WO2006054600A1 - 新規タンパク質及びそれを利用したポリグルタミン病等の神経変性疾患の予防・治療薬 - Google Patents

新規タンパク質及びそれを利用したポリグルタミン病等の神経変性疾患の予防・治療薬 Download PDF

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Hitoshi Okazawa
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Tokyo Medical And Dental University
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • New protein and its prevention / treatment drug for neurodegenerative diseases such as polyglutamine disease
  • the present invention relates to a novel protein and a gene encoding the same. More details
  • Transcriptional dysfunction is an important pathological element in neurodegenerative diseases such as polyglutamine disease.
  • the present inventor has already shown that, in polyglutamine disease, the entire gene expression, which is not a decrease in the expression of a few genes, is damaged (see Non-Patent Document 1).
  • many transcription factors are co-localized or interact with polymutamine disease mutant proteins.
  • the general level of transcription, the overall function of transcription factors, is down-regulated by mutant polyglutamine proteins.
  • One of the major challenges in polyglutamine disease is to elucidate the relationship between transcriptional dysfunction and neuronal cell death. However, it is not clear whether the inhibition of transcription function causes neuronal cell death. Nor is it known how neuronal cells die if transcription is severely inhibited.
  • Non-Patent Document 1 BBRC, vol. 313, pl 10-116 (2004).
  • transcriptional disorders in cells are considered to be one of the major molecular pathologies. But whether a transcriptional disorder actually causes neuronal cell death and what form of cell death is caused! It ’s still known to me.
  • the present invention clarifies the relationship between transcriptional dysfunction and neuronal cell death, and also provides a novel protein that can be used as a preventive / therapeutic agent in neurodegenerative diseases such as polyglutamine disease.
  • the purpose is to provide.
  • the present inventor first analyzed nerve cells on which ⁇ -amatin (AMA) that specifically inhibits RNA polymerase II was allowed to act.
  • AMA ⁇ -amatin
  • amatine causes very slow neuronal cell death. It took more than 5 days for half of the neurons to die.
  • the morphological characteristics of these dying cells were distinguished from apoptosis or necrosis as analyzed by electron microscopy. Moreover, DNA ladder by electrophoresis was not observed.
  • dying neurons had a cytoplasmic vacuole separate from the autophagonome labeled with pEGFP-LC-3.
  • the present invention also has the following constitutional powers (1) to (6).
  • a transformant comprising a recombinant vector containing the gene according to (2) above.
  • Prophylactic / therapeutic agent for neurodegenerative diseases such as polyglutamine disease, spinocerebellar degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, Parkinson's disease and the like comprising the protein according to (1) above
  • this novel YAP isoform suppresses neuronal cell death, it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for neurodegenerative diseases such as polyglutamine disease.
  • the present inventor prepared a large number of siRNAs against RNA polymerase ⁇ ( ⁇ ) in order to clarify the relationship between transcription function and neuronal cell death.
  • ⁇ RNA polymerase ⁇
  • PolII repression was inadequate. So we used ⁇ -amatin, an effective inhibitor of ⁇ . This soot molecule can supplement PolII.
  • AMA AMA-treated Euron and Hela cells
  • AMA induces progressive cell death.
  • the trend was particularly prominent in primary cultures-Euron, where the cell half-life was 5 days or longer, but without AMA treatment-cell death was clearly earlier than Euron. It also showed AMA concentration dependence. This progression of neuronal death is much slower than the low-potassium-induced apoptosis of cerebellum-euron.
  • the first morphological change of HeLa cells began 6-12 hours after AMA was harvested, and cytoplasmic vacuoles were found near the nucleus. Similar vacuoles were also observed in cortex-euron at a very low rate but 2 days after AMA treatment. These vacuoles are not derived from mitochondria, Golgi apparatus, lysosomes, or endonoms from immunohistochemical analysis using antibodies specific to cell organelles. Also, EGFP-LC3, a phagonome marker protein, was not localized in the vacuole, so it was not an autophagosome.
  • the vacuole is an endoplasmic reticulum that has been swollen by ECFP-ER, which has a sequence that targets the ER (cell organelle) and a KDEL sequence that searches for ER at the end and end of the enhanced cyan fluorescent protein. Became clear. This suggests that AMA stresses ER.
  • a novel isoform of YAP was discovered by PCR cloning of RNA from cortex-euron and cerebellum-euron. This new isoform has 13nt, 25nt, and 61nt bases inserted!
  • the cDNA from cortex-euron was amplified by RT-PCR, subcloned, introduced into the pBluescript vector, and transformed E. coli cells were spread on a bacterial dish. Of the 14 colonies extracted from the bacterial dish, there were 10, 1 and 3 inserts of 13 nt, 25 nt and 61 nt, respectively.
  • the sequence of inserts is consistent with the genome sequence, and the sequence of intron junctions strictly follows the rules. In these three types of isoforms, a reading frame shift occurs due to the insertion of a base, and as a result, YAP originally has a transcription activation domain which is lacking.
  • RT-PCR examined which tissues express a novel isoform of YAP.
  • isoforms with 13 and 61 bases inserted were specifically expressed in comparative neurons. Only a faint band of insl3 was seen in the cerebral thread and tissue containing many glial cells and other cells other than neurons. ins61 was very specific for cortex-euron. The kidney showed a band larger than ins61. ins25 was not detected by RT-PCR.
  • a YAP isoform lacking a transcriptional activity domain may have the opposite effect on neuronal cell death.
  • the missing molecule had a dominant negative effect on cisplatin-induced apoptosis in MCF-7 cells.
  • the expression of the missing isoform from cDNA was confirmed in the cells.
  • siRNAs of p73 and YAP were added. As a result, OP was suppressed by these siRNAs in HeLa cells. This is OP also from YAP to p73 It is mediated by this cascade, supporting the hypothesis!
  • OP a novel prototype of cell death called OP was found that explains that neurodegeneration proceeds very slowly. It was also demonstrated that a novel YAP isoform lacking the transcriptional activity domain plays an important role in suppressing OP. In addition, microarray analysis revealed that similar molecules were altered in both apoptosis and OP. Thus, OP may share some molecular mechanisms with apoptosis. The two types of cell death may be the same if the forces caused by the different molecules specific to each cell death process are corrected.
  • novel YAP isoform described above can be used as a prophylactic / therapeutic agent for neurodegenerative diseases such as polyglutamine disease, and this leads to a new treatment method for neurodegenerative diseases.
