JP2002533419A - Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅをコードするアデノウイルスベクターを使用する、肺水腫のための遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 インビボのＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅのレベルを増大させるために、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子を肺上皮細胞に移入することによって哺乳動物肺水腫を遺伝子治療するための方法および組成物が提供される。組換えアデノウイルスベクターは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子の、肺上皮細胞への移入を媒介する。このベクターは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子を発現するｃＤＮＡに連結する、ウイルス誘導されたプロモーターエレメントからなる発現制御配列を使用する。これらの遺伝子は、上皮膜を横切る水の移動の原因となる経上皮の浸透圧勾配を生成でき、それによって、哺乳動物肺における肺水腫のクリアランスを生じ得ることが示された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） インビボでのＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅのレベルを増加させる目的で、Ｎａ，Ｋ
−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子の、肺上皮細胞への移入による、肺水腫の遺
伝子治療のための、方法および組成物が提供される。

【０００２】 心臓性および非心臓性の肺水腫は、毎年数百万の人々に影響を与え、かなりの
罹病率および死亡率をもたらす（Ｌａｒｇｅ Ｓｔａｔｅ Ｐｅｅｒ Ｒｅｖｉ
ｅｗ、１９９７）。これらの人々の肺胞は、肺毛細管からの液体で満たされ、こ
れは、体循環への酸素移動を損なう（Ｈａｌｌら、１９８６）。この一連の事象
は、低酸素血症、光炭酸ガス症をもたらし、そして矯正的な対策がとられない場
合には、死をもたらす。

【０００３】 不運なことに、肺水腫を処置する特定の処置または満足に効果のある処置は、
利用可能ではない。現在の治療は、全く補助的であり、そして肺毛細管の静水圧
を減少させるための利尿治療を含む。この治療は、水腫の蓄積を減少させること
が示されているが、肺水腫のクリアランスには影響を与えない（Ｓｚｎａｊｄｅ
ｒら、１９８６）。多くの場合において、この治療は、不適切に低い左心室の拡
張期終期容量、減少した心拍出量、低血圧、および減少した末梢酸素送達をもた
らす。肺がそれ自体を乾燥状態に保つ能力を改善または再構築する治療は、肺水
腫に関連する罹病率を減少させ得る（Ｍａｔｔｈａｙら、１９９０；Ｖｅｒｇｈ
ｅｓｅら、１９９９）。

【０００４】 水腫は、スターリングの式により表されるように、毛細血管透過性および／ま
たは静水圧の増加の結果として、肺胞内に蓄積する（Ｓｔａｕｂ、１９８０）。
逆に、水腫は、肺胞の気腔からのＮａ⁺の能動的な移動の結果として、肺胞から
クリアランスされる。このＮａ⁺移動は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅの作用に起因
し、これらは、２型肺胞上皮（ＡＴ２）細胞の基底外側表面に位置する。これら
のＡＴＰａｓｅは、経上皮浸透圧の勾配を生じさせ、これは、肺胞気腔から細胞
透過経路または傍細胞経路を介しての流体の移動を引き起こす。

【０００５】 能動的Ｎａ⁺移動の結果生じる肺水腫クリアランスは、生存動物モデル、単離
されたラットの肺、およびヒトにおいて実証されてきた（Ｍａｔｔｈａｙおよび
Ｗｉｅｎｅｒ−Ｋｒｏｎｉｓｈ、１９９０；Ｅｆｆｏｒｓら、１９８９；ならび
にＧｏｏｄｍａｎら、１９８３）。肺の液体クリアランスにおける能動的Ｎａ⁺
移動の役割を支持することは、単離されたラットの肺での実験であり、これは、
肺の液体クリアランスが、低体温により（能動的移送の阻害を介して）完全に停
止し、そしてアミロライド（Ｎａ⁺チャネルインヒビター）およびウアバイン（
Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅインヒビター）の両方によって減少することを実証した
。

【０００６】 Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅは、これらが細胞容量および細胞内ｐＨの維持に必須
である全ての真核生物細胞において発現される。これらはまた、ヒトの身体の全
体での多くの移送および分泌の上皮におけるベクトル性イオン移動のために重要
である。特に、これらのＡＴＰａｓｅは、肺胞上皮において発現され、ここでこ
れらは、２型肺胞細胞の基底外側の面に存在する。

【０００７】 Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ分子は、十分に制御されたヘテロダイマーである。細
胞表面での内因性Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ発現は、堅く調節され、そして細胞内
Ｎａ⁺または細胞容量のいずれかの変化に依存する。増加したＮａ，Ｋ−ＡＴＰ
ａｓｅ活性のための刺激が減少するにつれて、これはタンパク質キナーゼＡ（Ｐ
ＫＡ）および／またはタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）を介してリン酸化され、
後期エンドソーム内への内在化をもたらし、構築された潜在的に機能性のＮａ，
Ｋ−ＡＴＰａｓｅの細胞質の貯蔵を生じさせる。必要であれば、小胞を含むこれ
らのＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅは、細胞膜に迅速に漸増して、Ｎａ⁺濃度または細
胞容量が変化すると、即座の要求に応じ得る。さらに、構築されていないＮａ，
Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットタンパク質の細胞内プールが、細胞外小器官内に
存在し、そしてまた、迅速な構築および細胞膜への漸増のために利用可能である
。他者の研究の結果は、さらなる外因性Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅの必要性がない
はずであることを提案する。

【０００８】 Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅは、高エネルギーホスフェートを利用して、細胞内Ｎ
ａ⁺を細胞外Ｋ⁺と交換する。ベクトル性Ｎａ⁺移動の実施に加えて、Ｎａ，Ｋ−
ＡＴＰａｓｅは、細胞容量および細胞内ｐＨを調節し、そして脱分極可能細胞に
おける膜貫通電位の原因である。機能性Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅは、２つのサブ
ユニットαおよびβからなる。両方のサブユニットが、正常なＮａ，Ｋ−ＡＴＰ
ａｓｅ機能のために必要である。各サブユニットの３つのアイソフォームが、単
離され、そしてクローン化されている。αサブユニットは、ＡＴＰａｓｅ活性を
有し、そしてＮａ⁺／Ｋ⁺交換の原因である。βサブユニットは、ヘテロダイマー
構築および寿命、ならびに形質膜への往来（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を制御す
る。全ての細胞がこれらのタンパク質を発現するが、アイソフォーム発現（例え
ば、α₁／β₁、α₁／β₂、α₂／β₁）は、発達的に調節され、そして組織によっ
て異なる。α₁サブユニット、α₂サブユニット、およびβ₁サブユニットは、ラ
ットの肺で発現される主要なサブユニットである。

【０００９】 亜急性高酸素症（８５％のＯ₂×７日間）に曝露したラットの肺は、肺水腫ク
リアランスを増加させた（Ｏｌｉｖｅｒａら、１９９４）。これらの知見は、増
加したＡＴ２細胞および全肺Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ発現に関連した。急性高酸
素症（１００％のＯ₂×６４時間）に曝露したラットは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓ
ｅ発現を減少させ、そして肺液体クリアランスを減少させた。従って、Ｎａ，Ｋ
−ＡＴＰａｓｅの発現および機能は、高酸素症による肺傷害に続く肺液体クリア
ランスに匹敵する。

【００１０】 組換え遺伝子技術は、肺傷害の処置に適用されていない。可能なアプローチは
、遺伝子移入に有用な複製欠損アデノウイルスを使用することである。アデノウ
イルスは、呼吸性上皮に向性であり、非複製細胞に高効率で感染し、そして宿主
ゲノムに組込まれない。十字形遺伝子（Ｅ_1a）の非存在は、アデノウイルスがＥ _1a を発現する細胞の外側で複製することを不可能にする。従って、アデノウイル
スは、Ｅ_1aを発現しない真核細胞の感染に続いて成長しない。これらの組換えベ
クターは、アデノウイルスにより形質導入される細胞において目的の遺伝子の高
レベルの過渡的な発現を可能にする強力なプロモーターを用いて構築され得る。

【００１１】 治療のための遺伝子を移入するためにアデノウイルスを使用することの問題は
、初期（第１および第２）の世代のアデノウイルスが、有意な宿主応答を引き起
こし、これがヒト遺伝子治療のためのこれらの使用を制限することが報告されて
いることである。これらの炎症性効果は、部分的には、形質導入された細胞の細
胞表面でのアデノウイルス抗原の発現に起因する。これらの抗原は、細胞傷害性
Ｔ細胞応答を引き起こし、これは、形質導入された細胞の排除をもたらす。肺に
おける多くの遺伝子の送達および短期間の発現に適したベクターは、高能力の、
ヘルパーウイルス依存性のアデノウイルスであり得、これらは、アデノウイルス
タンパク質を発現する遺伝子を含まない。その結果、抗アデノウイルス宿主応答
の多くが、それ自体で優位であるようなこれらのベクターの使用によって、撤廃
されることが予測される。これらのベクターはまた、インビボで細胞に遺伝子移
入し得る。それ自体で、これらのベクターは、組換えタンパク質の産生のために
有用である。

