JP2002531132A

JP2002531132A - 改良された効率を有するアグロバクテリウム媒介植物形質転換法

Info

Publication number: JP2002531132A
Application number: JP2000586924A
Authority: JP
Inventors: チヨン，ミン; フライ，ジヨイス
Original assignee: モンサントテクノロジーエルエルシー
Priority date: 1998-12-11
Filing date: 1999-12-09
Publication date: 2002-09-24
Also published as: ATE331035T1; BR9916103A; AR021628A1; WO2000034491A3; US20010054186A1; DE69932082T2; ZA200104091B; WO2000034491A2; US7045357B2; EP1137790B1; AU2049200A; CA2353796C; EP1137790A2; DK1137790T3; DE69932082D1; CA2353796A1; AU773764B2; PT1137790E; ES2267307T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物のための迅速な形質転換及び再生の系に関する。特に、本発明は、植物組織調製系に関する。その形質転換法は、改良された農業経済学的品質を有する稔性植物の作製のための効率的かつ信頼性のある方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景本発明は、植物バイオテクノロジーの分野に関する。より詳細には、本発明は
、単子葉植物又は双子葉植物のゲノムへ遺伝子成分を組み込む方法に関する。特
に、トウモロコシ、ダイズ、イネ及びコムギを遺伝学的に形質転換するための再
現性のある系が本明細書に提供される。最も具体的には、コムギを形質転換する
ための系がある。

【０００２】本発明の方法は、アグロバクテリウムを再生可能な植物の細胞又は組織と共培
養する際の新規な条件を含む。例示的な方法は、多様な選択可能又はスクリーニ
ング可能なマーカー系を使用して、多数の異なる植物種を用いて、核酸を異なる
再生可能組織へ導入するための、アグロバクテリウム媒介形質転換を使用する改
良された方法を含む。本発明は、稔性トランスジェニック植物、特にコムギも提
供する。他の態様において、本発明は、安定的に形質転換された稔性の植物、配
偶子及びこれらの植物由来の子孫の作製に関する。

【０００３】過去十年の間に、組換えＤＮＡ技術により、広範な生物に由来する遺伝子を穀
類植物へ移入することが可能となった。この進歩により、害虫、病気及び除草剤
に対する植物の抵抗力を改良したり、植物産物の品質を変化させるため生合成過
程を修飾したりするための非常に大きな機会が与えられた（Ｋｎｕｔｓｏｎら，
１９９２；Ｐｉｏｒｅｒら，１９９２；Ｖａｓｉｌら，１９９２）。しかしなが
ら、経済的に重要な植物の生産性の高い作製に適した、効率のよいアグロバクテ
リウム媒介形質転換法の利用可能性は、限定されている。

【０００４】植物形質転換のため多くの方法が試みられてきたが、高度に効率的な方法はほ
んの少数である。植物細胞のＤＮＡ形質転換のための方法には、アグロバクテリ
ウム媒介植物形質転換（例えば、米国特許第５，４１６，０１１号及び第５，５
６９，８３４号及び国際特許公開第９７／４８８１４号を参照のこと）が含まれ
る。さらに、プロトプラスト形質転換、花粉への遺伝子移入、生殖器官への注入
、未成熟胚への注入、及び粒子撃ち込みが、植物の形質転換のため利用されてい
る。特定の植物系にとって利用可能な形質転換法の数にも関わらず、いくつかの
異なる穀類及び多様な再生可能組織へ適用可能な、植物へ遺伝子を導入する方法
を入手することは有利であろう。

【０００５】細胞へのＤＮＡ導入のためのいくつかの技術が、当業者に周知であり、それら
は、（１）化学的方法（ＧｒａｈａｍａｎｄｖａｎｄｅｒＥｂ，１９７
３；Ｚａｔｌｏｕｋａｌら，１９９２）、（２）微量注入（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，
１９８０）、電気穿孔（ＷｏｎｇａｎｄＮｅｕｍａｎ，１９８２；Ｆｒｏｍ
ｍら，１９８５；米国特許第５，３８４，２５３号）及び遺伝子銃（Ｊｏｈｎｓ
ｔｏｎａｎｄＴａｎｇ，１９９４；Ｆｙｎａｎら，１９９３）のような物理
的方法、（３）ウイルスベクター（Ｃｌａｐｐ，１９９３；Ｌｕら，１９９３；
ＥｇｌｉｔｉｓａｎｄＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９８８）並びに（４）受容体媒
介メカニズム（Ｃｕｒｉｅｌら，１９９２；Ｗａｇｎｅｒら，１９９２）を含む
カテゴリーに分類されうる。

【０００６】最近まで、いくつかの単子葉植物種のため利用される方法には、単離されたプ
ロトプラストへの直接的なＤＮＡ移入及びマイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒ
ｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）媒介ＤＮＡ輸送（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら，１９８９；
Ｆｒｏｍｍら，１９９０）が含まれていた。リポソーム、ＰＥＧ及び電気穿孔を
介してＤＮＡをプロトプラストへ輸送するプロトプラスト法は、イネにおいて広
範に使用されている。いくつかの研究室において多数のトランスジェニック植物
が回収されているが（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら，１９８９；Ｄａｔｔａら，１９９
０）、プロトプラスト法には長期にわたる胚形成懸濁培養物の樹立が必要である
。プロトプラストから再生した植物の中には、長期にわたる懸濁培養のために、
不稔性で表現型が異常なものが存在する（Ｄａｖｅｙら，１９９１；Ｒｈｏｄｅ
ｓら，１９８８）。米国特許第５，６３１，１５２号は、単子葉植物及び双子葉
植物の形質転換及び再生のための、迅速かつ効率的なマイクロプロジェクタイル
撃ち込み法（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を記
載している。

【０００７】さらに最近、アグロバクテリウム媒介形質転換を介して単子葉植物種を形質転
換することが成功している。国際特許公開第９７／４８８１４号は、安定的に形
質転換された稔性コムギを作製するための方法を開示している。その方法は、多
様な外植片を使用した、短期間でのトランスジェニックコムギ植物の回収を記載
している。アグロバクテリウム媒介形質転換は、撃ち込み法に代わる実行可能な
方法を提供し、その方法はトランスジェニック系の迅速な分子的分析も可能にす
る。

【０００８】現在のアグロバクテリウム媒介法を利用した植物形質転換系の主要な欠点には
、遺伝子型又は種の多様性及び外植片の制限による、系の作製効率及び形質転換
の問題が含まれる。国際特許公開第９４／００９７７号は、単子葉植物を形質転
換するための方法を記載しているが、その方法は、ある単子葉植物のためには新
鮮に培養された未成熟胚を使用し、異なる単子葉植物のためには培養された未成
熟胚又はカルスを使用することに依存している。いずれの系においても、外植片
は新鮮なうちに単離されなければならず、その方法は、労力を要し、遺伝子型及
び外植片による制限を受ける。高効率の形質転換を達成するため、特定の株又は
ベクターの使用に依存している報告もある。一つの報告においては、高効率の形
質転換を達成するために、特別なスーパーバイナリーベクターを使用しなければ
ならない（Ｉｓｈｉｄａら，１９９６）。

【０００９】当分野における形質転換法の数にも関わらず、単子葉植物及び双子葉植物の両
方に適用可能な方法はほとんど開発されていない。本発明は、アグロバクテリウ
ム媒介形質転換法の改良を提供する。その方法は、従来の方法と比較して、高い
形質転換効率により証明されるように、標的ＤＮＡを植物へ輸送する効率が高く
、労力の節約及び費用面での利点を提供する。

【００１０】発明の概要本発明は、一つ又は複数の遺伝子成分の導入により修飾されたゲノムを有する
稔性トランスジェニック植物を作製する方法を提供し、その方法は、（ａ）該植物のゲノムへ導入することが望まれるＤＮＡ組成物を含む遺伝子成
分を導入する工程、（ｂ）外植片の重量を減少させる条件下で、再生可能な植物の細胞又は組織と
、アグロバクテリウムとを共培養する工程、（ｃ）形質転換された細胞系を同定又は選択する工程、及び（ｄ）それらから稔性トランスジェニック植物を再生させる工程を含む。