  • the novel isoform lacking the transcriptional activity domain of YAP as described above is composed of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3.
  • a protein human and animal-derived proteins containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3, and synthetic protein strength can also be obtained.
  • Substantially identical means that the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3 has an amino acid sequence ability in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and has a dominant negative effect on the transcriptional activation factor YAP.
  • SEQ ID NO: 1 to It is preferable that the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 has a homology of about 90% or more, preferably about 95% or more.
  • the protein of the present invention may be any of carboxyl group, carboxylate, amide, or ester at the C-terminus.
  • the amino group of the amino acid residue at the N-terminus may be protected to formyl group, acetyl group, etc. It may be protected with a group. Further, it may be a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound, or a salt with a physiologically acceptable acid or base.
  • the protein of the present invention can also be produced by a known protein purification method for human cells or tissue. It can also be produced by culturing a transformant containing a gene encoding a protein. Moreover, you may manufacture according to the well-known peptide synthesis method. Examples of the synthesis method include a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method. That is, when the partial peptide or amino acid that can constitute the protein of the present invention is condensed and the product has a protective group, the target protein can be synthesized by removing the protective group.
  • the method can be carried out using a general method. That is, a gene encoding a target protein is ligated to a vector, and a host organism is transformed with the obtained expression vector to obtain a transformant. The transformant can be cultured under predetermined conditions and the target protein can be recovered.
  • any gene encoding the protein of the present invention (a novel isoform of YAP)
  • any gene containing a predetermined base sequence is applicable.
  • any of genomic DNA, cell-derived tissue cDNA, and synthetic DNA can be used.
  • the gene can be inserted into the vector by, for example, cleaving the base sequence of the purified gene with an appropriate restriction enzyme and inserting it into an appropriate vector DNA restriction enzyme site or multicloning site.
  • a method of linking can be used.
  • a promoter, a terminator, a ribosome binding sequence and the like may be incorporated into the expression vector.
  • Vectors include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, butterophage such as ⁇ phage, and retroviruses such as Moro-1 leukemia quinoles. Animal viruses such as Inoles, vaccinia virus or baculovirus can be used.
  • the target transformant can be obtained by transforming a host organism with the above expression vector.
  • the host organism is not particularly limited as long as it can express the gene of the present invention, for example, Escherichia bacterium such as Escherichia coli, Bacillus bacterium, yeast, animal cells, etc. Can be used.
  • Escherichia bacterium such as Escherichia coli
  • Bacillus bacterium Bacillus bacterium
  • yeast yeast
  • animal cells etc.
  • a transformation method a known method such as the calcium chloride method and electrovolution can be adopted, but the method is not limited to these methods.
  • the protein of the present invention can be produced by culturing the transformant. When recovering the protein, disrupt the cells if necessary, remove the cells by centrifugation, etc., and then use the general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation.
  • the target protein can be isolated and purified by gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination.
  • the protein of the present invention (a novel isoform of YAP) is used as a prophylactic / therapeutic agent for neurodegenerative diseases such as polyglutamine disease
  • its administration route is mainly by parenteral administration such as intravenous administration.
  • the drug can be prepared by appropriately using a pharmacologically acceptable carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of salt water and a glucose solution.
  • a pharmacologically acceptable carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of salt water and a glucose solution.
  • the ability to cross the blood-brain barrier may be a problem. If there is a problem with its permeability, a method of crossing the blood brain barrier by adding the TAT amino acid sequence of HIV can be appropriately employed.
  • the gene When a gene encoding a novel isoform is used as a prophylactic 'therapeutic agent, the gene should be incorporated into the expression vector so that the novel isoform is expressed in the target cell after administration.
  • a TAT sequence may be added so that the expressed protein can be introduced into nerve cells.
  • the vector into which the gene is incorporated may be encapsulated in an appropriate coat protein, liposome, virus particle, or the like. This makes it possible to send a gene specifically to the target cell or target tissue and express a new isoform of YAP. It is.
  • Akt is a serine-threonine kinase, also called protein kinase B (PKB), which phosphorylates and modifies YAP during the process of intracellular signaling. Therefore, phosphorylation of YAP creates a binding site with 14-3-3 protein, and inhibits dephosphorylation enzyme to suppress YAP degradation, thereby further enhancing the effect of suppressing neuronal cell death.
  • PKI protein kinase B
  • a drug that inhibits c-Abl or ATM that activates YAP, or a drug that inhibits p73 or p53 acting in combination with YAP may be used as a preventive or therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
  • E17 Cerebral cortex tissue isolated from Wistar rat fetal embryo and cerebellar tissue isolated from P7 Wistar rat neonatal force were scrutinized with a razor and gently mixed every 5 minutes for 20 minutes at 37 ° C for 0.25% trypsin (Gibco) -containing phosphate buffer (hereinafter referred to as PBS; pH 7.5). Subsequently, after stopping the reaction with DMEM containing 50% baby sera (hereinafter FBS), DNasel (Boehringer Mannheim) was added to a final concentration of 100 / zg / ml, and pipetting using a blue chip was performed. The tissue was separated more easily.
  • the cells were washed three times with PBS, fixed with 2.5% glutaraldehyde / 0.1M PB, and further fixed with 1% 0 sO / 0.1M PB for 2 hours. Dehydrate the fixed cells using an ethanol gradient,
  • Alexa fluor 488 (1: 1000 dilution; Molecular Probes) was visualized so that it could be detected by immunostaining by reacting as a secondary antibody at room temperature for 30 minutes.
  • Hela cells were transfected with pEGFP-LC3 or pEGFP-ER (BD Biosciences) using Superfect (Qiagen) according to the product manual.
  • RNA labeling and amplification were performed according to the manufacturer's manual.
  • oligo dT primer containing T7 promoter sequence and random hexamer (40 ° C, 4 ° C). was used to synthesize double-stranded cDNA containing ⁇ 7 promoter from 2 ⁇ g of total RNA using MMLV reverse transcriptase.
  • CRNA was synthesized from AMA-treated cortex-euron, AMA-treated cerebellum-euron, and cerebellum-euron treated with low potassium.
  • NA was labeled with Cy3 or Cy5.