【００１２】 目的は、アデノウイルスを使用して、肺疾病（肺水腫を含む）の遺伝子治療を
開発することである。現在利用可能な肺水腫の処置は、肺が過剰の流体を肺胞気
腔から、他の器官に影響を与えずに除去する能力に影響を与えることができない
。従って、肺水腫のための特定の処置はいずれも、現在使用可能ではない。肺水
腫に特異的に影響を与える処置の開発は、複雑な機能性タンパク質を、肺胞上皮
細胞に送達することを必要とする。現在、肺胞上皮でのＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ
のような移送タンパク質の高効率の過剰発現が可能である薬学的送達システムは
、遺伝子移入以外に、存在しない。

【００１３】 複製欠損アデノウイルスは、以前に、ヒト遺伝子移入研究のために使用された
。これらの大部分が、第Ｉ段階での研究であり、遺伝性状態および癌の処置に焦
点を当て、そして限定された結果を得た。急性状態または生命を脅かす状態の処
置に関する遺伝子治療は、報告されていない。肺水腫のような後天性状態のため
のこれらのベクターの使用は、これらのベクターの新たな用途を示す。

【００１４】 （発明の要旨） 本発明は、組換え遺伝子技術を使用して、哺乳動物の肺の後天性疾患において
、肺水腫を減少させるための、方法および組成物に関する。アデノウイルスは、
後天性の、急性／短期間の肺の疾患の処置のために好ましいベクターである。本
発明の方法は、以下の工程を包含する： （ａ）（ｉ）アデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有さ
ないアデノウイルス；および （ｉｉ）遺伝ベクターを有さない肺細胞におけるレベルと比較して過剰発現
のレベルでＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子をコードする、ヌクレオ
チド配列、 を含む組換え遺伝ベクターを得る工程、ならびに （ｂ）サブユニット遺伝子の発現が可能な条件下で、インビボで、肺の上皮細
胞にこの遺伝ベクターを移入する工程。

【００１５】 本発明はまた、組換え遺伝ベクターに関し、この組換え遺伝ベクターは、以下
を含む： （ａ）アデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有さない、
アデノウイルス；および （ｂ）遺伝ベクターを有さない肺細胞におけるレベルと比較して過剰発現のレ
ベルでＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットをコードする、ヌクレオチド配列。

【００１６】 本発明の１つの局面は、組換え遺伝ベクターが移入された宿主細胞であって、
このベクターは、以下を含む： （ａ）アデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有さない、
アデノウイルス；および （ｂ）遺伝ベクターを有さない肺細胞におけるレベルと比較してインビボで過
剰発現のレベルでＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットをコードする、ヌクレオ
チド配列。

【００１７】 適切な宿主細胞としては、上皮細胞、特に、肺上皮細胞が挙げられる。宿主細
胞におけるベクターからの遺伝子の発現は、インビトロまたはインビボで起こり
得るが、臨床使用にためには後者が好ましい。本発明は、インビボでのＮａ，Ｋ
−ＡＴＰａｓｅ活性を増加させ、そして肺の液体クリアランスを改善する目的で
、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子を肺上皮細胞に移入させ、この遺
伝子を発現させるための、方法および組成物を提供する。これらの方法および組
成物は、肺水腫の遺伝子治療の目的で、内因性肺胞移送プロセスを増強するよう
設計される。実験データは、インビトロおよびインビボでのＮａ，Ｋ−ＡＴＰａ
ｓｅの活性の増強は、１つのみのサブユニットの過剰発現を必要とすることを示
す（Ｆａｃｔｏｒら、１９９８ ａおよびｂ）。速度限定サブユニットは、細胞
型、器官、および種によって変動する。３つの可能なサブユニットのうちの１つ
の選択が好ましく、そして種および細胞型によって変動する。単一のサブユニッ
トを使用することが望ましい。なぜなら、これはアデノウイルスの構築および増
殖を単純化し、アデノウイルス設計の最適化を可能にし、そして１つ以上のトラ
ンスジーンを合成するために必要な細胞代謝応答を最小にするからである。例え
ば、アデノウイルスにより媒介される遺伝子移入およびβ₁サブユニット遺伝子
またはα₂サブユニット遺伝子の発現は、ラット細胞においてＮａ，Ｋ−ＡＴＰ
ａｓｅ活性を増加させ、そしてラットの肺において肺の液体のクリアランスを増
加させ、一方でα₁サブユニット遺伝子の移入は、ヒトの肺細胞またはサルの肺
における能動的なＮａ⁺移送の変化に影響を与えるために、必要である。

【００１８】 （発明の詳細な説明） 本発明は、動物およびヒトにおける肺水腫のインビボでの処置のための治療方
法、ならびにこの方法をもたらす組成物を提供する。本方法は、組換え遺伝子（
特に、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅをコードするＤＮＡヌクレオチド配列）をインビ
ボにて肺胞上皮細胞へと導入する工程を包含する。これらの細胞は、組換え遺伝
子を転写および翻訳し、それにより、重要な膜貫通輸送分子の発現を増加させ、
そして肺胞気腔から液体をクリアリングする、肺の能力を増強する。

【００１９】 本発明の方法は、肺胞上皮細胞への遺伝子の導入を媒介するための組換えヒト
アデノウイルスベクターの使用を含む。本発明の組換えアデノウイルスベクター
は、上皮細胞への遺伝子移入において、他の非ウイルス性ベクター（例えば、陽
イオン性脂質）に対して優れた結果を生成すると報告されている（Ｂｒｏｄｙお
よびＣｒｙｓｔａｌ，１９９４）。詳細には、本発明の方法は、肺胞および気管
上皮細胞へのＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ遺伝子の移入を媒介する組換えアデノウイ
ルスベクターの使用を含む。

【００２０】 本発明のベクターは、α₁、α₂および／またはβ₁Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサ
ブユニットタンパク質を発現するｃＤＮＡ分子に連結されたウイルス由来プロモ
ーターエレメントからなる発現制御配列を用いる。これらのタンパク質は、上皮
膜を横切る水の移動を担う経上皮浸透圧勾配を生成し得ることが示された。これ
らのベクターによって生成されるトランスジェニックタンパク質（Ｎａ，Ｋ−Ａ
ＴＰａｓｅ）は、肺胞水腫クリアランスをもたらすために必要な能動溶質輸送を
担うことが示されている膜貫通輸送分子である。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ発現ア
デノウイルスの多数の試験は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ活性を増加させるために
は、培養中のヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）およびカニクイザルはα₁サブユニッ
トまたはβ₁サブユニットの過剰発現を必要とするが、一方、ラット肺胞上皮細
胞および肺はα₁サブユニットの過剰発現を必要とすることを示した。従って、
律速サブユニットは細胞型および種によって変化し、そしてＮａ，Ｋ−ＡＴＰａ
ｓｅ機能の増強は、１つの律速サブユニットの過剰発現を必要とする。

【００２１】 Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットタンパク質をコードするヌクレオチド配
列を過剰発現することは、水腫クリアランスの増加をもたらしたことは、予想外
であった。なぜなら、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットタンパク質は肺細胞
に既に存在し、何人かによって、急な刺激には応答しない「ハウスキーピング」
遺伝子であると考えられているからである（Ｓｕｚｕｋｉ−Ｙａｇａｗａら，１
９９２）。Ｎａ⁺経上皮移動は、頂部細胞膜および基底細胞膜の両方で輸送分子
の機能に依存する。頂部Ｎａ⁺チャネルは、Ｎａ⁺の侵入のための受動的通路であ
る。これは、膜結合性ヘテロ三量体Ｇタンパク質によって、リン酸化および脱リ
ン酸化に応答して開口および閉口する、強固に調節されたチャネルである。これ
は、何人かによって、指向性Ｎａ⁺輸送を制御する際の律速調節エレメントであ
ると考えられている。

【００２２】 本発明の新たな世代の、高能力のヘルパーウイルス依存性アデノウイルスベク
ター系を開発して、より前の世代のアデノウイルスについて見られたアデノウイ
ルス誘導性宿主応答を減少させた。これらの炎症応答は、感染細胞におけるアデ
ノウイルスタンパク質の発現に起因し、細胞傷害性Ｔ細胞応答および感染細胞の
クリアランスをもたらした（ｖｏｎ Ｇｉｎｋｅｌら，１９９７）。アデノウイ
ルスタンパク質をコードする全ての遺伝子の除去は、アデノウイルス感染細胞の
宿主媒介除去を制限するこの炎症応答を有意になくし、第１世代および第２世代
のアデノウイルスベクターについて以前に観察された（Ｍｏｒｓｙら，１９９８
；Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒら，１９９８）よりも長期の導入遺伝子発現をもたらすと
予想される。これらのヘルパーウイルス依存性ベクターを生成するために必要な
ヘルパーウイルスおよび細胞（２９３Ｃｒｅ４）は、Ｍｅｒｃｋから、材料移動
の同意によって得られた。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ ｃＤＮＡおよびプロモータ
ーエレメントを含むＤＮＡベクター（ヘルパーウイルスプラスミド）は、野生型
ヒトアデノウイルス５型のヒトの固有ＤＮＡおよびフラグメントを用いて、本発
明者らによって構築されている。これらの小片は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ発現
ヘルパーウイルス依存性アデノウイルスの構築に必要である。

