JP2002529080A

JP2002529080A - 細胞の遺伝子マーキングならびに疾病の予防および治療のためのその使用

Info

Publication number: JP2002529080A
Application number: JP2000581177A
Authority: JP
Inventors: ハンス−ハーラルト・ゼドラツェク; クラウス・ハーフェマン; ロールフ・ミュラー
Original assignee: アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 1998-11-05
Filing date: 1999-10-19
Publication date: 2002-09-10
Also published as: CA2349497A1; WO2000028010A2; AU1040700A; WO2000028010A3; DE19850986A1; EP1127109A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、人体の処置に適当な細胞を産生させる方法に関する。この方法によれば、（ａ）人体から細胞を採取し、（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞をインビトロにおいて、プロモーターの制御下にある成長因子および／または分化因子をコードする少なくとも１種の遺伝子によって、工程（ｂ）からの細胞が人体に再び導入された場合に所望の様式で分化できるようにトランスフェクトする。本発明はまた、上記の方法で得られた細胞、および疾患の処置のための医薬の製造におけるそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本発明は、細胞に成長因子および／または分化因子の遺伝子の少なくとも１種
、成長因子および／または分化因子の関連受容体の遺伝子の少なくとも１種を挿
入し、これらの細胞を挿入した遺伝子により、インビトロまたはインビボで所望
の機能を有する段階に細胞を分化させる方法に関する。

【０００２】

【背景技術】

１) 基礎細胞の移植を補助することによる治療法は、次第にその重要性を増している。
すなわち、たとえば骨髄細胞の移植は高用量の化学療法後の白血病または腫瘍症
の処置として確立されている。原理的には、移入される細胞がそれらの機能およ
び／または生存能を傷害されることなく細胞懸濁液に変換できれば、細胞の生体
への移入には問題はない。この種類の細胞懸濁液を循環、生体の腔部、臓器また
は局所に投与するのは比較的簡単である。

【０００３】しかしながら、移入される細胞は細胞懸濁液の生成によりそれらの機能および
生存能にかなり傷害を生じる分化段階であることが必要な場合は、これらの分化
した細胞の投与はきわめて困難である。これは、たとえば、とくに細胞が所望の
分化段階において付着性の強い形態で増殖する場合に起こり、細胞懸濁液の産生
のための細胞培養容器からの剥離は、適当な場合タンパク質分解酵素の添加とと
もに機械的な方法（たとえば掻き取り）を用いてのみ可能である。

【０００４】これらの困難性に関する知識により、この種の細胞を問題なく移植できるよう
に、新規な方法が開発された。

【０００５】

【発明の開示】

２) 発明の概要本発明は、細胞に成長因子および／または分化因子の遺伝子の少なくとも１種
、成長因子および／または分化因子の関連受容体の遺伝子の少なくとも１種を挿
入し、これらの細胞を挿入した遺伝子により、インビトロまたはインビボで所望
の機能を有する段階に強制的に分化させる方法に関する。本発明の特定の実施態
様においては、この機能はトランスフェクトされた細胞の組織グループへのイン
テグレーションを伴うものである。

【０００６】本発明はとくに、成長因子および／または分化因子の遺伝子の少なくとも１種
、および／または成長因子および／または分化因子の関連受容体の遺伝子の少な
くとも１種が挿入された細胞、ならびに障害の予防または治療の目的でのこれら
の細胞の使用に関する。

【０００７】本発明はさらに骨髄、リンパ臓器、体腔、生体滲出液、血液、血管および結合
組織から得られ、障害の予防または治療の目的で成長因子および分化因子ならび
に／またはその受容体の遺伝子の少なくとも１種が挿入された単核細胞に関する
。

【０００８】この種類の細胞は、それらに導入された遺伝子を発現し、細胞培養液中におけ
る成長因子および／またはその受容体の発現の結果として、とくに生体への投与
後に、所望の分化段階までさらに分化を受ける。

【０００９】本発明によれば、細胞に導入された遺伝子の発現は、プロモーターの制御下に
置かれる。これらのプロモーターは非特異的に、細胞型特異的に、代謝的におよ
び／または薬理学的に活性化可能および／または自己強化性である。

【００１０】特定のプロモーターの選択の結果として、導入された細胞の増殖および分化は
必要に応じて影響されることが可能である。本発明の細胞はさらに処置すること
なく、治療剤または予防剤としても使用することができる。

【００１１】しかしながら、それらはまた、遺伝子療法のための細胞性ベクターとして使用
することもできる。このためにはインビトロすなわち細胞培養液中において、異なるプロモーター
の制御下に（たとえば細胞型特異的に、細胞周期特異的に、代謝的に、薬理学的
に活性化可能および／または自己強化性に）予防的もしくは治療的に活性なタン
パク質または医薬のプレカーサーを医薬に活性化する他の酵素をコードする付加
的なヌクレオチド配列をそれらに挿入する。この種類のヌクレオチド配列の例は
既に血管障害（EP A 0 777 739）、中枢神経系障害（EP A 0 777 740）、腫瘍（
EP A 0 804 601）、および免疫系によって引き起こされる障害（EP A 0 807 183
）の予防および治療のために、引用された特許出願ならびに特許出願EP A 0 859
058、EP A 0 864 651およびDE 19752299.8に記載されている。

【００１２】本発明において請求される方法および本方法によって調製される細胞は新規で
ある。先行技術は、インビトロにおける分化を細胞培養液中への成長因子の添加
によって実施し、分化した細胞を細胞培養容器から機械的またはタンパク質分解
的に剥離後に使用するものである。

【００１３】たとえば、末梢単核細胞とくにヒト血液からのＣＤ34−陽性細胞が細胞培養液
中、Asaharaら, Science 275: 964 (1997) によって、ウシの血清および脳抽出
物の添加により内皮細胞様細胞に分化され、それらの性質の検討に使用された。
しかしながら、これらの細胞は、内皮細胞としての分化段階およびそれらに関連
する細胞培養容器への強力な付着のために、傷害を与えることなく剥離すること
および個々の懸濁液へ変換することがきわめて困難なことから体内への注射には
使用されなかった。

【００１４】この代わりに、血液から新たに単離された単核細胞が注射されたが、それらは
それらが定着した特定の臓器の局所条件によってインビボでは異なる細胞に分化
し、ごく一部のみが内皮細胞に分化できる（Asaharaら, 1997, 上記参照）こと
が知られている。

