その結果、
ニューロンにおける可溶性Pin1の減少を生じた。この可能性を試験するため、Pi
n1および２つのタウキナーゼ、GSK3bおよびCdc2のレベルをADおよび通常の脳組
織中で比較した。脳組織をホモジナイズし、可溶性タンパク質を直接免疫ブロッ
ティング分析に付し、その後、ImageQuanを用いタンパク質レベルを半定量した
。６歳の適した通常の脳と比較すると、GSK3bレベルは、わずかに減少し(４０±
１１％)、Cdc2レベルは、有意に、AD脳の約５倍に増加した(５４７±８７％、n
＝６、P＜０.０１)。これらの発見は、Cdc2、しかしGSK3bではない、のレベルが
アルツハイマー病の脳では異常に上昇することを示した従前の研究(Vincent, I.
et al., J Neurosci 17: 3588-3598 (1997))と一致する。
【０１４２】 AD脳内の可溶性Pin1のレベルは、通常の脳よりも低く、その平均は約５倍低か
った(２２.４±３.４％)。Pin1レベルのこの減少は、Pin1免疫沈降分析により確
認された。これらのデータは、可溶性Pin1はアルツハイマー病を患うヒト由来の
脳では有意に減少することを示す。そのため、Pin1は可能性ある遺伝子治療の標
的となり得る。
【０１４３】 タウ内におけるPin1結合部位の同定 Pin1と有糸分裂リンタンパク質の間の相互作用は、リガンドの特異的リン酸化
Ser／Thr残基と相互作用するホスホセリン結合モジュールとして作用するPin1 N
末端WWドメインを仲介する(実施例１−１０)。タウ中のPin1結合部位を同定する
ため、従前に同定されたタウリン酸化部位を覆うリン酸化および非リン酸化のペ
プチドを、ELISAによりPin1結合能についてアッセイした(Jicha, G.A. et al.,
J Neurochem 69: 2087-2095 (1997))。Pin1は、リン酸化スレオニン−２３１を
含むタウペプチド(pT２３１ タウペプチド)に特異的および高親和的な、解離定
数４０nMである(図４A)結合性を示した。結合は、Pin1と非リン酸化対応物との
間には観察されず(図４A)、これは、T２３１リン酸化にはPin1結合が絶対に必要
であることを示す。Pin1のN末端WWドメインが結合に応答するかどうか決定する
ために、変異体Pin1Y２３A(実施例６)を使用した。Pin1Y２３A変異体は、WWドメ
インで重要な意味をもつTyr−２３での単一Ala置換を含み、その結果、ホスホセ
リン結合活性を完全に喪失する(実施例６)。Pin1Y２３AとpT２３１ タウペプチ
ドとの間の結合は、検出されなかった(表５)。総合すると、これらの結果は、Pi
n1はタウ中のpT２３１残基を含むモチーフにWWドメインを介し特異的に結合する
ことを示す。
【０１４４】 T２３１(pT２３１−tau)のリン酸化は、AD脳において十分に文書で証明されて
おり、CP９を含む幾つかのmAbにより認識され得る(Illenberger, S. et al., Mo
l Biol Cell 9: 1495-1512 (1998); Vincent, I. et al., J Neurosci 17: 3588
-3598 (1997); Preuss, U. and Mandelkow, E.M. Eur J Cell Biol 76: 176-184
(1998); Jicha, G.A. et al., J Neurochem 69: 2087-2095 (1997); Billingsl
ey, M.L. and Kincaid, R.L. Biochem J 323: 577-591 (1997))。Pin1がpT２３
１−tauと相互作用するかどうか決定するため、GST−Pin1ビーズを用い、AD脳抽
出物またはPHFからタウを単離し、T２３１リン酸化はCP９を用い検出した。Pin1
ビーズにより単離したタウはCP９と強力に免疫反応した。これらの結果は、T２
３１におけるタウのリン酸化により、タウはPin1との結合を生じることを示し、
Pin1結合はpT２３１−tauの脱リン酸化を生じないことを示す。タウのT２３１は
、インビトロでCdc2キナーゼにより容易にリン酸化されるため(Vincent, I. et
al., J Cell Biol 132: 413-425 (1996): Vincent, I et al., J Neurosci 17:
3588-3598 (1997); Jicha, G.A. et al., J Neurochem 69: 2087-2095 (1997))
、実験を行い、インビトロでCdc2によりリン酸化されるタウにPin1が結合するか
どうか決定した。Pin1およびそのWWドメイン、しかしそのPPIaseドメインではな
い、は、Cdc2リン酸化タウに結合した。そのため、Pin1は、WWドメインを介しpT
２３１−tauに結合する。これらのデータは、Cdc2が異常にアップレギュレート
されるAD脳のPHFにおける、Pin1の、有糸分裂的にリン酸化されたタウへの結合
および隔離と一致する。
【０１４５】 タウによる微小管への結合を促進するタウとのPin1相互作用 Pin1とリン酸化タウとの間の高親和性相互作用は、タウの生物学的活性に影響
し得る。Cdc2を含む多くのプロテインキナーゼによるリン酸化では、タウは、正
確な機構は十分には理解されていないが、微小管(MT)との結合能およびMTアセン
ブリの促進能を喪失する(Bramblett, G.T. et al., Neuron 10: 1089-1099 (199
3); Iqbal, K. et al., FEBS Lett. 349: 104-108 (1994); Yoshida, H. and Ih
ara, Y. J Neurochem 61: 1183-1186 (1993); Alonso, A.C. et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 91: 5562-5566(1994); Busciglio, J et al., Neuron 14: 8
79-888 (1995))。Pin1がリン酸化タウによるMTへの結合能を回復するかどうかを
決定するため、リン酸化タウは、精製Cdc2を使用して産生し(Vincent, I. et al
., J Cell Biol 132: 413-425 (1996); Vincent, I. et al., J Neurosci 17: 3
588-3598 (1997))、Pin1存在下または非存在下でTaxol−安定化MTへの結合能を
評価した。Cdc2によるタウのリン酸化がタウのMTへの結合を防止し、その一方、
結合は、Pin1とのインキュベーションにより回復した。Pin1は、タウ結合MTの画
分中で検出され、Pin1とリン酸化タウとの間の相互作用を確認した。これらのデ
ータは、Pin1がリン酸化タウと結合し、MT結合能を回復することを示す。
【０１４６】 リン酸化タウのMTアセンブリ促進能におけるPin1の効果は、光散乱アッセイ(B
ramblett, G.T. et al., Neuron 10: 1089-1099 (1993); Alonso, A.C. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5562-5566 (1994); Busciglio, J. et al.,
Neuron 14: 879-888 (1995))を使用し決定した。端的には、MTは、ウシチューブ
リン(Cytoskeleton, Inc)を精製したホスホセルロースからアセンブリし、Taxol
で安定化した。非リン酸化またはCdc2リン酸化組換え体タウ(0.1mg/ml)を、MTを
加える前に３５℃で５分間、Pin1(0.1mg/ml)と共にインキュベーションした。結
合タウを、２５℃で２０分間、遠心分離(50,000×g)により単離し、その後、CP2
7およびPin1抗体を使用し免疫ブロッティング分析した。タウのMTアセンブリ促
進能を、十分に確立された光散乱アッセイを使用し決定した。端的には、MTのア
センブリは、８０mM PIPES、pH６.８、１mM EGTA、１mM MgCl２、１mM GTP、２
０％グリセロール中、３５℃で２分間、タウと共に、またはタウなしで、チュー
ブリン(2mg/ml)をインキュベーションすることにより開始した。次いで当該混合
物を１００μlのキュベットに移し、MTアセンブリ率を、室温、３５０nmで濁度
増加を用いモニターした。Pin1の効果を試験するため、Pin1またはその変異体(0
.05mg/ml)を、MTアセンブリアッセイ前に３５℃で５分間、タウまたはCdc2リン
酸化タウ(0.05mg/ml)でプレインキュベーションした。各実験は少なくとも３度
行い、同様の結果が観察された。GST−Pin1またはHis−Pin1を用いた結果は同様