【００２３】 本発明に好適な高能力の、ヘルパーウイルス依存性ベクターは、アデノウイル
スタンパク質をコードするＤＮＡ配列をコードしない（Ｍｉｔａｎｉら，１９９
５；Ｐａｒｋｓら，１９９６，１９９７）。従って、「漏れた（ｌｅａｋｙ）」
アデノウイルスタンパク質発現に起因した宿主応答は、生じないようである。こ
れは、α₁アンチトリプシン遺伝子およびレプチン遺伝子をマウスにおいて過剰
発現するために類似のベクターを用いた近年の刊行物において確認された（Ｍｏ
ｒｓｅら，１９９８；Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒら，１９９８）。第１世代アデノウイ
ルスを与えたマウスとは対照的に、高能力のヘルパーウイルス依存性アデノウイ
ルスを与えたマウスの肝臓は、「（未感染の）コントロールと」組織学的に「区
別できず」、そして肝細胞酵素レベルの上昇は観察されなかった。本報告は、有
意な宿主応答を誘導しない、少量のヘルパーアデノウイルスが、付随して投与さ
れたことを示した。炎症の減少は、導入遺伝子発現の持続時間を延長するアデノ
ウイルス形質導入細胞の喪失を弱めることもまた報告された（Ｍｏｒｓｙら，１
９９８；Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒら，１９９８）。

【００２４】 近年のデータは、アデノウイルスレセプターが、気道細胞への遺伝子移入を制
限する気管上皮細胞の基底外側局面に位置することを示す（Ｆａｓｂｅｎｄｅｒ
ら，１９９８；Ｚａｂｎｅｒら，１９９７）。これらのレセプターは、肺胞上皮
細胞の頂部表面に発現されるようである。従って、アデノウイルスベクターは、
（気道とは対照的に）肺胞遺伝子移入という目的に比類なく適切である。他の肺
遺伝子移入ストラテジーは、効率的とはいえ、この時点では、高い遺伝子移入効
率、生成の容易さおよび肺胞上皮についての相対的特異性の組み合わせを提供し
ない。この特性の独特の組み合わせに起因して、組換えアデノウイルスは、肺水
腫についての遺伝子治療のために好ましいベクターである。

【００２５】 本発明の実施のために適切なプロモーターとしては、ヒトサイトメガロウイル
ス由来の前初期プロモーターを含む構成的プロモーターエレメントが挙げられる
。このウイルスプロモーターエレメントは、ヒトおよび他の種のα₁、α₂および
／またはβ₁Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子についてのｃＤＮＡを
含む発現制御配列に連結される。さらなる調節配列としては、ヒトＳＶ４０ ｔ
イントロンまたはヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルおよび他の転写制御
シグナル（例えば、スプライスドナー部位−スプライスアクセプター部位）が挙
げられる。

【００２６】 本明細書中に記載される発明は、全ての野生型タンパク質をコードするアデノ
ウイルス遺伝子を欠損する、ヘルパーウイルス依存性アデノウイルスベクターの
使用を用いる。これらのベクターは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ ｃＤＮＡ、続く
ポリアデニル化配列（例えば、ＳＶ４０ｔイントロン）に連結されている構成的
プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む発現カセットのクローニングによ
り生成される。次いで、この発現カセットは、ヒト５型アデノウイルスの左側お
よび右側の反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）末端反復（ＩＴＲ）を含むシャトルベクタ
ー中に挿入される。ヒト５型アデノウイルス由来のパッケージングシグナルは、
左側のＩＴＲの３’端に近接する。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｓｔｏｕｔら、１９８５、Ａｎｓｏｒｇｅら、１９９
０）から入手したヒトヒポキサンチングアニンホルホリボシルトランスフェラー
ゼ（ｈＧＰＲＴ）遺伝子由来の１０〜１２ｋｂのイントロンＤＮＡは、ＩＴＲの
間にある。全長Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ ｃＤＮＡを含む発現カセットが、シャ
トルベクターのヒトイントロンＤＮＡ内に挿入される。制限エンドヌクレアーゼ
消化によりその骨格から切り出される場合、このシャトルベクターの５’端は、
アデノウイルス野生型反転末端反復およびアデノウイルスパッケージングシグナ
ルを含む。このベクターの３’端は、アデノウイルス野生型反転末端反復からな
る。シャトルベクター（ｐＨＶ１０α₁、ｐＨＶ１０α₂、ｐＨＶ１２β₁）を含
むＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子は、組換えヘルパーアデノウイル
スであるａｄＬＣ８ｃｌｕｃ（Ｐａｒｋｓら、１９９６）を用いて、ＨＥＫ２９
３ｃｒｅ細胞中に同時トランスフェクトされる。このアデノウイルスは、パッケ
ージングシグナルに隣接する２ｌｏｘＰ部位を含む。ａｄＬＣ８ｃｌｕｃの残部
は、以前に記載された（Ｐａｒｋｓら、１９９６）第１世代Ｅ１ａ^-欠失組換え
アデノウイルスベクター（Ｆａｃｔｏｒら、１９９８ａおよびｂ）と同様である
。ｃｒｅリコンビナーゼを発現する細胞（ＨＥＫ２９３ｃｒｅ４、Ｇｒａｈａｍ
、１９９６）中にトランスフェクトした場合、パッケージングシグナルは、効率
的に切り出され、これにより、新しく合成されたａｄＬＣ８ｃｌｕｃがアデノウ
イルスキャプシド中にパッケージングされることを不可能にする。ａｄＬＣ８ｃ
ｌｕｃゲノムの残部は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子含有シャト
ルベクターであるｐＨＶ１０α₁、ｐＨＶ１０α₂、ｐＨＶ１２β₁のヘルパーウ
イルス依存性アデノウイルスベクターへのＤＮＡ配列のレスキューを可能にする
に必要なタンパク質をコードするアデノウイルス遺伝子を含む。従って、生成さ
れるアデノウイルスは、ｈｖα₁、ｈｖα₂、およびｈｖβ₁である。これらのヘ
ルパーウイルス依存性アデノウイルスは、ＨＥＫ２９３細胞のコンフルエントな
１５ｃｍ組織培養プレートに３ｐｆｕ／細胞で感染させることによって増殖され
る。細胞病理学的効果（ＣＰＥ）の発生後に、細胞を採取し、濃縮し、そして６
サイクルの凍結および融解により熱的に破壊した。得れらた細胞溶解物は、連続
的なＣｓＣｌ密度勾配超遠心分離を通して、精製前に高速遠心分離により細胞片
を取り除かれる。得られたウイルスを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．
４／１ｍＭ ＭｇＣｌ／１０％グリセロールに対して透析して、１０％グリセロ
ール中での−７０℃での貯蔵の前に、ＣｓＣｌを除去する（ＭｃＧｒｏｒｙら、
１９８８、Ｆａｃｔｏｒら、１９９８、Ｆａｃｔｏｒら、１９９８）。ヘルパー
ウイルス依存性アデノウイルスは、光学密度に基づいて力価測定される。予測さ
れるｃＤＮＡの存在は、ＰＣＲにより確認される。ａｄＬＣ８ｃｌｕｃの存在は
、アガロース下で増殖したＨＥＫ２９３細胞の感染後のプラーク生成数によって
、そしてルミノメーターにおける細胞溶解物でのルミネセンスの測定によってア
ッセイされる。野生型アデノウイルスは、Ａ５４９細胞におけるプラーク生成数
によって、そしてＥ１ａ ＤＮＡ配列に対するＰＣＲによってアッセイされる。

【００２７】 多くの形態のＡＴＰａｓｅが存在し、従って、適切なＡＴＰａｓｅの選択は、
本発明の成功のための基準の一部であった。調節エレメントの選択もまた、重要
である。第１世代の複製欠損アデノウイルスを使用する予備的研究は、内因性調
節エレメントがトランスジェニックＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットの寿命
に有害に影響していることを示した。この知見は、全ての５’調節エレメントお
よび３’調節エレメントが除去されたｃＤＮＡの使用を用いたその後の設計につ
ながった。同様に、ベクターにより首尾よく移入され得る大きさの制約は、相同
組換えし得るベクターが生成されるまで、全ての５’非翻訳配列を除去し、そし
て３’非翻訳配列の量を次第に低減させる、いくつかのα₁およびα₂含有シャト
ルベクターの構築を必要とした。

【００２８】 接着性上皮を横切るベクトル性Ｎａ⁺移動は、部分的に、先端の（ａｐｉｃａ
ｌ）Ｎａ⁺チャネルによって調節される。この十分に研究されたポリマー輸送分
子は、厳密に制御され、そして浸透圧勾配または静水圧勾配に対する水の移動を
もたらす、上皮を横切る（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｉｌｉａｌ）浸透勾配の生成
に必要とされるベクトル性Ｎａ⁺移動のレギュレーターであると仮定される。従
って、本発明における個々のＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子の過剰
発現は、先端のＮａ⁺チャネル発現において同時に増加することなく、アデノウ
イルス媒介性遺伝子移入の後に、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ機能および水腫クリア
ランスの増大を生じた。