  • the synthesized cRNA was precipitated with lithium chloride, washed with ethanol, and dissolved in nuclease-free / water. OD to check cRNA quality,
  • an in situ hybridization kit plus (Agilent technologies: 5184-3568) was used according to the product manual.
  • Cy3 and Cy5 labeled cRNA (1 ⁇ g each) were mixed and treated with fragmentation buffer at 60 ° C for 30 minutes.
  • the cRNA fragmented with Mouse Development Oligo Microarray (Agilent technologies: G4120A) containing 20,371 oligonucleotides of 60-base mouse cDNA was reacted at 60 ° C. for 17 hours.
  • the microarray after the reaction was washed twice and dried by blowing nitrogen gas (99.999%) using a filter-equipped air gun (Nihon mycrolis KK).
  • the fluorescence signal was detected with CRBIO lie (Hitachi software engineering Co., Ltd.), a microarray scanner. Data was analyzed using DNASIS array (Hitachi softwa reengineering Co., Ltd.), an analysis software. Control spots and spots with strong fluorescence due to unnatural signals were excluded from the data. After that, the signal intensity of each spot was normalized to all signal intensity. Scattering of standardized signal intensity In the figure, the fluorescence of Cy3 is plotted on the Y axis and the fluorescence of Cy5 is plotted on the X axis. The ratio of Cy3 fluorescence to Cy5 was calculated, and the genes that protruded with Cy3 / Cy5 of 2.0 or more and 0.5 or less were tabulated.
  • RT-PCR cloning of YAP is performed using RNA LA PCR Kit (AMV) (Takara) with two primers: F: 5, GG AATTCTATGGAGCCCGCGCAA-3 ', R: 5, -ACGCGTCGACCTATAACCACGTG AG-3.
  • AMV RNA LA PCR Kit
  • F 5 GG AATTCTATGGAGCCCGCGCAA-3 '
  • R 5, -ACGCGTCGACCTATAACCACGTG AG-3.
  • the PCR product cDNA was inserted into pBluescriptll SK + using EcoRI and Sail.
  • the base sequence is a primer using the sequence contained in cDNA synthesized with M13.
  • All cells on a culture dish are 62.5 mM Tris-HCL (pH 6.8), 2% (w / v) SDS, 2.5% (v / v) 2-mercaptoethanol, 5% (w / v) glycerin, Dissolved in 0.0025% (w / v) bromophenol blue.
  • the cell lysate was adjusted to 3.3 x 10 4 Hela cells per lane, 1.0 x 10 5 primary cultures-euron, electrophoresed on SDS-PAGE gel, and then polyvinylidene difluoride.
  • Adenovirus Expression Vector Kit (TAKARA SHUZO CO., LTD.) was used as an adenovirus vector lacking replication ability according to the product manual.
  • YAP cDNA was excised from pBSinsl3, pBSins25, and pBSins61 with EcoRI and Sail. Both ends of the cDNA fragment were blunted with Blunting high kit (Toyobo CO., LTD.), and then inserted into pAxCAwt cosmid (Takara) using Swal.
  • the purified cosmid was introduced into 293 cells together with adenovirus DNA by the calcium phosphate method, and the culture solution of dead cells was collected as a virus solution.
  • adenoviral vectors as AxCAinsl3, AxCAins25 and AxCAins61. These vectors were used to infect Hela cells and primary neurons at a multiplicity of infection (MOI) of 100. Also preliminarily Protein expression efficiency and adenovirus toxicity were examined by infecting primary cultures-Euron with EGFP-incorporated vectors and various MOI Motta vectors. More than 90% -Euron force 3 ⁇ 4GFP was expressed in MOI 100! /. The difference in the proportion of dead cells in uninfected-Euron and Motta-infected neurons was examined using trypan blue and was around 3% even with an MOI of 500 or more.
  • RNA extracted from primary culture-Euron was electrophoresed using MOPS / formaldehyde gel.
  • the separated RNA was transferred to Hybond-N (Pharmacia) and fixed by UV crosslinking (1 20,000 ⁇ J / cm 2 ).
  • the full-length cDNA of 61-base insert was excised from pBSins61, purified using gel, and labeled with [a32P] dCTP (Amersham) and random primer DNA labeling kit (Takara).
  • the probe labeled with 32P was reacted with a nylon membrane at 60 ° C and permeated.
  • the reacted membrane was washed twice with 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS at 50 ° C. for 20 minutes, and washed twice with O.lx SSC, 0.1% SDS at 60 ° C. for 20 minutes.
  • the film was exposed to an X-ray film at -80 ° C for an appropriate time.
  • SiRNA oligonucleotides were introduced into the cells using RNAiFect (QIAGEN) according to the product manual. In 6 wells, 2.5 ⁇ 10 4 cells were infected 24 hours later with 0.5 ⁇ g of each siRNA. 24 hours after infection, AMA was added to a final concentration of 10 g / ml. After 24 hours, cell death was performed.
  • the YAP and p73 siRNA sequences were the same as previously published.
  • novel protein of the present invention and a preventive or therapeutic agent for neurodegenerative diseases such as polyglutamine disease using the same are polyglutamine disease, spinocerebellar degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, Alheimer's disease, Parkinson It can be used for prevention and treatment of neurodegenerative diseases such as diseases.

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Abstract

　転写機能障害と神経細胞死との関係を明らかにすることにより得られる知見からポリグルタミン病の予防・治療薬となり得る新規タンパク質を提供することを目的とする。 　以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質からなる。 （ａ）配列番号１～配列番号３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ転写活性化因子YAPに対する優性ネガティブ効果を有するタンパク質。

Description

明 細 書
新規タンパク質及びそれを利用したポリグルタミン病等の神経変性疾患の 予防 ·治療薬
技術分野
[0001] 本発明は、新規タンパク質、及びそれをコードする遺伝子に関する。さらに詳しくは
、ポリグルタミン病等の神経変性疾患の予防'治療薬の技術分野に属する。
背景技術
[0002] 転写機能障害は、ポリグルタミン病等の神経変性疾患における重要な病理学的要 素である。本発明者は既にポリグルタミン病では少数遺伝子の発現低下ではなぐ遺 伝子発現全体が傷害されることを示してきた (非特許文献 1参照)。すなわち、多数の 転写因子は、ポリグルタミン病の変異タンパク質に共局在する、あるいは相互作用す ることが分力つている。転写因子の機能の総体である一般的な転写レベルは、変異 ポリグルタミンタンパクによってダウンレギュレートされる。ポリグルタミン病における主 要な課題の 1つは、転写機能障害と神経細胞死との関係を明らかにすることである。 しかし、転写機能の阻害が神経細胞死を引き起こす力否かは定かでない。また、転 写が著しく阻害された場合に、どのようにして神経細胞が死に至るかについても全く 分かっていない。
[0003] 非特許文献 1 : BBRC,vol.313,pl 10-116(2004).
