JP2002534086A - 治療用ホスホジエステラーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この特許は、ホスホジエステラーゼ4をコードする遺伝子の発現を阻害することを目的とする一連の新規治療用オリゴヌクレオチドポリマーの発明について記載する。それらは、個々のPDEアイソフォームを検討する際の分析ツールとして有用であり、抑うつ、血栓、嚢胞性線維症、胃病変、肺高血圧症、緑内障、多発性硬化症、アトピー性皮膚炎、喘息および他のアレルギー性疾患並びにサイクリックAMPの増加またはホスホジエステラーゼ濃度の低下が有用である他の疾患を治療薬により治療する際に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 [技術分野] 酵素ホスホジエステラーゼ(PDE)は、アデニル酸シクラーゼおよびグアニル酸
シクラーゼと共に細胞のサイクリックAMPおよびサイクリックGMPの適正なバラン
スを維持することを担う酵素である。多数の別個のホスホジエステラーゼ（PDE1
〜PDE9）が存在し、そのほとんどは、細胞分布、cAMPまたはcGMPの加水分解に対
する特異性、種々の化合物による選択的な阻害並びにカルシウム、カルモジュリ
ン、cAMPおよびcGMPによる調節に対する特異性が異なることがある2つ以上のア
イソザイム変種またはスプライス変種として存在する(J. A. Beavo in Cyclic N
ucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action. Mul
tiple Phosphodiesterase Isozymes: Background, Nomenclature, and Implicat
ions. Eds. Beavo, J. and Houslay, M. D., John Wiley and Son, New York, 1
990, pp. 3-15 and T. J. Torphy et al., "Novel Phosphodiesterases Inhibit
ors for the Therapy of Asthma", Drug News & Prospective, 6(4) May 1993,
pp. 203-214)。cAMPに特異的であるPDE4ファミリーは少なくとも4つのアイソザ
イム変種(a〜d)および多数のスプライス変種を含む（Houslay, M. D., et al. i
n Advances in Pharmacology 44, Eds. J. August et al., p.225, 1998）。総
合的には、細胞特異的パターンにおいて発現される、数多くのプロモーターによ
って調節される20を超えるPDE4アイソフォームが存在することができる。

【０００２】 PDE4は、脳および主要な炎症細胞に存在し、アトピー性皮膚炎または湿疹、喘
息および枯草熱を含む数多くの疾患において異常に高い濃度で見出されている（
AST1 Connections, Vol. 8#1(1996)p. 3 and J. of Allergy and Clinical Immu
nology 70: 452-457, 1982）。選択的PDE4阻害剤が求められた疾患状態には、喘
息、アトピー性皮膚炎、抑うつ、再灌流傷害、敗血症性ショック、内毒素性ショ
ック、成人呼吸窮迫症候群、自己免疫性糖尿病、尿崩症、多発梗塞性痴呆、AIDS
、癌、クローン病、多発性硬化症、脳虚血、乾癬、同種移植片拒絶、再狭窄、潰
瘍性大腸炎、悪液質、大脳マラリア、アレルギー性鼻・結膜炎、骨関節炎、リウ
マチ性関節炎、慢性気管支炎、好酸性肉芽種および自己免疫性脳脊髄炎が挙げら
れる(Houslay et al., 1998)。アトピー性疾患に罹患している患者では、患者の
末梢血単核白血球、T細胞、肥満細胞、好中球および好塩基球において、高いPDE
4活性を検出することができる。この増加したPDE活性は、cAMP濃度を低下し、こ
れらの細胞におけるcAMPコントロールをくずし、罹患している個体の血液および
組織における免疫応答が増加する。

【０００３】 PDE阻害剤は多数の機能的経路に影響し、多数の免疫経路および炎症性経路に
作用し、数多くの免疫媒介物質の合成または放出に影響する(J. M. Hanifin and
S. C. Chan, "Atopic Dermatitis-Therapeutic Implication for New Phoaphod
iesterase Inhibitors, Monocyte Dysregulation of T Cells" in AACI News, 7
/2, 1995; J. M. Hanifin et al., "Type 4 Phosphodiesterase Inhibitors Hav
e Clinical and In Vitro Anti-inflammatory Effects in Atopic Dermatitis,"
J. of Invest. Der., 1996, 107: 51-56 and Cohen, V. L. in INC's 7th Annu
al Conference on Asthma and Allergy(Oct. 27-28, 1997)-Phosphodiesterase
4 Inhibitors: Second Generation and Beyond)。PDE4阻害剤が臨床的に使用さ
れることにより、喘息と、アトピー性皮膚炎および枯草熱を含む他のアレルギー
との疾患モデルにおいて、強烈な活性を有する広域スペクトルの抗炎症剤である
ことが示された。臨床で使用されているPDE4阻害剤にはテオフィリン、ロリプラ
ム(rolipram)、デンブフィリン(denbufylline)、CDP 840(トリアリールエタン)
およびCP80633（ピリミドン）が挙げられる。PDE4阻害剤は好酸球応答に影響し
、好塩基球ヒスタミン放出を低下し、IgE、PGE2およびIL10合成を低下し、抗CD3
刺激性IL4産生を低下することが示されている。

【０００４】 これまでに開発されたPDE4阻害剤の全ては、中枢神経系作用および消化管作用
を示す小型分子化合物であった。第1世代のPDE4阻害剤はPDE4活性を低下し、こ
の酵素の過剰発現によって生じる数多くの炎症性問題を改善する際に有効であっ
たが、それらの有効性は機序に関連する副作用によって制限されており、吐き気
および嘔吐のためにそれらのどれも全身的に使用することができない(ASTI Conn
ections, Vol. 8#1(1996)p.3 and Hanifin reference and Cohen, V. L. in INC
's 7th Annual Conference on Asthma and Allergy(Oct. 27-28, 1997)-Phophod
iesterase 4 Inhibitors: Second Generation and Beyond)。

【０００５】 オリゴヌクレオチド治療、すなわち特定の遺伝子の発現を調節するためのオリ
ゴマーの使用は、多くの伝統的な治療の望ましくない非特定的毒性作用を生じる
ことなく、遺伝子の発現を選択的に改変する機会を提供している。アンチセンス
オリゴヌクレオチドの使用は多数の疾患を治療する強力な新規方法として登場し
た。これまでの多数の研究は抗ウィルス剤または抗癌剤としてのアンチセンスオ
リゴヌクレオチドの使用に焦点を絞っている(Wickstrom, E., Ed., Prospects f
or Antisence Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, New York: Wilcy-Li
ss, 1991; Crooke, S. T., and Lebleu, B., Eds., Antisence Research and Ap
plications. Boca Raton: CRC Press, 1993, pp. 154-182; Baserga, R., and D
enhardt, D. T., 1992, Antisense Strategies, New York: The New York Acade
my of Sciences, Vol. 660; Murray, J. A. H., Ed., Antisense RNA and DNA,
New York: Wiley-Liss, 1993, Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
5: 7079-7083(1988), Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143
-4146(1986))。

【０００６】 有効であるが、現在のPDE4阻害剤の副作用を持たない、PDE4を調節する治療薬
を開発する必要性がある。従って、PDE4を特異的に調節し、生物学的に有効であ
り、無毒性の治療薬が必要である。

【０００７】 [発明の概要] 本発明は、インビボまたはインビトロにおいてPDE4活性を調節する際に使用す
るための、末端をブロックした(end-blocked)酸抵抗性核酸ポリマー、例えば末
端をブロックした(end-blocked)2'-O-アルキルおよび2'-O-アルキル-n(O-アルキ
ル)オリゴヌクレオチドを提供する。これらのPDE4ポリマーは低いpHにおいて、
実質的な安定性と、ヌクレアーゼ分解に対する実質的な抵抗性と、インビボおよ
びインビトロにおける結合特異性を示す。これらのポリマーのヌクレオチドはリ
ボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドであってもよく、PDE4
の発現に関与するDNA配列（例えば、コード配列、プロモーター配列、エンハン
サー配列等）またはPDE4mRNAをターゲットとすることができる。これらの低毒性
で、高い特異性を有し、酸安定性である末端をブロックした(end-blocked)ポリ
マーは、PDE4媒介性疾患の治療薬による治療のための改善された核酸構造である
。3'、5'または3'および5'酸安定性で、ヌクレアーゼ抵抗性末端は、ヌクレアー
ゼ抵抗性を増加することによって改善された生物学的に有効性（bioavailabilit
y)を提供する。