【００２９】 肺胞気腔への本発明のアデノウイルスベクターの広範な送達が可能な送達スト
ラテジーとしては、機能的界面活性剤ベースの小胞、および残気容積（ｒｅｓｉ
ｄｕａｌ ｖｏｌｕｍｅ）へと終期呼気（ｅｎｄ−ｅｘｐｉｒａｔｏｒｙ）肺容
積を駆動し、そして生理学的を超える（ｓｕｐｒａ−ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ）
吸息を引き起こして、小胞およびウイルスの広範な分布を生じる、終期呼気胸圧
縮を含む、アデノウイルスの気管内点滴注入のための新しい方法論の使用が挙げ
られる（Ｋａｔｋｉｎら、１９９７、Ｆａｃｔｏｒら、１９９８ａおよびｂ）。
これらの方法としては、残気容積へと終期呼気肺容積を駆動することを目的とす
る、安全な気管内挿管法および胸圧縮ストラテジーの使用が挙げられる。これら
の方法は、動物が、胸圧縮を止めた後に、肺の全ての分節にアデノウイルスの広
範な散布をもたらす深く／力強く吸息することを引き起こす。この発生は、ヘル
パーウイルス依存性アデノウイルスベクターを使用するヒト遺伝子治療のための
重要な因子である。

【００３０】 （実施例） 以下の実施例は、本発明の方法および組成物の実施形態を示す。

【００３１】 （実施例１：インビトロでのラット肺胞上皮細胞およびヒト肺胞上皮細胞への
アデノウイルス媒介性Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ遺伝子移入） 第１世代のヒト５型複製欠損アデノウイルスは、Ｅ１ａ、およびこれらの組換
えウイルスがこれらを欠くアデノウイルスＤＮＡ配列を発現する細胞の外側で複
製する能力を損なうＥ１ｂの全てまたは部分にわたる配列を欠失している。ベク
ターａｄβ₁において、ヒトサイトメガロウイルス由来の初期即時性プロモータ
ー／エンハンサーエレメントを使用して、ｃＤＮＡから下流のＳＶ４０ｔイント
ロンポリアデニル化を有するラットβ₁Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ遺伝子の転写を
駆動した。他の同一なアデノウイルス含有ラットα₁ｃＤＮＡ（ａｄα₁）、Ｅ．
ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子（ａｄβ−ｇａｌ）またはｃＤＮＡなし（ａｄＮｕｌ
ｌ）もまた、本実施例および以下の実施例において使用した。

【００３２】 これらのウイルスを、当業者に公知の技術を使用して生成した（Ｆａｃｔｏｒ
ら、１９９８ａおよびｂ；ＭｃＧｒｏｒｙ、１９８８）。この技術としては、ヒ
ト型アデノウイルスゲノム（シャトルベクター）の左端の部分に隣接したＮａ，
Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットをコードするｃＤＮＡを含む発現カセットを含む
プラスミド、およびアデノウイルスキャプシドのパッケージング限界を超えるア
デノウイルスゲノムを含むプラスミドの使用が挙げられる。これらのプラスミド
を、ヒト胎児性腎臓細胞（ＨＥＫ２９４）中に同時トランスフェクトした。これ
らの２つのプラスミドの間での相同組換えは、アデノウイルスキャプシドに一致
する適切な大きさのアデノウイルスゲノムを生成する。相同組換えを、ＨＥＫ２
９３細胞における代表的な細胞病理学的効果（ＣＰＥ）の存在により検出した。
高力価の組換えアデノウイルスを、当業者に公知の方法を使用して、ＨＥＫ２９
３細胞における増幅によって調製した。ウイルスを、連続的塩化セシウム超遠心
分離、続いて等張性の生理学的緩衝液に対する透析によって脱塩することによっ
て細胞溶解物から精製した。従って、生成したウイルスを、コンフルエントに満
たない（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ＨＥＫ２９３細胞の感染後に生成された
プラークを計数することによって力価測定した。野生型アデノウイルスの混入を
、Ａ５４９細胞でのアデノウイルスの連続的希釈により生成されるプラーク生成
数によって、およびＥ１ａ ＤＮＡ配列に対するＰＣＲを通してアッセイした。
所望のｃＤＮＡの存在を、ＰＣＲによって再確認した。

【００３３】 本実施例についての２型肺胞上皮細胞（ＡＴ２）細胞を、当業者に公知の方法
を使用して、２００〜２３０ｇｍ雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから
単離した。この方法としては、エラスターゼ消化およびＩｇＧでコーティングさ
れたプレート上でのパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）による精製が挙げられる（Ｄ
ｏｂｂｓら、１９８６；Ｒｉｄｇｅら、１９９７；Ｆａｃｔｏｒら、１９９８ｂ
）。アデノウイルス遺伝子の移入に対する感受性について試験するために、ＡＴ
２細胞を、組織培養処理したプラスチックワイヤにプレートし、そしてａｄβ−
ｇａｌでの感染前に２４時間接着させた。図１は、５または１０ｐｆｕ／細胞の
ａｄβ−ｇａｌを感染させ、そして４８時間後にＸ−ｇａｌで染色したラットＡ
Ｔ２細胞を示す。非感染（偽）細胞（左の顕微鏡写真）と比較すると、ａｄβ−
ｇａｌは、１０ｐｆｕ／細胞を使用した場合に、９５％よりも多くの細胞におい
てβ−ガラクトシダーゼを産生した（右の顕微鏡写真）。これらの顕微鏡写真は
、組換えアデノウイルスがインビトロで肺胞上皮細胞中に非常に効率的に遺伝子
を移入し得ることを示す。トランスジーン活性化について試験するために、ＡＴ
２細胞に、５または１０ｐｆｕ／細胞のａｄβ₁を感染させ、そして同様の力価
のａｄβ−ｇａｌを感染させたＡＴ２細胞に対して、および偽感染細胞に対して
比較した。感染の２４時間後に、トランスジーン活性化を、ノーザンブロット分
析（放射性標識したラットβ₁Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ ｃＤＮＡプローブを使
用する）およびウエスタンブロッティング（抗イヌβ₁抗体および西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ免疫検出法を使用する）を通して測定した。５または１０ｐｆｕ
／細胞のａｄβ₁を感染させたＡＴ２細胞は、β₁ｍＲＮＡおよびタンパク質にお
ける著しい増加を有した（図２）。

【００３４】 同様に処理した細胞を、１、５または１０ｐｆｕ／細胞のａｄβ₁を感染させ
たＡＴ２細胞におけるＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ活性の測定のため使用した。これ
らの細胞は、ウアバイン感受性⁸⁶Ｒｂ⁺取り込みにおいて２５０％までの増加を
有し、このことにより、β₁Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子のアデ
ノウイルス媒介遺伝子移入がインビトロで肺胞上皮細胞におけるＮａ，Ｋ−ＡＴ
Ｐａｓｅ活性を増強し得ることが確認された。他の実験において、ＡＴ２細胞に
、ａｄα₁を感染させ、そしてＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅにおける変化は、全くみ
られなかった。図３は、ラットβ₁サブユニットｃＤＮＡ（ａｄβ₁）を発現する
複製欠損アデノウイルスを感染させたラットＡＴ２細胞を示す。Ｋ⁺アナログ（^{8 6} Ｒｂ⁺）のウアバイン感受性取り込みとして示されるＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ機
能が、５または１０ｐｆｕ／細胞を感染させた細胞において２５０％程度まで増
加された。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ（ａｄβ−ｇａｌ）を発現するウイルスによ
る感染は、これらの細胞におけるＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ機能を変化させなかっ
た。

【００３５】 実施例１に開示されるアデノウイルスベクターを使用して、ヒト肺胞上皮細胞
株（Ａ５４９）に感染させ、α₁Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅを発現するアデノウイ
ルスベクターであるａｄα₁の機能性を実証した。これらの細胞は、ヒト気管支
肺胞細胞癌腫に由来した。そしてこれらの細胞は、ＡＴ２細胞といくらかの特徴
を共有する。Ａ５４９は、肺胞上皮機能を研究するために広範に使用されている
（Ｆａｃｔｏｒら、１９９８ｂ；ＭａｓｏｎおよびＷｉｌｌｉａｍｓ １９８０
；Ｓｍｉｔｈ．１９９９）。

【００３６】 Ａ５４９細胞を、組織培養処理されたプラスチック製品（ｐｌａｓｔｉｃｗａ
ｒｅ）上に配置し、そしてアデノウイルスを用いた感染前に、２４時間付着させ
た。細胞を１〜２００ｐｆｕ／細胞のａｄα₁またはａｄβ₁で感染させ、そして
細菌酵素のβガラクトシダーゼ（ａｄβ−ｇａｌ）を産生するＥ．ｃｏｌｉ ｌ
ａｃＺ遺伝子を発現する以外は同一のアデノウイルスを同じ用量用いて感染させ
た細胞と比較した。感染の４８時間後、導入遺伝子活性化およびタンパク質産生
をノーザンブロット（ラットα₁およびβ₁ Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニッ
ト特異的な放射性標識ｃＤＮＡプローブを用いる）およびウエスタンブロット分
析（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの
Ｄｒ．Ｋ．Ｓｗｅａｄｎｅｒより提供される、モノクローナル抗ラットα₁ Ｎ
ａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット抗体を用いる）を用いて測定した。コントロ
ール細胞およびａｄβ₁またはａｄβ−ｇａｌで感染させた細胞と比較した場合
、ａｄα₁感染細胞は、有意なレベルのα₁ｍＲＮＡおよびα₁タンパク質を有し
た。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ機能を、これらの細胞においてＫ⁺アナログ（⁸⁶Ｒ
ｂ⁺）のウアバイン感受性取り込みを測定することによってアッセイした。ａｄ
α₁感染細胞は、＞１０ｐｆｕ／細胞で感染させたＡ５４９細胞において２５０
％まで上昇したＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ活性を有した。ａｄβ₁およびａｄβ−
ｇａｌは、これらのインビトロ実験においてＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ機能に影響
しなかった。（ａｄ＝アデノウイルス）。