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 上述のように、神経変性疾患、特にポリグルタミン病にぉ 、ては細胞における転写 障害が主要な分子病態の一つと考えられている。しかし、転写障害が実際に神経細 胞死を引き起こすのか否か、また、どのような形態の細胞死が引き起こされるのかに つ！ヽては未だ知られて ヽな 、。
そこで本発明は、上記従来の状況に鑑み、転写機能障害と神経細胞死との関係を 明らかにするとともに、得られる知見力もポリグルタミン病等の神経変性疾患における 予防 ·治療薬となり得る新規タンパク質を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0005] 上記課題を解決するため、本発明者は、まず RNAポリメラーゼ IIを特異的に阻害す る α -アマ-チン (AMA)を作用させた神経細胞の分析を行った。その結果、アマ-チ ンが極めて緩徐な神経細胞死を引き起こすことを発見した。神経細胞の半分が死に 至るまでの期間は 5日以上であった。この死にゆく細胞の形態学的特徴は、電子顕 微鏡で分析した結果、アポトーシス、またはネクローシスとは区別されるものであった 。また、電気泳動による DNAラダーは観察されな力つた。さらに、死にゆく神経細胞は 、 pEGFP-LC-3で標識されるオートファゴノームとは別の細胞質の液胞を有して 、た
[0006] そして、アポトーシスと、アマ-チンにより誘発される神経細胞死との遺伝子発現の 比較により、転写活性ィ匕因子 (コアクチベータ一）として知られる YAPの新規アイソフ オームの存在を見出した。新規ァイソフォームは、非典型的な神経細胞死の過程に おいて発現するものである。これらのァイソフォームは、転写活性ィ匕ドメインが欠如し ており、 P73及び YAPが仲介する MCF-7細胞のアポトーシスを抑制するものであった 。このことは、新規アイソフォームが細胞死に対する優性ネガティブ効果を有している ことを示している。 YAPァイソフォームを発現するアデノウイルスベクターもまた、 a -了 マ二チンによって誘発される神経細胞死を抑制した。つまり、転写抑制は、非典型的 かつ緩徐な神経細胞死を引き起こす力 その細胞死は、 YAPの新規アイソフォーム によって抑制できることが明らかになった。
[0007] この緩徐な神経細胞死の過程は、アポトーシス、ネクローシス、またはオートフアジ 一とはまったく別のものである。本発明者は、この新しい神経細胞死の形態を、ポリグ ルタミン病における神経変性のプロトタイプとして提案するとともに、これらの知見に 基づいて、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の（1)〜（6)の構成力もなる。
(1)以下の（a)又は (b)のタンパク質。
(a)配列番号 1〜配列番号 3の 、ずれかで表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質
(b)アミノ酸配列（a)において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加さ れたアミノ酸配列力 なり、かつ転写活性ィ匕因子 YAPに対する優性ネガティブ効果を 有するタンパク質。
(2)上記（1)記載のタンパク質をコードする遺伝子。
(3)上記（2)記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
(4)上記（2)記載の遺伝子を含有する組換えベクターを含む形質転換体。
(5)上記（1)記載のタンパク質を含むポリグルタミン病、脊髄小脳変性症、筋萎縮性 側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病等の神経変性疾患の予防'治療薬
(6)上記（1)記載のタンパク質を介する細胞内シグナル伝達を利用したポリダルタミ ン病、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病 等の神経変性疾患の予防 ·治療薬。
発明の効果
[0008] 本発明によれば、極めて緩徐に進行する神経細胞死の新 、形態 (オメガプロセス 、 OP)の存在が明らかにされるとともに、転写活性ィ匕ドメインが欠如した YAPの新規ァ イソフォームを見い出し、このアイソフォームが OPを抑制するのに重要な役割を果た すことが証明された。
この YAPの新規ァイソフォームは、神経細胞死を抑制するため、ポリグルタミン病等 の神経変性疾患の予防 ·治療薬として利用することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 以下、本発明について詳細に説明する。
本発明者は、転写機能と神経細胞死との関係を明らかにすべぐ初めに RNAポリメ ラーゼ Π (ΡοΙΠ)に対する多数の siRNAを作製した。しかし、類似のアプローチによって 基本的な転写機構を解明しょうとする最近の研究と同様に、 PolIIの抑制は不十分に 終わった。そこで我々は、 ΡοΙΠの有効な阻害剤である α -アマ-チンを利用した。この ΑΜΑ分子は PolIIを補足できる。
[0010] まず、 3つの異なる濃度の AMAを、ヒーラ（Hela)細胞、ラット胚（E15)の皮質-ユー ロンの初代培養、及びラットの小脳-ユーロンの初代培養の培地にカ卩えた。そして、 B rU摂取量の測定により AMAが皮質-ユーロン及び小脳-ユーロンにおいて転写を抑 制することを確認した。次に、 AMAで処理した-ユーロンおよびヒーラ（Hela)細胞の 生存率を算出し、 AMAが進行性の細胞死を誘発することを発見した。その傾向は特 に初代培養-ユーロンにおいて顕著であり、細胞の半減期は 5日以上であつたが、 A MA処理を行わない-ユーロンよりは明らかに早い細胞死であった。また、 AMAの濃 度依存性も示していた。この神経細胞死の進行は、小脳-ユーロンの低カリウム誘発 性アポトーシスよりもはるかに遅いものである。
[0011] ヒーラ（Hela)細胞の最初の形態変化は、 AMAをカ卩えた後 6〜12時間で始まり、核 近傍に細胞質の液胞が見られるようになった。類似の液胞は、ごく低い割合だが AM A処理後 2日間経過した皮質-ユーロンにおいても観察された。これらの液胞は、細 胞小器官に特異的な抗体を用いた免疫組織ィ匕学的な分析から、ミトコンドリア、ゴル ジ体、リソソーム、エンドノームに由来するものではない。また、ファゴノームのマーカ 一タンパク質である EGFP-LC3がその液胞に局在しなかったことから、オートファゴソ ームでもない。液胞は、強化シアン蛍光タンパク質の^末端と^末端に ER (細胞小 器官）を標的とするシークェンスと ERを検索する KDELシークェンスをそれぞれ有す る ECFP-ERによって、膨張した小胞体であることが明らかになった。これは AMAが E Rにストレスを与えることを示唆して 、る。