【００１１】図面の簡単な説明図１は、ｐＭＯＮ１５７１５を示す図である。

【００１２】図２は、ｐＭＯＮ１８３６５を示す図である。

【００１３】図３は、ｐＭＯＮ２５４５７を示す図である。

【００１４】発明の詳細な説明本発明は、任意の植物種を用いて使用されうる。本発明は、単子葉植物種に特
に有用である。本発明を実施するために特に好ましい種には、コムギ、トウモロ
コシ、イネ及びダイズが含まれる。

【００１５】本発明は、稔性トランスジェニック植物、及び植物の細胞又は組織を形質転換
し、形質転換された細胞又は組織を分化した形質転換植物へと再生させるための
方法を提供する。本発明に係る形質転換法を開始するには、まず、植物の細胞又
は組織へ挿入すべき遺伝子成分を選択することが必要である。遺伝子成分には、
本発明に係る方法を使用して植物の細胞又は組織へ導入される任意の核酸が含ま
れうる。遺伝子成分には、非植物ＤＮＡ、植物ＤＮＡ又は合成ＤＮＡが含まれう
る。

【００１６】好ましい実施形態において、遺伝子成分は、以下の型の遺伝子成分のうちの少
なくとも一つ又は複数を含む、組換え二本鎖プラスミド又はベクター分子のよう
なＤＮＡ組成物へ取り込まれる。

【００１７】（ａ）ＲＮＡ配列の生成を引き起こす、植物細胞において機能するプロモータ
ー、（ｂ）農業経済学的に有益な産物をコードするＲＮＡ配列の生成を引き起こす
構造ＤＮＡ配列、（ｃ）ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を引き起
こす、植物細胞において機能する３’非翻訳ＤＮＡ配列。

【００１８】ベクターは、植物の細胞又は組織の形質転換を助長し、所望の（一つ又は複数
の）遺伝子の発現を制御する多数の遺伝子成分を含有しうる。

【００１９】１つの好ましい実施形態において、遺伝子成分はｍＲＮＡを発現するように配
向し、そのｍＲＮＡは一つの実施形態においてタンパク質へと翻訳されうる。二
本鎖型で存在する植物構造コーディング配列（遺伝子、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又
はその他のＤＮＡ）の発現は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によるＤＮＡの一方の鎖
からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写、及びそれに続く核内でのｍＲ
ＮＡ初期転写物のプロセシングを含む。このプロセシングには、ｍＲＮＡの３’
末端へポリアデニル化ヌクレオチドを付加する３’非翻訳領域が関与している。

【００２０】所望の遺伝子成分を含有するプラスミド又はベクターを調製するための手段は
、当分野において周知である。植物を形質転換するために使用されるベクター、
及びそれらのベクターを作成する方法は、米国特許第４，９７１，９０８号、第
４，９４０，８３５号、第４，７６９，０６１号及び第４，７５７，０１１号に
記載されており、これらは完全に本明細書に参照と組み込まれる。ベクターは、
典型的には、これらに限定されないが、プロモーター配列、リーダー配列、イン
トロン配列及びターミネーター配列のような制御因子を含む、多数の遺伝子成分
からなる。制御因子は、それらが調節する配列又は（一つ又は複数の）遺伝子に
対する因子の近接度に応じて、シス制御因子又はトランス制御因子とも呼ばれる
。

【００２１】ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写は、通常「プロモーター」と呼ばれるＤＮＡの領域
により制御される。プロモーター領域は、ＤＮＡと会合し、ＤＮＡ鎖の一方を鋳
型としてｍＲＮＡへの転写を開始して、対応する相補的なＲＮＡ鎖を作成するよ
う、ＲＮＡポリメラーゼにシグナルを伝達する塩基配列を含有する。

【００２２】植物細胞において活性を有する多数のプロモーターが文献に記載されている。
そのようなプロモーターには、これらに限定されないが、アグロバクテリウムツ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫
瘍誘導プラスミド上に保持されたノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）及びオクトピン
シンターゼ（ＯＣＳ）のプロモーター；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭ
Ｖ）の１９Ｓ及び３５Ｓのプロモーター並びにゴマノハグサモザイクウイルス（
ｆｉｇｗｏｒｔｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）（ＦＭＶ）３５Ｓプロモーターの
ようなカリモウイルスのプロモーター；増強型ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ｅ
３５Ｓ）；並びにリブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ
ＲＵＢＩＳＣＯ、極めて多量に存在する植物ポリペプチド）由来の光により誘導
可能なプロモーターを含む。これらのプロモーターは全て、植物において発現さ
れている様々な型のＤＮＡ構築物を作出するために使用されている。例えば、国
際特許公開８４／０２９１３号を参照のこと。

【００２３】転写活性を増強するため（米国特許第５，１０６，７３９号）、又は所望の転
写活性、誘導可能性、及び組織もしくは発達段階特異性を組み合わせるため、プ
ロモーターハイブリッドを構築することもできる。植物において機能するプロモ
ーターは、記載（Ｐｏｓｚｋｏｗｓｋｉら，１９８９；Ｏｄｅｌｌら，１９８５
）されているような誘導可能プロモーター、ウイルスプロモーター、合成プロモ
ーター、構成性プロモーター、並びに時間的に制御されたプロモーター、空間的
に制御されたプロモーター、空間・時間的に制御されたプロモーター（Ｃｈａｕ
ら，１９８９）である。組織により増強された、組織特異的な、又は発達段階的
に制御されたその他のプロモーターも当分野において既知であり、本発明の実施
において有益であると企図される。

【００２４】プロモーターは、植物及び植物ＤＮＡウイルスのような多様な起源から入手す
ることができ、これらに限定されないが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＦＭ
Ｖ３５Ｓプロモーター、並びにｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子のような植物遺伝子か
ら単離されたプロモーターを含む。下記のように、選択された特定のプロモータ
ーは、目的の遺伝子産物を有効量産生させるために十分な発現を引き起こすこと
ができることが好ましい。

【００２５】本発明のＤＮＡ構築物（即ち、キメラ／組換え植物遺伝子）において使用され
るプロモーターは、所望により、調節特性に影響を与えるよう修飾されうる。プ
ロモーターは、オペレーター領域とのライゲーション、ランダムな、又は調節さ
れた突然変異導入等により誘導されうる。さらに、遺伝子発現の上昇を補助する
ための複数の「エンハンサー配列」を含有するよう、プロモーターを改変するこ
ともできる。そのようなエンハンサー配列の例は、ケイら（Ｋａｙら（１９８７
））により報告されている。

【００２６】本発明のＤＮＡ構築物により産生されたｍＲＮＡは、５’非翻訳リーダー配列
を含有していてもよい。この配列は、遺伝子を発現するよう選択されたプロモー
ターに由来していてもよく、ｍＲＮＡの翻訳を増加させるため特異的に修飾され
うる。５’非翻訳領域は、ウイルスＲＮＡ、適当な真核生物遺伝子、又は合成遺
伝子配列からも得られる。そのような「エンハンサー」配列は、得られたｍＲＮ
Ａの翻訳効率を増加させるか、又は改変するために望ましいかもしれない。本発
明は、非翻訳領域が、プロモーター配列に付随している５’非翻訳領域の両方に
由来している構築物に限定されない。むしろ、非翻訳リーダー配列は、無関係の
プロモーター又は遺伝子に由来するものであってもよい（例えば、米国特許第５
，３６２，８６５号を参照のこと）。発現を増強するか、又は遺伝子の転写もし
くは翻訳に影響を与えるよう作用するその他の遺伝子成分も、遺伝子成分として
企図される。

【００２７】キメラ構築物の３’非翻訳領域は、転写終結因子、又はそれと等価な機能を有
する因子、及びＲＮＡの３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を引き
起こすよう植物において機能するポリアデニル化シグナルを含有しているべきで
ある。適当な３’領域の例は、（１）ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子のよ
うなアグロバクテリウム腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子、及び（２）ダイズ
貯蔵タンパク質遺伝子及びリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ遺伝
子の小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）のような植物遺伝子のポリアデニル
化シグナルを含有する３’転写非翻訳領域である。好ましい３’領域の例は、エ
ンドウ由来のｓｓＲＵＢＩＳＣＯＥ９遺伝子に由来するものである（参照とし
て完全に本明細書に組み込まれる欧州特許出願第３８５，９６２号）。