【００３７】 ラットα₁サブユニットは、ウアバインに対して非常に耐性である（ＩＣ₅₀＝
１０^-3Ｍ）が、ヒトα₁アイソフォームは、ウアバインに対して感受性である（
ＩＣ₅₀＝１０^-5Ｍ）。α₁サブユニット過剰発現の効果の特異性を証明するため
に、Ａ５４９細胞を、連続した濃度のウアバイン（１×１０^-11〜１×１０^-3Ｍ
）の存在下でのＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ活性（⁸⁶Ｒｂ⁺取り込み）の測定前に、
２５ｐｆｕ／細胞のａｄα¹で感染させた。阻害曲線をコンピューター援用非線
形回帰分析を用いて描いた。ａｄα₁感染Ａ５４９細胞が、ウアバイン阻害曲線
を有する結果が示され、右へ移動した阻害曲線は、減少したウアバイン感受性を
示す。非線形回帰分析を用いて分析されたａｄα₁感染細胞からのデータにより
、２つのウアバイン感受性パターンの存在を示唆する二相性パターンが明らかと
なった。さらなる分析により、２ログより多く異なる２つのＩＣ₅₀が明らかとな
り、２つのα₁Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅアイソフォーム（ウアバイン感受性ヒト
およびウアバイン感受性ラット）の存在が確認された。これらの曲線の非線形回
帰分析は、これら各アイソフォームの相対的な寄与の推定を可能にした。この分
析により、トランスジェニックα₁アイソフォームが、測定されたＮａ，Ｋ−Ａ
ＴＰａｓｅ活性全体の６０％に寄与することが示された。これは、感染されなか
った細胞に見出された上記のＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ活性において観察された上
昇の全ての原因となる。

【００３８】 これらの結果により、ａｄα₁ベクターの機能性が確認され、そしてこれらの
結果は、ラット上皮実験と対照的に、ヒト肺胞上皮細胞が、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａ
ｓｅ活性を上昇するためにα₁サブユニットの過剰発現を必要とすることを示唆
する。

【００３９】 他の研究が、ラットα₂ｃＤＮＡ（ａｄα₂）を発現するアデノウイルスベクタ
ーを用いて実施された。このウイルスは、ヒト肺胞上皮細胞株（Ａ５４９細胞）
を感染させるために使用された（Ｒｉｄｇｅら、１９９９）。１００ｐｆｕ／細
胞で感染されたＡ５４９細胞は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ ｍＲＮＡ（ラットサ
ブユニット特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いたｒｔＰＣＲを介して測定
し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して規準化した）および発現（モノクロー
ナル抗ラットα₂抗体を用いたウエスタンブロット分析を介して測定した）にお
いて有意な上昇を有した。ウアバイン感受性⁸⁶Ｒｂ⁺取り込みを用いて測定され
たＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ活性は、ｃＤＮＡを発現する以外は同一のアデノウイ
ルス（ａｄＮｕｌｌ）で感染させたＡ５４９細胞と比較して、＞２００％上昇さ
れた。

【００４０】 （実施例２：インビボにおけるラット肺へのアデノウイルス媒介遺伝子移入） Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子過剰発現が、肺水腫クリアランス
の達成に必要な経上皮の浸透勾配（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｓｍｏ
ｔｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔ）に影響し得るかどうかを試験するために、正常な２
８０〜３００ｇｍの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、実施例１に開
示されるベクターで感染させた。必要である最適な用量を決定するための用量応
答実験に続いて、ラットに、４×１０⁹ｐｆｕ／動物を与えた。

【００４１】 ２５０〜３００ｇｍの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、１４ｇの
アンギオカテーテル（ａｎｇｉｏｃａｔｈｅｔｅｒ）を用いる経口気管内挿管の
前に、ペントバルビタールを用いて軽く鎮静させた。選択した用量のアデノウイ
ルスを、８００ｍｌの５０％界面活性剤／５０％透析緩衝液の混合物（Ｓｕｒｆ
ａｎｔａ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ
）中で懸濁した。２００ｍｌのアデノウイルス溶液を点滴注入する直前に、残存
した肺の量にアプローチするためおよびラットが呼気することを刺激するために
、各ラットの胸郭を、円周的に圧迫した。５分間隔で動物の９０°回転を点在さ
せた、４回の点滴注入を、アデノウイルスの不変の送達を促進するために使用し
た。アデノウイルスビヒクルの気管内点滴注入の直後に、ラットの圧迫をやめ、
その動物が深く、力強い吸息を取ることを可能にし、これはアデノウイルスベク
ターの広範囲に及ぶ、末端の分散を促進した。この送達スキームの効率を試験す
るために、４匹のラットに、核標的されたＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子を発現
し、そして細菌酵素のβガラクトシダーゼ（ａｄβ−ｇａｌ）を産生する、４×
１０⁹ｐｆｕのアデノウイルスを与えた。７２時間後、これらの動物の肺を回収
し、固定し、そしてβガラクトシダーゼ発現の証明のために、Ｘ−ｇａｌ（βガ
ラクトシダーゼに対する基質）を用いて染色した（Ｊａｆｆｅら，１９９２；Ｍ
ａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、１９９３）。図４は、界面活性剤に基づくビヒクルに
おけるアデノウイルスの気管点滴注入を介した、４×１０⁹ｐｆｕのａｄβ−ｇ
ａｌを与えられたラットの肺のＸ−ｇａｌ染色の背側図および腹側図を示す。播
種性の送達および導入遺伝子発現を、肺全体にわたる青色の存在によって確認し
た。これらの肺のＸ−ｇａｌ染色により、各ａｄβ−ｇａｌ肺の全ての葉および
区（ｓｅｇｍｅｎｔ）における広範囲におよぶβガラクトシダーゼ発現が明らか
となり、使用される送達スキームが、インビボにおけるアデノウイルス媒介Ｎａ
，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ過剰発現の研究に必要な、広範囲におよぶウイルス送達を可
能にすることを確認した。

【００４２】 Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ過剰発現が、肺胞水腫クリアランスに影響し得るかど
うかを決定するために、ラットを４×１０⁹ｐｆｕのａｄα₁またはａｄβ₁のい
ずれかで感染させた。感染の７日後、肺胞水腫クリアランスを、十分に確立され
た単離された肺調製を用いて測定した（Ｏｌｉｖｅｒａら、１９９３、１９９４
；Ｂａｒｎａｒｄら、１９９７；Ｓｚｎａｊｄｅｒら、１９９５；Ｒｕｔｓｃｈ
ｍａｎら、１９９３）。コントロールと比較すると、ａｄβ₁は、肺水腫クリア
ランスを＞１００％上昇した。図５は、４×１０⁹ｐｆｕのａｄα₁で感染させた
ラット中の肺液体（ｌｕｎｇ ｌｉｑｕｉｄ）クリアランスが、感染の７日後に
＞１００％上昇されることを示す。α₁サブユニットのアデノウイルス媒介過剰
発現は、肺液体クリアランスを変化させなかった。抗イヌβ₁Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰ
ａｓｅ抗体を用いたこれらの肺の免疫染色は、ａｄβ₁を与えられたラットの肺
胞上皮においてのみ、高レベルのβ₁タンパク質の発現を示した。図６は、偽感
染されたかまたは４×１０⁹ｐｆｕのａｄα₁もしくはａｄβ₁で感染されたかの
いずれかのラット肺の顕微鏡写真（２００×）を示す。肺を、抗イヌβ₁Ｎａ，
Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット抗体を用いて感染の７日後に免疫染色した。右の
写真に見出され得るように、ａｄβ₁は、気管の点滴注入を介して送達され、全
ての肺胞上皮細胞においてβ₁タンパク質発現の顕著な上昇を生じた。これは、
界面活性剤に基づくアデノウイルス送達系の使用が、肺胞上皮におけるトランス
ジェニックタンパク質の過剰発現を達成し得ることを示す。これらの結果は、単
一Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット、β₁Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ遺伝子の
過剰発現が、インビボにおいてＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅの発現および機能を増大
し得ることを示す。

【００４３】 （実施例３：急性肺傷害（急性高酸素症）のモデルにおけるアデノウイルス媒
介Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子過剰発現の試験） ６４時間、１００％のＯ₂に曝露されたラット肺（急性高酸素症）は、Ｎａ，
Ｋ−ＡＴＰａｓｅ発現を低下し、そして肺水腫クリアランスを減少した（Ｏｌｉ
ｖｅｒａら、１９９５）。１００％のＯ₂で処理された肺から単離されたＡＴ２
細胞は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ発現および機能において類似した減少を有する
。従って、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ発現は、急性肺傷害のこのモデルのＡＴ２細
胞およびラット肺における機能と平行する。高酸素症のラットは、急性の病気で
あり、高い死亡率（７２時間で、＞５０％）、体重減少を有し、そして有意な胸
水を有する（Ｃｒａｐｏら、１９８０）。アデノウイルス媒介のＮａ，Ｋ−ＡＴ
Ｐａｓｅサブユニット遺伝子の過剰発現は、肺胞上皮におけるＮａ，Ｋ−ＡＴＰ
ａｓｅの発現および機能の回復が、後の急性高酸素症肺傷害に見出される肺水腫
クリアランスにおける減少を弱め得るかどうか決定するために、使用された。