[0012] また、皮質-ユーロンとヒーラ (Hela)細胞の電子顕微鏡による観察によれば、染色 質の凝集、ミトコンドリアの拡大、細胞質の膨張等のアポトーシスゃネクローシスの特 徴は見られなかった。細胞系と 1次-ユーロンのゲノム DNA分析でも、 AMA処理によ つて DNAラダーの形成は見られなかった。これらの実験結果から、 AMAがアポトーシ ス、ネクローシス、またはオートファジーとは全く別の形態の、緩徐な神経細胞死を引 き起こすことが明らかになった。本発明者はこの新しいタイプの神経細胞死を「オメガ プロセス（OP)」と名づけた。
[0013] 次に、 OP (オメガプロセス）の分子機構を理解するため、我々はマイクロアレイ分析 を行った。 AMAにより誘発された皮質ニューロン及び小脳ニューロンの細胞死と、小 脳-ユーロンの低カリウム誘発性アポトーシスとの遺伝子発現を比較した。実験は 2 回ずつ行い、その結果、アポトーシス及び OPの両方において発現が変化する 8個の 遺伝子と、 OPにおいて特異的に発現が変化する 11個の遺伝子を見出した。後者は 、 p73が仲介するアポトーシスにおける中心的存在として知られる転写活性ィ匕因子 (コ ァクチべ一ター）の YAPを含んでいた。ノーザンブロット法により、 AMAが転写段階に おいて YAPの発現をダウンレギュレートすることを確認した。
[0014] さらに、皮質-ユーロン及び小脳-ユーロンからの RNAの PCRクロー-ングによって 、 YAPの新規アイソフォームを発見した。この新規アイソフォームは 13nt、 25nt、及び 61ntの塩基が挿入されて!、る。 RT-PCRによって皮質-ユーロンからの cDNAを増幅 し、サブクロー-ングして pBluescriptベクターに導入し、形質転換した E.coli細胞を細 菌皿上に広げた。細菌皿から抽出された 14コロニーの中で、 13nt、 25nt、 61nt挿入物 はそれぞれ 10、 1、 3個であった。揷入物のシークェンスはゲノムシークェンスと一致し 、イントロンの連結部位のシークェンスも厳密にその規則に従っている。それら 3種類 のァイソフォームは、塩基の挿入によりリーディングフレームシフトが起こっており、結 果的に YAPが本来有して 、る転写活性ィ匕ドメインが欠損して 、る。
[0015] 次に、 RT-PCRによりどの組織が YAPの新規アイソフォームを発現するのか調べた。
興味深いことに、 13及び 61塩基が挿入されたァイソフォーム（insl3及び ins61)は、比 較的ニューロンにお 、て特異的に発現した。多数のグリア細胞と神経細胞以外の他 の細胞を含む脳糸且織では、 insl3のかすかなバンドが見られるのみであった。 ins61は 皮質-ユーロンに対して非常に特異的であった。腎臓は ins61より大きいバンドを示し た。 ins25は、 RT-PCRにより検出されなかった。
[0016] 本発明者は、転写活性ィ匕ドメインの欠如した YAPァイソフォームが神経細胞死にお いて逆の効果を与えるのではないかと推測した。予想通り、欠如した分子は、 MCF-7 細胞のシスブラチン誘発性アポトーシスにぉ ヽて優性ネガティブ効果を示した。また 同時に、細胞内で cDNAからの欠如したァイソフォームの発現を確認した。さらに、新 規ァイソフォームが OPを抑制する力否かを調べた。 AMAをカ卩えて力 4日目以降で は、皮質-ユーロン及び小脳-ユーロンの両方において、新規アイソフォームの発現 により細胞死の速度は低下して ヽた。
[0017] p73と YAPが、 MCF-7細胞のシスプラチン誘発性アポトーシスのように、 OPも仲介す るか否かを調べるため、 p73及び YAPの siRNAを加えた。その結果、ヒーラ（Hela)細胞 においてこれらの siRNAによって OPが抑制された。これは、 OPもまた YAPから p73へ のカスケードによって仲介されると 、う仮説を裏付けて!/、る。
[0018] 最後に、 OPの過程における YAPァイソフォームの経時変化をウェスタンブロット法で 観察した。興味深いことに、 rYAP(=hYAP2)は実験後 3日で減少し始めたにもかかわ らず、塩基が挿入された新規アイソフォームの量は皮質-ユーロン内にぉ 、て比較 的長期間安定して 、た。 YAPの新規アイソフォームの量はヒーラ（Hela)細胞内よりも 皮質-ユーロン内にぉ ヽて多力つた。同様の変化は小脳-ユーロン内にぉ 、ても観 察された。これらのデータをまとめると、ニューロンに特異的な YAPの新規アイソフォ ームは、 YAPに対する優性ネガティブ効果によって、神経細胞死を抑制することを示 している。神経変性における主要な疑問の 1つは、神経細胞死が遅い速度で進行す ることであった力 優性ネガティブな新規アイソフォームが-ユーロンに特異的に発現 するという発見は、この疑問を見事に説明している。
[0019] 以上説明のように、神経変性が極めて遅く進行することを説明する、 OPという細胞 死の新規なプロトタイプを見出した。また、転写活性ィ匕ドメインが欠如した YAPの新規 ァイソフォームが、 OPを抑制するのに重要な役割を果たすことが証明された。さらに、 マイクロアレイ分析により、類似の分子がアポトーシスと OPの両方で変化していること が分かった。従って、 OPがいくつかの分子メカニズムをアポトーシスと一部共有して いる可能性がある。この 2つのタイプの細胞死は、各細胞死プロセスに特異的な異な る分子によって引き起こされる力 元を正せば同じものである可能性がある。
したがって、上記の YAPの新規ァイソフォームは、ポリグルタミン病等の神経変性疾 患の予防 ·治療薬として利用可能であり、これにより神経変性疾患に対する新しい治 療方法が導かれることとなる。
[0020] 上記のような、 YAPの転写活性ィ匕ドメインが欠如した新規アイソフォームは、配列番 号 1〜配列番号 3のいずれかに示すアミノ酸配列から構成される。このようなタンパク 質としては、配列番号 1〜配列番号 3と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有するヒト及び動物由来のタンパク質や、合成タンパク質力も得ることができる。 実質的に同一とは、配列番号 1〜配列番号 3のアミノ酸配列において 1もしくは数個 のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ転写活性化因 子 YAPに対する優性ネガティブ効果を有するタンパク質をいう。また、配列番号 1〜 配列番号 3で表されるアミノ酸配列と約 90%以上、好ましくは約 95%以上の相同性を有 していることが好ましい。
[0021] また、本発明のタンパク質は、 C末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミド又 はエステルのいずれであっても良ぐ N末端のアミノ酸残基のァミノ基がホルミル基、 ァセチル基等の保護基で保護されていても良い。さらに、糖鎖が結合したいわゆる糖 タンパク質等の複合タンパク質や、生理学的に許容される酸もしくは塩基との塩であ つても良い。