であった。これは、N末端タグは、アッセイされるMTアセンブリには影響がない
ことを示す。
【０１４７】 濁度変化率は、タウ非存在下では、最小となったが、組換え体タウを混合物に
加えると劇的に増加した(図５A)。しかし、増加率は、タウがCdc2によりリン酸
化されるならば、実質的に消失した。これらの結果は、Cdc2によるタウのリン酸
化がMTアセンブリ促進能を阻害することを示す。Pin1は、非リン酸化タウのMTア
センブリ能に影響を与えないけれども、Pin1は、Cdc2リン酸化タウのMTアセンブ
リ促進能を回復した(図５B)。対照的に、Pin1Y２３A変異体は、リン酸化タウの
効果を促進する微小管アセンブリに全く効果がなく、これは、相互作用が、リン
酸化タウの機能を調節するためにPin1に必須であることを示す。Pin1存在下でリ
ン酸化タウにより誘導されたMTアセンブリ率は、組換え体タウにより誘導された
ものよりも僅かに高く、これは、従前の研究で、ある程度のタウリン酸化がチュ
ーブリンアセンブリ促進活性を最大とするのに必要である(Iqbal, K. et al., F
EBS Lett. 349: 104-108 (1994); de Ancos, J.G. et al., J Biol Chem 268: 7
976-7982 (1993))ことが示されたことと一致する。そのため、そのPin1は、リン
酸化タウに結合するばかりでなく、その生物学的活性をもまた機能的に回復する
。
【０１４８】 タウタンパク質は、タンパク質および他の分子を細胞を通して輸送する機能を
有するニューロンの内部微小管構造を通常安定化する(Lee, V.M. Curr Opin Neu
robiol 5: 663-663 (1995); Mandelkow, E. et al., Neurobiol Aging 16: 347-
354 (1995); Kosik, K.S. et al., Ann N Y Acad Sci 777: 114-120 (1996); Sp
illantini, M.G. and Goedert, M. Trends Neurosci 21: 428-433 (1998); Iqba
l, K. et al., J Neural Transm Suppl 53: 169-180 (1998))。神経機能に対す
るタウの重要性は、タウ中の変異が前頭側頭痴呆(FTDP−１７)の遺伝型の原因と
なるという最近の発見により示された(Clark, L.N. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 95: 13103-13107 (1998); Spillantini, M.G. and Goedert, M. Tre
nds Neurosci 21: 428-433 (1998); Hutton, M. et al., Nature 393: 702-705
(1998); Poorkaj, P. et al., Ann Neurol 43: 815-825 (1998))。FTDP−１７脳
の病変の徴候(signature)は、AD患者の脳の場合と同様、高リン酸化タウからな
る凝集である(Spillantini, M.G. et al., Brain Pathol 8: 387-402 (1998); R
eed, L.A. et al., J Neuropathol Exp Neurol 57: 588-601 (1998))。特定のFT
DP−１７変異はまた、タウのMT結合能およびMTアセンブリ促進能を阻害し(Hong,
M. et al., Science 282: 1914-1917 (1998); Hasegawa, M. et al., FEBS Let
t. 437: 207-210 (1998))、これは、タウとMTとの相互作用がニューロンの通常
機能に重要であることを示唆する。更にまた、FTDP−１７における老人斑および
レビ小体の欠失(Spillantini, M.G. et al., Brain Pathol 8: 387-402 (1998);
Reed, L.A. et al., J Neuropathol Exp Neurol 57: 588-601 (1998))は、ADの
タウの病状は疾患過程の単なる二次的効果ではなく、むしろ直接ニューロン喪失
を生じ得ることを示唆する。