【００２８】典型的には、ポリアデニル化部位の数百塩基対下流に位置するＤＮＡ配列が、
転写を終結させるようはたらく。そのＤＮＡ配列は、本明細書において転写終結
領域と呼ばれる。その領域は、転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の
効率的なポリアデニル化のために必要であり、３’非翻訳領域として知られる。
ＲＮＡポリメラーゼは、ポリアデニル化が起こる部位を通ってコーディングＤＮ
Ａ配列を転写する。

【００２９】一つの好ましい実施形態において、ベクターは、選択可能、スクリーニング可
能又はスコア化可能なマーカー遺伝子を含有する。これらの遺伝子成分は、形質
転換植物の同定において機能する産物、又は所望の利用性を有する産物を産生す
るため、本明細書において機能的遺伝子成分とも呼ばれる。選択装置として機能
するＤＮＡは、再生可能な植物組織において機能して、毒性化合物に対する耐性
を植物組織に付与するであろう化合物を産生する。選択可能、スクリーニング可
能又はスコア化可能なマーカーとして使用するための目的遺伝子には、これらに
限定されないが、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、グリーン蛍光タンパ
ク質（ＧＦＰ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）遺伝子、抗生物質又は除草剤
に対する耐性遺伝子が含まれるであろう。トランスポゾン及び関連する抗生物質
耐性遺伝子の例には、トランスポゾンＴｎｓ（ｂｌａ）、Ｔｎ５（ｎｐｔＩＩ）
、Ｔｎ７（ｄｈｆｒ）；ペニシリン：カナマイシン（及びネオマイシン、Ｇ４１
８、ブレオマイシン）；メトトレキサート（及びトリメトプリム）；クロラムフ
ェニコール；及びテトラサイクリンが含まれる。

【００３０】植物における選択可能マーカーのための有用な特徴は、微生物の使用に関する
報告（ＡｄｖｉｓｏｒｙＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＮｏｖｅｌＦｏｏｄｓ
ａｎｄＰｒｏｃｅｓｓｅｓ、１９９４年７月）に概説されている。これらに
は、以下のものが含まれる。

【００３１】ｉ）最少数の非形質転換組織を有する厳密な選択、ｉｉ）再生を有意に妨害しない多数の独立した形質転換イベント、ｉｉｉ）多数の種への適用、及びｉｖ）マーカーの存在に関して組織をスコア化するためのアッセイの利用可能
性。

【００３２】前述のように、カナマイシン（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシンＢ（ａｐｈＩ
Ｖ）及びゲンタマイシン（ａａｃ３及びａａｃＣ４）に対する耐性を含む、いく
つかの抗生物質耐性マーカーが、これらの要件を満たしている。

【００３３】多数の選択可能マーカー遺伝子が当分野において既知である。本発明において
使用するための特に好ましい選択可能マーカー遺伝子には、カナマイシン（Ｄｅ
ｋｅｙｓｅｒら，１９８９）等の抗生物質及びグリホサート（Ｄｅｌｌａ−Ｃｉ
ｏｐｐａら，１９８７）等の除草剤のような化合物に対する耐性を付与する遺伝
子が含まれるであろう。その他の選択装置も、使用可能であり、本発明の範囲内
である。

【００３４】本発明は、前記のような選択可能又はスクリーニング可能なマーカー及び関連
制御因子を、特定の所望の形質を付与するために十分なように発現される一つ又
は複数の核酸と共に含有する、任意の適当な植物形質転換プラスミド又はベクタ
ーを用いて使用されうる。本発明により企図される適当な目的構造遺伝子の例に
は、これらに限定されないが、昆虫又は害虫に対する耐性、除草剤耐性のための
遺伝子、収量、栄養増強、環境もしくはストレスに対する耐性、又は植物の生理
、生長、発達、形態もしくは（一つもしくは複数の）植物産物の任意の所望の変
化のような品質改良のための遺伝子が含まれるであろう。

【００３５】又は、ＤＮＡコーディング配列は、内因性遺伝子の発現の標的された阻害を引
き起こす非翻訳可能ＲＮＡ分子をコードすることにより、例えばアンチセンスも
しくは共抑制により媒介されるメカニズムを介して、これらの表現型に影響を与
えるものであってもよい（例えば、Ｂｉｒｄら，１９９１を参照のこと）。ＲＮ
Ａは、所望の内因性ｍＲＮＡ産物を切断するよう操作された触媒性ＲＮＡ分子（
即ち、リボザイム）であってもよい（例えば、ＧｉｂｓｏｎａｎｄＳｈｉｌ
ｌｉｔｏｅ，１９９７）。従って、目的の表現型又は形態の変化を発現するタン
パク質又はｍＲＮＡを産生する遺伝子はいずれも、本発明の実施のため有用であ
る。

【００３６】本発明により包含される方法により導入されうる核酸の例には、例えば、他の
種に由来するＤＮＡ配列もしくは遺伝子、又はさらには、同じ種に由来するか、
もしくは同じ種に存在するが、古典的な生殖又は育種の技術ではなく遺伝子操作
法により受容細胞へと組み込まれる遺伝子もしくは配列が含まれる。しかし、外
因性という用語は、形質転換される細胞に通常は存在しない遺伝子、又は形質転
換ＤＮＡセグメントに見出されるような形態、構造等では存在しない遺伝子、又
は通常存在するが異なる発現が望ましい遺伝子をさすものとする。従って、「外
因性」の遺伝子又はＤＮＡという用語は、類似の遺伝子がそのような細胞に既に
存在するか否かに関わらず、受容細胞へと導入される任意の遺伝子又はＤＮＡセ
グメントをさすものとする。外因性ＤＮＡに含まれるＤＮＡの型には、植物細胞
に既に存在するＤＮＡ、他の植物に由来するＤＮＡ、異なる生物に由来するＤＮ
Ａ、又は遺伝子のアンチセンスメッセージを含有するＤＮＡ配列、もしくは遺伝
子の合成物もしくは修飾物をコードするＤＮＡ配列のような外部で生成したＤＮ
Ａが含まれうる。

【００３７】本開示を参照することにより、その他の可能な選択可能又はスクリーニング可
能なマーカー遺伝子、制御因子、及びその他の目的配列が、数多く当業者に明ら
かとなろう。従って、上記の記述は、網羅的ではなく例示的であるものとする。

【００３８】植物形質転換ベクター又は構築物の構築の後、ｉｎｖｉｔｒｏでＤＮＡ組成
物として調製された該核酸分子を、大腸菌のような適当な宿主へ導入し、アグロ
バクテリウムのような他の適当な宿主へと接合させるか、又はコンピテントなア
グロバクテリウムへと直接形質転換する。これらの技術は、当業者に周知であり
、ダイズ、ワタ及びコムギを含む多数の植物系に関して記載されている（例えば
、参照として完全に本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５６９，８３４号
及び第５，１５９，１３５号並びに国際特許公開第９７／４８８１４号を参照の
こと）。

【００３９】本発明は、一つ又は複数の遺伝子成分を植物へ導入するための細菌株の使用を
包含する。当業者は、アグロバクテリウム媒介形質転換法の有益性を認識してい
るであろう。好ましい株には、これらに限定されないが、アグロバクテリウムツ
メファシエンス株Ｃ５８、植物細胞へのＤＮＡの移入を媒介するために使用され
るノパリン株、ＬＢＡ４４０４のようなオクトピン株、又はアグロピン株、例え
ばＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５又はＥＨＡ１０９が含まれるであろう。植物形質
転換のためのこれらの株の使用が、報告されており、その方法は当業者に周知で
ある。

【００４０】本発明は、再生可能な細胞又は組織を用いて使用されうる。当業者は、再生可
能な植物組織とは、一般に、外因性ＤＮＡの挿入及び適切な培養条件の後に、分
化した植物を形成することができる組織をさすことを理解している。そのような
組織には、これらに限定されないが、カルス組織、胚軸組織、子葉、根及び葉が
含まれうる。例えば、再生可能な組織には、葯（ＺｈｏｕａｎｄＫｏｎｚａ
ｋ、１９８９）、小胞子（Ｚｉａｕｄｄｉｎら，１９９２）、花部（Ｂａｒｃｅ
ｌｏら，１９９４）及び葉組織（Ｃｏｎｇｅｒら，１９８７）に由来するカルス
又は胚様体が含まれうる。例えばコムギにおいては、コムギ小穂から未成熟胚を
単離することができる。その他の組織も、本発明の実施において有益であると企
図される。