【０００８】 本発明はまた、本発明のポリマーを含む製薬学的組成物を提供する。これらの
製薬学的組成物は任意の製薬学的に許容されうる担体を含んでもよい。製薬学的
組成物は、補助剤、安定化剤、フィラー等などの添加剤を含んでもよい。

【０００９】 本発明はまた、PDE4をターゲットとする治療的に有効な量のポリマーでこのよ
うな治療を必要としている患者を治療する方法を提供する。好ましい具体例にお
いて、本発明は、異なるPDE4アイソザイムをコードするmRNAsをターゲットとす
る一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーを提供する。PDE4Dをターゲ
ットとするオリゴヌクレオチドの治療の有効性は、本明細書において、予備的な
ヒトでの臨床試験のデータを使用して証明される。

【００１０】 本発明はまた、1つ以上のオリゴヌクレオチドポリマーを患者に投与するステ
ップを含む、1つ以上のPDE4酵素の活性を低下する方法を含む。好ましくは、オ
リゴヌクレオチドはPDE4をコードするmRNAをターゲットとする。

【００１１】 酸安定性末端が酸性環境（例えば、pHが1〜2の胃）において、修飾された核酸
に安定性の改善を与え、それによってインビボにおいてポリマーの生物学的有効
性（バイオアベイラビリティー：bioavailability）を増加するのは本発明のポ
リマーの利点である。

【００１２】 それらがインビボおよびインビトロにおいてPDE4ターゲット配列に特異的に結
合するのは本発明のポリマーの別の利点である。

【００１３】 末端をブロック化した核酸が、修飾された核酸で治療した被験者に無毒性であ
ることは本発明の別の利点である。本発明の修飾された核酸、例えば2'-O-アル
キルおよび2'-O-アルキル-n(O-アルキル)末端-ブロック化オリゴヌクレオチドは
、通常のポリアニオンオリゴヌクレオチドの治療的投与によって通常生じる、血
清および他の蛋白質への結合の増加、血清アミノ基転移酵素の刺激、血小板数の
減少等などの副作用を示さない。

【００１４】 酸安定性末端が、リポソーム小胞のマクロファージおよび好中球中での酸性環
境において、PDE4オリゴヌクレオチドに安定性の改善を提供するのはさらに別の
利点である。

【００１５】 本発明のPDE4オリゴヌクレオチドが帯電したリポソームに容易に封入されるの
はさらに別の利点である。

【００１６】 PDE4ポリマーが低い毒性である、すなわち本発明のPDE4オリゴヌクレオチドで
非経口的に治療したマウスが400 mg/ml以下のLD₅₀を示すことはさらに別の利点
である。

【００１７】 本発明のこれらの目的および他の目的、利点および特徴は、以下にさらに詳細
に記載する本発明の核酸およびその用途の詳細を読むと当業者に明らかになる。

【００１８】 [好ましい例の詳細な説明] 本発明を記載する前に、本発明は記載されている特定の方法、プロトコール、
細胞系統、動物種または属、構築物および試薬に限定されず、従って当然のこと
であるが変更することが可能であることを理解されるべきである。また、本明細
書において使用する用語は特定の具体例を説明する目的だけのためであり、添付
の請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図のものではな
いことも理解されるべきである。

【００１９】 本明細書および添付の請求の範囲において、単数形「a」、「and」および「th
e」は、内容がそうでないことを明らかに記載していない限り、複数のものを含
むことが注目されるべきである。従って、例えば「構築物」の言及は複数のこの
ような構築物を含み、「オリゴヌクレオチド」の言及は1つ以上のオリゴヌクレ
オチドおよび当業者に周知のその等価物等への言及を含む。

【００２０】 そうでないことを規定しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語
および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されるものと同
じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または等価な任意の方法、装置
および材料を本発明を実施または試験する際に使用することができるが、好まし
い方法、装置および材料を本明細書において記載する。

【００２１】 本明細書において記載される全ての刊行物は、本明細書において記載される発
明に関連して使用してもよい、刊行物に記載されている、例えば、細胞系統、構
築物および方法を記載および開示する目的のために参照することで本明細書の一
部をなすものとする。上記および本文中に論ぜられている刊行物は、本願の提出
日以前にそれらの開示内容が単に提供されているだけのものである。発明者が従
来の発明によってなされたこのような開示より先行するという権利を得ないこと
を自認すると解釈されるべきものは本明細書にはない。

【００２２】 本明細書において論ぜられる刊行物は、本願の提出日以前にその開示のためだ
けに提供されている。本発明が従来の発明によってこのような刊行物より先行す
るという権利を得ないことを自認すると解釈されるべきものは本明細書にはない
。さらに、提供される刊行物の刊行日は、個々に確認する必要がある場合もある
実際の刊行日と異なる場合もある。

【００２３】 [定義] 本明細書において交換可能として使用される「核酸」および「核酸分子」とい
う用語は、ヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチ
ドまたは両方を含む分子をいう。この用語はリボヌクレオチドおよびデオキシリ
ボヌクレオチドのモノマーおよびポリマーを含み、リボヌクレオチドおよび/ま
たはデオキシリボヌクレオチドは、ポリマーの場合は5'から3'への結合を介して
互いに結合される。しかし、結合は、例えば5'から2'への結合を含む核酸を含む
核酸合成分野に周知の結合のいずれを含んでもよい。核酸分子に使用されるヌク
レオチドは天然に存在しても、または天然に存在する塩基対と塩基対関係を形成
することができる合成によって製造される類似物であってもよい。塩基対関係を
形成することができる非天然型塩基の例には、アザおよびデアザピリミジン類似
物、アザおよびデアザプリン類似物並びにプリンおよびピリミジン環の炭素およ
び窒素原子の1つ以上が酸素、硫黄、セレン、リン等のようなヘテロ原子によっ
て置換された他のヘテロ環状塩基類似物が挙げられるが、それらに限定されない
。

【００２４】 本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、約1〜約1
00個のヌクレオチド、さらに好ましくは1〜80個のヌクレオチド、よりさらに好
ましくは約4〜約35ヌクレオチドを含む核酸分子をいう。本明細書において使用
される「オリゴヌクレオチドポリマー」という用語は、約1〜約100個のヌクレオ
チド、さらに好ましくは約1〜80個のヌクレオチド、よりさらに好ましくは約4〜
約35ヌクレオチドを有する本明細書のポリマーをいう。

【００２５】 本明細書において使用される「PDE4オリゴヌクレオチド」という用語は、PDE4
発現または活性に影響を与える配列をターゲットにするオリゴヌクレオチドをい
う。これらには、PDE4DNAコード配列、PDE4DNAプロモーター配列、PDE4DNAエン
ハンサー配列、PDE4をコードするmRNA等が挙げられるが、それらに限定されない
。

【００２６】 本明細書において使用される「修飾されたオリゴヌクレオチド」および「修飾
された核酸分子」という用語は、核酸塩基、糖部分、ヌクレオシド間リン酸結合
およびジアミン、コレステリルまたは他の親油性基などの付加置換基を有する分
子の全てまたはいずれかの天然分子構造の分子レベルでの1つ以上の化学的修飾
、またはこれらの部位の修飾の組み合わせを有するオリゴヌクレオチドを含む核
酸をいう。ヌクレオシド間リン酸結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステ
ル、ホスホールアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエス
テル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホーアルアミ
デート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート
、ホスホロジチオネート、架橋ホスホロチオエートおよび/またはスルホンイン
ターヌクレオチド結合または3'-3'、5'-2'もしくは5'-5'結合、並びに（混合骨
格修飾オリゴヌクレオチドを生じる）このような同様の結合の組み合わせであっ
てもよい。修飾はオリゴヌクレオチド分子の内部（1つまたは反復）または末端
部であってもよく、コレステリル、アミノ基と末端リボースとの間の種々の数の
炭素を有するジアミン化合物、対向鎖または関連酵素または他の蛋白質に切断ま
たは架橋するデオキシリボースおよびリン酸修飾などの、ヌクレオシド間リン酸
結合の分子への付加を含んでもよい。リボース-ジアルデヒドなどの求電子基は
、蛋白質などのリジル残基のεアミノ基に共有結合すると思われる。オリゴマー
に結合するn-エチルマレイミドなどの求核基は、mRNAの5'側末端または別の求電
子部位に共有結合すると思われる。修飾されたオリゴヌクレオチドという用語は
、そのいずれもが5'〜3'結合を介して共に結合する、2'-置換リボヌクレオチド
またはデオキシリボヌクレオチドモノマーなどの糖部分の修飾を含むオリゴヌク
レオチドも含む。修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、配列のターゲット特異
性が維持されるRNAまたはモルホリノ修飾の骨格を含んでもよい。