【０１４９】 通常の成人の脳の殆どのニューロンは、分裂終了であり、有糸分裂キナーゼ活
性を喪失しており(Rakie, P. Ann. NY. Acad. Sci. 457: 193-211 (1985); Nagy
, Z. et al., Neuroscience 87: 731-739 (1998)、幾つかの研究では、有糸分裂
がAD脳のニューロンで異常に活性化されていることが示された(Vincent, I. et
al., J Cell Biol 132: 413-425 (1996); Vincent, I. et al., J Neurosci 17:
3588-3598 (1997); Nagy, Z. et al., Acta Neuropathol 94: 6-15 (1997); Na
gy, Z. et al., Acta Neuropathol (Berl) 93: 294-300 (1997))。ホスホエピト
ープの同様のパターンが、有糸分裂細胞およびADニューロンで観察され、有糸分
裂ホスホエピトープは対合ヘリックスフィラメント前に現われる(Illenberger,
S. et al., Mol Biol Cell 9: 1495-1512 (1998); Vincent, I. et al., J Cell
Biol 132: 413-425 (1996); Vincent, I. et al., J Neurosci 17: 3588-3598
(1997); Kondratick, C.M. and Vandre, D.D. J Neurochem 67: 2405-2416 (199
6); Vincent, I. et al., Neurobiol Aging 19: 287-296 (1998); Preuss, U. a
nd Mandelkow, E.M. Eur J Cell Biol 76: 176-184 (1998))。そのため、ニュー
ロンの有糸分裂の異常な活性化が、タウの高リン酸化およびPHFの形成に寄与し
得ることが提唱される(Nagy, Z. et al., Neuroscience 87: 731-739 (1998))。
この仮説は、さらに、必須有糸分裂レギュレーターPin1が有糸分裂細胞およびAD
脳中に存在するタウの通常のリン酸化モチーフに結合することが示された上記の
データによっても支持される。
【０１５０】 Pin1は、リン酸化タウのMT結合能およびMTアセンブリ促進能を回復し得る。こ
の結合は、脱リン酸化なしにリン酸化タウの生物学的活性化の回復の最初の例を
提供する。Pin1は、リン酸化Ser／Thr−Proモチーフに結合し得、そしてN末端お
よびC末端ドメインをそれぞれ使用してリン酸化Ser／Thr−Proペプチド結合を異
性化し得るため、Pin1がリン酸化Ser／Thr−Proモチーフの構造を変えることに
よりタウ機能を調節することに関係し得る。
【０１５１】 Pin1は、有糸分裂への移行を阻害し、Cdc25の活性化を直接阻害し(Lu, K.P. e
t al., Nature 380: 544-547 (1996); Shen, M. et al., Genes Dev 12: 706-72
0 (1998))、阻害性リン酸をCdc2から取り除く鍵の有糸分裂誘導性ホスファター
ゼを阻害する(Nurse, P. Cell 79: 547-550 (1994), King, R.W. et al., Cell
79: 563-571 (1994))。そのため、Pin1は、ニューロンにおける有糸分裂の異常
な活性化を防止し、リンタンパク質がPro指示性キナーゼ(Pro-directed kinase)
の一時的なおよび異常な活性化によりリン酸化される場合、タウのようなリンタ
ンパク質の機能を制御する。しかし、有糸分裂の長期間の活性化および持続され
た活性化は、ADの発生の間に見られるようなPin1に結合しPin1を隔離する、タウ
の継続的な高リン酸化を生じる。これは、少なくとも２つの可能性ある結果を生
ずる。第一に、タウの高リン酸化は、PHFが外来性Pin1のための特別の結合部位
を有しているという発見により示唆されるように、利用可能なPin1の能力よりも
高い結合部位を作成し得る。この場合、高リン酸化タウは、MTに結合することが
できず、その後にPHFを形成し、ニューロンの通常機能に影響を与える(Lee, V.M
