JP2002540280A

JP2002540280A - 分子プローブとして有用な４，７−ジクロロローダミン色素

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Publication number: JP2002540280A
Application number: JP2000608692A
Authority: JP
Inventors: リンダジー．リー，; スコットシー．ベンソン，; バーネットビー．ローゼンブルム，; サンドラエル．スパージェオン，; ロナルドジェイ．グラハム，
Original assignee: PE Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1999-03-27
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2002-11-26
Anticipated expiration: 2020-03-24
Also published as: WO2000058406A1; EP1165694A1; DE60042706D1; ATE277128T1; JP2006151973A; EP1386946B1; DE60014051T8; EP1386946A1; JP4732130B2; AU772329B2; ATE438691T1; JP3848838B2; DE60014051D1; CA2367868C; JP2011016813A; US6080852A; CA2367868A1; US6713622B1; ES2329562T3; ES2226801T3

Abstract

(57)【要約】蛍光色素として有用な１セットの４，７−ジクロロローダミン化合物を開示する。別の局面において、本発明は、４，７−ジクロロローダミン色素化合物で標識された試薬を含む。これには、デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、およびポリヌクレオチドが挙げられる。さらなる局面において、本発明は、このような色素化合物および試薬を利用する方法を含む。これには、ジデオキシポリヌクレオチド配列決定およびフラグメント分析法が挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、分子プローブとして有用である、蛍光色素化合物に概して関する。
より詳細には、本発明は、蛍光標識化試薬として有用である、４，７−ジクロロ
ローダミン色素に関する。

【０００２】（参考文献）

【０００３】

【表１】（背景）生物工学分析の非放射性検出は、現代の分析バイオテクノロジーにおいて重要
な技術である。放射標識の必要性をなくすことで、安全性が高まり、そして試薬
を処分する際の環境的な影響が、大きく低減し、分析のための費用が減少する。
このような非放射性検出方法を使用する方法の例としては、ＤＮＡ配列決定、オ
リゴヌクレオチドプローブ方法、ポリメラーゼ連鎖反応産物の検出、イムノアッ
セイなどが挙げられる。

【０００４】多くの適用において、混合物中における複数の空間的重なり分析の独立した検
出は、例えば、単一チューブマルチプレックスＤＮＡプローブアッセイ、イムノ
アッセイ、多色ＤＮＡ配列決定法などを必要とする。多遺伝子座ＤＮＡプローブ
アッセイの場合において、多色検出を提供することによって、反応チューブの数
は減少され得、これにより実験プロトコールを単純化し、そして適用特異的キッ
トの製造を容易にする。自動化されたＤＮＡ配列決定の場合、多色標識化により
単一レーンの４種の塩基全ての分析を可能にし、これによりスループットオーバ
ー単一色法を増加させ、そしてレーン間の電気泳動移動度変化に関連する不確定
性を排除する。

【０００５】マルチプレックス検出は、色素標識の選択において、特に電気泳動による分離
および酵素を用いる処理（例えば、ＤＮＡ配列決定）を必要とする分析に対して
、多数の厳しい制限を与える。第１に、蛍光スペクトルが、スペクトル的に分解
される色素の収集を見出すことは、困難である。なぜならば、有機蛍光色素の典
型的な発光バンドの半値幅は、約４０〜８０ナノメーター（ｎｍ）であり、そ
して利用可能なスペクトルの幅は、励起光源によって制限されるからである。第
２に、重ならない蛍光スペクトルを有する色素が見出されたとしても、各蛍光効
率が低すぎる場合、このセットは、まだ適切とはなり得ない。例えば、ＤＮＡ配
列決定の場合、増加したサンプルの充填は、低い蛍光効率（Ｐｒｉｎｇｌｅ）を
補償し得ない。第３に、いくつかの蛍光色素が同時に使用される場合、同時励起
が困難となる。なぜならば、色素の吸収バンドが、幅広く分かれるからである。
第４に、色素の電荷、分子サイズおよびコンホメーションは、フラグメントの電
気泳動の移動度に悪影響を与えてはならない。最後に、蛍光色素は、フラグメン
ト（例えば、ＤＮＡ合成溶媒および試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ
酵素など）を作製するか、または操作するために、使用される化学物質と適合性
でなければならない。

【０００６】これらの厳しい制限のために、多色適用（特に、４色のＤＮＡ配列決定の分野
）において使用され得る、数セットのみの蛍光色素が見出された（Ｓｍｉｔｈ
１９９２，１９９５；Ｐｒｏｂｅｒ；Ｃｏｎｎｅｌｌ）。

【０００７】多色適応において特に有用な蛍光色素の１つのクラスは、ローダミン色素であ
る（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）
、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン１１０（Ｒ１１０）など）（Ｂｅｒｇ
ｏｔ）。ローダミン色素は、フルオレセイン色素に比べて特に魅力的である。な
ぜなら、（１）ローダミンは、フルオレセインよりも典型的により光安定性であ
り、（２）ローダミン標識化ジデオキシヌクレオチドは、熱安定性ポリメラーゼ
酵素に対して良好な基質であり、そして（３）ローダミン色素の蛍光スペクトル
は、フルオレセインより有意に赤色（高波長）側にある。

【０００８】しかし、マルチプレックス検出法の状況において、現在利用可能なローダミン
の１つの重要な欠点は、このような色素の比較的幅広い蛍光スペクトルである。
この幅広い蛍光スペクトルは、空間的に隣接する色素のスペクトル間の乏しいス
ペクトル分解を生じ、これによって、このような色素の組み合わせの多成分分析
を困難としている。図７に示した蛍光性蛍光スペクトルは、高い程度のスペクト
ルの重なりを示す。現在利用可能なローダミン色素の第２の欠点は、それらの吸
収スペクトルが、現在利用可能な固相状態周波数２倍グリーンダイオードレーザ
ー（例えば、約５３２ｎｍに輝線を有する、ネオジム固相状態ＹＡＧレーザー）
の波長と一致しない。このようなレーザーを使用することは、そのコンパクトな
サイズ、長い有効寿命、および電力の効率的使用のために非常に利点がある。

【０００９】（要旨）本発明は、分子プローブとして有用である、４，７−ジクロロローダミン色素
のクラスの発明に関する。

【００１０】本発明の目的は、現在利用可能なローダミン色素よりも実質的に狭い蛍光スペ
クトルを有する、ローダミン色素のクラスを提供することである。

【００１１】本発明の別の目的は、現存のローダミン色素と比較して、レッドシフトした吸
収スペクトルを有する、ローダミン色素のクラスを提供することである。

【００１２】第１の局面において、本発明の上記の目的および他の目的は、以下の式：

【００１３】

【化１７】を有する、化合物によって達成される。

【００１４】第２の局面において、本発明は、以下の式：

【００１５】

【化１８】を有する、化合物を含む。

【００１６】第３の局面において、本発明は、以下の式：

【００１７】

【化１９】を有する、標識化ヌクレオチドを含む。

【００１８】第４の局面において、本発明は、以下の式：

【００１９】

【化２０】を有する、標識化ヌクレオチドを含む。

【００２０】このＢとＤとを連結する結合部は、Ｒ₁〜Ｒ₆またはＸ₁〜Ｘ₃の位置の１つでＤ
に結合される。好ましくは、このＢとＤとを連結する結合部は、Ｘ₂またはＸ₃の
位置１つでＤに結合される。特に好ましい実施形態において、この結合部は、以
下：

【００２１】

【化２１】である。Ｂがプリンである場合、結合部は、このプリンの８−位置に結合される
。Ｂが７−デアザプリンである場合、結合部は、この７−デアザプリンの７−位
置に結合される。Ｂがピリミジンである場合、結合部は、このピリミジンの５−
位置に結合される。

【００２２】第５の局面において、本発明は、ヌクレオチド配列決定の方法を含み、このよ
うな方法は、例えば、以下の工程：ポリヌクレオチドの第１のクラス、第２のク
ラス、第３のクラス、および第４のクラスの混合物を形成する工程；ポリヌクレ
オチドを電気泳動で分離する工程であって、これにより、類似した大きさのポリ
ヌクレオチドのバンドを形成する工程；色素を蛍光発光させ得る、照射ビームで
バンドを照射する工程；色素の蛍光スペクトルによって、バンドでポリヌクレオ
チドのクラスを同定する工程を包含する。この第１クラスの各ポリヌクレオチド
は、３’−末端ジデオキシアデノシンを含み、そして第１色素で標識されており
、第２クラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシシチジンを含み、
そして第２色素で標識されており、第３クラスの各ポリヌクレオチドは、３’−
末端ジデオキシグアノシンを含み、そして第３色素で標識されており、第４クラ
スの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシチミジンを含み、そして第４
色素で標識されている。第１色素、第２色素、第３色素、または第４色素が、本
発明の４，７−ジクロロローダミン色素であり、他の色素は、４，７−ジクロロ
ローダミン色素および互いからスペクトル的に分解可能であるように、色素が選
択される。

【００２３】これらの局面および他の局面、本発明の目的、特徴、および利点は、以下の発
明の詳細な説明、図面、および添付の特許請求の範囲を参照することで、より理
解され得る。

【００２４】（好ましい実施形態の詳細な説明）ここで、本発明の好ましい実施形態、添付の図面に例示される例を詳細に、言
及する。本発明は、好ましい実施形態と共に記載するが、本発明をこれらの実施
形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。一方、本
発明は、添付の特許請求の範囲によって規定されるように、本発明の範囲内に含
まれ得る、代替物、改良物および均等物を包含することが意図される。

【００２５】一般に、本発明は、蛍光色素として有用な４，７−ジクロロローダミン化合物
の新規なクラス、分子標識としてこのような色素を使用する試薬、および分析バ
イオテクノロジーの分野において、このような色素および試薬を利用する方法を
含む。本発明の化合物は、多色蛍光ＤＮＡ配列決定およびフラグメント分析の分
野において、特定の適用を見出す。