【００１５】分化に至るまで細胞をマーキングする本発明において請求される方法は文献に
より既知の細胞の脱分化方法とは異なっている。この脱分化は細胞への遺伝子の
挿入によって行われ、この細胞の不死化を招来する。この種の遺伝子にはたとえ
ば - ＣＭＶのＩＥ84（Speirら, Science 265: 391, 1994） - ＡＶのＥ1Ａ（Nevins, Science 258: 424, 1992）がある。

【００１６】３) 発明の詳述出発細胞、プロモーター、ならびに受容体および／または成長因子および分化
因子をコードするヌクレオチド配列の選択は、これらの細胞に要求される意図し
た用途により、すなわち生体内で要求される細胞の分化状態およびこれらの細胞
に要求される治療目的に応じて行われる。

【００１７】３.１) 要求される分化状態：内皮細胞ａ) 意図される使用 - 内皮細胞欠損（たとえば、血管拡張後の）の内皮細胞による置換または血管
新生の促進 - 特許出願EP A 0 893 493およびEP A 0 926 236に詳細に記載されているよう
な遺伝子療法のための細胞ベクターとしての使用

【００１８】ｂ) 出発細胞の選択 - 以下から得られる単核細胞・たとえば静脈、毛細血管、動脈および臍帯または胎盤からの血液・骨髄細胞懸濁液・脾臓細胞懸濁液・リンパ節細胞懸濁液・腹腔細胞懸濁液・胸膜細胞懸濁液・リンパ・結合組織液（たとえば、表皮的たとえば機械的に傷害された上皮の表面に出現）赤血球、顆粒球および他の細胞成分はこれらの体液から密度勾配遠心分離によ
り分離され、血小板は本技術分野の熟練者に周知の方法に従い分別遠心分離によ
り分離される。 - 臓器、体腔または血液から得られる、表面マーカー、ＣＤ34、ＣＤ11、ＣＤ
13、ＣＤ14、ＣＤ64および／またはＣＤ68を有する単核細胞これらの細胞の単離は、本技術分野の熟練者に周知の方法、たとえばそれぞれ
の表面抗原に特異的なモノクローナル抗体でコートされた支持体上への免疫吸着
を用いて実施される。 - 内皮細胞内皮細胞は本技術分野の熟練者に周知の方法を用い、たとえば脂肪組織から、
静脈を掻き落とすことにより、または臍帯内皮の剥離により得ることができる。

【００１９】ｃ) 成長および分化因子ならびにそれらの受容体の遺伝子の選択内皮細胞の増殖および分化に寄与するすべての成長因子およびそれらの受容体
が適当である。これらには、たとえば - 成長因子・血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および他のＫＤＲまたはＦltリガンドたと
えばＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはニューロピリン・線維芽細胞成長因子（ＦＧＦα，ＦＧＦβ）・上皮成長因子（ＥＦＧ）・インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２）・β−内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）・内皮細胞付着因子（ＥＣＡＦ）・インターロイキン−３（ＩＬ−３）・コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）・ＧＭ−ＣＳＦ・Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ・インターロイキン−４（ＩＬ−４）・インターロイキン−１（ＩＬ−１）・インターロイキン−８（ＩＬ−８）・血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ，−ＡＢ，−ＢＢ）・インターフェロンγ（ＩＮＦγ）・オンコスタチンＭ・Ｂ61 ・血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤＥＧＦ）・幹細胞因子（ＳＣＦ）・トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）・アンギオゲニン・プレイオトロフィン・Ｆlt−３リガンド（ＦＬ）−幹細胞成長因子（Ｓcg7）・Ｔie−２リガンドたとえばアンギオポイエチン−１・ストローマ由来因子−１（ＳＤＦ−１）、および・ＴＮＦα - 受容体・ＶＥＧＦ受容体Ｉ（Ｆlt）・ＶＥＧＦ受容体II（ＫＤＲ）・ＶＥＧＦ受容体III ・ＦＧＦ受容体（−１、−２、−３、−４、−５）・ＩＧＦ受容体・ＥＣＧＦ受容体・ＥＣＡＦ受容体・ＩＬ−３受容体・オンコスタチンＭ受容体・ＬＩＦ受容体・Ｂ61受容体・ＰＤＥＧＦ受容体・ＳＣＦ受容体・ＴＧＦβ受容体・Ｔie−２受容体・ＳＤＦ−１受容体・プレイオトロフィン受容体・ＥＧＦ受容体・ＴＮＦα受容体および／または・ＳＤＦ−１受容体・ＰＤＧＦ受容体（αおよびβ）が包含される。

【００２０】ｄ) プロモーターの選択 - 非制限的に活性化可能な、内皮細胞特異的に、代謝的に活性化可能な、自己
強化性および／または薬理学的に制御可能なプロモーター、ならびにそれらの組
み合わせ（第４項参照）

【００２１】３.２) 要求される分化状態：骨芽細胞ａ) 意図される使用 - 骨の治癒促進（たとえば、骨折後の局所的または全身的投与）

【００２２】ｂ) 細胞の選択 - ３.１.に記載のようにして得られる単核細胞 - ３.１.に記載のようにして得られる表面マーカー、ＣＤ34、ＣＤ11、ＣＤ13
、ＣＤ14および／またはＣＤ68を有する単核細胞本技術分野の熟練者には周知の方法を用いて、たとえば皮下組織から得られる
線維芽細胞

【００２３】ｃ) 成長および分化因子の受容体ならびに成長因子および分化因子の遺伝子の
選択骨芽細胞の増殖および分化に寄与するすべての成長因子および分化因子が適当
である。 - 成長および分化因子これらには、とくに、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、たとえば、ＢＭＰ−１、
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７お
よびＢＭＰ−８（Takaharaら, Genomics 29: 9, 1995; Celesteら, PNAS USA 87
: 9843, 1990; Oezkaynakら, EMBO J. 9: 2085, 1990; Oezkaynakら, J. Biol.
Chem. 267: 25220, 1992; Hinoら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 223: 304,
1996; Ruppertら, Eur. J. Biochem. 237: 295, 1996）、プレイオトロフィン
（ＰＴＮ）ならびにミッドカイン（Kurtzら, Crit. Rev. Oncogenesis 6: 151,
1995; Int. Dev. Bio. 37: 183, 1993）が包含される。 - 受容体ＢＭＰ、ＰＴＮおよびミッドカインの受容体

【００２４】ｄ) プロモーターの選択 - ＢＭＰの遺伝子の非制限的に活性化可能なプロモーター、代謝的に活性化可
能な、自己強化性および／または薬理学的に制御可能なプロモーター、ならびに
それらの組み合わせ（第４項参照）