. Curr Opin Neurobiol 5: 663-668 (1995); Mandelkow, E. et al., Neurobiol
Aging 16: 347-354 (1995); Kosik, K.S. et al., Ann N Y Acad Sci 777:114-
120 (1996), Spillantini, M.G. and Goedert, M. Trends Neurosci 21: 428-43
3 (1998); Iqbal, K. et al., J Neural Transm Suppl 53: 169-180 (1998))。
同時に、Pin1の減少は、有糸分裂の停止およびアポトーシスを誘導するため(Lu,
K.P. et al., Nature 380: 544-547 (1996))、PHF自身に対するPin1の隔離はま
た、ニューロンに有害な影響を有する。そのため、Pin1の減少およびPHFの形成
の両方が、ADにおけるニューロン喪失に寄与し得る。高リン酸化タウの凝集がま
た、FTDP−１７のような幾つか他のニューロン変成疾患の通常の神経病理学的特
徴であるため(Spillantini, M.G. et al., Brain Pathol 8; 387-402 (1998); R
eed, L.A. et al., J Neuropathol Exp Neurol 57: 588-601 (1998))、Pin1がこ
れらの疾患に含まれている可能性がある。そのため、Pin1は、遺伝子治療に利用
する適用用の標的となり得る。Pin1、そのWWドメインまたはWWドメイン擬態の適
用は、細胞死の発生(アポトーシス、ネクローシス)からニューロンを保護および
予防できるか、疾患状態のニューロン機能を回復できる(例えば、アルツハイマ
ー、皮質変性、筋緊張性ジストロフィー)。
【０１５２】 均等物 本発明は、好ましい実施態様に関し特に示され述べられている一方、形式およ
び詳細における種々の変化が添付の請求項に定義の本発明の精神および範囲から
出発することなく形成されることは、当業者に理解されることであろう。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Pin1 WWドメインのリンタンパク質(pSer)への、リンペプチドに
よるが、しかし非リン酸化(Ser)またはプロリンリッチ(Pro)ペプチドによるもの
ではない結合の競合のグラフ的提示である。
【図２】 選択WWドメインのアミノ酸配列アラインメントである。Pin1／ヒ
ト(配列番号１)；Ess1/S.c.(配列番号２)；Nedd4/マウス(配列番号３)；Dmd/ヒ
ト(配列番号４)；FbpII/マウス(配列番号５)；FE65/ラット(配列番号６)およびY
ap/マウス８配列番号７)。頭部および底部の線は、そのままのPin1のX線構造要
素、および単離YAP WWドメインにおけるNMR構造要素を各々示す。黒色囲中の白
文字は、変異がリンタンパク質との相互作用に影響するPin1WWドメインにおける
残基を定義する。白色囲中の黒文字は、変異が検出可能に影響しない残基を定義
する。配列上の数はヒトPin1配列を参照する。
【図３】 YEPベクターにおいてPin1またはその変異cDNAで置換された、十
分に機能化されたPTF１ゲノムフラグメントを記載する。HAタグをN末端に添加し
、タンパク質発現を検出した。
【図４】 図４Aは、Pin1抗体(Pin1 Ab)を使用した酵素結合免疫収着検定法
により検出したPin1のタウペプチドへの結合親和性のグラフ的提示である。図４
Bは、Pin1とリン酸化(pT231)または非リン酸化(T231)タウペプチドの結合親和性
のグラフ的提示である。
【図５】 図５Aは、タウ誘導チューブリン結合に影響するPin1の無能のグ
ラフ的提示である。図５Bは、リン酸化タウ(pTau)の、Pin1Y２３A変異体存在下
ではなく、Pin1存在下での、微小管結合の能力のグラフ的提示である。
【図６】 ６番目のアミノ酸から始まるPin1のWWドメイン／ヒト(配列番号
３３)；ESS1/9C(配列番号３４)；Yap/ヒト(配列番号３５)；Nedd4/マウス(配列
番号３６)；RSPS/9C(配列番号３７)；Dmd/ヒト(配列番号３８)；FE65/ラット(配
列番号３９)およびコンセンサス(配列番号４２)のアミノ酸配列を示す。
【図７】 リン酸化リガンドの調節ドメインとの相互作用による、タンパク