【００４１】本発明の一つの実施形態において、胚形成カルス組織が出発外植片材料として
使用される。胚形成カルスは、未成熟胚から作製される。これらのカルスは、未
成熟胚を単離し、炭水化物及び植物生長制御物質を含有する栄養培地上で培養す
ることにより作製されうる。

【００４２】特定の穀類の形質転換のための胚形成カルス又はその他の標的組織は、当業者
に既知の多数の方法により単離されうる。例えば、参照として完全に本明細書に
組み込まれる国際特許第９７／４８８１４号は、コムギ未成熟胚及び胚形成カル
スの単離を記載している。コムギ未成熟胚の単離は、ウィークスら（Ｗｅｅｋｓ
ら（１９９３））及びベイシルら（Ｖａｓｉｌら（１９９３））によっても記載
されている。

【００４３】同様に、トウモロコシの未成熟胚は、適当な培養培地上で予備培養され、アグ
ロバクテリウム接種のため使用されうる。ダイズにおいては、例えば、葉組織か
ら懸濁細胞培養物を発生させ、アグロバクテリウム接種の前に長期にわたり維持
することができる。胚軸切片も、ダイズのための外植片として企図され、当業者
に既知のように、発芽した実生から調製されうる。

【００４４】本発明のもう一つの実施形態は、予備培養された細胞又は組織を出発材料とし
て使用することである。本明細書において使用されるように、予備培養とは、ア
グロバクテリウム接種の前に、植物組織の生長を支持する適切な培地中で細胞又
は組織を培養することを意味する。アグロバクテリウム接種前の再生可能な細胞
又は組織の予備培養は、長期間、例えば７日間以上行いうる。より好ましくは、
予備培養期間は６日以下である。さらに好ましくは、予備培養期間は約１時間か
ら４日のような比較的短い期間である。最も好ましくは、予備培養期間は約１か
ら３日である。予備培養のための適当な培地の例には、これらに限定されないが
、これらに限定されないがピクロラム（ｐｉｃｈｌｏｒａｍ）及び２，４−Ｄを
含む付加的な栄養及び／又は植物生長制御因子が補充した、ＭＳ基本培地（Ｍｕ
ｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ，１９６２）又はＮ６基本培地（Ｃｈｕら
，１９７８）が含まれるであろう（表２参照）。当業者は、適切に補充された場
合、植物組織の生長及び発達を支持する多様な組織培養培地に精通している。こ
れらの組織培養培地は、市販の調製物として購入するか、又は当業者が特別に調
製し修飾することができる。そのような培地の例には、これらに限定されないが
、然るべく補充された、ガンボルグの培地（Ｇａｍｂｏｒｇら，１９６８）、マ
カウンの木本培地（ＭｃＣｏｗｎａｎｄＬｏｙｄ，１９８１）、ニッシュ及
びニッシュの培地（ＮｉｔｓｃｈａｎｄＮｉｔｓｃｈ，１９６９）並びにシ
ェンク及びヒルデブラントの培地（ＳｃｈｅｎｋａｎｄＨｉｌｄｅｂｒａｎ
ｄｔ，１９７２）が含まれるであろう。当業者は、形質転換及び再生において使
用するための培地、並びに栄養及び生長制御物質のような培地補充物質が、通常
、特定の標的目的穀類のため最適化されることを承知している。

【００４５】再生可能植物組織が単離された後、方法の次の工程は、遺伝子成分の植物組織
への導入することである。この過程は、本明細書において「形質転換」とも呼ば
れる。植物細胞が形質転換され、独立に形質転換された各植物細胞が選択される
。独立した形質転換体は植物細胞系と呼ばれる。遺伝子成分を再生可能植物組織
へと挿入するための多数の方法が報告されており、使用可能である。

【００４６】主にアグロバクテリウムツメファシエンスの使用により、双子葉植物を形質転
換し、トランスジェニック植物を入手するための方法が、ワタ（米国特許第５，
００４，８６３号、米国特許第５，１５９，１３５号、米国特許第５，５１８，
９０８号、国際特許公開第９７／４３４３０号）、ダイズ（米国特許第５，５６
９，８３４号、米国特許第５，４１６，０１１号、ＭｃＣａｂｅら，１９８８、
Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，１９８８）、アブラナ属植物（Ｂｒａｓｓｉｃａ）（米国
特許第５，４６３，１７４号）及びラッカセイ（Ｃｈｅｎｇら，１９９６、Ｄｅ
ＫａｔｈｅｎａｎｄＪａｃｏｂｓｅｎ，１９９０）を含む多数の穀類に関
して公開されている。

【００４７】電気穿孔、粒子撃ち込み及びアグロバクテリウムを使用した単子葉植物の形質
転換も、報告されている。形質転換及び植物再生は、アスパラガス（Ｂｙｔｅｂ
ｉｅｒら，１９８７）、オオムギ（ＷａｎａｎｄＬｅｍａｕｘ，１９９４）
、トウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓら，１９８８、Ｉｓｈｉｄａら，１９９６、Ｇｏ
ｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら，１９９０、Ｆｒｏｍｍら，１９９０、Ｋｏｚｉｅｌら，
１９９３、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，１９９５）、エンバク（Ｓｏｍｅｒｓら，１
９９２）、イネ（Ｔｏｒｉｙａｍａら，１９８８、ＺｈａｎｇａｎｄＷｕ，
１９８８、Ｚｈａｎｇら，１９８８、ＢａｔｔｒａｗａｎｄＨａｌｌ，１９
９２、Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，１９９１、Ｐａｒｋら，１９９６）、サトウキビ（
ＢｏｗｅｒａｎｄＢｉｒｃｈ，１９９２）、ヒロハノウシノケグサ（Ｗａｎ
ｇら，１９９２）及びコムギ（Ｖａｓｉｌら，１９９２、Ｗｅｅｋｓら，１９９
３）において達成されている。

【００４８】本発明は、アグロバクテリウム媒介形質転換を利用する。本発明の一つの利点
は、標準的なバイナリーベクターが、本発明における実験と共に使用されうる点
である。形質転換は、試験した全ての植物系において達成された。他の報告され
たトウモロコシの系においては、高い形質転換を達成するためにスーパーバイナ
リーベクターが必須であることが示されているため（Ｉｓｈｉｄａら，１９９６
）、スーパーバイナリーベクターが必要でないという事実は有益性を増加させる
。

【００４９】再生可能組織にアグロバクテリウムを接種し、接種された外植片を、共培養期
間中に外植片の重量が減少するように処理する。アグロバクテリウム接種後の再
生可能な細胞又は組織の処理は、接種された外植片の重量を減少させ、ＤＮＡ移
入過程を助長する任意の方法を含む。

【００５０】本発明の特に好ましい実施形態は、アグロバクテリウム接種後の外植片の重量
を減少させるため、制限された又は減少した水分条件を使用する。共培養中に外
植片の重量を減少させるための可能な方法には、これらに限定されないが、共培
養中の外植片への外因性水分を制限すること、共培養中に真空を適用することに
より外植片の重量を減少させること、例えばマンニトール、ソルビトール、ラフ
ィノースもしくはポリエチレングリコール又はそれらの組み合わせの使用により
培地の浸透圧（ｏｓｍｏｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を増加させること、蒸発
もしくは送風により外植片の重量を減少させるため外植片を空気乾燥させること
、又は例えば乾燥環境中に外植片を置くことにより共培養中の外植片から水分を
抽出する化学的手段が含まれうる。適当な乾燥剤の例には、これらに限定されな
いが、酸化カルシウム又は硫酸が含まれるであろう。

【００５１】アグロバクテリウム接種された外植片の重量を減少させる一つの好ましい方法
は、共培養中の該外植片への水分供給を制限することである。共培養とは、本明
細書において使用されるように、外植片にアグロバクテリウム培養物を接種した
時点から、アグロバクテリウム増殖を阻害する化合物の添加により、又はそのよ
うな過程によりアグロバクテリウムの増殖を抑制する時点までを意味する。アグ
ロバクテリウムを接種された外植片は、ゲル化剤を含有する培地を含有しないペ
トリ皿のような組織培養容器内に置かれる。一つの実施形態において、外植片は
、これらに限定されないが、ペトリ皿内に置かれたフィルター紙を含む、適当な
ブロッティング材料の上に置かれる。