【００２５】３.３) 要求される分化状態：グリア細胞ａ) 意図される使用 - ＣＮＳの損傷の治癒促進 - たとえば特許出願EP A 0 777 740に詳細が記載されているようなＣＮＳに対
する障害および／または損傷の遺伝子療法のための細胞ベクター、

【００２６】ｂ) 細胞の選択 - ３.１.に記載のようにして得られる単核細胞 - ３.１.に記載のようにして得られる表面マーカー、ＣＤ34、ＣＤ11、ＣＤ13
、ＣＤ14および／またはＣＤ68を有する単核細胞

【００２７】ｃ) 成長および分化因子ならびに関連受容体の遺伝子の選択成長因子および分化因子グリア細胞の増殖および分化に寄与するすべての成長因子が、本発明の意味の
範囲内において適当である。これらには、たとえば - グリア成長因子（ＧＧＦ）（Trachtenbergら, Nature 379: 174, 1996） - ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４；trk−Ｃ，Funakoshiら, Science 267:
1495, 1995） - 脳由来神経栄養因子（ＢｄＮＦ；trk−Ｂ） - 毛様体神経栄養因子（ＣＮＦ） - グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ） - 神経成長因子（ＮＧＦ，trk−Ａ）が包含される。受容体グリア細胞の増殖および分化に寄与するすべての成長因子の受容体が本発明の
意味の範囲内において適当である。これらには、たとえば - ＧＧＦ受容体 - ＮＧＦ受容体 - ＣＮＦ受容体 - ＢｄＮＦ受容体 - ＮＴ−４受容体 - ＧＤＮＦ受容体が包含される。

【００２８】ｄ) プロモーターの選択 - 非制限的に活性化可能、グリア細胞特異的に活性化可能、代謝的に活性化可
能、自己強化性および／または薬理学的に制御可能なプロモーターならびにそれ
らの組み合わせ（第４項参照）

【００２９】３.４) 要求される分化状態：滑液細胞ａ) 意図される使用 - 関節損傷の予防および治療

【００３０】ｂ) 細胞 - ３.１.に記載のようにして単離される単核細胞 - ３.１.の記載に相当する表面マーカーを有する血液細胞 - 本技術分野の熟練者には周知の方法により得られる線維芽細胞

【００３１】ｃ) 成長因子および分化因子ならびにそれらの受容体の遺伝子 - 成長因子および分化因子これらの成長因子には、滑液細胞の抗炎症反応および分化を招来するすべての
タンパク質、たとえばサイトカイン、サイトカイン阻害剤、酵素阻害剤、抗接着
分子、酸素ラジカルのアンタゴニストおよび軟骨細胞の成長因子が包含される。これらには、たとえば - トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β−１およびβ−２ - インターロイキン−10（ＩＬ−10） - インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１） - インターロイキン−４（ＩＬ−４） - インターロイキン受容体アンタゴニストタンパク質（ＩＲＡＰ） - メタロプロテイナーゼ阻害剤たとえばＴＩＭＰ−１、−２、−３ - 線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ） - インターロイキン−６（ＩＬ−６） - プラスミノーゲンアクティベーター阻害剤（ＰＡＩ−１，−２） - 血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ） - スーパーオキシドジスムターゼ - たとえばＣＤ18、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ44のような可溶性（細胞外分画）接
着分子 - 受容体が包含される。これらには、その活性化が滑液細胞の抗炎症反応および分化を招来するすべて
の受容体が包含される。これらには、たとえば - ＴＧＦβ受容体 - ＩＬ−10受容体 - ＩＧＦ−１受容体 - ＩＬ−４受容体 - ｂＦＧＦ受容体が包含される。

【００３２】ｄ) プロモーター - 非特異的、リンパ球および／またはマクロファージ特異的、および／または
滑液細胞特異的プロモーター（第４項参照）

【００３３】３.５) 要求される分化状態：抗炎症細胞ａ) 意図される使用 - 炎症、自己免疫疾患および臓器拒絶の予防および治療

【００３４】ｂ) 細胞 - ３.１.に記載のようにして単離される単核血液細胞 - ３.１.に記載のようにして単離される細胞表面マーカーを有する細胞 - 線維芽細胞

【００３５】ｃ) 成長因子および分化因子ならびに／またはそれらの受容体の遺伝子抗体反応または細胞性免疫反応に対して抗アレルギー性を示すかまたはそれら
を阻害するすべてのサイトカインおよびそれらの受容体は、本発明の意味の範囲
内において適当である。これらには、たとえば - サイトカイン・インターフェロン（ＩＦＮα，ＩＦＮβ，ＩＦＮγ）・インターロイキン−４（ＩＬ−４）・インターロイキン−６（ＩＬ−６）・インターロイキン−９（ＩＬ−９）・インターロイキン−13（ＩＬ−13）・ＬＩＦ・オンコスタチン・インターロイキン−10（ＩＬ−10）・インターロイキン−12（ＩＬ−12）・ＴＧＦβ ・腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）・ＴＮＦβ ・インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ） - 受容体・ＩＦＮα、−β、−γの受容体・可溶性ＩＬ−４受容体・ＩＬ−４受容体・ＩＬ−６受容体・可溶性ＩＬ−６受容体・可溶性ＩＬ−２受容体・ＩＬ−10受容体・ＩＬ−12受容体・ＩＬ−13受容体・ＴＮＦα受容体・ＴＮＦβ受容体・ＴＧＦβ受容体が包含される。

【００３６】ｄ) プロモーター - 非制限的に活性化可能、リンパ球および／またはマクロファージ-特異的に
活性化可能、代謝的に活性化可能、自己強化性および／または薬理学的に制御可
能なプロモーターならびにそれらの組み合わせ（第４項参照）

【００３７】３.６) 要求される分化状態：炎症に関与する細胞ａ) 意図される使用 - たとえば感染および腫瘍症の過程における炎症および拒絶反応の支持

【００３８】ｂ) 細胞 - ３.１.に記載のようにして単離される単核血液細胞 - ３.１.に記載のようにして単離される表面マーカーを有する細胞 - 線維芽細胞

【００３９】ｃ) 成長因子および分化因子ならびに／またはそれらの受容体の遺伝子抗体誘導反応または細胞性免疫反応を促進するすべてのサイトカインおよび／
またはそれらの受容体は本発明の意味の範囲内において適当である。これらには、たとえば - 成長因子・インターロイキン−１・インターロイキン−２・インターロイキン−４・インターロイキン−５・インターロイキン−６・ＬＩＦ・インターロイキン−７・インターロイキン−８・インターロイキン−11 ・ＧＭ−ＣＳＦ・Ｍ−ＣＳＦ・Ｇ−ＣＳＦ・ＩＦＮα、−β、−γ - 受容体・ＩＬ−１受容体・ＩＬ−２受容体・ＩＦＮα、−β、−γ受容体・ＩＬ−３受容体・ＩＬ−５受容体・ＩＬ−６受容体・ＧＭ−ＣＳＦ受容体・Ｍ−ＣＳＦ受容体・インテグリンβ−２タンパク質が包含される。