質−タンパク質相互作用のWWドメイン調節を記載する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＺＮＡＥ (72)発明者 シャオ・ジェン・ジョウ アメリカ合衆国02459マサチューセッツ州 ニュートン、メイプルウッド・アベニュー 68番 Ｆターム(参考） 2G045 CB01 DA36 FB01 FB03 FB07 JA01 4B065 AA90X AA91X AA93X BB19 BC50 CA44 4C084 AA17 ZA012 ZA162 4H045 AA30 CA40 EA20

Claims (46)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 WWドメイン含有ポリペプチドのリン酸化リガンドへの結合を
    調節することを含む、タンパク質−タンパク質相互作用のメディエートする方法
    。
  2. 【請求項２】 WWドメイン含有ポリペプチドがPin1、NEDD4、YAP、FE65、フ
    ォーミン結合タンパク質、ジストロフィン、ウトロピン、Ess1p/Ptflp、Rsp5、P
    ub1、Dodo、Msb1、ORF1、YKB2、DP71、C38D4.5、P9659.21、Yo61、Yfx1、ZK1248
    .15、KO15c11、CD45AP、FBP11、FBP21、FBP23、FBP28およびFBP30からなる群か
    ら選択される、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 リガンドがNIMA、Cdc25C、Cdc27、Plk1、Myt1、Rab4、タウ
    タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、Weel、Mos、Sox3、Xbr-lb、MP75(E-
    MAP-115)、MP110(Cdc5)、MP68およびMP30からなる群から選択される、請求項１
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 WWドメイン含有ポリペプチドのリガンドへの結合が阻害され
    る、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 阻害が、リン酸化リガンド模倣物がWWドメイン含有ポリペプ
    チドに結合し、それによりWWドメインポリペプチドのリガンドへの結合を阻害す
    る競合的阻害を含む、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 リン酸化リガンドがホスホセリンまたはホスホスレオニンペ
    プチド、またはペプチド模倣または小有機分子を含む、請求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】 リン酸化リガンドが配列番号８、１０、１３、２０および２
    ９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 阻害が、WWドメイン含有ポリペプチドのリン酸化、またはWW
    ドメイン含有ポリペプチドの脱リン酸化の阻害を含み、それによりWWドメイン含
    有ポリペプチドのリガンドへの結合を阻害する、請求項４記載の方法。
  9. 【請求項９】 WW含有ポリペプチドのリガンドへの結合が促進される、請求
    項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 促進がリガンドのリン酸化を含み、それによりWWドメイン
    含有ポリペプチドのリン酸化リガンドへの結合を促進する、請求項９記載の方法
    。
  11. 【請求項１１】 促進が、WWドメイン含有ポリペプチドの脱リン酸化または
    ドメイン含有ポリペプチドのリン酸化の阻害を含み、それによりWWドメイン含有
    ポリペプチドのリガンドへの結合を促進する、請求項９記載の方法。
  12. 【請求項１２】 Pin1 WWドメインの有糸分裂調節タンパク質への結合のメ
    ディエートを含む、細胞生育の調節法。
  13. 【請求項１３】 調節された細胞生育が細胞増殖である、請求項１２記載の
    方法。
  14. 【請求項１４】 Pin1 WWドメインが、リン酸化NIMAに結合し、それにより