【００２６】本発明は、４，７−ジクロロローダミンおよび関連の色素の蛍光特性が、分子
プローブとして利用するために、非常に好ましいという発見に一部基づいている
。これらの発光バンド幅は、４，７−ジクロロ誘導体を欠くアナログよりも、一
般に２０〜３０％狭く、そしてこれらの発光および吸収極大は、４，７−ジクロ
ロ誘導体を欠くアナログよりも、一般に約１０〜３０ｎｍ高波長側である。

【００２７】（Ｉ．定義）他に示されない限り、本明細書中で使用される場合、以下の用語および語句は
、以下の意味を有すると意図される：「連結基」（Ｌ）とは、試薬に結合した「相補的官能基」と反応し得る官能基
であり、このような反応が、色素をこの試薬に接続する「結合部」を形成する。
使用される特定の連結基は、相補的官能基の性質および所望の結合部の型に依存
する。いくつかの場合において、連結基は相補的な官能基との反応の前に活性化
されなければならず、例えば、カルボキシレート連結基の、ジシクロヘキシルカ
ルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いる活性化により、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを形成する。好ましくは、相補的
官能基がアミンである場合には必ず、本発明の連結基は、イソチオシアネート、
イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、スルホニルクロリド、アルデ
ヒドもしくはグリオキサール、エポキシド、カーボネート、アリールハライド、
イミドエステル、カルボジイミド、酸無水物、４，６−ジクロロトリアジニルア
ミン、または他の活性カルボキシレートである。好ましくは、相補的官能基がス
ルフヒドリルである場合には必ず、連結基は、ハロアセチル、アルキルハライド
、マレイミド、ハロアセチル、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤（例え
ば、フルオロベンゼン）などである。相補的官能基がカルボキシレートである場
合、連結基は、好ましくは、ジアゾアルカン（ｄｉａｚｏａｌａｎｅ）、ジアゾ
アセチル、カルボニルジイミダゾール、およびカルボジイミド（Ｈｅｒｍａｎｓ
ｏｎ）である。特に好ましい実施形態において、連結基は、アミンに相補的な官
能基と反応する活性化ＮＨＳエステルであり。この場合、活性化ＮＨＳエステル
を形成するために、カルボキシレート連結基を含む本発明の色素は、ジシクロヘ
キシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応し、ＮＨＳエ
ステルを形成する（Ｋｈａｎｎａ；Ｋａｓａｉ）。以下の表１は、代表的な連結
基の見本を、適合性の相補的官能基および生じる結合部とともに示す。

【００２８】

【表２】用語「低級アルキル」は、１〜８個の炭素原子を含む、直鎖炭化水素部分およ
び分枝炭化水素部分（すなわち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ
ｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペン
チルなど）を意味する。

【００２９】用語「プロパノ」とは、特に、部分−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−をいう。

【００３０】「シクロアルキル」とは、環を形成する炭化水素部分（例えば、シクロヘキシ
ルおよびシクロペンチル）をいう。シクロアルキル置換基と一緒になった窒素原
子は、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、より大きい
環、およびそれらの置換された形態を形成し得る。

【００３１】「低級置換アルキル」は、電子吸引置換基（例えば、ハロ、シアノ、ニトロ、
スルホなど）を含む低級アルキルを意味する。

【００３２】「低級ハロアルキル」は、１以上のハロゲン原子置換基（通常、フルオロ、ク
ロロ、ブロモ、またはヨード）を有する低級置換アルキルを意味する。

【００３３】「低級アルケン」は、炭素−炭素結合のうち１つ以上が二重結合である、低級
アルキルまたは低級置換アルキルを意味する。

【００３４】「低級アルキン」は、炭素−炭素結合のうち１つ以上が三重結合である、低級
アルキルまたは低級置換アルキルを意味する。

【００３５】「低級アルコキシ」とは、酸素原子に単結合で結合された低級アルキルを含む
部分をいう。

【００３６】「アリール」とは、単一または複数のフェニルまたは置換フェニル（例えば、
ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル、など）をいう。

【００３７】用語「ヌクレオシド」とは、ペントースに１’位で連結されたプリン、デアザ
プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シ
トシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）からなる
化合物をいい、２’−デオキシ形態および２’−ヒドロキシ形態を含む（Ｓｔｒ
ｙｅｒ）。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド」とは、ヌクレオ
シドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）をいい、ここでエステル化
の最も一般的な部位は、ペントースのＣ−５位に結合されるヒドロキシル基であ
る。本開示においてしばしば、用語ヌクレオシドは、ヌクレオシドおよびヌクレ
オチドの両方を含むことを意図される。

【００３８】ヌクレオシドを参照した「アナログ」は、改変された塩基部分、改変された糖
部分、および／または改変されたリン酸エステル部分を有する合成的アナログ（
例えば他で記載されるような）を含む（Ｓｃｈｅｉｔ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）。用
語「標識化ヌクレオシド」とは、式Ｉの色素化合物に共有結合で結合されたヌク
レオシドをいう。

【００３９】本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌク
レオチド」とは、天然ヌクレオチドモノマーまたはそのアナログの線状ポリマー
をいい、一本鎖および二本鎖の、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド
、そのα−アノマー形態などを含む。通常、ヌクレオシドモノマーは、ホスホジ
エステル結合部で連結され、ここで本明細書中で使用される場合、用語「ホスホ
ジエステル結合部」とは、ホスホジエステル結合またはそのアナログ（ホスホロ
チオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノ
エート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａ
ｔｅ）、ホスホラニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホ
ラミデートなどを含む）をいい、対イオンが存在する場合、付随する対イオン（
例えば、Ｈ⁺、ＮＨ₄ ⁺、Ｎａ⁺など）を含む。ポリヌクレオチドは、代表的には、
サイズにおいて少数のモノマー単位（例えば、８〜４０個）から、数千のモノマ
ー単位までの範囲である。他に示されない限り、ポリヌクレオチドが、文字の配
列（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）により表される場合には必ず、ヌクレオチド
は、５’→３’の順に、左から右であること、および「Ａ」がデオキシアデノシ
ンを意味し、「Ｃ」がデオキシシチジンを意味し、「Ｇ」がデオキシグアノシン
を意味し、そして「Ｔ」がチミジンを意味するということが理解される。

【００４０】本明細書中で使用される場合、一連の色素を参照した用語「スペクトル分解」
は、これらの色素の蛍光発光スペクトルが十分に明確（すなわち、十分に重複し
ていない）であり、その結果、それぞれの色素が結合される試薬（例えば、ポリ
ヌクレオチド）が、他に記載される（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ；Ｗｈｅｅｌｅｓ
ｓ）システムにより例示されるような、標準的な光検出システムを使用して（例
えば、バンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシステム、分光器と連結した
電荷結合素子などのシステムを利用して）、それぞれの色素により生成される蛍
光シグナルに基づいて識別され得る（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ；Ｗｈｅｅｌｅｓ
ｓ）。

【００４１】本明細書中で使用される場合、用語「置換（された）」とは、１つ以上の水素
原子が、１つ以上の非水素原子、官能基、または部分で置き換えられる分子をい
う。例えば、非置換窒素は、−ＮＨ₂であるが、置換窒素は、−ＮＨＣＨ₃である
。例示的な置換基としては、ハロ（例えば、フッ素および塩素）、低級アルキル
、低級アルケン、低級アルキン、スルフェート、スルホネート、スルホン、アミ
ノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェノキシ、芳香族、
フェニル、多環式芳香族、複素環式、および連結基が挙げられるが、これらに限
定されない。

【００４２】（ＩＩ．４，７−ジクロロローダミン色素化合物）第１の局面において、本発明は、以下の式Ｉのような一般構造を有する４，７
−ジクロロローダミン色素化合物の新規なクラスを含む（本開示の全体を通して
提供される全ての分子構造は、示される厳密な電子構造だけでなく、それらの全
ての共鳴構造、エナンチオマー、ジアステレオマー、およびプロトン化状態も含
むことが意図される）。

【００４３】

【化２２】式Ｉにおいて、可変性の置換基は、以下のように規定される。Ｒ₁〜Ｒ₆は、独
立して、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、シ
クロアルキル、フェニル、アリール、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド
、ニトリル、低級アルコキシ、連結基、またはそれらの組み合わせであるか、あ
るいは、一緒に考慮される場合、Ｒ₁およびＲ₆は、ベンゾであり、あるいは、一
緒に考慮される場合、Ｒ₄およびＲ₅は、ベンゾである。好ましくは、Ｒ₁〜Ｒ₆は
、水素、メチル、またはエチルである。Ｙ₁〜Ｙ₄は、独立して、水素、低級アル
キル、アルキルスルホネート、アルキルカルボキシレート、またはシクロアルキ
ルである。あるいは、一緒に考慮される場合、Ｙ₁およびＲ₂、Ｙ₂およびＲ₁、Ｙ ₃ およびＲ₃、ならびに／またはＹ₄およびＲ₄は、プロパノ、エタノ、またはそれ
らの置換形態であり、縮合環を形成する。Ｘ₁〜Ｘ₃は、独立して、水素、塩素、
フッ素、低級アルキル、カルボキシレート、スルホン酸（スルホネート）、ヒド
ロキシメチル（−ＣＨ₂ＯＨ）、および連結基である。好ましくは、Ｘ₁は、カル
ボキシレートであり、そしてＸ₂およびＸ₃は、独立して水素および連結基である
。

【００４４】一連の本発明の特に好ましい化合物において、Ｒは、水素（ｄＪＯＮ）または
メチル（ＤＭＤＪ）であり、以下に式ＩＩとして示される。

【００４５】

【化２３】本発明の別の特に好ましい化合物を、ｄＲ６５０といい、以下に式ＩＩＩとし
て示される。

【００４６】

【化２４】第３の特に好ましい一連の化合物は、以下の式ＩＶに示されるような、Ｒが６
−ヘキサン酸（ｄＪＯＤＡ）またはメチル−ｐ−安息香酸（ｄＲ１３４）である
化合物である。