【００４０】ｄ) プロモーター - 非制限的に活性化可能、リンパ球および／またはマクロファージ−特異的に
活性化可能、代謝的に活性化可能、自己強化性および／または薬理学的に制御可
能なプロモーターならびにそれらの組み合わせ（第４項参照）。

【００４１】４) プロモーターの選択本発明の意味の範囲内においては、使用されるプロモーター配列は、転写因子
に結合したのち、３′末端に隣接して配置される移入遺伝子、たとえば成長因子
もしくは分化因子の受容体の遺伝子または成長因子もしくは分化因子の遺伝子の
転写を活性化するヌクレオチド配列である。本発明の意味の範囲内では少なくと
も１種のプロモーター配列が本発明の細胞中に挿入される。このプロモーター配
列は少なくとも１種のさらに他のプロモーター配列と結合することができる。プ
ロモーター配列と結合させるプロモーター配列の選択は処置すべき障害に依存す
る。すなわち、プロモーター配列は、非制限的に、内皮細胞特異的に、ある種の
代謝条件下たとえば低酸素によって誘導可能であり、または医薬により誘導可能
であり、ウイルス特異的におよび／または細胞周期特異的に活性化可能である。
この種のプロモーター配列は既に特許出願EP A 0 804 601、EP A 0 777 739、EP
A 0 807 183、EP A 0 777 740、EP A 0 753 580、EP A 0 857 781、EP A 0 790
313、EP A 0 860 445、EP A 0 864 651およびEP A 0 805 209に記載されている
。これらの特許出願を引用する。選択されるプロモーター配列には、たとえば以
下のプロモーターが包含される。

【００４２】４.１) 非制限的に活性化可能なプロモーターおよびアクティベーター配列には
たとえば、 - ＲＮＡポリメラーゼIIIのプロモーター - ＲＮＡポリメラーゼIIのプロモーター - ＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー - ＳＶ40プロモーターが包含される。

【００４３】４.２) 代謝的に活性化可能なプロモーターおよびエンハンサー配列、たとえば
、低酸素により誘導可能なエンハンサー（Semenzaら, PNAS 88: 5680, 1991; Mc
Burneyら, Nucl. Acids Res. 19: 5755, 1991）

【００４４】４.３) 細胞周期特異的に活性化可能なプロモーターこれらにはたとえば、cdc25Ｂ遺伝子、cdc25Ｃ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、
cdc2遺伝子、Ｂ−myb遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、Ｅ2Ｆ−１遺伝子のプロモーター
または細胞増殖時に出現もしくは活性化される転写因子のための他の結合配列が
ある。これらの結合配列には、たとえば、c-mycタンパク質の結合配列が包含さ
れる。とくにこれらの結合配列中では、Ｍyc Ｅ-box［5′-GGAAGCAGACCACGTGGTC
TGCTTCC-3′(配列番号：１)；Blackwood & Eisenmann, Science 251: 1211, 199
1］と命名されたヌクレオチド配列のモノマーまたはマルチマーが包含される。

【００４５】４.４) 自己強化性および／または薬理学的に制御可能なプロモーター最も単純な場合、プロモーターは同種または異種のプロモーターを組み合わせ
、たとえばテトラサイクリンオペレーターの形態のテトラサイクリンにより適当
なリプレッサーとの組み合わせにおいて活性化または不活性化できるプロモータ
ーの形態で誘導可能にすることができる。

【００４６】しかしながら、本発明によればプロモーターは薬理学的に制御可能なプロモー
ターユニットとともにまたはそれがなくても自己-強化性とすることができる。このタイプの自己−強化性および／または薬理学的に制御可能なプロモーター
は特許出願EP A 0 848 061 に記載され、ここにとくに引用する。

【００４７】４.５) 内皮細胞特異的に活性化可能なプロモーターこれらには好ましくは内皮細胞内で形成されるタンパク質をコードする遺伝子
のプロモーターまたはエンハンサーからのプロモーターまたはアクティベーター
配列が包含される。本発明の意味の範囲内では、たとえば、以下のタンパク質の遺伝子のプロモー
ターが使用される。 - 脳特異的、内皮細胞グルコース−１トランスポーター - エンドグリン - ＶＥＧＦ受容体−１（flt-1） - ＶＥＧＦ受容体−２（flt-2，ＫＤＲ） - ＶＥＧＦ受容体−３（flt-3） - tie−１またはtie−２ - Ｂ61受容体（Ｅck受容体） - Ｂ61 - エンドセリン、とくにエンドセリンＢまたはエンドセリン−１ - エンドセリン受容体、とくにエンドセリンＢ受容体 - マンノース−６ホスフェート受容体 - フォンビルブラント因子 - ＩＬ−１α、ＩＬ−１β - ＩＬ−１受容体 - 血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１） - 間質細胞接着分子（ＬＣＡＭ−３） - 合成アクティベーター配列 - 血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ）

【００４８】天然の内皮細胞特異的なプロモーターの代替として、優先的にまたは選択的に
内皮細胞に対して活性な転写因子のオリゴメライズされた結合部位からなる合成
アクティベーター配列を使用することができる。この例には、エンドセリン−１
遺伝子におけるその結合部位が5′-TTATCT-3′である転写因子、ＧＡＴＡ−２が
ある（Leeら, Biol. Chem. 16188, 1991; Dormannら, J. Biol. Chem. 1279, 19
92; Wilsonら, Mol. Cell Biol. 4854, 1990）。

【００４９】４.６) グリア細胞特異的に活性化可能なプロモーターグリア細胞で活性化されるプロモーターおよびアクティベーター配列はたとえ
ば、以下のタンパク質、すなわち、シュワン細胞特異的タンパク質、ペリアキシ
ン、グルタミンシンセターゼ、グリア細胞特異的タンパク質（グリア細胞繊維性
酸性タンパク質＝ＧＦＡＰ）、グリア細胞タンパク質Ｓ100、ＩＬ−６、ＣＮＴ
Ｆ、５−ＨＡＴ受容体、ＴＮＦα、ＩＬ−10、インスリン様成長因子受容体Ｉお
よびIIまたはＶＥＧＦをコードする遺伝子からの遺伝子調節配列がある。