    細胞増殖をもたらす、請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 Pin1 WWドメインを脱リン酸化し、それによりPin1 WWドメ
    インをリン酸化有糸分裂調節タンパク質に結合させ、細胞増殖をもたらす、請求
    項１３記載の方法。
  16. 【請求項１６】 細胞生育を阻害する、請求項１２記載の方法。
  17. 【請求項１７】 Pin1 WWドメインのリン酸化Cdc25Cへの結合を阻害し、そ
    れにより細胞生育を阻害する、請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 Pin1 WWドメインをリン酸化し、それによりPin1 WWドメイ
    ンはリン酸化有糸分裂調節タンパク質に結合せず、細胞死をもたらす、請求項１
    ６記載の方法。
  19. 【請求項１９】 Pin1 WWドメインのリン酸化リガンドへの結合の阻害を含
    む、Pin1プロリル−ペプチジルcis-transイソメラーゼ活性の阻害法。
  20. 【請求項２０】 Pin1 WWドメインをリン酸化し、それによりWWドメインの
    リン酸化リガンドへの結合が阻害される、請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 配列番号３３のSer16がリン酸化される、請求項２０記載
    の方法。
  22. 【請求項２２】 NEDD4 WWドメインのリン酸化リガンドへの結合のメディエ
    ートを含む、タンパク質分解の調節法。
  23. 【請求項２３】 NEDD4 WWドメインのホスホセリンまたはホスホスレオニン
    リガンドへの結合の阻害を含み、それによりユビキチンリガーゼ活性が阻害され
    る、タンパク質分解が阻害されている請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ジストロフィンのWWドメインとリン酸化リガンドの相互作
    用の調節法。
  25. 【請求項２５】 WWドメイン含有タンパク質との間の相互作用の調節、相互
    作用およびリン酸化リガンドの調節を含む、哺乳類における神経退行性疾患の調
    節法。
  26. 【請求項２６】 リン酸化リガンドがタウタンパク質およびアミロイド前駆
    体タンパク質を含む群から選択される、請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 Pin1 WWドメインのリン酸化タウへの結合をメディエート
    することを含む、アルツハイマー病におけるタウの機能の調節法。
  28. 【請求項２８】 Pin1 WWのリン酸化スレオニン２３１タウへの結合の促進
    を含み、それによりリン酸化タウが微小管に結合し、微小管結合をもたらす、請
    求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 a)WWドメイン含有ポリペプチドを１個以上の試験物質と接
    触させる、 b)試験物質とWWドメイン含有ポリペプチドを相互作用に適当な条件下に維持する
    、そして c)試験物質をWWドメイン含有ポリペプチドの間の相互作用を測定する、 段階を含み、相互作用が、試験物質がWWドメイン含有ポリペプチドとリガンドの
    間の相互作用の調節をすることを示すものである、WWドメイン含有ポリペプチド
    とリン酸化リガンドの相互作用を調節する物質の同定法。
  30. 【請求項３０】 WWドメイン含有ポリペプチドがPin1、NEDD4、YAP、FE65、
    フォーミン結合タンパク質、ジストロフィン、ウトロピン、Ess1p/Ptflp、Rsp5
    、Pub1、Dodo、Msb1、ORF1、YKB2、DP71、C38D4.5、P9659.21、Yo61、Yfx1、ZK1
    248.15、KO15c11、CD45AP、FBP11、FBP21、FBP23、FBP28およびFBP30からなる群
    から選択される、請求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 リガンドがタウタンパク質、Cdc25C、Cdc27、Plk1、NIMA
    、Myt1、Rab4、アミロイド前駆体タンパク質、Weel、Mos、Sox3、Xbr-lb、MP75(