【００２７】 本明細書において使用される「核酸骨格（nucleic acid backbone) 」という
用語は、分子中でヌクレオチドを結合する化学的部分の構造をいう。これは、化
学的に結合しているヌクレオチドのいずれかおよび全ての手段から形成される構
造を含んでもよい。本明細書において使用される修飾された骨格は、ヌクレオチ
ド間の化学結合の修飾、並びに安定性および親和性を増強するために使用するこ
とができる、糖構造の修飾などの他の修飾を含む。例えば、塩基が天然のbアノ
マーに対して逆転しているデオキシリボースのaアノマーを使用することができ
る。好ましい具体例において、糖基の2'-OHを、親和性を含むことなく、分解に
抵抗する2'-O-アルキルまたは2'-O-アルキルn(O-アルキル)に変更することがで
きる。

【００２８】 本明細書において交換可能として使用される「酸性化（acidification)」およ
び「プロトン付加されたまたは酸性化」という用語は、核酸のプロトン受容部位
にプロトン（または正の水素イオン）を添加する過程をいう。プロトン受容部位
には核酸の塩基構造のアミン基およびホスホジエステル結合のリン酸が挙げられ
る。pHが低下すると、プロトン付加されるこれらのアクセプター部位の数は増加
して、核酸はより高くプロトン付加または酸性化される。

【００２９】 「プロトン付加された核酸または酸性化された核酸」という用語は、約16 A_{26 0} /mlの濃度で水に溶解したとき、生理的なpHより低いpH、すなわち約pH7より低
いpHを有する核酸をいう。修飾された核酸、ヌクレアーゼ抵抗性核酸およびアン
チセンス核酸はこの定義に含まれると意味される。一般に、核酸の反応性部位に
プロトンを付加することによって核酸をプロトン付加または酸性化するが、核酸
のpHを低下する他の修飾を使用することもでき、この用語によってふくまれるこ
とが意図される。

【００３０】 本明細書において使用される「末端をブロック化した（end-blocked)」という
用語は、例えばヌクレアーゼ作用による選択したヌクレオチドの分解を防止する
分子レベルでの化学的修飾を有する核酸をいう。化学的修飾が核酸の必須部分、
例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドのコード領域を保護するように、この化
学的修飾は位置付けされる。末端ブロックは3'末端ブロックまたは5'末端ブロッ
クであってもよい。例えば、3'末端ブロックは分子の最も3'-側の位置であって
も、または3'末端の内側であってもよいが、ただし、それは核酸の必須配列の3'
側である。

【００３１】 「実質的にヌクレアーゼ抵抗性である」という用語は、天然に存在する核酸ま
たは未修飾の核酸と比較したとき、ヌクレアーゼ分解に抵抗性である核酸をいう
。本発明の修飾された核酸は、未修飾のものと比較して少なくとも1.25倍ヌクレ
アーゼ分解に対する抵抗性が大きく、さらに好ましくは少なくとも2倍抵抗性が
大きく、よりさらに好ましくは少なくとも5倍抵抗性が大きく、最も好ましくは
未修飾のものと比較して少なくとも10倍抵抗性が大きい。このような実質的にヌ
クレアーゼ抵抗性である核酸には、2'-ハロゲン、2'-O-メチル、2'-O-アルキル
、2'-O-アルキル-n(O-アルキル)、3'-ハロゲン、3'-O-アルキル、3'-O-アルキル
-n(O-アルキル)、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホール
アミデート結合、シロキサン結合、カルボネート結合、カルボキシメチルエステ
ル結合、アセトアミデート結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、架橋ホ
スホーアルアミデート結合、架橋メチレンホスホネート結合、ホスホロチオエー
ト結合、メチルホスホネート結合、ホスホロジチオネート結合、モルホリノ、架
橋ホスホロチオエート結合、スルホンインターヌクレオチド結合、3'-3'結合、5
'-2'結合、5'-5'結合、2'-デオキシ-エリスロペントフラノシル、2'-フルオロ、
2'-O-アルキルヌクレオチド、2'-O-アルキル-n(O-アルキル)ホスホジエステル、
モルホリノ結合、p-エトキシオリゴヌクレオチド、PNA結合、p-イソプロピルオ
リゴヌクレオチドまたはホスホールアミデート、スルフィド結合、スルホキシド
結合、スルファメート結合、スルファミド結合、ホルムアセタール/ケタール結
合、チオホルムアセタール結合、キラルリン結合、アミノアルキルホスホロチオ
アミデートおよび4残基結合またはこれらの骨格のキメラ変種を有する核酸が挙
げられるが、それらに限定されない。

【００３２】 本明細書において使用される「実質的に酸抵抗性である(substantially acid
resistant)」という用語は、未修飾の核酸と比較したとき、酸分解に対して抵抗
性である核酸をいう。典型的には、核酸の相対的な酸抵抗性は、抵抗性核酸の分
解の割合を未修飾のもの（すなわち、「通常の」骨格、塩基およびホスホジエス
テル結合を有する対応する核酸）の分解の割合と比較することによって測定され
る。抵抗性である核酸は、好ましくは、未修飾のものと比較して、酸分解に対し
て少なくとも1.5倍抵抗性が大きく、少なくとも2倍抵抗性が大きく、よりさらに
好ましくは少なくとも5倍抵抗性が大きく、最も好ましくは少なくとも10倍抵抗
性が大きい。

【００３３】 本明細書において使用される「ポリマー」という用語は、1)修飾された核酸骨
格および2)分子の末端部分または末端付近の少なくとも1つの末端ブロックを有
する核酸またはオリゴヌクレオチド分子をいう。

【００３４】 本明細書において使用される「LD₅₀」という用語は、処理した全ての実験動物
において50パーセント致死にいたる作用物質の用量である。これは、通常、経口
、非経口等などの侵襲的投与をいうが、作用物質の局所適用などの侵襲性の低い
投与方法を使用して毒性点まで適用することもできる。

【００３５】 本明細書において使用される「アルキル」という用語は、メチル、エチル、プ
ロピル、tert-ブチル、n-ヘキシル等などの1-6炭素原子を含有する分岐または未
分岐の飽和炭化水素をいう。

【００３６】 本明細書において使用される「感受性」という用語は、関心のある核酸、すな
わちPDE4に相補的なオリゴヌクレオチドのような結合パートナーによる核酸の認
識の相対的な強度をいう。関心のある配列に対する結合パートナーの認識は、背
景配列の認識より有意に大きくなければならず、好ましくは結合パートナーの認
識の強度は背景蛋白質の認識より少なくとも10倍、さらに好ましくは少なくとも
100倍大きく、よりさらに好ましくは少なくとも500倍大きくなければならない。

【００３７】 本明細書において使用される「選択性」という用語は、特定の核酸配列に対す
る結合パートナーの優先的な結合をいう。好ましくは、選択的な結合パートナー
は少なくとも10倍、さらに好ましくは100倍、よりさらに好ましくは1000倍任意
の他の背景配列と比較して指定されたポリヌクレオチド配列に結合しやすい。