【００５２】目的のプラスミド又はベクターを保持するアグロバクテリウム株は、株及びベ
クターのための選択的抗生物質を補充されたルリアブルタニ（ＬｕｒｉａＢｕ
ｒｔａｎｉ）（ＬＢ）のような、適切な培養培地上で培養される。当業者は、ア
グロバクテリウムの増殖のための手順及び適当な培養条件、並びにその後の接種
手順に精通している。接種のために使用されるアグロバクテリウム培養物の密度
及びアグロバクテリウム細胞と外植片との比率は、系によって異なっていてもよ
く、従って任意の形質転換法のためのこれらのパラメータの最適化が予想される
。典型的には、アグロバクテリウム培養物を、画線培養されたプレート又はグリ
セロールストックから接種し、一晩増殖させ、細菌細胞を洗浄し外植片の接種に
適した培養培地中に再懸濁させる。本発明のための適当な接種培地には、これら
に限定されないが、１／１０ＭＳ塩を含むＣＭ４Ｃ培地（表２）又は減少した塩
濃度を有する修飾ＣＭ４Ｃ培養培地が含まれる。いくつかの場合において、これ
らに限定されないが、シルウェット（Ｓｉｌｗｅｔ）（Ｌ７７）（Ｗｉｔｅｓ、
Ｈｕｄｓｏｎ、Ｏｈｉｏ）又はプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８（Ｓｉ
ｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む界面活性剤を、低濃度で接種培地へ添
加してもよい。洗浄され再懸濁したアグロバクテリウム細胞懸濁液と共に外植片
をインキュベートする。接種は、一般的には、約２０℃〜２８℃、好ましくは約
２３℃〜２８℃の温度で、約１分から約３時間実施される。

【００５３】共培養期間中に外植片と共にインキュベートされる添加された液体の量は、培
養容器のサイズ、出発外植片のサイズ／重量、及び外植片／プレートの数によっ
て様々である。添加された液体の量は、６０×２０ｍｍの培養プレートの場合、
０μＬから１０００μＬ、好ましくは０μＬから５００μＬの範囲であり得る。
共培養期間は、約１時間から約１週間、好ましくは約１日から４日、より好まし
くは約１日から３日の範囲であり得る。共培養期間後、アグロバクテリウムを接
種された外植片の重量は、約５０％以下減少している。より好ましくは、アグロ
バクテリウムを接種された外植片の重量は、最大約４０％減少している。さらに
好ましくは、アグロバクテリウムを接種された外植片の重量は、最大３０％減少
している。

【００５４】共培養期間後、アグロバクテリウムを接種された外植片を、アグロバクテリウ
ム増殖を阻害するための薬剤を含有する適切な培地上で培養する。アグロバクテ
リウムを接種された外植片を、そのような培地上で、一般的には１日から１４日
、好ましくは２日から７日培養する。当業者は、アグロバクテリウム増殖を阻害
するための適切な培地成分を承知している。そのような培地成分には、これらに
限定されないが、カルベニシリン又はセフォタキシムのような抗生物質が含まれ
るであろう。

【００５５】アグロバクテリウム増殖を阻害するための培養工程の後、好ましくは外植片を
選択培地上に置く前に、これらに限定されないが、β−グルクロニダーゼ（ＧＵ
Ｓ）をコードする遺伝子のようなスクリーニング可能マーカー遺伝子を含む形質
転換ベクター上に含まれる遺伝子の存在を検出する一過性アッセイにより、それ
らをＤＮＡ輸送効率について分析する。選択された外植片の数に対する青色スポ
ット（ＧＵＳ発現を示す）の総数を、ＤＮＡ移入効率の陽性の相関として使用す
る。共培養中の最適な重量減少量及び形質転換効率の両方が、一過性に予測され
、続いて、安定的な形質転換体の高効率産生により確認される。

【００５６】好ましい実施形態において、選択剤なしにアグロバクテリウム増殖を阻害する
ための抗生物質を含有する非選択培地上でのインキュベーションの後、これらに
限定されないが、選択剤を含有するカルス誘導培地を含む、選択増殖培地上で外
植片を培養する。典型的な選択剤には、これらに限定されないが、ゲネチシン（
Ｇ４１８）、パロモマイシンのような抗生物質、又はグリホサートのようなその
他の化学物質が含まれる。続いて、形質転換された苗木の作製に適した再生培地
へ培養物を移す。当業者は、植物の形質転換及び再生のため、各植物系について
実行し最適化することができる多数の型の培地及び移入要件を承知している。従
って、本発明において開示されたそのような培地及び培養条件を、修飾するか、
又は栄養的に等価な成分、もしくは選択及び再生のための類似の手順と置換する
ことが可能である。

【００５７】続いて、作製された形質転換体を、形質転換ベクター上に含まれる特定の目的
核酸の存在又は欠如を決定するため分析する。分子的分析には、これらに限定さ
れないが、サザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５）又はＰＣＲ（ポリメ
ラーゼ連鎖反応）分析が含まれうる。これら及びその他の周知の方法が、開示さ
れた方法により作製された形質転換植物の安定性を確認するため実施されうる。
これらの方法は、当業者に周知であり、報告されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら，１９８９を参照のこと）。

【００５８】当業者は、本発明により提供された方法及び組成物の多くの利点を認識するで
あろう。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例証するために含まれる
。実施例に開示された技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発
明者らにより発見された技術を表しており、本発明の実施のための好ましい形態
を構成するものと見なされうることを当業者は認識すべきである。しかし、本開
示を参照することにより、開示された特定の実施形態に多くの変更を加えること
が可能であり、それでも本発明の本旨及び範囲を逸脱することなく類似の結果が
得られることを、当業者は認識すべきである。

【００５９】実施例実施例１プラスミドベクターの構築当業者に既知の標準的な分子生物学的技術を使用して、プラスミドベクターを
構築した。多数のアグロバクテリウム媒介植物形質転換ベクターが記載されてい
る（ＫｌｅｅａｎｄＲｏｇｅｒｓ，１９８９）。簡単に説明すると、本明細
書に記載の植物形質転換ベクターは、これらに限定されないが、植物ゲノムへの
核酸分子の移入を促進するための一つ又は複数のＴ−ＤＮＡ境界配列、複製因子
、選択可能マーカー、並びに一つ又は複数の目的遺伝子を含む、一つ又は複数の
核酸配列を含む。ｐＭＯＮ２５４５７（図３）は、（一つ又は複数の）コーディ
ング領域の上流に位置するトウモロコシ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）イ
ントロンも含有する。ｐＭＯＮ１５７１５（図１）及びｐＭＯＮ１８３６５（図
２）は、ソラナムツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）由来のイ
ントロン（ＳＴ−ＬＳ１^＊ＩＮＴ）を含有する。実施例において使用したベクタ
ーの基本的特徴が表１に要約されており、プロモーター／コーディング配列／３
’非翻訳領域のように記載されている。

【００６０】表中の略語は、以下の通りである。ＦＭＶは、ゴマノハグサモザイクウイルス
由来のプロモーター（米国特許第５，３７８，６１９号）であり、ｅ３５Ｓプロ
モーターは、−９０から−３００の領域の重複を含有する、カリフラワーモザイ
クウイルス（ＣａＭＶ）の３５ＳＲＮＡ由来の３５Ｓプロモーターの修飾物で
あり、ｎｏｓプロモーターは、アグロバクテリウムツメファシエンスｐＴｉＴ３
７に由来する。ＧＵＳ遺伝子は、大腸菌由来のβ−グルクロニダーゼコーディン
グ配列であり、ｎｐｔＩＩ遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを
コードし、ｎｏｓ３’領域はアグロバクテリウムツメファシエンスｐＴｉＴ３７
のＮＯＳ遺伝子のための下流非翻訳配列及びポリＡシグナルを含有する。関連制
御因子と共に目的遺伝子としてのＣＰ４遺伝子を使用して、いくつかのグリホサ
ート耐性構築物も試験した。

【００６１】

【表１】

【００６２】実施例２予備培養されたコムギの未成熟胚（ＰＣＩＥ）を使用した形質転換１．外植片の調製受粉後１３〜１５日目に、未成熟穀果（コムギ小穂）から、コムギ（トリチカ
ムアエスチバヌ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）Ｌ）ｃｖボブホワイト
（Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）の未成熟胚を単離し、ＣＭ４Ｃ（表２）上で１〜６日間培
養した。胚形成カルス無しの胚を、アグロバクテリウム接種のため選択した。