    E-MAP-115)、MP110(Cdc5)、MP68およびMP30からなる群から選択される、請求項
    ２９記載の方法。
  32. 【請求項３２】 物質がWWドメインとリガンドの間の相互作用を促進する、
    請求項２９記載の方法。
  33. 【請求項３３】 物質がWWドメインとリガンドの間の相互作用を阻害する、
    請求項２９記載の方法。
  34. 【請求項３４】 請求項２９の方法により同定された物質。
  35. 【請求項３５】 a)WWドメイン含有ポリペプチドと１個以上の試験物質を接
    触させ、それにより組合わせを作る、 b)段階a)の組合わせをリガンドとWWドメインの相互作用に適した条件下に維持す
    る； c)段階b)における組合わせの相互作用の量を測定する；そして d)段階c)の相互作用の量と、リガンドとWWドメインの間の相互作用に適した条件
    下で試験物質の非存在下での相互作用の量と比較する 段階を含む、WWドメイン含有ポリペプチドとリン酸化されているリガンドの相互
    作用を調節する物質の同定法。
  36. 【請求項３６】 WWドメインが、Pin1、NEDD4、YAP、FE65、フォーミン結合
    タンパク質、ジストロフィン、ウトロピン、Ess1p/Ptflp、Rsp5、Pub1、Dodo、M
    sb1、ORF1、YKB2、DP71、C38D4.5、P9659.21、Yo61、Yfx1、ZK1248.15、KO15c11
    、CD45AP、FBP11、FBP21、FBP23、FBP28およびFBP30WWドメインからなる群から
    選択されるWWドメインである、請求項３５記載の方法。
  37. 【請求項３７】 リガンドがタウタンパク質、Cdc25C、Cdc27、Plk1、NIMA
    、Myt1、Rab4、アミロイド前駆体タンパク質、Weel、Mos、Sox3、Xbr-lb、MP75(
    E-MAP-115)、MP110(Cdc5)、MP68およびMP30からなる群から選択される、請求項
    ３５記載の方法。
  38. 【請求項３８】 請求項３５の方法により同定された物質。
  39. 【請求項３９】 アミノ酸が２３位のチロシン、３４位のトリプトファン、
    １４位のアルギニン、１６位のセリン、１８位のセリンからなる群から選択され
    るものであるアミノ酸の修飾を含む、変異Pin1 WWドメイン。
  40. 【請求項４０】 修飾アミノ酸がアラニン、グルタミン酸またはフェニルア
    ラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基による置換を含む、請求項３９記
    載の変異体。
  41. 【請求項４１】 a)医薬とWWドメイン含有ポリペプチドまたはそのフラグメ
    ントを、医薬／WWドメイン複合体の形成に適した条件下で合わせる；そして b)段階a)の医薬／WWドメイン複合体を哺乳類に投与し、医薬／WWドメイン複合体
    とリン酸化リガンドが相互作用し、それにより状態を軽減する 段階を含む、WWドメイン含有ポリペプチドのリガンドであるリン酸化リガンドの
    変化によりもたらされる状態である、哺乳類の状態を処置するための医薬の送達
    法。
  42. 【請求項４２】 a)WWドメインと相互作用する医薬を提供する； b)個体に医薬を投与し、医薬がWWドメインと結合し、それによりWWドメインとリ
    ン酸化リガンドの間の相互作用を調節する 段階を含む、個体におけるWWドメイン含有タンパク質とリン酸化リガンドの間の
    相互作用の調節法。
  43. 【請求項４３】 WWドメイン含有ペプチドとリン酸化リガンドの調節ドメイ
    ンとの結合を調節することを含む、タンパク質−タンパク質相互作用の調製法。
  44. 【請求項４４】 WWドメイン含有ポリペプチドとリン酸化リガンドの調節ド
    メインの結合をメディエートすることを含む、細胞生育の調節法。
  45. 【請求項４５】 WWドメイン含有ポリペプチドがPin1である、請求項４４記
    載の方法。
  46. 【請求項４６】 Pin1 WWドメインの、リン酸化リガンド調節ドメインへの
    結合の阻害を含む、Pin1プロリル−ペプチジルcis-transイソメラーゼ活性の阻
    害法。
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