【００３８】 「治療」、「治療用の」等の用語は、一般に、望ましい薬理学的および/また
は生理学的影響を得ることを意味するために本明細書において使用される。この
影響は、疾患またはその症状を完全または部分的に予防するということに関して
は予防的であってもよく、および/または疾患および/または疾患に寄与する有害
な影響の部分的または完全な治癒に関しては治療的であってもよい。本明細書に
おいて使用される「治療」は、哺乳類、特にヒトの疾患の任意の治療を含み、 (a)疾患の素因を有する可能性があるが、疾患に罹患しているとまだ診断されて
いない被験者において疾患が生じることを予防すること、 (b)疾患を阻止、すなわち疾患の発症を停止すること、 (c)疾患を軽減、すなわち疾患の寛解を生ずること を含む。本発明は、一般に、内因性遺伝子の発現をインビボにおいて調節する核
酸配列を投与することによって、患者を治療することに関する。

【００３９】 「治療的に有効な」量は、無毒性であるが、望ましい治療的影響を提供するの
に十分な量の化合物を意味し、本願の場合には、その用量の修飾された核酸が治
療される状態または疾患の症状の軽減、改善または予防に有効である。

【００４０】 [発明の一般的な態様] アンチセンスの概念は十分に発展されており、数多くの異なるアンチセンス治
療薬が臨床試験に導入され、臨床試験を終了している。アンチセンス治療化合物
は、特定の蛋白質をコードするmRNAに相補的で、好ましくはヌクレアーゼ抵抗性
であるオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に
、ターゲットとされる遺伝子の転写または翻訳を妨害し、それによってターゲッ
トとされる遺伝子の発現を低下する。アンチセンスの場合に可能である特異性の
大きさのために、副作用はあったとしてもかなり少ない。

【００４１】 好ましい具体例において、本発明は、実質的にヌクレアーゼ抵抗性である中性
またはプロトン付加されたオリゴヌクレオチドポリマーまたは酸性化オリゴヌク
レオチドポリマーを使用する。この具体例は、ホスホールチオエート結合、2'-
デオキシ-エリスロペントフラノシル、2'-フルオロ、2'-O-アルキルまたは2'-ア
ルキル-n(O-アルキル)ホスホジエステル、p-エトキシオリゴヌクレオチド、p-イ
ソプロピルオリゴヌクレオチド、ホスホールアミデート、キメラ結合および任意
の他の骨格修飾によって完全または部分的に誘導化されるオリゴヌクレオチドポ
リマーを含む。この具体例はまた、オリゴヌクレオチドポリマーを内因性ヌクレ
アーゼ活性に対して実質的に抵抗性を有するようにする他の修飾も含む。オリゴ
ヌクレオチドポリマーをヌクレアーゼ抵抗性にする別の方法には、オリゴヌクレ
オチドポリマーを含むプリンまたはピリミジン塩基を共有結合により修飾するこ
とが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、修飾された塩基を含むオリ
ゴヌクレオチドポリマーを実質的にヌクレアーゼ抵抗性を有するように、塩基を
メチル化、ヒドロキシルメチル化することができ、またはそれ以外に置換しても
よい。

【００４２】 本発明のオリゴヌクレオチドポリマーのエキソヌクレアーゼ抵抗性を増強する
ために、核酸配列の3'側および/または5'側末端は、好ましくは、エキソヌクレ
アーゼブロック官能基に結合される。例えば、オリゴヌクレオチドのどちらかの
末端に1つ以上のホスホチオエートヌクレオチドを配置してもよい。また、オリ
ゴヌクレオチドポリマーのどちらかの末端に1つ以上の逆塩基を配置してもよく
、または1つ以上のアルキル部分、例えばブタノール置換ヌクレオチドまたは化
学基をオリゴヌクレオチドポリマーの1つ以上の末端に配置してもよい。5'側ブ
ロック基および3'側ブロック基は1つ以上のホスホールチオエートヌクレオチド
（典型的には6未満）、逆塩基結合またはアルキル、アルケニルまたはアルキニ
ル基または置換ヌクレオチドまたは2'-O-アルキル-n(O-アルキル)を含んでもよ
い。ブロック基の掲載の一部には、逆塩基、ジデオキシヌクレオチド、メチルホ
スフェート、アルキル基、アルコール基、アリール基、コルジセビン、シトシン
アラバノシド、2'-メトキシエトキシヌクレオチド、ホスホールアミデート、ペ
プチド結合、ジニトロフェニル基、ホスホロチオエート結合を有する2'または3'
-O-メチル塩基、3'-O-メチル塩基、フルオレセイン、コレステロール、ビオチン
、アクリジン、ローダミン、ソラーレン、グリセリル、メチルホスホネート、ヘ
キサ-エチルオキシ-グリコール、ブタノール、ヘキサノールおよび3'-O-アルキ
ルが挙げられる。酵素-抵抗性ブタノールは、好ましくは、C4スペーサーとも呼
ばれる構造OH-CH₂CH₂CH₂CH₂(4-ヒドロキシブチル)を有する。

【００４３】 典型的には、核酸の相対的ヌクレアーゼ抵抗性は、抵抗性核酸の消化の割合を
未修飾のもの（すなわち、「通常の」骨格、塩基およびホスホジエステル結合を
有する対応する核酸）の消化の割合と比較することによって、測定することがで
きる。分解の割合は、全長の核酸の損失を評価するための分析HPLCを使用するこ
とによって、または任意の他の好適な方法によって（例えば、染色、オートラジ
オグラフィー、蛍光等を使用して逐次ゲル上の産物を可視化することによって、
または光学密度のシフトを測定することによって）測定することができる。分解
は、一般に、時間の関数として測定される。

【００４４】 未修飾核酸と修飾核酸の比較は、無傷の未修飾核酸の割合に対する無傷の修飾
核酸の割合を判定することによって実施することができる。例えば、ヌクレアー
ゼに15分間暴露後に、未修飾核酸の25%(すなわち、75%分解)が無傷であり、修飾
核酸の50%（すなわち、50%分解）が無傷である場合には、修飾核酸は、未修飾核
酸より2倍（50%を25%で割る）ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性であるといわれ
る。一般に、実質的にヌクレアーゼ抵抗性である核酸は、15分間のヌクレアーゼ
暴露後に、対応する配列を有する未修飾核酸と比較して、ヌクレアーゼ分解に対
して少なくとも約1.25倍抵抗性が大きく、典型的には少なくとも約1.5倍抵抗性
が大きく、好ましくは約2倍抵抗性が大きく、さらに好ましくは少なくとも約5倍
抵抗性が大きく、よりさらに好ましくは少なくとも約10倍抵抗性が大きい。

【００４５】 酸分解の割合は、全長の核酸の損失を評価するための分析HPLCを使用すること
によって、または任意の他の好適な方法によって（例えば、染色、オートラジオ
グラフィー、蛍光等を使用して逐次ゲル上の産物を可視化することによって、ま
たは光学密度のシフトを測定することによって）測定することができる。分解は
、一般に、時間の関数として測定される。

【００４６】 未修飾核酸と修飾核酸の比較は、完全な（inatact)未修飾核酸の割合に対する
完全な修飾核酸の割合を判定することによって実施することができる。例えば、
低いpH環境に30分間暴露後に、未修飾核酸の25%(すなわち、75%分解)が完全であ
り、修飾核酸の50%（すなわち、50%分解）が完全である場合には、修飾核酸は、
未修飾核酸より2倍（50%を25%で割る）ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性である
といわれる。一般に、実質的に「酸抵抗性である」核酸は、37℃における約1.5
〜約4.5のpHへの30分間の暴露後に、対応する配列を有する未修飾核酸と比較し
て、酸分解に対して少なくとも約1.25倍抵抗性が大きく、典型的には少なくとも
約1.5倍抵抗性が大きく、好ましくは約1.75倍抵抗性が大きく、さらに好ましく
は少なくとも約5倍抵抗性が大きく、よりさらに好ましくは少なくとも約10倍抵
抗性が大きい。

【００４７】 核酸の酸性化はプロトン（または水素原子）を核酸の反応性部位に付加する過
程である。pHが低下すると、プロトン付加される反応性部位の数は増加し、核酸
はさらに高度にプロトン付加または酸性化される。核酸のpHが低下すると、その
細菌阻止作用が増加する。従って、本発明の核酸は、水に溶解されたとき、pH7
未満〜pH 1、好ましい具体例ではpH 6〜約1またはpH 5〜約1のpHを与えるように
プロトン付加または酸性化される。他の好ましい具体例において、溶解された核
酸はpH 4.5〜約1のpHを有し、好ましい具体例では、4.0〜約1のpHを有し、より
好ましい具体例では、pH 3.0〜約1のpHを有し、別の好ましい具体例では、2.0〜
約1のpHを有する。