【００６３】

【表２】

【００６４】２．アグロバクテリウムの培養及び接種バイナリーベクターを保持する無毒化アグロバクテリウム株Ｃ５８（ＡＢＩ）
を、全ての実験に使用した。アグロバクテリウムの培養を、グリセロールストッ
クから、又は新鮮に画線培養されたプレートから開始し、対数増殖期中期（ｍｉ
ｄ−ｌｏｇｐｈａｓｅ）（約ＯＤ_６６０＝１〜１．５）になるまで、５０ｍｇ
／Ｌカナマイシン、５０ｍｇ／Ｌストレプトマイシン及びスペクチノマイシン、
並びに２５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを２００μＭアセトシリンゴン（ＡＳ
）と共に含有する液体ＬＢ培地（ｐＨ７．０）（Ｍｉｌｌｅｒ，１９７２）中で
振とう（およそ１５０ｒｐｍ）しながら２６℃〜２８℃で一晩増殖させた。アグ
ロバクテリウム細胞を接種培地に再懸濁させ、密度をＯＤ_６６０が１になるよう
調整した。ＣＭ４Ｃ培地中で培養された未成熟胚を、ペトリ皿１枚当たり１０ｍ
Ｌ又は細胞培養クラスタープレート１枚当たり５ｍＬの接種培地を含有する、無
菌ペトリ皿（１６×２０ｍｍ）又は６穴細胞培養プレート（ＣｏｓｔａｒＣｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）のウェルに移した。等量のア
グロバクテリウム細胞懸濁液を、アグロバクテリウム細胞の最終濃度がＯＤ_６０ _００．５となるよう添加した。大部分の実験において、プルロニックＦ６８を最
終濃度０．０１％で接種混合物へ添加した。アグロバクテリウムと未成熟胚（Ｉ
Ｅ）との比率は、約１０ｍＬ：２０〜２００ＩＥであった。接種のための条件は
、約２３℃〜２６℃の温度で、約５〜６０分間であった。

【００６５】３．共培養接種期間後、社内の真空装置を使用することにより、残存しているアグロバク
テリウム細胞を外植片から除去した。無菌ワットマンＮｏ．１フィルター紙（ペ
トリ皿のサイズに適合する）１枚を、さらなる液体又は寒天補充培地を含まない
６０×１５又は６０×２０ｍｍの各ペトリ皿に置いた。２００マイクロリットル
の滅菌水をフィルター紙の中央に置いた。２〜３分後、接種された未成熟胚をプ
レートに置いた。通常２０〜５０個の外植片を１群として分類し（サイズ約１ｃ
ｍ及び６０〜８０ｍｇ／群）、プレート１枚当たり４〜５群とした。プレートを
直ちにパラフィルムで覆い、次いで暗所で２４℃〜２６℃で２〜３日間共栽培し
た。

【００６６】４．ＤＮＡの輸送、アグロバクテリウムの増殖及び外植片の重量に対する共培
養中の水分の効果選択の２〜３日遅延の後、ＤＮＡ輸送の効率を、一過性ＧＵＳ発現により測定
した。ＤＮＡ輸送に対する共培養中の水分の効果を、予備培養された外植片を使
用して試験した。表３に示されるように、３００μＬ以下の水を共培養プレート
に添加した場合、外植片の重量は約２０％〜３５％減少した。有意に多い一過性
ＧＵＳ発現も観察された。４００μＬ以上の水を添加した場合、外植片の重量は
増加し、比較的少ないＧＵＳスポットが外植片上に観察された。短時間（５〜３
０分）の接種を、共培養プレート中の５００μＬ以上の水と組み合わせて使用し
た場合には、一過性ＧＵＳ発現は有意に減少した。共培養のため３００μＬ未満
の水を使用した場合には、ＧＵＳ発現を示す青色のスポットが、全ての未成熟胚
の胚盤組織の表面上に、特に、活発な細胞分裂を示す範囲に均一に分散していた
。対照的に、５００μＬ以上の水を共培養中に添加した場合には、３０％〜５０
％の未成熟胚のみがＧＵＳ発現を示した。

【００６７】

【表３】

【００６８】５．選択及び再生遅延培地上で２〜３日後、未成熟胚を２５ｍｇ／ＬＧ４１８及び５００ｍｇ
／Ｌのカルベニシリンが補充されたＣＭ４Ｃへ移した。２〜３週間後、胚を小片
（およそ２ｍｍ）に破壊し、第一再生培地である、２５ｍｇ／ＬＧ４１８及び
２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含むＭＭＳ．２Ｃ培地（表２）へ継代した。再
生培地への移動の際、各カルス片をいくつかの小片（およそ２ｍｍ）へとさらに
分割した。移動後２週間目に、若い苗条及び生存カルス組織を、第二再生培地で
ある、同濃度のＧ４１８及びカルベニシリンを含むＭＭＳ０Ｃ（表２）へ移した
。比較的大きい組織片を、前記のような小片へと分離した。後に真の形質転換体
であることが確認された苗木は、活発に生長し、この培地上で強い根系を形成さ
せた。強い根毛、１０本以上の短く強い根、又は二次根を有する植物を、さらな
る増殖及び選択のための二次再生培地を含有するサンデーカップ（Ｓｕｎｄａｅ
ｃｕｐｓ）（ＳｗｅｅｔｈｅａｒｔＣｕｐＣｏｍｐａｎｙ、Ｃｈｉｃａｇ
ｏ、ＩＬ）に移した。この時点で、ＧＵＳ組織化学的アッセイのため、いくつか
の苗木から葉試料を採取した。サンデーカップでの増殖期間中、非形質転換体の
大部分が死滅するか、又はＧ４１８に対する感受性の徴候を示した。強い根系を
有し活発に生長するＧ４１８に対して高度に耐性の植物を、土壌に移した後、サ
ンデーカップの頂部まで生長させた。同じ胚に由来する植物は全て、同じイベン
トからの同胞種であると見なした。

【００６９】６．形質転換効率再生した植物は、可視の異常を示さず、稔性であった。全ての植物を、ＧＵＳ
組織化学的アッセイにより試験した。多くのトランスジェニックイベントが作製
された。１２回の異なる実験からの合計１５１９個の外植片について、９９個の
トランスジェニックイベントが作製され、平均形質転換効率は６．５％であった
。接種期間の長さ及び接種に使用したアグロバクテリウムの密度を含む、試験し
た異なるパラメータについて、形質転換効率の範囲は１．４％から１９％であっ
た。

【００７０】７．トランスジェニック植物の検出及び分析高輝度高出力（ＨＩＤ）シルバニア（Ｓｙｌｖａｎｉａ）光源（ＧＴＥＰｒ
ｏｄｕｃｔｓＣｏｒｐ．、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＨ）から供給される８０
０ｍｏｌｍ^−２ｓ^−１の１６時間光周期を有する環境的に調節された生長チャン
バー内で植物を生長させた。日／夜温度は、１８／１６℃であった。接種から植
物の大部分を土壌に移すまでには約２．５から３ヶ月かかり、可視の異常は観察
されなかった。各植物を以下の方法のうちの一つ又は複数により検査した。

【００７１】１）植物の異なる部分を使用したＧＵＳ組織化学的比色アッセイ（Ｊｅｆｆｅ
ｒｓｏｎ，１９８７）。

【００７２】２）チェングらの文献（Ｃｈｅｎｇら（１９９７））に記載のような葉漂白ア
ッセイ。

【００７３】３）サザンハイブリダイゼーション分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５）も実
施した。当業者に既知の標準的な方法（例えば、ＲｏｇｅｒａｎｄＢｅｎｄ
ｉｃｈ，１９８５に記載の方法を参照のこと）を使用して、被検植物の葉組織か
らゲノミックＤＮＡを単離する。ＤＮＡを単離した後、当業者に既知のプロトコ
ル及び方法を使用してサザン分析を実施することができる。

【００７４】実施例３．ＮｐｔＩＩ選択を使用したコムギの胚形成カルスの形質転換１．外植片の調製この研究を通して、春播きコムギ、トリチカムアエスチバムｃｖ．ボブホワイ
トを使用した。ストック植物を前記と同様の生長条件下で環境的に調節された生
長チャンバー内で生長させた。開花後１３〜１５日目に植物から未成熟穀果（小
穂）を収集した。未成熟胚（ＩＥ）を無菌的に切開し、暗所で２３〜２５℃で、
ＣＭ４又はＣＭ４Ｃカルス誘導培地（表２）上で１０〜３０日間培養した。