【００４７】

【化２５】本発明の第４の特に好ましい化合物は、本明細書中でｄＲ１３９といい、ここ
でＹ₁およびＹ₂、ならびにＹ₃およびＹ₄は、窒素置換基としてピロリジニル環を
形成し、Ｒ₁〜₆は水素であり、Ｘ₁はカルボキシルであり、そしてＸ₂およびＸ₃
は、カルボキシルおよび水素である。ｄＲ１３９の構造を、以下に式Ｖとして示
す。

【００４８】

【化２６】第２の局面において、本発明は、以下に式ＶＩとして示される一般構造を有す
る、新規なクラスの４，７−ジクロロローダミン色素化合物を含む。

【００４９】

【化２７】式ＶＩにおいて、Ｒ₇〜Ｒ₁₀、Ｒ₁₂〜Ｒ₁₆、およびＲ₁₈は、水素、フッ素、塩
素、メチル、エチル、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、シクロアル
キル、フェニル、アリール、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリ
ル、低級アルコキシ、連結基、またはそれらの組合せであり得る。好ましくは、
Ｒ₇〜Ｒ₁₀およびＲ₁₃〜Ｒ₁₆は、水素、メチル、またはエチルである。Ｒ₇および
Ｒ₈、またはＲ₁₃およびＲ₁₄は共に、酸素（＝Ｏ）、イオウ（＝Ｓ）、イミニウ
ム（＝ＮＨ）、アルキルイミニウム（＝ＮＲ）であり得る。Ｒ₁₁およびＲ₁₇は、
水素、低級アルキル、アルキルスルホネート、アルキルカルボキシレート、低級
アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、連結基、また
はそれらの組合せであり得る。好ましくは、Ｒ₁₁およびＲ₁₇は、メチルまたはフ
ェニルである。Ｘ₁〜Ｘ₃は、独立して、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、ア
ミン、アミド、カルボキシレート、スルホン酸（スルホネート）、ヒドロキシメ
チル（−ＣＨ₂ＯＨ）、および連結基である。好ましくは、Ｘ₁は、カルボキシレ
ートであり、そしてＸ₂およびＸ₃は、独立して水素または連結基である。特に好
ましい実施形態は、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₁₀、Ｒ₁₃、Ｒ₁₄およびＲ₁₇が、水素またはメチ
ルであり、Ｒ₉およびＲ₁₅が、水素であり、Ｒ₁₁およびＲ₁₅がメチルまたはフェ
ニルであり、そしてＲ₁₂およびＲ₁₈が、水素である実施形態である。

【００５０】（ＩＩＩ．４，７−ジクロロローダミン色素化合物を利用する試薬）別の局面において、本発明は、式Ｉ〜ＶＩの４，７−ジクロロローダミン色素
化合物で標識された試薬を含む。本発明の試薬は、本発明の色素が結合され得る
実質的に任意の試薬である。好ましくは、これらの色素は、試薬に直接にか、ま
たは結合部を介して共有結合で結合される。例示的な試薬としては、タンパク質
、ポリぺプチド、多糖類、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、脂
質、固体支持体、有機ポリマーおよび無機ポリマー、ならびにそれらの組合せお
よび集合（例えば、染色体、核、生存細胞（例えば、細菌）、他の微生物、哺乳
動物細胞、組織、糖タンパク質など）が挙げられる。

【００５１】（Ａ．ヌクレオチド試薬）本発明の好ましいクラスの試薬は、本発明の非対称ベンゾキサンテン色素を組
み込むヌクレオチドおよびヌクレオシドを含む。このようなヌクレオチド／ヌク
レオシド試薬は、酵素的合成により形成されるポリヌクレオチドの標識に関連し
て（例えば、ＰＣＲ増幅、Ｓａｎｇｅｒ型ポリヌクレオチド配列決定、およびニ
ックトランスレーション反応に関連して使用されるヌクレオチドトリホスフェー
ト）特に有用である。

【００５２】本発明の好ましいヌクレオチド／ヌクレオシド試薬は、以下の式ＶＩＩに示さ
れ、

【００５３】

【化２８】この式において、Ｂは、ヌクレオシド塩基；７−デアザプリン、プリン、または
ピリミジンヌクレオチド塩基、それらのアナログであり、そして好ましくは、ウ
ラシル、シトシン、デアザアデニン、またはデアザグアノシンである。Ｄは、本
発明の式Ｉ〜ＶＩの４，７−ジクロロローダミン色素化合物である。Ｗ₁および
Ｗ₂は、独立して、ＨまたはＯＨであり、Ｗ₃は、ＯＨ、ＯＰＯ₃、ＯＰ₂Ｏ₆、Ｏ
Ｐ₃Ｏ₉であり、それらのアナログ（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアニ
リデート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラミデートおよび他のホスフェー
トアナログなど）を含み、存在する場合、付随する対イオン（例えば、Ｈ⁺、Ｎ
ａ⁺、ＮＨ₄ ⁺など）を含む。１つの好ましい実施形態において、Ｗ₁は、Ｈであり
、Ｗ₂は、ＯＨであり、そしてＷ₃は、ＯＰ₃Ｏ₉である。第２の好ましい実施形態
において、Ｗ₁およびＷ₂は、Ｈであり、そしてＷ₃は、ＯＰ₃Ｏ₉である。Ｂが、
プリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分はプリンまたはデアザプリン
のＮ⁹−位に結合され、そしてＢが、ピリミジンである場合、糖部分は、ピリミ
ジンのＮ¹−位に結合される。ＢとＤとを連結する結合部は、Ｒ₁〜Ｒ₁₈またはＸ ₁ 〜Ｘ₃の位置のうちの１つにて、Ｄに結合される。

【００５４】Ｂが、プリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分はプリンまたはデア
ザプリンのＮ⁹−位に結合され、そしてＢが、ピリミジンである場合、糖部分は
、ピリミジンのＮ¹−位に結合される。

【００５５】ＢとＤとを連結する結合部は、Ｒ₁〜Ｒ₁₈またはＸ₁〜Ｘ₃の位置のうちいずれ
か１つにてＤに結合され得る。好ましくは、この結合部は、Ｘ₂またはＸ₃のうち
の１つにて結合される。好ましくは、Ｂが、プリンである場合、ＢとＤとを連結
する結合部は、プリンの８位に結合され、Ｂが、７−デアザプリンである場合、
この結合部は、７−デアザプリンの７位に結合され、そしてＢが、ピリミジンで
ある場合、この結合部は、ピリミジンの５位に結合される。

【００５６】１つの特に好ましい実施形態において、本発明のヌクレオチドは、以下に式Ｖ
ＩＩＩで示される構造を有するジデオキシヌクレオチドトリホスフェートであり
、存在する場合、付随する対イオンを含む。

【００５７】

【化２９】標識化ジデオキシヌクレオチド（例えば、式ＶＩＩＩに示される）は、Ｓａｎ
ｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ）において、鎖終結試薬または「ター
ミネーター」としての特定の適用を提供する。

【００５８】第２の特に好ましい実施形態において、本発明のヌクレオチドは、以下の式Ｉ
Ｘで示される構造を有するデオキシヌクレオチドトリホスフェートであり、存在
する場合、付随する対イオンを含む。

【００５９】

【化３０】式ＩＸに示されるような標識化デオキシヌクレオチドは、例えば、ポリメラー
ゼ連鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓ）において、ポリメラーゼ伸長産物を標識するための
手段として特定の適用を提供する。

【００６０】ヌクレオチド／ヌクレオシド標識は、公知の連結基、および結合部を形成する
ための付随する相補的官能基を使用する、多数の公知のヌクレオシド／ヌクレオ
チド標識技術のいずれかを使用して達成され得る。好ましい連結基の考察に関し
ては，上記を参照のこと。色素とヌクレオシドとを連結する結合部は、（ｉ）オ
リゴヌクレオチド標的ハイブリダイゼーションと干渉しないべきであり、（ｉｉ
）関連する酵素（例えば、ポリメラーゼ、リガーゼなど）と適合性であるべきで
あり、そして（ｉｉｉ）色素の蛍光を消光しないべきである。

【００６１】１つの好ましい実施形態において、本発明の色素は、ピリミジン塩基の５−炭
素、または７−デアザプリン塩基の７−炭素に共有結合で結合される。いくつか
の適切な塩基標識手順は、本発明と共に使用される得るということが報告されて
いる。（Ｇｉｂｓｏｎ；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ；Ｎｅｌ
ｓｏｎ１９９２；Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ；Ｆｕｎｇ１９８８；Ｗａｒｄ；Ｗｏｏ）
。

【００６２】好ましくは、結合部はアセチレンアミド結合部、またはアルケンアミド結合部
であり、色素とヌクレオチド塩基との間の結合部は、色素の活性化ＮＨＳエステ
ルの、ヌクレオチドのアルキニルアミノ誘導体化塩基またはアルケニルアミノ誘
導体化塩基との反応により形成される。より好ましくは、生じた結合部は、３−
（カルボキシ）アミノ−１−プロピニルまたは３−アミノー１−プロピン−１−
イルである（式Ｘ．１）。本発明の色素をヌクレオシド塩基に連結するためのい
くつかの好ましい結合部は、以下に式Ｘ．１〜６として示される（Ｋｈａｎ）。

【００６３】

【化３１】アルキルアミノ誘導体化ヌクレオシドの合成は、（Ｈｏｐｂｂｓ１９８９，
１９９２）により記載される。簡単には、アルキルアミノ誘導体化ヌクレオチド
は、適切なハロジデオキシヌクレオシド（通常５−ヨードピリミジンおよび７−
ヨード−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシド）およびＣｕ（Ｉ）をフラス
コ中に配置し、空気を除くためにアルゴンでフラッシュし、乾燥ＤＭＦを添加し
、次いでアルキニルアミン、トリエチルアミンおよびＰｄ⁰を添加することによ
り形成される。この反応混合物を数時間か、または薄層クロマトグラフィーがハ
ロジデオキシヌクレオシドの消失を示すまで攪拌する。保護されていないアルキ
ニルアミンを使用する場合、アルキニルアミノヌクレオシドを、反応混合物を濃
縮し、そしてカップリング反応において生成したハロゲン化水素を中和するため
の水酸化アンモニウムを含む溶出溶媒を使用してシリカゲル上でクロマトグラフ
ィーすることにより単離し得る。保護されたアルキニルアミンが使用される場合
、メタノール／塩化メチレン、次いで強塩基性アニオン交換樹脂の炭酸水素塩形
態を反応混合物に添加し得る。次いでこのスラリーを約４５分間攪拌し、濾過し
、そしてこの樹脂をさらなるメタノール／塩化メチレンでリンスし得る。合わせ
た濾液を濃縮し、そしてメタノール−塩化メチレン勾配を使用するシリカゲル上
のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し得る。５’トリホスフェートを、
標準の技術により得る。