【００４８】 本発明の第1の態様は、適当なPDE4mRNA(s)の1つ以上にハイブリダイゼーショ
ンすることをターゲットとする1つ以上のオリゴヌクレオチドポリマーの治療的
に有効な量を投与するステップを含むこのような治療を必要としている患者を治
療する方法である。第2の態様では、本発明は、適当なPDE4mRNA(s)の1つ以上に
ハイブリダイゼーションすることをターゲットとする1つ以上のオリゴヌクレオ
チドポリマーの、PDE4酵素の1つ以上の発現を低下するのに効果的な量を投与す
るステップを含む、このような治療を必要としている患者を治療する方法である
。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは製薬学的に許容されうる担体
に含有される。ターゲットとされるPDE4遺伝子配列は、PDE4遺伝子、それらのア
イソザイム変種およびそれらのスプライス変種からなる群から選択される。

【００４９】 本発明の方法および組成物は、個々のPDEアイソフォームを検討する際の分析
ツールとしておよび治療薬による治療の際に有用である。本発明の方法および組
成物は、喘息、枯草熱、アトピー性皮膚炎、抑うつ、再灌流傷害、敗血症性ショ
ック、毒性ショック、内毒素性ショック、成人呼吸窮迫症候群、自己免疫性糖尿
病、尿崩症、多発梗塞性痴呆、AIDS、癌、クローン病、多発性硬化症、脳虚血、
乾癬、同種移植片拒絶、再狭窄、潰瘍性大腸炎、悪液質、大脳マラリア、アレル
ギー性鼻-結膜炎、骨関節炎、リウマチ性関節炎、慢性気管支炎、好酸性肉芽種
および自己免疫性脳脊髄炎を含む種々の疾患または障害を治療するのに有用であ
る。本発明の特定の具体例は上記の疾患の治療に関する。

【００５０】 必要に応じて、本明細書に記載するオリゴヌクレオチドポリマーは、種々の生
理学的担体分子を用いて製剤化することができる。本明細書に記載するオリゴヌ
クレオチドポリマーはまた、ターゲット細胞に流入する能力を増強する分子で複
合体化することもできる。このような分子の例には、炭水化物、ポリアミン、ア
ミノ酸、ペプチド、脂質および細胞増殖に必須の分子が挙げられるが、それらに
限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドポリマーは脂質と組み合わせること
ができ、得られるオリゴヌクレオチドポリマー/脂質エマルジョンまたはリポソ
ーム懸濁液はオリゴヌクレオチドポリマーのインビボにおける半減期を特に効果
的に増加することができる。陽イオン、陰イオンおよび/または中性脂質組成物
またはリポソームは、一般に、参照することで本明細書の一部をなすものとする
国際公開公報第90/14074号、国際公開公報第91/16024号、国際公開公報第91/174
24号、特許番号第4,897,355号に記載されている。

【００５１】 または、PDEターゲットに向かうオリゴヌクレオチドポリマーはまたホスホジ
エステラーゼ阻害剤および抗菌剤として二重の役割において機能するようにプロ
トン付加または酸性化することもできる。従って、本明細書に記載する発明の別
の具体例は、細胞の取り込みを増加し、リポソームへの封入を改善するようにさ
らにプロトン付加または酸性化されるPDE調節作用を有する治療用オリゴヌクレ
オチドポリマーの用途であり、結果としてそれはまた抗生物質として作用するこ
とができる。

【００５２】 また、オリゴヌクレオチドポリマーは、例えば、オリゴヌクレオチドポリマー
のインビボ安定性をさらに増強し、またはそれ以外には薬理学的特性（例えば、
インビボにおける半減期の延長、毒性の低下等）を増強する種々の十分に確立さ
れている化合物または構造と複合体化することができる。

【００５３】アンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーの選択 アンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーは、遺伝子またはmRNA転写物の特定
の機能的ドメインをターゲットとすることができる。可能なターゲットには、調
節領域、5'側非翻訳領域、翻訳開始部位、翻訳停止部位、3'側非翻訳領域、エク
ソン/イントロン境界およびスプライス部位並びにコード領域内部の配列が挙げ
られるが、それらに限定されない。

【００５４】 ターゲット遺伝子内のターゲットドメインを選択する際の第1のステップとし
て、ターゲット遺伝子、プレ-mRNAまたはmRNAをターゲット配列内のホモポリマ
ーラン（列中の4以上の塩基）の存在について検討する。

【００５５】 ターゲット遺伝子を選択し、ホモポリマーランにマーキングし、ターゲットド
メインを同定したら、そのドメイン内のプレ-mRNA、mRNAまたはDNA配列の領域を
分析する。可能なアンチセンスターゲット部位の上流および下流の約5〜100塩基
延在する配列セグメントの分析を実施する。安定と思われる二次構造の位置を20
℃より高い予測された融点を有するステム-ループ構造と規定する。MacのOLIGO
4.0またはOligo Techなどの市販のソフトウェアーを使用してこの分析を実施す
ることができる。ループ-ステム二次構造形成のためのステムハイブリダイゼー
ションに関与する配列を二次構造の一部と考え、アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドポリマーを分析および選択する目的のための構造単位として取り扱う。このタ
ーゲット選択技法の一具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドポリマ
ーは（市販の分析プログラムにより）100℃より低い予測された二次構造融点を
有する遺伝子、プレ-mRNAまたはmRNAの配列をターゲットとすることができる。
好ましい具体例において、二次構造融点は60℃より低くてもよい。さらに別の好
ましい具体例において、二次構造融点は40℃より低くてもよい。最も好ましい具
体例において、二次構造融点は20℃より低くてもよい。

【００５６】 安定なループ構造を有するまたは安定なダイマーを形成するオリゴヌクレオチ
ドポリマー配列は避けるべきである。このターゲット選択技法の一具体例におい
て、（市販の分析プログラムにより）100℃より低い予測二次構造融点を有する
アンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーを選択する。好ましい具体例において
、二次構造融点は80℃より低くてもよい。さらに好ましい具体例において、二次
構造融点は60℃より低くてもよい。さらに別の好ましい具体例において、二次構
造融点は40℃より低くてもよい。最も好ましい具体例において、二次構造融点は
20℃より低くてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーによる安定な
二次または三次構造の形成は、ターゲットDNAまたはターゲットRNAに結合する能
力によりおそらく完了されうる。同様に、アンチセンスオリゴヌクレオチドポリ
マーによるホモダイマーの形成は、ターゲットDNAまたはターゲットRNAに結合す
る能力により完了しうる。1塩基のホモダイマーランは、理想的には、オリゴヌ
クレオチドポリマー配列内では3塩基以下である。一般に、ターゲット内では、
最も低い二次構造融点（ループTm）を有する、または二次構造を持たない配列が
最も良好に作用する。

【００５７】 本発明の組成物としておよび本発明の方法において有用なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドポリマーの配列は以下を含む。 ターゲット遺伝子 （配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）46） ターゲットドメイン アンチセンスオリゴヌクレオチド配列 （ヌクレオチド 位置#S)

【化１】

【００５８】 ターゲット遺伝子 （配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）47） ターゲットドメイン アンチセンスオリゴヌクレオチド配列 （ヌクレオチド 位置#S)

【化２】

【００５９】 ターゲット遺伝子 （配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）48） ターゲットドメイン アンチセンスオリゴヌクレオチド配列 （ヌクレオチド 位置#S)

【化３】

【００６０】 ターゲット遺伝子 （配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）49） ターゲットドメイン アンチセンスオリゴヌクレオチド配列 （ヌクレオチド 位置#S)

【化４】

【００６１】 ターゲット遺伝子 （配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）50） ターゲットドメイン アンチセンスオリゴヌクレオチド配列 （ヌクレオチド 位置#S)

【化５】

【００６２】 ターゲット遺伝子 （配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）51） ターゲットドメイン アンチセンスオリゴヌクレオチド配列 （ヌクレオチド 位置#S)