[0022] 本発明のタンパク質は、ヒトゃ動物の細胞又は組織力も公知のタンパク質の精製方 法によって製造することができる。また、タンパク質をコードする遺伝子を含有する形 質転換体を培養することによつても製造することができる。また、公知のペプチド合成 法に準じて製造しても良い。合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法を挙 げることができる。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくは アミノ酸を縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目 的のタンパク質を合成することができる。
[0023] 形質転換体力 製造する場合、その方法は一般的な方法を用いて行うことができる 。すなわち、 目的のタンパク質をコードする遺伝子をベクターにライゲーシヨンし、得ら れた発現ベクターで宿主生物を形質転換し、形質転換体を得る。その形質転換体を 所定の条件下で培養し、 目的のタンパク質を回収することによって行うことができる。
[0024] 本発明のタンパク質 (YAPの新規アイソフォーム）をコードする遺伝子としては、所定 の塩基配列を含有するものであれば適用可能である。具体的には、ゲノム DNA、細 胞 '組織由来の cDNA、合成 DNAのいずれも用いることができる。
[0025] ベクターへの遺伝子の挿入は、例えば、精製された遺伝子の塩基配列を適当な制 限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローユングサイ トに挿入してベクターに連結する方法を用いることができる。また、発現ベクターには 本発明に係る遺伝子のほか、プロモーター、ターミネータ一、リボソーム結合配列等 を組み込んでも良い。
[0026] ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来の プラスミド、 λファージ等のバタテリオファージ、モロ-一白血病ゥイノレスなどのレトロゥ イノレス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどを用いること ができる。
[0027] 上記の発現ベクターで宿主生物を形質転換すれば、 目的の形質転換体が得られ る。宿主生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば、特に制限される ものではなぐ例えば、ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli)等のェシエリヒア属菌、バチ ルス属菌、酵母、動物細胞等を用いることができる。形質転換法としては、既に公知 である塩ィ匕カルシウム法、エレクトロボレイシヨン等の手段を採用することができるが、 これらの方法に限定されない。
[0028] そして、この形質転換体を培養することにより、本発明のタンパク質を生成すること ができる。タンパク質を回収するに際しては、必要に応じて細胞を破砕し、遠心分離 などにより細胞を除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学 的方法、例えば、硫酸アンモ-ゥム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマト グラフィー、ァフィユティークロマトグラフィー等を単独または適宜組み合わせて目的 のタンパク質を単離精製することができる。
[0029] 本発明のタンパク質 (YAPの新規ァイソフォーム）をポリグルタミン病等の神経変性 疾患の予防'治療薬として用いる場合、その投与経路は、主に、静脈内投与などの 非経口投与により行なわれる。注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水と ブドウ糖溶液の混合物等の、薬理学的に許容され得る担体を適宜用いて薬剤を調 製することができる。なお、生体 (in vivo)への投与法（drug delivery)については、血 液脳関門を通過できる力否かが問題となる可能性がある。もしその通過性に問題が あるときは、 HIVの TATアミノ酸配列を付加することにより血液脳関門を通過する方法 等を適宜採用することができる。
[0030] 新規ァイソフォームをコードする遺伝子を予防 '治療薬に用いる場合は、投与後、 目的細胞において新規アイソフォームが発現されるように、当該遺伝子を発現べクタ 一に組み込むとよ 、。発現したタンパク質が神経細胞に導入できるように TAT配列を 付加しても良い。また、遺伝子を組み込んだベクターを、適当な外被タンパク質ゃリ ポソーム、ウィルス粒子などに内包させても良い。これにより、 目的細胞または目的組 織に特異的に遺伝子を送り込み、 YAPの新規アイソフォームを発現させることが可能 である。
[0031] さらに、 YAPの新規アイソフォームを介する細胞内シグナル伝達を利用した神経変 性疾患の予防'治療薬も考えられる。例えば、 Aktは、プロテインキナーゼ B (PKB)と も呼ばれるセリン.スレオニンキナーゼである力 細胞内シグナル伝達の過程で YAP をリン酸化して修飾する。したがって、 YAPをリン酸化して 14-3-3タンパク質との結合 部位を作り、脱リン酸ィ匕酵素を阻害して YAPの分解を抑制することによって、神経細 胞死の抑制効果をより高めることができる。あるいは YAPを活性ィ匕する c-Ablや ATM を阻害する薬剤、または、 YAPと結合して作用する p73や p53を阻害する薬剤を神経 変性疾患の予防 ·治療薬として用いることも考えられる。
実施例
[0032] 以下、本発明における実験方法につ!、て詳述する。
(神経細胞の一次培養）
E17 Wistarラット胎児胚より分離した大脳皮質組織と、 P7 Wistarラット新生児力も分 離した小脳組織を剃刀で細力べし、 5分毎にやさしく振り混ぜながら 37°Cで 20分間、 0. 25%トリプシン（Gibco)を含むリン酸緩衝液（以下 PBS ; pH7.5)で処理した。続いて、 50 %仔ゥシ血清（以下 FBS)を含む DMEMで反応を止めた後、終濃度 100 /z g/mlとなるよ うに DNasel (Boehringer Mannheim)を加え、ブルーチップを用いたピペッティングによ り、やさしく組織を分離した。ナイロンメッシュ（FALCON、孔径 70mm)を通して細胞を 遠心分離し、 20mMグルコース、 16mM炭酸水素ナトリウム、 4mMグルタミン、 25 μ g/ml ゲンタマイシン、 10%FBSを加えた DMEMで再懸濁した後、ポリリジン（Sigma)をコート した 24ゥエルプレート（Corning)に各ゥエル 3 X 105個となるように培養した。 12時間後 、グリア細胞の増殖を防ぐため終濃度 4Mとなるように培養液中にシトシンァラビノシド を加えた。そして、 OPを誘導するため、 α -アマ-チン (Sigma)を濃度依存性の実験 以外では終濃度 10又は 25 g/mlとなるように培養液に加え、濃度依存性の実験では 終濃度が 10から 250 g/mlとなるように加えた。