【００６４】（Ｂ．ポリヌクレオチド試薬）本発明のなお別の好ましいクラスの試薬は、本発明の４，７−ジクロロローダ
ミン色素で標識されるポリヌクレオチドを含む。このような標識化ポリヌクレオ
チドは、ＤＮＡ配列決定プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドハ
イブリダイゼーションプローブなどを含む多数の重要な状況において有用である
。

【００６５】本発明のポリヌクレオチドは、式：

【００６６】

【化３２】を有するヌクレオチドを含み、ここで可変性の置換基および結合部は、以下に規
定される。Ｄは、本発明の４，７−ジクロロローダミン色素化合物である。Ｂは
、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基、好ましくは
、ウラシル、シトシン、デアザアデノシン、またはデアザグアノシンである。Ｚ ₁ は、Ｈ、ＯＨ、またはＯＣＨ₃である。Ｚ₂は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰＯ₃、ＯＰ₂Ｏ₆、
ＯＰ₃Ｏ₉、またはＮｕｃ（隣接するヌクレオチド）であり、ここでＮｕｃおよび
ヌクレオシドは、ホスホジエステル結合部またはそれらのアナログ（例えば、ホ
スホロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアニロチオエート、ホスホ
ラミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉａｔｅ）、および他のホスフェートア
ナログなど）により連結され、存在する場合付随する対イオン（例えば、Ｈ⁺、
Ｎａ⁺、ＮＨ₄ ⁺）を含み、この結合部は、Ｎｕｃの５’位に結合される。Ｚ₃は、
Ｈ、ＯＰＯ₂であり、ホスフェートアナログまたはＮｕｃを含み、ここでＮｕｃ
およびヌクレオシドは、ホスホジエステル結合部またはそのアナログにより連結
され、この結合部は、Ｎｕｃの３’位に結合され、ここでＮｕｃとは、ヌクレオ
シド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドをいう。Ｂが、プリンまたは７−
デアザプリンである場合、糖部分は、プリンまたはデアザプリンのＮ⁹位に結合
され、そしてＢが、ピリミジンである場合は、糖部分はピリミジンのＮ¹位に結
合される。Ｂは、上記の本発明のヌクレオチド試薬のように、糖部分および色素
化合物に結合される。規定されるように、式ＸＩの標識化ヌクレオチドは、５’
末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの任意の内
部ヌクレオチドであり得る。

【００６７】１つの好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドとしては、多重
色素が挙げられ、これらのうち少なくとも１つは本発明の色素化合物であり、蛍
光エネルギー移動がドナー色素とアクセプター色素との間で起こるように配置さ
れる。このような多色素ポリヌクレオチドは、スペクトル的に調整可能なプロー
ブまたはＤＮＡ配列決定プライマーとしての適用を提供する（Ｊｕ；Ｌｅｅ）。

【００６８】標識化ポリヌクレオチドは、酵素的に（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはリ
ガーゼ（Ｓｔｒｙｅｒ）を使用して）か、または化学合成（例えば、ホスホラミ
ダイト法、ホスファイト−トリエステル法など（Ｇａｉｔ）により）のいずれか
により合成され得る。標識は、上記の標識化ヌクレオチドトリホスフェートモノ
マーを利用する酵素合成の間に導入され得るか、または合成の後に導入され得る
。

【００６９】一般的に、標識化ポリヌクレオチドが、酵素合成により作製される場合、以下
の手順が使用され得る。テンプレートＤＮＡを、変性させ、そしてオリゴヌクレ
オチドプライマーを、このテンプレートＤＮＡにアニールする。デオキシヌクレ
オチドトリホスフェートおよび／またはジデオキシヌクレオチドトリホスフェー
トの混合物を、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄ
ＡＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＴＴＰを含む反応系に添加し、ここで少なくとも
１つのデオキシヌクレオチドおよび／またはジデオキシヌクレオチドの１つの少
なくとも１つのフラクションを上記のような本発明の色素化合物で標識する。次
に、ポリメラーゼ酵素を、ポリメラーゼ活性が有効である条件下で添加する。標
識化ポリヌクレオチドを、ポリメラーゼ鎖合成の間に標識化デオキシヌクレオチ
ドおよび／またはジデオキシヌクレオチドの組込みにより形成する。代替の酵素
合成法において、２つのプライマーを、１つのプライマーの代わりに使用し、一
方のプライマーは、標的の＋（プラス）鎖に相補的であり、他方のプライマーは
、標的の−（マイナス）鎖に相補的であり、ポリメラーゼは、熱的に安定なポリ
メラーゼであり、そして反応温度は、変性温度と伸長温度との間を循環され、そ
れによりＰＣＲにより標的配列に対する標識化相補体を指数関数的に合成する（
Ｍｕｌｌｉｓ；Ｉｎｎｉｓ）。

【００７０】合成に続いて、ポリヌクレオチドは、多数の位置で標識化され得、この位置と
しては、以下が挙げられる：５’末端（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ；Ｏｒｇｅｌ；Ｓｍｉ
ｔｈ）；ホスホジエステル骨格（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）；または３’末端（Ｎｅｌ
ｓｏｎ１９９２ａ；Ｎｅｌｓｏｎ１９９２ｂ；Ｎｅｌｓｏｎ１９９５）。オリゴ
ヌクレオチド標識化手順の完全な概説については、（Ｓｔｅｉｎｅｒ）を参照の
こと。

【００７１】１つの好ましい合成後化学的標識化法において、オリゴヌクレオチドは、以下
のように標識される。カルボキシレート連結基を含む色素を、約１当量の１，３
−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび約３当量のＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドと、乾燥酢酸エチル中で３時間室温にて反応させることによりＮＨＳエステ
ルに変換する。反応混合物を、５％ＨＣｌで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し
、濾過し、そして固体になるまで濃縮して、ＤＭＳＯに再懸濁する。次いで、こ
のＤＭＳＯ色素ストックを、過剰（１０〜２０×）に、０．２５Ｍ炭酸水素塩／
炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．４）中のアミノヘキシル誘導体化オリゴヌクレオチドに
添加し、そして６時間反応させる（Ｆｕｎｇ１９８８）。この色素標識化オリゴ
ヌクレオチドを、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを通して、緩衝液（例え
ば、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ））で溶出することにより
、未反応の色素から分離する。粗標識化オリゴヌクレオチドを含むフラクション
を、勾配溶出を利用する逆相ＨＰＬＣによりさらに精製する。

【００７２】（ＩＶ．本発明の化合物および試薬を使用する方法）本発明の色素および試薬は、蛍光検出を利用する方法、特に、複数の空間的に
重なる被分析物の同時検出を必要とする方法に、良く適している。本発明の色素
および試薬は、特に、電気泳動（ここで、例えば、サイズ、コンフォメーション
、電荷、疎水性などの同様の物理化学的特性を有する標的物質の一連のバンドま
たはスポットが直線配置または平面配置で存在する）のような生化学的分離手順
に供されたポリヌクレオチドのクラスの同定に良く適している。本明細書中で使
用されるように、用語「バンド」は、同様または同一の物理化学的特性に基づく
、被分析物の任意の空間的集団または凝集を含む。通常、バンドは、電気泳動に
よる色素−ポリヌクレオチド結合体の分離の際に生じる。

【００７３】ポリヌクレオチドのクラスは、種々の状況において生じ得る。本明細書中で「
フラグメント分析」法または「遺伝分析」法と呼ばれる方法の好ましいカテゴリ
ーにおいて、標識化ポリヌクレオチドフラグメントは、標識化プライマーまたは
ヌクレオチドを使用するテンプレート指向酵素的合成を通して、例えば、ライゲ
ーションまたはポリメラーゼ指向プライマー伸長によって生成され；このフラグ
メントは、サイズ依存分離プロセス（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィ
ー）に供され；そしてこの分離されたフラグメントは、その分離に続いて、例え
ば、レーザー誘発蛍光によって検出される。特に好ましい実施形態において、ポ
リヌクレオチドの複数のクラスは、同時に分離され、この異なるクラスはスペク
トル的に分解可能な標識によって区別される。

【００７４】増幅フラグメント長多型検出（ＡｍｐＦＬＰ）として公知の１つのこのような
フラグメント分析法は、増幅フラグメント長多型（すなわち、ＰＣＲ（Ｖｏｓ）
によって増幅される制限フラグメント長多型）に基づく。種々のサイズのこれら
の増幅されたフラグメントは、家系を通した変異体遺伝子に続く連結されたマー
カーとして作用する。増幅されたフラグメントが染色体の変異体遺伝子に接近す
るほど、結合部相関がより高くなる。多くの遺伝障害についての遺伝子が同定さ
れていないため、これらの結合部マーカーは、疾患危険性または父系（ｐａｔｅ
ｒｎｉｔｙ）の評価を補助するのに役立つ。ＡｍｐＦＬＰ技術において、ポリヌ
クレオチドは標識化ポリヌクレオチドＰＣＲプライマーを使用することによって
、またはＰＣＲの標識化ヌクレオチド三リン酸エステルを使用することによって
標識され得る。