【化６】

【００６３】オリゴヌクレオチドポリマーのインビボ試験 疾患の治療薬による治療に使用する場合には、アンチセンスPDEオリゴヌクレ
オチドポリマーまたはその混合物の適当な用量はいくつかの十分に確立されてい
る方法のいずれかによって決定することができる。例えば、生体作用薬の体重1k
gあたりの最大耐性用量またはMTDを決定するために動物の研究を通常使用する。
一般に、試験する動物種の少なくとも1つは哺乳類である。当業者は、通常、ヒ
トを含む他の種に対する有効性のため、および毒性を回避するために用量を外挿
する。また、治療用量は、疾患の重症度および宿主のサイズまたは種に応じて異
なってもよい。

【００６４】 オリゴヌクレオチドポリマーは、好ましくは、経口、鼻腔内、直腸、局所、腹
腔内、筋肉内、皮下、頭蓋内、真皮下、経皮、気管内方法等を介して製薬学的に
許容されうる担体中で投与される。

【００６５】 例えば、局所疾患は、好ましくは、局所適用用に設計された製剤によって治療
または予防される。または、ターゲットとされる疾患状態が胃または腸内にある
場合には、オリゴヌクレオチドポリマーの製剤は経口投与によって提供すること
ができる。また、喘息のような肺部位の疾患は、非経口および吸入治療による肺
への好適に製剤化された形態のオリゴヌクレオチドポリマーを直接適用により治
療することができる。

【００６６】 好適に製剤化されたオリゴヌクレオチドポリマーを非経口的に投与する場合に
は、オリゴヌクレオチドポリマーは腎臓、肝臓、脾臓、リンパ腺、副腎、大動脈
、膵臓、骨髄、心臓および唾液腺に比較的高い濃度に蓄積することがある。オリ
ゴヌクレオチドポリマーはまた、骨格筋、膀胱、胃、食道、十二指腸、脂肪およ
び気管にはわずかにしか蓄積しない傾向もある。典型的には、大脳皮質、脳幹、
小脳、脊髄、軟骨、皮膚、甲状腺および前立腺にはさらに低い濃度しか見出され
ない（一般に、Crooke, 1993, Antisense Research and Applications, CRC Pre
ss, Boca Raton, FL）。

【００６７】 当業者は、医療従事者または患者の点から、望ましくない症状の実質的に任意
の改善または予防が望ましいと考える。従って、本明細書において使用される「
治療」、「治療的用途」または「医療用用途」という用語は、疾患状態または症
状を治療するまたはそれ以外には疾患または他の望ましくない症状の進行をいか
なるようにも予防、妨害、遅延または回復する主張されているオリゴヌクレオチ
ドポリマーの任意の用途および全ての用途をいう。

【００６８】 好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドポリマーを使用して治療することが
できる動物宿主には、無脊椎動物、脊椎動物、鳥類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ
、イヌ、ネコおよび特にヒトなどの哺乳類が挙げられるが、それらに限定されな
い。オリゴヌクレオチドポリマーは、治療される特定の動物に適当であるように
設計される。

【００６９】 本明細書に記載する発明の別の具体例は、さらにプロトン付加または酸性化さ
れる治療用オリゴヌクレオチドポリマーの用途であり、その結果、それは抗生物
質としても作用することができる。精製された核酸または粗核酸は、リン酸、硝
酸、塩酸、酢酸等を含む酸でプロトン付加または酸性化することができる。例え
ば、酸を核酸溶液と合わせてもよく、または核酸を酸性溶液に溶解してもよい。
過剰の酸はクロマトグラフィーによって、またはある場合には、核酸を乾燥する
ことによって除去することができる。

【００７０】 当業者に周知のプロトン付加された核酸を製造するための他の方法は本発明の
範囲内であると等しく考えられる。本発明の核酸をプロトン付加したら、それら
を過剰な酸などの任意の望ましくない成分から分離することができる。当業者は
、望ましくない成分からオリゴヌクレオチドポリマーを分離する多数の方法を知
っていると思われる。例えば、プロトン付加後に、オリゴヌクレオチドポリマー
溶液にクロマトグラフィーを実施することができる。好ましい具体例において、
オリゴヌクレオチドポリマー溶液は、プロトン付加後に、ポリ（スチレン-ジビ
ニルベンゼン）系樹脂カラム（例えば、Hamilton's PRPまたはPolymer Lab's PL
RP）で分析される。

【００７１】 プロトン付加または酸性化した核酸は、直接使用しても、または好ましい具体
例では、沈殿、逆相クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーションまたはゲル
ろ過により任意の過剰の酸および塩を除去するためにさらに処理してもよい。プ
ロトン付加されたオリゴまたは酸性化オリゴは、沈殿、凍結乾燥、溶媒留去等に
よって濃縮してもよい。水または生理食塩液に懸濁させたとき、本発明の酸性化
した核酸調製物は、典型的には、1)酸性化過程においてどのくらいの酸が使用さ
れるかによって決定することができるプロトン付加のレベルまたは酸性化のレベ
ルおよび2)核酸の濃度に応じて、0.5〜4.5のpHを示す。または、核酸は、水素イ
オンを負荷した陽イオン交換カラムを通過させることによってプロトン付加する
ことができる。

【００７２】 配列の独立的な方法によって、プロトン付加したオリゴヌクレオチドポリマー
は抗菌作用を示すことが発見されている。本発明のプロトン付加したオリゴヌク
レオチドポリマーは、水に溶解するとき、7未満から約1のpH、または好ましい具
体例では、pH6〜約1もしくはpH5〜約1を生ずるようにプロトン付加または酸性化
される。他の好ましい具体例において、溶解した核酸はpH 4.5〜約1のpH、また
は好ましい具体例では、4.0〜約1のpH、またはより好ましい具体例では、3.0〜
約1のpH、または別の好ましい具体例では、2.0〜約1のpHを有する。

【００７３】製薬学的組成物および送達 オリゴヌクレオチドポリマーは、インビボにおいて使用するために種々の生理
学的担体分子を用いて製剤化することができる。例えば、オリゴヌクレオチドポ
リマーは脂質、カチオン型脂質またはアニオン型脂質（プロトン付加または酸性
化されたオリゴヌクレオチドポリマーにとって好ましくてもよい）と組み合わせ
ることができ、得られるオリゴヌクレオチドポリマー/脂質エマルジョンまたは
リポソーム懸濁液はオリゴヌクレオチドポリマーのインビボにおける半減期を特
に効果的に延長する。

【００７４】 疾患を治療薬によって治療する際に使用する場合には、PDE調節オリゴヌクレ
オチドポリマーまたはその混合物の適当な用量はいくつかの十分に確立されてい
る方法のいずれかによって決定することができる。例えば、生体作用薬の体重1k
gあたりの最大耐性用量またはMTDを決定するために動物研究を通常使用する。一
般に、試験する動物種の少なくとも1つは哺乳類である。当業者は、通常、ヒト
を含む他の種に対する有効性のため、および毒性を回避するために用量を外挿す
る。また、治療用量は、疾患の重症度および宿主のサイズまたは種に応じて異な
ってもよい。

【００７５】 プロトン付加または酸性化したオリゴヌクレオチドポリマーの使用は、カチオ
ン型リポソームを上回る数多くの利点を有すると考えられるアニオン型脂質への
封入化を容易にする（R. J. Lee and L. Huang, "Lipidic Vector Systems for
Gene Transfer", in Critical Reviews in Therapeutics Drug Carrier Systems
14(2): 173-206(1997)）。具体的には、アニオン型リポソームはカチオン型リ
ポソームより毒性が低いと思われ、非特異的取り込みが低く、特定の細胞に対し
て適当なリガンドでターゲット化することができる。

【００７６】 プロトン付加されたまたは酸性化オリゴヌクレオチドポリマーを使用するため
の好適なアニオン型脂質の例には、カルジオリピン、ジミリストイル、ジパルミ
トイルまたはジオレオイル、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルグリセ
ロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリンまたはホスファチジルグ
リセロール、ホスファチジン酸、リソホスファチジン酸、ホスファチジルセリン
、ホスファチジルイノシトールおよびコレステロールのアニオン型が挙げられる
が、それらに限定されない。カチオン型、アニオン型および/または中性脂質組
成物の使用は、一般に、参照することで本明細書の一部をなすものとする国際公
開公報第90/14074号、国際公開公報第91/16024号、国際公開公報第91/17424号お
よび米国特許第4,897,355号に記載されている。