【００５０】４.７) 滑液細胞特異的に活性化可能なプロモーター滑液細胞で活性化されるプロモーターおよびアクティベーター配列には、たと
えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）たとえばＭＭＰ−１（間質
コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−３（ストロメリシン／トランシン）またはメタロプロ
テイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）たとえばＴＩＭＰ−１、−２、−３をコー
ドする遺伝子のプロモーター配列がある。

【００５１】４.８) リンパ球および／またはマクロファージ特異的に活性化可能であるプロ
モーターリンパ球および／またはマクロファージにおいて活性化されるプロモーターお
よびアクティベーター配列には、たとえば、サイトカイン、サイトカイン受容体
ならびに接着分子および抗体のＦc フラグメントの受容体、たとえばＩＬ−受容
体、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−３、ＩＬ−３
受容体（αサブユニット）、ＩＬ−３受容体（βサブユニット）、ＩＬ−４、Ｉ
Ｌ−４受容体、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、インターフェロン調節因
子１（ＩＲＦ−１）をコードする遺伝子のプロモーターならびにアクティベータ
ー配列があり、ＩＲＦ−１のプロモーターはＩＬ−６により、ＩＦＮγもしくは
ＩＦＮβ、ＩＦＮγ応答プロモーターＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−10、ＩＬ−11
、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ受容体（α−鎖）、ＩＬ−13、ＬＩＦ
、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）受容体、Ｉ型およびII型マク
ロファージスカベンジャー受容体、ＭＡＣ−１（白血球機能抗原）、ＬＦＡ−１
α（白血球機能抗原）またはｐ150,95（白血球機能抗原）によるのと同程度に活
性化される。

【００５２】４.９) 同種または異種プロモーターの組み合わせ同種プロモーターの組み合わせは、たとえばヌクレオチド配列の５′から３′
のリーディング方向で多数のプロモーターを順次連結することによって行われる
。

【００５３】同種または異種プロモーターの組み合わせには、しかしながら、特許出願WO 9
6／06943；EP A 0 790 313；EP A 0 860 445；EP A 0 864 651；EP A 0 805 209
；EP A 0 848 063およびEP A 0 848 061に既に詳細に記載された技術が優先して
採用される。本発明に関連してこれらの特許出願はとくに引用される。この種の
技術の例には次のものがある。

【００５４】４.10) キメラプロモーターキメラプロモーターは、上流に配置された、細胞特異的、代謝的またはウイル
ス特異的に活性化可能なアクティベーター配列と、下流に位置するプロモーター
モジュールとの組み合わせであり、後者はヌクレオチド配列ＣＤＥ−ＣＨＲまた
はＥ2ＦＢＳ−ＣＨＲを含有し、これに抑制的タンパク質が結合して、その結果
として細胞周期のＧ₀およびＧ₁相において上流に配置されたアクティベーター配
列の活性化を阻害できる（WO 96／06943，Lucibelloら, EMBO J. 12, 1994）。

【００５５】とくにプロモーターエレメントＣＤＥ−ＣＨＲの機能化に関する継続的な研究
により、上流に配置されたアクティベーター配列のＣＤＥ−ＣＨＲエレメントに
よる細胞周期依存性の調節は、転写因子の活性化配列が富グルタミン活性化ドメ
インによって活性化されるか否かに大きく依存することが示された（Zwickerら,
Nucl. Acids Res. 3822, 1995）。この種の転写因子には、たとえば、Ｓp1およびＮＦ−Ｙが包含される。

【００５６】これは、したがってプロモーターエレメントＣＤＥ−ＣＨＲのキメラプロモー
ターのための使用を制限する。同じことがＢ-myb遺伝子のプロモーターエレメン
トＥ2Ｆ−ＢＳ−ＣＨＢについて考えられる（Zwickerら, Nucl. Acids Res. 382
2, 1995）。

【００５７】４.11) ハイブリッドプロモーターハイブリッドプロモーターは既に特許出願EP A 0 848 063 に記載されている
。内皮細胞特異的プロモーターと少なくともさらに１種のプロモーターの組み合
わせのために、たとえば、以下のすべての成分を含有する遺伝子構築体が選択さ
れる。

【００５８】内皮細胞特異的プロモーターのヌクレオチド配列は、転写因子の少なくとも１
つの結合部位が突然変異した形態である。この突然変異によれば、エフェクター
遺伝子の転写の開始はブロックされる。

【００５９】活性化合物をエフェクター遺伝子としてコードする導入遺伝子非特異的に、細胞特異的に、ウイルス特異的に、テトラサイクリンおよび／ま
たは細胞周期特異的に活性化可能であり、内皮細胞特異的プロモーター内の突然
変異結合部位に結合してそれを活性化することができるように突然変異を受けた
少なくとも１種の転写因子の少なくとも１種の遺伝子の転写を活性化する少なく
とも１種のプロモーターまたはエンハンサー配列本発明の例示的な実施態様においてはプロモーター配列中の突然変異はたとえ
ば、cdc25ＢプロモーターのＴＡＴＡボックスの突然変異とすることができる。

【００６０】ＴＡＴＡの突然変異は、たとえば、ＴＧＴＡＴＡＡとすることができる。この
突然変異により正常なＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）のＤＮＡ結合
部位はもはや認識されず、エフェクター遺伝子はもはや効率的に転写されない。
したがって、ＴＢＰをコードする核酸配列が共突然変異されなければならない。
この共突然変異により、ＴＢＰは突然変異ＴＡＴＡボックス（たとえば、ＴＧＴ
ＡＴＡＡ）に結合し、すなわち、フェクター遺伝子の効率的な転写を招来する。
このタイプのＴＢＰ遺伝子の共突然変異はたとえば、Strubin & Struhl（Cell,
721, 1992 および Heardら（EMBO J. 3519, 1993）に記載されている。

【００６１】４.12) 核保持シグナルと核輸出因子を組み合わせた多重プロモーターこの技術は特許出願EP A 0 805 209 に既に詳細に記載されている。この特許
出願を引用する。本発明によれば、このタイプのプロモーターは以下の成分を含有する。 - 移入遺伝子の基本転写を活性化する第一の内皮細胞特異的に活性化可能なプ
ロモーターまたはエンハンサー配列 - 活性化合物をエフェクター遺伝子としてコードする移入遺伝子 - そのｃＤＮＡが５′末端で構造遺伝子（ｂ）の３′末端に間接または直接に
連結する核保持シグナル（ＮＲＳ） - 優先的に核輸出因子に対する結合構造を有する核保持シグナルの転写産物 - 核輸出因子の基本転写を活性化するさらに他の非特異的、細胞特異的、ウイ
ルス特異的、代謝的および／または細胞周期特異的に活性化可能なプロモーター
またはエンハンサー配列 - 核保持シグナルの転写産物に結合し、それによって細胞核から移入遺伝子の
転写産物の輸送を仲介する核輸出因子（ＮＥＦ）をコードする核酸