【００７５】２．アグロバクテリウムの培養アグロバクテリウムの培養及び採取のプロトコルは、実施例２の記載と同様で
あり、ｐＭＯＮ１８３６５を使用した。

【００７６】３．接種カルス誘導培地（ＣＭ４又はＣＭ４Ｃ）で培養した未成熟胚を、アグロバクテ
リウム細胞懸濁液を含むペトリ皿（２５×１００ｍｍ）に移した。アグロバクテ
リウムと胚形成カルス組織（ＥＣ）との比率は、アグロバクテリウム約３０ｍＬ
：ＥＣ３０であった。界面活性剤シルウェット（Ｌ７７）（ＷｉｔｃｏＣｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＯＨ）又はプルロニックＦ６８（Ｓｉｇｍａ
、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、０．０１〜０．０２％の濃度で接種培地へ添加
した。接種は、暗所で、２３℃〜２５℃で、２〜３時間実施した。

【００７７】４．共栽培接種後、社内の真空装置を使用して、液体培養物中の余分なアグロバクテリウ
ムを外植片から除去した。無菌ワットマンＮｏ１．フィルター紙１枚を６０×２
０ｍｍの各ペトリ皿に置いた。接種培地又は無菌水５０マイクロリットルをフィ
ルター紙の中央に置いた。１から２分後、接種された胚形成カルス（１０〜３０
日間培養された各未成熟胚に由来）を液体培地又は水のうねに置いた。通常、約
１０〜１２個の外植片を、各プレートのフィルター紙上の円内に置いた。プレー
トをパラフィルムで覆い、暗所で、２４℃から２５℃で、３日間共栽培を進めた
。

【００７８】５．ＤＮＡ輸送の効率選択の２〜３日遅延の後、ＤＮＡ輸送の効率を、一過性ＧＵＳ発現アッセイに
より測定した。アグロバクテリウムを接種された外植片への水分を制限した全て
の実験において、比較的高レベルのＧＵＳ発現が観察された。表４に示されるよ
うに、２００μＬ未満の液体培地を共培養プレートに添加した場合には、有意に
多い一過性ＧＵＳ発現が観察された。４００μＬ以上の培地を添加した場合には
、４０個未満のＧＵＳスポットが外植片上に可視であった。

【００７９】

【表４】

【００８０】６．選択及び植物の再生ＣＭ４Ｃ培地（表２）上で２〜５日後、アグロバクテリウムを接種された胚形
成カルスを、２５ｍｇ／ＬＧ４１８及び５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有
するＣＭ４又はＣＭ４Ｃ（表２）へ移した。各胚形成カルスを５又は６片に分離
し、各片を単一の外植片として処理した。胚形成カルスをカルス誘導のため２〜
３週間培養した後、第一再生培地へ移した。その後の培養法は、実施例２の概説
と同様である。

【００８１】７．トランスジェニック植物の検出及び分析Ｔ_１植物を実施例２の記載と同様にして分析した。

【００８２】８．形質転換効率前記のようにして植物をアッセイした後、各実験におけるトランスジェニック
イベントの数を決定した。１０回の異なる実験から、全部で５１５個の初期外植
片から５３個の陽性トランスジェニックイベントが得られた。形質転換効率は３
．６％から３７．７％の範囲であり、平均１０％であった。処理パラメータには
、界面活性剤の型並びに共培養期間中のプレート内の水の濃度及び量が含まれて
いた。

【００８３】９．トランスジェニック植物の子孫分析Ｔ_１子孫におけるＧＵＳ遺伝子及びＮＰＴＩＩ遺伝子の分離を、葉組織におけ
るＧＵＳ組織化学的アッセイ、又はＴ_１実生におけるパロモマイシン噴霧試験の
いずれかにより分析した。各Ｔ_０植物から採取されたＴ_１種子を２”のポットに
植え、前記のストック植物と同様の条件下で生長させた。３葉段階の植物に、２
％（ｗ／ｖ）パロモマイシンを含有する０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（いずれもシグ
マ社（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）より
入手可能）を噴霧した。１週間後、植物をパロモマイシン感受性について評価し
た。機能的ＮＰＴＩＩ遺伝子を有する植物は漂白されず、機能的ＮＰＴＩＩ遺伝
子を有しない植物は漂白されたスポットを示した。次いで、χ^２検定によりデー
タを分析し、機能的なＧＵＳ遺伝子座又はＮＰＴＩＩ遺伝子座の数を決定した（
表５）。例えば、耐性植物対感受性植物の比率が３：１であれば、単一の機能的
ｎｐｔＩＩ遺伝子座がこのトランスジェニックイベントに存在する。比率が３：
１より大きいのであれば、複数の機能的イベントが存在する。

【００８４】

【表５】

【００８５】実施例４グリホサート選択を使用したコムギの形質転換１．外植片の調製ストック植物の生長、未成熟胚の単離、及び誘導培養のための手順は、実施例
２の記載と同様であった。外植片は、胚形成カルス組織を含まない３〜６日間予
備培養された未成熟胚（ＰＣＩＥ）、又は１０〜３０日間培養された胚形成カル
ス組織のいずれかであった。

【００８６】２．アグロバクテリウムの調製、接種、共栽培及びＴ−ＤＮＡ輸送プロトコルは実施例２及び３の記載と同様であった。

【００８７】３．選択及び植物の再生３日間の共栽培後、アグロバクテリウムを感染させたＰＣＩＥ及び胚形成カル
スを、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンが補充されたＣＭ４Ｃ培地（表２）へ移し
、約７日間培養した。ＰＣＩＥ外植片は、この培地上で胚形成カルスを形成した
。次いで、外植片を、暗所で、２ｍＭグリホサート及び５００ｍｇ／Ｌカルベニ
シリンを含むＣＭ４Ｃ選択培地へ１週間移した。全てのカルスを、約８０μＥの
光条件でのさらに２週間の選択のため、０．１ｍＭグリホサート及び２５０ｍｇ
／Ｌカルベニシリンが補充されたＭＭＳ０．２Ｃ（表２）へ移した。この培養期
間の完了時に緑色のスポット又は苗条が形成された。全ての胚形成カルスを、第
二再生培地である、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン及び０．０２ｍＭグリホサー
トが補充されたＭＭＳ０Ｃ（表２）へ移した。Ｌ−トリプトファン及びＬ−フェ
ニルアラニン（１０^−７ｍＭ／アミノ酸）を含む芳香族アミノ酸を、選択を助長
するためこの培地へ添加した。２週間毎に、これらの組織を新鮮な培地に移した
。培養期間中の任意の時点で、伸長した分裂組織及び根を有する苗木を、胚形成
カルスから再生させることができた。根系が確立された後、植物を土壌に移し、
続いてアッセイした。同じＰＣＩＥ又はカルスに由来する植物は、全て同じトラ
ンスジェニックイベントからの同胞種であると見なした。

【００８８】４．植物のトランスジェニック性質の確認トランスジェニック植物は、グリホサート選択に耐えて生存し、実施例２に記
載と同様の環境的条件の生長チャンバー内で生長した。通常、グリホサート選択
（グリホサート選択に耐えて生存する植物を全て形質転換体と見なした）又はサ
ザンハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５）のいずれかにより
、トランスジェニック植物を検査した。

【００８９】５．形質転換効率グリホサート耐性トランスジェニック植物も、本発明のアグロバクテリウム形
質転換法を使用して作製された。１０〜１４日齢のカルス組織及び３〜６日間予
備培養された未成熟胚の両方を外植片として使用した。全ての推定トランスジェ
ニック植物が、前記のアッセイ法により陽性であることが確認された。１２回の
実験からの平均形質転換効率は４．６％であった（全部で２８４４個の外植片が
１３１個のトランスジェニックイベントを生じた）。形質転換効率の範囲は３．
３％から６．７％であった。