[0033] (細胞死アツセィ）
細胞を 0.4%トリパンブルー溶液 (Invitrogen)で 5分間処理した。そして、各実験にお いて、各 3ディッシュから 100倍の拡大率で 10〜20箇所の視野をランダムに選択し、そ の中で少なくとも 2000個、青く染まった細胞 (死んで!/ヽる細胞）と染まって!/、な 、細胞 (生きている細胞）を数えた。
[0034] (電子顕微鏡）
細胞を PBSで 3回洗った後、 2.5%グルタルアルデヒド /0.1M PBで固定し、さらに 1% 0 sO /0.1M PBで 2時間固定した。固定された細胞をエタノール勾配を用いて脱水し、
4
エポキシ榭脂に包埋した。そして、その超薄切片をゥラニル酢酸とクェン酸鉛で染色 し、 日立 H-7000電子顕微鏡で観察した。
[0035] (アマ-チンにより誘発された液胞の同定）
Hela細胞を α -アマ-チン（Sigma)で 6時間処理した後、 PBSで洗い、室温において 4%パラホルムアルデヒドで 15分間固定した。続いて、細胞を、室温において次に示 す一次抗体で 1時間反応させた：マウス抗 CCO 1モノクローナル抗体（ 1： 1000希釈； M olecular Probes)、マウス抗 EEA1モノクローナル抗体（1:100希釈； Transduction Lab.) 、ゥサギ抗カルネキシンポリクローナル抗体（1:100希釈； Stressgen)、マウス抗ゴルジ 58kモノクローナル抗体（1:100希釈； Sigma)、抗 CD63 (1:100希釈； Cymbus Biotechno logy Ltd.)。そして、 Alexa fluor 488 (1:1000希釈； Molecular Probes)を二次抗体とし て室温で 30分間反応させることにより免疫染色で検出できるように視覚化した。 Hela 細胞には、 Superfect (Qiagen)を製品マニュアルに従って用い、 pEGFP- LC3又は pE GFP-ER(BD Biosciences)を遺伝子導入した。
[0036] (マイクロアレイ分析のための RNAプローブ）
細胞を PBSで 2回洗った後、培養皿の中で TRIZOL試薬（INVITROGEN)処理を行 い、製品マニュアルに従って全 RNAを抽出した。
Agilent Fluorescent Linear Amplincation Kit (Agilent technologies： U2554A ^ ： 品マ-ユアルに従って用い、 RNAの標識、増幅を行った。初めに、 T7プロモーター配 列を含むオリゴ dTプライマーとランダムへキサマー（40°C、 4時間）を用いて MMLV逆 転写酵素により 2 μ gの全 RNAから Τ7プロモーターを含んだ 2本鎖 cDNAを合成した。 これらの cDNAを铸型として、 Cy3または Cy5標識した CTPを用い、 T7 RNAポリメラー ゼにより cRNAを合成した。 AMA処理した皮質-ユーロン、 AMA処理した小脳-ユー ロン、また低カリウムで処理をした小脳-ユーロンのそれぞれから抽出し、合成した cR NAを Cy3または Cy5標識した。合成された cRNAをリチウムクロライドで沈殿させ、エタ ノールで洗 、、ヌクレアーゼのな!/、水で溶解した。 cRNAの質を調べるために OD 、
260
OD 、 A (Cy3に対し）、 A (Cy5に対し）を測定した。そして、 cRNAの OD /OD
280 552 650 260 280 と増幅率、色素含有率 [pmol/ μ g RNA]を算出した。我々のサンプルはこれらの基準 にお 、て高 ヽ質を示した（OD /OD ： 2.0く、増幅率： 400く、 Cy3含有： 15く [pmol/
260 280
μ g RNA], Cy5含有： 12く [pmol/ μ g RNA])。
[0037] (マイクロアレイ分析）
ハイブリダィゼーシヨン方法は、 in situハイブリダィゼーシヨンキットプラス（Agilent te chnologies : 5184-3568)を製品マニュアルに従って用いた。初めに、 Cy3と Cy5標識さ れた cRNA (各 1 μ g)を混ぜ合わせ、 60°Cで 30分間、フラグメンターシヨンバッファーで 処理した。そして、 60塩基のマウス cDNAのオリゴヌクレオチドを 20,371含む Mouse De velopment Oligo Microarray (Agilent technologies : G4120A)と断片ィ匕した cRNAを 60 °Cで 17時間反応させた。反応後のマイクロアレイを 2回洗浄し、窒素ガス (99.999%) をフィルター付きの空気銃（Nihon mycrolis KK)を用いて吹きかけて乾燥した。
蛍光シグナルはマイクロアレイスキャナーである CRBIO lie (Hitachi software engine ering Co., Ltd.)で検出した。データは解析ソフトである DNASIS array (Hitachi softwa re engineering Co., Ltd.)を用いて解析した。コントロールスポットや不自然なシグナ ルによる強い蛍光を持つスポットはデータから除いた。その後、それぞれのスポットの シグナル強度は全てのシグナル強度を標準化した。標準化したシグナル強度を散布 図上で Cy3の蛍光を Y軸、 Cy5の蛍光を X軸にプロットした。 Cy5に対する Cy3の蛍光 の割合を計算し、 Cy3/Cy5が 2.0以上、 0.5以下と突出した遺伝子を表にした。
[0038] (PCRクローニング）
YAPの RT— PCRクロー-ングは、 RNA LA PCR Kit (AMV) (Takara)により、 F:5，— GG AATTCTATGGAGCCCGCGCAA- 3'、 R:5，- ACGCGTCGACCTATAACCACGTG AG- 3，の二つのプライマーを用いて、ラット皮質-ユーロンの全 RNA1 μ gから逆転写 によって得た cDNAより行った。 PCRによる増幅は 35サイクル（94°Cで 30秒、 52°Cで 30 秒、 72°Cで 90秒）行った。 PCR産物の cDNAを EcoRIと Sailを用いて pBluescriptll SK+ に挿入した。塩基配列は M13と合成された cDNAに含まれる配列を用いたプライマー により、 ABI PRISMTM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kit ver.3.1 (Applied Biosystems)と ABI PRISMTM 310 DNA Sequencer (Applied Biosystems)を用いて決 定した。 YAPの 13nt、 25nt、 61ntの挿入部位を含む pBluescriptを pBSinsl3、 pBSins25 、 pBSins61と名付けた。上記の YAPの挿入部位を pCI-neo (Promega)に挿入し、それ らを pCIinsl3、 pCIins25、 pCIins61と名付けた。