【００６２】核保持シグナルをコードする遺伝子は好ましくは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−
２のＲev応答エレメント（ＲＲＥ）、レトロウイルスのＲＲＥ−等価保持シグナ
ルまたはＨＢＶのＲＲＥ−等価保持シグナルからなる群より選択される。

【００６３】核輸出因子は優先的に、ウイルスＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ビスナ-マイダウ
イルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイ
ルス、レトロウイルス、ＨＴＬＶのＲev遺伝子、hnＲＮＰ−Ａ１タンパク質の遺
伝子または転写因子ＴＦIII−Ａの遺伝子からなる群より選択される遺伝子であ
る。

【００６４】４.13) アクティベーター応答性プロモーターユニットアクティベーター応答性プロモーターユニットは特許出願EP A 0 805 209 に
既に詳細に記載されている。この特許出願を引用する。アクティベーター応答性プロモーターユニットは以下の成分から構成される。 - たとえば、細胞周期特異的に、細胞増殖依存性に、代謝的に、内皮細胞特異
的にもしくはウイルス特異的にまたは細胞周期特異的および代謝的、内皮細胞特
異的もしくはウイルス特異的の両者により（いわゆるキメラプロモーター）活性
化可能な１種または２種以上の同種または異種プロモーターまたはエンハンサー
配列 - いずれの場合もプロモーターまたはエンハンサー配列の下流に配置され、そ
れらの基本転写はこれにより活性化される１種または２種以上の同種または異種
のアクティベーターサブユニット - １種または２種以上のアクティベーターサブユニットの発現産物により活性
化されるアクティベーター応答性プロモーター

【００６５】好ましい実施態様においては、本発明のアクティベーター応答性プロモーター
ユニットはＤＮＡ結合ドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメインおよ
びトランス活性化ドメインからのキメラ転写因子の結合配列とすることが可能で
ある。本出願において言及される転写因子結合部位はすべて単一（モノマー）ま
たは多数のコピー（マルチマー、たとえば１０コピーまで）で存在することがで
きる。

【００６６】２つのアクティベーターサブユニットによって活性化されるアクティベーター
応答性プロモーターの例には、ＳＶ40プロモーターとの組み合わせでのＬexＡオ
ペレーターがある。第一のアクティベーターサブユニットは、アミノ酸１〜81ま
たは１〜202をコードするＬexＡ−ＤＮＡ結合タンパク質のｃＤＮＡを包含し、
その３′末端はＧal80タンパク質（アミノ酸１〜435）のｃＤＮＡの５′末端に
連結する。

【００６７】第二のアクティベーターサブユニットはアミノ酸851〜881をコードするＧal4
タンパク質のＧal80結合ドメインのｃＤＮＡからなり、その３′末端はアミノ酸
126〜132をコードするＳＶ40の大きなＴ抗原のｃＤＮＡの５′末端に連結し、そ
の３′末端はアミノ酸406〜488をコードするＨＳＶ−１のＶＰ16のトランス活性
化ドメインのｃＤＮＡの５′末端に連結する。

【００６８】２つのアクティベーターサブユニットによって活性化されるアクティベーター
応答性プロモーターの他の例には、ＳＶ40プロモーターとの組み合わせにおける
Ｇal4タンパク質の結合配列がある。

【００６９】第一の活性化ユニットは、Ｇal4タンパク質（アミノ酸１〜147）のＤＮＡ結合
ドメインのｃＤＮＡからなり、その３′末端は、Ｇal80タンパク質（アミノ酸１
〜435）のｃＤＮＡの５′末端に連結する。

【００７０】第二の活性化サブユニットはＧal4タンパク質（アミノ酸851〜881）のＧal 18
0結合ドメインのｃＤＮＡからなり、その３′末端はＳＶ40の核局在シグナル(Ｓ
Ｖ40の大きなＴ；アミノ酸126〜132）のｃＤＮＡの５′末端に連結し、その３′
末端はアミノ酸406〜488をコードするＨＳＶ−１のＶＰ16のトランス活性化ドメ
インのｃＤＮＡの５′末端に連結する。

【００７１】Ｇal4タンパク質の結合配列とＳＶ40プロモーターから構成されるアクティベ
ーター応答性プロモーターを活性化する２つのアクティベーターサブユニットの
さらに他の例は、 - ＣＤ4 Ｔ−細胞抗原の細胞質ドメイン（アミノ酸397〜435）のｃＤＮＡから
なり、その５′末端はＨＳＶ−１からのＶＰ16のトランス活性化ドメイン（アミ
ノ酸406〜488）のｃＤＮＡの３′末端に連結し、その５′末端は一方ＳＶ40の核
局在化シグナル（ＳＶ40の大きなＴ；アミノ酸16〜132）のｃＤＮＡの３′末端
に連結する第一の活性化ユニット、および - ＳＶ40の核局在化シグナル（ＳＶ40の大きなＴ；アミノ酸126〜132）のｃＤ
ＮＡおよびＧal4タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜147）のｃＤＮ
Ａからなり、その３′末端はｐ56 lckタンパク質のＣＤ4 結合配列（アミノ酸１
〜71）のｃＤＮＡの５′末端に連結する第二の活性化ユニットである。

【００７２】

【実施例】

５) 本発明の主題を例示するための例以下の実施例は、内皮細胞についてＣＤ14⁺ 細胞の遺伝子マーキングをどのよ
うにして出現させることができるかを記載する。

【００７３】ａ) ＣＤ14⁺ 細胞の単離末梢の単核血液細胞、ＰＢＭＣは健康ドナーから、製造業者（Ficoll-Paque,
Pharmacia）の説明書に従いFicoll密度勾配遠心分離によって単離した。

【００７４】得られたＰＢＭＣを冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、４℃で15分間、抗−ＣＤ14抗体
カップリング磁性ビーズ（ＣＤ14 Micro Beads, Miltneyi Biotec）とインキュ
ベートし、ついで冷ＰＢＳ中で洗浄し、0.002％ＥＤＴＡおよび１％ヒト血清ア
ルブミンを含有するＰＢＳ中に懸濁した。

【００７５】ＣＤ14⁺ 細胞をカラムから剥離するには、Vario MACS 分離キット（Miltenyi
Biotec）を用い製造業者の説明書に従って行った。この方法で調製したＣＤ14⁺
細胞の純度は70％〜95％の範囲である。