【００７５】別の例示的なフラグメント分析方法は、可変数の縦列繰り返し、またはＶＮＴ
Ｒ（Ｗｅｂｂｅｒ；Ｃａｓｋｅｙ）に基づいている。ＶＮＴＲは、特定の配列の
隣接する複数のコピーを含み、繰り返し単位の数が可変である、二本鎖ＤＮＡの
領域である。ＶＮＴＲ座の例は、ｐＹＮＺ２２、ｐＭＣＴ１１８、およびＡｐｏ
Ｂである。ＶＮＴＲ方法のサブセットは、マイクロサテライト繰り返し、すなわ
ち、短い縦列繰り返し（ＳＴＲ）（すなわち、短く（２〜４塩基）繰り返された
配列によって特徴付けられるＤＮＡの縦列繰り返し）の検出に基づく方法である
。ヒトの最も豊富にある散在した繰り返しＤＮＡファミリーの１つは、（ｄＣ−
ｄＡ）ｎ−−（ｄＧ−ｄＴ）ｎジヌクレオチド反復ファミリー（（ＣＡ）ｎジヌ
クレオチド繰り返しファミリーとも呼ばれる）である。ヒトゲノム内に５０，０
００〜１００，０００（ＣＡ）ｎもの繰り返し領域が存在すると考えられ、代表
的には、１ブロックあたり１５〜３０の繰り返しを有する。これらの繰り返し領
域の多くは、長さが多型であり、それ故に有用な遺伝マーカーとして作用し得る
。好ましくは、ＶＮＴＲ法またはＳＴＲ法において、色素標識は、色素標識され
たＰＣＲプライマーを使用することによってポリヌクレチドフラグメント内に導
入される。

【００７６】特に好ましいフラグメント分析方法において、本発明に従って同定されたクラ
スは、末端ヌクレオチドに関して、４つの可能な末端塩基と一組のスペクトル的
に分解可能な色素（Ｆｕｎｇ１９８９）のメンバーとの間に一致が確立される
ように規定される。このような組は、市販の分光光度計を用いて発光帯域および
吸収帯域を測定することによって、本発明の色素から容易に組み立てられる。よ
り好ましくは、これらクラスはＤＮＡ配列決定の化学的方法または鎖終結方法の
状況において生じ、そして最も好ましくは、これらクラスは鎖終結方法（すなわ
ち、ジデオキシＤＮＡ配列決定、またはＳａｎｇｅｒ配列決定）の状況において
生じる。この方法は、配列が決定される一本鎖ＤＮＡテンプレートまたは二本鎖
ＤＮＡテンプレートを使用する、インビトロでのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮ
Ａ鎖の合成を含む。合成は、オリゴヌクレオチドプライマーがテンプレートをア
ニールする１つの部位のみにおいて開始される。この合成反応は、連続したＤＮ
Ａ伸長を支持しないヌクレオチドアナログの組み込みによって終結される。この
鎖終結ヌクレオチドアナログは、代表的には、３’→５’ＤＮＡ鎖伸長に必要な
３’−ＯＨ基を欠く２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’−三リン酸エステ
ル（ｄｄＮＴＰ）である。適切な割合のｄＮＴＰ（２’−デオキシヌクレオシド
５’−三リン酸エステル）および４つのｄｄＮＴＰの１つが使用される場合、ｄ
ｄＮＴＰが組み込まれ得る各部位において、酵素触媒重合が鎖の集団の画分で終
結される。標識化プライマーまたは標識化ｄｄＮＴＰが各反応に使用される場合
、配列情報は、高分解電気泳動による分離後、蛍光によって検出され得る。鎖終
結方法において、本発明の色素は配列決定プライマーまたはジデオキシヌクレオ
チドのいずれかに取りつけられ得る。

【００７７】上記フラグメント分析方法の各々において、標識化ポリヌクレオチドは好まし
くは、電気泳動手順（ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ；Ｏｓｔｅｒｍａｎ）
によって分離される。好ましくは、この型の電気泳動マトリクスは、約２〜２０
重量％の間の濃度（体積に対する重量）を有する架橋したポリアクリルアミドま
たは架橋していないポリアクリルアミドである。より好ましくは、ポリアクリル
アミド濃度は、約４〜８％の間である。好ましくは、ＤＮＡ配列決定の状況にお
いて、特に電気泳動マトリクスは、鎖分離剤または変性剤（例えば、尿素、ホル
ムアミドなど）を含む。このようなマトリクスを構成するための詳細な手順は、
（Ｍａｎｉａｔｉｓ１９８０；ＡＢＩＰＲＩＳＭ^TM ３７７ＤＮＡＳｅｑ
ｕｅｎｃｅｒＵｓｅｒ’ｓＭａｎｕａｌ）によって与えられる。特定の分離
において採用される最適ポリマー濃度、最適ｐＨ、最適温度、最適変性剤濃度な
どは、多くの因子に依存する。この因子としては、分離される核酸のサイズ範囲
、それらの塩基組成、それらが一本鎖かまたは二本鎖であるか、および情報が電
気泳動によって探求されるクラスの性質が挙げられる。従って、本発明の適用は
、特定の分離のための条件を最適化するために標準の予備試験を必要とし得る。

【００７８】電気泳動分離の後に、色素−ポリヌクレオチド結合体が、色素標識化ポリヌク
レオチドからの蛍光発光を測定することによって検出される。このような検出を
実施するために、標識化ポリヌクレオチドは標準的手段（例えば、高強度水銀蒸
気ランプ、レーザーなど）によって照射される。好ましくは、この照射手段は、
４８８ｎｍと５５０ｎｍとの間の波長の照射ビームを有するレーザーである。よ
り好ましくは、色素−ポリヌクレオチドは、アルゴンイオンレーザー、特にアル
ゴンイオンレーザーの４８８ｎｍ輝線および５１４ｎｍ輝線によって、またはネ
オジミウム固相状態ＹＡＧレーザーの５３２ｎｍ輝線によって生成されるレーザ
ー光によって照射される。これらの線で同時にレーザー光を発する幾つかのアル
ゴンイオンレーザーが、市販されている（例えば、Ｃｙｏｎｉｃｓ，Ｌｔｄ．（
Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆ）からのＭｏｄｅｌ２００１）。次いで、蛍
光は、光感知検出器（例えば、光増幅増倍管、電荷結合デバイスなど）によって
検出される。

【００７９】（Ｖ．実施例）本発明は、以下の実施例を考慮することによってさらに明らかにされ、これら
の実施例は、本発明を純粋に例示すること、および本発明の範囲をいかなる方法
においても限定しないことが意図される。全ての試薬は、他に指示されない限り
、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）か
ら購入した。無水３，６−ジクロロトリメリト酸を（Ｋｈａｎｎａ）によって記
載されるように調製した。

【００８０】（実施例１）（ｄＲ１３９の調製）

【００８１】

【化３３】ｍ−アミノフェノール（１２．６ｇｍ、０．１１５モル）および１，４−ジブ
ロモブタン（５０ｇｍ、０．２３モル）の溶液を、１３０℃まで１２時間加熱し
た。この混合物を室温まで冷却し、ジエチルエーテル、次いで酢酸エチルで粉砕
した。この残渣を酢酸エチルに溶解し、１ＭＮａＯＨ、水、および飽和ＮａＣ
ｌで抽出した。ＭｇＳＯ₄で有機層を乾燥し、濾過し、そして真空下で溶媒を除
去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、薄黄色の
固体を得た。この固体を５００ｍｌトルエンおよび１７ｍｌのトリエチルアミン
（０．１２モル）と共に１時間還流し、室温まで冷却し、水および飽和ＮａＣｌ
で洗浄した。この溶液を再びＭｇＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして真空下でエバ
ポレートし、３−ピロリジニルフェノールを白色固体として得た（６．０ｇｍ、
０．０３７モル、３２％）。

【００８２】３−ピロリジニルフェノール（１．６３ｇｍ、１０ｍｍｏｌ）、無水３，６−
ジクロロトリメリト酸（１．３ｇ、５ｍｍｏｌ）およびポリリン酸（５ｍＬ）の
混合物を１６０℃まで２時間加熱した。室温まで冷却した後、水（２０ｍｌ）を
加え、沈殿した生成物を濾過によって回収した。逆相ＨＰＬＣによる精製によっ
て、ｄＲ１３９（極大吸収波長５６８ｎｍ（メタノール）、（式Ｖ））の５カル
ボキシル異性体および６カルボキシル異性体を分離し、異性体１（０．３ｇｍ、
５％）および異性体２（０．６ｇｍ、１０％）を得た。

【００８３】（実施例２）（ｄＲ６５０の合成）

【００８４】

【化３４】４−ヒドロキシインドールを、シアノ水素化ホウ素ナトリウムおよび酢酸を用
いて還元し、４−ヒドロキシジヒドロインドールを得た。ヨウ化エチル（４０ｍ
ｌ）、炭酸カリウム（１．０９ｇｍ、７．８ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシジ
ヒドロインドール（１．０６ｇｍ、７．８ｍｍｏｌ）の混合物を２時間還流した
。過剰のヨウ化エチルを真空下でエバポレートし、水を加え（１０ｍｌ）、そし
て生成物をジクロロメタンで抽出した。シリカゲルクロマトグラフィーによって
、Ｎ−エチル−４−ヒドロキシ−ジヒドロインドール（０．３０ｇｍ、収率２３
％）を薄黄色固体として得た。

【００８５】Ｎ−エチル−４−ヒドロキシ−ジヒドロインドール（０．３０ｇｍ、１．８ｍ
ｍｏｌ）、無水３，６−ジクロロトリメリト酸（２３０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）
およびポリリン酸無水物（ＰＰＡ）（５ｇ）の混合物を１８０℃まで２．５時間
加熱した。室温まで冷却後、この固体をＮａＯＨ水溶液（１Ｍ、７．５ｍｌ）に
溶解した。この生成物をＨＣｌ水溶液（２Ｍ、７．５ｍｌ）で沈殿させた。この
固体を、濾過によって回収し、逆相ＨＰＬＣによって精製し、ｄＲ６５０（極大
発光波長６３３ｎｍ（８Ｍ尿素）、極大吸収波長６１４ｎｍ（８Ｍ尿素）、（式
ＩＩＩ））を得た。これらの異性体の５カルボキシル基および６カルボキシル基
の位置化学について帰属しなかった。異性体１（５３ｍｇ、５％）および異性体
２（１０５ｍｇ、１０％）は逆相ＨＰＬＣにより分離可能であった。