【００４４】 雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、４×１０⁹ｐｆｕのａｄα₁、ａ
ｄβ₁、またはｃＤＮＡを含まない以外は同一のアデノウイルス（ａｄＮｕｌｌ
）を与えた。これらのベクターは、実施例２に開示されるように気管の点滴注入
を介してラットに送達され、続いて７日間回復された。次いでこれらを、液体で
充填された単離された肺調製物を用いた肺水腫クリアランスの測定前に、６４時
間１００％の基準気圧酸素に曝露した。この方法は、²²Ｎａ⁺、³Ｈ−マンニトー
ルおよびＥｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅ Ｔａｇｇｅｄアルブミンを含む等張性の等浸
透圧性溶液の、気腔への点滴注入を包含する。脈管構造を、ＦＩＴＣ−タグ化（
ＦＩＴＣ−ｔａｇｇｅｄ）アルブミンを含む類似した等張溶液を用いて、一定の
圧力で還流する。肺を、温度およびｐＨが正常な生理学的範囲内に維持される、
等張性の緩衝化塩溶液からなる浴槽中に浸す。６０分の実験期間にわたる肺胞Ｅ
ｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅ Ａｌｂｕｍｉｎの濃度における変化を使用して、肺液体
クリアランスを算定する。気腔部と血管部との間の標識された物質の移動を用い
て、肺胞透過性および内皮透過性を測定する（Ｆａｃｔｏｒら、１９９８ｂ、Ｏ
ｌｉｖｅｒら、１９９３、Ｏｌｉｖｅｒら、１９９４、Ｏｌｉｖｅｒら、１９９
５、Ｂａｒｎａｒｄら、１９９７、Ｓｚｎａｊｄｅｒら、１９９５、Ｒｕｔｓｃ
ｈｍａｎら、１９９３）。引き続く研究において、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ過剰
発現が、肺水腫クリアランスおよび急性高酸素症の肺損傷の間の生存に影響する
ことを見出した。ａｄα₁、ａｄＮｕｌｌおよび非感染コントロールと比較した
場合、感染した高酸素症ラットにおける肺水腫のクリアランスは、３００％を超
えるまで増加した。図７は、肺の液体クリアランスが、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ
β₁サブユニット遺伝子（ａｄβ₁）を過剰発現するアデノウイルスに感染させ
たラットにおける急性高酸素症の６４時間後に、３００％まで増加することを示
す。ａｄＮｕｌｌ動物およびａｄα₁動物における肺の液体クリアランスには、
非処置化高酸素症コントロールとの違いはなかった。これらの結果は、Ｎａ，Ｋ
−ＡＴＰａｓｅ過剰発現が、急性の肺損傷の存在下で肺胞上皮機能を回復するこ
とを示唆する。

【００４５】 生存研究を、感染したａｄβ₁ラットにおいて行った。成体の雄Ｓｐｒａｇｕ
ｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、４×１０⁹ｐｆｕのａｄβ₁に感染させ、そして７日
間回復させた後、１４日目まで１００％の基準気圧のＯ₂に暴露させた。ａｄβ₁ 感染したラットの全ては、１４日の実験期間の終わりまで生存した（図８）。ａ
ｄα₁およびａｄＮｕｌｌ群における生存には、界面活性剤コントロールまたは
未処置コントロール（生存のメジアン＝約４日）との違いはなかった。他の群と
異なり、ａｄβ₁動物は、それらの体重を十分に維持し、そして胸水を有さなか
ったように見えた。従って、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子の過剰
発現は、肺水腫クリアランス、および急性肺損傷の間の生存を改善する。これら
の結果はまた、肺胞上皮におけるＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ機能の重要性について
のさらなる支持を提供する。

【００４６】 （実施例４：うっ血性心不全（高血圧肺水腫）のラットモデルにおけるＮａ，
Ｋ−ＡＴＰａｓｅ過剰発現の影響） 左心房圧の上昇は、ラット肺における肺水腫を発症する。このモデルは、うっ
血性心不全に起因する肺水腫の研究のために以前に用いられた。１５ｃｍＨ₂Ｏ
の左心房圧の存在下での、液体に満たされた（ｆｌｕｉｄ−ｆｉｌｌｅｄ）単離
された肺調製物を用いる、肺水腫クリアランスの測定は、５０％を超えるクリア
ランスの低下を示す。さらに、低分子の溶質に対する肺胞の透過性を、これらの
動物において、わずかに増加させる。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅおよび先端のＮａ ⁺ チャネルインヒビターを用いる実験は、能動的輸送のこの低下が、部分的に、
これらの動物において見出されたクリアランスの低下を説明することを示唆する
。

【００４７】 成体の、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、本明細書中で開示される
ように、４×１０⁹ｐｆｕのａｄβ₁かまたはａｄＮｕｌｌのいずれかに感染させ
た。感染の７日後、これらの肺を単離し、そして肺水腫クリアランスを１５ｃｍ
Ｈ₂Ｏの左心室（肺静脈）圧の存在下で測定した。０ｃｍＨ₂Ｏの左心室圧を用い
て研究した非感染コントロールと比較して、肺水腫クリアランスは、ａｄＮｕｌ
ｌおよび非感染コントロールにおいて５０％まで低下した。ａｄβ₁感染した動
物における水腫クリアランスは、１５ｃｍＨ₂Ｏの左心室圧で研究した他の動物
と比較して１００％を超えるまで増加した。図９は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ
β₁サブユニット遺伝子のアデノウイルス媒介過剰発現が、うっ血性心不全のラ
ットモデルにおける上昇した左心室圧の存在下でのラット肺において、４×１０ ⁹ ｐｆｕのアデノウイルスの気管内滴注の７日後に、肺水腫クリアランスを正常
に戻すことを示す。従って、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット過剰発現が、
うっ血性心不全のモデルにおいてさえ、肺水腫クリアランスを維持し得る。

【００４８】 （実施例５：霊長類肺におけるＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ過剰発現の効果） Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ過剰発現が、霊長類肺における肺水腫クリアランスに
影響し得るか否かを決定するために、アデノウイルスを正常な成体カニクイザル
に投与した。１×１０¹⁰ｐｆｕのａｄα₁またはａｄβ₁を含む１０ｍｍの５０％
界面活性剤／５０％生理食塩水ビヒクルを、これらのサルの右下肺葉の後肺底区
に送達した。ウイルスを有さない同容量の界面活性剤／生理食塩水ビヒクルを、
内部コントロールとして用いるためにこれらの同じサルに右下葉の後肺底区に送
達した。このサルを、３日間回復させた後、肺水腫クリアランスの測定した。Ｅ
ｖａｎ’ｓブルータグ化アルブミントレーサー溶液を含む、２０ｍｌの等張性緩
衝化塩溶液を、右下葉および左下葉の後肺底区に送達した。１０分後１００μｌ
のトレーサー溶液を、Ｅｖａｎ’ｓブルーアルブミン濃度のベースライン測定の
ために吸引した。６分後、最終吸引を行った。Ｅｖａｎ’ｓブルーアルブミン濃
度の変化を用いて、肺水腫クリアランスを計算し、そしてサルを回復させた。

【００４９】 偽感染した左下葉と比較して、肺水腫クリアランスは、ａｄα₁に感染させた
後に６倍を越えるまで増加した。上記に列挙したラット実験と異なり、ａｄβ₁
は、この霊長類モデルにおける肺水腫クリアランスに影響しなかった。このデー
タは、ヒト肺胞上皮細胞（Ａ５４９）由来の上記に列挙した研究を実証し、そし
てα₁サブユニットが、霊長類、そしておそらくヒト肺胞上皮における律速なサ
ブユニットであり得ることを示唆する。

【００５０】 （実施例６：ヒト肺上皮細胞をインビトロで形質導入するための、高能力、複
製不能アデノウイルスベクターを用いる、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット
過剰発現の効果） アデノベクター依存性高能力ヘルパーウイルスが、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ機
能に、インビトロで影響し得るか否かを試験するために、ヒト肺上皮細胞（Ａ５
４９）を、ヒトＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ α₁ｃＤＮＡ（ｈｖα₁）を発現する高
能力ヘルパーウイルス依存性アデノウイルスに感染させた。細胞を、８×１０¹⁰ ウイルス粒子のｈｖα₁に感染させた。感染の４８時間後のＮａ，Ｋ−ＡＴＰａ
ｓｅ活性をウアバイン感受性⁸⁶Ｒｂ⁺取込みを測定することにより確認した。ｃ
ＤＮＡ（ｈｖＮｕｌｌ）を発現しない類似のウイルスに感染させた細胞と比較し
て、ｈｖα₁に感染させたＡ５４９細胞は、約２５０％まで増加したＮａ，Ｋ−
ＡＴＰａｓｅ活性を有した。これらの細胞のウエスタンブロット分析は、ヒトＮ
ａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅα₁サブユニットタンパク質レベルのおいて有意な増加を
示した。これらの結果は、Ａ５４９細胞においてアデノベクターを発現する第１
世代のＮａ、ＡＴＰａｓｅを用いてみられた結果に類似する。これらはまた、高
能力、ヘルパーウイルス依存性アデノベクターが、能動的Ｎａ⁺輸送をインビト
ロで増強し得ることを示す。