【００７６】ｂ) プラスミドの構築以下のＤＮＡ配列は、本技術分野の熟練者には周知の方法を用い、５′から３
′のリーディング方向に調製する。 - ＬexＡのＤＮＡ結合配列(ヌクレオチド配列 5′-TACTGTATGTACATACAGTA-3′
，配列番号：２，Brentら, Nature 612: 312, 1984） - フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）プロモーター（ヌクレオチド配列−487
〜＋247；Jahroudi & Lynck, Mol. Cell. Biol. 14: 999, 1994） - ＶＥＧＦ受容体IIをコードするＤＮＡ（ＫＤＲ，Yinら, Mammalian Genome
9: 408, 1998） - ｖＷＦプロモーター - ＬexＡの結合ドメイン(アミノ酸１〜81；Kimら, Science 255: 203, 1992) - ＨＳＶ−１ＶＰ16のトランス活性化ドメイン（アミノ酸406〜488；Triezen
bergら, Genes Developm. 2: 718, 1988; Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Deve
lopm. 5: 190, 1995） - ＳＶ40のポリアデニル化シグナル（Elderら, Annu. Rev. Genet. 15: 295,
1981）

【００７７】このヌクレオチド配列は模式的に図１に示す。この核酸配列（図１）をｐ×Ｐ2 プラスミドベクターにクローン化する（Nord
en, BioTechniques 6: 454, 1988）。核酸構築体それぞれの成分を、各成分の末端へ導入された適当な制限部位およ
びＰＣＲ増幅を用いて互いに連結させる。成分の組み合わせは制限特異的酵素お
よびＤＮＡライガーゼの補助によって行われる。

【００７８】ｃ) ＣＤ14⁺ 細胞のトランスフェクションＣＤ14⁺ 細胞を培養メジウム１ml中１×10⁷の濃度に調整し［メジウム199，20
％ウシ胎児血清、およびペニシリン／ストレプトマイシン／アンフォテリシン（
Gibco-BRL）］、60mmの培養皿に接種し、ｂ)（ＶＥＧＦ受容体をコード）に示す
プラスミドおよび Superfect（Quiagen, Duesseldorf）の複合体とともに３７℃
で１０分間インキュベートする。この複合体は、Superfect（Quiagen）の製造業者による詳細な説明に従い調製
する。

【００７９】トランスフェクションの成功はＲＴ−ＰＣＲによるＶＥＧＦ受容体II（ＤＲ）
ｍ−ＲＮＡの検出によって決定される。ＲＴ−ＰＣＲはSewingら, J. Cell Sci.
104: 545, 1993の記載のように実施する。

【００８０】ｄ) ＶＥＧＦ受容体II（ＫＤＲ）−発現ＣＤ14細胞のインビトロ培養ＶＥＧＦ受容体II（ＫＤＲ）−発現ＣＤ14細胞を、培養メジウム「ＥＧＭ−２
」（Biowhittaker）中１×10⁶／mlに調整し、これに５０ng／mlのＶＥＧＦ（Pep
ro Tech, London, England）および１０％ウシ胎児血清、５％ウマ血清ならびに
0.8μg／mlのハイドロコーチゾンを添加して７日間インキュベートする。

【００８１】７日後、細胞を、本技術分野の熟練者には周知のアルカリホスファターゼ−抗
アルカリホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）法を使用し、特異的な抗体の補助によっ
て（表１参照）免疫細胞化学的に検討する。ＣＤ14、ＣＤ31、ＣＤ34、ＣＤ36、
ＣＤ144およびｖＷＦに特異的なｍ−ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ（Sewingら, J. Cell
Sci. 104: 545, 1993）の補助により付加的に検出する。