【００８６】（実施例３）（ｄＪＯＮの合成）

【００８７】

【化３５】６−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン（１．４９ｇｍ、１
０ｍｍｏｌ）、無水３，６−ジクロロトリメリト酸（１．３ｇ、５ｍｍｏｌ）お
よびメタンスルホン酸（２ｍｌ）の混合物を１６０℃まで６時間加熱した。室温
まで冷却した後、水（２０ｍｌ）を加え、この沈殿生成物を濾過によって回収し
た。逆相ＨＰＬＣによる精製によって、ｄＪＯＮ（極大吸収波長５５７ｎｍ（メ
タノール）、（式ＩＩ））の５カルボキシル異性体および６カルボキシル異性体
を分離し、異性体１（２７０ｍｇ、５％）および異性体２（５５０ｍｇ、１０％
）を得た。

【００８８】（実施例４）（式ＶＩの合成）

【００８９】

【化３６】２ｍｌのジクロロメタン中の塩化Ｏ−フルオロ−ベンゾイル（１．５９ｇｍ、
１０ｍｍｏｌ）の溶液を、氷浴中で冷却した５ｍｌのジクロロメタンおよびトリ
エチルアミン（１．０１ｇｍ、１ｍｍｏｌ）中のｍ−Ｎ−メチルアミノフェノー
ル（１．２３ｇｍ、１０ｍｍｏｌ）に滴下した。この反応溶液を室温まで１時間
にわたって昇温させた。この混合物をジクロロメタンで希釈し、水および飽和Ｎ
ａＣｌで抽出し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして真空下でエバポレートし
た。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、Ｎ−メチル
，Ｎ−（ｍ−ヒドロキシフェニル）−Ｏ−フルオロ−ベンズアミドを白色泡状物
（１．２ｇｍ、５ｍｍｏｌ、５０％）として得た。

【００９０】水素化ナトリウム（２００ｍｇ、油中６０％分散、５０ｍｍｏｌ）を１０ｍｌ
のジメチルホルムアミド中のアミド（１．２ｇｍ、５ｍｍｏｌ）に周囲の温度で
加えた。次いで、この混合物を２時間加熱還流し、室温まで冷却した。溶媒を真
空下でエバポレートし、５ｍｌの塩酸（２Ｍ）を加えた。この混合物を酢酸エチ
ルで２回抽出した。この合わせた酢酸エチル抽出物を水および飽和ＮａＣｌで洗
浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして減圧下でエバポレートした。この粗
生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、環化した三環式アミド
を白色固体として得た（０．５６ｇｍ、２．５ｍｍｏｌ、５０％）。

【００９１】ジメチルスルフィド／ボラン錯体（３．７５ｍｌ、７．５ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中
２Ｍ）を、氷浴中で冷却した１０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン中の三環式アミ
ド（０．５６ｇｍ、２．５ｍｍｏｌ）に滴下した。この混合物を１時間還流し、
氷浴中で冷却し、１０ｍｌのメタノールをゆっくり滴下した。溶媒を真空下でエ
バポレートし、より多くのメタノールを加え、そして真空下で徹底してエバポレ
ーションを繰り返した。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって
精製し、白色固体として三環式アミンを得た（４００ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ、７
６％）。

【００９２】

【化３７】この三環式アミン（４００ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）、無水３，６−ジクロロト
リメリト酸（２４８ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）およびポリリン酸（１ｇ）の混合
物を１８０℃まで２時間加熱した。室温まで冷却後、この固体をＮａＯＨ水溶液
（１Ｍ、７．５ｍｌ）に溶解した。この生成物をＨＣｌ水溶液（２Ｍ、７．５ｍ
ｌ）で沈殿させた。この固体を濾過によって回収し、逆相ＨＰＬＣによって精製
し、色素（極大吸収波長６３８ｎｍ）を得た。これらの異性体の５カルボキシル
基および６カルボキシル基の位置化学について、帰属しなかった。異性体１（３
２ｍｇ、５％）および異性体２（６５ｍｇ、１０％）を逆相ＨＰＬＣによって分
離可能であった。

【００９３】（実施例５）（ｄＲ１３９標識化ジデオキシアデノシン三リン酸エステル、式ＶＩＩＩの調
製）ｄｄＡＴＰ−ＮＨ₂（５μＬ、２０ｍＭ、０．１μｍｏｌ）（Ｈｏｂｂｓ１９
８９、１９９２）、ｄＲ１３９−ＮＨＳ（０．１５μｍｏｌ）および２５０ｍＭ
炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９（５μＬ）の溶液を混合した。室温で１０分
放置した後、この溶液をアニオン交換カラムを有するＨＰＬＣに供し、４０％ア
セトニトリル／６０％０．１Ｍトリエチルアンモニウム炭酸水素塩から４０％ア
セトニトリル／６０％１．５Ｍトリエチルアンモニウム炭酸水素塩の勾配で溶出
して、遊離色素を除去した。色素標識化ヌクレオチドおよび標識していないヌク
レオチドを含む画分を真空遠心で濃縮し、逆相カラムを使用する第２のＨＰＬＣ
に供した。標識されていないヌクレオチドおよび色素標識化ヌクレオチドの各色
素異性体を、１５％アセトニトリル／８５％０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢
酸塩から３５％アセトニトリル／６５％０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸塩
の溶出勾配を使用して分離した。色素標識化ヌクレオチドを含有する溶液を真空
遠心で濃縮し、１０ｍＭの炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９に再溶解し、ＵＶ
／可視分光光度計中の溶液の吸光度を測定することによって定量した。収率はお
よそ１％であった。

【００９４】（実施例６）（色素標識化オリゴヌクレオチドの調製、式ＸＩ）５’−アミノヘキシル官能基化オリゴヌクレオチド（１０μＬ、１ｍＭ）およ
びｄＲ１３９−ＮＨＳ（１０μＬ、メチルスルホキシド中１２ｍＭ）の溶液およ
び炭酸塩／炭酸水素塩（２μＬ、１Ｍ）緩衝液を合わせた。このアミノヘキシル
誘導体化プライマーを自動化固相ＤＮＡ合成によって、その合成の最後のサイク
ルにおいてＡｍｉｎｏｌｉｎｋ−２を使用して調製した（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ）。室温で１０分放置した後、この溶液をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５によ
るゲル濾過に供し、遊離の色素を分離した。色素標識化オリゴヌクレオチドおよ
び標識していないオリゴヌクレオチドを含有する画分を回収し、逆相カラムによ
るＨＰＬＣ精製に供した。標識されていないオリゴヌクレオチドおよび色素標識
化オリゴヌクレオチドの各色素異性体を、１０％アセトニトリル／８５％０．１
Ｍトリエチルアンモニウム酢酸塩から３０％アセトニトリル／６５％０．１Ｍト
リエチルアンモニウム酢酸塩の溶出勾配を使用して分離した。色素標識化オリゴ
ヌクレオチドを含有する溶液を真空遠心で濃縮し、１０ｍＭＴｒｉｓ，１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０（ＴＥ）を含有する緩衝液に再溶解した。

【００９５】（実施例７）（本発明の４，７−ジクロロローダミンジデオキシヌクレオチドターミネータ
ーを利用する配列決定反応）色素ターミネーター反応をＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ
、ＦＳを用いて、ＡＢＩＰＲＩＳＭ^TMＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃ
ｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＣｏｒｅＫｉｔＭａｎｕａｌ（ＰＥＢｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）の基本プロトコルに従って、実施した。（このＦＳ酵素は、２
点変異、すなわちＧ４６ＤおよびＦ６６７Ｙを有する組換えサームス属水生ＤＮ
Ａポリメラーゼである）。ｄＮＴＰ混合物および色素ターミネーターを除く全て
の試薬は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ^TMＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ
ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＣｏｒｅＫｉｔ（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から
得た。反応成分の予備混合物を以下のように調製し、ここで容量は１反応に基づ
いている：

【００９６】

【化３８】反応物をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃ
ｌｅｒ（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の０．５ｍｌチューブに調整した。全反
応物容量は、２０μｌであり、これは、１５μｌの上記反応予備混合物、適切な
量の色素標識化ターミネーター、および水を含む。色素ターミネーター反応物を
、ＡおよびＧターミネーターについての１ｐｍｏｌの色素ターミネーター、また
はＣおよびＴターミネーターについての１５ｐｍｏｌの色素ターミネーターのい
ずれかを用いて、本発明の色素を用いて、調整した。幾つかの場合において、Ｃ
またはＴについての色素ターミネーターは、５μＬが１５ｐｍｏｌ未満の色素タ
ーミネーターを生じるように、非常に低い濃度であった。これらの場合において
、５μｌの色素ターミネーターが使用され、水をこの反応物に加えなかった。３
０μＬの鉱油を各反応容量の上部に加え、サーモサイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃ
ｙｃｌｉｎｇ）の間の蒸発を軽減した。反応物を以下の２５サイクルをサーモサ
イクルした：３０秒間９６℃、１５秒間５０℃、４分間６０℃；次いで４℃で保
持するサイクル。

【００９７】全ての反応物をＣｅｎｔｉ−Ｓｅｐスピンカラム（ＰｒｉｎｃｅｔｏｎＳｅ
ｐａｒａｔｉｏｎ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、ＮＪ）によるスピン−カラム精製によっ
て精製した。カラム内のゲル材料を０．８ｍＬの脱イオン水を用いて、室温で少
なくとも３０分間水和した。このカラムを水和した後、ゲル材料内に気泡が捕捉
されていないことが明らかであり、上端キャップ、次いで下端キャップを取り外
した。このカラムを重力によって排水した。次いで、カラムをＣｅｎｔｉ−Ｓｅ
ｐキット内に設けられた洗浄チューブ内に挿入し、可変速度ミクロ遠心分離器（
ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭｏｄｅｌ５４１５）中で１３００×ｇで２分間遠心分
離した。カラムを洗浄チューブから取り外し、サンプル回収チューブ内に挿入し
た。この反応混合物をガラスピペットを使用して油下から慎重に除き、Ｃｅｎｔ
ｉ−Ｓｅｐカラムの上部に充填した。カラムを２分間遠心分離した。サンプルを
真空遠心下で乾燥した。