【００５１】 （材料および方法） （ヘルパーウイルス依存性アデノウイルスベクターの産生） 本明細書中に記載される発明は、全てのアデノウイルスタンパク質コード遺伝
子を欠くヘルパーウイルス依存性アデノウイルスベクターの使用を用いる。これ
らはのベクターは、アデノウイルスＩＴＲ’ｓおよびイントロンＤＮＡに隣接す
る発現カセットを含むＮａ Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットを含む、シャトルプ
ラスミドの、ＨＥＫ２９３ｃｒｅ４細胞へのトランスフェクション、続いてトラ
ンス位でアデノウイルスタンパク質配列を提供する複製欠損アデノウイルスとの
感染により産生され、それによりシャトルプラスミド由来のＤＮＡ配列を含むゲ
ノムを含む組換えアデノウイルスの産生を可能にする。ヘルパーウイルスのパッ
ケージング配列は、ｌｏｘＰ部位に隣接する。Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えば、
ＨＥＫ２９３ｃｒｅ４）を発現する細胞に感染させる場合は、ｌｏｘＰ部位間の
配列（すなわち、パッケージングシグナル）を切除して、それを非パッケージ化
可能にする。このウイルスはまた、引き続くヘルパーウイルス依存性アデノウイ
ルスの産生および使用の工程において、このアデノウイルスによる汚染の容易な
検出を可能にする、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む。

【００５２】 （１．ｐＣＭＶα₁、ｐＣＭＶα₂、およびｐＣＭＶβ₁の産生） ヒトα₁、α₂、またはβ₁ Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子に関
する全長ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはｐＣＩ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のポリクローニング部位へと挿入した。これらのベクター
は、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターおよびヒトＳＶ４０ウイルス
または成長ホルモンポリアデニル化シグナルのいずれかを含む。これらの発現カ
セット内のＰｍｅ１エンドヌクレアーゼ部位を、標準的ＤＮＡクローニング技術
を用いて除去した。このように生成されたシャトルプラスミドベクター（ｐＣＭ
Ｖα₁、ｐＣＭＶα₂、およびｐＣＭＶβ₁と命名した）は、ヒトサイトメガロウ
イルス最初期プロモーターエレメント、ヒトＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ ｃＤＮＡ
およびポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを含む。

【００５３】 （２．ｐＨＶ１０およびｐＨＶ１２の産生） 開示されるシャトルプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉの複製起源およびアンピシリ
ン耐性遺伝子（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ））を含む真核生物発現ファージミド骨格を用いる。ポリクローニング部位へ
挿入されるものは、左ＩＴＲおよびパッケージングシグナル（ヒトアデノウイル
ス５型地図単位０−１．２に対応する）および右ＩＴＲ（地図単位９９．６−１
００に対応する）である。これらのフラグメントを、テンプレートとして初代複
製不能（ｉｎｃｏｍｂｅｔｅｎｔ）アデノウイルスを用いるＰＣＲを介して生成
した。これらの要素の間には、ヒトＨＧＰＲＴ遺伝子由来の１０．３ｋｂまたは
１２ｋｂのイントロンＤＮＡ（それぞれ、ｐＨＶ１０およびｐＨＶ１２）がある
。これらのプラスミドを産生するために用いられる１０．３ｋｂフラグメントを
、ヒトｈＧＰＲＴ遺伝子のＥｃｏＲＩ消化により得た。１２ｋｂフラグメントを
、ヒトＨＧＰＲＴ遺伝子の１．７ｋｂ ＢｇＩＩＩフラグメントを１０ｋｂ Ｅ
ｃｏＲＩフラグメント遺伝子内のＢｇＩＩＩ部位へと挿入することにより得た。
ｐＣＭＶα₁、ｐＣＭＶα₂、およびｐＣＭＶβ₁由来の発現カセットを含むＮａ
，Ｋ−ＡＴＰａｓｅを、標準的なＤＮＡクローニング法を用いて、制限エンドヌ
クレアーゼ消化によりそれらの骨格から切除し、そしてイントロンＤＮＡ内に（
センス方向またはアンチセンス方向で）挿入して、シャトルベクター、ＰＨＶ１
０α₁、ｐＨＶ１０α₂、およびｐＨＶ１２β₁を生成させる。

【００５４】 （３．ｈｖα₁、ｈｖα₂、およびｈｖβ₁の産生） ｐＨＶ１０α₁、ｐＨＶ１０α₂およびｐＨＶ１２β₁の、それぞれ１４．６ｋ
ｂ、１４．８ｋｂ、および１５．０ｋｂのヘルパーウイルス依存性ベクター部分
を、Ｐｍｅ１を用いる制限エンドヌクレアーゼ消化を介してその骨格から切除し
、そして低融点アガロースを用いるアガロースゲル電気泳動を介して分離する。
市販のシステム（Ｗｉｚａｒｄ Ｐｒｅｐｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ
，ＷＩ）を使用して、このゲルからフラグメントを取り出す。次いで、これらの
フラグメントを、製造業者の指導（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ
，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を通して脂質ベースの方法論を用いて、ＨＥＫ２９
３ｃｒｅ４細胞にトランスフェクトする。完全細胞培地を吸引し、そしてリポフ
ェクションの前に、抗生剤または抗真菌剤なしの限定培地に交換する。２時間後
に、完全培地を添加する。１５ｃｍの組織培養処理したプラスチック皿で増殖し
たＨＥＫ２９３ｃｒｅ４細胞のコンフルエントに満たない層（ｌａｗｎ）（７５
〜８０％のコンフルエント）を使用する。ＨＥＫ２９３ｃｒｅ４細胞は、アデノ
ウイルスＥ１ａおよびｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子（Ｐａｒｋｓら、１９９６）
の両方を発現する安定な形質転換体である。トランスフェクト後の約１８〜２４
時間、これらの細胞を、１ｐｆｕ／細胞のパッケージング不能Ｅ１ａアデノウイ
ルス（ａｄＬＣ８ｃｌｕｃ）に感染させる。ａｄＬＣ８ｃｌｕｃのパッケージン
グ配列は、ＩｏｘＰ部位に隣接する。ｃｒｅ発現細胞において発現する場合、Ｉ
ｏｘＰ部位の間のＤＮＡ配列を切除する。ａｄＬＣ８ｃｌｕｃからのパッケージ
ング配列の除去が、アデノウイルスキャプシドへの挿入を不可能にする（例えば
、パッケージできない）。ａｄＬＣ８ｃｌｕｃゲノムの残部は、アデノウイルス
キャプシドを産生するアデノウイルスタンパク質遺伝子をトランスで提供し、こ
のアデノウイルスキャプシドに、ｐＨＶ１０α₁、ｐＨＶ１０α₂、およびｐＨＶ
１２β₁由来のヘルパーウイルス依存性パッケージング可能ＤＮＡを挿入し得る
。シャトルベクターから切除されたＤＮＡフラグメントの大きさは、パッケージ
ングし得ると予想されるもの未満である（ＰａｒｋｓおよびＧｒａｈａｍ，１９
９７）。２つのヘルパーウイルス依存性ベクターの、野生型アデノウイルスゲノ
ムサイズの７５％と１０５％との間である単一のゲノムへの自発的連結（コンカ
テマー化（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ））は、ＨＥＫ２９３ｃｒｅ４
細胞で自発的に起こり、野生型アデノウイルスタンパク質コード配列を欠くヘル
パーウイルス依存性アデノウイルスベクターの産生に有効な方法を作製する（Ｍ
ｏｒｓｙら、１９９８）。ｐＨＶ１０α₁、ｐＨＶ１０α₂、およびｐＨＶ１２β ₁ を、コンカテマー化の後で３０ｋｂを超えないアデノウイルスゲノムを産生す
るように慎重に設計した。これらのベクターの質量は、実質的にａｄＬＣ８ｃｌ
ｕｃのゲノム未満である。これが、ａｄＬＣ８ｃｌｕｃの予想外の混入／キャリ
ーオーバーからのヘルパー依存性アデノウイルスの、超遠心分離を介する効率的
な分離を可能する。このように産生されるＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅを含む、ヘル
パーウイルス依存性アデノウイルスは、ｈｖα₁、ｈｖα₂およびｈｖβ₁である
。