【００７７】 オリゴヌクレオチドポリマーを脂質結合構造に集成することによって、好適な
ターゲッティング剤（例えば、特異的抗体または受容体）をオリゴヌクレオチド
ポリマー/脂質複合体に導入することによって、オリゴヌクレオチドポリマーを
特定の細胞種にターゲット化することができる。

【００７８】 本発明のオリゴヌクレオチドポリマーを製薬学的担体と混合して含有する製薬
学的組成物は従来の製剤作製技法により調製することができる。担体は、例えば
、静脈内、経口、局所、エアゾール（局所または吸入療法用）、坐剤、非経口ま
たは脊髄注射のような投与に望ましい調製物の形態に応じて多種多様の形態をと
ることができる。

【００７９】 経口投与形態における組成物を調製する際には、例えば、経口液体製剤（例え
ば、懸濁液、エリキシルおよび溶液など）の場合には、水、グリセロール、オイ
ル、香味剤、保存剤、着色剤等、または経口固形製剤（例えば、粉末、カプセル
および錠剤など）の場合には、デンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合
剤、崩壊剤等などの通常の製薬学的媒体のいずれかを使用することができる。投
与の容易さのために、錠剤およびカプセルは最も有利な経口投与単位形態となり
、その場合には、固形の製薬学的担体が明らかに使用される。望ましい場合には
、錠剤は標準的な糖衣または腸溶性であってもよい。

【００８０】 注射による非経口適用のためには、製剤は、適当な生理食塩液中に水溶性また
は溶解性で、製薬学的に許容されうる形態のオリゴヌクレオチドポリマーの水溶
液を含んでもよい。注射用懸濁液も、適当な脂質担体、懸濁化剤、等張性を調節
するための薬剤、保存剤等を使用して調製することができる。非経口的に投与可
能な組成物を調製する実際の方法および被験者に投与するのに必要な調節は示さ
れており、また当業者に明らかであり、より詳細には、例えば参照することで本
明細書の一部をなすものとするRemington's Pharmaceutical science, 15th Ed.
, Mack Publishing Company, Easton, PA(1980)に記載されている。本明細書に
記載されるオリゴヌクレオチドポリマーは、オリゴヌクレオチドについて確立さ
れている最大耐性用量(MTD)より低い濃度で非経口的に投与されるべきである。

【００８１】 局所投与のためには、担体は、クリーム、包帯、ゲル、ローション、軟膏また
は液体であってもよい、製剤に応じて多種多様の形態をとってもよい。

【００８２】 エアゾールは、オリゴヌクレオチドを、エチルアルコールなどの噴射剤または
噴射剤と溶媒相にオリゴヌクレオチドを溶解または懸濁させることによって調製
される。局所またはエアゾール形態の製薬学的組成物は、一般に、使用する特定
の形態に応じて、約0.01重量%（ヌクレオチドの）〜約40重量％、好ましくは約0
.02重量％〜約10重量％、さらに好ましくは約0.05重量％〜約5重量％を含有する
。

【００８３】 坐剤は、オリゴヌクレオチドポリマーに、カカオオイル、カカオ脂、グリセリ
ン、ゼラチンまたはポリオキシエチレングリコールなどの脂質基剤を混合するこ
とによって調製される。

【００８４】 本明細書に記載するオリゴヌクレオチドポリマーは、従来の治療薬を投与する
ために使用される実質的に任意の手段によって生体に投与することができる。動
物に生体作用性化合物を送達する分野において種々の送達系が知られている。こ
れらの系には、静脈内または筋肉内または気管内注射、鼻腔スプレー、吸入用エ
アゾールおよび経口または坐剤投与が挙げられるが、それらに限定されない。使
用する特定の送達系は疾患の位置に依存し、疾患の位置を決定し、適当な送達系
を選択することは当業者の技術の範囲内である。

【００８５】例 当業者に本発明をどのように製造し、使用するかについての完全な開示および
説明を提供するために以下の例を記載し、発明と考えられるものの範囲に限定す
る意図はない。使用する数（例えば、量、温度、濃度等）に関して正確さを確実
にするための努力が払われているが、弱冠の実験誤差および偏差は許されるべき
である。特に明記しないかぎり、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり
、温度は℃単位であり、圧力は周囲または周囲温度付近である。

【００８６】例1: B細胞媒介性皮膚炎 抗炎症性オリゴヌクレオチドポリマー、OE-2a(配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
）：32)は5'側および3'側が逆Tsでブロックされた2'O-メチルRNAホスホジエステ
ルであり、ヒトPDE4遺伝子をターゲットとする。OE-2aは35mg/ml(7.7μMolar)の
濃度で約pH3の水に溶解し、重症の再発性アトピー性皮膚炎の病歴を有する37歳
の男性を治療するために使用された。皮膚炎はOE-2aで特異的に消失した。また
、アトピー性皮膚炎のその後の発症は完全になくなった。

【００８７】 37歳の男性は、両側の前腕の内側を完全に覆う重症のアトピー性皮膚炎で来院
した。アトピー性皮膚炎は、強烈な掻痒感を伴う丘疹によって特徴づけられる慢
性疾患である。炎症性応答は、Bリンパ球によるIgEの過剰な産生に関連する。よ
り高い濃度のPDE4がアトピー性皮膚炎患者で報告されている。PDE4をターゲット
とするアンチセンスオリゴヌクレオチドポリマー、OE-2aは左側の前腕の2"×3"
部分に適用された。第2のオリゴ、OE-1は同じ腕の別の部分に適用された。OE-1
はOE-2aと同様の塩基分布を有するが、細菌遺伝子と相同である。オリゴヌクレ
オチドポリマーは12時間間隔で2回適用された。

【００８８】 OE-2aは、適用した領域の皮膚炎の消失が成功した。OE-1は影響がなかった。
患者は、第2回めの治療の前に、掻痒感は約6時間後OE-2aに対応する領域でなく
なったと言った。

【００８９】 第2の腕の治療は、主にOE-2aを用いてこの時点で開始した。再度、12時間間隔
で2回の追跡調査を実施した。患者は、6時間以内に掻痒感は全く消失したと言っ
た。皮膚炎は、第2の治療の12時間以内に完全に消失した。

【００９０】 1年の2月から12月までこの患者のアトピー性皮膚炎の再発は見られなかったが
、夏の暑さの間には患者は典型的には発作が再発する。

【００９１】例2:T細胞媒介性皮膚炎 35 mg/ml(7.7μMolar)のOE-2aの約pH3の水溶液を、ツタウルシの一種（poison
ivy）によって誘発されたT細胞媒介性接触皮膚炎の症例を治療するために使用
した。皮膚炎は2回の治療で完全に消失し、罹患した患者の他の領域のその後の
発疹を予防した。

【００９２】 女性は、足の裏の数箇所の領域のツタウルシの一種（poison ivy）による炎症
で来院した。患者は、T細胞媒介性の種類の過敏症に関連する掻痒感を愁訴した
。接触皮膚炎は、発赤、硬結および小胞形成によって特徴づけられた。抗炎症性
ｐリゴOE-2aを足の裏に適用した。12時間以内に、患者は強力な掻痒感が消失し
たことに気づいた。OE-2aの2回めの適用により、発赤、硬結および小胞形成は消
失した。OE-2aの適用が足の裏の目に見えるツタウルシの一種（poison ivy）に
よる炎症を消失させただけでなく、患者の別の箇所でのツタウルシの一種（pois
on ivy）によって誘発される皮膚炎のいかなる別の発疹をも予防したことに注目
することは興味深い。

【００９３】例3:急性膨疹-潮紅反応 43.6 mg/ml(7.7μMolar)でpH7のOE-2aは、スズメバチに多数さされた数分以内
に適用したとき、即時型および遅延型過敏症の療法を予防することができた。