【００９８】この乾燥させたサンプルを２５μｌのＴｅｍｐｌａｔｅＳｕｐｐｒｅｓｓｉ
ｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に再懸濁し、撹拌し、
９５℃まで２分間加熱し、氷上で冷却し、再び撹拌し、そして遠心分離（１３，
０００×ｇ）した。１０μｌの精製したサンプルを、ＰＥＡＢＩＰＲＩＳＭ ^TM ３１０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を
用いる使用に適応したサンプルバイアル内に等分した。Ｍｏｄｅｌ３１０によ
る電気泳動は、６１ｃｍ長で、５０ｃｍの検出器に対する長さを有する５０μｍ
内径の非コート溶融シリカキャピラリーを使用する。このキャピラリーを線形ジ
メチルポリアクリルアミド（ＤＭＡ）ふるい分けポリマー（Ｍａｄａｂｈｕｓｈ
ｉ）、緩衝液、および核酸変性剤（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する溶
液で充填した。サンプルを、３０秒間、２．５ｋＶにおいて、動電学的に注入し
た。電気泳動を、４２℃に維持したキャピラリー温度で、２時間１２．２ｋＶに
おいて実施した。

【００９９】全ての刊行物および特許出願は、本明細書中において、各々の個々の刊行物ま
たは特許出願が特別にかつ個々に参考として援用されるように指示されるのと同
程度に、参考として援用される。

【０１００】幾つかの実施形態のみが上記において詳細に記載されたが、有機化学分野の当
業者は、多くの改変が、それらの教示から逸脱することなく好ましい実施形態に
おいて可能であることを明らかに理解する。全てのこのような改変は、前述の特
許請求の範囲内に包含されることが意図される。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１月１６日（２００２．１．１６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【化１】を有する化合物であって、ここで：Ｒ₇〜Ｒ₁₀、Ｒ₁₂〜Ｒ₁₆、およびＲ₁₈は、水素、フッ素、塩素、メチル、エチ
ル、Ｃ₁〜Ｃ₈アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₈アルケン、Ｃ₁〜Ｃ₈アルキン、シクロアルキル
、フェニル、アリール、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、
Ｃ₁〜Ｃ₈アルコキシ、連結基、もしくはそれらの組み合わせからなる群から独立
して選択され、そして／またはＲ₇、Ｒ₈、Ｒ₁₃およびＲ₁₄は共に、酸素、硫黄、
イミニウム、およびアルキルイミニウムからなる群から選択され；Ｒ₁₁およびＲ₁₇は、水素、低級アルキル、アルキルスルホネート、アルキルカ
ルボキシレート、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、ア
リール、連結基、またはそれらの組み合わせからなる群から独立して選択され；
そしてＸ₁〜Ｘ₃は、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、アミン、アミド、カルボキ
シレート、スルホネート、ヒドロキシメチル、および連結基からなる群から独立
して選択される、化合物。

【化２】を有する化合物であって、ここで：Ｒ₇〜Ｒ₁₀、Ｒ₁₂は、水素、フッ素、塩素、メチル、エチル、低級アルキル、
低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、スルホネ
ート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、連結基、または
それらの組み合わせからなる群から独立して選択され；そしてＲ₁₁は、水素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル
、フェニル、アリール、連結基、またはそれらの組み合わせからなる群から独立
して選択される、化合物。

【化３】を有する標識化ヌクレオチドであって、ここで：Ｄは、請求項１に記載の色素化合物であり；Ｂは、７−デアザプリンヌクレオチド塩基、プリンヌクレオチド塩基、または
ピリミジンヌクレオチド塩基であり；Ｗ₁およびＷ₂は、ＨおよびＯＨからなる群から独立して選択され；Ｗ₃は、ＯＨ、ＯＰＯ₃、ＯＰ₂Ｏ₆、ＯＰ₃Ｏ₉、およびそれらのアナログからな
る群から選択され；ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部位は、プリンま
たはデアザプリンのＮ⁹−位置で結合され、そしてＢがピリミジンである場合、
該糖部位は、ピリミジンのＮ¹−位置で結合され；ＢとＤとを連結する結合部が、Ｒ₁〜Ｒ₁₈またはＸ₁〜Ｘ₃の位置の１つでＤに
結合され；そしてここで、Ｂがプリンである場合、該結合部は、該プリンの８−位置に結合され
、Ｂが７−デアザプリンである場合、該結合部は、該７−デアザプリンの７−位
置に結合され、そしてＢがピリミジンである場合、該結合部は、該ピリミジンの
５−位置に結合される、標識化ヌクレオチド。

【化４】である、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。

【化５】である、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。

【化６】である、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。

【化７】である、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。

【化８】である、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。

【化９】である、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。

【化１０】を有するヌクレオチドを含む、標識化ポリヌクレオチドであって、ここで：Ｄは、請求項１に記載の色素化合物であり；Ｂは、７−デアザプリンヌクレオチド塩基、プリンヌクレオチド塩基、または
ピリミジンヌクレオチド塩基であり；Ｚ₁は、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；Ｚ₂は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰＯ₃およびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、Ｎ
ｕｃは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり；そしてＮ
ｕｃおよびＤに結合した該ヌクレオシドは、ホスホジエステル結合またはそのア
ナログによって連結され、該結合は、該Ｎｕｃの５’−位置に結合し；Ｚ₃は、Ｈ、ＰＯ₃、ホスフェートアナログおよびＮｕｃからなる群から選択さ
れ、ここで、ＮｕｃおよびＤに結合した該ヌクレオシドは、ホスホジエステル結
合またはそのアナログによって連結され、該結合は、該Ｎｕｃの３’−位置に結
合され；ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部位は、該プリン
またはデアザプリンのＮ⁹−位置で結合され、そしてＢがピリミジンである場合
、該糖部位は、該ピリミジンのＮ¹−位置で結合され；ＢとＤとを連結する結合部が、Ｒ₁〜Ｒ₁₈またはＸ₁〜Ｘ₃の位置の１つでＤに
結合され；そしてここで、Ｂがプリンである場合、該結合部は、該プリンの８−位置に結合され
、Ｂが７−デアザプリンである場合、該結合部は、該７−デアザプリンの７−位
置に結合され、そしてＢがピリミジンである場合、該結合部は、該ピリミジンの
５−位置に結合される、標識化ポリヌクレオチド。

【化１１】である、請求項２６に記載の標識化ポリヌクレオチド。

【化１２】である、請求項２６に記載の標識化ポリヌクレオチド。

【化１３】である、請求項２６に記載の標識化ポリヌクレオチド。

【化１４】である、請求項２６に記載の標識化ポリヌクレオチド。

【化１５】である、請求項２６に記載の標識化ポリヌクレオチド。

【化１６】である、請求項２６に記載の標識化ポリヌクレオチド。

【請求項３５】４，７−ジクロロローダミン色素との結合によって共有結合されるポリヌクレオチドを含む、色素標識化ポリヌクレオチドであって、ここで、該結合は、該ポリヌクレオチドの５’末端に結合され、そして該４，７−ジクロロローダミン色素は、以下の構造：

【化１００】から選択され、ここで、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃、Ｒ₁₄、Ｒ₁₅、Ｒ₁₆、およびＲ₁₈は、水素
、フッ素、塩素、メチル、エチル、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、および結合部から独立して選択され；そしてＲ₁₁およびＲ₁₇は、水素、低級アルキル、アルキルスルホネート、アルキルカルボキシレート、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、および結合部から独立して選択される、色素標識化ポリヌクレオチド。

【請求項３６】Ｘ₁がカルボキシレートである、請求項３５に記載の色素
標識化ポリヌクレオチド。

【請求項３７】Ｘ₁がスルホネートである、請求項３５に記載の色素標識
化ポリヌクレオチド。

【請求項３８】Ｘ₂およびＸ₃の１つが結合部である、請求項３５に記載の色素標識化ポリヌクレオチド。

【請求項３９】Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃、Ｒ₁₄、Ｒ₁₅、およびＲ₁₈が
水素である、請求項３５に記載の色素標識化ポリヌクレオチド。

【請求項４０】Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₁₃、およびＲ₁₄がメチルである、請求項３５に記載の色素標識化ポリヌクレオチド。

【請求項４１】前記結合部が、Ｘ₂およびＸ₃から選択される１つの位置において結合される、請求項３５に記載の色素標識化ポリヌクレオチド。

【請求項４２】前記結合部が、Ｒ₁₁およびＲ₁₇から選択される１つの位置において結合される、請求項３５に記載の色素標識化ポリヌクレオチド。

【請求項４３】ドナー色素およびアクセプター色素を含む、請求項３５に記載の色素標識化ポリヌクレオチドであって、該ドナー色素および該アクセプター色素の少なくとも１つが、蛍光エネルギー移動が該ドナー色素と該アクセプター色素との間で起こるように配置される、４，７−ジクロロローダミン色素である、色素標識化ポリヌクレオチド。

【請求項４４】前記結合部が、アミノヘキシル結合である、請求項３５に記載の色素標識化ポリヌクレオチド。

【請求項４５】ポリヌクレオチドを標識する方法であって、該方法は、連結基を有する４，７−ジクロロローダミン色素と５’末端に相補的官能基を有するポリヌクレオチドとを組合せる工程を包含し、ここで、該４，７−ジクロロローダミンは、以下の構造：