【００５５】 （４．ｈｖα₁、ｈｖα₂およびｈｖβ₁の伝播） トランスフェクトおよび感染の２４時間後、ＨＥＫ２９３ｃｒｅ４細胞を収集
し、そして−７０℃での凍結および３７℃での解凍を６サイクル行って熱的分裂
させる。得られた粗ウイルス溶解物から、低速遠心分離（４℃で、８００×ｇ×
１０分間）によって細胞細片を取り除き、得られた上清を、ａｄＬＣ８ｃｌｕｃ
の３ｐｆｕ／細胞で同時に感染させた、ＨＥＫ２９３ｃｒｅ４細胞のコンフルエ
ントな層を含む１５ｃｍの組織培養処理した皿を感染させるために使用する。２
４時間後に、細胞を再び収集し、そして熱的分裂させる。このサイクルを４〜５
回繰り返す。次いで、この細胞を、−７０℃での凍結および３７℃での解凍を６
サイクル行って溶解する。得られたウイルス溶解物から、遠心分離（４℃で、８
００×ｇを１０分間）によって細胞細片を取り除く。得られた上清を、１．４０
ｇ／ｍｌの密度を有する２．５ｍｌのＣｓＣｌ溶液の上端に、１．２５ｇ／ｍｌ
の密度を有する２．５ｍｌのＣｓＣｌ溶液を層状にすることで作製されるＣｓＣ
ｌ勾配上に、層状にする（両方の溶液は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７
．４）、１ｍＮのＭｇＣＬ₂から作製し、使用前にオートクレーブによって滅菌
する）。この勾配を、スイングバケツローター（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ
４１ｔｉ）中、１５０，０００×ｇ（３５，０００ｒｐｍ）で、１時間２０℃で
遠心分離する。この遠心分離チューブの外側をイソプロピルアルコールで消毒し
、得られた遠心分離チューブの底に最も近いバンドを、（滅菌した（２０ｇ）を
使用して、このチューブの壁を通して）吸引する。次いで、この吸引液を、１．
３３ｇ／ｍｌの密度を有する滅菌したＣｓＣｌ溶液８ｍｌの上に層状にし、そし
て１５０，０００×ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１ｔｉ、３５，０００ｒｐｍ）
で、１８時間２０℃で遠心分離する。得られたバンドを、上記のように吸引する
。（Ｆａｃｔｏｒら、１９９８ ａおよびｂ）１０％グリセロールを含む滅菌リ
ン酸緩衝化生理食塩水の１ｌに対して、一定に攪拌しながら４℃で４時間透析し
、この透析液を時間ごとに交換することによって、ＣｓＣｌを取り出す。２６０
ｎｍでの光学密度読み取り（１０Ｄ＝１０¹²ウイルス粒子）、およびＮａ，Ｋ−
ＡＴＰａｓｅサブユニット特異的抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用するラット２型肺胞肺胞上皮細胞の免疫
細胞化学によって、系列濃度のｈｖα₁、ｈｖα₂またはｈｖβ₁での感染に続い
て、ヘルパーウイルス依存性ベクターの力価を定量する。感染性ヘルパーウイル
ス依存性粒子の数を決定するために、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットの増
大した発現を示す細胞の数を数える。ＨＥＫ２９３細胞の感染に続くプラーク産
生カウントを通して、そして照度計を使用する細胞溶解物の発光の測定によって
、ａｄＬＣ８ｃｌｕｃの存在をアッセイする。ヒトＡ５４９細胞の感染に続くプ
ラーク生成のカウントの測定によって、そしてＥ１ａ特異的オリゴヌクレオチド
プライマーを使用するＰＣＲを通して、野生型アデノウイルスの存在をアッセイ
する。

【００５６】 （引用刊行物）

【００５７】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、０（偽）、５または１０ｐｆｕ／細胞のベクターａｄβ−ｇａｌで感
染させたラットＡＴ２細胞を示す顕微鏡写真である；遺伝子発現についてのＸ−
ｇａｌ染色を、感染後４８時間で行った。

【図２】 図２は、ラットβ₁Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子に対応する、
放射性標識したｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析を示す（パネル
Ａ）；パネルＢは、ポリクローナル抗イヌβ₁Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ抗体を用
いた肺全体の組織のウェスタンブロットを示す。

【図３】 図３は、ラットＡＴ２細胞へのアデノウイルス媒介Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅβ ₁ 遺伝子移入後のＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ機能を示す；Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ
機能を、偽感染コントロールに対する放射性標識したＫ⁺アナログ、⁸⁶Ｒｂ⁺のウ
アバイン感受性取り込みとして測定した（^*ｐ＜０．００１、Ｓｔｕｄｅｎｔ
ｔ検定）。

【図４】 図４は、界面活性剤に基づくビヒクルにおけるアデノウイルスの気管点滴注入
を介して４×１０⁹ｐｆｕのａｄβ−ｇａｌを与えたラットの肺のＸ−ｇａｌ染
色の背側および腹側の図を示す。

【図５】 図５は、偽感染コントロールに対する、４×１０⁹ｐｆｕのａｄβ₁で感染させ
たラットにおける肺の液体クリアランスを示す（^*ｐ＜０．００１、Ｓｔｕｄｅ
ｎｔ ｔ検定）。

【図６】 図６は、偽感染したかまたは４×１０⁹ｐｆｕのａｄα₁もしくはａｄβ₁で感
染させたかのいずれかのラット肺の顕微鏡写真（２００倍）を示す；肺を、抗イ
ヌβ₁Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニット抗体を用いて、感染後７日目に免疫
染色した。

【図７】 図７は、未処置コントロールに対する、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅβ₁サブユニ
ット遺伝子（ａｄβ₁）を過剰発現するアデノウイルスに感染させたラットにお
ける６４時間の急性高酸素症後の肺の液体クリアランスを示す（^*ｐ＜０．００
２、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。

【図８】 図８は、４×１０⁹ｐｆｕのａｄβ₁で感染させ、そして１００％基準気圧Ｏ₂
に暴露する前に７日間回復させたラットの生存率を示す。

【図９】 図９は、１５ｃｍＨ₂Ｏの左心房圧にて研究した、偽感染コントロールに対す
る、上昇した左心房圧の存在下で測定したａｄβ₁感染ラットにおける肺の液体
クリアランスを示す（^*ｐ＜０．００１、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。

【図１０】 図１０は、アデノウイルス遺伝子をコードせず、そしてヒトＮａ，Ｋ−ＡＴＰ
ａｓｅα₁サブユニットｃＤＮＡを含む、高能力アデノウイルスベクターに感染
させたヒト肺胞上皮細胞におけるＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ活性を示す。活性を、
ウアバイン感受性⁸⁶Ｒｂ⁺取り込みとして測定した。データは、ｈｖＮｕｌｌ感
染コントロール 対 ｈｖＮｕｌｌα₁感染コントロールに対して正規化されて
表わされる（^*ｐ＜０．００１、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年７月６日（２００１．７．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項２】 前記上皮細胞が肺胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項３】 少なくとも１つのサブユニットがラットにおいて過剰発現さ れ、そしてα₁ である、請求項１に記載の方法。

【請求項４】 以下： （ａ）アデノウイルスタンパク質をコードする全てのヌクレオチド配列を欠失 したアデノウイルス；ならびに （ｂ）該遺伝ベクターを有しない肺細胞におけるレベルと比較して、過剰発現 のレベルで少なくとも１つのＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットをコードす るヌクレオチド配列、 を含む、組換え遺伝ベクター。

【請求項５】 外因性調節エレメントをさらに含む、請求項４に記載のベク
ター。

【請求項６】 組換え遺伝ベクターを用いてトランスフェクトされた宿主細
胞であって、該ベクターが、以下： （ａ）アデノウイルスタンパク質をコードする全てのヌクレオチド配列を欠失 したアデノウイルス；ならびに （ｂ）該遺伝ベクターを有しない肺細胞におけるレベルと比較して、過剰発現 のレベルで少なくとも１つのＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットをコードす るヌクレオチド配列、 を含む、宿主細胞。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA11 CA04 DA02 DA03 EA02 FA15 FA20 GA11 HA17 4B065 AA91X AA93X AA93Y AA95Y AB01 AC14 BA02 CA31 CA44 4C084 AA13 CA53 ZA59 4C087 AA01 AA03 BC83 CA12 NA14 ZA59

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 罹患した哺乳動物肺の肺水腫を低減するための方法であって
   、該方法は、以下： （ａ）以下を含む組換え遺伝ベクターを得る工程 （ｉ）アデノウイルスタンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３をコードするヌク レオチド配列を欠失したアデノウイルス；および （ｉｉ）該遺伝ベクターを有しない肺細胞におけるレベルと比較して、過 剰発現のレベルでＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットをコードするヌク レオチド配列；ならびに （ｂ）Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットをコードする該ヌクレオチド配列 が過剰発現できる条件下で、該遺伝ベクターを該肺の上皮細胞に移入する工程 、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記アデノウイルスが高能力であり、そしてヘルパーウイル
   ス依存性である、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記上皮細胞が肺胞である、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 コードされた前記サブユニットが、ａ₁、ａ₂、および／また
   はｂ₁である、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 以下： （ａ）アデノウイルスタンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよびＥ３をコードするヌク レオチド配列を欠失したアデノウイルス；ならびに （ｂ）該遺伝ベクターを有しない肺細胞におけるレベルと比較して、過剰発現 のレベルでＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットをコードするヌクレオチド配 列、 を含む、組換え遺伝ベクター。
6. 【請求項６】 調節エレメントをさらに含む、請求項５に記載のベクター。
7. 【請求項７】 組換え遺伝ベクターを用いてトランスフェクトされた宿主細
   胞であって、該ベクターが、以下： （ａ）アデノウイルスタンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよびＥ３をコードするヌク レオチド配列を欠失したアデノウイルス；ならびに （ｂ）該遺伝ベクターを有しない肺細胞におけるレベルと比較して、過剰発現 のレベルでＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅサブユニットをコードするヌクレオチド配 列、 を含む、宿主細胞。