【００９０】６．トランスジェニック植物の子孫分析Ｔ_１世代におけるＣＰ４遺伝子及びＧＵＳ遺伝子の分離を、葉組織及び根組織
におけるＧＵＳ組織化学的アッセイ又は３〜６葉段階における１エーカー当たり
６４〜１２８オンスのＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）噴霧試験のいずれかにより試
験した。データをχ^２検定により分析し、機能的なＣＰ４遺伝子座及びＧＵＳ遺
伝子座の数を決定した。２１個の系を分析した（１７個のＣＰ４、４個のＧＵＳ
）。ＣＰ４系のうち、１１個の系の子孫が３：１分離比（耐性：感受性）を示し
、５個の系が１５：１の比率を示し、１個の系が１：１の比率を示した。ＧＵＳ
系のうち、４個の系の子孫が３：１の比率（陽性：陰性）を示し、２個の系が１
：１の比率を示し、１個の系が１５：１の比率を示した。５００個を越える子孫
を分析した。

【００９１】実施例５．トウモロコシの胚形成カルスの形質転換１．外植片の調製トウモロコシ（ジーメイズ（Ｚｅａｍａｙｓ）Ｌ．）の三系交雑種（Ｐａ９
１×Ｈ９９）×Ａ１８８及び近交系Ｈ９９の未成熟胚（１から１．５ｍｍ長）を
、１．５ｍｇ／ｌ２，４−Ｄが補充された培地Ｄ（Ｄｕｎｃａｎら，１９８５
）（培地Ｄ−１．５Ｄ）中で暗所で２７℃で１４日間培養した。

【００９２】２．アグロバクテリウムの調製、接種及び共培養ｐＭＯＮ２５４５７を保持する無毒化アグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１（Ｈ
ｏｏｄら，１９８６）を、トウモロコシ形質転換に使用した。アグロバクテリウ
ムの培養は、実施例２の記載と同様にして開始させ、増殖させ、採取したが、細
胞の選択は異なる抗生物質（１００ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン及びカナマイシン
）を用いて行った。接種のため、細胞密度をＯＤ_６６０が０．５から１．０にな
るよう調整した。胚形成カルス（１４日間予備培養）をアグロバクテリウム懸濁
細胞中に、暗所で、２３℃から２５℃で３時間浸した。通常、０．０１％シルウ
ェット（Ｗ７７）を接種混合物中に含ませた。接種後、前記のようにしてアグロ
バクテリウム細胞を接種プレートから除去し、外植片を実施例２及び３の記載と
同様にして共培養した。通常、５０〜３００μＬの水を各共培養プレートに添加
した。５００μＬ以上の水を共培養プレートに添加する処理を、対照として使用
した。

【００９３】３．植物の再生及びトランスジェニック植物の同定遅延培地（５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含む培地Ｄ−１．５Ｄ）上で３日
後、予備培養しアグロバクテリウムを感染させた未成熟胚又は胚形成カルスを、
段階的な選択のためパロモマイシンが補充された、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリ
ンを含む前記のような修飾培地Ｄへ移した。外植片を２５ｍｇ／Ｌパロモマイシ
ンを用いて１週間選択し、次いで破壊し、２又は３週間の間隔で、５０ｍｇ／Ｌ
、１００ｍｇ／Ｌ及び２００ｍｇ／Ｌの濃度のパロモマイシンを含む培地へ継代
した。生存組織を、０．５ｍｇ／Ｌベンジルアデニン（ＢＡ）が補充された培地
ＤからなるＢＡパルス培地へ移した。５日後、胚形成カルスを、植物再生のため
のＭＳ基本培地へ移した。トランスジェニック植物を、組織化学的ＧＵＳアッセ
イにより同定した。表６は、ＧＵＳ発現に対する共培養中の水分枯渇の効果を示
す。

【００９４】

【表６】

【００９５】実施例６．ダイズの懸濁細胞及び予備培養された胚軸外植片の形質転換１．外植片の調製１ｍｇ／Ｌ２，４−Ｄ及び０．１ｍｇ／Ｌベンジルアデニン（ＢＡ）が補充
されたＭＳ基本培地上で、ダイズｃｖ．Ａ３２３７の葉組織から誘導されたカル
スから懸濁細胞培養を開始させた。接種前、懸濁細胞をこの培地上で２ヶ月間維
持した。細胞を液体培養物から採取し、アグロバクテリウムを接種した。胚軸切
片は、ｃｖ．Ａ３２３７の５日齢の発芽した実生から調製した。胚軸を約０．５
ｃｍの切片に切り離した。接種前、外植片を、様々な培地上で５日間予備培養し
た。

【００９６】２．アグロバクテリウムの調製、接種及び共培養バイナリーベクターｐＭＯＮ１５７１５を保持する無毒化アグロバクテリウム
株ＡＢＩを、全てのダイズ実験に使用した。アグロバクテリウムの培養は、前記
と同様にして開始させ、増殖させ、採取した。接種のため、細胞密度をＯＤ_６６ _０が０．１から１．０になるよう調整した。外植片をアグロバクテリウム溶液中
に１５分から３０分間浸し、感染した外植片を、１枚のフィルター紙が置かれた
ペトリ皿（１００×２０ｍｍ、１００×１５ｍｍ、又は６０×２０ｍｍ）で共培
養した。水分の効果を試験するための共培養期間中、水又は液体培地を排除し、
共培養中に水又は液体培地５００μＬ又は１０００μＬを使用する対照を設定し
た。共培養は、暗所で、２３℃〜２５℃で３日間実施した。

【００９７】３．ＤＮＡ輸送の効率５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含む修飾ＭＳ培地（ピーナッツＰと命名）上
での選択の２日遅延の後、外植片をＧＵＳアッセイにより分析した。有意に多い
一過性ＧＵＳ発現（およそ５０倍）が、対照と比較して、懸濁細胞を使用した水
分制限処理において示された。アグロバクテリウムを接種された外植片への水分
を制限することの、ＤＮＡ輸送に対する陽性効果は、胚軸外植片においても観察
された。その効果は、表７に示されるような異なる予備培養培地条件下でより明
白であった。

【００９８】

【表７】

【００９９】参考文献下記の参考文献及び本明細書に引用された全ての参考文献が、本明細書におい
て使用された方法論、技術及び／又は組成物を補足し、説明し、そのバックグラ
ウンドを提供し、又は教示する程度に、参照として本明細書に組み込まれる。

【０１００】

【表８】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＭＯＮ１５７１５を示す図である。

【図２】ｐＭＯＮ１８３６５を示す図である。

【図３】ｐＭＯＮ２５４５７を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD14 CD17 4B024 AA08 BA12 CA02 DA01 FA02 GA11 4B065 AA88X AB01 BC33 CA29 CA31 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）植物のゲノムへ導入することが望まれる一つ又は複数
の遺伝子成分を、再生可能な植物の細胞又は組織と該遺伝子成分を含有するアグ
ロバクテリウムとを共培養することにより導入する工程、（ｂ）該アグロバクテリウムを接種された外植片の重量を減少させる条件下で
、工程（ａ）の該アグロバクテリウムと再生可能な植物の細胞又は組織とを共培
養する工程、（ｃ）形質転換された細胞系を同定又は選択する工程、及び（ｄ）それらから稔性トランスジェニック植物を再生させる工程を含む、稔性トランスジェニック植物を作製する方法。
【請求項２】再生可能な細胞又は組織が、工程（ａ）の前に予備培養され
る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】共培養のための条件が、アグロバクテリウムを接種された外
植片から水分を制限又は除去することを含み、このとき、外植片の重量を５０％
以下減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】アグロバクテリウムを接種された外植片の重量を最大４０％
減少させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】アグロバクテリウムを接種された外植片の重量を最大３０％
減少させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】アグロバクテリウム接種後の水分の制限又は除去の期間が１
時間よりも長い、請求項３に記載の方法。
【請求項７】アグロバクテリウム接種後の水分の制限又は除去の期間が１
時間から約６日である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】アグロバクテリウム接種後の水分の制限又は除去の期間が約
１日から約４日である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】アグロバクテリウム接種後の水分の制限又は除去の期間が約
１日から約３日である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】トランスジェニック植物が単子葉植物である、請求項１に
記載の方法。
【請求項１１】トランスジェニック植物が双子葉植物である、請求項１に
記載の方法。
【請求項１２】単子葉植物がコムギ、トウモロコシ又はイネである、請求
項１０に記載の方法。
【請求項１３】単子葉植物がコムギである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】単子葉植物がトウモロコシである、請求項１０に記載の方
法。
【請求項１５】単子葉植物がイネである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】双子葉植物がダイズである、請求項１１に記載の方法。