【化１０１】から選択され、ここで、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃、Ｒ₁₄、Ｒ₁₅、Ｒ₁₆、およびＲ₁₈は、水素
、フッ素、塩素、メチル、エチル、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、および連結基から独立して選択され；Ｒ₁₁およびＲ₁₇は、水素、低級アルキル、アルキルスルホネート、アルキルカルボキシレート、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、および連結基から独立して選択され；そしてＸ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、アミン、アミ
ド、カルボキシレート、スルホネート、ヒドロキシメチル、および連結基から独立して選択され、ただし、該４，７−ジクロロローダミン色素が、少なくとも１つの連結基を含み、これにより、４，７−ジクロロローダミン色素−５’標識化ポリヌクレオチドが形成される、方法。

【請求項４６】前記相補的官能基がアミンである、請求項４５に記載の方法。

【請求項４７】前記連結基が、ＮＨＳエステルである、請求項４５に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ４Ｈ０５６Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ベンソン，スコットシー．アメリカ合衆国カリフォルニア 94611，オークランド，ファラロンウェイ 6490 (72)発明者ローゼンブルム，バーネットビー．アメリカ合衆国カリフォルニア 95118，サンノゼ，エステルアベニュー 1521 (72)発明者スパージェオン，サンドラエル．アメリカ合衆国カリフォルニア 94403，サンマテオ，ロスプラドスストリート 3361 (72)発明者グラハム，ロナルドジェイ．アメリカ合衆国カリフォルニア 94583，サンレイモン，エルスーヨドライブ 3240 Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 FB02 FB07 FB12 4B063 QA01 QA13 QQ42 QR08 QR42 QR58 QS34 QX02 4C034 CF01 4C050 AA01 AA08 BB07 CC07 DD08 EE02 FF05 GG01 HH01 4H050 AA01 AB92 4H056 BA02 BB05 BB14 BC02 BD05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の式：【化１】を有する化合物であって、ここで：Ｒ₇〜Ｒ₁₀、Ｒ₁₂〜Ｒ₁₆、およびＲ₁₈は、水素、フッ素、塩素、メチル、エチ
ル、Ｃ₁〜Ｃ₈アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₈アルケン、Ｃ₁〜Ｃ₈アルキン、シクロアルキル
、フェニル、アリール、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、
Ｃ₁〜Ｃ₈アルコキシ、連結基、もしくはそれらの組み合わせからなる群から独立
して選択され、そして／またはＲ₇、Ｒ₈、Ｒ₁₃およびＲ₁₄は共に、酸素、硫黄、
イミニウム、およびアルキルイミニウムからなる群から選択され；Ｒ₁₁およびＲ₁₇は、水素、低級アルキル、アルキルスルホネート、アルキルカ
ルボキシレート、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、ア
リール、連結基、またはそれらの組み合わせからなる群から独立して選択され；
そしてＸ₁〜Ｘ₃は、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、アミン、アミド、カルボキ
シレート、スルホネート、ヒドロキシメチル、および連結基からなる群から独立
して選択される、化合物。
【請求項２】Ｘ₁がカルボキシレートである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】Ｘ₁がスルホネートである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】Ｘ₂およびＸ₃の１つが連結基である、請求項１に記載の化合
物。
【請求項５】Ｒ₇〜Ｒ₉、Ｒ₁₂〜Ｒ₁₅、およびＲ₁₈が水素である、請求項１
に記載の化合物。
【請求項６】Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₁₃、およびＲ₁₄がメチルである、請求項１に記
載の化合物。
【請求項７】Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₁₃、およびＲ₁₄が共に、酸素、硫黄、イミニウ
ム、およびアルキルイミニウムからなる群から選択される、請求項１に記載の化
合物。
【請求項８】Ｒ₁₁およびＲ₁₇がメチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】Ｒ₁₁およびＲ₁₇がフェニルである、請求項１に記載の化合物
。
【請求項１０】以下の式：【化２】を有する化合物であって、ここで：Ｒ₇〜Ｒ₁₀、Ｒ₁₂は、水素、フッ素、塩素、メチル、エチル、低級アルキル、
低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、スルホネ
ート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、連結基、または
それらの組み合わせからなる群から独立して選択され；そしてＲ₁₁は、水素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル
、フェニル、アリール、連結基、またはそれらの組み合わせからなる群から独立
して選択される、化合物。
【請求項１１】Ｒ₇〜Ｒ₉、およびＲ₁₂が水素である、請求項１０に記載の
化合物。
【請求項１２】Ｒ₇およびＲ₈がメチルである、請求項１０に記載の化合物
。
【請求項１３】Ｒ₁₁がメチルである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１４】Ｒ₁₁がフェニルである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１５】以下の式：【化３】を有する標識化ヌクレオチドであって、ここで：Ｄは、請求項１に記載の色素化合物であり；Ｂは、７−デアザプリンヌクレオチド塩基、プリンヌクレオチド塩基、または
ピリミジンヌクレオチド塩基であり；Ｗ₁およびＷ₂は、ＨおよびＯＨからなる群から独立して選択され；Ｗ₃は、ＯＨ、ＯＰＯ₃、ＯＰ₂Ｏ₆、ＯＰ₃Ｏ₉、およびそれらのアナログからな
る群から選択され；ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部位は、プリンま
たはデアザプリンのＮ⁹−位置で結合され、そしてＢがピリミジンである場合、
該糖部位は、ピリミジンのＮ¹−位置で結合され；ＢとＤとを連結する結合部が、Ｒ₁〜Ｒ₁₈またはＸ₁〜Ｘ₃の位置の１つでＤに
結合され；そしてここで、Ｂがプリンである場合、該結合部は、該プリンの８−位置に結合され
、Ｂが７−デアザプリンである場合、該結合部は、該７−デアザプリンの７−位
置に結合され、そしてＢがピリミジンである場合、該結合部は、該ピリミジンの
５−位置に結合される、標識化ヌクレオチド。
【請求項１６】Ｂがウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザ
グアノシンからなる群から選択される、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド
。
【請求項１７】前記結合部が、以下：【化４】である、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項１８】前記結合部が、以下：【化５】である、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項１９】前記結合部が、以下：【化６】である、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項２０】前記結合部が、以下：【化７】である、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項２１】前記結合部が、以下：【化８】である、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項２２】前記結合部が、以下：【化９】である、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項２３】Ｗ₁およびＷ₂の両方がＨであり；そしてＷ₃がＯＰ₃Ｏ₉で
ある、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項２４】Ｗ₁がＨであり；Ｗ₂がＯＨであり；そしてＷ₃がＯＰ₃Ｏ₉
である、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項２５】ＢとＤとを連結する結合部が、Ｘ₂またはＸ₃の位置の１つ
でＤに結合される、請求項１５に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項２６】以下の式：【化１０】を有するヌクレオチドを含む、標識化ポリヌクレオチドであって、ここで：Ｄは、請求項１に記載の色素化合物であり；Ｂは、７−デアザプリンヌクレオチド塩基、プリンヌクレオチド塩基、または
ピリミジンヌクレオチド塩基であり；Ｚ₁は、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；Ｚ₂は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰＯ₃およびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、Ｎ
ｕｃは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり；そしてＮ
ｕｃおよびＤに結合した該ヌクレオシドは、ホスホジエステル結合またはそのア
ナログによって連結され、該結合は、該Ｎｕｃの５’−位置に結合し；Ｚ₃は、Ｈ、ＰＯ₃、ホスフェートアナログおよびＮｕｃからなる群から選択さ
れ、ここで、ＮｕｃおよびＤに結合した該ヌクレオシドは、ホスホジエステル結
合またはそのアナログによって連結され、該結合は、該Ｎｕｃの３’−位置に結
合され；ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部位は、該プリン
またはデアザプリンのＮ⁹−位置で結合され、そしてＢがピリミジンである場合
、該糖部位は、該ピリミジンのＮ¹−位置で結合され；ＢとＤとを連結する結合部が、Ｒ₁〜Ｒ₁₈またはＸ₁〜Ｘ₃の位置の１つでＤに
結合され；そしてここで、Ｂがプリンである場合、該結合部は、該プリンの８−位置に結合され
、Ｂが７−デアザプリンである場合、該結合部は、該７−デアザプリンの７−位
置に結合され、そしてＢがピリミジンである場合、該結合部は、該ピリミジンの
５−位置に結合される、標識化ヌクレオチド。
【請求項２７】Ｂがウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザ
グアノシンからなる群から選択される、請求項２６に記載の標識化ヌクレオチド
。
【請求項２８】前記結合部が、以下：【化１１】である、請求項２６に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項２９】前記結合部が、以下：【化１２】である、請求項２６に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項３０】前記結合部が、以下：【化１３】である、請求項２６に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項３１】前記結合部が、以下：【化１４】である、請求項２６に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項３２】前記結合部が、以下：【化１５】である、請求項２６に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項３３】前記結合部が、以下：【化１６】である、請求項２６に記載の標識化ヌクレオチド。
【請求項３４】以下の工程を包含する、ポリヌクレオチド配列決定の方法
であって、該方法は：以下のようなポリヌクレオチドの第１クラス、第２クラス、第３クラス、およ
び第４クラスの混合物を形成する工程であって：該第１クラスの各ポリヌクレオチドが３’−末端ジデオキシアデノシンを含
み、そして第１色素で標識されており；該第２クラスの各ポリヌクレオチドが３’−末端ジデオキシシチジンを含み
、そして第２色素で標識されており；該第３クラスの各ポリヌクレオチドが３’−末端ジデオキシグアノシンを含
み、そして第３色素で標識されており；そして該第４クラスの各ポリヌクレオチドが３’−末端ジデオキシチミジンを含み
、そして第４色素で標識されており；ここで、該第１色素、第２色素、第３色素、第４色素の１つが、請求項１に
記載の４，７−ジクロロローダミン色素であり；他の色素は、４，７−ジクロロローダミン色素および互いからスペクトル分
析可能である、工程；該ポリヌクレオチドを電気泳動で分離する工程であって、これにより、類似し
た大きさのポリヌクレオチドのバンドを形成する、工程；該色素を蛍光発光させ得る、照射ビームでバンドを照射する、工程；および該色素の蛍光スペクトルによって、該バンドで該ポリヌクレオチドのクラスを
同定する、工程、を包含する、方法。