【００８２】以下の結果が得られた。細胞培養液中に存在する細胞の大部分は７日後既に、内皮細胞の特徴的な表面
マーカーを示す細胞に分化した（表２参照）。

【表１】

【００８３】

【表２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に用いられるプラスミドの核酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 29/00 29/00 31/00 31/00 35/00 35/00 37/00 37/00 43/00 １０５ 43/00 １０５Ａ６１Ｋ 35/14 ＺＣ１２Ｎ 5/10 35/26 // Ａ６１Ｋ 35/14 35/28 35/26 35/32 35/28 35/50 35/32 35/55 35/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 35/55 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ロールフ・ミュラードイツ連邦共和国デー−35037マルブルク．アンデアハウシュタット38 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 DA03 EA04 FA02 FA10 GA11 HA01 HA17 4B065 AA93 AB06 AC14 BA02 BD42 CA24 CA27 CA44 4C084 AA13 NA14 ZA022 ZA962 ZB072 ZB112 ZB212 ZB262 ZB312 4C087 AA01 AA02 BB34 BB43 BB44 BB46 BB58 BB59 BB62 BB63 CA04 DA27 MA67 NA14 ZA02 ZA96 ZB07 ZB11 ZB26 ZB31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】人体の処置に適当な細胞の製造方法において、 (ａ) 人体から細胞を採取し、 (ｂ) 工程（ａ）からの細胞をインビトロにおいて、プロモーターの制御下に
置かれた成長因子および／または分化因子の少なくとも１種の遺伝子によって、
工程（ｂ）からの細胞が人体に戻されたのち所望の様式で分化する能力を有する
ようにトランスフェクトする方法。
【請求項２】工程（ｂ）からの細胞は人体に戻されたのち、組織グループ
中にインテグレートされる請求項１記載の方法。
【請求項３】工程（ｂ）において、成長因子および／もしくは分化因子な
らびに／または成長因子および／もしくは分化因子の受容体の遺伝子は核酸構築
体の部分としてトランスフェクトされ、それらはプロモーターの制御下において
成長因子および／もしくは分化因子ならびに／または上述の受容体の遺伝子の両
者、医薬的なプレカーサーの活性化のため予防的または治療的に活性なタンパク
質または酵素を発現できる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】プロモーターは、細胞型特異的に、細胞周期特異的に、代謝
的にまたは薬理学的に活性化可能である請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】工程（ａ）の細胞は、血液、静脈、毛細管、動脈、臍帯もし
くは胎盤からの単核細胞、骨、脾臓、リンパ節、リンパおよび結合組織液からの
細胞の懸濁液、腹腔細胞懸濁液、胸膜細胞懸濁液、内皮細胞ならびに線維芽細胞
からなる群より選択される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】単核細胞はＣＤ34、ＣＤ11、ＣＤ13、ＣＤ14およびＣＤ68か
らなる群より選択される表面マーカーを含有する請求項５記載の方法。
【請求項７】所望の分化は、内皮細胞の分化に相当し、成長因子および／
または分化因子の遺伝子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および他のＫＤＲも
しくはＦltリガンド、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ニューロピ
リン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦα，ＦＧＦβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、
インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２）、β−内皮細胞成長因子（Ｅ
ＣＧＦ）、内皮細胞付着因子（ＥＣＡＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）
、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳ
Ｆ、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、
インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ，−
ＡＢ，−ＢＢ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、オンコスタチンＭ、Ｂ61、
血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤＥＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トランス
フォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、アンギオゲニン、プレイオトロフィン、
Ｆlt−３リガンド（ＦＬ）、Ｔie−２リガンド（アンギオポイエチン−１，アン
ギオポイエチン−２）、ストローマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）およびＴＮ
Ｆαからなる群より選択され、成長因子および／または分化因子の受容体の遺伝
子はＶＥＧＦ受容体Ｉ（Ｆlt）、ＶＥＧＦ受容体II（ＫＤＲ）、ＶＥＧＦ受容体
III、ＦＧＦ受容体（−１，−２，−３，−４，−５）、ＩＧＦ受容体、ＥＣＧ
Ｆ受容体、ＥＣＡＦ受容体、ＩＬ−３受容体、オンコスタチンＭ受容体、ＬＩＦ
受容体、Ｂ61受容体、ＰＤＥＧＦ受容体、ＳＣＦ受容体、ＴＧＦβ受容体、Ｔie
−２受容体、ＳＤＦ−１受容体、プレイオトロフィン受容体、ＥＧＦ受容体、Ｔ
ＮＦα受容体および／またはＳＤＦ−１受容体ならびにＰＤＧＦ受容体（αおよ
びβ）からなる群より選択される請求項６記載の方法。
【請求項８】所望の分化は骨芽細胞の分化に相当し、成長因子および／ま
たは分化因子の遺伝子はＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、Ｂ
ＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−８、プレイオトロフィンおよ
びミッドカインからなる群から選択され、成長因子および／または分化因子の受
容体の遺伝子はＢＭＰ１〜８、ＰＴＮおよびミッドカインの受容体からなる群よ
り選択される請求項６記載の方法。
【請求項９】所望の分化はグリア細胞の分化に相当し、成長因子および／
または分化因子の遺伝子は、グリア成長因子（ＧＧＦ）、ニューロトロフィン−
４（ＮＴ−４；trk−Ｃ）、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＦ
）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ、
trk−Ａ）からなる群より選択され、成長因子および／または分化因子の受容体
の遺伝子はＧＧＦ受容体、ＮＧＦ受容体、ＣＮＦ受容体、ＢｄＮＦ受容体、ＮＴ
−４受容体およびＧＤＮＦ受容体からなる群から選択される請求項６記載の方法
。
【請求項１０】所望の分化は滑液細胞の分化に相当し、成長因子および／
または分化因子の遺伝子はトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β−１およ
びβ−２、インターロイキン−10（ＩＬ−10）、インスリン様成長因子−１（Ｉ
ＧＦ−１）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン受容体アン
タゴニストタンパク質（ＩＲＡＰ）、メタロプロテイナーゼインヒビター、たと
えばＴＩＭＰ−１、−２、−３、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インターロイ
キン−６（ＩＬ−６）、プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター（ＰＡ
Ｉ−１，−２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、スーパーオキシドジスムタ
ーゼ、ＣＤ−18の可溶性細胞外分画、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ44からなる群より選択
され、成長因子および／または分化因子の受容体の遺伝子はＴＧＦ−β受容体、
ＩＬ−10受容体、ＩＧＦ−１受容体、ＩＬ−４受容体およびｂＦＧＦ受容体から
なる群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項１１】所望の分化は抗炎症細胞の分化に相当し、成長因子および
／または分化因子の遺伝子は、サイトカイン、インターフェロン（ＩＦＮα，Ｉ
ＦＮβ，ＩＦＮγ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−
６（ＩＬ−６）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−13（
ＩＬ−13）、ＬＩＦ、オンコスタチン、インターロイキン−10（ＩＬ−10）、イ
ンターロイキン−12（ＩＬ−12）、ＴＧＦβ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα，ＴＮ
Ｆβ）およびインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）か
らなる群より選択され、成長因子および／または分化因子の受容体の遺伝子は可
溶性ＩＬ−４受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、可溶性ＩＬ−６受容体
、可溶性ＩＬ−２受容体、ＩＬ−10受容体、ＩＬ−12受容体、ＩＬ−13受容体、
ＴＮＦα、ＴＮＦβ受容体、ＴＧＦβ受容体ならびにＩＦＮα、−β、−γの受
容体からなる群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項１２】所望の分化は炎症に関与する細胞の分化に相当し、成長因
子および／または分化因子の遺伝子はインターロイキン−１、インターロイキン
−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、
ＬＩＦ、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−11
、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＩＦＮα、−β、−γからなる
群より選択され、成長因子および／または分化因子の受容体の遺伝子は、ＩＬ−
１受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＦＮα、−β、−γ受容体、ＩＬ−３受容体、Ｉ
Ｌ−５受容体、ＩＬ−６受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｍ−ＣＳＦ受容体、イン
テグリンβ−２タンパク質からなる群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項１３】工程（ａ）からの細胞は、５′−３′方向に、以下のエレ
メントからなるプラスミド、すなわち - ＬexＡのＤＮＡ結合配列(ヌクレオチド配列 5′-TACTGTATGTACATACAGTA-3′
) - フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）プロモーターのコード配列（ヌクレオチ
ド配列−487〜＋247） - ＶＥＧＦ受容体II（ＫＤＲ）をコードするＤＮＡ - ｖＷＦプロモーター - ＬexＡの結合ドメインのコード配列（アミノ酸１〜81） - ＨＳＶ−１ＶＰ16のトランス活性化ドメインのコード配列（アミノ酸406〜
488） - ＳＶ40のポリアデニル化シグナルからなるプラスミドでトランスフェクトされたＣＤ14−陽性、末梢単核血球細胞
（ＰＢＭＣ）である請求項６記載の方法。
【請求項１４】請求項１〜１３のいずれかに記載の方法で得られる細胞。
【請求項１５】請求項１４記載の遺伝子療法用細胞。
【請求項１６】内皮細胞欠損の治療剤の製造、血管新生の促進、骨の癒合
、ＣＮＳに対する損傷の治癒促進、関節損傷、炎症、自己免疫疾患、臓器拒絶の
予防および治療、ならびに感染または腫瘍症における炎症および拒絶反応の予防
および治療の補助のための請求項１４記載の細胞の使用。