【００９４】 昆虫にかまれたことに応答した重症の膨疹および潮紅皮膚反応の病歴を有する
女性患者は、腕に多数箇所スズメバチにさされて来院した。患者は重症の疼痛を
有し、ヒステリー状態であった。OE-2aを速やかに投与した。5分以内に、患者は
沈静化し、疼痛は消失した。注目すべきことに、さされてから5分以内のOE-2aの
投与はいかなる即時型膨疹および潮紅反応並びにいかなる遅延型反応も予防した
。

【００９５】例4:化学的に誘発された皮膚炎 OE-2aは、標準的な皮膚治療に応答しなかった化学的に誘発された接触皮膚炎
の症例の治療に使用して成功した。

【００９６】 59歳の女性は、タートルネックセーターのドライクリーニング剤に反応して誘
発された頸部の接触皮膚炎の症例で来院した。1ヶ月の治療経過中、女性患者は
コルチゾン、抗生物質および種種の他の局所的薬剤により皮膚科医によって治療
された。種々の治療は一時的な散発的な寛解しか生じず、掻痒および発赤を消失
させることはなかった。この時点で、患者はOE-2aで局所的に治療された。2回の
治療後に掻痒および発赤は完全に消失し、5ヶ月間再発しなかった。

【００９７】例5:PDE4の鼻腔内投与 重症のアレルギー性鼻炎に罹患している数人の健康な男性被験者をOE-2aで治
療した。男性は年齢が45歳から73歳の範囲であった。体重は175ポンドから230ポ
ンドの範囲であった。滅菌した経鼻的スプレー容器に、通常の生理食塩液に溶解
したOE-2aを含有する溶液を充填した。約300 A₂₆₀/mlの濃度のオリゴヌクレオチ
ドポリマーの生理食塩溶液を、各鼻腔に鼻腔内経路に1日2回投与した。この投与
療法を3日間持続した。

【００９８】 検討の結果、3日の治療経過後、全ての被験者は全てのアレルギー性鼻炎の症
状が完全に消失したことが見出された。具体的には、鼻づまりがなく、鼻汁がな
く、くしゃみがなく、鼻呼吸の困難さがなく、鼻排泄物は完全に消失したようで
あった。被験者は、鼻炎を誘発するアレルゲンに暴露され続けたが、治療スケジ
ュールが終了した以降も鼻炎症状のいかなるものの再発も生じなかった。結論と
して、生理食塩液に溶解し、経鼻スプレーを介して投与したPDE-4の鼻腔内投与
は、わずか3日の治療後に健康な男性被験者のアレルギー性鼻炎を治癒し、さら
なる症状の再発はないと思われた。

【００９９】 本発明は、本発明の具体的な例を参照することにより記載されているが、本発
明の真の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更を実施することができ
、等価物と置換することができることが当業者によって理解されるべきである。
また、特定の状況、材料、物質の組成、方法、工程段階を適合するために、本発
明の目的、精神および範囲に多数の改良を加えることができる。全てのこのよう
な改良は、本明細書に添付の請求の範囲内であることが意図されている。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 9/00 9/00 9/10 9/10 11/00 11/00 11/06 11/06 11/16 11/16 13/00 13/00 17/04 17/04 17/06 17/06 19/02 19/02 25/00 １０１ 25/00 １０１ 25/24 25/24 25/28 25/28 27/14 27/14 27/16 27/16 29/00 １０１ 29/00 １０１ 31/18 31/18 33/06 33/06 35/00 35/00 37/06 37/06 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アロウ，エイミー アメリカ合衆国メイン州04217，ベセル， バードヒル・ロード 184 (72)発明者 トンプソン，テリー アメリカ合衆国オレゴン州97068，ウェス ト・リン，サウスウェスト・エック・ロー ド 2222 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA01 CA11 4C084 AA13 BA35 CA53 DC32 NA14 ZA02 ZA12 ZA33 ZA34 ZA36 ZA59 ZA60 ZA68 ZA81 ZA89 ZA94 ZB05 ZB08 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB38 ZC20 ZC35 ZC55 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 NA14 ZA02 ZA12 ZA33 ZA34 ZA36 ZA59 ZA60 ZA68 ZA81 ZA89 ZB05 ZB08 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB38 ZC20 ZC35 ZC55

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 天然に存在するヌクレオチドポリマーの骨格構造に修飾され
   た骨格構造を有する核酸と、 核酸の少なくとも一方の末端または末端付近におけるブロック的化学修飾と を含み、約0.01〜約10のpHにおける少なくとも1時間のpH安定性と同じ数のヌ
   クレオチドを有する天然に存在する核酸のヌクレアーゼ抵抗性とによって特徴づ
   けられるPDE4に相補的な酸抵抗性ポリマー。
2. 【請求項２】 前記ポリマーが、約2個〜約100個のヌクレオチドを含む請求
   項1に記載のポリマー。
3. 【請求項３】 前記ポリマーが、PDE4A1、PDE4A4a、PDE4A4b、PDE4A4c、PDE
   4A5、PDE4A8a、PDE4B1a、PDE4B2a、PDE4B2b、PDE4B2c、PDE4B3a、PDE4C1a、PDE4
   C1b、PDE4C2a、PDE4C3a、PDE4C5a、PDE4C6a、PDE4C7a、PDE4D1a、PDE4D1b、PDE4
   D2a、PDE4D3a、PDE4D3a、PDE4D4aおよびPDE4D5aからなる群から選択されるPDE4
   遺伝子に対してターゲットとされる請求項1または2に記載のポリマー。
4. 【請求項４】 前記骨格構造が、2'-ハロゲン、2'-O-メチル、2'-O-アルキ
   ル、2'-O-アルキル-n(O-アルキル)、3'-ハロゲン、3'-O-アルキル、3'-O-アルキ
   ル-n(O-アルキル)、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホー
   ルアミデート結合、シロキサン結合、カルボネート結合、カルボキシメチルエス
   テル結合、アセトアミデート結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、架橋
   ホスホーアルアミデート結合、架橋メチレンホスホネート結合、ホスホロチオエ
   ート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロジチオネート結合、モルホリノ、
   架橋ホスホロチオエート結合、スルホンインターヌクレオチド結合、3'-3'結合
   、5'-2'結合、5'-5'結合、2'-デオキシ-エリスロペントフラノシル、2'-フルオ
   ロ、2'-O-アルキルヌクレオチド、2'-O-アルキル-n(O-アルキル)ホスホジエステ
   ル、モルホリノ結合、p-エトキシオリゴヌクレオチド、PNA結合、p-イソプロピ
   ルオリゴヌクレオチドまたはホスホールアミデート、スルフィド結合、スルホキ
   シド結合、スルファメート結合、スルファミド結合、ホルムアセタール/ケター
   ル結合、チオホルムアセタール結合、キラルリン結合、アミノアルキルホスホロ
   チオアミデート結合および4残基結合からなる群の1つ以上を含む請求項1、2また
   は3のいずれかに記載のポリマー。
5. 【請求項５】 前記ポリマーが、PDE4発現に関与するDNA配列にハイブリダ
   イゼーションする請求項1、2、3または4のいずれかに記載のポリマー。
6. 【請求項６】 前記ポリマーが、PDE4mRNAにハイブリダイゼーションする請
   求項1、2、3または4のいずれかに記載のポリマー。
7. 【請求項７】 前記ヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、
   配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番
   号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番
   号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番
   号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番
   号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番
   号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番
   号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44および配列番号45から
   なる群から選択される配列を有する請求項1、3または4のいずれかに記載のポリ
   マー。
8. 【請求項８】 ポリマーが7以下のpHを有するようにプロトン付加される請
   求項1、2、3、4、5、6または7のいずれかに記載のポリマー。
9. 【請求項９】 天然に存在する核酸の核酸骨格構造に修飾した核酸骨格構造
   、およびポリマーの少なくとも一方の末端または末端付近におけるブロック的化
   学修飾を有する、修飾PDE4に向けられるヌクレオチドのポリマーと、 製薬学的に許容されうる担体と を含む製薬学的組成物。
10. 【請求項１０】 前記ポリマーが、約1個〜約100個のヌクレオチドを含む、
    請求項9に記載の製薬学的組成物。
11. 【請求項１１】 前記ポリマーが、7以下のpHを有するようにプロトン付加
    される請求項9または10に記載の製薬学的組成物。