[0039] (ウェスタンブロット解析）
全ての細胞を培養皿の上で 62.5mMトリス- HCL (pH6.8)、 2% (w/v) SDS、 2.5% (v/ v) 2-メルカプトエタノール、 5% (w/v)グリセリン、 0.0025% (w/v)ブロモフエノールブル 一で溶解した。細胞溶解液を、 1レーンあたり 3.3 X 104個の Hela細胞、 1.0 X 105個の 初代培養の-ユーロンとなるように調整し、 SDS-PAGEゲルで電気泳動した後、ポリビ -リデン'ジフルオライド膜（PVDF: Fine Trap, Nihon Eido)に転写し、それぞれの一 次抗体で 1時間処理して力 30分間ホースラディッシュ ·ペルォキシダーゼの標識さ れ 7こ二次 体で処¾し、 ECL Western Blotting Detection System (Amersham Biosci nces)で視覚化した。一次抗体、二次抗体の希釈については、ゥサギ抗 YAPポリクロ ーナル抗体（H- 125, Santa Cruz)は 1 : 1000、マウス抗 GAPDHモノクローナル抗体（C hemicon)は 1： 100000、 HRP標識した抗マウス IgG (Amersham)は 1： 5000、 HRP標識し た抗ゥサギ IgG (Amersham)は 1： 3000で使用した。
[0040] (アデノウイルスベクター）
複製能力の欠如したアデノウイルスベクターは Adenovirus Expression Vector Kit ( TAKARA SHUZO CO., LTD.)を製品マニュアルに従って用いた。 YAPの cDNAを p BSinsl3、 pBSins25、 pBSins61から EcoRI、 Sailで切り出した。 cDNAの断片の両端を Bl unting high kit (Toyobo CO., LTD.)で平滑化した後、それらを pAxCAwtコスミド（Tak ara)に Swalを用いて挿入した。精製されたコスミドを、 293個の細胞に対しリン酸カル シゥム法によりアデノウイルスの DNAと共に導入し、死細胞の培養液をウィルス液とし て回収した。 2、 3回増幅を繰り返した後、このベクターのクロナリティ (5 X 108〜5 X 109 PFU/ml)をエンドヌクレアーゼと PCRを用いて調べた。我々は AxCAinsl3、 AxCAins2 5、 AxCAins61としてアデノウイルスベクターを作製した。これらのベクターを Hela細胞 と初代培養のニューロンに感染多重度 (MOI) 100で感染に使用した。また、予備的に タンパク質の発現効率とアデノウイルスの毒性を、 EGFPを組み込んだベクターと様々 な MOIのモッタベクターを初代培養の-ユーロンに感染させることにより調べた。 MOI 100で 90%以上の-ユーロン力 ¾GFPを発現して!/、た。非感染-ユーロンとモッタ感染 ニューロンでの死細胞の割合の違いはトリパンブルーを用いて調べ、 MOIが 500以上 でも 3%程度だった。
[0041] (ノザンブロッテイング）
初代培養の-ユーロンより抽出した全 RNA10 μ gを MOPS/ホルムアルデヒドゲルを 用いて電気泳動した。分離された RNAを Hybond-N (Pharmacia)に転写し、 UV架橋（1 20,000 μ J/cm2)により固定した。 61塩基揷入物の全長 cDNAを pBSins61から切り出し 、ゲルを用いて精製し、 [a32P]dCTP(Amersham)とランダムプライマー DNA標識キット (Takara)で標識した。 32Pで標識したプローブを 60°Cでナイロン膜と反応させ、ー晚 浸透した。反応させた膜は 50°Cで 20分間、 1 X SSC、 0.1% SDSで 2回洗浄し、 60°Cで 2 0分間、 O.lx SSC、 0.1% SDSで 2回洗浄した。そして、膜を X線フィルムに— 80°Cで適 度な時間、感光した。
[0042] (RNA干渉）
細胞に、 RNAiFect (QIAGEN)を製品マニュアルに従って用い、 siRNAオリゴヌタレ ォチドを導入した。 6ゥエル中で 2.5 X 104の細胞に 24時間後各ゥエル 0.5 μ gの siRNA を感染させた。感染 24時間後、終濃度 10 g/mlとなるように AMAを加えた。さらに 24 時間後に細胞死アツセィを行った。 YAPと p73の siRNAの配列は以前に公開されたも のと同じものを用いた。
産業上の利用可能性
[0043] 本発明の新規タンパク質及びそれを利用したポリグルタミン病等の神経変性疾患 の予防，治療薬は、ポリグルタミン病、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症、アル ッハイマー病、パーキンソン病等の神経変性疾患の予防 ·治療等のために用いること ができる。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の（a)又は (b)のタンパク質。
(a)配列番号 1〜配列番号 3の 、ずれかで表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質
(b)アミノ酸配列（a)において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加さ れたアミノ酸配列力 なり、かつ転写活性ィ匕因子 YAPに対する優性ネガティブ効果を 有するタンパク質。
[2] 請求項 1記載のタンパク質をコードする遺伝子。
[3] 請求項 2記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
[4] 請求項 2記載の遺伝子を含有する組換えベクターを含む形質転換体。
[5] 請求項 1記載のタンパク質を含むポリグルタミン病、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側 索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病等の神経変性疾患の予防'治療薬。
[6] 請求項 1記載のタンパク質を介する細胞内シグナル伝達を利用したポリグルタミン 病、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病等 の神経変性疾患の予防 ·治療薬。
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